KR20090122946A - 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하기 위한 세포투과성 ｎａｎｏｇ 및 ｏｃｔ４의 병합 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카포시 섬유아세포성장인자 4 (kFGF4)-유래 거대분자 전달 도메인 (MTD)을 포함하는 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 기술한다. 또한 상기 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 세포에 상기 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 병합하여 처리하여 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하는 방법, 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하기 위한 상기 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 병합 용도가 기술된다.

거대분자 전달 도메인, Nanog, Oct4, 줄기세포

Description

줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하기 위한 세포투과성 ＮＡＮＯＧ 및 ＯＣＴ４의 병합 용도{COMBINED USE OF CELL PERMEABLE NANOG AND OCT4 FOR INCREASING SELF-RENEWAL AND SUPPRESSING DIFFERENTIATION OF STEM CELLS}

본 발명은 줄기세포의 자가-재생 (self-renewal)을 촉진하고 분화를 억제하기 위한 세포투과성 Nanog (CP-Nanog) 및 세포투과성 Oct4 (CP-Oct4) 재조합 단백질의 병합 용도에 관한 것이다.

줄기세포는 모든 다세포성 유기체에서 발견되는 세포이다. 이들은 유사 세포분열을 통해 스스로 재생할 수 있는 능력이 있고 다양한 범위의 특정화된 세포 유형으로 분화할 수 있다. 줄기세포의 고전적인 정의는 이것이 두 가지 특성, 즉 자가-재생 및 잠재능을 보유하는 것을 요구한다. 자가-재생은 미분화된 상태를 유지하면서 수많은 주기의 세포분열을 거칠 수 있는 능력으로서 정의되는 반면, 잠재능은 특정화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 역량이다. 엄격한 의미에서, 다중분화성(multipotent) 또는 단일분화성(unipotent) 전구세포가 종종 줄기세포로 언급된다고 하더라도, 이는 줄기세포가 전능성(totipotent) 또는 다능성(pluripotent) 이 되는, 즉 임의의 천연 세포 유형을 발생시킬 수 있 것을 요구한다.

포유동물 줄기세포의 2가지 큰 유형은 포배 (blastocysts)에서 발견되는 배아 줄기세포와, 성체 조직에서 발견되는 성체 줄기세포이다.

배아 줄기 (ES) 세포는 포배 또는 초기 상실기 배아의 내부세포괴 (ICM)의 외배엽 조직으로부터 유래한다. ES 세포는 다능성이고 발달 동안에 3종의 일차배엽, 즉 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 모든 유사체를 발생시킨다. 따라서, ES 세포는 특정 세포 유형에 대한 충분하고 필요한 자극이 주어지면 성체의 200종 이상의 세포 유형의 각각으로 발달할 수 있다.

인간 배아 줄기세포는 여러 전사인자 및 세포 표면 단백질의 존재에 의해 정의된다. 전사인자인 Oct4, Nanog, 및 SOX2는 다능성의 분화 및 유지를 초래하는 유전자의 억제를 보증하는 핵심 조절 네트워크를 형성한다.

성체 줄기세포는 조직 또는 기관 내 분화된 세포들 중에서 발견되는 미분화된 세포이다. 성체 줄기세포는 스스로 재생할 수 있고 조직 또는 기관의 주요 특정화된 세포 유형을 양산하도록 분화할 수 있다. 살아있는 유기체에서 성체 줄기세포의 일차적인 역할은 이들이 발견되는 조직을 유지하고 복구하는 것이다. 상당한 성체 줄기세포 연구는 무기한으로 분열하거나 자가-재생하는 이들의 능력 및 이들의 분화 잠재능을 연구하는데 집중되어 왔다. 마우스에서, 다능성 줄기세포는 성체 섬유아세포 배양으로부터 직접적으로 생성된다.

배아 줄기세포 잠재능은 검사되지 않은 상태로 남아있지만, 성체 줄기세포 치료는 골수 이식을 통한 백혈병 및 관련된 골/혈액 암을 성공적으로 치료하는데 수년간 사용되고 있다. 성체 줄기세포의 생산이 배아의 파괴를 요구하지 않기 때문에 연구 및 요법에 있어 성체 줄기세포의 사용은 배아 줄기세포와 같이 논쟁적이지는 않다.

한편, 포유동물 배아 발달 동안에, 초기 세포 분화는 밀집 (compaction) 및 포배 형성 동안에 쉽게 관찰 가능해진다. 이 시점에, ES 세포는 2개의 개별적인 발달 경로, 즉, 배아밖 (extraembryonic) 조직을 발생시키는 영양배엽세포 (trophectoderm, TE)와, 배아의 뚜렷한 배엽을 발생시키는 내세포괴 (ICM)를 책임지게 된다. 세포 분화의 이러한 과정은 세포 운명의 결정에 관여하는 전사인자, 자가분비 및 주변분비 신호전달에 관여한 사이토카인, 및 세포 형태 및 생리에 관여하는 기타 구조 및 기능성 단백질을 포함하는, 유전자 및 단백질 발현에 있어서의 뚜렷한 변경을 특징으로 한다.

초기 배아 발생에 있어 이 중요한 시점에 세포 운명의 결정에 관여하는 전사인자의 증가된 개수가 확인되었다. 이러한 전사인자의 2종, Oct4 및 Nanog는 ICM 및 ES 세포에서 다능성 및 자가-재생을 유지하기 위해 협력하여 작용하는 것으로 생각된다.

POU 팔합체 (octamer)-결합 도메인 전사인자인 Oct4는 포유동물 배아 발생에 결정적인 것으로 알려져 있다. Oct4 단백질은 ICM 및 TE 모두에서 초기 포배기에서 발현된다. 그러나 이 발현은 TE에서는 신속하게 하향-조절되고 일반적으로 확장된 포배기에 의해 ICM 세포로 제한된다.

Oct4는 생체 내 및 시험관 내 모두에서, 세포 계통 다능성을 확립하고 유지 하는데 결정적인 역할을 담당하는 것으로 입증되었다. Oct4의 결손은 임신 3.5일째에 마우스에서 초기 치사를 초래한다. 다능성 ICM은 형성되지 않고 세포는 TE 계통으로 분화한다. 마우스 ES 세포에서 Oct4의 조건부 억제는 또한 영양막 계통으로의 분화를 초래하는 반면, 과발현은 원시 내배엽으로의 분화를 초래한다. 이러한 연구는 Oct4의 발현 수준이 세포 계통의 결정에 중요한 요인이었음을 제시한다. Oct4가 ICM 다능성의 유지에 요구되고, 부분적으로는, 마우스에서 영양막 계통을 억제함으로써 작용하는 것이 또한 제안되었다.

신규 호메오박스 유전자인 Nanog의 발현이 마우스에서 초기 배아형성 동안에 보고되었다. Nanog 역시 마우스 ICM 및 ES 세포의 자가-재생 및 다능성 유지에 중요한 역할을 담당한다. Nanog 유전자의 결손은 배아 치사를 의미하고 ICM 및 ES 세포 모두에서 다능성의 상실을 초래한다. Nanog 결핍 ICM (Nanog -/-) 및 ES 세포는 배아밖 내배엽으로 분화한다. Nanog 단백질은 상실기와 같은 초기에 검출되었다. 놀랍게도, Nanog는 내부 무극 (apolar) 세포 내에서 강력하게 발현되었지만, 후기 상실배의 외부 무극 세포에서는 약하게 발현되거나 발현되지 않았다. 포배기에서, Nanog는 ICM에서만 발현되었고 TE에서는 발현되지 않았다.

요약하면, Oct4 및 Nanog는 ICM 및 ES 세포의 자가-재생 및 다능성에 필수적인 인자이다. 이러한 사실을 근거로, 본 발명자들은 미분화된 상태로 자가-재생 능력 및 다능성을 유지하는 줄기세포를 확립하는 것을 목표로 연구하였다. 그 결과, 본 발명자들은 세포투과성을 갖도록 유전적으로 조작된 Nanog 및 Oct4로 이들을 병합하여 처리함으로써 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하는 방법 을 개발하였다.

기술적 해결과제

본 발명은 세포투과성을 갖는 거대분자 전달 도메인 (MTD) 및 인간 전사인자 Nanog를 포함하고, 상기 MTD가 인간 Nanog 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합되어 있는 세포투과성 Nanog (CP-Nanog) 재조합 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 세포투과성을 갖는 MTD 및 인간 전사인자 Oct4를 포함하고, 상기 MTD가 인간 Oct4 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합되어 있는 세포투과성 Oct4 (CP-Oct4) 재조합 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질 각각을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 상기 단리된 폴리뉴클레오티드 각각을 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킴으로써 수득될 수 있는 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질 각각을 높은 수준으로 생산할 수 있는 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질 각각을 높은 수준으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하기 위한 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 복합 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 병합하여 줄기세포를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 병합하여 줄기세포를 처리하는 단계를 포함하는 자가-재생 능력 및 분화 잠재능을 유지하는 다능성 줄기세포를 확립하는 방법에 관한 것이다.

유리한 효과

본 발명의 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질은 Nanog 및 Oct4를 줄기세포 내로 도입할 수 있고, 그로써, 상기 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질은 환자-특이적 또는 개인 맞춤형 (personally tailored) 줄기세포 요법에 유용한 자가-재생 능력 및 분화 잠재능을 유지하는 다능성 줄기세포주의 확립에 효과적으로 사용될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 세포투과성을 갖는 거대분자 전달 도메인 (MTD)을 Nanog 및 Oct4에 각각 융합시켜 달성되는, 줄기세포의 자가-재생 및 다능성을 유지하는데 필수적인 핵심 전사인자인 Nanog 및 Oct4가 세포투과성을 갖도록 유전적으로 조작하는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 본 발명은 카포시 섬유아세포 성장인자 4 (kaposi fibroblast growth factor-4, kFGF4)-유래 MTD 및 전사인자 Nanog 또는 그의 단편을 포함하고, 상기 kFGF4-유래 MTD가 전사인자 Nanog의 N-말단, C-말단, 또는 양쪽 모두에 융합되어 있는 세포투과성 Nanog (CP-Nanog) 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 kFGF4-유래 MTD 및 전사인자 Oct4 또는 그의 단편을 포함하고, 상기 kFGF4-유래 MTD가 전사인자 Oct4의 N-말단, C-말단, 또는 양쪽 모두에 융합되어 있는 세포투과성 Oct4 (CP-Oct4) 재조합 단백질을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "거대분자 전달 도메인 (MTD)"은 세포막을 가로지르는 생물학적 활성 분자의 횡단을 용이하게 하는 펩티드를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포투과성 재조합 단백질"은 거대분자 전달 도메인 (MTD)과 생물학적 활성 분자 또는 그의 단편을 포함하고, 이들이 유전적 융합, 화학적 연결 비-공유 연합에 의해 또는 달리 기능적으로 연결되는 공유 결합 복합체를 지칭한다.

Nanog는 미분화된 배아 줄기세포의 자가-재생에 결정적으로 관여하는 전사인자이다. 인간 Nanog 단백질 (등재번호 NP_079141)은 세포의 핵 성분에 국소화되는 보존된 호메오도메인 모티프 (homeodomain motif)를 갖는 305개 아미노산 단백질이다. 상기 호메오도메인은 DNA 결합을 용이하게 만든다. 인간 Nanog 단백질에는 N-말단 도메인, 호메오도메인, 및 C-말단 도메인이 존재한다. 생쥐 Nanog와 같이, 인간 Nanog의 N-말단 도메인은 세린, 트레오닌, 및 프롤린이 풍부한 반면, C-말단 영역은 트립토판 반복을 포함한다.

인간 Nanog 단백질은 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 1로 표시되는 염기서열을 갖는다.

Oct4는 미분화된 배아 줄기세포의 자가-재생에 결정적으로 관여하는 POU 패밀리의 호메오도메인 전사인자인다. Oct4는 POU 패밀리 구성원의 특징이며 N-말단 및 C-말단 전이활성 도메인 모두를 갖는 이분 (bipartite) DNA-결합 POU 도메인으로 구성된다. 상기 N-말단 도메인은 프롤린-풍부 전이활성 도메인으로 분류되는 반면, C-말단 도메인은 비록 높은 프롤린 함량을 가진다고 하더라도 세린/트레오닌-풍부 전이활성 도메인이다.

인간 Oct4 단백질은 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 3으로 표시되는 염기서열을 갖는다.

본 발명은 전사인자 Nanog 및 Oct4를 세포막을 통과하여 세포 내로 전달할 수 있는 거대분자 전달 도메인으로서 카포시 섬유아세포 성장인자 4 (kFGF4)-유래 MTD를 사용한다. 본 발명의 kFGF4-유래 MTD는 서열번호: 8로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 7로 표시되는 염기서열을 갖는다.

먼저, 본 발명의 세포투과성 Nanog 재조합 단백질은 kFGF4-유래 MTD, SV40 거대 T 항원 유래 핵 국소화 서열 (NLS; 서열번호: 8), 용이한 정제를 위한 히스티틴-표지 (His-Tag), 및 전사인자 Nanog 또는 그의 단편을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 kFGF4-유래 MTD를 이용하여 3종의 전장 형태 및 5종의 결절 형태의 세포투과성 Nanog 재조합 단백질을 제작한다 (도 1 참고).　

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전장 형태 Nanog"는 전사인자 Nanog의 전체 N-말단 도메인, 호메오도메인, 및 트립토판 반복을 포함하는 구조물을 지칭하는 반면, 용어 "결절 형태 Nanog"는 그의 N-말단 도메인, 호메오도메인, 및 C-말단 도메인의 임의의 하나 이상이 결손된 구조물을 지칭한다.

도 1을 참고로 하여, 전장 형태의 세포투과성 Nanog 재조합 단백질은 하기와 같다:

1) kFGF4-유래 MTD가 전장 Nanog의 N-말단에 융합되어 있는 His-MTD-Nanog (HMN);

2) kFGF4-유래 MTD가 전장 Nanog의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog-MTD (HNM); 및

3) kFGF4-유래 MTD가 전장 Nanog의 양쪽 말단 모두에 융합되어 있는 His-MTD-Nanog-MTD (HMNM),

상기에서 His-tag 및 SV40 거대 T 항원 유래 NLS가 모든 구조물의 N-말단에 공유적으로 결합되어 있음.

상기에 기술된 바와 같은 세포투과성 Nanog 재조합 단백질의 전장 형태에서, His-MTD-Nanog (HMN)는 서열번호: 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 19로 표시되는 염기서열을 가지며; His-Nanog-MTD (HNM)는 서열번호: 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 20으로 표시되는 염기서열을 가지며; His-MTD-Nanog-MTD (HMNM)는 서열번호: 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 21로 표시되는 염기서열을 갖는다.

또한, 결절 형태의 세포투과성 Nanog 재조합 단백질은 하기와 같다:

1) kFGF4-유래 MTD가 호메오도메인 및 트립토판 반복이 결손된 Nanog N-말단 도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog N-말단-MTD (HNNM);

2) kFGF4-유래 MTD가 N-말단 및 C-말단 도메인이 결손된 Nanog 호메오도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog 호메오도메인-MTD (HNHM);

3) kFGF4-유래 MTD가 N-말단 도메인 및 호메오도메인이 결손된 Nanog C-말단 도메인의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog C-말단 MTD (HNCM);

4) kFGF4-유래 MTD가 C-말단 도메인이 결손된 Nanog N-말단 도메인 및 호메오도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog N-말단-호메오도메인-MTD (HNNHM); 및

5) kFGF4-유래 MTD가 N-말단 도메인이 결손된 Nanog 호메오도메인 및 C-말단 도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog 호메오도메인-C-말단-MTD (HNHCM),

상기에서 His-tag 및 SV40 거대 T 항원 유래 NLS가 모든 구조물의 N-말단에 공유적으로 결합되어 있음.

상기에 기술된 바와 같은 세포투과성 Nanog 재조합 단백질의 결절 형태에서, His-Nanog N-말단-MTD (HNNM)는 서열번호: 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 22로 표시되는 염기서열을 가지며; His-Nanog 호메오도메인-MTD (HNHM)는 서열번호: 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 23으로 표시되는 염기서열을 가지며; His-Nanog C-말단 MTD (HNCM)는 서열번호: 15로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 24로 표시되는 염기서열을 가지며; His-Nanog N-말단-호메오도메인-MTD (HNNHM)는 서열번호: 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 25로 표시되는 염기서열을 가지며; His-Nanog 호메오도메인-C-말단-MTD (HNHCM)는 서열번호: 17로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 26으로 표시되는 염기서열을 갖는다.

세포투과성 Nanog 재조합 단백질의 대조군으로서, 전장 Nanog가 kFGF4-유래 MTD 없이, SV40 거대 T 항원 유래 핵 국소화 서열 (NLS) 및 히스티딘-표지 (His-Tag)에만 융합되어 있는 His-Nanog (HN)를 제작한다. 상기 대조군 단백질은 서열번호: 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 18로 표시되는 염기서열을 갖는다.

이어서, 본 발명의 세포투과성 Oct4 재조합 단백질은 kFGF4-유래 MTD, SV40 거대 T 항원 유래 핵 국소화 서열 (NLS)(서열번호: 8), 용이한 정제를 위한 히스티딘-표지 (His-Tag), 및 전사인자 Oct4로 구성된다.

본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 kFGF4-유래 MTD를 이용하여 3종의 전장 형태의 세포투과성 Oct4 재조합 단백질을 제작한다 (도 2 참고).　

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전장 형태 Oct4"는 전사인자 Oct4의 전체 프롤린 풍부 영역, POU 특이적 도메인, 및 호메오도메인을 포함하는 구조물을 지칭하는 반면, 용어 "결절 형태 Oct4"는 그의 프롤린 풍부 영역, POU 특이적 도메인, 및 호메오도메인의 임의의 하나 이상이 결손된 구조물을 지칭한다.

도 2를 참고로 하여, 전장 형태의 세포투과성 Oct4 재조합 단백질은 하기와 같다:

1) kFGF4-유래 MTD가 전장 Oct4의 N-말단에 융합되어 있는 His-MTD-Oct4 (HMO);

2) kFGF4-유래 MTD가 전장 Oct4의 C-말단에 융합되어 있는 His-Oct4-MTD (HOM); 및

3) kFGF4-유래 MTD가 전장 Oct4의 양쪽 말단 모두에 융합되어 있는 His-MTD-Oct4-MTD (HMOM),

상기에서 His-tag 및 SV40 거대 T 항원 유래 NLS가 모든 구조물의 N-말단에 공유적으로 결합되어 있음.

상기에 기술된 바와 같은 세포투과성 Oct4 재조합 단백질의 전장 형태에서, His-MTD-Oct4 (HMO)는 서열번호: 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 32로 표시되는 염기서열을 가지며; His-Oct4-MTD (HOM)는 서열번호: 29로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 33으로 표시되는 염기서열을 가지며; His-MTD-Oct4-MTD (HMOM)는 서열번호: 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 34로 표시되는 염기서열을 갖는다.

세포투과성 Oct4 재조합 단백질의 대조군으로서, 전장 Oct4가 kFGF4-유래 MTD 없이, SV40 거대 T 항원 유래 핵 국소화 서열 (NLS) 및 히스티딘-표지 (His-Tag)에만 융합되어 있는 His-Oct4 (HN)를 제작한다. 상기 대조군 단백질은 서열번호: 27로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 31로 표시되는 염기서열을 갖는다.

또한, 본 발명은 상기에 기술된 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터를 이용하여 숙주세포를 형질감염시킴으로써 수득될 수 있는, 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질 각각을 높은 수준으로 생산할 수 있는 형질전환체를 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현벡터"는 생체 내 (in vivo) 또는 시험관 내 (in vitro) 발현을 할 수 있는 구조물을 의미한다. 바람직하게는, 발현벡터는 적합한 숙주 유기체의 게놈 내로 도입된다.

용어 "도입된"은 바람직하게는 게놈 내로의 안정한 도입을 포함한다.

본 발명의 염기서열은 적합한 숙주 유기체에 의해 상기 염기서열의 발현을 제공할 수 있는 조절서열에 염기서열이 작동적으로 연결되는 벡터 내에 존재할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 벡터는 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 하기에 기술된 바와 같은 적합한 숙주세포 내로 형질전환될 수 있다.

벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 또는 파아지 벡터의 선택은 종종 그것이 도입되는 숙주세포에 좌우될 것이다. 본 발명에 사용하기 위한 벡터는 하나 이상의 선별가능 마커 유전자, 예컨대 항생제 내성을 부여하는 유전자, 예를 들어 암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜, 또는 테트라사이클린 내성을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.

벡터는 예를 들어, RNA의 생산을 위해 시험관 내에서 사용될 수 있고, 또는 숙주세포를 형질감염, 형질전환, 형질도입 또는 감염시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 복제가능 벡터 내로 도입하고, 상기 벡터를 합당한 숙주세포 내로 도입하고, 상기 숙주세포를 벡터의 복제를 유도하는 조건 하에서 성장시킴으로써 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 벡터는 문제의 숙주세포 내에서 벡터가 복제할 수 있게 하는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예시에는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1, 및 pIJ702의 복제 기원이 포함된다.

일부 적용에서, 본 발명에 사용하기 위한 염기서열은 선정된 숙주세포에 의해서와 같이, 상기 염기서열의 발현을 제공할 수 있는 조절서열에 작동적으로 연결된다. 예를 들면, 본 발명은 이러한 조절서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 염기서열을 포함하는 벡터를 포함하는데, 즉 이 벡터가 발현벡터이다.

용어 "작동적으로 연결된"은 기술된 구성요소들이 그들의 의도된 방식으로 이들이 기능하게 하는 것을 허용하는 관계 내에 있는 병렬 (juxtaposition)을 지칭한다. 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 조절서열은 상기 코딩 서열의 발현이 대조군 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 달성되는 그러한 방식으로 연결된다.

용어 "조절서열"은 프로모터, 인핸서, 및 기타 발현 조절 신호를 포함한다.

용어 "프로모터"는 당해 분야의 주지기술 내에서, 예를 들어 RNA 중합효소 결합 부위로 사용된다.

본 발명의 세포투과성 재조합 단백질을 암호화하는 염기서열의 증강된 발현이 또한 이종 조절 영역, 예를 들어, 프로모터, 분비 선도자 및 종결 영역의 선택에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 염기서열은 적어도 프로모터에 작동적으로 연결된다. 세균, 진균 또는 효모 숙주 내에서 염기서열의 전사를 지시하는데 적합한 벡터의 예시는 당해 분야에 잘 알려져 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 His-tag 서열을 포함하여 세포투과성 재조합 단백질의 N-말단에 6개의 히스티딘 잔기를 융합시킴으로써 1-단계 정제를 가능케 하는 pET-28a(+) 벡터 (Novagen, USA) 내로 클로닝된다.

따라서, 상기 발현벡터 내에서 발현된 세포투과성 재조합 단백질은 kFGF4-유래 MTD가 전장 또는 결절된 Nanog 또는 Oct4에 융합되고, His-tag 및 NLS가 그의 N-말단에 연결된 구조를 갖는다.

세포투과성 Nanog 재조합 단백질을 발현하기 위해 이렇게 제작된 발현벡터는 각각 pET28a(+)-HMN, pET28a(+)-HNM, pET28a(+)-HMNM, pET28a(+)-HNNM, pET28a(+)-HNHM, pET28a(+)-HNCM, 및 pET28a(+)-HNHCM으로 명명된다. 또한, 세포투과성 Oct4 재조합 단백질을 발현하기 위한 발현벡터는 각각 pET28a(+)-HMO, pET28a(+)-HOM, 및 pET28a(+)-HMOM으로 명명된다.

이들 중에서, His-Nanog-kFGF4-유래 MTD 구조물을 포함하는 발현벡터 pET28a(+)-HNM; His-kFGF4-유래 MTD 구조물-Oct4를 포함하는 pET28a(+)-HMO; His-Oct4-kFGF4-유래 MTD 구조물을 포함하는 pET28a(+)-HOM; 및 His-kFGF4-유래 MTD-Oct4-kFGF4-유래 MTD 구조물을 포함하는 pET28a(+)-HMOM을 각각 한국생명공학연구원 (KRIBB, 대한민국 305-333, 대전시 유성구 어은동 52 소재) 내 유전자은행 (KCTC)에 기탁번호 KCTC 11278BP, KCTC 11279BP, KCTC 11280BP 및 KCTC 11281BP로 기탁하였다. 본원에 언급되는 모든 기탁은 부타페스트 조약에 따라 2008년 2월 22일자에 이루어진 것으로, 기탁된 생물학적 물질의 공중에의 이용가능성에 대해 기탁자에게 부과된 모든 제한은 특허가 허여되면 취소할 수 없게 제거될 것이다.

본 발명은 또한 상기 발현벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킴으로써 수득될 수 있는 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질 각각을 높은 수준으로 생산할 수 있는 형질전환체를 제공한다.

본 발명과 관련하여 용어 "숙주세포"는 상기에 기술된 바와 같은 염기서열 또는 발현벡터를 포함하고 본원에서 정의되는 바와 같은 특이적 특성을 갖는 세포투과성 재조합 단백질의 생산에 사용되는 임의의 세포를 포함한다.

따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 본 발명의 세포투과성 재조합 단백질을 발현하는 염기서열로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포를 제공한다. 상기 세포는 상기 벡터에 적합하도록 선택될 것이고 원핵 (예를 들어, 세균), 진균, 효모, 또는 식물 세포일 수 있다. 바람직하게는, 숙주세포는 인간 세포가 아니다.

적합한 세균 숙주 유기체의 예시는 그람 양성 또는 그람 음성 세균 종이다. 본 발명의 세포투과성 재조합 단백질을 암호화하는 염기서열의 특성 및/또는 발현된 단백질의 이후의 처리를 위한 요구성에 따라, 원핵 숙주, 예컨대 대장균 (E. coli)이 바람직할 수 있다.

효모, 진균, 및 식물 세포와 같은 적합한 숙주세포의 사용은 본 발명의 재조합 발현 생성물에 최적의 생물학적 활성을 부여하는 것이 요구됨에 따라 후-번역 변경 (예를 들어, 미리스토일화 (myristoylation), 당화, 절단, 지질화, 및 티로신, 세린, 또는 트레오닌 인산화)을 제공할 수 있다.

숙주세포의 유전형은 발현을 향상시키도록 변경될 수 있다. 숙주세포 변경의 예시에는 단백분해효소 결핍, 희귀 tRNA의 보충, 및 이황화 결합 형성을 증강시키기 위한 세포질 내 환원 전위의 변경이 포함된다.

예를 들어, 숙주세포 E. coli는 문헌 [Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494-500 (1995)]에 기술된 바와 같이 이종 단백질의 발현을 향상시키기 위해 희귀 tRNA를 과발현할 수 있다. 숙주세포는 많은 환원 효소가 결핍되어 문헌 [Bessette, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13703-13708 (1999)]에 기술된 바와 같이 안정한 이황화 결합의 형성에 유리해질 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 숙주세포로 사용된 E. coli는 세포투과성 재조합 단백질을 높은 수준으로 생산하도록 본 발명에 따른 세포투과성 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된다. 세균 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 형질전환, 형질감염, 접합, 원형질 융합, 인산칼슘-침전, 및 다이에틸아미노에틸 (DEAE) 덱스트란과 같은 다양이온 (polycation)을 이용한 적용과 같은 생화학적 수단, 및 전기천공, 직접 미세주입, 미세투사 충격 (microprojectile bombardment), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, PEG-매개 융합 및 리포좀-매개 방법과 같은 기계적 수단을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질 각각을 높은 수준으로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 형질전환체 내로 도입된 발현벡터 내에서 본 발명의 세포투과성 재조합 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에서 적합한 배지에 형질전환체를 배양함으로써 수행될 수 있다.　 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 형질전환체를 상기 형질전환체를 성장시키는데 적합한 배지에 접종하고, 계대배양을 수행하고, 그 배양액을 본 배양 배지에 옮긴 후, 예를 들어 유전자 발현 유도인자, 아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드 (IPTG)가 보충된, 적합한 조건 하에서 배양하고, 그로써, 재조합 단백질의 발현을 유도함으로써 수행될 수 있다.　 상기 배양이 종결된 후, 배양 용액으로부터 "실질적으로 순수한" 재조합 단백질을 회수하는 것이 가능하다.　 용어 "실질적으로 순수한"은 본 발명의 재조합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 그들의 의도된 용도에 실용적이고 적합한 수준으로 자연계 또는 생체 내 시스템에서 발견될 수 있는 다른 성분들을 본질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. "실질적으로 순수한" 시료 (preparation) 또는 실질적으로 정제된 시료는 약 85% 이상 순수한, 바람직하게는 약 95% 이상 순수한 것일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이 "실질적으로 순수한" 또는 "단리된" 단백질은 통상의 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

상기와 같이 수득된 본 발명의 재조합 단백질은 숙주세포의 내부 또는 외부 (예: 배지)로부터 분리되어 실질적으로 순수한 동질 (homogeneous) 폴리펩티드로서 정제될 수 있다. 폴리펩티드 분리 및 정제를 위한 방법은 임의의 특정 방법으로 제한되지 않는다. 사실상, 임의의 표준 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피, 여과, 초미세여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역침전, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 등전점 전기영동, 투석, 및 재결정화가 폴리펩티드를 분리하고 정제하기 위해 적절히 선택되고 조합될 수 있다.

예를 들어, 크로마토그래피로는, 친화 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다 (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). 이러한 크로마토그래피는 HPLC 및 FPLC와 같은 액체 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 매우 순수하게 정제된 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명의 재조합 단백질을 생산하는 형질전환체의 배양액으로부터 본 발명의 재조합 단백질의 분리 및 정제를 위해, 단백질의 분리 및 정제를 위한 통상적인 방법이 사용될 수 있다.

예를 들어, 만약 재조합 단백질이 이를 생산하는 형질전환체 세포 내에 가용성 형태로 축적된다면, 세포를 원심분리에 의해 배양액으로부터 회수한 후 세척하고 초음파 분쇄기, 프렌치 프레스, 만톤-가울린 (Manton-Gaulin) 균질기, 다이노밀 (Dynomill) 등을 이용하여 파괴하여 무세포 추출액을 수득한다.

정제된 시료는 무세포 추출액을 원심분리하여 상청액을 수득한 후, 이 상청액을 용매 추출, 황산암모늄 등을 이용한 염석 또는 탈염, 유기용매를 이용한 침전, 다이메틸아미노에틸 (DEAE)-세파로스, 다이아니온 (DIAION) HPA-75 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japan) 등과 같은 수지상에서의 음이온-교환 크로마토그래피, S-세파로스 FF (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 등과 같은 수지상에서의 음이온-교환 크로마토그래피, 부틸 세파로스, 페닐 세파로스 등과 같은 수지상에서의 소수성 크로마토그래피, 분자 체를 이용한 겔 여과, 친화 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), 및 등전 포커싱 (isoelectric focusing)과 같은 전기영동을 수행함으로써 수득될 수 있다.

만약 폴리펩티드가 세포 내에서 봉입체로 발현된다면, 세포를 유사하게 회수하고, 파괴한 후 원심분리하여 침전된 분획을 수득한다. 이 분획으로부터, 폴리펩티드를 통상의 방식으로 회수한 후, 폴리펩티드의 봉입체를 폴리펩티드 변성제를 이용하여 가용화시킨다. 이어서 가용화된 용액을 투석제 또는 폴리펩티드 변성제를 함유하지 않는 용액 또는 폴리펩티드를 변성시키지 않을 정도로 낮은 농도의 폴리펩티드 변성제를 함유하는 용액으로 희석하여 가용화된 폴리펩티드가 정상적인 4차 구조를 갖도록 탈변성시키고, 그의 정제된 시료가 상기에 기술된 바와 같은 동일한 분리 및 정제 방법을 이용하여 수득될 수 있다.

만약 상기 폴리펩티드가 세포 외로 분비된다면, 배양액을 원심분리와 같은 수단에 적용하여 가용성 분획을 수득한다. 이 가용성 분획으로부터 폴리펩티드의 정제된 조제가 상기에 기술된 바와 같은 무세포 추출액으로부터의 분리 및 정제에서와 동일한 방식으로 수득될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포투과성 재조합 단백질은 대부분 봉입체로서 불용성 분획 내에 존재하는 것으로 확인되었다. 불용성 분획으로부터 재조합 단백질을 정제하기 위해, 불용성 분획을 8 M 우레아 (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM 트리스-HCl, 8 M 우레아, pH 8.0)를 함유하는 용해 (lysis) 완충액에 용해시키고 초음파처리를 한 후, 원심분리하여 침전물을 분리한다. 이렇게 분리된 침전물을 변성제로서 우레아가 보충된 완충액에 용해시키고 원심분리하여 상청액을 분리한다.　 우레아를 이용하여 불용성 분획으로부터 용출된 재조합 단백질을 His-결합 정제 키트를 이용하여 정제한 후 염 제거 및 단백질 재중첩을 위해 아미콘 필터 상에서 초미세여과를 수행하여 본 발명의 정제된 재조합 단백질을 수득한다.

또한, 본 발명은 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하기 위한 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 복합 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 줄기세포를 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질로 병합 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 사용된 줄기세포는 임의의 다능성 (pluripotent) 또는 다분화능 (multipotent) 포유동물 줄기세포일 수 있다.

다능성 세포는 3개의 주된 배엽으로부터 유래되는 임의의 세포로 발달할 수 있는 능력이 있다. 성체 줄기세포는, 태반 줄기세포, 태아 줄기세포 및 제대 줄기세포가 모두 사용될 수 있지만, 바람직한 줄기세포는 배아 줄기 (ES) 세포, 배아 암종 (EC) 세포 또는 배아 생식 (EG) 세포 (미국특허 제6,090,622호; Donovan & Gearhart, Nature 414:92-97 (2001))이다. 체세포, 골수 및 제대혈 줄기세포가 사용될 수 있고, 특히 자가 AE2 세포가 바람직하다.

줄기세포의 대표적인 예시에는 내세포괴 (ICM)-유래 배아 줄기세포, 포배-유래 배아 줄기세포, 지방세포-유래 중간엽 줄기세포, 골수-유래 조혈 줄기세포, 제대혈-유래 조혈 줄기세포, 태반-유래 조혈 줄기세포, 수동 (mobilized) 말초혈액-유래 조혈 줄기세포, 성체 뇌의 하부뇌실질 (subventricular zone)-유래 신경 줄기세포, 성체 신피질-유래 신경 줄기세포, 골수-유래 내피 줄기세포, 후각 점막-유래 후각 줄기세포, 고환 정조전구세포 (spermatogonial progenitor)-유래 고환세포, 유선-유래 유방 줄기세포, 체세포 재프로그램 (reprogramming)-유래 유도된 다능성 줄기세포 등이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

적합한 줄기세포를 수득하고 본 발명의 방법에 사용하기 전에 이들을 (예컨대, 미분화된 상태로) 유지하는 방법은 잘 알려져 있다.

ES 세포는 시험관 내 배양에서 무기한으로 증식할 수 있는 배아로부터 유래한 세포이다. ES 세포는 다능성인데, 즉 이들은 성체 동물을 구성하는 모든 유형의 세포들을 생체 내에서 발생시킬 수 있는 능력이 있다. 생쥐 ES 세포 (미국특허 제5,670,372호) 및 인간 ES 세포 (미국특허 제6,200,806호; Thomson 등, Science 282:1145-7 (1998))가 용이하게 이용가능하고 이들의 미분화된 성장을 위한 조건은 잘 알려져 있다 (Smith 등, Ann . Rev . Cell Dev . Biol . 17:435-62 (2001); Wobus 등, Mol . Aspects Med . 22:149-64 (2001); Tessarollo 등, Methods Mol. Biol. 158:47-63 (2001); Marshall 등, Methods Mol. Biol. 158:11-18 (2001); Wobus 등, Cells Tissues Organs 166:1-5 (2000); Pera 등, J. Cell Sci. 113:5-10 (2000); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (ed. Turksen) (2002) ISBN 0896038815). ES 세포는 일부 비-배아세포 유형을 형성할 수 없으므로, 전능성 (totipotent)이라기 보다는 다능성으로 언급되는 것이 적절하다.

인간 환자와의 적합성을 보증하기 위해, 인간 줄기세포, 특히 인간 ES 세포가 본 발명에 따른 용도에 바람직하다. 생쥐 ES 세포의 수준에는 미치지 못한다고 하더라도, 인간 ES 세포의 성장 및 분화에 대한 지식은 향상되고 있다 (Zhang 등 (2001) Nature Biotechnol . 19: 1129-1133; Donovan 등, Nature 414:92-97 (2001); Pera, Curr . Opin . Genet . Dev. 11:595-599 (2001)). 그러나 비-인간 환자가 치료되거나 연구되는 경우에, 다른 생물체 유래 (예컨대, 비-인간 영장류 또는 생쥐 유래)의 줄기세포가 사용될 수 있다. 비-인간 줄기세포가 또한 이종간이식 적합성 기술과 함께 인간에게 사용될 수 있다.

인간에의 투여를 위해, 자가 ES 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이들은 예를 들어, 환자로부터 체세포 핵 전달에 의해 배아를 준비하고, 이 배아로부터 ES 세포를 얻는 것에 의해 제조될 수 있다. 자가 체세포가 또한 사용될 수 있다.

치료적 사용을 위한 물질을 대량으로 제공하는 것이 유리하기 때문에, 줄기세포는 시험관 내에서 연장된 증식을 할 수 있는 것이 바람직하다.

상기에 기술된 바와 같이 본 발명에 따르면, 발현된 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합된 kFGF4-유래 MTD를 포함하는 재조합 단백질의 발현에 의해 세포투과성이 Nanog 및 Oct4에 부여된다.

줄기세포는 자가-재생 및 모든 유형의 세포로의 분화를 위한 독특한 능력인 이들의 본질을 세포 외에서는 유지할 수 없다. 줄기세포 요법을 위해, 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포는 이들의 본질을 유지하면서 세포 외에서 이들의 세포 개체수를 증폭시켜야만 한다. 그러나, 세포 외 배양기간이 길어짐에 따라, 이들의 자가-재생 및 다능성은 심각하게 손상된다. 또한, 이들의 세포 개체수를 증가시키기 위해 제조되거나 분리된 줄기세포의 세포 외 배양은 쉽게 노화 및 다양한 세포 유형으로의 분화를 초래하고, 그 결과로 이들의 줄기세포로서의 본질을 상실하게 된다.

개인 맞춤형 (personally tailored) 줄기세포주를 확립하기 위해, 현재 연구는 이들의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제함으로써 줄기세포를 유지하기 위한 방법을 개발하는데 초점이 맞추어져 있다. 따라서, 세포 외 배양에서 세포 개체수를 증가시키고 단리된 일차 줄기세포의 분화를 억제하는 방법은 환자-특이적 또는 개인 맞춤형 줄기세포 요법을 실현하는데 결정적이다.

이를 위해, 본 발명은 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하기 위해 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 병합하여 사용한다.

만약 줄기세포가 본 발명의 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질로 병합 처리된다면, Nanog 및 Oct가 성공적으로 세포의 핵 내로 도입되고, 그로써 이들의 미분화 상태를 유지하면서 이들의 자가-재생 능력을 촉진하고 분화능을 억제할 수 있다.

이들의 독특한 본질, 즉 자가-재생 능력 및 분화능과 관련하여 특정된 줄기세포는 질환의 치료를 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 생물체 내에 존재하는 임의의 세포 유형으로 분화할 수 있는 잠재능 및 능력을 갖는 이러한 세포의 동정은 다능성 전구체의 조혈 및 유전적 변경에 대한 적합성과의 밀접한 상관관계로 인해 초기에는 자가면역 질환 및 암의 치료에 흥미가 모아졌으나, 그 후에는 거의 모든 영역의 인간 질환으로 확대되었다. 자가면역 질환과 함께, 백혈병과 같은 암을 위한 골수 복원 치료에 추가로, 줄기세포 요법이 또한 손상 시 질환을 수반하는 기관 조직의 복구를 위해 고려되고 있다. 이들 제안된 줄기세포 요법은 생물체의 특정 조직 부위에의 일차 줄기세포 및/또는 변경된 줄기세포의 투여를 포함한다. 중요한 적용 범위는 당뇨병, 간질환, 척수 재생, 골 재생, 안구 재생, 및 심장 치유를 포함한다.

인식될 수 있는 바와 같이, 이러한 줄기세포가 이식, 세포 재생 및 대체 요법, 약물 발견, 포유동물 발달을 연구하기 위한 모델 시스템의 구축, 및 유전자 요법에의 사용을 위한 모든 유형의 쉽게 이용가능한 세포 및 조직의 공급을 제공할 수 있기 때문에, 다른 종으로부터, 구체적으로 영장류 및 특히 인간으로부터 줄기세포를 분리하고 성장시키는데 대단한 관심이 집중되고 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 통상적인 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 지닌다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 실행하거나 검사하는데 사용될 수 있다고 하더라도, 특정 방법 및 물질이 본원에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 상기 간행물이 인용된 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 기술하고 설명하기 위해 그 전체로서 참고로 본원에 포함된다.

본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an", 및 "the"는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에서 논의된 간행물들은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 기재에 대해 단독으로 제공된다. 본원의 어떠한 사항도 본 발명이 이전의 발명에 의해 이러한 간행물에 선행하지 않는다는 승인으로 해석되지는 않는다. 또한, 제공되는 공개 일자는 개별적으로 확인할 필요가 있을 수 있는 실제 공개 일자와 다를 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 제작되는 세포투과성 Nanog 재조합 단백질의 전장 및 결절 형태를 예시하는 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따라 제작되는 세포투과성 Oct4 재조합 단백질의 전장 형 태를 예시하는 모식도이다.

도 3은 본 발명에 따라 PCR로 증폭된 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 분석 사진이다.

도 4a는 본 발명에 따라 pGEM-Teasy 벡터 내로 세포투과성 Nanog 또는 Oct4 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 단편의 서브클로닝을 예시하는 모식도이다.

도 4b는 본 발명에 따라 pGEM-Teasy 벡터 내로 서브클로닝된 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 분석 사진이다.

도 5a는 본 발명에 따라 pET 28(+) 벡터 내로 세포투과성 Nanog 또는 Oct4 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 단편의 클로닝을 예시하는 모식도이다.

도 5b는 본 발명에 따른 pET 28(+) 벡터 내로 클로닝된 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 분석 사진이다.

도 6은 본 발명에 따른 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 유도성 발현을 나타내는 SDS-PAGE 분석 사진이다.

도 7은 본 발명에 따라 변성 조건 하에서 정제된 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 순도를 나타내는 SDS-PAGE 분석 사진이다.

도 8은 본 발명에 따라 유세포 분석기로 분석된 세포투과성 Nanog 재조합 단백질의 세포투과성을 나타내는 그래프이다.

도 9는 본 발명에 따라 유세포 분석기로 분석된 세포투과성 Oct4 재조합 단 백질의 세포투과성을 나타내는 그래프이다.

도 10은 본 발명에 따라 동초점 레이저 주사 현미경으로 세포투과성 Nanog 재조합 단백질의 세포투과성을 시각적으로 나타낸 사진이다.

도 11은 양성 대조군을 이용하여, 본 발명에 따른 세포투과성 Oct4 재조합 단백질의 세포투과성을 비교한 그래프이다.

도 12는 본 발명에 따른 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질이 병합하여 처리된 인간 성체 줄기세포의 자가-재생 및 억제 분화능을 시각적으로 나타낸 사진이다.

도 13a는 처리 시간의 경과에 따라 본 발명에 따른 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질이 병합 처리된 인간 성체 줄기세포의 개수를 나타내는 그래프이다.

도 13b는 처리 시간의 경과에 따라 본 발명에 따른 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질이 병합 처리된 인간 성체 줄기세포의 자가-재생 속도를 나타내는 그래프이다.

도 14는 처리 시간의 경과에 따라 본 발명에 따른 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질이 병합 처리된 인간 성체 줄기세포의 세포 형태에 있어서의 변화를 시각적으로 나타낸 사진이다.

도 15a는 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 복합 처리가 종결된 후 선발된 클론성 성체 줄기세포의 자가-재생 및 억제 분화능을 시각적으로 나타낸 사진이다.

도 15b는 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 복합 처리가 종결된 후 선발된 클론성 성체 줄기세포의 개수를 나타내는 그래프이다.

도 16은 처리 시간의 경과에 따라 본 발명에 따른 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질이 병합 처리된 성체 줄기세포에서 p21의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯 분석 사진이다.

도 17은 처리 시간의 경과에 따라 본 발명에 따른 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질이 병합하여 처리된 성체 줄기세포의 텔로머라제(텔로머라제) 활성에 있어서의 증가를 보여주는 비-변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 분석 사진이다.

하기 실시예는 본 발명의 실시를 원조하고, 본 발명에 대한 실험적인 지지를 제공하며, 모델 프로토콜을 제공하기 위해 제시된다. 어떠한 경우에도 이들 실시예가 발명을 제한하는 것으로 이해되지는 않는다.

실시예 1 - 세포투과성 재조합 단백질의 제작

<1-1> 세포투과성 Nanog (CP-Nanog) 재조합 단백질

kFGF4-유래 MTD를 이용하여 세포투과성 Nanog (CP-Nanog) 재조합 단백질을 제작하기 위하여, 3종의 전장 및 5종의 결절 형태의 CP-Nanog 재조합 구조물을 고안하였다.

본 발명의 세포투과성 Nanog 재조합 단백질은 kFGF4-유래 MTD (서열번호: 6), SV40 거대 T 항원 유래 핵 국소화 서열 (NLS)(서열번호: 8), 용이한 정제를 위한 히스티딘-표지 (His-Tag), 및 전사인자 Nanog (서열번호: 2)로 이루어져 있다.

도 1을 참고로 하여, 전장 형태의 CP-Nanog 재조합 구조물을 하기와 같이 ㅈ제작하였다:

1) kFGF4-유래 MTD가 전장 Nanog의 N-말단에 융합되어 있는 His-MTD-Nanog (HMN);

2) kFGF4-유래 MTD가 전장 Nanog의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog-MTD (HNM); 및

3) kFGF4-유래 MTD가 전장 Nanog의 양쪽 말단 모두에 융합되어 있는 His-MTD-Nanog-MTD (HMNM),

상기에서 His-tag 및 SV40 거대 T 항원 유래 NLS가 모든 구조물의 N-말단에 공유적으로 결합되어 있음.

전장 CP-Nanog 재조합 구조물을 제조하기 위해, 각각의 재조합 구조물에 특이적인 시발체 쌍으로서 하기 표 1에 기재된 올리고뉴클레오티드 및 주형으로서 인간 Nanog cDNA (서열번호: 1)를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다.　 이때, His-MTD-Nanog (HMN)를 중폭하기 위한 정방향 및 역방향 시발체는 각각 서열번호: 36 및 39로 표시되는 염기서열을 가지며; His-Nanog-MTD (HNM)를 증폭하기 의한 것들은 각각 서열번호: 35 및 40으로 표시되는 염기서열을 가지며; His-MTD-Nanog-MTD (HMNM)를 증폭하기 위한 것들은 각각 서열번호: 36 및 40으로 표시되는 염기서열을 갖는다.

또한, 세포투과성 Nanog 재조합 단백질의 결절 형태를 하기와 같이 제작하였다:

1) kFGF4-유래 MTD가 호메오도메인 및 트립토판 반복이 결손된 Nanog N-말단 도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog N-말단-MTD (HNNM);

2) kFGF4-유래 MTD가 N-말단 및 C-말단 도메인이 결손된 Nanog 호메오도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog 호메오도메인-MTD (HNHM);

3) kFGF4-유래 MTD가 N-말단 도메인 및 호메오도메인이 결손된 Nanog C-말단 도메인의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog C-말단 MTD (HNCM);

4) kFGF4-유래 MTD가 C-말단 도메인이 결손된 Nanog N-말단 도메인 및 호메오도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog N-말단-호메오도메인-MTD (HNNHM); 및

5) kFGF4-유래 MTD가 N-말단 도메인이 결손된 Nanog 호메오도메인 및 C-말단 도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog 호메오도메인-C-말단-MTD (HNHCM);

상기에서 His-tag 및 SV40 거대 T 항원 유래 NLS가 모든 구조물의 N-말단에 공유적으로 결합되어 있음.

결절된 CP-Nanog 재조합 단백질을 제조하기 위해, 각각의 재조합 단백질에 특이적인 시발체 쌍으로서 하기 표 1에 기재된 올리고뉴클레오티드 및 주형으로서 인간 Nanog cDNA (서열번호: 1)를 이용하여 PCT을 수행하였다.　 이때, His-Nanog N-말단-MTD (HNNM)를 증폭하기 위한 정방향 및 역방향 시발체는 각각 서열번호: 35 및 41로 기재되는 염기서열을 가지며; His-Nanog 호메오도메인-MTD (HNHM)를 증폭하기 위한 것들은 각각 서열번호: 37 및 41로 기재되는 염기서열을 가지며; His-Nanog C-말단 MTD (HNCM)를 증폭하기 위한 것들은 각각 서열번호: 38 및 41로 기재되는 염기서열을 가지며; His-Nanog N-말단-호메오도메인-MTD (HNNHM)를 증폭하기 위한 것들은 각각 서열번호: 35 및 41로 기재되는 염기서열을 가지며; His-Nanog 호메오도메인-C-말단-MTD (HNHCM)를 증폭하기 위한 것들은 각각 서열번호: 37 및 40으로 기재되는 염기서열을 갖는다.

시발체	서열	서열번호
HN-5' (45nts)	5'-CCG　CAT　ATG　AAG　AAG　AAG　AGG　AAG　AGT　GTG　GAT　CCA　GCT　TGT　CCC-3'	35
HMN-5' (84nts)	5'-CCG　CAT　ATG　AAG　AAG　AAG　AGG　AAG　GCA　GCC　GTT　CTT　CTC　CCT　GTT　CTT　CTT　GCC　GCA　CCC　AGT　GTG　GAT　CCA　GCT　TGT　CCC　CAA-3'	36
HNH-5' (51nts)	5'-CCG　CAT　ATG　AAG　AAG　AAG　AGG　AAG　CAG　AAG　ACC　AGA　ACT　GTG　TTC TCT　TCC-3'	37
HNC-5' (51nts)	5'-CCG　CAT　ATG　AAG　AAG　AAG　AGG　AAG　AAC　AAC　TGG　CCG　AAG　AAT　AGC AAT　GGT-3'	38
HN-3' (36nts)	5'-CCG　CAT　ATG　TCA　CAC　GTC　TTC　AGG　TTG　CAT　GTT　CAT-3'	39
HNM-3' (72nts)	5'-CCG　CAT　ATG　TCA　GGG　TGC　GGC　AAG　AAG　AAC　AGG　GAG　AAG　AAC　GGC TGC CAC　GTC　TTC　AGG　TTG　CAT　GTT　CAT-3'	40
HNHM-3' (72nts)	5'-CCG　CAT　ATG　TCA　GGG　TGC　GGC　AAG　AAG　AAC　AGG　GAG　AAG　AAC　GGC TGC　TTT　CTG　CCA　CCT　CTT　AGA　TTT CAT-3'	41
HNNM-3' (75nts)	5'-CCG　CAT　ATG　TCA　GGG　TGC　GGC　AAG　AAG　AAC　AGG　GAG　AAG　AAC　GGC TGC　TTT　CTT　GAC　TGG　GAC　CTT　GTC　TTC　CTT-3'	42

주형으로서 100 ng의 인간 Nanog cDNA, 0.2 mM dNTP 혼합물 (dGTP, dATP, dTTP, 및 dCTP, 각각 2 mM), 0.6 μM의 각 시발체, 5 ㎕의 10× Taq 완충액, 1 ㎕의 Taq 중합효소 (타카라, 일본)를 포함하는 50 ㎕ 반응액 내에서 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 2분간의 초기 변성 후에 94℃에서 45초, 53℃에서 45초 및 72℃에서 45초를 25회 수행하고, 이어서 72℃에서 5분간 최종 연장하여 수행되었다. PCR 반응이 종결된 후, 증폭된 PCR 생성물을 제한효소 NdeI으로 절단하고 1.0% 아가로스 겔 상에 로우딩하여 분획화하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, kFGF4-유래 MTD에 융합된 각각의 재조합 구조물에 대해 예상되는 단편이 성공적으로 증폭되었음을 확인하였다.

예상된 크기의 DNA 밴드를 겔로부터 잘라내고, 퀴아퀵 겔 추출 키트 (QIAquick Gel extraction kit, 퀴아젠, 미국)를 이용하여 용출하고 정제하였다. 용출된 DNA를 에탄올로 침전시키고 연결 (ligation)을 위해 6 ㎕의 증류수에 재현탁하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 코딩 영역을 포함하는 PCR 증폭된 DNA 단편을 TA 클로닝 방법에 따라 T4 라이게이즈 (ligase)를 이용하여 pGEM-T Easy 벡터 (프로메가, 메디슨, WI, 미국) 내로 서브클로닝한 후, 이어서 상기 pGEM-T Easy 벡터를 E. coli DH5α 적격 세포 (competent cells) 내로 형질전환시켰다. 상기 세포를 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 배지 상에 도말하고 이를 37℃에서 밤새 배양하였다. pGEM-T Easy 벡터에 삽입된 재조합 단편을 제한효소 NdeI을 처리하여 분리한 후, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 전장 형태에 대한 약 1 kb의 DNA 단편, 결절 형태에 대한 약 0.3 내지 0.7 kb의 DNA 단편 및 약 3 kb의 벡터 단편이 검출되었는데, 이는 Cp-Nanog 재조합 구조물의 삽입 DNA가 pGEM-T Easy 벡터 내에 적절하게 서브클로닝되었음을 나타내는 것이다.

히스티딘-표지 및 T7 프로모터를 포함하는 pET-28(+)a 벡터 (노바젠, 메디슨, WI)를 제한효소 NdeI (엔지노믹스, 대한민국)으로 처리하였다. pET-28a(+) 플라스미드는 N-말단 또는 C-말단에서 His-표지 융합을 용이하게 하고 T7 파아지 프로모터로부터 E. coli 내 유전자의 강력한 발현을 제공하도록 고안된 것이다. MTD-Nanog 재조합 구조물을 암호화하는 각각의 단리된 삽입 DNA 단편을 상기에 기술된 바와 같이 사전-처리된 pET-28a(+) 벡터 내로 클로닝하였다. 각각의 CP-Nanog 암호화 유전자의 3' 말단에서, 코딩 서열은 번역 종결 코돈에 이어서 His-표지 서열에 NdeI 부위에서 틀 내로 융합되고, 그 결과로 니켈 칼럼 상에서의 용이한 정제를 위해 C-말단에 부가된 6개의 히스티딘 잔기를 갖는 CP-Nanog 재조합 단백질이 생성되었다.

클론들을 제한효소 NdeI으로 처리하고 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행한 후에, 전장 형태에 대한 약 1 kb의 DNA 단편, 결절 형태에 대한 약 0.3 내지 0.7 kb의 DNA 단편 및 약 5 kb의 벡터 단편이 검출됨이 입증되었고, 이는 도 5에 나타난 바와 같이, CP-Nanog 재조합 구조물의 삽입 DNA가 pET-28a(+) 벡터 내로 클로닝되었음을 나타내는 것이다.

세포투과성 Nanog 재조합 단백질을 발현하기 위해 성공적으로 클로닝된 발현벡터를 각각 pET28a(+)-HMN, pET28a(+)-HNM, pET28a(+)-HMNM, pET28a(+)-HNNM, pET28a(+)-HNHM, pET28a(+)-HNCM, pET28a(+)-HNNHM, 및 pET28a(+)-HNHCM으로 명명하였다.

이들 중에서, His-Nanog-kFGF4-유래 MTD 구조물을 포함하는 발현벡터 pET28a(+)-HNM를 부다페스트 조약에 따라 한국생명공학연구원 (KRIBB, 대한민국 305-333, 대전시 유성구 어은동 52 소재) 내 유전자은행 (KCTC)에 2008년 2월 22일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 11278BP를 부여받았다.

상기에서 제작된 바와 같은 전장 형태의 세포투과성 Nanog 재조합 단백질에서, His-MTD-Nanog (HMN)는 서열번호: 10으로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 19로 기재되는 염기서열을 가지며; His-Nanog-MTD (HNM)는 서열번호: 11로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 가지며; His-MTD-Nanog-MTD (HMNM)는 서열번호: 12로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 21로 기재되는 염기서열을 갖는다.

또한, 상기에서 제작된 바와 같은 결절 형태의 세포투과성 Nanog 재조합 단백질에서, His-Nanog N-말단-MTD (HNNM)는 서열번호: 13로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 22로 기재되는 염기서열을 가지며; His-Nanog 호메오도메인-MTD (HNHM)는 서열번호: 14로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 23으로 기재되는 염기서열을 가지며; His-Nanog C-말단 MTD (HNCM)는 서열번호: 15로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 24로 기재되는 염기서열을 가지며; His-Nanog N-말단-호메오도메인-MTD (HNNHM)는 서열번호: 16으로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 25로 기재되는 염기서열을 가지며; His-Nanog 호메오도메인-C-말단-MTD (HNHCM)는 서열번호: 17로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 26으로 기재되는 염기서열을 갖는다.

세포투과성 Nanog 재조합 단백질의 대조군으로서, kFGF4-유래 MTD를 포함하지 않고 전장 Nanog가 SV40 거대 T 항원 유래 핵 국소화 서열 (NLS) 및 히스티딘-표지 (His-Tag)에만 융합되어 있는 His-Nanog (HN)를 제작하였다. 대조군 단백질은 서열번호: 9로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 18로 기재되는 염기서열을 갖는다.

<1-2> 세포투과성 Oct4 (CP-Oct4) 재조합 단백질

kFGF4-유래 MTD를 이용하여 세포투과성 Oct4 (CP-Oct4) 재조합 단백질을 제작하기 위해, 3종의 전장 형태의 CP-Oct4 재조합 구조물을 고안하였다.

본 발명의 세포투과성 Oct4 재조합 단백질은 kFGF4-유래 MTD (서열번호: 6), SV40 거대 T 항원 유래 핵 국소화 서열 (NLS)(서열번호: 8), 용이한 정제를 위한 히스티딘-표지 (His-Tag), 및 전사인자 Oct4 (서열번호: 4)를 포함한다.

도 2를 참고로 하여, 전장 형태의 CP-Oct4 재조합 구조물을 하기와 같이 제작하였다:

1) kFGF4-유래 MTD가 전장 Oct4의 N-말단에 융합되어 있는 His-MTD-Oct4 (HMO);

2) kFGF4-유래 MTD가 전장 Oct4의 C-말단에 융합되어 있는 His-Oct4-MTD (HOM); 및

3) kFGF4-유래 MTD가 전장 Oct4의 양쪽 말단 모두에 융합되어 있는 His-MTD-Oct4-MTD (HMOM),

상기에서 His-tag 및 SV40 거대 T 항원 유래 NLS가 모든 구조물의 N-말단에 공유적으로 결합되어 있음.

전장 CP-Oct4 재조합 구조물을 제조하기 위해, 각각의 재조합 구조물에 특이적인 시발체 쌍으로서 하기 표 2에 기재된 올리고뉴클레오티드 및 주형으로서 인간 Oct4 cDNA (서열번호: 3)를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다.　 이때, His-MTD-Oct4 (HMO)를 중폭하기 위한 정방향 및 역방향 시발체는 각각 서열번호: 44 및 45로 표시되는 염기서열을 가지며; His-Oct4-MTD (HOM)를 증폭하기 의한 것들은 각각 서열번호: 43 및 46으로 표시되는 염기서열을 가지며; His-MTD-Oct4-MTD (HMOM)를 증폭하기 위한 것들은 각각 서열번호: 44 및 46으로 표시되는 염기서열을 갖는다.

시발체	서열	서열번호
HO-5' (45nts)	5'-CCG　CAT　ATG　AAG　AAG　AAG　AGG　AAG　GCG　GGA　CAC　CTG　GCT　TCG　GAT-3'	43
HMO-5' (84nts)	5'-CCG　CAT　ATG　AAG　AAG　AAG　AGG　AAG　GCA　GCC　GTT　CTT　CTC　CCT　GTT　CTT　CTT　GCC　GCA　CCC　GCG　GGA　CAC　CTG　GCT　TCG　GAT　TTC-3'	44
HO-3' (36nts)	5'-CCG　CAT　ATG　TCA　GTT　TGA　ATG　CAT　GGG　AGA　GCC　CAG-3'	45
HOM-3' (72nts)	5'-CCG　CAT　ATG　TCA　GGG　TGC　GGC　AAG　AAG　AAC　AGG　GAG　AAG　AAC　GGC TGC　GTT　TGA　ATG　CAT　GGG　AGA　GCC　CAG-3'	46

주형으로서 100 ng의 인간 Nanog cDNA, 0.2 mM dNTP 혼합물 (dGTP, dATP, dTTP, 및 dCTP, 각각 2 mM), 0.6 μM의 각 시발체, 5 ㎕의 10× Taq 완충액, 1 ㎕의 Taq 중합효소 (타카라, 일본)를 포함하는 50 ㎕ 반응액 내에서 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 2분간의 초기 변성 후에 94℃에서 45초, 53℃에서 45초 및 72℃에서 45초를 25회 수행하고, 이어서 72℃에서 5분간 최종 연장하여 수행되었다. PCR 반응이 종결된 후, 증폭된 PCR 생성물을 제한효소 NdeI으로 절단하고 1.0% 아가로스 겔 상에 로우딩하여 분획화하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, kFGF4-유래 MTD에 융합된 각각의 재조합 구조물에 대해 예상되는 단편이 성공적으로 증폭되었음을 확인하였다.

예상된 크기의 DNA 밴드를 겔로부터 잘라내고, 퀴아퀵 겔 추출 키트 (퀴아젠, 미국)를 이용하여 용출하고 정제하였다. 용출된 DNA를 에탄올로 침전시키고 연결을 위해 6 ㎕의 증류수에 재현탁하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 코딩 영역을 포함하는 PCR 증폭된 DNA 단편을 TA 클로닝 방법에 따라 T4 라이게이즈를 이용하여 pGEM-T Easy 벡터 (프로메가, 메디슨, WI, 미국) 내로 서브클로닝한 후, 이어서 상기 pGEM-T Easy 벡터를 E. coli DH5α 적격 세포 내로 형질전환시켰다. 상기 세포를 50 ㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 배지 상에 도말하고 이를 37℃에서 밤새 배양하였다. pGEM-T Easy 벡터에 삽입된 재조합 단편을 제한효소 NdeI을 처리하여 분리한 후, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 약 1.1 kb의 DNA 단편 및 약 3 kb의 벡터 단편이 검출되었는데, 이는 CP-Oct4 재조합 구조물의 삽입 DNA가 pGEM-T Easy 벡터 내에 적절하게 서브클로닝되었음을 나타내는 것이다.

히스티딘-표지 및 T7 프로모터를 포함하는 pET-28(+)a 벡터 (노바젠, 메디슨, WI)를 제한효소 NdeI (엔지노믹스, 대한민국)으로 처리하였다. pET-28a(+) 플라스미드는 N-말단 또는 C-말단에서 His-표지 융합을 용이하게 하고 T7 파아지 프로모터로부터 E. coli 내 유전자의 강력한 발현을 제공하도록 고안된 것이다. MTD-Oct4를 암호화하는 각각의 단리된 삽입 DNA 단편을 상기에 기술된 바와 같이 사전-처리된 pET-28a(+) 벡터 내로 클로닝하였다. 각각의 CP-Oct4 암호화 유전자의 3' 말단에서, 코딩 서열은 번역 종결 코돈에 이어서 His-표지 서열에 NdeI 부위에서 틀 내로 융합되고, 그 결과로 니켈 칼럼 상에서의 용이한 정제를 위해 C-말단에 부가된 6개의 히스티딘 잔기를 갖는 CP-Oct4 재조합 단백질이 생성되었다.

클론들을 제한효소 NdeI으로 처리하고 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 수행한 후에, 약 1.1 kb의 DNA 단편 및 약 5 kb의 벡터 단편이 검출됨이 입증되었고, 이는 도 5에 나타난 바와 같이, CP-Oct4 재조합 구조물의 삽입 DNA가 pET-28a(+) 벡터 내로 클로닝되었음을 나타내는 것이다.

세포투과성 Oct4 재조합 단백질을 발현하기 위해 성공적으로 클로닝된 발현벡터를 각각 pET28a(+)-HMO, pET28a(+)-HOM 및 pET28a(+)-HMOM으로 명명하였다.

His-kFGF4-유래 MTD 구조물-Oct4를 포함하는 발현벡터 pET28a(+)-HMO; His-Oct4-kFGF4-유래 MTD 구조물을 포함하는 발현벡터 pET28a(+)-HOM; 및 His-kFGF4-유래 MTD-Oct4-kFGF4-유래 MTD 구조물을 포함하는 발현벡터 pET28a(+)-HMOM을 부다페스트 조약에 따라 한국생명공학연구원 (KRIBB, 대한민국 305-333, 대전시 유성구 어은동 52 소재) 내 유전자은행 (KCTC)에 2008년 2월 22일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 11279BP, KCTC 11280BP 및 KCTC 11281BP를 각각 부여받았다.

상기에서 제작된 바와 같은 전장 형태의 세포투과성 Oct4 재조합 단백질에서, His-MTD-Oct4 (HMO)는 서열번호: 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 32로 표시되는 염기서열을 가지며; His-Oct4-MTD (HOM)는 서열번호: 29로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 33으로 표시되는 염기서열을 가지며; His-MTD-Oct4-MTD (HMOM)는 서열번호: 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 34로 표시되는 염기서열을 갖는다.

세포투과성 Oct4 재조합 단백질의 대조군으로서, kFGF4-유래 MTD를 포함하지 않고 전장 Oct4가 SV40 거대 T 항원 유래 핵 국소화 서열 (NLS) 및 히스티딘-표지 (His-Tag)에만 융합되어 있는 His-Oct4 (HO)를 제작하였다. 대조군 단백질은 서열번호: 27로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 31로 기재되는 염기서열을 갖는다.

실시예 2 - 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 유도성 발현

<2-1> 최적 세균 균주의 선발

실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 kFGF4-유래 MTD에 융합된 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 발현을 위한 최적의 세균 균주를 선택하기 위해, His-Nonag-MTD (HN), His-MTD-Oct4 (HMO), His-Oct4-MTD (HOM), 및 His-MTD-Oct4-MTD (HMOM) 재조합 구조물을 각각 포함하는 발현벡터를 E. coli BL21 (DE3), BL21-Gold (DE3), BL21-CodonPlus (DE3) 및 BL21-GoldpLysS (DE3) 균주에 각각 형질감염시켰다. 이때, kFGF4-유래 MTD를 포함하지 않는 His-Nanog (HN) 및 His-Oct4 (HO) 발현벡터를 대조군으로 사용하였다.

형질감염 후, 흡광도 600 (OD₆₀₀)이 0.4 및 0.6 사이에 도달할 때까지 세포를 강력한 교반 하에서 카나마이신 (㎍/㎖)을 함유하는 LB 배지에서 37℃로 배양하였다. 이어서 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해 배지에 IPTG (아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드)를 0.7 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 단백질 유도는 37℃에서 3시간 동안 지속하였다. IPTG를 이용하여 E. coli 균주에서 발현된 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에 로우딩하고, 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색한 후, 탈염색하였다. 대부분의 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질은 BL21-GoldpLysS (DE3)에서 높은 수준으로 발현되었다. 그러나, 일부 CP-Nanog 재조합 단백질은 BL21-GoldpLysS (DE3)에서 발현되지 않았다.

상기 결과로부터, BL21-GoldpLysS (DE3)가 본 발명에 따른 세포투과성 재조합 단백질의 발현을 위한 최적 균주로 선발되었다.

<2-2> 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 발현

실시예 <2-1>에 기재된 바와 동일한 방법에 따라, His-Nonag-MTD (HN), His-MTD-Oct4 (HMO), His-Oct4-MTD (HOM), 및 His-MTD-Oct4-MTD (HMOM) 재조합 구조물 각각을 포함하는 발현벡터를 실시예 <2-1>에서 이들의 발현에 최적의 균주로 선발된 BL21-GoldpLysS (DE3)에 형질감염시키고, 그 세포를 배양한 후, 배양액에 IPTG를 첨가하였다. IPTG 유도가 종결된 후, 배양액을 원심분리하여 가용성 및 불용성 분획을 분리하였다. IPTG를 이용하여 E. coli 균주 내에서 발현된 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질의 이렇게 수득된 가용성 및 불용성 분획을 SDS-PAGE 겔 상에 로우딩하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 대부분은 봉입체로서 불용성 분획에 포함되어 있고, 이들의 발현은 IPTG의 존재 하에서 유의미하게 증가함을 확인하였다.

실시예 3 - 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 정제

E. coli 시스템에서 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 유도성 발현은 봉입체로 알려진, 불용성 응집체의 형성을 초래한다. 이러한 봉입체를 완벽히 용해시키기 위해, 발현된 단백질 모두를 8 M 우레아에 용해시킴으로써 이들을 변성시켰다. 변성된 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질을 니켈 니트릴로아세테이트 수지 (퀴아젠, 힐든, 독일)를 이용하여 히스티딘-표지 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 8 M 우레아와 같은 강력한 변성제는 봉입체를 완벽하게 용해시키기 때문에, 정제 방법은 pH-의존성 변성 조건 하에서 수행되었다.

E. coli 배양액을 4,000 ×g로 20분간 원심분리하여 수확하고, 용해 완충액 (100 mM NaH₂PO₄, 10 mM 트리스-HCl, 8 M 우레아, pH 8.0)에 재현탁한 후, 탐침이 장착된 초음파 파쇄기를 이용하여 얼음 중에서 초음파 처리하였다. 세포 용해물을 7,000 ×g로 20분간 원심분리하여 상청액과 세포 조직파편 펠렛으로 분리하였다. 상청액을 취한 후 상기 용해 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 수지와 가벼운 교반 (회전 교반기 이용) 하에서 2시간 내지 밤새 인큐베이션하였다. 세척 완충액 (100 mM NaH₂PO₄, 트리스-HCl, 8 M 우레아, pH 6.3)으로 5회 세척한 후, 수지에 결합된 단백질을 용출 완충액 (100 mM NaH₂PO₄, 트리스-HCl, 8 M 우레아, pH 4.5)으로 용출하였다. 상기에 기술된 변성 조건 하에서 정제된 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

상기에서 정제된 His-표지된 재조합 단백질을 탈변성시키기 위해, 변성제를 제거함으로써 변성된 단백질을 재중첩시켰다. 단백질을 재중첩 완충액 (0.55 M 구아니딘 HCl, 0.44 M L-아르기닌, 50 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM NDSB, 2 mM 글루타치온 산화형, 및 0.2 mM 글루타치온 환원형)으로 투석함으로써 우레아를 단백질로부터 제거하였다. 재중첩된 재조합 단백질 모두를 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 세포 배양 배지 (예컨대, α-최소 필수 배지: α-MEM)와 같은 생리적 완충액에 대해 4℃에서 9시간 동안 투석하였다. 재중첩 완충액을 α-MEM으로 교체한 후, 정제된 재조합 단백질 모두의 세포투과성은 시험관 내 및 생체 내에서 결정되도록 준비되었다.

도 7에 나타난 SDS-PAGE 분석 결과에 따르면, 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질은 각각 약 37 및 43 kDa에 해당하는 단일 밴드로 검출되었는데, 이는 본 발명의 세포투과성 재조합 단백질이 불용성 분획으로부터 순수하게 정제되었음을 나타내는 것이다.

실시예 4 - 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 정량적 세포투과성의 결정

본 발명에 따라 kFGF4-유래 MTD에 융합된 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 세포투과성을 포유동물 세포에서 정량적으로 결정하기 위해, 각 재조합 단백질의 세포 유입 (cellular uptake)을 MTD를 포함하지 않는 대조군의 세포 유입과 비교하였다.

먼저, 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이, 가용성 형태로 정제된 4종의 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질 (HNM, HMO, HOM, 및 HMOM)을 0.7 ㎍/㎕의 플루오레세인 아이소티오시아네이트 (FITC)와 혼합하고 교반에 의해 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. FITC가 완벽히 제거되어 FITC-접합 재조합 단백질이 수득될 때까지 반응 용액을 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM; 웰진 인크, 대한민국)에 대해 2시간 동안 투석하였다. 마우스 대식세포 유래 RAW 264.7 세포를 10% 우태아혈청 및 1% 페니실린 (500 ㎎/㎖, 웰진 인크)이 보충된 DMEM에서 유지하고 공기 중 5% CO₂의 습윤 대기 하에서 37℃로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 상기에서 제조된 10 μM의 FITC-접합된 재조합 단백질 각각과 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 이들을 트립신/EDTA (T/E, 인비트로젠, 찰스버그, CA)로 처리하여 세포 표면 결합된 단백질을 제거하고 차가운 PBS로 3회 세척하였다.

본 발명의 FITC-접합된 재조합 단백질로 처리된 세포를 형광-활성화 세포 분류기 (FACS)(FACS Calibur, 벡톤-딕킨슨, 산디아고, CA)로 분석하였다. 각각의 시료에 대해, 세포 (1×10⁴)를 셀퀘스트 프로 세포측정 분석 소프트웨어 (CellQuest Pro cytometric analysis software)를 이용하여 분석하였다. 각 실험을 2회 이상 수행하였다. kFGF4-유래 MTD에 융합된 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질 각각의 세포투과 잠재능을 MTD를 포함하지 않는 대조군 단백질의 세포투과 잠재능과 시각적으로 비교하였다

도 8 및 9는 유세포측정 분석 결과를 나타내는 것으로, 여기서 회색으로 채워진 곡선은 세포 단독을 나타내고, 검정색 곡선은 FITC 단독을 나타내고, 파란색 곡선은 대조군 (HN 및 HO)의 세포투과성을 나타내고, 빨간색 곡선은 재조합 단백질 (HNM, HMO, HOM 및 HMOM) 각각의 세포투과성을 나타낸다.

도 8 및 9에 나타난 결과를 참고하여, 본 발명에 따른 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질 모두는 대조군보다 유의미하게 높은 수준의 원형질막-침투 능력을 나타냄을 확인하였다.

실시예 5 - 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 세포투과성 및 세포내 국소화의 결정

세포 내로 운반된 인간 Nanog 및 Oct4 단백질의 세포내 국소화를 시각적으로 관찰하기 위해, NIH 3T3 세포를 무처리 (세포 단독) 또는 kFGF4-유래 MTD를 포함하지 않는 FITC-접합된 재조합 단백질 (대조군: HN 및 HO) 또는 kFGF4-유래 MTD에 융합된 FITC-접합된 재조합 단백질 (HNM, HMO, HOM, 및 HMOM)로 처리하고, 공초점 레이저 주사현미경으로 시각적으로 관찰하였다.

NIH 3T3 세포를 8-웰 챔버 슬라이드 (LabTek, 날젠 눈크, 로체스터, NY)에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO₂ 중에서 10% 우태아혈청, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후, 무혈청 DMEM, 유리 FITC 함유 무혈청 DMEM 또는 10 μM FITC-접합된 재조합 단백질을 함유하는 무혈청 DMEM으로 37℃, 5% CO₂ 중에서 1시간 동안 처리하였다. 처리 1시간 후, 관찰을 위해 세포를 4% 파라포름알데하이드 (PFA)로 20분간 실온에서 고정하였다.

내재화된 FITC-접합된 재조합 단백질의 직접적인 검출을 위해, 세포를 PBS로 3회 세척하고 핵 형광 염색 용액인 프로피디움 아이오다이드 (PI, 시그마-알드리치, 세인트루이스, MO)를 1 ㎍/㎖ 농도로 대조 염색하였다. 5분간 PI 염색 후, 세포를 PBS로 3회 세척하고 DABCO (플루카, 세인트루이스, MO) 함유 폴리비닐 알코올 중첩 배지를 이용하여 고정시켰다. 형광의 세포내 분포를 공초점 레이저 주사현미경으로 분석되는 단일 세포의 중앙에서 결정하였고, 그 결과를 도 10 및 11에 나타내었다. 각각의 형광색소에 특이적인 매개변수로서 FITC는 488 nm 광에서 여기되고, 530 nm 대역주파수 필터로 검출되었다.

놀랍게도, 도 10 및 11에 나타난 바와 같이, FITC-접합된 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질은 세포 단독, FITC 단독 및 kFGF4-유래 MTD를 포함하지 않는 대조군과 비교하여 핵 내에 대량으로 고르게 분포하였다. SV40 거대 T 항원-유래 NLS 및 kFGF4-유래 MTD에 융합된 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 세포내 핵 국소화는 유세포분석에 의해 결정된 상기 단백질의 세포 유입 효율과 완벽하게 일치하였다.

실시예 6 - 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질이 병합 처리된 성체 줄기세포의 세포 개체수에 있어서의 증가 및 세포 분화의 억제

2종의 전사인자, Nanog 및 Oct4는 내세포괴 (ICM) 및 배아 줄기세포 (ES)에서 다능성 및 자가-재생을 유지하기 위해 협력하여 작용하는 것으로 생각된다. 이에 하기와 같이 성체 줄기세포에 본 발명의 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질을 병합하여 처리함으로써 성체 줄기세포가 이들의 자가-재생 및 분화능을 유지할 수 있는지 여부를 조사하였다 .

인간 성체 줄기세포로서, 지방흡입-유래 지방세포로부터 제조된 중간엽 줄기세포 (MSCs)를 사용하였다. 줄기세포를 10% 우태아혈청이 보충된 α-최소 필수 배지 (α-MEM)에 접종하여 5% CO₂의 습윤된 대기 중에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 5 ㎖의 α-MEM을 포함하는 5개의 6-㎜ 배양 접시에 각 접시 당 1.5×10⁴ 세포의 농도로 분주하고, 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질 (HNM+HMO, HNM+HOM, 또는 HNM+HMOM)을 각각 10 μM 농도로 15일간 3일 간격으로 병합 처리하였다. 이때, 재조합 단백질로 처리되지 않은 세포 (세포 단독)를 음성 대조군으로 사용하고, kFGF4-유래 MTD (HN+HO)를 포함하지 않는 Nanog 및 Oct4 대조군 단백질로 병합 처리된 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 세포의 개수를 역상 현미경 (니콘 이클립스 TS100, 카와사키, 일본)을 이용하여 처리 전 (0일째), 및 처리하고 4, 11, 및 15일째에 선발된 9개의 원형 지역 (r = 1 ㎜) 내에서 세었고 이를 평균 내었다.

도 12 및 13에 나타난 바와 같이, 처리 후 12일째까지는, CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질로 병합 처리된 세포의 개수가 무처리 세포 (세포 단독) 및 Nanog 및 Oct4 대조군 단백질 (HN+NO)로 병합 처리된 세포와 비교하여 유의미하게 증가하였는데, 이는 Nanog 및 Oct4가 MSCs의 핵 내로 성공적으로 도입되어, 그로써 세포 외 배양 동안에 자가-재생 활성을 유지할 수 있음을 나타내는 것이다. 단백질 처리와 무관하게, 모든 배양된 세포는 15일째에 갑자기 사멸하였는데, 이는 아마도 이 세포의 복제 수명이 다했기 때문으로 추측되었다. 단지 HNM+HOM의 병합 처리 그룹에서만, 2개의 세포가 생존하여 일차 줄기세포로 분리되었는데, 이는 그의 독특한 특성, 자가-재생 능력 및 분화 잠재능을 유지하는 줄기세포주의 확립이 가능함을 나타내는 것이다. 한편, 배양 후 11일째에 무처리 그룹에서 생존된 7개의 세포는 그들의 형태가 완벽하게 변화하였는데, 이는 도 14에 나타난 바와 같이, 다른 세포 유형으로의 분화 및 노화를 나타내는 것이다.

또한, 도 12는 처리 후 11일째에, 무처리 그룹 (세포 단독) 및 HN+HO 처리 그룹의 세포들은 분화되어 다른 세포 유형으로의 특정 형태학적 변화를 초래하는 반면, CP-Nanog 및 CP-Oct4 병합 처리 그룹 (HN+HO, HNM+HMO 및 HNM+HMOM)의 세포는 여전히 중간엽 줄기세포의 특징적인 형태를 유지하고 단백질 처리가 종결된 후에도 34일 이상 이를 유지하였다.

CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질의 병합 처리가 단리된 줄기세포의 분화 및 노화를 억제할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 상기 병합 처리를 15일째에 중단하고, HNM+HOM의 그룹에서 생존한 2개의 단리된 세포와, 무처리 그룹 (세포 단독)에서 생존한 7개의 세포를 상기 처리의 중단 후에 CP-단백질의 부재 하에서 34일간 더 배양하였다.

도 15a는 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질의 병합 처리가 중단된 후 선발된 클론성 성체 줄기세포의 자가-재생 및 억제성 분화능을 시각적으로 보여주는 역상 현미경 (니콘 이클립스 TS100, 카와사키, 일본) 사진이고, 도 15b는 동일한 처리 후 선발된 클론성 성체 줄기세포의 개수를 나타내는 그래프이다. 도 15a 및 15b에 나타난 바와 같이, HNM+HOM 그룹으로부터 선발된 세포의 개수는, 44일째 (세포가 상기 처리의 중단 후 29일간 더 배양된 시점)에 세포 단독 그룹으로부터 선발된 세포의 개수 (15개 세포)에 비하여 시간의 경과에 따라 유의미하게 증가 (62개 세포)하였다. 상기 처리의 중단 후 세포를 34일간 더 배양된 시점인 49일째에, 세포 단독 그룹으로부터 유래한 세포는 모두 사멸하였다. 그러나, HNM+HOM 처리 그룹으로부터 유래한 세포는 어떠한 형태학적 변화없이 여전히 생존하였다.

상기 결과는 본 발명에 따른 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질의 병합 처리가 줄기세포의 개수를 유의미하게 증가시키고 세포 분화 및 세포 노화를 강력하게 억제할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 7 - 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질이 병합 처리된 성체 줄기세포에서 p21 발현의 억제

중간엽 줄기세포 (MSCs)에 대한 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질의 생물학적 기능을 평가하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 하기와 같이 수행하였다.

세포를 실시예 6에 따라 세포 단독, kFGF4-유래 MTD를 포함하지 않는 Nanog 및 Oct 대조군 단백질 (HN+HO)의 병합 처리 및 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질 (HNM+HMO, HNM+HOM 및 HNM+HMOM)의 병합 처리의 5개 실험 그룹으로부터 0일째, 5일째 및 8일째에 각각 수확한 후 PBS로 세척하였다. 이어서 세포를 단백분해효소 억제제 칵테일 (로쉐 몰레큘라 바이오케미칼즈, GmbH, 만하임, 독일)을 함유하는 RIPA 완충액 (20 mM 트리스-HCl [pH 8], 137 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100, 2 mM EDTA)으로 용해시키고 얼음 중에서 20분간 인큐베이션하여 세포 용해물을 수득하였다. 세포 용해물을 4℃에서 10분간 13,000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 분리하였다. 이렇게 수득된 상청액을 12% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE) 상에서 분석한 후 NuPAGE (인비트로젠, 찰스배드, CA, 미국)의 트랜스-블롯 (Trans-Blot) 시스템을 이용하여 PDVF 막 (immobilon-P^SQ)(베드포드, MA, 미국) 위로 옮겼다. PVDF 막을 TBST (10 mM 트리스, 100 mM NaCl, 0.1% 트윈 20, pH 7.5) 중의 5% 탈지 분유로 차단한 후 이어서 5% TBST를 이용해 1:1000으로 희석된 항-p21 항체 (산타크루즈 바이오테크놀러지, 산타크루즈, CA)와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 TBST로 세척하고 TBST를 이용해 1:1000으로 희석된 홍당무 과산화효소-접합된 이차 항체 (산타크루즈 바이오테크놀러지, 산타크루즈, CA)와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. TBST로 세척한 후, 항원/항체 상호작용을 시각적으로 나타내기 위해 막을 ECL 플러스 시스템 (아머샴 파마시아 바이오테크, 웁살라, 스웨덴)을 이용해 염색하였다.

도 16에 나타난 바와 같이, p21 발현은 무처리 그룹 (세포 단독) 또는 대조군 단백질 (HN+HO)로 처리된 그룹과 비교하여 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질 (HNM+HMO, HNM+HOM 및 HNM+HMOM)이 병합 처리된 그룹의 세포에서 거의 완벽하게 억제되었다. 사이클린 의존성 키나제 억제제 (CDK)인, p21의 유의미하게 감소된 발현은 본 발명에 따른 CP-Nanog 및 CP-Oct4의 병합 처리가 처리된 줄기세포의 자가-재생을 위한 세포주기 진행을 강력하게 유도함을 나타내는 것이다.

실시예 8 - 세포투과성 Nanog 및 Oct4 재조합 단백질이 병합 처리된 성체 줄기세포의 텔로머라제 활성에 있어서의 증가

CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질이 병합 처리된 성체 줄기세포가 확립된 줄기세포주의 특징을 나타내는지 여부를 결정하기 위해, 텔로머라제 활성을 측정하였다. 생식세포와 같은 불멸세포는 매우 높은 수준의 텔로머라제 활성을 나타낸다. 텔로머라제는 염색체 말단에 텔로미어 (telomere) 반복을 부가함으로써 텔로미어 길이를 유지하여 복제성 수명을 연장하는데 관여하는 리보핵산단백이다.

CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질로 병합 처리된 중간엽 줄기세포의 텔로머라제 활성은 TRAPEZE (등록상표) 텔로머라제 검출 키트 (케미콘 인터내소날 인크, 테메큘라, CA)를 이용한 텔로머릭 반복 증폭 프로토콜 (Telomeric Repeat Amplication Protocol, TRAP) 분석에 의해 결정하였다. 무처리 (세포 단독), Nanog 및 Oct4 대조군 단백질 (HN+NO) 및 Cp-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질 (HNM+HMO, HNM+HOM 및 HNM+HMOM)로 처리된 세포를 0일째 및 상기 처리 후 3일째에 수확하였다. 세포 펠렛을 1× CHAPS 용해 완충액 (10 mM 트리스-HCl pH 7.5, 1 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0.1 mM β-머캅토에탄올, 0.5% CHAPS, 10% 글리세롤)에 현탁하고 얼음 중에서 30분간 인큐베이션한 후, 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상청액을 분리하였다. 이렇게 수득된 상청액을 하기와 같은 조건 하에서의 PCR에 사용하였다: 94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 및 72℃에서 1분의 반응 30회. 증폭된 PCR 산물을 0.5× TBE 완충액 중의 12.5% 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 상에 로우딩하고, 에티듐-브로마이드 (EtBr)로 염색한 후 탈염색하였다. 증폭 효율 및 정량적 분석을 위한 36개-염기 쌍의 내부 대조군이 화살표로 표시된 바와 같이 각각의 반응에 대해 사용되었다 (도 17).

도 17에 나타난 바와 같이, CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질의 병합 처리는 높은 수준의 텔로머라제 활성을 유도하였다. 3일째 CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질로 병합 처리된 세포에서의 텔로머라제 활성은 3일째 무처리 세포의 텔로머라제 활성과 비교하여 유의미하게 증가하였다 (3일째, 대조군 단백질 (HN+HO)로 처리된 세포는 매우 병약하고 쉽게 사멸하였기 때문에, 분석에 충분한 정도로 세포 추출물을 준비할 없었음). CP-Nanog 및 CP-Oct4 재조합 단백질로 병합 처리된 세포에서의 높은 텔로머라제 활성은 이러한 병합 처리가 이 세포의 복제성 수명을 증가시킴을 나타내는 것이다.

본 발명은 그의 특정한 실시형태를 참고로 상세히 기술되었다. 그러나 그의 범위가 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의되는, 발명의 원리 및 요지를 벗어나지 않으면서 이들 실시형태에 변경이 이루어질 수 있음이 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 인식될 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAN NATIONAL UNIVERSITY <120> COMBINED USE OF CELL PERMEABLE NANOG AND OCT4 FOR INCREASING SELF-RENEWAL AND SUPPRESSING DIFFERENTIATION OF STEM CELLS <130> KC090123 <150> US60/891,824 <151> 2007-02-27 <160> 46 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 918 <212> DNA <213> Human Nanog Transcription Factor <400> 1 atgagtgtgg atccagcttg tccccaaagc ttgccttgct ttgaagcatc cgactgtaaa 60 gaatcttcac ctatgcctgt gatttgtggg cctgaagaaa actatccatc cttgcaaatg 120 tcttctgctg agatgcctca cacggagact gtctctcctc ttccctcctc catggatctg 180 cttattcagg acagccctga ttcttccacc agtcccaaag gcaaacaacc cacttctgca 240 gagaatagtg tcgcaaaaaa ggaagacaag gtcccagtca agaaacagaa gaccagaact 300 gtgttctctt ccacccagct gtgtgtactc aatgatagat ttcagagaca gaaatacctc 360 agcctccagc agatgcaaga actctccaac atcctgaacc tcagctacaa acaggtgaag 420 acctggttcc agaaccagag aatgaaatct aagaggtggc agaaaaacaa ctggccgaag 480 aatagcaatg gtgtgacgca gaaggcctca gcacctacct accccagcct ctactcttcc 540 taccaccagg gatgcctggt 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Asp 100 105 110 Arg Phe Gln Arg Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu Leu 115 120 125 Ser Asn Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe Gln 130 135 140 Asn Gln Arg Met Lys Ser Lys Arg Trp Gln Lys Asn Asn Trp Pro Lys 145 150 155 160 Asn Ser Asn Gly Val Thr Gln Lys Ala Ser Ala Pro Thr Tyr Pro Ser 165 170 175 Leu Tyr Ser Ser Tyr His Gln Gly Cys Leu Val Asn Pro Thr Gly Asn 180 185 190 Leu Pro Met Trp Ser Asn Gln Thr Trp Asn Asn Ser Thr Trp Ser Asn 195 200 205 Gln Thr Gln Asn Ile Gln Ser Trp Ser Asn His Ser Trp Asn Thr Gln 210 215 220 Thr Trp Cys Thr Gln Ser Trp Asn Asn Gln Ala Trp Asn Ser Pro Phe 225 230 235 240 Tyr Asn Cys Gly Glu Glu Ser Leu Gln Ser Cys Met Gln Phe Gln Pro 245 250 255 Asn Ser Pro Ala Ser Asp Leu Glu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Glu 260 265 270 Gly Leu Asn Val Ile Gln Gln Thr Thr Arg Tyr Phe Ser Thr Pro Gln 275 280 285 Thr Met Asp Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Met Asn Met Gln Pro Glu Asp 290 295 300 Val 305 <210> 3 <211> 1083 <212> DNA <213> Human Oct4 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Cys Gly Ala Gly 820 825 830 Thr Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala 835 840 845 Gly Ala Ala Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly 850 855 860 Thr Gly Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys 865 870 875 880 Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala 885 890 895 Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr 900 905 910 Gly Gly Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Thr Gly 915 920 925 Thr Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Gly Thr Gly Gly Thr Thr 930 935 940 Cys Thr Gly Thr Ala Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly 945 950 955 960 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Ala Ala 965 970 975 Gly Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Cys Ala Cys Ala 980 985 990 Ala Cys Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Gly 995 1000 1005 Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Thr 1010 1015 1020 Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Thr 1025 1030 1035 1040 Gly Thr Cys Cys Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys 1045 1050 1055 Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly 1060 1065 1070 Gly Thr Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly 1075 1080 1085 Gly Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Cys Ala Cys Thr 1090 1095 1100 Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly 1105 1110 1115 1120 Thr Cys Cys Cys Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Gly 1125 1130 1135 Gly Gly Ala Ala Gly Cys Cys Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Thr 1140 1145 1150 Gly Thr Cys Thr Cys Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr Cys 1155 1160 1165 Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Ala Thr Gly Cys Ala 1170 1175 1180 Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Thr 1185 1190 1195 1200 Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Cys Thr Thr Cys 1205 1210 1215 Thr Thr Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala 1220 1225 1230 <210> 31 <211> 385 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-Oct4 recombinant protein <400> 31 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Lys Lys Lys Arg Lys Ala Gly His Leu Ala Ser 20 25 30 Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly 35 40 45 Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln 50 55 60 Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser 65 70 75 80 Glu Val Trp Gly Ile Pro Pro Cys Pro Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly 85 90 95 Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val Gly Val Gly Leu Val Pro Gln 100 105 110 Gly Gly Leu Glu Thr Ser Gln Pro Glu Gly Glu Ala Gly Val Gly Val 115 120 125 Glu Ser Asn Ser Asp Gly Ala Ser Pro Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Lys Leu Glu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu 145 150 155 160 Ser Gln Asp Ile Lys Ala Leu Gln Lys Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys 165 170 175 Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val 180 185 190 Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr 195 200 205 Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys 210 215 220 Leu Arg Pro Leu Leu Gln Lys Trp Val Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu 225 230 235 240 Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ala Glu Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys 245 250 255 Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn 260 265 270 Leu Phe Leu Gln Cys Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gln Ile Ser His Ile 275 280 285 Ala Gln Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val Trp Phe Cys 290 295 300 Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg 305 310 315 320 Glu Asp Phe Glu Ala Ala Gly Ser Pro Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser 325 330 335 Phe Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Phe Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser 340 345 350 Pro His Phe Thr Ala Leu Tyr Ser Ser Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu 355 360 365 Ala Phe Pro Pro Val Ser Val Thr Thr Leu Gly Ser Pro Met His Ser 370 375 380 Asn 385 <210> 32 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-MTD-Oct4 recombinant protein <400> 32 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Lys Lys Lys Arg Lys Ala Ala Val Leu Leu Pro 20 25 30 Val Leu Leu Ala Ala Pro Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Pro Pro Gly Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro 50 55 60 Gly Trp Val Asp Pro Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly 65 70 75 80 Gly Pro Gly Ile Gly Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser Glu Val Trp Gly 85 90 95 Ile Pro Pro Cys Pro Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly Gly Met Ala Tyr 100 105 110 Cys Gly Pro Gln Val Gly Val Gly Leu Val Pro Gln Gly Gly Leu Glu 115 120 125 Thr Ser Gln Pro Glu Gly Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ser Asn Ser 130 135 140 Asp Gly Ala Ser Pro Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro Gly Ala Val Lys 145 150 155 160 Leu Glu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu Ser Gln Asp Ile 165 170 175 Lys Ala Leu Gln Lys Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu Leu Lys Gln 180 185 190 Lys Arg Ile Thr Leu Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Thr Leu 195 200 205 Gly Val Leu Phe Gly Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe 210 215 220 Glu Ala Leu Gln Leu Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg Pro Leu 225 230 235 240 Leu Gln Lys Trp Val Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln Glu 245 250 255 Ile Cys Lys Ala Glu Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr 260 265 270 Ser Ile Glu Asn Arg Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe Leu Gln 275 280 285 Cys Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln Gln Leu 290 295 300 Gly Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln 305 310 315 320 Lys Gly Lys Arg Ser Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg Glu Asp Phe Glu 325 330 335 Ala Ala Gly Ser Pro Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser Phe Pro Leu Ala 340 345 350 Pro Gly Pro His Phe Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe Thr 355 360 365 Ala Leu Tyr Ser Ser Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe Pro Pro 370 375 380 Val Ser Val Thr Thr Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn 385 390 395 <210> 33 <211> 397 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-Oct4-MTD recombinant protein <400> 33 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Lys Lys Lys Arg Lys Ala Gly His Leu Ala Ser 20 25 30 Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly 35 40 45 Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln 50 55 60 Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser 65 70 75 80 Glu Val Trp Gly Ile Pro Pro Cys Pro Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly 85 90 95 Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val Gly Val Gly Leu Val Pro Gln 100 105 110 Gly Gly Leu Glu Thr Ser Gln Pro Glu Gly Glu Ala Gly Val Gly Val 115 120 125 Glu Ser Asn Ser Asp Gly Ala Ser Pro Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro 130 135 140 Gly Ala Val Lys Leu Glu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu 145 150 155 160 Ser Gln Asp Ile Lys Ala Leu Gln Lys Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys 165 170 175 Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val 180 185 190 Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr 195 200 205 Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys 210 215 220 Leu Arg Pro Leu Leu Gln Lys Trp Val Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu 225 230 235 240 Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ala Glu Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys 245 250 255 Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn 260 265 270 Leu Phe Leu Gln Cys Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gln Ile Ser His Ile 275 280 285 Ala Gln Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val Trp Phe Cys 290 295 300 Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg 305 310 315 320 Glu Asp Phe Glu Ala Ala Gly Ser Pro Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser 325 330 335 Phe Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Phe Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser 340 345 350 Pro His Phe Thr Ala Leu Tyr Ser Ser Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu 355 360 365 Ala Phe Pro Pro Val Ser Val Thr Thr Leu Gly Ser Pro Met His Ser 370 375 380 Asn Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 385 390 395 <210> 34 <211> 409 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-MTD-Oct4-MTD recombinant protein <400> 34 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Lys Lys Lys Arg Lys Ala Ala Val Leu Leu Pro 20 25 30 Val Leu Leu Ala Ala Pro Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe 35 40 45 Ser Pro Pro Pro Gly Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro 50 55 60 Gly Trp Val Asp Pro Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly 65 70 75 80 Gly Pro Gly Ile Gly Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser Glu Val Trp Gly 85 90 95 Ile Pro Pro Cys Pro Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly Gly Met Ala Tyr 100 105 110 Cys Gly Pro Gln Val Gly Val Gly Leu Val Pro Gln Gly Gly Leu Glu 115 120 125 Thr Ser Gln Pro Glu Gly Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ser Asn Ser 130 135 140 Asp Gly Ala Ser Pro Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro Gly Ala Val Lys 145 150 155 160 Leu Glu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu Ser Gln Asp Ile 165 170 175 Lys Ala Leu Gln Lys Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu Leu Lys Gln 180 185 190 Lys Arg Ile Thr Leu Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Thr Leu 195 200 205 Gly Val Leu Phe Gly Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe 210 215 220 Glu Ala Leu Gln Leu Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg Pro Leu 225 230 235 240 Leu Gln Lys Trp Val Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln Glu 245 250 255 Ile Cys Lys Ala Glu Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr 260 265 270 Ser Ile Glu Asn Arg Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe Leu Gln 275 280 285 Cys Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln Gln Leu 290 295 300 Gly Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln 305 310 315 320 Lys Gly Lys Arg Ser Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg Glu Asp Phe Glu 325 330 335 Ala Ala Gly Ser Pro Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser Phe Pro Leu Ala 340 345 350 Pro Gly Pro His Phe Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe Thr 355 360 365 Ala Leu Tyr Ser Ser Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe Pro Pro 370 375 380 Val Ser Val Thr Thr Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn Ala Ala Val 385 390 395 400 Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 405 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HN-5' forward primer <400> 35 ccgcatatga agaagaagag gaagagtgtg gatccagctt gtccc 45 <210> 36 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMN-5' forward primer <400> 36 ccgcatatga agaagaagag gaaggcagcc gttcttctcc ctgttcttct tgccgcaccc 60 agtgtggatc cagcttgtcc ccaa 84 <210> 37 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNH-5' forward primer <400> 37 ccgcatatga agaagaagag gaagcagaag accagaactg tgttctcttc c 51 <210> 38 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNC-5' forward primer <400> 38 ccgcatatga agaagaagag gaagaacaac tggccgaaga atagcaatgg t 51 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HN-3' reverse primer <400> 39 ccgcatatgt cacacgtctt caggttgcat gttcat 36 <210> 40 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNM-3' reverse primer <400> 40 ccgcatatgt cagggtgcgg caagaagaac agggagaaga acggctgcca cgtcttcagg 60 ttgcatgttc at 72 <210> 41 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNHM-3' reverse primer <400> 41 ccgcatatgt cagggtgcgg caagaagaac agggagaaga acggctgctt tctgccacct 60 cttagatttc at 72 <210> 42 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNNM-3' reverse primer <400> 42 ccgcatatgt cagggtgcgg caagaagaac agggagaaga acggctgctt tcttgactgg 60 gaccttgtct tcctt 75 <210> 43 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO-5' forward primer <400> 43 ccgcatatga agaagaagag gaaggcggga cacctggctt cggat 45 <210> 44 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HMO-5' forward primer <400> 44 ccgcatatga agaagaagag gaaggcagcc gttcttctcc ctgttcttct tgccgcaccc 60 gcgggacacc tggcttcgga tttc 84 <210> 45 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HO-3' reverse primer <400> 45 ccgcatatgt cagtttgaat gcatgggaga gcccag 36 <210> 46 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HOM-3' reverse primer <400> 46 ccgcatatgt cagggtgcgg caagaagaac agggagaaga acggctgcgt ttgaatgcat 60 gggagagccc ag 72

Claims (34)

1. 카포시 섬유아세포 성장인자 4 (kFGF4)-유래 거대분자 전달 도메인 (MTD) 및 인간 전사인자 Nanog를 포함하고, 상기 kFGF4-유래 MTD가 인간 Nanog 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합되어 있는 단리된 세포투과성 Nanog 재조합 단백질.
2. 제1항에 있어서, 상기 kFGF4-유래 MTD가 서열번호: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인 단리된 세포투과성 Nanog 재조합 단백질.
3. 제1항에 있어서, 상기 인간 전사인자 Nanog가 N-말단 도메인, 호메오도메인 및 트립토판 반복을 모두 포함하는 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 전장 형태, 또는 상기 N-말단 도메인, 호메오도메인 및 트립토판 반복의 하나 이상이 결손된 결절 형태인 것인 단리된 세포투과성 Nanog 재조합 단백질.
4. 제1항에 있어서, 핵 국소화 서열 (NLS)을 추가로 포함하고, 상기 핵 국소화 서열이 재조합 단백질의 일 말단에 공유적으로 결합되는 것인 단리된 세포투과성 Nanog 재조합 단백질.
5. 제4항에 있어서, 상기 핵 국소화 서열이 서열번호: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인 단리된 세포투과성 Nanog 재조합 단백질.
6. 제1항에 있어서, 히스티딘-표지 (His-Tag) 친화성 도메인을 추가로 포함하고, 상기 히스티딘-표지 친화성 도메인이 재조합 단백질의 N-말단에 공유적으로 결합되는 것인 단리된 세포투과성 Nanog 재조합 단백질.
7. 제1항에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합 단백질인 단리된 세포투과성 Nanog 재조합 단백질:

   kFGF4-유래 MTD가 전장 Nanog의 N-말단에 융합되어 있는 His-MTD-Nanog (HMN),

   kFGF4-유래 MTD가 전장 Nanog의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog-MTD (HNM),

   kFGF4-유래 MTD가 전장 Nanog의 양쪽 말단 모두에 융합되어 있는 His-MTD-Nanog-MTD (HMNM),

   kFGF4-유래 MTD가 호메오도메인 및 트립토판 반복이 결손된 Nanog N-말단 도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog N-말단-MTD (HNNM),

   kFGF4-유래 MTD가 N-말단 및 C-말단 도메인이 결손된 Nanog 호메오도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog 호메오도메인-MTD (HNHM),

   kFGF4-유래 MTD가 N-말단 도메인 및 호메오도메인이 결손된 Nanog C-말단 도메인의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog C-말단 MTD (HNCM),

   kFGF4-유래 MTD가 C-말단 도메인이 결손된 Nanog N-말단 도메인 및 호메오도 메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog N-말단-호메오도메인-MTD (HNNHM), 및

   kFGF4-유래 MTD가 N-말단 도메인이 결손된 Nanog 호메오도메인 및 C-말단 도메인 단편의 C-말단에 융합되어 있는 His-Nanog 호메오도메인-C-말단-MTD (HNHCM),

   상기에서 His-tag 및 SV40 거대 T 항원 유래 NLS가 모든 재조합 단백질의 N-말단에 공유적으로 결합되어 있음.
8. 제7항에 있어서,

   His-MTD-Nanog (HMN)가 서열번호: 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고;

   His-Nanog-MTD (HNM)가 서열번호: 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖고;

   His-MTD-Nanog-MTD (HMNM)가 서열번호: 12로 표시되는 아미노산 서열을 갖고;

   His-Nanog N-말단-MTD (HNNM)가 서열번호: 13으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고;

   His-Nanog 호메오도메인-MTD (HNHM)가 서열번호: 14로 표시되는 아미노산 서열을 갖고;

   His-Nanog C-말단 MTD (HNCM)가 서열번호: 15로 표시되는 아미노산 서열을 갖고;

   His-Nanog N-말단-호메오도메인-MTD (HNNHM)가 서열번호: 16으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고;

   His-Nanog 호메오도메인-C-말단-MTD (HNHCM)가 서열번호: 17로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인 단리된 세포투과성 Nanog 재조합 단백질.
9. 카포시 섬유아세포 성장인자 4 (kFGF4)-유래 거대분자 전달 도메인 (MTD) 펩티드 및 인간 전사인자 Oct4를 포함하고, 상기 kFGF4-유래 MTD가 인간 Oct4 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합되어 있는 단리된 세포투과성 Oct4 재조합 단백질.
10. 제9항에 있어서, 상기 kFGF4-유래 MTD가 서열번호: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인 단리된 세포투과성 Oct4 재조합 단백질.
11. 제9항에 있어서, 상기 인간 전사인자 Oct4가 프롤린 풍부 영역, POU 특이적 도메인 및 호메오도메인 모두를 포함하는 서열번호: 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 전장 형태, 또는 상기 프롤린 풍부 영역, POU 특이적 도메인 및 호메오도메인의 하나 이상이 결손된 결절 형태인 것인 단리된 세포투과성 Oct4 재조합 단백질.
12. 제9항에 있어서, 핵 국소화 서열 (NLS)을 추가로 포함하고, 상기 핵 국소화 서열이 재조합 단백질의 일 말단에 공유적으로 결합되는 것인 단리된 세포투과성 Oct4 재조합 단백질.
13. 제12항에 있어서, 상기 핵 국소화 서열이 서열번호: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인 단리된 세포투과성 Oct4 재조합 단백질.
14. 제9항에 있어서, 히스티딘-표지 (His-Tag) 친화성 도메인을 추가로 포함하고, 상기 히스티딘-표지 친화성 도메인이 재조합 단백질의 N-말단에 공유적으로 결합되는 것인 단리된 세포투과성 Oct4 재조합 단백질.
15. 제9항에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 재조합 단백질인 단리된 세포투과성 Oct4 재조합 단백질:

    kFGF4-유래 MTD가 전장 Oct4의 N-말단에 융합되어 있는 His-MTD-Oct4 (HMO),

    kFGF4-유래 MTD가 전장 Oct4의 C-말단에 융합되어 있는 His-Oct4-MTD (HOM), 및

    kFGF4-유래 MTD가 전장 Oct4의 양쪽 말단 모두에 융합되어 있는 His-MTD-Oct4-MTD (HMOM),

    상기에서 His-tag 및 SV40 거대 T 항원 유래 NLS가 모든 재조합 단백질의 N-말단에 공유적으로 결합되어 있음.
16. 제15항에 있어서,

    His-MTD-Oct4 (HMO)가 서열번호: 28로 표시되는 아미노산 서열을 갖고;

    His-Oct4-MTD (HOM)가 서열번호: 29로 표시되는 아미노산 서열을 갖고;

    His-MTD-Oct4-MTD (HMOM)가 서열번호: 30으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것인 단리된 세포투과성 Oct4 재조합 단백질.
17. 제1항에 따른 세포투과성 Nanog 재조합 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
18. 제17항에 있어서, 서열번호: 19 내지 26으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드.
19. 제9항에 따른 세포투과성 Oct4 재조합 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
20. 제19항에 있어서, 서열번호: 32 내지 34로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드.
21. 제17항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
22. 제21항에 있어서, pET28a(+)-HNM (기탁번호: KCTC 11278BP).
23. 제19항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
24. 제21항에 있어서, pET28a(+)-HMO (기탁번호: KCTC 11279BP), pET28a(+)-HOM (기탁번호: KCTC 11280BP) 또는 pET28a(+)-HMOM (기탁번호: KCTC 11281BP)인 발현벡터.
25. 제21항에 따른 발현벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킴으로써 수득될 수 있는 세포투과성 Nanog 재조합 단백질을 높은 수준으로 생산할 수 있는 형질전환체.
26. 제24항에 따른 발현벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킴으로써 수득될 수 있는 세포투과성 Oct4 재조합 단백질을 높은 수준으로 생산할 수 있는 형질전환체.
27. 제25항에 따른 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 세포투과성 Nanog 재조합 단백질을 높은 수준으로 생산하는 방법.
28. 제26항에 따른 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 세포투과성 Oct4 재조합 단백질을 높은 수준으로 생산하는 방법.
29. 제1항에 따른 세포투과성 Nanog 재조합 단백질 및 제9항에 따른 세포투과성 Oct4 재조합 단백질을 병합하여 줄기세포를 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 줄기세포가 성체 줄기세포, 태반 줄기세포, 태아 줄기세포 또는 제대 줄기세포인 것인 방법.
31. 제29항에 있어서, 상기 줄기세포가 배아 줄기 (ES) 세포, 배아 암종 (EC) 세포 또는 배아 생식 (EG) 세포인 것인 방법.
32. 줄기세포의 자가-재생을 촉진하고 분화를 억제하기 위한 제1항에 따른 세포투과성 Nanog 재조합 단백질 및 제9항에 따른 세포투과성 Oct4 재조합 단백질의 병합 용도.
33. 제32항에 있어서, 상기 줄기세포가 성체 줄기세포, 태반 줄기세포, 태아 줄기세포 또는 제대 줄기세포인 것인 병합 용도.
34. 제32항에 있어서, 상기 줄기세포가 배아 줄기 (ES) 세포, 배아 암종 (EC) 세포 또는 배아 생식 (EG) 세포인 것인 병합 용도.

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