KR20200005345A - 신장 스페로이드 및 그의 제조 방법 - Google Patents
신장 스페로이드 및 그의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20200005345A KR20200005345A KR1020180078965A KR20180078965A KR20200005345A KR 20200005345 A KR20200005345 A KR 20200005345A KR 1020180078965 A KR1020180078965 A KR 1020180078965A KR 20180078965 A KR20180078965 A KR 20180078965A KR 20200005345 A KR20200005345 A KR 20200005345A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- kidney
- spheroid
- renal
- cells
- culture
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 신규 신장 스페로이드 및 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 삼차원 신장 모사체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 신장 스페로이드 제조 방법은 세포 집합체의 응집을 개선시켜, 신장 스페로이드의 제작 성공률을 현저히 개선한다. 이에 따라 제조된 신장 스페로이드는 우수한 신장 세포 특이적 표현형을 나타내며, 정상 신장 특성을 잘 나타내는 신장 모사체로 활용될 수 있다.
특히, 본 발명의 신장 스페로이드는 신장 수송체와 관련된 약물 반응성에 변화를 감지할 수 있어, 신독성 약물 반응을 검사하는 데에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 신규 신장 스페로이드 제조 방법은 세포 집합체의 응집을 개선시켜, 신장 스페로이드의 제작 성공률을 현저히 개선한다. 이에 따라 제조된 신장 스페로이드는 우수한 신장 세포 특이적 표현형을 나타내며, 정상 신장 특성을 잘 나타내는 신장 모사체로 활용될 수 있다.
특히, 본 발명의 신장 스페로이드는 신장 수송체와 관련된 약물 반응성에 변화를 감지할 수 있어, 신독성 약물 반응을 검사하는 데에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규 신장 스페로이드 및 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 삼차원 신장 모사체에 관한 것이다.
신약 개발 시 후보물질의 독성과 효능을 체외에서 평가할 수 있는 세포 배양 시스템의 중요성은 날로 증가하고 있다. 그러나 종래의 2D 세포주 배양법은 세포가 유래한 위치 고유의 성질과 조직 단위의 특성을 재현해내기 힘들다는 단점이 있다. 또한, 동물실험 모델은 인체와 유전적, 생물학적인 특성이 상이하기 때문에 약물 시험 반응의 신뢰성에 한계가 있다. 이에 대한 대안으로 암 환자 유래 이종 이식 모델이 활용되기도 하지만 대규모 약물 스크리닝에는 부적합하다는 단점이 있다.
문헌[Fatehullah et al., Nature cell biology 18.3 (2016): 246.]에 따르면 기존의 문제점을 보완할 새로운 약물 스크리닝 플랫폼으로서 오가노이드가 주목받고 있다. 오가노이드 기술은 환자 오가노이드 뱅킹, 다양한 질병 모델링, 유전체 교정 기술 융합을 통한 재생 치료, 환자 유전체 정보와 연계한 맞춤 치료 및 정밀 치료 등 다양한 잠재적 응용 가능성을 보여주고 있다.
사람 생체 내 조직 구성을 정확히 재현하는 오가노이드를 형성하는 과정은 단순한 기초 연구 도구에서부터 응용 연구의 플랫폼까지 다양하게 적용할 수 있게 확장되었다. 유전적 변화 없이 대량으로 오가노이드를 배양할 수 있다면, 오가노이드는 초고속 스크리닝을 위한 좋은 모델이 될 수 있으며, 환자 맞춤형 표적 치료에 이용될 수 있고, 재생의학 분야에 적용될 수 있는 완벽한 조직을 제공할 수 있다.
그러나 오가노이드 배양은 생존력, 크기 및 형태 측면에서 이질적인 세포가 한데 혼합되게 되므로, 배양 세포의 이질적 특성에 따라 약물 독성 및 효능 분석의 예측을 어렵게 만든다. 이러한 오가노이드의 제작의 한계를 극복하고 신약개발시 후보물질의 독성과 효능을 평가할 수 있는 인체모사 신장 오가노이드 시스템 개발이 요구되고 있다.
한편, 신장은 대사 및 배설 과정에서 핵심적 역할을 수행하므로, Little 그룹에서 유도된 만능 줄기세포를 사용하여 사구체에서부터 집합관에 이르기까지 신장의 구조를 재현한 신장 오가노이드를 제조한 바 있다. 그러나 만능유도 줄기세포로부터 유래한 신장 오가노이드는 임신 3/4분기의 태아와 유사한 상태였고, 신독성 결과로는 시스플라틴 단일 약물에 대한 반응성만 확인할 수 있었다.
현재까지 체외 신장 독성 검증에 사용되고 있는 사람의 근위세뇨관 유래 세포들의 경우, 체외 증식 과정 및 불멸화 과정 동안 기존 신장의 특성을 잃어버리거나 특이적 수송체의 발현이 현저하게 떨어져 약물 흡수 및 대사를 검증하는데 어려움이 있다.
본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자, 생쥐의 신장으로부터 신장 특이적 마커의 발현을 유지하는 1차 세포를 획득하였고, 이를 3차원적 배양법을 통해 생체와 유사한 반응성을 가지는 신장 모사체를 제작 할 수 있는 배양 용기, 배양 세포 및 그의 조합, 배양 조건 및 배양 시간을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규 신장 스페로이드 제조 방법 및 이에 따라 생성된 신장 스페로이드, 및 이를 포함하는 삼차원 신장 세포체를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 신독성 반응성이 우수한 신장 세포체를 제조하기 위해, 신장 유래 불멸화 신장 세포를 이용하여 신장 스페로이드를 제조하였고, 이의 신장 특이성 및 신독성 반응성의 우수함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (a) 스페로이드 형성 유닛(spheroid forming unit; SFU) 내 매트리겔(matrigel) 및 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 포함하는 3차원 배양 배지에 일차 신장 세포를 투여하는 단계; (b) 레티노이드산, 덱사메타손, ITS (insulin-transferrin-selenium), 비타민 D3, 및 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF) 로 구성된 신장 세포 성숙 인자를 더 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 배양 배지를 3차원 배양하는 단계를 포함하는 신장 스페로이드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 스페로이드란 자가 조직화가 가능한 3차원 세포 집합체를 의미한다. 스페로이드는 실제 조직의 해부 구조를 모방하는 소형의 단순화된 형태의 생체 외 3 차원 기관으로, 다양한 약물 스크리닝 및 질환 모델로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 신장 스페로이드 제조 방법은 스페로이드 형성 유닛 내 매트리겔 및 세포외기질을 포함하는 3차원 배양 배지에 일차 신장 세포를 투여하는 단계 (a)를 포함한다.
스페로이드 형성 유닛은 코니칼 튜브일 수 있다. 상기 코니칼 튜브는 바닥이 둥근 형태, 반구 형태, 또는 V-자 형태일 수 있다. 본 발명에서, 바닥이 오목부로 형성된 배양 용기를 사용할 경우 바닥이 평평한 배양 용기를 사용한 방식에 비해 3차원 배양 세포의 세포 응집이 현저히 개선되어 효율적으로 스페로이드를 제조할 수 있다. 상기 코니칼 튜브는 예컨대 필터가 장착된 캡이 있는 코니칼 튜브 (cornical tube)이며, 대한민국 공개특허 제10-2017-0034241호에 개시된 것일 수 있다.
상기 (a) 단계에서 일차 신장 세포는 SV40 및 hTERT 유전자로 불멸화된 신장 유래 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 신장 스페로이드 제조 방법은 상기 단계 (a)를 수행하기 전에 2차원 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 2차원 배양은 약 7일 내지 약 150일까지 수행할 수 있다. 일 실시양태에서 상기 2차원 배양은 약 12일 내지 약 50일 동안 수행할 수 있다. 상기 2차원 배양을 수행할 경우, 단계 (a)를 수행하기 약 10일 전에 배양액에 신장 세포 분화인자를 첨가할 수 있다. 일 실시양태에서, 단계 (a)를 수행하기 약 7일 전에 신장 세포 분화인자를 첨가할 수 있다.
상기 (a) 단계의 3차원 배양 배지에서 세포외기질:매트리겔의 중량비는 1:1 내지 3:1일 수 있고, 바람직하게는 약 2:1일 수 있다.
본 발명의 신장 스페로이드 제조 방법은 배양 배지에 신장 세포 성숙인자를 더 첨가하는 단계 (b)를 포함한다. 상기 단계 (b)에서 신장 세포 성숙인자는 불멸화된 신장 세포를 분화 상태로 유도할 수 있는 성분을 의미한다. 본 발명에서, 상기 신장 세포 성숙인자는 레티노이드산, 덱사메타손, 0.5 내지 2X ITS (구체적으로, 5 내지 20 ug/ml의 insulin, 2.75 내지 11 ug/ml의 transferrin, 33.5 내지 134 ng/ml 의 selenium), 비타민 D3, EGF, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 신장 세포 성숙인자는 1 내지 10 μM 농도의 레티노이드산, 10 내지 1,000 nM 농도의 덱사메타손, ITS, 1 내지 100 nM 농도의 비타민 D3, 1 내지 100 ng/ml 농도의 EGF, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 단계 (b)는 단계 (a)와 동시에 수행되거나, 또는 단계 (a) 이후, 예컨대 약 1일 내지 약 7일 후에 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 단계 (b)는 단계 (a) 수행 약 1일 또는 2일 후에 수행된다.
본 발명의 신장 스페로이드 제조 방법은 배양 용기에서 3차원 배양을 수행하여 세포 집합체를 형성하는 단계 (c)를 포함한다.
상기 단계 (c)에 따라, 3차원 배양은 5일 내지 20일 동안 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 3차원 배양은 약 7일, 10일, 또는 14일 동안 수행될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 신장 스페로이드 제조 방법에 따라 생성된 신장 스페로이드 및 이를 포함하는 신장 세포체를 제공하며, 신독성 약물 반응에 활용 될 수 있다.
본 발명에 따른 신장 스페로이드 제조 방법에 따라 생성된 신장 스페로이드는 기존의 2차원 배양법에 의해 제조된 신장 세포에 비해 신장 특이적 유전자 발현 수준이 현저히 상승됨을 확인하였다.
또한, 상기 스페로이드는 신장 특이적 단백질이 발현되었으며, 전자 현미경 상에서 신장의 구조가 확인되었으며, 신장 특이적 수송체가 발현되고, 단백질 흡수가 확인되었다.
상기 신장 스페로이드는 약물 흡수에 관여하는 OCT2 저해제인 시메티딘(cimetidine) 및 약물 배출에 관여하는 P-glycoprotein(P-gp) 억제제인 베라파밀(verapamil)을 처리함에 따라 신독성 반응성이 변화함이 관찰되었다.
따라서, 본 발명에 따른 신장 스페로이드 제조 방법에 따라 생성된 신장 스페로이드는 신독성 약물에 반응하는 수송체가 잘 발현되어 있으며, 신독성 약물 반응에 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 신규 신장 스페로이드 제조 방법은 세포 집합체의 응집을 개선시켜, 신장 스페로이드의 제작 성공률을 현저히 개선한다. 이에 따라 제조된 신장 스페로이드는 우수한 신장 세포 특이적 표현형을 나타내며, 정상 신장 특성을 잘 나타내는 신장 모사체로 활용될 수 있다.
특히, 본 발명의 신장 스페로이드는 신장 수송체와 관련된 약물 반응성에 변화를 감지할 수 있어, 신독성 약물 반응을 검사하는 데에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 생쥐 유래의 불멸화 신장 세포를 형태학적으로 분석한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 체외 증식을 분석한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 4 및 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 신장 특이적 단백질 발현을 분석한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 단백질 흡수능을 분석한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 신독성 약물에 대한 반응성을 분석한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 gamma-GT 활성도를 분석한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포를 2D 배양 및 회전 배양하여 제조된 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예 따른 스페로이드 제조 단계(A), 형성된 스페로이드의 현미경 사진(B) 및 배양 방법(C)에 관한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 구조 및 신장 특이적 단백질 발현을 분석한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신장 특이적 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신장 특이적 수송체 유전자의 발현을 분석한 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신장 관련 호르몬에 대한 반응성을 분석한 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 gamma-GT 활성도를 분석한 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 단백질 흡수능을 분석한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물에 대한 세포 사멸을 비교한 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성을 나타내는 도이다.
도 19는 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물에 대한 관련 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 20은 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물에 대한 관련 단백질 발현을 분석한 도이다.
도 21은 일 실시예에 따라 제조된 생쥐 유래의 신장 스페로이드의 신독성 약물과 신장 특이적 수송체 기능의 연관성을 분석한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 체외 증식을 분석한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 4 및 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 신장 특이적 단백질 발현을 분석한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 단백질 흡수능을 분석한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 신독성 약물에 대한 반응성을 분석한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 gamma-GT 활성도를 분석한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포를 2D 배양 및 회전 배양하여 제조된 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예 따른 스페로이드 제조 단계(A), 형성된 스페로이드의 현미경 사진(B) 및 배양 방법(C)에 관한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 구조 및 신장 특이적 단백질 발현을 분석한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신장 특이적 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신장 특이적 수송체 유전자의 발현을 분석한 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신장 관련 호르몬에 대한 반응성을 분석한 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 gamma-GT 활성도를 분석한 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 단백질 흡수능을 분석한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물에 대한 세포 사멸을 비교한 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성을 나타내는 도이다.
도 19는 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물에 대한 관련 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 20은 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물에 대한 관련 단백질 발현을 분석한 도이다.
도 21은 일 실시예에 따라 제조된 생쥐 유래의 신장 스페로이드의 신독성 약물과 신장 특이적 수송체 기능의 연관성을 분석한 도이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 예시적으로 제공되었을 뿐, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 한정되지 않는다.
<실시예 1> 신장 유래 불멸화 신장 세포 제조
3 내지 5 주령 생쥐에서 분리한 신장을 잘게 잘라 2 mg/ml collagenase Ⅰ 용액에 넣어 37℃에서 30분 동안 혼합하였다.
상기 혼합액을 40 μM strainer (100 μm)에 여과하여 조직을 제외한 단일 세포(일차세포, primary cells)만을 분리하였다. 분리된 신장 세포를 10%(v/v) 우태아 혈청(FBS, RMBIO, Missoula, MT, USA) 및 20 ng/ml 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF)가 첨가된 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)에 5% CO2 및 37℃에서 배양하였다.
배양 2 내지 6 시간 후에 배양액에 hTERT 및 SV40 lentivirus를 4μg/ml 농도의 polybrene과 함께 배양액에 첨가하여, 불멸화 신장 세포(immortalized cells)를 제조하였다. 제조된 볼멸화 신장 세포는 80% 컨플루언스(confluence)에서 0.1% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산을 사용하여 분리 계대 배양하였다.
각각의 계대 배양으로 배가되는 세포수는 2X=NH/NI에 의해 계산되었다. NI는 접종된 세포의 수이고, NH는 합류점(> 80 %)에서 수확된 세포의 수이고, X는 세포의 배증이다. 계산된 모 집단의 배증을 이전 모집단 배증에 더하여 누적 모집단 배증 수준을 계산하였다.
모든 실험 프로토콜은 한국 생명공학연구원(KRIBB)의 기관 윤리위원회의 승인을 받았다.
<실험예 1> 불멸화 신장 세포의 형태학적 특징
1-1. 불멸화 신장 세포의 형태
상기 실시예 1에서 제조된 생쥐 유래의 불멸화 신장 세포를 체외에서 계대배양하면서 그 형태를 현미경으로 관찰하였다. 또한, 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하여 증식된 세포의 수를 일차 세포와 비교하였다.
일차 및 불멸화 세포(1×103)를 6-well 배양 접시에 있는 커버슬립에 배양하였다. 세포 배양 7 일째, 세포를 메탄올로 고정시키고 실온에서 5 분 동안 0.005 % 크리스탈 바이올렛 염색 용액으로 염색하였다.
도 1 및 도 2를 참고하면, 일차세포, 생쥐 유래의 불멸화 신장 세포는 체외에서도 신장 상피세포와 유사한 모양을 유지하며 증식하는 것을 확인하였다.
상기의 결과는 불멸화된 신장 세포가 세대를 거듭나도 체외 증식이 가능하다는 것을 보여주며, 상기 불멸화된 신장 세포를 이용한 스페로이드 제조 가능성을 시사한다.
<실험예 2> 불멸화 신장 세포의 신장 특이성 및 기능성 확인
불멸화 신장 세포의 신장 특이성을 평가하기 위해 신장 특이 유전자 및 단백질의 발현을 확인하였다.
또한, 불멸화 신장 세포의 신장 기능성을 평가하기 위해 신장 특이적 기능인 단백질(Dextran-488) 흡수, 신독성 약물인 시스플라틴에 대한 반응 및 gamma-GT의 활성도를 확인하였다.
2-1. 불멸화 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현
신장 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin 및 Nephrin을 발현 정도를 qRT-PCR을 이용하여 측정하였다(도 3).
구체적으로, RNAeasy Mini kit를 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA을 이용하여 cDNA 보관 키트(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 사용하여 1 μg을 역전사하였다. qPCR을 제조사의 지침(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) 및 Agilent Technologies)에 따라 SYBRGreen Master Mix를 사용하여 각 cDNA의 양을 측정하였다. 데이터를 표준화하였고, ΔΔCT 방법을 사용하여 각 유전자의 발현량을 분석하였다. 사용된 프라이머 서열은 표 1과 같다.
| 유전자 | 프라이머 서열 (정방향) | 프라이머 서열 (역방향) |
| NCC | CCTCAAGCAGGAAGGTAGCC (서열번호 1) |
TCACTGTTGGTGCCTGTCTC (서열번호 2) |
| NKCC2 | GAGAAGCGGGAATTGGTCTTG (서열번호 3) |
CTCCACCTCCACGAACAAAC (서열번호 4) |
| SGLT1 | CTGCAGACATCTTCTCCGGG (서열번호 5) |
GGCAGTGATTGCTAGCAGGA (서열번호 6) |
| AQP1 | GGCCTTTGGTTTGAGCATCG (서열번호 7) |
CCGGAGGATGCTGATCTGAC (서열번호 8) |
| AQP2 | TTCGAGCTGCCTTCTACGTG (서열번호 9) |
GGCTGTTGCATTGTTGTGGA (서열번호 10) |
| Podocin | CCGCTGCATTGAGAATGGAC (서열번호 11) |
CGGCCTTTGCCTTCTTGTCA (서열번호 12) |
| Nephrin | CGAACTGATGCATGCAAGAAGG (서열번호 13) |
TACACTAGTGCGTGGTCTCT (서열번호 14) |
도 3을 참고하면, 생쥐 유래의 불멸화 신장 세포에서 신장 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin 및 Nephrin의 발현을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포가 신장 특이적 표현형을 유지하고 있음을 보여준다.
2-2.
불멸화 신장 세포의 신장 특이적 단백질 발현
신장 세포 특이적으로 발현하는 단백질인 LTL, PNA, AQP2 및 Nephrin의 발현 정도를 확인하기 위해 슬라이드를 제작하여 각각의 단백질을 염색하여 발현 정도를 확인하고, 정량하였다(도 4 및 도 5).
구체적으로, 세포를 8-well slide chamber 에서 배양한 후 4% 파라포름알데히드 가 함유된 PBS 용액을 이용하여 4 ℃에서 2 시간 동안 고정하였다. 고정 후 PBS로 5분간 3번 세척하였다. 그리고 실온에서 10분 동안 0.5% Triton X-100가 함유된 PBS를 처리 후 세척한 다음 endogenous peroxidase 의 활성을 제거하기 위하여 3% hydrogen peroxide로 15분간 반응시킨 후 세척하였다. 2% 염소 혈청을 함유한 PBS에서 실온으로 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 LTL, PNA, AQP2, Nephrin 항체를 4℃에서 17시간 동안 처리 후, 세척하였다. 이후 biotinylated goat anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG를 실온에서 30분간 처리하였다. 3번 세척한 다음, horseradish peroxidaseconjugated streptavidin을 30분간 처리하였다. 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB) 용액으로 발색하였다. 발색된 세포는 PBS로 세척하고 Mayer's Haematoxylin으로 대조 염색한 후 광학 현미경 하에서 관찰하였다.
도 4 및 5를 참고하면, 불멸화 신장 세포를 체외 계대배양한 후에도 신장 특이적 단백질의 발현이 유지되는 것을 보여준다.
2-3.
불멸화 신장 세포의 단백질 흡수능
불멸화 신장 세포의 단백질 흡수능 측정을 위해 알부민 흡수능을 측정하였다. Fluorescein으로 표지된 알부민을 4 또는 37℃에서 6시간 동안 세포와 함께 배양하였다. 세포를 빙냉 링거 용액(ice cold Ringers Solution)(pH 7.3)으로 8회 세척하고 1x MOPS 중 0.1 % Triton X-100로 용해시켰다. 형광은 485/520 nm에서 측정되었다(도 6).
2-4. 불멸화 신장 세포의 신독성 약물에 대한 반응
불멸화 신장 세포의 신독성 약물에 대한 반응성 측정을 위해, 시스플라틴 또는 시클로스포린(cyclosporine) A를 신장 스페로이드에 처리한 후, 사멸 세포의 수를 비교하였다.
세포에 각각의 약물을 처리한 후, two-color live/dead cell assay kit(Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 이용하여 세포 생존력을 측정하였다.
Calcein-AM(2 μM)과 ethdium homodimer-1(4 μM)을 세포에 첨가하고 37℃에서 10% CO2로 15 분간 배양하였다. PBS로 세척한 후, 형광 현미경(Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan) 하에서 세포를 시각화하였다. Calcein과 ethidium homodimer-1은 각각 녹색(485±10 nm) 및 적색(530±12.5 nm) 형광 필터를 사용하여 나타냈다(도 7).
2-5. 불멸화 신장 세포의 gamma-GT 활성도
불멸화 신장 세포의 GGT(gamma-GT) 활성 측정을 위해, GGT 활성 발색 분석 키트(BioVision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 gamma glutamyl-p-nitroanilide로부터 para-nitroanilide의 방출을 측정함으로써 측정하였다.
세포를 200 μL의 빙냉 GGT 분석 완충액에서 균질화하고 10 μL 분취액을 90 μL의 GGT 기질 용액과 합하고 5 시간 배양을 위해 분석 플레이트에 첨가하였다. 418 nm에서의 흡광도 변화는 37 ℃에서 30 분마다 측정되었다(도 8).
상기 결과는 실시예 1에서 제조된 불멸화 신장 세포에 화학적 및 기능적으로 신장 특이성이 있음을 보여주는 것으로, 상기 불멸화 신장 세포를 이용한 신독성 측정용 신장 스페로이드 제조가 가능함을 시사한다.
<실시예 2> 불멸화 신장 세포의 3D 세포 배양
상기 실시예 1에서 제조된 불멸화 신장 세포 1 X 104 개를 세포외기질 및 매트리겔(2:1 중량비)로 혼합한 겔 매트릭스에 혼합한 후, 50 μl씩 현적 배양(hanging-drop culture)을 수행하여 겔을 굳혔다.
현적 후, 겔을 PBS가 채워진 접시에 놓고 3 내지 6시간 동안 굳힌 후, 세포를 10 % FBS, 1X가 보충된 DMEM/F12로 채워진 스페로이드 형성 유닛(spheroid forming unit; SFU)으로 계대하였다. SFU는 대한민국 공개특허 제10-2017-0034241호에 따라 제조된, 필터가 장착된 캡이 있는 코니칼 튜브(cornical tube)이다. 1x의 ITS(10ug/mL insulin-5.5ug/mL transferrin-67ng/mL selenium), 20ng/mL 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF), 100nM dexamethasone, 5μM all-trans retinoic acid를 6 시간 동안 처리 하고, 2 내지 5 일 동안 배양하였다(도 9).
3D 배양에 따른 불멸화 신장 세포의 신장 특징을 평가하기 위해, 신장 특이적 유전자의 발현량을 2D 배양한 불멸화 신장세포와 비교하였다.
하기 표 2의 프라이머를 이용하여, 실험예 1과 동일한 방법으로 신장 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin, Nephrin 등의 발현을 확인하였다(도 9).
프라이머의 발현량은 2D 배양한 불멸화 신장 세포의 발현량을 1로 설정하고 그에 비해 3D 배양한 불멸화 신장 세포의 mRNA의 양을 측정하였다.
| 유전자 | 프라이머 서열 (정방향) | 프라이머 서열 (역방향) |
| Oct1 | GACGCCTGGAAAGTGGACC (서열번호 15) |
GCAACATGGATGTATAGTCTGG (서열번호 16) |
| Oct2 | CCAGTGCATGAGGTATGAGGT (서열번호 17) |
CTGAAACAGGTCCAGCATCCA (서열번호 18) |
|
Oat1
|
CTGATGGCTTCCCACAACAC (서열번호 19) |
GTCCTTGCTTGTCCAGGGG (서열번호 20) |
|
Oat2
|
CAACTGCGGAATCTGGTGCT (서열번호 21) |
ATCAGGCAGGGCACAATGATG (서열번호 22) |
| Oat3 | ATGACCTTCTCCGAGATTCTGG (서열번호 23) |
GTGGTTGGCTATTCCGAGGAT (서열번호 24) |
| Ent2 | TCTCAGGCTCCAACTCAGGA (서열번호 25) |
CCGTCAGCCAGATCTTCCG (서열번호 26) |
| Oatp4c1 | AATCAGAATGGGGGTTCGCA (서열번호 27) |
GAGACACTGGGGGTGAAAGC (서열번호 28) |
| Mrp1 | GCACCTATGCCAACGCTGAG (서열번호 29) |
AGACGAGTTGCTGAGATGCC (서열번호 30) |
| Pept1 | CCGGCACACCCTTCTAGTG (서열번호 31) |
TGGCGTTGTGACTGGTGAC (서열번호 32) |
| Pept2 | AAAGCGACAACATTGGCTAGA (서열번호 33) |
AAATCCCAAATCGCCATCCAT (서열번호 34) |
| Urat1 | CGATGTTCTTCTGGCCGTCT (서열번호 35) |
TGGTCGTAAACCCAGCCATC (서열번호 36) |
| Ent1 | CGGGTTTGAAAGCGCTCG (서열번호 37) |
GGTGACTGGTTGTCATGGCT (서열번호 38) |
| Mate1 | CATGGAACGCACGGAGGAGT (서열번호 39) |
CATCATCAGCTGGGCCAAGAA (서열번호 40) |
| p-Gp | GGACTTTGCAGAGGAAACCG (서열번호 41) |
TGTCCAGCCAACCTGCATAA (서열번호 42) |
| Mrp2 | CTGGAAATCACGATGGACGA (서열번호 43) |
GAAAGCCCAAGGGAATCCACA (서열번호 44) |
도 9를 참고하면, 현적 배양 후 회전 배양에 따라 제조된 3D 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현량은 2D 배양된 신장 세포에 비해 현저히 우수함을 알 수 있다.
다만, 단순히 현적 배양 후 회전 배양을 실시한 신장 세포는 신장 특이적 유전자의 발현량은 증가하였으나, 신장의 약물 대사에서 중요한 역할을 수행하는 수송체 유전자의 발현은 증가하지 않았다. 이는 단순히 현적 배양후 회전배양으로 제조된 불멸화 신장 세포로는 신장 특이성이 나타나더라도 신독성 검사에 이용하기엔 부족하다는 것을 의미한다.
<실시예 3> 신장 스페로이드 제작
신독성 검사에 이용할 수 있는 신장 스페로이드를 제조하기 위해, 본 발명의 발명자들은 실시예 2의 배양 방법을 변형하여 신장 스페로이드를 제작하였다(도 10).
상기 실시예 1의 불멸화 신장 세포 1 X 106 개를 세포외기질 및 매트리겔(2:1 중량비)로 혼합한 겔 매트릭스에 혼합한 후 50 μl씩 현적 배양(hanging-drop culture)을 수행하여 gel을 굳혔다.
현적 후, 겔을 PBS가 채워진 접시에 놓고 3 내지 6시간 동안 굳힌 후, 세포를 10 % FBS, 1X가 보충된 DMEM/F12로 채워진 스페로이드 형성 유닛(spheroid forming unit; SFU)으로 배양하였다. SFU는 대한민국 공개특허 제10-2017-0034241호에 따라 제조된, 필터가 장착된 캡이 있는 코니칼 튜브(cornical tube)이다. 배양 2일 째에 10% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배양액에 1X ITS(10ug/mL insulin-5.5ug/mL transferrin-67ng/mL selenium), 20ng/mL 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF), 100nM 덱사메타손(dexamethasone), 20nM 비타민 D3, 5μM all-trans retinoic acid를 6 시간 동안 처리 한 후, all-trans retinoic acid를 제거한 동 배지에서 2 내지 5 일 동안 배양하였다.
레티노이드산은 배양 2일째에 배양액에 추가하였다. 레티노이드산 처리 시간은 2시간에서 5일일 수 있으며, 배양 2일째부터 5일재까지 각각 또는 지속적으로 처리할 수 있다. 배양 2일째에 6시간 처리하고 제외하는 조건이 가장 좋은 구조적 성숙 및 유전자와 단백질의 발현 양상을 보였으며 배양 2일째부터 지속적으로 처리하는 경우 세포의 생장이 감소하고 세포의 사멸이 증가하는 것으로 보였다.
3 내지 5일 회전 배양한 후, 제조된 신장 스페로이드의 기능성을 분석하였다.
상기 실시예 3의 스페로이드 제조 방법은 도 10의 A에 도식화되었으며, 도 10을 참고하면, 실시예 3에 의해 제조된 스페로이드는 신장 오가노이드와 유사한 형태로 제조되었다.
<실험예 3> 신장 스페로이드의 신장 특이성 및 기능성 확인
상기 제조된 신장 스페로이드의 신장 특이성을 평가하기 위해 신장 특이적인 단백질, 유전자 및 수송체 단백질의 발현을 확인하였다
또한, 신장 스페로이드의 기능성을 확인하기 평가하기 위해, 신장 특이적 수송체 유전자의 발현, 신장 관련 호르몬에 대한 반응성, gamma-GT 활성도 및 신독성 약물인 시스플라틴 및 시클로스포린 A에 대한 반응을 확인하였다.
3-1. 신장 스페로이드의 신장 특이적 단백질 발현
신장 스페로이드의 신장 특이적 단백질의 발현을 확인하기 위해, LTL, PNA, AQP2, Podocin 및 Nephrin을 염색한 후, 전자 현미경으로 확인하였고, H&E 염색을 통해 신장 특이적 구조를 확인하였다(도 11).
도 11을 참고하면, 신장 스페로이드에서 신장 특이적 성숙된 구조가 확인되었으며, LTL, PNA, AQP2, Podocin 및 Nephrin의 발현이 확인되었다.
상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드가 구조적/기능적으로 성숙되었음을 시사한다.
3-2. 신장 스페로이드의 신장 특이적 유전자 발현
신장 스페로이드의 신장 특이적 유전자의 발현을 확인하기 위해, 신장 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin 및 Nephrin의 발현을 확인하였다(도 12).
도 12을 참고하면, 신장 스페로이드에서 신장 특이적 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin 및 Nephrin의 발현이 2D 배양한 신장 세포에 비해 높은 수준으로 발현되었다.
상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 2D 배양한 신장 세포에 비해 신장 특이성이 우수하다는 것을 시사한다.
3-3. 신장 스페로이드의 신장 특이적 수송체 유전자 발현
신장 스페로이드의 신장 특이적 수송체 유전자의 발현을 확인하기 위해, 상기의 프라이머 세트를 이용하여 수송체 유전자의 발현을 측정하였다(도 13).
도 13을 참고하면, 신장 스페로이드에서 신장 특이적 수송체 유전자의 발현이 2D 배양한 신장 세포에 비해 높은 수준으로 발현되었다.
상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 2D 배양한 신장 세포에 비해 신장 수송체 단백질의 발현이 우수함을 의미하며, 신장 기능성이 향상되었다는 것을 시사한다.
3-4. 신장 스페로이드의 신장 관련 호르몬에 대한 반응성 및 Gamma-GT 활성도
신장 스페로이드의 신장 관련 호르몬에 대한 반응성 측정을 위해, 부갑상선 호르몬(PTH)에 대한 반응을 측정하였다. PTH는 Prospec(New Brunswick, NJ, USA)에서 입수하였다. 포스포디에스테라아제 억제제인 3-이소부틸-1-메틸잔틴 0.1 mM과 함께 밤새 인큐베이션 한 후, 세포를 100 nM PTH로 30분 동안 처리하였다. 세포 내 cAMP는 cAMP 직접 EIA 키트를 사용하여 측정하였다.
Gamma-GT의 활성은 GGT 활성 발색 분석 키트(BioVision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 gamma glutamyl-p-nitroanilide로부터 para-nitroanilide의 방출을 측정함으로써 측정하였다.
스페로이드를 200 μL의 빙냉 GGT 분석 완충액에서 균질화하고 10 μL 분취 액을 90 μL의 GGT 기질 용액과 합하고 5 시간 배양을 위해 분석 플레이트에 첨가하였다. 418 nm에서의 흡광도 변화는 37 ℃에서 30 분마다 측정되었다
도 14 및 15를 참고하면, 신장 스페로이드에서 신장 관련 호르몬인 부갑상샘호르몬(parathyroid hormone; PTH)에 대한 반응성 및 gamma-GT 활성 2D 배양한 신장 세포에 비해 높은 수준이 확인되었다.
상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 2D 배양한 신장 세포에 비해 부갑상샘호르몬에 대한 반응성이 현저히 우수함을 보여준다.
3-5. 신장 스페로이드의 단백질 흡수능
신장 스페로이드의 단백질 흡수능 측정을 위해, 알부민 흡수능을 측정하였다. Fluorescein으로 표지된 알부민을 4 또는 37℃에서 6시간 동안 세포와 함께 배양하였다. 세포를 빙냉 링거 용액(ice cold Ringers Solution)(pH 7.3)으로 8회 세척하고 1x MOPS 중 0.1 % Triton X-100로 용해시켰다. 형광은 485/520 nm에서 측정되었다.
도 16를 참고하면, 신장 스페로이드에서 Dextran 및 Albumin 단백질의 흡수가 2D 배양한 신장 세포에 비해 현저히 우수함을 알 수 있다.
상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 2D 배양한 신장 세포에 비해 단백질 흡수능이 우수함을 의미하며, 이는 신장 기능성이 향상되었다는 것을 시사한다.
<실험예 4> 신장 스페로이드의 신독성 약물 반응성
신장 스페로이드의 신독성 약물 반응성을 평가하기 위해, 실시예 3에서 제조된 신장 스페로이드에 시스플라틴 및 시클로스포린 A를 처리하고, 세포 사멸 정도, 관련 유전자 및 단백질의 발현 정도를 확인하였다.
4-1. 신독성 약물에 대한 사멸 신장 세포 계수
신독성 약물에 대한 신장 세포 사멸 정도를 비교하기 위해, 시스플라틴 및 시클로스포린 A 를 신장 스페로이드에 처리한 후, 사멸 세포의 수를 비교하였다.
세포에 각각의 약물을 처리한 후, two-color live/dead cell assay kit(Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 이용하여 세포 생존력을 측정하였다.
Calcein-AM(2 μM)과 ethdium homodimer-1(4 μM)을 세포에 첨가하고 37℃에서 10% CO2로 15 분간 배양하였다. PBS로 세척한 후, 형광 현미경(Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan) 하에서 세포를 시각화하였다. Calcein과 ethdium homodimer-1은 각각 녹색(485±10 nm) 및 적색(530±12.5 nm) 형광 필터를 사용하여 나타냈다.
도 17을 참고하면, 신장 스페로이드에 신독성 약물을 처리한 결과 신장 스페로이드의 세포가 사멸하였다. 또한, 도 18을 참고하면, 근위세뇨관의 마커인 LTL의 발현이 시스플라틴 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있다.
상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 신독성 약물에 대한 민감도가 우수함을 의미하며, 이는 본 발명의 신장 스페로이드가 신독성 약물 반응에 이용 가능함을 시사한다.
4-2. 신독성 약물 관련 유전자 발현
신장 스페로이드의 신독성 약물 관련 유전자의 발현을 확인하기 위해, 하기 표 3의 프라이머 세트를 이용하여 유전자 발현량을 측정하였다.
| 유전자 | 프라이머 서열 (정방향) | 프라이머 서열 (역방향) |
| Havcr1 | GCTGCTACTGCTCCTTGTGA (서열번호 45) |
TCTTCAGCTCGGGAATGCAC (서열번호 46) |
| Lcn2 | GCTGTCGCTACTGGATCAGA (서열번호 47) |
TGGCGAACTGGTTGTAGTCC (서열번호 48) |
| Clusterin | CCCAAAGGGGGTGTACTTGA (서열번호 49) |
GAATCTTCATGGCGTGGCCT (서열번호 50) |
도 19를 참고하면, 신장 스페로이드에 신독성 약물을 농도별로 처리함에 따라 신독성 관련 유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 신독성 약물에 대한 민감도가 우수함을 의미하며, 이는 본 발명의 신장 스페로이드가 신독성 약물 반응에 이용 가능함을 시사한다.
4-3. 신독성 약물 관련 단백질
신장 스페로이드의 신독성 약물 반응을 평가하기 위해, 신장 손상의 바이오마커로 알려진 KIM-1 및 NGAL 발현 양상을 면역조직화학 및 웨스턴블롯팅을 통해 확인하였다.
면역조직화학은 다음 기술된 방법으로 실시하였다. 2 % 한천 배지에 내장된 유기체를 10% 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 끼우고 두께 5μm로 절편하였다. 절편을 비특이적 결합을 차단하기 위해 실온에서 0.2%의 fish skin gelatin을 함유 한 2% bovine serum albumin에서 비특이적 결합을 차단하기 위해 1시간 동안 항온 배양하고, 4 ℃에서 일차 항체로 밤새 항온 처리 한 다음, 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 핵은 4',6'-diamidino-2-phenylindole으로 대조 염색하였다.
웨스턴블롯팅은 다음 기술된 방법으로 실시하였다. 세포를 방사 면역 침전 분석 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 및 0.1 % 소듐 도데실 설페이트)에서 용해시키고 15,000 xg에서 10분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거하였다. 소듐 도데실 설페이트에 5분간 가열하고, 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 단백질을 분해하고, polyvinylidene difluoride membranes(Millipore, Billerica, MA, USA)로 옮겼다. 막을 0.5 % Tween-20을 함유하는 PBS 중의 5 % 탈지유 중에서 실온에서 1 시간 동안 블로킹시켰다. 막을 적절한 1 차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 배양 한 다음, 실온에서 1 시간 동안 2 차 항체와 함께 배양하였다. 화학 발광 키트(Intron Biotech, Seoul, Korea, Millipore)로 단백질을 검출하였다.
도 20을 참고하면, 신장 스페로이드에 신독성 약물을 농도별로 처리함에 따라 신장 손상 바이오 마커의 발현이 비처리군에 비해 증가됨을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명의 신장 스페로이드에 신독성 약물을 처리함에 따라 세포 사멸, 관련 유전자 및 단백질이 증가됨을 확인하였으며, 이는 본 발명의 신장 스페로이드가 신독성 약물에 대한 반응성이 우수함을 시사한다.
<실험예 5> 신장 스페로이드의 수송체 매개 반응성
본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물 반응성이 신장 특이적 수송체와 관련이 있는지 평가하기 위해, 실시예 2에서 제조된 신장 스페로이드에 신장 세포내 흡수 및 배출에 관여하는 수송체 억제제인 시메티딘 및 베라파밀 을 처리하고, 시스플라틴 및 디곡신(digoxin)에 대한 반응성을 확인하였다.
시메티딘(cimetidine)은 흡수에 관여하는 대표적인 수송체인 OCT2의 저해제이고, 베라파밀(verapamil)은 배출에 관여하는 대표적인 수송체인 p-gp의 저해제이다.
수송체 억제제를 처리하는 것을 제외하고 신장 스페로이드의 약물 반응성은 실험예 3과 동일한 방법을 실시하였다.
도 21를 참고하면, 생쥐 유래의 신장 스페로이드의 흡수를 저해하면, 신독성 약물을 고농도로 처리하여도, 관련 유전자의 발현이 증가함에도 불구하고 세포 사멸이 크게 감소하였음을 알 수 있다.
또한, 신장 스페로이드의 배출을 저해하면, 신독성 약물을 저농도로 처리하여도 세포 사멸이 크게 증가하였다.
상기 결과는 본 발명의 신장 스페로이드는 신독성 약물에 반응하는 수송체의 발현을 증가할 뿐 아니라 수송체를 매개로 인한 약물 독성 반응을 보이는 것으로 사료된다. 이는 본 발명의 신장 스페로이드가 신독성 약물 반응을 보다 정확하게 예측할 수 있음을 시사한다.
상기 결과는, 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드에서 신독성 약물에 반응하는 수송체가 잘 발현될 뿐만 아니라, 상기 수송체에 매개로 인한 약물 독성 반응이 잘 나타나는 것을 보여준다.
따라서, 본 발명에 따른 신장 스페로이드의 제조 방법을 통해 보다 정확한 신독성 약물 반응 예측이 가능한 신장 유사체의 생성이 가능하다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> kidney spheroid and method of preparing the same
<130> P18-053-KRI
<160> 50
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCC-F
<400> 1
cctcaagcag gaaggtagcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NCC-R
<400> 2
tcactgttgg tgcctgtctc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKCC2-F
<400> 3
gagaagcggg aattggtctt g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NKCC2-R
<400> 4
ctccacctcc acgaacaaac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SGLT1-F
<400> 5
ctgcagacat cttctccggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SGLT1-R
<400> 6
ggcagtgatt gctagcagga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AQP1-F
<400> 7
ggcctttggt ttgagcatcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AQP1-R
<400> 8
ccggaggatg ctgatctgac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AQP2-F
<400> 9
ttcgagctgc cttctacgtg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AQP2-R
<400> 10
ggctgttgca ttgttgtgga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Podocin-F
<400> 11
ccgctgcatt gagaatggac 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Podocin-R
<400> 12
cggcctttgc cttcttgtca 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nephrin-F
<400> 13
cgaactgatg catgcaagaa gg 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nephrin-R
<400> 14
tacactagtg cgtggtctct 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oct1-F
<400> 15
gacgcctgga aagtggacc 19
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oct1-R
<400> 16
gcaacatgga tgtatagtct gg 22
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oct2-F
<400> 17
ccagtgcatg aggtatgagg t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oct2-R
<400> 18
ctgaaacagg tccagcatcc a 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oat1-F
<400> 19
ctgatggctt cccacaacac 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oat1-R
<400> 20
gtccttgctt gtccagggg 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oat2-F
<400> 21
caactgcgga atctggtgct 20
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oat2-R
<400> 22
atcaggcagg gcacaatgat g 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oat3-F
<400> 23
atgaccttct ccgagattct gg 22
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oat3-R
<400> 24
gtggttggct attccgagga t 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ent2-F
<400> 25
tctcaggctc caactcagga 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ent2-R
<400> 26
ccgtcagcca gatcttccg 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oatp4c1-F
<400> 27
aatcagaatg ggggttcgca 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oatp4c1-R
<400> 28
gagacactgg gggtgaaagc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mrp1-F
<400> 29
gcacctatgc caacgctgag 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mrp1-R
<400> 30
agacgagttg ctgagatgcc 20
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pept1-F
<400> 31
ccggcacacc cttctagtg 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pept1-R
<400> 32
tggcgttgtg actggtgac 19
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pept2-F
<400> 33
aaagcgacaa cattggctag a 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pept2-R
<400> 34
aaatcccaaa tcgccatcca t 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Urat1-F
<400> 35
cgatgttctt ctggccgtct 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Urat1-R
<400> 36
tggtcgtaaa cccagccatc 20
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ent1-F
<400> 37
cgggtttgaa agcgctcg 18
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ent1-R
<400> 38
ggtgactggt tgtcatggct 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mate1-F
<400> 39
catggaacgc acggaggagt 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mate1-R
<400> 40
catcatcagc tgggccaaga a 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p-Gp-F
<400> 41
ggactttgca gaggaaaccg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p-Gp-R
<400> 42
tgtccagcca acctgcataa 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mrp2-F
<400> 43
ctggaaatca cgatggacga 20
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mrp2-R
<400> 44
gaaagcccaa gggaatccac a 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Havcr1-F
<400> 45
gctgctactg ctccttgtga 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Havcr1-R
<400> 46
tcttcagctc gggaatgcac 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lcn2-F
<400> 47
gctgtcgcta ctggatcaga 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Lcn2-R
<400> 48
tggcgaactg gttgtagtcc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clusterin-F
<400> 49
cccaaagggg gtgtacttga 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Clusterin-R
<400> 50
gaatcttcat ggcgtggcct 20
Claims (9)
- (a) 스페로이드 형성 유닛(spheroid forming unit; SFU) 내 매트리겔(matrigel) 및 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 포함하는 3차원 배양 배지에 일차 신장 세포를 투여하는 단계;
(b) 상기 배양 배지에 레티노이드산, 덱사메타손, ITS(insulin-transferrin-selenium), 비타민 D3, 및 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF)로 구성된 신장 세포 성숙 인자를 더 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 배양 배지를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 신장 스페로이드의 제조 방법. - 제 1 항에 있어서, (a) 단계의 일차 신장 세포는 SV40 및 hTERT 유전자로 불멸화된 신장 유래 세포인 신장 스페로이드의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, (a) 단계의 3차원 배양 배지에서 세포외기질:매트리겔의 중량비는 2:1인 신장 스페로이드의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, (b) 단계의 레티노이드산은 배양 2일째에 첨가되는 것인 신장 스페로이드의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, (c) 단계는 현적 배양(hanging-drop culture)을 수행한 후 회전 배양을 수행하는 것인 신장 스페로이드의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서, (c) 단계의 3차원 배양은 2 내지 5 일 동안 수행되는 것인 신장 스페로이드의 제조 방법.
- 제 1 항의 방법에 따라 제조된 신장 스페로이드.
- 제 7 항의 신장 스페로이드를 포함하는 체외 신독성 검증용 조성물.
- 제 7 항의 신장 스페로이드를 포함하는 신장 유사체.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180078965A KR102094929B1 (ko) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | 신장 스페로이드 및 그의 제조 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180078965A KR102094929B1 (ko) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | 신장 스페로이드 및 그의 제조 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200005345A true KR20200005345A (ko) | 2020-01-15 |
| KR102094929B1 KR102094929B1 (ko) | 2020-03-30 |
Family
ID=69156774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180078965A KR102094929B1 (ko) | 2018-07-06 | 2018-07-06 | 신장 스페로이드 및 그의 제조 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102094929B1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023113203A1 (ko) * | 2021-12-13 | 2023-06-22 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법 |
| WO2023146292A1 (ko) * | 2022-01-28 | 2023-08-03 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Twist1 억제제를 유효성분으로 포함하는 신장 오가노이드 성숙도 향상용 조성물 |
| WO2024091043A1 (ko) * | 2022-10-26 | 2024-05-02 | 한국화학연구원 | 신장 근위 세뇨관 오가노이드, 신장암 오가노이드, 갑상선 오가노이드 또는 갑상선암 오가노이드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160005037A (ko) * | 2013-05-08 | 2016-01-13 | 리젠메드티엑스, 엘엘씨 | 단리된 신장 세포를 포함하는 오가노이드 및 이의 용도 |
-
2018
- 2018-07-06 KR KR1020180078965A patent/KR102094929B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160005037A (ko) * | 2013-05-08 | 2016-01-13 | 리젠메드티엑스, 엘엘씨 | 단리된 신장 세포를 포함하는 오가노이드 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SLAS Discovery, vol.22(5), pp.456~472(2017)* * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023113203A1 (ko) * | 2021-12-13 | 2023-06-22 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법 |
| WO2023146292A1 (ko) * | 2022-01-28 | 2023-08-03 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Twist1 억제제를 유효성분으로 포함하는 신장 오가노이드 성숙도 향상용 조성물 |
| WO2024091043A1 (ko) * | 2022-10-26 | 2024-05-02 | 한국화학연구원 | 신장 근위 세뇨관 오가노이드, 신장암 오가노이드, 갑상선 오가노이드 또는 갑상선암 오가노이드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물 평가 방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102094929B1 (ko) | 2020-03-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2021204404B2 (en) | Phenotype profile of human retinal progenitor cells | |
| WO2003027281A2 (fr) | Cellules souches totipotentes provenant des tissus intestinaux de muscle squelettique | |
| KR101966523B1 (ko) | 오가노이드 배양을 위한 조성물 및 방법 | |
| KR102094929B1 (ko) | 신장 스페로이드 및 그의 제조 방법 | |
| US9969978B2 (en) | Method for producing cardiomyocytes from human or mouse embryonic stem cells in a medium consisting of a serum-free medium and N2 supplement | |
| WO2015015655A1 (ja) | フックス角膜内皮ジストロフィ不死化細胞株およびその作製法 | |
| Wu et al. | Enrichment of female germline stem cells from mouse ovaries using the differential adhesion method | |
| Dominov et al. | Pro‐and anti‐apoptotic members of the Bcl‐2 family in skeletal muscle: a distinct role for Bcl‐2 in later stages of myogenesis | |
| KR20200083346A (ko) | 전신경화증 질환 모델 및 이의 용도 | |
| CN103842497A (zh) | 生物人工近端小管系统及使用方法 | |
| CN103966169A (zh) | 一种中国人舌部鳞状上皮细胞癌细胞系ctsc-1及其建立方法 | |
| WO2019189640A1 (ja) | 幹細胞由来涙腺組織の作製方法 | |
| Kittipassorn et al. | Characterization of the novel spontaneously immortalized rat Müller cell line SIRMu-1 | |
| Trisler et al. | Retinal engineering: engrafted neural cell lines locate in appropriate layers. | |
| TWI396737B (zh) | 豬胚幹細胞導向分化之方法及使用該細胞於藥物篩選之用途 | |
| US20120141984A1 (en) | Methods of isolating stem cells | |
| CN114317398B (zh) | Gli1和EpCAM基因共同标记的肝祖细胞群及其应用 | |
| CN115624616B (zh) | 接头蛋白pinch在诊断血管发育异常相关疾病中的应用 | |
| US20180236051A1 (en) | Method for producing embryonic-like stem cells from ticks (acari: ixodidae), composition, uses thereof and diagnostic methods | |
| KR20220095153A (ko) | 형질전환된 인간 간성상세포주 및 이의 용도 | |
| CN117050157A (zh) | 异体共生年轻化因子及其在延缓机体衰老中的应用 | |
| Begum et al. | An Optimized Protocol of Electroporation of Hepatocyte Nuclear Factor 1 Alpha (Hnf-1 α) in Mesenchymal Stem Cells | |
| KR20220067308A (ko) | 베체트 환자 신경병증 아바타 모델 | |
| CN114814232A (zh) | Rassf6作为阿尔茨海默病标志物的应用 | |
| CN116121191A (zh) | 一种人乳腺恶性叶状肿瘤细胞系sysh-mpt-04及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |