KR20030088023A - 미리 선별된 면역형 및(또는) 유전자형을 갖는 동형접합성간세포 군집의 제조 방법, 그로부터 유래된 이식에 적합한세포, 및 이들을 사용하는 재료 및 방법 - Google Patents

미리 선별된 면역형 및(또는) 유전자형을 갖는 동형접합성간세포 군집의 제조 방법, 그로부터 유래된 이식에 적합한세포, 및 이들을 사용하는 재료 및 방법 Download PDF

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Abstract

본원에는 공여자로부터의 면역형 및(또는) 유전자형에 대해 미리 선별된 동형접합성 간세포 (HS 세포)의 균일한 군집을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 본 발명은 진단, 치료 및 미용상 이식, 및 각종 유전자 질환, 신경퇴행성 질환, 외상성 손상 및 암의 치료를 위해 조직적합성 HS 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료 및 미용상 이식, 및 각종 유전자 질환, 신경퇴행성 질환 및 암의 치료 등을 비롯한 예방 및 치료적 목적으로 비-질환 유전자형에 대해 미리 선별된 조직적합성 HS 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은, 진단, 치료 및(또는) 이식을 위해 면역조직적합성 세포를 일정하고 신뢰할 수 있으며 포괄적으로 공급할 목적을 지닌, 각각의 HS 세포가 유일한 HLA 일배체형에 대해 동형접합성인 다수의 공여자로부터 유래한 HS 세포의 목록화된 이식 집합물에 관한 것이다.

Description

미리 선별된 면역형 및(또는) 유전자형을 갖는 동형접합성 간세포 군집의 제조 방법, 그로부터 유래된 이식에 적합한 세포, 및 이들을 사용하는 재료 및 방법 {A Method for Producing a Population of Homozygous Stem Cells Having a Pre-selected Immunotype and/or Genotype, Cells Suitable for Transplant Derived therefrom, and Materials and Methods Using Same}
본원은 2001년 1월 2일에 출원된 미국 가출원 제60/258,881호를 우선권으로 청구한다.
한 개체로부터 다른 개체로의 조직 이식은 거부반응의 위험이 따른다. 위험도는 공여자 및 수용자 세포의 표면 상에서 발현되는 특정한 유전자 산물인 항원들 간의 불일치 정도에 비례한다. 이식의 성공을 확보하기 위해, 공여자 조직은 수용자 조직과 면역조직적으로 적합성이어야 하며, 즉 공여자와 수용자 조직이 매칭되어야 한다. 매칭은 공여자 조직이 "자가" 항원을 발현시키는 경우에 달성된다. 수용자로부터의 T-세포는 "자가"로서 공여자 조직을 인식할 것이며, 따라서 이에 대한 면역 반응은 발생시키지 않을 것이다.
연구된 모든 포유동물 종에 있어서, 가장 강력한 이식 항원을 코딩하는 단일 유전자 좌위가 존재한다. 이는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)로서 공지되어 있다. 인간 백혈구 항원 (HLA)은 MHC에 대한 인간 대응물에 대한 유전자 명칭이다. HLA는 고도로 특이적인 방식으로 면역 반응을 한정하고, 이로써 조절한다. HLA에 의해 코딩된 분자는 이종 미생물 항원을 개체 자체의 T-세포에 결합시킨 채로 제공한다. 실제로, 이종 항원은 이들이 개체 자체의 HLA 분자와 관련하여 제공되는 경우에 개체의 T-세포에 의해서만 인식될 수 있다. 따라서, HLA 분자는 T-세포 수용체, 이종 미생물 항원 및 자가-HLA 분자로 구성된 삼분자 복합체에 관여한다.
이식과 관련하여, 비-자가 HLA 항원을 발현시키는 공여자 조직은 세포독성 T-세포에 의해 확실하게 사멸된다. 조직 이식편은 1개의 아미노산만큼 적은 수만큼 자가-HLA 분자와 상이한 HLA 분자로 인해 거부될 수 있다. 이러한 거부반응에 대한 주원인은 비-자가 HLA 분자가 자가-HLA 분자에 의해 인식되지 않은 다수의 펩티드를 인식하여 이들과의 복합체를 형성시키는 것으로 간주된다. T-세포는 이들 비-자가 HLA-펩티드 복합체에 비내성이고, 비-자가 HLA 분자의 구별되는 특징에 결합할 것이다.
따라서, HLA에 대한 공여자와 수용자 조직의 매칭은 수용자에서의 세포독성 T-세포 반응의 기회를 감소시키고, 따라서 이식체의 생존 기회를 상승시킨다. 그러나, 이들 자체의 매칭은 이식에 대한 문제점을 제공한다. 첫째, HLA 분자의 두 클래스, 즉 클래스 I 및 클래스 II가 존재한다. 둘째, 각각의 HLA 클래스에 대한 수가지 유전자가 존재하고, 상기 유전자의 각각은 다수의 대립유전자를 갖는다 (즉, HLA는 다형성이다). HLA는 다양한 면역 반응의 능력을 갖는 개체를 제공하는 한편, 이는 공여자-수용자 매칭이 수행하기에 어렵도록 만들기 때문에, 한 개체로부터 다른 개체로의 이식을 어려운 과업으로 만든다.
인간에 있어서, 클래스 I HLA 분자에 대해서는 3종의 유전자, HLA-A, HLA-B 및 HLA-Cw가 존재하고, 클래스 II HLA 분자에 대해서는 3종의 유전자, HLA-DR, -DP 및 -DQ가 존재한다. 또한, HLA 유전자는 다형성이다. 22종의 상이한 HLA-A 대립유전자, 42종의 상이한 -B 대립유전자, 9종의 상이한 -Cw 대립유전자 및 18종의 상이한 -DR 대립유전자가 존재한다. 매칭의 복잡성에 부가하여, 개체는 각각의 A, B, Cw 및 DR 대립유전자의 2가지를 보유하며, 여기서 A, B, Cw 및 DR (일배체형)의 한 세트는 각각의 모체로부터 유전되고, 따라서 개체는 A, B, Cw 및 DR 일배체형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
현재, HLA-A, -B, -Cw 및 -DR 매칭된 비관련 공여자 조직을 사용한 이식은 조직 분류 자원에 대한 다수의 요구를 야기한다. 이는 주로 HLA 유전자의 다형성 특성 및 거부반응 및 급성 이식편 대 숙주 질환을 최소화시키기 위한 매칭의 고도의 엄격성에 대한 요구로 인한 것이다. 평균적으로, HLA 다형성으로 인해, HLA-A, -B, -Cw 및 -DR에 대한 공여자-수용자 매칭을 발견하는 기회는 전체적인 군집에서의 환자의 조직형의 빈도에 따라 1/1,000 내지 수백만분의 1의 범위일 것이다. 또한, 문헌[Hansen, J.A., Anasetti, C., Peterdorf, E., Clift, R.A. and Martin, P.J., "Marrow tranplants from unrelated donors," Transplant Proc., 1994 Jun; 26;1719-1712 (개관)]을 참조한다.
본 발명은 동일한 HLA 일배체형의 2가지 세트를 보유하는 세포 또는 조직의 신뢰가능한 공급원을 제공하며, 이는 공여자와 수용자 간의 조직학적 매칭의 가능성을 상당히 증가시키고, 따라서 진단, 이식 및(또는) 치료에 사용할 수 있다. HS 세포는 동형접합성이고, 단지 1종의 HLA 일배체형을 발현시킨다. 따라서, 공여자 HS 세포는 이형접합성 간세포에서와 같이 2종보다는 공여자와 매칭할 1종의 HLA 일배체형만을 보유한다. HS 세포는 다수 종족의 무작위 공여자로부터 취하여, 무작위로 군집에서 개체에 의해 보유된 1종 이상의 일배체형을 면역조직적으로 매칭시키는 HS 세포 군집의 집합물 또는 뱅크 (bank)를 제공할 수 있다. 집합물은 특유한 HLA 일배체형을 갖는 약 200개의 상이한 HS 세포주만을 함유하여, 전체 군집 중 대부분을 공급할 (즉, 이식에 적합한 면역조직적합성 세포를 제공할) 수 있다.
또한, 인간에서의 유전자 요법은 윤리적인 문제를 초래한다. 체세포만이 관련된 유전자 조작과 생식세포가 관련될 수 있는 유전자 조작 간에 구별이 초래되었다. 체세포 조작은 일반적으로 단지 환자에만 영향을 미치기 때문에 승인되는 반면, 생식세포 조작은 환자의 자손에게 영향을 미치기 때문에 승인되지 않는다. 또한, 형질전환 동물에서의 연구에 의해 유전자 결함이 배아의 유전자 조작에 의해서만 효과적으로 교정할 수 있는 것으로 입증되었다. 그러나, 이러한 접근법은 실용적 이유로, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 세포 DNA내로의 통합에 의해 유발되는 삽입 돌연변이 유발의 수준이 비허용적으로 높으므로 유전자 요법에 대해 실현가능하지 않다.
또한, 본 발명은 유전자-대체 요법에서의 상당한 진보를 보장한다. 현재, 유전자 요법에 대한 다수의 장애가 존재한다. 질환이 유전자 중재에 적합한지의 여부, 장애에 대한 유전자를 동정하고 클로닝했는지의 여부, 유전자를 세포에 도입하는 효율적인 방법이 존재하는지의 여부 또는 유전자가 효과가 있는 질환에 걸린 조직 이외의 조직에서 발현될 수 있는지의 여부와 같은 문제는 유전자 요법의 실행가능성을 상당히 방해한다.
따라서, 유전자 요법을 포함한 이식 및(또는) 치료에 사용할 수 있는 조직적합성 세포 또는 조직의 신뢰가능한 공급원이 당해 분야에서 명백하게 요망된다. 예를 들어, 유전자 질환을 앓고 있는 환자와 조직적합성인 HS 세포를 이식을 위해 특정 세포형으로 분화시키기 전에 유전자 조작할 수 있다.
<발명의 개요>
본 발명은 단리된 동형접합성 간세포 (HS 세포), 및 이들 세포를 면역형 및 유전자형에 대해 선별할 수 있다는 발견에 관한 것이고, 따라서 본 발명은 진단, 이식 및(또는) 치료에 유용하다.
본 발명은 또한 혈청학적 또는 분자적 방법에 의해 HLA-A, -B, -Cw 및 -DR로분류된 HS 세포주에 대한 집합물 또는 뱅크를 제공하는데, 이는 조직 분류 자원에 대한 요구를 감소시킬 수 있다. 추가로, 본 발명은 면역형뿐만 아니라 유전자형에 대해서도 선별된 세포를 제공한다. 따라서, 본 발명은 비-질환 유전자형에 대해 미리 선별된 HS 세포를 작용 영역으로 이식할 수 있는 세포 이식 등에 의한 유전적 장애의 치료 방법을 제공한다. 따라서, 실제적인 유전적 간섭이 없는 효과적인 유전자 요법을 제공한다.
추가로, 본원에 개시된 본 발명은 HLA-분류된 HS 세포, 및 이들로부터 유래된 선조 세포 및 분화 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 2001년 11월 30일 출원된 "단리된 동형접합성 간세포, 그로부터 유래된 분화 세포 및 이들을 제조 및 사용하는 방법"이라는 제목의 미국 특허 출원 제09/997,240호, 및 다능성 동형접합성 간세포 (HS 세포), 이들의 생성 방법 및 재료, 및 생체내 또는 시험관내에서 HS 세포를 선조 세포 또는 다른 원하는 분화 세포, 세포 군 또는 조직 군으로 분화시키는 방법을 제공하는 미국 가출원 제60/253,943호의 교시내용과 조합시 유용하다.
살아있는 동물로 이식할 경우, 스템플라즘 (stemplasm)으로부터 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포의 활성화시 HS 세포가 생성된다. 본 발명의 추가의 목적은 상기 스템플라즘 내에서 발생의 여러 단계로부터 HS 세포를 단리하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 스템플라즘으로부터 단리할 수 있는 세포의 선별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 HS 세포는 다능성이며, 수정되지 않아서 생존 배아로 발생할 수없는 세포 군체로부터 단리된 것이기 때문에 윤리적 문제를 일으키지 않는다. 더욱이, 면역조직적합성 매칭은 동형접합성 ES 세포주가 조직 또는 세포 이식 요법에서 이용되거나, 뱅크 및(또는) 집합물 중에 유지되는 경우 달성되기 어렵다. 이것은, 어드밴스드 셀 테크놀로지 (Advanced Cel Technology) 및 다른 기관에 의해 개발된 것을 포함한 ES 세포주가 수정된 배아 또는 성인 분화된 세포를 사용한 핵 전달 기술로부터 유래되고, 게놈이 이형접합성이기 때문이다 (예를 들어, WO 01/84920A1, WO 01/79445A2 및 WO 01/29206A1). 제1 생식세포분열기 후의 생식세포 또는 스템플라즘에서 유래한 본 발명의 다능성 간세포는, 게놈이 동형접합성 (최소한의 이형접합성 또는 균일한 동형접합성)이거나 MHC 동형접합성에 대해 선별 (2개의 일배체 생식세포의 융합 및 핵 전달의 경우)된 것이기 때문에, 이러한 세포는 현재 이용가능한 이식술, 세포 치환술, 및 ES 세포주를 사용한 유전자 요법 기술이 직면하거나, ES 세포주를 뱅크 및(또는) 집합물에서 유지하는데 직면하는 면역조직적합성 문제를 극복하는데 사용될 수 있다.
배우자형성 동안, 이형접합성 생식세포, 즉 부계와 모계 염색체 둘다를 갖는 생식세포는 생식세포분열을 행한다. 제1 생식세포분열기 (생식세포분열 I)에서 상동성 염색체는 분리되어, 교차 현상으로 인해 도입되는 약간의 이형접합성을 갖는 부계 염색체 또는 모계 염색체를 함유하는 2개의 동형접합성 딸세포를 형성한다. 또한, 난모세포형성 동안, 하나의 딸세포 (제1 극체)의 방출이 관찰된다. 다른 딸세포는 중기 II에서 정지된다. 이러한 중기 II 이배체 난모세포는 최소한의 이형접합성을 갖는 동형접합성 간세포를 유도하는데 사용될 수 있다.
적절한 활성화시, 중기 II 난모세포는 염색분체 중 하나 (즉, 제2 극체)의 방출에 의해 생식세포분열이 완결되도록 진행하고 일배체 세포가 유발될 수 있다. 생식세포분열이 완결된 이러한 일배체 난모세포는 세포질분열 없이 자기 복제하여 이것을 이배체로 만들고 균일한 동형접합성이 되도록 만든다. 따라서, 생식세포분열이 완결된 이러한 일배체 난모세포도 이형접합성이 없는 본 발명의 동형접합성 간세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 문헌 (Kaufman M.H. Robertson E.J., Handyside A.H., Evans M.J., "Establishment of pluripotential cell lines from haploid mouse embryos," J. Embryol. Exp. Morphol., 73:249-61 (1983)) 참고할 수 있다. 생식세포분열 I 또는 II 생식세포로부터 유래된 스템플라즘으로부터 유래된 간세포는 또한 상기 언급한 동형접합성을 가지고 있다. 개체로부터 유래된 2개의 일배체 생식세포의 융합 또는 핵 전달로 인해 생성된 간세포는 동형접합성이 클 수 있음에도 불구하고, MHC에 대해 동형접합성인 세포를 선별할 수 있고, 이를 세포 기초의 치료적 응용에 사용할 수 있다.
최소한의 이형접합성과 균일한 동형접합성을 가진 HS 세포 2종 모두는, 동형접합성 간세포가 2세트의 동일한 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 일배체형을 포함할 수 있다는 점에서 이형접합성 ES 세포 (예를 들어, 수정된 배아, 핵 전달, 치료 클로닝 배아, 및 성인 간세포로부터 유도된 것)를 갖는 간세포에 비해서 우수하다. 따라서, HS 세포를 사용하면, 공여자와 이식 치료가 필요한 개체간의 면역조직적합성 매칭이 보다 쉽게 이루어진다. 이같은 하나의 MHC 일배체형에 대해 동형접합성인 간세포는 동일한 일배체형을 갖는 수용자뿐 아니라, 모 일배체형 중 어느 하나와 동일한 MHC 성분을 갖는 수용자에게도 허용된다.
인간 MHC 유전자 좌위는 염색체 6 상의 4 Mb 이내에 위치하고, MHC 대립유전자는 일반적으로 일괄 유전된다. 일부 MHC 대립유전자 조합은 군집 중에서 상당히 높은 빈도로 공유된다. 예를 들어, 15개의 가장 일반적인 HLA-A, -B, -Cw, -DR 일배체형은 21.3％의 코카서스 인종 미국인에 의해 공유되고, 일배체형 빈도에 대한 유사한 결과가 다른 종족에서도 관찰된다. 추가로, 하나의 인종 군에서 공통적인 HLA 일배체형은 다른 인종 군과 상당히 공유된다. 예를 들어, 코카서스 미국인의 184개 공통적인 일배체형 중 156개 일배체형이 아프리카계 미국인, 아시아계 미국인, 라틴계 미국인 또는 토착 미국인과 공유된다. 다른 인종 군의 공통적인 일배체형의 수 및 상응하는 공유 일배체형의 수는 아프리카계 미국인 (198/63), 아시아계 미국인 (210/100), 라틴계 미국인 (194/147) 및 토착 인디언 (194/173)이다. 모리 (Mori, M) 등의 문헌 ["HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry," Transplantation, 64 (7): 1017-27 (1997)]을 참고할 수 있다. 이와 같은 연관 불균형을 지지하는 증거를 고려하면, 제1 생식세포분열기 후의 미수정된 이배체 배우체에서 유도된 HS 세포를 사용하여 조직 또는 세포 이식을 위한 간세포 뱅크 또는 집합물에서 유지될 필요가 있는 면역학적으로 상이한 세포주의 수를 감소시킬 수 있다.
따라서, 가능하게는, 상이한 일배체형에 대해 동형접합성인 수백개의 간세포주는 대부분의 군집과 충분히 매칭될 수 있을 것이다. 이 수는 배아 간세포, 성인간세포, 또는 치료 클로닝 간세포로부터 유도된 간세포주를 위한 뱅크 또는 집합물을 유지하기 위해 필요한 일배체형의 수에 비해서 매우 작은 것이다. 예를 들어, 매 200개의 일배체형에 대해서, 20,000회 이상의 이형접합 가능성이 있다 (도 1).
상기 미국 특허 출원 제09/997,240호 및 미국 가출원 제60/253,943호와 함께 사용하는 경우 본 발명은 여러 질환, 예를 들어 유전 질환, 신경퇴행성 질환, 내분비-관련 장애 및 암, 외상성 손상, 미용 및 치료적 이식 및 유전자 치료 및 세포 치환 요법에 유용하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 면역형 및(또는) 유전자형에 대해 선별된 동형접합성 간세포의 군집을 생성하기 위한 방법을 제공한다. HS 세포는 당업계에 공지된 혈청학적 및(또는) 분자적 기술을 이용하여 HLA-A, -B, -Cw 및 -DR에 대해 면역형이 분류된 것이다. HS 세포는 또한 당업계 공지된 분자적 기술을 이용하여 유전자형에 대해 선별된다. 이어서 상기 HS 세포를 사용하여, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 출원 제07/997,240호 및 미국 가출원 제60/253,943호에 개시된 방법으로 선조 세포 및(또는) 다른 분화 세포, 세포형 군 또는 조직형 군이 유래될 수 있다. 또한, 본 발명은 치료적 또는 미용 이식을 위해, 및(또는) 유전적 장애 및 신경퇴행성 장애, 외상성 손상 및 암의 치료를 위해 예비-HLA 분류된 HS-유래의 분화 세포 및(또는) 조직을 사용하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 (a) 면역형, 즉 의도된 수용자의 동형접합성 또는 이형접합성 HLA 일배체형을 분석하여 표적 면역형을 결정하고, (b) 체세포분열을 하도록 활성화된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포 샘플을 생성하여, 특정 HLA 일배체형에 대해 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM)를 각각 함유하는 다수의 배반포-유사 군체를 발생시키고, (c) 상기 ICM의 각각의 면역형을 분석하여 표적 HLA 일배체형을 가지고 있는 것을 선별하고, (d) 선별된 ICM으로부터 단리된 HS 세포를 배양하여 표적 HLA 일배체형에 대해 동형접합성인 영구 HS 세포주를 생성함으로써, 의도된 수용자로 이식하기에 적합한 표적 면역형을 가진, 체세포분열을 하도록 활성화된 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포로부터 동형접합성 간세포의 군집을 생성하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 의도된 수용자, 또는 의도된 수용자의 친족 또는 의도된 수용자와 공통된 하나 이상의 HLA 일배체형을 가지고 있는 의도된 수용자와 무관한 개체로부터 유래된 HS 세포를 제공하는 것이다. 공지된 기술을 사용하여 표적 HLA 일배체형을 가지고 있는 HS 세포를 분석 및 수거하고, 의도된 수용자 및 공여자의 면역형을 분석한다.
이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 출원 번호 제09/997,240호 및 미국 가출원 번호 제60/253,943호에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, HS 세포는 (a) 2개의 난모세포 또는 2개의 정세포를 융합하거나; (b) 난자형성 동안 제2 극체의 방출을 방해하거나; (c) 적절한 조건에서 제2 극체의 방출 및 자발적 게놈 자기복제를 허용하거나; 또는 (d) 2개의 일배체 난핵 또는 정핵을 핵이 제거된 난모세포 내로 전이시킴으로써 생성된 배반포-유사 군체로부터 유래하며, 방법 (a) 및 (d)는 동형접합성 간세포를 유전자형 분석에 의해 추가로 스크리닝하는 것을 필요로 한다.
본 발명의 또다른 목적은, 이 거명을 통해 본원에 참고문헌으로 인용된 미국특허 출원 번호 제09/997,240 및 미국 가출원 번호 제60/253,943호에 상세히 기재되어 있는 방법에 의해 생성된 스템플라즘으로부터 수용자 조직적합성 동형접합성 간세포 군집을 단리하는 방법을 제공하는 데 있다. 이러한 수용자 조직접합성 HS 세포의 군집은 (a) 표적 면역형 및 유전자형을 결정하기 위해, 의도된 수용자의 면역형 및 유전자형을 분석하고; (b) 공여자의 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포의 체세포 분열을 활성화시켜, 특정 대립유전자에 대해 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM)를 각각 포함하고 있는 다수의 배반포-유사 군체로 발생시키고; (c) 선별된 ICM으로부터 HS 세포를 단리하고, 이 HS 세포를 배양하여 세포주를 만들고; (d) 이 HS 세포주 각각의 유전자형을 분석하여 표적 유전자형에 대해 동형접합성인 것을 선별함으로써 제조될 수 있다. 상기 HS 세포는 조직학적 수단을 통해 이식한 후 생성된 스템플라즘으로부터 동정될 수 있고, 적합한 HLA 일배체형 및 유전자형에 대해 분석될 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은, (a) 표적 면역형 및 유전자형을 결정하기 위해 의도된 수용자의 유전자형 및 HLA-일배체형을 분석하고; (b) 공여자의 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포의 체세포 분열을 활성화시켜, 특정한 대립유전자에 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM)를 각각 포함하고 있는 다수의 배반포-유사 군체 및 특정한 HLA 일배체형으로 발생시키고; (c) 이 ICM으로부터 HS 세포를 단리하고, 이 HS 세포를 배양하여 세포주를 만들고; (d) 이 HS 세포주 각각의 HLA 일배체형 및 유전자형을 분석하고, 표적 HLA 일배체형 및 유전자형을 지닌 것을 선별함으로써, 의도된 수용자 내로 이식되기에 적합하도록, 표적 유전자형 (즉,표적 유전자의 비-질환 대립유전자)을 갖고 체세포 분열이 활성화된 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포로부터 수용자 조직적합성, 동형접합성 간세포 군집을 생성하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은, 1개의 기능적 대립유전자를 지닌 의도된 수용자로부터 유래하거나, 또는 의도된 수용자에 공통적인 1개 이상의 HLA 일배체형 및 표적 유전자에서의 1개 이상의 비-질환 대립유전자를 지닌 의도된 수용자와는 무관한, 의도된 수용자 또는 사람의 가까운 친족으로부터 유래한 HS 세포를 제공하는 데 있다. 표적 HLA 일배체형 및 표적 유전자형을 지닌 HS 세포를 분석 및 수거하고, 의도된 수용자 및 공여자의 면역형 및 유전자형을 분석하는 데에는 공지의 기술이 이용된다.
본 발명의 또다른 목적은, 원하는 세포, 세포군, 또는 조직형에 도달하도록, 생체내 또는 시험관내 인자들을 이용한 적합한 조건하에서, 단리되고(되거나), 면역형이 분류되고(되거나) 유전자형이 분류된 HS 세포의 분화를 지시하는 것을 포함하는, 원하는 세포, 세포군 또는 조직형의 제조 방법을 제공하는 데 있다. 전형적인 조직에는 상피조직, 연결조직, 근육조직 또는 신경조직이 포함되지만, 이것에만 제한되는 것은 아니다.
상피세포의 예시적인 형태에는 각질화 상피세포; 습윤-중층 장벽 상피 (wet-stratified barrier epithelia); 표면 상피세포 (lining epithelial cell); 외분비 상피세포; 내분비 상피세포; 세포밖 매트릭스-분비 상피세포; 장, 외분비선 및 비뇨생식관의 세포와 같은 흡수성 상피세포; 및 수축성 상피세포가 포함되지만, 이것에만 제한되는 것은 아니다. 연결조직 세포의 예시적인 형태에는 세포밖 매트릭스-분비 세포; 신진대사 및 저장을 위해 특화된 세포; 및 혈액 및 면액계의 순환세포가 포함되지만, 이것에만 제한되는 것은 아니다. 근육세포의 예시적인 형태에는 추진 작용이 있는 수축세포 및 섬모세포가 포함되지만, 이것에만 제한되는 것은 아니다. 신경세포 또는 감각세포의 예시적인 형태에는 감각 변환기; 자율 뉴런; 감각기관 및 말초 뉴런의 지지세포; 및 중추신경계의 뉴런 및 신경아교세포가 포함되지만, 이것에만 제한되는 것은 아니다. 생식성 세포의 예시적인 형태에는 생식세포 및 영양세포 (nurse cell)가 포함되나, 이것에만 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또다른 목적은, 이식 및(또는) 치료를 진단하기 위한 면역조직적합성 세포를, 믿을 수 있고, 일정하며, 포괄적으로 공급할 수 있도록, 다수의 공여자로부터 유래한 예비-HLA 분류된 HS 세포의 군집을 갖고 있고, 각각의 군집은 1개 이상의 HLA 일배체형에 대해 동형접합성인, 분류된 이식 집합물 또는 뱅크를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 원래위치에서 (in situ) 또는 시험관내에서 면역조직학적으로 개체와 양립할 수 있는 단리된 HS 세포로부터, 적합한 대체 세포, 세포군, 조직 또는 기관을 생성함으로써 상기 개체의 장애 또는 질환 상태를 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 장애 및 질환 상태의 예에는 외상성 상해 (예, 외상 후 회복 및 재건, 사지 대체, 척수 상해, 화상 등) 및 출생 결손; 세포, 조직 및 기관의 병리학적 및 악성 질환 (예, 암); 및 근육 세포 및 조직의 퇴행성 및 선천성 질환 (예, 낭성 섬유증, 근이영양증, 심장 이상), 신경 (예, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다발성 경화증), 상피 (예, 실명 및 근육병증, 아테롬성경화증 및 기타 혈관 협착 이상, 크론병과 같은 효소 결핍, 및 당뇨병과 같은 호르몬 결핍), 및 결합 조직 (예, 면역 이상 및 빈혈)이 포함되지만, 이것에만 제한되는 것은 아니다. HS-유래 세포 및 조직은 이를 필요로 하는 대상체에게, 바람직하게는 대상체 자신의 공여 물질을 이용하여 식피 (skin graft) 또는 이식될 수 있다.
본 발명의 상기 목적 및 다른 목적은 하기의 상세한 설명, 실시예 및 청구의 범위에 상세히 설명되어 있으며, 이들은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명은 공여자의 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포로부터의 면역형 및(또는) 유전자형에 대해 미리 선별된 동형접합성 간세포 (HS 세포)의 균일한 군집의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진단, 치료 및 미용상 이식, 세포 치환술 및(또는) 유전자 요법, 및 각종 유전자 질환, 신경퇴행성 질환, 외상성 손상 및 암의 치료에 대해 상기한 조직적합성 HS 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 비제한적으로 진단, 치료 및 미용상 이식 (비제한적으로 창상 및 화상 회복을 위한 피부 이식, 골절된 사지의 재건에 사용하기 위한 연골뼈, 연골 및 힘줄, 및 귀, 코, 입술 및 두피의 재건을 포함), 세포 치환술 및(또는) 유전자 요법, 및 비제한적으로 신경퇴행성 질환, 외상성 손상 및 암을 포함한 각종 질환의 치료를 포함한 예방 및 치료적 중재를 위해 비-질환 유전자형에 대해 미리 선별된 조직적합성 HS 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유전자 분류되고(되거나) HLA 분류된 ("면역형 분류된") HS 세포를 분화시켜, 전구 세포, 및 다른 분화 세포, 세포 군체 또는 조직형을 발생시키는 방법에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 각각의 HS 세포주가 유일한 HLA 일배체 세포에 대해 동형접합성이고, 진단, 치료 및(또는) 이식에 대한 일정하고, 신뢰가능하고, 포괄적인 세포 공급원을 소유하고자 하는 목적으로 상기한 일배체 세포의 HLA 성분을 보유하는 임의의 개체와 조직적합성인 다양한 공여자로부터의 HS 세포주에 대한 목록화된 이식체 집합물 (depository)을 제공하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본원에서 기술된 방법은 2000년 11월 30일에 출원된 미국 가출원 제60/253,943호를 우선권으로 주장하는, 2001년 11월 30일에 출원된 "단리된 동형접합성 간세포, 그로부터 유래된 분화 세포 및 이들을 제조 및 사용하는 방법 (Isolated Homozygous Stem Cells, Differentiated Cells Derived Therefrom, and Methods of Making and Using Same)"이라는 제목의 미국 특허원 제09/997,240호에 개시되어 있는 재료 및 방법과 함께 유용하며, 상기 문헌은 둘 다 본원에 참고로 인용되어 있다.
도 1: 비-HS 세포 뱅크 대 HS 세포 뱅크에 있어서의 필요한 세포량 차이를 나타낸 그래프.
도 2: 제1 생식세포분열기 후의 난모세포로부터 HS 세포의 유도를 예시한 개략도.
도 3: 정자형성 및 난자형성의 개략도.
도 4A: HLA 유전자 좌위의 혈청학적 특이성을 나타낸 표.
도 4B: 공식적으로 인식된 HLA-DR 및 HLA-DQ 특이성.
도 5: HLA 클래스 II 대립유전자의 유전자형 분류를 위한 예시적 제한 엔도뉴클레아제들의 목록.
도 6: HLA 클래스 II의 분류를 위한 예시적 SSO 프로브들의 목록.
도 7: 마이크로세텔라이트 (microsatellite)의 분류 및 서열분석을 위해 사용되는 프라이머들의 예시적 서열 목록.
도 8: 마이크로세텔라이트 12개의 상대적 위치를 나타내는 HLA 클래스 I, II 및 III의 지도.
도 9의 (A): C57/DBA2 마우스.
도 9의 (B): 과배란 난모세포-유래의 배반포-유사 군체.
도 9의 (C): 대표적인 콜로니 I.
도 9의 (D): 대표적인 콜로니 II.
도 9의 (E): 유전자형 분류 실험 결과.
도 9의 (F): 면역형 분류 실험 결과.
도 10의 (A): 마우스 HS 세포로부터 유래한 영양세포층 상에서 배양된, 단리된 내부 세포 군체의 사진.
도 10의 (B): 인간의 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 난모세포로부터 유래한 상실배아-유사 군체를 나타낸 사진.
도 10의 (C): 인간의 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 난모세포로부터 유래한 초기 배반포-유사 군체의 사진.
도 10의 (D): 인간의 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 난모세포로부터 유래한 내부 세포 군체를 보여주는 배반포-유사 군체의 사진.
도 11: HLA 클래스 II 대립유전자를 증폭하기 위한 PCR 프라이머들의 예시적 목록.
본원에 인용된 모든 참고문헌들은 본원에서 그의 전문이 참고로 포함되었다.본원의 그 어떤 것도, 본 발명이 선행 발명의 개시물에 우선하는 자격이 없다고 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 본원의 전문에 걸쳐, 기재된 바람직한 실시양태 및 실시예는 본 발명을 제한하기 보다는 예시하는 것으로 이해해야 한다.
A.정의
본 발명의 문맥에서, HS 세포계는 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포의 체세포분열 활성화, 또는 자연 발생 기형발생 조직으로부터 유래된 간세포 및 스템플라즘으로부터 유래된 간세포 (이 거명에 의해 본원에 포함되는 미국 특허 출원 제09/997,240호, 및 미국 가출원 제60/253,943호에 기재됨)로의 2개의 일배체 생식세포의 융합 또는 핵 전이로 인한 배반포-유사 군체로부터 유래된 간세포를 의미한다. HS 세포계로부터 단리된 HS 세포는 다능성이며, 적절한 조건하에서 분화되어 다중-기능성 선조 세포, 체세포 전구제 및 기타 유형의 분화된 세포를 생성할 수 있다.
"분화"란 세포가 정상적인 기능을 하는 세포로 성숙함에 따라서 겪게 되는 고도로 조절된 과정이다. 분화된 세포는 고유의 특성을 갖고, 특정 기능을 수행하며, 잘 분열되지 않는다. 반대로, 분화되지 않은 세포는 다수의 비특이적 활성 및 기능이 있는 비특정된 외관을 지닌, 빠르게 분열되는 미성숙의 배아 또는 원시 세포이다.
본원에서 사용한 용어 "간세포"는 활발하게 분열되고 순환하는 비교적 분화되지 않은 세포를 말하며, 이들은 성숙 및 분화된 기능성 계통의 세포를 적절하게 자극시킬 때 생성된다. 간세포의 규정된 특성들은 다음과 같다: (a) 그 자체로는최종 분화되지 않음; (b) 동물의 생존기간에 제한되지 않고 분열할 수 있음; 및 (c) 분열할 때, 각각의 딸세포는 남아 있는 간세포를 선별하거나, 또는 비가역적으로 최종 분화를 일으키는 과정에 착수한다. 이들의 능력 (즉, 몇 가지 형태의 분화된 세포를 생성할 수 있는 능력)에 있어서 처음에는 제한되지 않은 이들 간세포들을 "다능성"으로 명명한다. 현재, 다능성 세포의 공급원으로는 배아 (ES) 간세포, 배아 암종 (EC) 세포, 체세포 클로닝에 의해 생성된 세포, 기형종 및 기형암종이 포함된다.
3 개의 배엽 (즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽) 중 하나에서 세포를 생성할 수 있는 각 선조 세포주를 본원 명세서에서는 "다중-기능성"으로 언급한다. 각각의 선조 세포주는 최종 분화되지 않으며, 동물의 생존기간 동안 계속하여 분열할 수 있으며, 유일한 1 가지 유형의 배아 층에서 다른 조직 또는 세포가 되는 것으로 생각된다. 그러므로, 특히 선조 세포주는 뼈, 연골, 평활근, 횡문근 및 조형 세포 (중배엽); 간, 원장 및 호흡기 상피 (내배엽); 또는 신경, 신경교세포, 모낭 및 원뢰 (외배엽)로 분화될 수 있다. 그러므로, 용어 "선조 세포"는 "다중-기능성 간세포" 또는 "전구 세포"와 유사하게 사용될 수 있다. 생체내에서 (여기서, "생체내에서"란 용어는 면역장애가 있는 동물에서 상기 HS 세포를 캡슐화하여 이러한 캡슐화된 세포로부터 스템플라즘을 생성함으로써 유발된 분화를 포함함) 또는 시험관내에서 HS 세포의 유도된 분화에 의해 생성되는 이러한 선포 세포주는 배지에서 영구 세포주로 유지될 수 있다.
"기형종"은 다양한 유형의 분화 조직, 3 개의 배아 층 모두에서 유도된 조직, 예를 들어, 뼈, 근육, 연골, 신경, 원뢰, 선상피 등을 포함하는 세포들의 붕괴된 군체인데, 계속하여 분열되고 생성되지만 분화된 조직보다 더 많은 분화되지 않은 간세포와 혼합되어 있다.
"기형암종"은 기형종에 대해 부차적이다. 기형종은 대개 양성이지만, 이들이 악성이 될 경우에는 기형암종이 발달하므로 숙주에게 치명적일 수 있다. 다른 종양과 달리, 기형종은 독특한 조직 형태를 나타낸다. 이들은 표피, 중추신경계 조직, 또는 성숙 연골과 같은 조직을 포함하는 다양한 분화된 조직으로 구성된다. 이들은 또한 비특이적 조직형, 예를 들어 림프 조직 또는 섬유 기질을 함유한다.
"스템플라즘"은 HS 세포를 숙주에 이식할 때 발생하는 군체를 설명하는 데 사용되는 새롭게 파생된 용어이다. 기형종과는 달리, 스템플라즘은 제어된 성장을 나타내지만, 여전히 3 개의 배아 배엽 모두로부터의 세포를 함유한다. 따라서, 상기는 본 발명의 HS 세포의 생체내 분화를 위한 수단으로 사용될 수 있다.
"동형접합성 간세포"는 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포로부터 발생된 분화되지 않은 간세포이다. 바람직하게는, 난자형성 (또는 "활성화") 동안 제2 극체의 방출을 방지하거나, 또는 적절한 조건에서 제2 극체를 방출시키고 일배체 난모세포의 게놈을 자발적으로 자가복제시킴으로써 형성된다. 동형접합성 (HS) 세포는 미수정된 생식세포의 "체세포분열 활성화" 동안 발생하는 배반포-유사 군체들의 내부 세포 군체에서 발생된 세포로부터 단리된 세포이며, 이들은 (a) 2 개의 난모세포 또는 2 개의 정세포를 융합하거나; (b) 난자형성 동안 제2 극체의 방출을 방지하거나; (c) 적절한 조건에서 제2 극체를 방출시키고 자발적으로게놈을 자가복제시키거나; 또는 (d) 2 개의 일배체 난핵 또는 정핵을 핵이 제거된 난모세포로 전이시킴으로써 달성될 수 있다.
포유류의 발육에 있어서, 난할은 한쪽측에 세포 군체 (다르게는 내부 세포 군체로 알려짐)에 의해 표시되는 적절한 배아가 있는 벽이 얇고 속이 빈 구, 즉 "배반포"를 형성한다. 상기 배반포는 착상 전에 형성되며, "포배"와 동의어이다. 상기 벽이 얇고 속이 빈 구의 벽은 영양아층이라고 불리며, 상기는 포유류의 배반포의 주변을 형성하는 상피의 추가-배아층이며 배아를 자궁 벽에 부착시킨다. 상기 영양아층은 융모막의 외층을 형성하며, 모체 조직과 함께 태반을 형성할 것이다.
본 발명의 문맥에서, "배반포-유사 군체"는 체세포분열을 하도록 활성화된, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포의 산물이라는 점에서 (당업계에서 사용하는) "배반포"라는 용어와는 상이하다.
본원에서 사용된 용어인 "체세포분열을 하도록 활성화된"은 체세포분열적으로 규칙적인 세포 분열을 수행하는 능력을 얻는 것을 의미한다. 체세포분열 활성화는, (1) 제2 생식세포분열이 재개되어 일배체 배우자 세포가 세포질분열없이 게놈 자가-복제 후 체세포분열하거나, 또는 (2) 제2 생식세포분열은 재개되지만 일배체 배우자 세포가 핵분열 및 세포질분열없이 체세포분열을 하도록 하는 생식세포의 활성화를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포"는 배우자형성 단계의 생식세포를 의미하며, 상기 배우자 형성 단계에서는 상기세포들이 부성 또는 모성 상동 염색체들의 2 개의 복제본을 포함한다. 일배체 생식세포는 생식세포분열이 달성되었으며 염색체들의 1 개의 복제본만을 보유하는 생식세포를 의미한다.
"대립유전자"는 다른 형태의 유전자 좌위이다. 각 좌위에 대한 단일 대립유전자는 각 부모로부터 개별적으로 유전된다. 본 발명의 문맥에서, 세포가 동일한 대립유전자의 2개의 복제본을 함유한다면 "동형접합성"으로 분류된다. 반대로, "이형접합성" 세포는 동일한 유전자 좌위의 2개의 상이한 대립유전자를 함유한다.
본 발명의 문맥에서, 개체의 "면역형"은 세포의 표면상에 위치한 조직적합성 항원으로 알려진 독특한 배열의 단백질을 특징으로 한다. 사람에서, 이러한 조직적합성 항원은 사람 백혈구 또는 HLA (신체내에서 세포의 표면상에서 발견되는 유전적으로 유전된 단백질의 복합 단위)라 불리운다.
세포의 면역형의 주요한 결정인자는, 신체의 면역계가 외래 유기체에 응답하도록 활성시키는데 중요한 역할을 하는 단백질로 구성된 백혈구 및 혈소판상의 유전적 지문인 HLA 프로파일이다. HLA는 이식 과정에서 의도된 숙주 및 잠재적인 공여자간의 매칭을 결정한다. HLA 항원에 대한 반응은 조직 이식편 거부의 주된 원인이다. HLA 인자는 모계 및 부계로부터 (각각 하나씩) 유전되므로, 형제자매간에 동일한 HLA형을 가질 확률 (예, 1/4)이 가장 크다. 숙주의 선천적인 세포와 동일한 면역형 또는 HLA 프로파일을 갖는 외래 세포는 숙주에 의해 "자가"로서 받아들여지며 숙주의 면역계에 의해 거부되지 않는다.
HLA 항원은 보통 무손상 단위로서 유전되는 단일 염색체 상의 다수개의 밀접하게 연결된 유전자의 산물이다. 이러한 조직적합성 복합체 또는 HLA 부위는 또한 보체 및 면역 반응에 중요한 유전자를 함유한다.
HLA 유전자 복합체는 HLA-A, -B, -Cw 및 -DR로 알려진 적어도 4개의 좌위를 함유한다. HLA 항원에는 2종류가 있다. 클래스 I은 HLA-A, -B 및 -Cw로 구성된다. 22개의 상이한 HLA-A 항원, 42개의 상이한 -B 항원, 9개의 상이한 -Cw 항원 및 18개의 상이한 -DR 항원이 있다. HLA-A, -B 및 -C 항원은 거의 모든 사람 세포에서 발현된다. 개체의 클래스 I HLA 프로파일을 사용하여 개체간 (예, 신장, 골수 등의 이식에서, 혈소판 또는 백혈구의 주입에서, 또는 가계 연구를 위한 잠재적인 공여자 및 수용자)의 적합성의 정도 또는 유전적 관계를 결정할 수 있다. 클래스 I 항원은 혈청학적 방법에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어 특정 A-, B- 또는 C-좌위 항원에 대해 공지된 특이성을 갖는 항혈청 기구를 사용하여 샘플 림프구를 배양함으로써 개체의 클래스 I HLA 프로파일을 결정할 수 있다. 양성 세포/혈청 상호작용은 세포의 HLA 항원의 특징을 나타낸다.
클래스 II는 HLA-DR과 -DQ로 구성된다. 18종의 상이한 DR 항원이 존재한다. 이들 항원은 통상적으로 B 림프구, 단핵구, 대식세포, 수상돌기 세포 및 내피 세포상에서 발현되지만, 면역 자극에 의해 다른 세포상에서도 유도된다. 클래스 II 항원 (예를 들어, DRβ1, DRβ3, DRβ4, DRβ5 및 DQβ1 유전자)은 환자 DNA에 대한 혈청학적 분석 및(또는) 분자적 분석을 통해 검출할 수 있다. 단지 중간 정도로 정확한 (resolution) 분류만이 요구되는 경우에는, 유전자의 모든 영역에 대하여 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브 (SSOP, Sequence SpecificOligonucleotide Probe)를 사용할 수 있다. 높은 정확성 (대립유전자 수준)이 요구되는 경우에는, SSOP 시험과 DNA 서열분석을 함께 사용할 수 있다. 높은 정확성의 시험은 통상적으로 골수 수용자와 이들의 기대되는 공여자에 대해서만 수행하는데, 훨씬 더 높은 정도의 매칭이 필수적이다.
숙주의 면역계는, 숙주 세포가 발현하는 1종 이상의 HLA 단백질을 발현하는 세포는 "자가"라고 인식하는 반면, 다른 HLA 단백질을 발현하는 세포는 "외래" 또는 "비-자가"라고 인식한다. 숙주의 면역계는 "외래" 또는 "비-자가" 단백질에 대한 반응을 구동시켜 외래 조직을 사멸시킨다. 외래 조직이 이식된 기관일 경우, 이러한 반응은 거부라고 불린다.
본 발명과 관련하여, 공여자 세포가 숙주에게 거부 없이 안정하게 이식될 수 있는 경우, 이들 세포는 의도된 숙주로의 "이식에 적합"하다고 특징지어진다. 이식에 적합하려면, 공여자 세포가 의도된 숙주와 "조직적합", 즉, HLA "매칭"되어야 한다. HLA가 실질적으로 매칭된다면, 면역계는 훨씬 덜 반응하게 된다. 인간은 부모로부터 HLA 단백질을 6번째 염색체에 유전받는다. 인간은 2개의 염색체 6 (통상적으로, 하나는 모계 유전되고 다른 하나는 부계 유전된 것임)을 보유하기 때문에, 그의 HLA 단백질 중 절반은 그의 부모 각각과 매칭될 것이다. 매칭되는 HLA 단백질이 많을 수록, 이식된 기관은 수용자에 의해 덜 거부될 것이다.
개체는 A, B, Cw 및 DR 대립유전자 각각을 2개씩 보유하며, 한 세트의 A, B, Cw 및 DR ("일배체형")은 각 부모로부터 유전된 것이다. 추가로, 개체는 A, B, Cw 및 DR 일배체형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 본 발명과 관련하여, 공여자 세포가 의도된 수용자에게 외래인 HLA 생성물을 발현하지 않는 경우, 그 공여자 세포는 상기 수용자와 HLA "매칭"되거나 "조직적합"하다고 여겨진다. 예를 들어, HLA-A1, -Cw7, -B8 또는 HLA-A29, -Cw7, -B8 등과 같은 일배체형과 동형접합성인 공여자 세포는 HLA-A1, -Cw7, -B8 또는 HLA-A29, -Cw8, -B65 일배체형 둘다를 갖는 이형접합성 HLA 프로파일을 보유한 수용자와 매칭될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자형"은 유기체 또는 유기체 중 한 군의 유전자 구성을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, "표적" 유전자형은 정상 서열이거나 야생형 서열일 것이며, 즉, 유전자 서열이 특정 병리 상태와 관련이 없을 것이다. 이러한 병리 상태는 종종 "유전 장애"라고 지칭되는데, 이는 이들이 돌연변이 유전자(들)의 발현과 연관이 있음을 의미하는 것이다. 유전 장애는 종종 특정 유전자 돌연변이에 의해 발병한다. 본 발명과 관련하여, 병리와 연관이 있는 유전자 돌연변이는 유전 (예를 들어, 유전되는 유전 장애)되거나 유도 (예를 들어 발암물질에 노출됨)될 수 있다.
유전되는 유전 장애의 예로는 알츠하이머병, 당뇨병, 그레브스병, 혈우병, 헌팅톤병, 근이영양증, 파킨슨병, 겸상 적혈구 빈혈증 및 각종 대사 장애 (즉, 페닐케톤뇨증 (PKU) 및 중증혼합 면역결핍증 (SCID) 등과 같은 효소 결핍) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 유도되는 유전 장애의 예로는 암 및 다발성 경화증 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
유전 장애 및 이와 연관된 인간 유전자의 목록은 OMIM (등록상표) (Online Mendelian Inheritance in Man) (맥쿠시크-나탄스 유전자 의료원 (McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine), 존스 홉킨스 대학 (미국 메랜드주 발티모어 소재) 및 미국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information), 미국립 의학 도서관 (미국 메릴랜드주 베테스다 소재), 2000. World Wide Web URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/)을 통해 입수할 수 있다. OMIM은 미국립 생명공학 정보 센터 (NCBI)가 보유한 데이타베이스로서, 유전 질환, 장애 및 형질 (trait) 및 이들의 여러가지 증상에 대해 대규모로 검색할 수 있다. OMIM은 인터넷 (world wide web)을 통해 이용할 수 있다.
B.본 발명의 동형접합성 간세포의 생성
미국 출원 제09/997,240호에 상세하게 기재된 바와 같이, HS 세포는 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포의 체세포분열 활성화후에 발생된 배반포-유사 군체로부터 단리된다. 도 2는 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포로부터 HS 세포를 발생시키는 바람직한 방법을 나타내는 흐름도를 제공한다.
생식세포는 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포로 발생하고, 이는 활성화된 후에 본 발명의 HS 세포가 유래되는 배반포-유사 군체를 생성한다. 본 발명의 HS 세포 및(또는) 분화된 세포는 이의 삽입 또는 이식 등이 필요한 질환에 걸린 개체에서, 이의 삽입 또는 이식 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 질환 진단 및(또는) 치료시에 유용성이 있다.
제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포는 동일한 개체에게서 얻거나 면역적합성 공여자로부터 얻을 수 있지만, 특정 상황에서는 자가-공여가 바람직하다. 그러나, 치료법 수행을 위해 선택한 질환에 걸린 개체가 유전 질환 (즉, 돌연변이 또는 부적절한 발현에 기인하여 중요한 유전자가 결실되었다는 특징이 있는 질환)을 앓고 있는 경우에는 비-자가 공여자를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 선별 절차를 수행하는 당업자가 원하는 유전자형을 나타내어 (예를 들어, 결함이 있거나 돌연변이된 유전자가 없는 세포) 결핍된 유전자를 발현할 수 있는 자가 생식세포를 선별할 수 있다. 또한, 이러한 선별 기술을 이용함으로써, 조직 이식시에 면역-부적합한 유전자형 또는 표현형을 피할 수도 있다.
HLA 일배체형 및 표적 유전자에 이형접합성인 HS 세포는 (a) 2개의 난모세포 또는 2개의 정세포를 융합하거나; (b) 난자형성 동안 제2 극체의 방출을 억제하거나; (c) 적당한 조건에서 제2 극체의 방출 및 게놈의 자발적인 자가-복제를 허용하거나; (d) 핵을 제거한 난모세포에 2개의 일배체 난핵 또는 정핵을 전달함으로써, 유도하여 선별할 수 있다. 도 3은 정자형성 및 난자형성에 관한 개략도를 제공하며, 남성과 여성에서 체세포분열과 생식세포 단계들 사이의 차이점을 보여준다.
본 발명과 관련하여 유용한 난모세포는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하거나 적합하다고 발견된 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 전형적으로, 인간의 난모세포는 공여자 개체의 난포에서 수거하고, 주변 세포 또는 부착 세포로부터 단리한다. 수율을 최대화시키기 위해서, 공여자 개체에서 과배란을 유도한다. 과배란은 적당한 고나도트로핀 또는 고나도트로핀 유사체를 단독으로 투여하거나 시트르산 클로미펜과 병용하여 투여함으로써 유도할 수 있다 ([Barriere et al., Rev. Prat., 40 (29):2689-93 (1990)], 상기 문헌은 본원에 참고로 도입됨). 마우스에서의 방법은 예를 들어 임신한 암컷의 혈청 (PMS)을 투여하여 난포자극호르몬 (FSH)을 모방하게 하고, 인간 융모 고나도트로핀 (hCG)을 투여하여 황체형성호르몬 (LH)을 모방하게 하는 것을 포함한다. 문헌 [Hogan et al., Manipulating the mouse embryo: A Laboratory Manual, 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994]을 참조한다. 효율적인 과배란의 유도는 암컷의 연령 및 체중, 고나도트로핀의 투여량, 투여 시간 및 사용된 품종 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러가지 변수에 따라 달라진다.
과배란의 유도 및 난모세포의 수거 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기에서 예시한 마우스 프로토콜은 문헌 [Hogan et al., 상기 문헌, pp. 130-132]에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌은 전문이 본원에 참고로 도입된다. 예를 들어, 호간 (Hogan)은 PMS와 hCG의 동결건조시킨 분말을 0.9％ NaCl 중에 재현탁하여 복강내 투여함으로써 과배란을 유도하였다고 기재하였다. PMS와 hCG는 둘다 내생성 LH의 방출 전에 투여해야 한다. 통상적으로, 마우스로부터의 난모세포 수거에 관한 호간의 프로토콜은 과도한 시행착오 없이 인간에게 맞게 수정할 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 역시 배란된 난모세포의 융합을 유도하는 것으로 나타났다 (예를 들어, 문헌 [Sekirina, G.G., Ontogenez, 16 (6):583-8 (1985)] 및 [Gulyas, B.J., Dev. Biol. 101 (1):246-50 (1984)] 참조, 상기 문헌은 본원에 참고로 도입됨). 별법으로, 문헌 [Nogues et al., Zygote, 2 (1):15-28 (1994)] (상기 문헌은 본원에 참고로 도입됨)은 불활성화된 센다이 (Sendai) 바이러스에 의한난모세포 융합을 유도하여 배아 발생의 제1 단계로 진행할 수 있는 "접합체" 또는 "난모세포 융합 생성물 (OFP)"을 생성하는 것을 기재하고 있다. 난모세포 융합 기술에 관한 고찰을 위해서는 문헌 [Gulyas, B.J., Dev. Biol.4:57-80 (1996)]을 참조하며, 상기 문헌은 본원에 참고로 도입된다.
별법으로, 난모세포에서의 제2 극체 방출을 억제하여 HS 세포를 생성할 수 있다. 마우스 난모세포의 활성화를 위한 상세한 프로토콜은 문헌 [Hogan et al., 상기 문헌, pp. 148-150]에 기재되어 있으며, 이에 따르면, 수거한 난자 및 이들에 부착한 세포 더미를 둘베코 (Dulbecco's) PBS 중 7％ 에탄올 용액에 5분 동안 유지시켜 배지로 세척하고 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션한다. 이후, 히알루로니다제를 처리하여 상기 세포 더미들을 제거한다. 자연적으로, 난모세포는 제1 생식세포분열기 및 제1 극체의 분리 후에 제2 생식세포분열 중기에서 정지되며, 정자에 의해 자극되어야만 제2 생식세포분열이 진행될 수 있다. 시험관내에서, 난모세포를 Ca++이온운반체 (A23187) 또는 에탄올 등과 같은 작용제에 노출시켜 정자에 의한 자극을 모방함으로써, 제2 생식세포분열이 계속되도록 촉발할 수 있다. 제2 극체의 방출 전에, 6-디메틸아미노퓨린 (6-DMAP) 또는 시토칼라신 D를 포함하나 이에 제한되지 않는 작용제를 사용하여 유사핵분열 (염색체 분리) 및 세포질분열 (세포의 분열)을 억제함으로써, 이러한 이배체 난모세포를 활성화시키고 이후에 배반포-유사 군체를 형성할 수 있다. 도 2는 활성화의 생성물을 도시한다.
다른 실시양태에서, 단독이거나 퓨로마이신에 의해 수반된 Ca++이온운반체(A23187)에 난모세포를 노출시켜 제2 극체의 방출을 허용할 수 있다. 일배체 난모세포는 분열하지 않고 게놈 자가복제를 추가로 실행할 수 있고, 생성된 이배체 난모세포는 적절한 조건하에서 인큐베이션되는 경우 군체들과 유사한 배반포를 형성할 수 있으며, HS 세포를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Taylor, A.S., et al., Hum. Reprod., 9 (12):2389-97 (1994)] 및 [Kaufman, M.H. et al., J. Embryol. Exp. Morphol, 73:249-61 (1983)]을 참고할 수 있다.
본 발명의 내용상 유용한 정세포는 당업계에 공지되거나 발견되어야 할 임의의 적합한 방법, 특히 시험관내 수정 분야에 통상적인 방법들을 이용하여 수득할 수 있다. 수컷에 사용하기 위한 HS 세포를 생성시키기 위하여, 정세포 (제2 생식세포분열 완결)를 수거한 다음, 융합을 유도한다. 정세포 융합은 잘 확립된 표준 기술을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Asakura, et al., Exp. Cell. Res., 181 (2):566-73 (1989)] (본원에 참조로 도입됨)는 한 쌍의 정세포의 융합 및 단일 첨체 (시나크로좀 (synacrosome))의 궁극적 형성을 유도하기 위한 저장성 배지의 사용을 교시한다. 별법으로는, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제2 정모세포 (제1 생식세포분열기 완결)를 활성화시킬 수 있다.
제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포를 통상의 기술, 특히 시험관내 수정 분야에서 통상적으로 사용되는 기술을 사용하여 공여자로부터 수거할 수 있다. 예를 들어, 인간 난소 여포로부터 난모세포를 흡인하는 기술을 기재하고 있는 문헌 [Jones et al., Fertil. Steril., 37 (1):26-29 (1982)], 부고환 및 고환으로부터 정자를 수집하는 기술을 기재하고 있는 문헌 [Lisek et al.,Tech. Urol., 3 (2):81-85 (1997)], 한 공여자의 핵 물질을 다른 공여자의 핵을 제거한 난모세포에 이식하는 기술을 기재하고 있는 문헌 ([Stice et al., Mol. Reprod. Dev., 38 (1):61-8 (1994)] 및 [Takeuchi et al., Hum. Reprod., 14 (5):1312-7 (1999)])을 참고할 수 있다. 상기 문헌들의 전문은 본원에 참조로 도입된다.
마지막으로, 상기한 바와 같이, 2개의 일배체 생식세포 핵을 핵을 제거한 난모세포로 전달함으로써 단리된 HS 세포를 생성시킬 수 있다. 구체적으로는, 두 정자 또는 일배체 난핵을 핵을 제거한 난모세포로 전달하여 난모세포 세포질 중의 공여자 수컷 또는 암컷의 핵 유전정보를 지닌 미수정 이배체 난모세포를 생성시킬 수 있다. 공여 핵 물질은 당업계의 통상적인 표준 기술을 이용하여 수거되고(되거나) 단리될 수 있다. 마찬가지로, 전달 단계는 시험관내 수정 분야에서 통상적인 기술을 이용하여 수행할 수 있다 (미국 특허 제5,945,577호, WO 98/07841 및 상기 논의된 스타이스 (Stice) 및 타께우찌 (Takeuchi)의 문헌 뿐 아니라 문헌 [Wobus et al., Cells Tissues Organs, 166:1-5 (2000)] (본원에 참조로 도입됨)을 참조함).
바이러스 벡터 전달, 세균 벡터 전달 및 합성 벡터 전달 (예를 들어 플라스미드, 리포좀 및 콜로이드 복합체를 통한 전달) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리뉴클레오티드 형질감염 기술에 의해 HS 세포로 유전자 변형을 도입할 수 있다.
수정된 배반포의 내부 세포 군체로부터 ES 세포를 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 배반포-유사 군체들의 내부 세포 군체로부터 HS 세포를 단리시키는데 상기 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gardner et al., Curr. Op. Obst. Gyn., 11:307-311 (1999)], 미국 특허 제5,843,780호 (Thomson et al.) 및 미국 특허 제5,905,042호 (Stice et al.) (그 내용들이 본원에 참조로 도입됨)를 참고할 수 있다.
HS 세포는 임의의 동물 공여 물질로부터 생산할 수 있고 임의의 동물계에서 사용할 수 있다. 인간 및 비인간 HS 세포 둘 다 본 발명에서 고려된다. 적합한 수의학적 적용으로는 포유류, 어류, 파충류, 조류 및 양서류로부터의 HS 세포의 발생 및 이들에의 사용을 포함한다.
C.면역형의 선별 방법
상기 기재한 방법으로 생산되어 수거된 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포는 HS 세포, 궁극적으로는 HS-유도된 선조 세포 및 다른 분화된 세포를 수득하기 위해 사용한다. 본 발명은 HS 세포를 표적 유전자의 면역형 및 유전자형에 대해 선별하는 것을 추가로 포함하므로 HS 세포는 질환의 치료에, 예를 들어 이러한 치료를 필요로 하는 질환에 걸린 개체에게 주입 또는 이식함으로써 사용될 수 있다.
제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포는 처음에는 질환에 걸린 개체으로부터 수득할 수 있고, 이 경우에는 면역형을 맞춰볼 필요가 없을 것이다. 그러나, 이러한 생식세포가 수용자와 관련되거나 관련되지 않은 공여자로부터 수득된 경우, 면역형을 선별할 필요가 있다. 또한, 미리 면역조직학적으로 분류되어 있는 간세포에 대한 뱅크를 만드는 것이 본 발명의 목적이다. 특정 상황에서는자가-공여자가 바람직하다. 그러나, 질환에 걸린 개체가 유전 질환 (즉, 돌연변이 또는 부적절한 발현에 기인하여 중요한 유전자가 결실되었다는 특징이 있는 질환)을 앓고 있는 경우에는 비-자가 공여자를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로, 선별 절차를 수행하는 당업자가 원하는 유전자형을 나타내어 (예를 들어, 결함이 있거나 돌연변이된 유전자가 없는 세포) 결핍된 유전자를 발현할 수 있는 자가 생식세포를 선별할 수 있다. 또한, 이러한 선별 기술을 이용함으로써, 조직 이식시에 면역-부적합한 유전자형 또는 표현형을 피할 수도 있다.
본 발명에서 고려된 바와 같이, 이식에 적합한 세포의 동형접합성 군집을 생산하는 방법에서는 수용자의 면역형 ('조직 분류')을 분석한 후 면역적합성 간세포 군집을 선별하는 것이 필요하다. 2가지 기술, 즉, 혈청학적 (림프구독성 시험) 기술 및 분자적 (DNA를 기초로 함) 기술이 조직 분류를 위해 통상적으로 사용된다. 이들은 또한 간세포 군집을 선별하기 위해 사용될 수 있고, 이는 하기에 기재하였다.
1.혈청학적 기술
본 발명에서 수용자의 혈청학적 분류를 위해, 완전한 클래스 I 및 클래스 II 조직형에 대한 항응고성 혈액의 약 20mL 샘플 2개가 수용자로부터 요구된다. 클래스 I 분류를 위해, 혈액 샘플 1개를 시트르산 나트륨으로 처리하고, 그 후 탈섬유소화하여 거짓 음성 반응을 초래할 수 있는 혈소판을 제거한다. 그 후, 샘플을 밀도 구배 배지에 적층시키고, 원심분리하여 림프구로부터 적혈구 및 다형 핵구를 분리한다. 적혈구 및 다형 핵구 침강물 및 림프구 층을 다른 튜브로 이동시키고 세척한다. 그 후, 림프구를 세고, 림프구독성 시험을 위해 1 mL 당 1,500,000 내지 2,000,000개의 표준화된 세포 수로 조정한다. 상기 세포와 분류시킨 혈청을 HLA 항-혈청이 림프구 표면의 특정 세포막 표적 항원에 결합하는 시험 플레이트의 웰에서 인큐베이션시킨다. 클래스 I 대립유전자의 혈청학적 특이성에 대해서는 도 4A를 참고할 수 있다. 그 후, 토끼 혈청 또는 보체를 첨가하여 세포를 용해시킨다. 세포는 림프구의 세포막에 형성된 항체-항원 복합체가 존재하여 이후 세포 용해를 유도하는 보체를 활성화시키는 경우에만 용해될 것이다. 염료가 죽은 세포로 들어가므로 용해된 세포가 검출되며, 이것이 양성 반응이다. 용해가 일어나지 않으면 세포는 염색되지 않으며, 이것이 음성 반응이다.
클래스 II 분류를 위해, 두번째 혈액 샘플을 EDTA로 처리한다. 그 후, 샘플을 면역자성 비드 (모노클로날 항체로 코팅된 초상자성 단분산 중합체 입자)와 인큐베이션하고, 자기장에 위치시켰다. 클래스 II 항원이 B 세포에서 발현되면, 면역자성 비드는 B 세포에 특이적인 모노클로날 항체로 코팅된다. B 세포 및 비드를 자기장에 포획시키고, 세척하고, 표준 기술을 이용하여 센다. 그 후, 상기 기재한 바와 같이 림프구독성 시험을 위해 60 ㎕와 같은 표준 부피를 사용한다. 클래스 II 대립유전자의 혈청학적 특이성에 대해서는 도 4B를 참고할 수 있다. 림프구독성 분석법은 문헌 [Hui et al, Handbook of HLA Typing Techniques, p.194 (1993)]에 추가로 기재되어 있다.
림프구독성 시험은 또한 간세포를 분류하기 위해 사용될 수 있다. 면역학적으로 잘 특성화된 항-혈청의 패널을 관련되거나 관련되지 않은 공여자의 간세포 샘플에 첨가하고 인큐베이션시킨다. 보체의 제공원인 토끼 혈청을 상기 혼합물에 첨가하는데, 이는 항-혈청이 간세포 표면의 HLA 항원과 결합하면 활성화된다. 활성화된 후, 보체는 세포를 용해시키고 세포가 표준 염료를 흡수하여 검출되게 할 것이다.
HS 세포가 상기 발생의 초기 단계에서 적당한 HLA 분자를 포함할 수 없었는지의 여부가 명확하지 않기 때문에, 분자적 시험 (하기 2절을 참조)을 또한 이용해야 한다.
별법의 실시양태에서, 수용자 및 또한 간세포 클래스 II 분자에 대해 혼합된 백혈구 배양 시험 (MLC)을 사용할 수 있다. 문헌 [Bach et al. (1964), Lymphocyte Interaction: A Potential Histocompatibility Test In Vitro, Science 143:813-814] (본원에 참조로 도입됨)에 기재된 상기 시험은 잠재성 공여자의 세포에 존재하는 동종항원에 대한 잠재성 수용자의 T-세포 반응을 측정한다.
2.분자적 기술
이 기술을 위해서는 수용자의 혈액 샘플 또는 간세포로부터의 게놈 DNA가 필요하다. 먼저, 게놈 DNA를 당업자에게 공지된 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 절차를 이용하여 증폭시킨다. 다음, PCT 증폭된 혈액 DNA를 제한 효소를 이용한 절단 (제한 단편 길이 다형성 분석:RestrictionFragmentLengthPolymorphism analysis) 또는 다중 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브 (SSOP)를 사용한 혼성화의 두가지 기술을 이용하여 분류할 수 있다. RFLP 분석은 신뢰성있고 보다 편리한 방법이며 방사선활성 표지화를 요하기 않기 때문에 바람직하다. 일부 대립유전자에서 특이적 부위를 인식하는 효소를 도입시켜, 효소가 증폭된 DNA를 절단하는지 여부를 간단히 검사함으로써 특이적 HLA-일배체를 검출할 수 있다. 도 5는 클래스 II 분류에 이용될 수 있는 제한 엔도뉴클레아제를 열거한 것이다. 상세한 방법은 문헌[Hue et al, Handbook, 9]에서 얻을 수 있다.
SSOP 분석은 증폭된 DNA를 나일론막상에 고정시킨 다음, 특이적 HLA-대립유전자에 대한 선택된 방사선활성 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화시키는 것을 필요로 한다. 도 6은 클래스 II 분류에 이용될 수 있는 SSOP를 열거한 것이다. 이 기술의 변형법, 즉 서열 특이적 프라이머 분류 (SSP) 또한 이용할 수 있다. 여기서, 분류 시스템의 특이성은 PCR 반응의 일부이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 특이적 HLA-대립유전자를 증폭시킴으로써, 완전히 매칭되는 프라이머를 PCR 반응에 보다 효과적으로 사용하여, 아가로스 겔 전기영동 및 투조법 (transillumination)에 의해 검출할 수 있을 것이다.
다른 PCR 방법, 예컨대 PCR 핑거프린팅에 의한 클래스 II 매칭 (문헌[Hue et al, Handbook, 9]), HLA의 다형적 마이크로세텔라이트 위치의 PCR 특성분석 (문헌[Martin et al., Immunogenetics 47:131-138, (1998)]) 또한 본 발명에 포함된다.
HLA의 다형적 마이크로세텔라이트 위치의 특성분석은 수용자 및 공여자의 HLA 일배체를 예정하는 바람직한 기술이며, 특히 공여자 및 수용자가 관련될 경우에 유용하다. 상기 마틴 (Martin) 등의 문헌에 기재된 바와 같이, 다수의 마이크로세텔라이트 반복체는 인간 게놈내에 산재되어 발견된다. 이들 마이크로세텔라이트는 고도로 다형적이고, 멘델의 법칙에 따라 유전되어 유전자 마커로서 유용하게 된다. 마틴 등은 HLA 내부 또는 근처에 있는 12개의 마이크로세텔라이트를 분류하여 서열분석하였다. 마이크로세텔라이트를 서열분석하기 위해 사용한 PCR 프라이머에 대해서는 도 7을 참조한다. 또한, 대립유전자를 크기에 따라 지정하였다. 이들 마이크로세텔라이트와 특정 HLA 대립유전자 사이의 연결 불균형은, 이들 마이크로세텔라이트가 HLA 분류를 예정할 수 있어 마커로서 사용될 수 있음을 제시한다. 도 8은 HLA-I, II 및 III 영역 및 12개의 마이크로세텔라이트의 상대적인 위치에 대한 지도를 도시한 것이다.
D.유전자형의 선별 방법
특정 예에서는, 표적 유전자형의 존재에 대해 선별하는 것이 필요하다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 내용상 "표적" 유전자형이란 비돌연변이 또는 "정상" 형태인 유전자형, 즉 병리적으로 연관되지 않은 유전자 서열을 말한다. 따라서, 생식세포 공여체가 유전적으로 연관된 질환 또는 질병의 영향을 받거나 그의 운반체인 경우에는, 각 공여자의 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포로부터 생성된 각 HS 세포계의 유전자형을 분석하여, 목적하는 표적 유전자형을 가진 군집만을 선별하는 것이 필요하다. 돌연변이 유전자형을 가진 이들 군집은 추가의 발생이 일어나지 않게 해야 한다. 공여자의 각 생식세포가 이배체이며 특정 일배체에 대해 동형접합성임을 상기한다. 따라서, 그로부터 (즉, 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포계 및 스템플라즘계의 생식세포분열 활성화에 의해) 생성된 세포의 각 군집은 둘다가 아니라 하나의 일배체 또는 다른 일배체를 균일하게 포함할 것이다.
세포 군집의 유전자 구성 또는 "유전자형"을 분석하기 위한 수많은 기술들이 있다. 대부분 cDNA가 유래될 수 있는 유전 물질 (예를 들어, 게놈 DNA 또는 mRNA) 샘플을 대표적인 세포로부터 추출하는 것으로 시작한다. 전형적으로 샘플을 PCR과 같은 기술을 이용하여 증폭시키고, 클로닝시켜 부분적인 또는 완전한 유전자 "라이브러리"를 유도한다. 다음, 라이브러리를 정상 또는 돌연변이 서열의 존재에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 추가의 발생을 위해 정상 서열을 함유하는 이들 군집을 선별하고, 돌연변이 서열을 함유하는 군집 (즉, 병리적으로 연관된 군집)은 제거할 것이다. 유전자 돌연변이는 겔-기초의 서열분석, 겔에 기초하지 않은 서열분석 및 유전자 마커를 포함하나 이로 제한되지 않는 기술을 이용하는 수많은 방법으로 검출할 수 있다. 생성된 서열을 돌연변이 또는 표적 (즉, 정상) 서열의 존재에 대해 자동적으로 스캐닝할 수 있다.
1.겔-기초의 서열분석
대부분의 일반적인 핵산 서열분석 방법은 폴리아크릴아미드 겔과 같은 겔을 이용하여 전형적으로 특이적 분할에 의해 절단된 또는 DNA 중합효소에 의해 합성된 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 DNA 단편을 분리하는 것과 관련이 있다. 겔-기초의 서열분석 기술의 예로는, 막삼-길버트 (Maxam-Gilbert) 서열분석법 (화학적 분해 방법으로도 일컬어짐) 및 생어 (Sanger) 서열분석법 (연쇄 종결법 또는 디데옥시법으로도 일컬어짐)이 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다.
막삼-길버트 서열분석법 (문헌[Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA74:560-564, 1977], 본원에 참고로 포함됨)에서는 특정 염기에서 DNA를 분할하는 화학물질을 이용하여 상이한 길이의 단편을 생성시킨다. 다중 서열분석법으로도 알려진 막삼-길버트 방법의 개선에 의해 조사자들은 단일 DNA 서열분석 겔상에서 약 40개의 클론을 분석할 수 있게 되었다.
생어 서열분석법 (문헌[Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 5463-5467, 1977], 본원에 참고로 포함됨)은 효소적 절차를 이용하여 네가지 상이한 반응으로 다양한 길이의 DNA 쇄를 합성하고, 4개의 염기중 하나가 차지하고 있는 위치에서 DNA 복제를 중단시킨 다음, 생성된 단편 길이를 측정하는 것과 관련이 있다.
막삼-길버트 및 생어 방법은 주로 네스티드 (nested) DNA 단편을 생성시키는 방법에 있어서 차이가 난다. 두 방법 모두 겔 전기영동에 의해 DNA 분자를 매우 높은 분할능으로 분리할 수 있기 때문에 단지 단일 뉴클레오티드의 차이로 크기가 다른 단편도 분할시킬 수 있다. 이러한 서열분석 방법의 거의 모든 단계는 현재 자동화되어 있다. 공지된 특정 질환 유전자를 고전압 용량 기술 및 초박막 전기영동을 이용하여 서열분석하여 단편 분리율을 증가시킬 수 있고, 공명 이온화 분광법을 이용하여 안정한 동위원소 표지를 검출할 수 있다.
2.겔에 기초하지 않은 서열분석
여러 배수로 효율을 증가시키는 것을 목적으로 하는 겔에 기초하지 않은 서열분석 기술 또한 이용될 수 있다. 이러한 기술에는 (a) 유세포분석에서 개별 표지된 염기의 개선된 형광 검출법, (b) 주사 투과 (scanning tunneling) 또는 원자력 현미경을 이용한 DNA 스트랜드상의 염기 서열의 직접 판독법, (c) DNA 서열의 개선된 중량 분광 분석법, 및 (d) 서열이 공지된 뉴클레오티드의 짧은 패널에 대한 혼성화에 의한 서열분석법이 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다.
혼성화에 의한 서열분석 (SBH)은 단시간에 하나 이상의 DNA 샘플을 효과적으로 확인하고 서열분석하는 데 적용될 수 있다. 이 절차는 DNA 진단, 검시 및 유전자 맵핑의 여러 분야에 적용된다. 이는 또한 유전 질환과 관련있는 돌연변이 및 다른 특성을 확인하고, 생물학적 다양성을 평가하고, DNA 서열 의존적인 여러 다른 유형의 데이타를 제공하는 데 이용될 수 있다.
혼성화에 의한 서열분석 (SBH)에 대한 여러 접근법이 있다. SBH 포맷 1에서는, DNA 샘플을 정렬시키고, 표지된 프로브를 샘플과 혼성화시킨다. 샘플 DNA와 동일한 세트를 갖는 복제막을 다수의 프로브를 평행 스코어링하기 위해 이용할 수 있고(있거나) 프로브를 다중화시킬 수 있다. 나일론막상에서 DNA 샘플을 정렬 및 혼성화시키는 기술도 개발되었다. 각 정렬을 다수회 재이용할 수 있다. 포맷 1은 특히 수많은 샘플을 배치 가공하는 데 효과적이다.
SBH 포맷 2에서는, 프로브를 정렬시키고, 표지된 DNA 샘플 단편을 정렬된 프로브와 혼성화시킨다. 이 경우, 정렬된 프로브와의 동시 혼성화 반응에 의해 한 단편의 완전한 서열을 결정할 수 있다. 다른 DNA 단편의 서열분석을 위해, 동일한 올리고뉴클레오티드 정렬을 재이용할 수 있다. 포맷 2의 변형법으로서, DNA 앵커를 정렬시키고 라이게이션을 이용하여 표적 DNA의 말단에서 올리고서열의 존재를 측정할 수 있다.
포맷 3에서는, 2개 세트의 프로브를 이용한다. 한 세트는 정렬 형태일 수 있고, 또다른 표지된 세트는 멀티웰 플레이트에 저장된다. 이 경우, 표적 DNA는 표지할 필요가 없다. 표적 DNA 및 표지된 프로브 세트를 정렬된 프로브 세트에 첨가한다. 부착된 프로브 세트 및 표지된 프로브 세트 둘다 표적 DNA에 대해 끊임없이 혼성화하는 경우, 이들은 공유적으로 라이게이션되어 스코어링된 것의 2배 길이의 서열을 생성한다. 이 방법은 보다 작은 조각으로 DNA를 서브클로닝하지 않고도 긴 DNA 단편, 즉 완전한 박테리아 게놈을 서열분석할 수 있게 한다.
SBH에 대한 추가의 상세한 설명은 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,503,980호, 동 제5,683,881호 및 동 제6,025,136호를 참고로 한다. 또한 본원에 참고로 포함되는 문헌[Bainst, W., et al., J. Theoret. Biol., 135: 303-307 1988]; [Matthews, J.A., et al., Anal, Biochem., 169, 1-25, 1988]; [Syvanen, A.C., Medical Biology, 64, 313-324 1986] 및 [Lehrach, H., et al., Genome Analysis, 1, 39-71, 1990]을 참조한다.
3.유전자 마커
특정 유전자 서열의 존재와 관련되는 짧은 서열인 유전자 마커를 사용하여 돌연변이 또는 정상 유전자의 존재를 검출할 수 있다. 본 발명에 유용한 유전자 마커의 예로는 물리적인 맵핑을 위한 짧은 서열의 표준 마커인 서열 태그된 부위 (STS) 및 발현된 유전자를 확인하기 위한 특이적 마커인 발현된 서열 태그 (EST)가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 이들 마커는 대부분의 인간 유전자를 신속하게 확인하는 수단을 제공한다. EST 연구에 대한 다른 간행물은 유전자의 염색체상의 위치를 결정하고 게놈 서열에서 코딩 영역을 확인하는 것을 포함한다.
유전자 마커는 그가 고도로 유전가능하고, 다중대립유전자성이며, 다수인 경우에 큰 유용성을 갖는다. 대부분의 유전자 마커는 그의 대립유전자가 한 세대로부터 다음 세대까지 고도로 보존되는 DNA의 뉴클레오티드 서열에 의해 결정되며 그의 대립유전자의 검출은 자연 환경에 의해 영향을 받지 않기 때문에 고도로 유전가능하다. 마커는 다중 대립유전자를 갖는데, 이는 진화 과정에서 마커 유전자 좌위를 형성하는 DNA 서열에서 발생 빈도가 적은 유전적으로 안정한 돌연변이가 발생하여 이후의 세대들을 거치면서 기존의 다른 대립유전자와 함께 확산되었기 때문이다. 발생 빈도가 적은 안정한 돌연변이와 조합된 DNA의 고도로 보존된 특성은 유전자 마커에 의해 상이한 유전자형을 예측 및 확인할 수 있게끔 한다.
DNA 핑거프린팅 (fingerprinting)이란 예를 들어 단리된 DNA의 샘플 중 마커 DNA의 존재를 비교함으로써 다양한 공급원들로부터 단리된 DNA에서의 서열 차이를 평가하는 방법을 지칭하는데 사용되는 넓은 의미의 용어이다. 통상적으로, DNA 핑거프린팅을 이용하여 다른 생물 종들로부터의 DNA 또는 동일한 종의 다른 개체들로부터의 DNA를 분석 및 비교한다. 핑거프린팅에 의해 검출되는 DNA 서열의 차이를 DNA 다형성이라고 부른다. 생물의 DNA내에서의 DNA 다형성의 존재는 이러한 생물의 유전적 기원이 그러한 다형성을 갖지 않는 DNA를 포함하는 생물의 유전적 기원과는 다르다는 사실을 암시하는 역할을 할 수 있다. 상기 다형성은 예를 들어 게놈에서의 삽입, 결실 및(또는) 돌연변이로부터 연유할 수 있다.
제한-단편-길이 다형성 (RFLP) (Bostein et al., Am. J. Hum. Genet. 32:314-331,1980); 단일 가닥 형태 다형성 (SSCP) (Fischer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1579-1583, 1983; Orita et al., Genomics 5: 874-879, 1989); 증폭된 단편-길이 다형성 (AFLP) (Vos et al., Nucleic Acids Res. 23: 4407-4414, 1995); 마이크로세텔라이트 또는 단일-서열 반복부 (SSR) (Weber, J. L. et al., Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396, 1989); 급속-증폭된 다형성 DNA (RAPD) (Williams et al., Nucleic Acids Res. 18: 6531-6535, 1990); 서열 태그된 부위 (STS) (Olson et al., Science 245: 1434-1435, 1989); 유전자-비트 (bit) 분석 (GBA) (Nikiforov et al., Nucleic Acids Res. 22: 4167-4175, 1994); 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄 반응 (ASPCR) (Gibbs et al., Nucleic Acids Res. 17: 2437-2448, 1989; Newton et al., Nucleic Acids Res. 17: 2503-2516, 1989); 닉- (nick) 번역 PCR (예, TaqMan. TM.) (Lee et al., Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766, 1993); 및 대립유전자-특이적 혼성화 (ASH) (Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6: 3543-3557, 1979); Sheldon et al., Clin. Chem. 39 (4): 718-719, 1993)를 비롯한 많은 유전자-마커 기술을 핑거프린팅에 적용할 수 있다. 상기 언급한 각 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
RAPD 및 AFLP 분석용 키트는 예를 들어 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈 (Perkin Elmer Applied Biosystems) (Foster City, Calif.)사로부터 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 기술은 DNA를 제한 효소로 절단한 다음, 절단된 DNA를 겔 전기영동에 의해 크기별로 분리하고, 이렇게 분리된 DNA를 특정 폴리뉴클레오티드 단편과 혼성화시키는 방법을 이용한다. 폴리뉴클레오티드 프로브가 결합하는 제한 단편의 크기 차이는 DNA 샘플에서의 서열 차이 또는 DNA 다형성을 반영한다. 본원에 참고로 포함되는 문헌 (Tanksley, Biotechnology 7: 257-264 (1988))을 참조한다.
통상적으로 겔 전기영동에 의해 분리될 수 있는 특정 크기의 재생가능한 다수의 DNA 단편을 PCR-기초의 핑거프린팅 방법으로 생성시킨다. 이러한 단편들을 시각화하여 증폭된 DNA의 "핑거프린트"를 생성시킨다. 예를 들어 형광 염료를 이용하는 시각화와 같이 직접적으로 시각화하거나, 폴리뉴클레오티드 프로브를 이용하여 혼성화하거나, 또는 PCR 동안 증폭 생성물을 (방사성동위원소나 형광으로) 표지한 다음 표지된 생성물을 겔에서 검출하여 크기-분리된 단편의 시각화를 수행한다. 이러한 핑거프린트는 혈통 분석, 특이적인 특징의 연관 분석, 종 내에서 개체들 사이의 일반적인 관련 정도의 분석, 및 종들 사이의 계통발생적 관계의 분석을 비롯한 다양한 용도를 갖는다. 이는 농업 분야에서 (예를 들어 작물 또는 동물내의) 특정 유전자형에 특이적인 유전적 특징의 마커-보조에 의한 선별 및 정량적 특징의 유전자 좌위 (QTL)의 확인 및 맵핑 등에 있어서 상당한 상업적 용도를 갖는다.
유전자 마커 및 서열분석 없이 유전자를 검출하는 기술에 대한 보다 상세한 검토를 위해서는 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제6,141,657호, 및 동 제5,683,880호 및 동 제6,100,030호를 참조한다.
E.HS 세포의 지시된 분화를 위한 방법
전체 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 제09/997,240호 및미국 가출원 제60/253,943호에 기술된 바와 같이, HS 세포를 유도하여, 피부, 모발, 신경 조직, 췌장 섬 세포, 골, 골수, 뇌하수체, 간, 방광, 및 인간을 포함한 동물에서 진단 또는 치료 유용성을 갖는 다른 조직을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 3개의 배엽 (내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두로부터 발생하는 다양한 유형의 조직으로 분화시킬 수 있다.
분화 기술 분야, 특히 ES 세포 및 배종양 (기형암종) 세포의 분화를 위해 개발된 기술 분야의 당업자라면 과도한 실험 없이도 다능성 HS 세포가 원하는 유형의 조직으로 분화되도록 유도할 수 있을 것이다.
분화된 조직을 연구, 진단의 목적으로 시험관내 배양하는 것을 포함하는 다양한 치료적 용도를 위해 또는 개체로의 이식을 위해 본 발명의 단리된 다능성 HS 세포를 선택된 조직으로 분화시킬 수 있다. 바람직하게는, HS 세포는 HS 형성을 위한 공여 물질을 제공한 개체에서 치료적으로 사용될 것이다. 이는 암컷에서는 제1 생식세포분열기 후의 이배체 난모세포의 활성화에 의해 또는 2개의 일배체 난모세포의 융합에 의해 달성될 수 있으며, 수컷에서는 제2 정모세포의 활성화 또는 정세포들의 융합에 의해 또는 정핵의 무핵성 난모세포로의 전달에 의해 달성될 수 있다.
ES 세포의 단리 및 배양에 이용되는 잘 알려진 방법을 변형시켜 HS 세포에 대하여 이용할 수 있다. 예시적인 방법들이 문헌 (Hogan et al., 상기 문헌, pp. 254-262, 265-272)에 제시되어 있다. 예를 들어, 문헌 (Hogan et al.)은 최적의 배양 배지를, 글루코스 및 피루브산나트륨을 포함하며 글루타민 (2 mM), 비필수 아미노산 (0.1 mM), 메르캅토에탄올 (0.1 mM) 또는 모노티오글리세롤 (0.15 mM), 겐타마이신 (50 ㎍/ml), 15 ％ 혈청 (예, 소 태아 혈청) 및 백혈병 억제 인자 (LIF)를 추가로 보충한 둘베코 변형 이글 (Dulbecco's modified Eagle's) 배지와 같은 중탄산염 완충 (pH 7.2 내지 7.4) 배지로서 기술하고 있다. Ca++/Mg++-무함유 인산염 완충 염수 중 트립신 및 EDTA의 혼합물을 사용하여 세포를 조직 배양 디쉬로부터 떼어내고 이들을 서로 분리할 수 있다. 바람직하게는 LIF를 보충한 배지내의 영양세포층 상에서 간세포를 배양하여 증식을 증대시키는 인자를 제공하고 간세포의 비분화된 상태를 유지한다. 섬유아세포, 특히 마우스 배 섬유아세포 (MEF) 및 STO 마우스 섬유아세포가 바람직한 영양세포이다. 영양세포는 체세포분열에서 미토마이신 C 또는 감마선조사 처리에 의해 불활성화된다. 다른 유형의 영양세포가 사용될 수 있으며, 영양세포가 없는 시스템이 사용될 수도 있다. 생존가능한 간세포 배양물의 준비 및 유지에서 각 단계에 대한 상세한 프로토콜은 문헌 (Hogan et al., 상기 문헌)에 제시되어 있다.
마찬가지로, ES 세포의 각 콜로니를 단리하고 이를 충분한 수로 증가시켜 DNA의 단리 및 스크리닝을 가능케 하는 방법을 HS 세포에 적용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Hogan et al., 상기 문헌, pp. 279-281)은 트립신처리된 콜로니를 자동 피페터 (pipettor)를 사용하여 배양 디쉬의 단일 웰로 추출 및 전달하는 단계, 및 트립신처리되지 않은 콜로니를 튜빙 및 마우쓰피스에 부착된 무균의 파스퇴르 (Pasteur) 피펫을 사용하여 트립신/EDTA의 마이크로드롭 (microdrop)으로 추출 및전달하는 단계를 포함하는 간세포 단리 기술을 기술하고 있다. 신속한 기술 및 PCR을 이용하여 바람직한 콜로니를 확인 및 분석할 수 있다.
염색체 이형 (anomaly)이 축적되는 위험을 최소화하기 위해, 스톡 바이알을 가능하다면 곧바로 동결시켜 보관한다. 배양물의 적절한 동결 및 보관 방법이 ES 세포에 대하여 잘 알려져 있으며, HS 세포에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Hogan, et al., 상기 문헌, pp. 283)에는 세포 배양물로부터의 샘플을 동결시키고, 트립신처리하고, 펠렛화하고, 재현탁시키는 방법에 대한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. 다능성 세포를 분화시키는 방법은 하기에 논의되어 있다. 본 발명의 HS 세포를 비롯한 다능성 세포를 분화시키는 방법들을 포함하는 이러한 방법들은 설명을 위한 것일 뿐이지 이들로 한정하고자 하는 것은 아니다. 본원에서 언급하지 않은 기술들 또는 아직 발견되지 않은 기술들을 포함하여 당업계에 공지된 분화 방법을 이용하여 본 발명을 실시할 수 있다.
예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함된 호울의 문헌[Hole, Cells Tissues Organs, 165: 181-189 (1999)]은 HS 세포를 분화시키는데 적합할 수 있는, 시험관내에서 배아 간세포로부터 조혈 세포의 분화를 지시하는 방법을 기술하고 있다. 추가로, 본원에 참고문헌으로 포함된 도에츠만 등의 문헌[Doetschman et al., Embryol. Exp. Morphol., 87: 27-45 (1985)]은 현탁 배지에서 성장한 ES 세포가 백혈병 억제 인자 (LIF)를 회피하면 적혈구 세포 및 대식세포로 이루어진 혈도 (blood islands)를 포함하는 포낭 배아체가 형성된다는 것을 제시하였다. 또한, 간세포로부터 호중구, 비대세포, 대식세포 및 적혈구 세포를 비롯한 기타 조혈 세포들을 생성하는 것은 문헌에 개시되어 있다[예를 들어, Wiles 및 Keller, Devel., 111 : 259-267 (1991) ; Keller et al, Mol. Cell. Biol. 13: 473-486 (1993a); 그리고 Lieschke 및 Dunn, Exp. Hematol. 23: 328-334 (1995): 이들은 모두 전체로서 본원에 참고문헌으로 포함된다]. 상기 방법들은 과도한 실험없이 본 발명의 HS 세포들에 사용하는데 적합할 수 있다.
또한, 본원에 참고문헌으로 포함된 초 등의 문헌[Cho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 9797-9802 (1999)]에 개시된 기술은 ES 세포들을 성숙한 Ig-분비 B 림프구로 효율적으로 분화시키기 위한 기술로서, 본 발명의 HS 세포들에 사용하는데 적합할 수 있다. 유사하게, 본원에 참고문헌으로 포함된 다니의 문헌[Dani, Cells Tissues Organs, 165: 173-180 (1999)]은 ES 세포를 지방세포로 분화시키는 방법을 기재하고 있다. 예를 들어, 분화 초기 단계의 배아체를 레티노산 (RA)으로 짧은 시간 동안 처리하는 것은 지방생성과 관련이 있는 것으로 보인다.
간세포를 여러가지 신경 세포 및 뉴런으로 분화시키는 기술은 본원에 참고문헌으로 포함된 오카베 등의 문헌[Okabe et al. Mech. Dev., 59: 89-102 (1996)]에 기재되어 있다. 유사하게, 본원에 참고문헌으로 포함된 맥도날드 등의 문헌[McDonald et al., Nature Medicine, 5: 1410-1412 (1999)]은 손상된 척수를 치료함에 있어서 특별한 유용성을 갖는 간세포로부터 유도된 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte) 및 뉴런을 기재하고 있다. 이 기술들은 과도한 실험없이 본 발명의 HS 세포에 사용하기에 적합할 수 있다.
특정 세포 계통 (lineage)을 유도하기 위하여 부세포주 (accessory cell lines; 예: OP9)을 사용하는 것도 고려할 수 있다. 예를 들어 적혈구성, 골수성 및 림프성 계통과 관련있는, 본원에 참고문헌으로 포함된 나카노 등의 문헌[Nakano et al., Science, 265: 1098-1101 (1994)] 및 나카야마 등의 문헌[Nakayama et al., Blood, 91: 2283-2295 (1998)]을 참고할 수 있다.
본 발명의 HS 세포를 여포 세포 및 상피 세포로 분화시키는 기술도 고려할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함된 테일러 등의 문헌[Taylor et al., Cell, 102: 451-361 (2000)]을 참고할 수 있다. 또한, 특정 조절 유전자의 발현은 분화를 지시하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 조혈 유전자와 관련있는, 본원에 참고문헌으로 포함된 호울 등의 문헌[Hole et al., Blood, 90: 1266-1276 (1996a)] 및 배티어즈의 문헌[Battieres. Clin. Hematol., 3: 467-483 (1997)]을 참고할 수 있다. 유사하게, PPAR (PPARδ 및 PPARγ) 및 C/EBPδ (C/EBPβ, C/EBPδ 및 C/EBPα)를 포함하나 이에 한정되지는 않는 지질 대사에 관련된 핵 조절 인자들도 전지방세포 (preadipocyte)를 지방세포로 최종 분화시키는 촉발제가 될 수도 있다. 그러한 인자들은 본 발명의 분화 방법과 관련하여 유용성을 가질 것이다.
분화에 특이적인 유전자의 발현을 검출하는 방법, 조직에 특이적인 항원을 검출하는 방법, 세포 또는 조직 형태를 검사하는 방법, 이온 채널 기능과 같은 기능적 발현을 검출하는 방법, 또는 HS 세포의 분화를 검출하는데 적합한 임의의 수단을 이용하여 필요한 기능에 따라 분화를 평가할 수 있다.
배아성암종 (EC) 세포를 다양한 배아세포 및 배아밖 세포형 (extraembryonic cell type)으로 분화를 유도하는 방법이 HS 세포의 분화를 유도하는데 이용될 수 있다 (문헌 [Andrews, APMIS, 106:158-168 (1998)]). HS 세포를 세포 운명 결정 및 분화를 촉발하는 것으로 알려진 다양한 인자들에 노출시킴으로써, HS 세포는 목적하는 세포형 또는 조직으로 만드는 시험관내에서의 지시된 분화를 경험할 수 있다. 많은 시험관내 분화 설계는 분화의 개시를 유리하게 하는 것으로 알려진 성장 인자의 제거를 포함한다. 일단 상기 인자들을 배지로부터 제거하면, 간세포들은 영양세포없이 현탁액에서 성장하면서 배아체로 알려진 클러스터를 형성하는데, 배아체 내에서 전부 3개의 배아생식세포 층의 후손들이 발견될 수 있다. 상기 배아체 내의 특정 세포 계통의 존재는 추가적 성장 인자 및 화학물질로 배지를 보충하여 개선시킬 수 있다. 이어서, 생성된 세포 군집은 목적하는 세포형의 증가된 비율을 함유할 것이고, 그 후 선택적으로 단리할 수 있다. 다능성 간세포 및 이들의 의약에서의 용도에 대한 논의를 위하여, 문헌 [Edwards et al., Modern Trend, 74 (1): 1-7 (2000)] (본 명세서에 참고로 포함됨)을 참고할 수 있다.
그러한 분화 조절 인자의 예시적 예로는 사이토카인, 호르몬 및 LIF와 같은 세포조절 인자, GM-CSF, SCF, IL-3, 갑상선 호르몬 (T3), 간세포 인자 (SCF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF-2), 혈소판 유도 성장 인자 (PDGF), 섬모 신경 영양 인자가 있지만, 이에 한정되지는 않는다. GM-CSF, SCF 및 IL-3과 같은 자극성 사이토카인들이 분화 촉진을 보이고 있지만 (문헌 [Keil F, et al., Ann. Hematol., 79 (5):243-8 (2000)] (본 명세서에 참고로 포함됨) 참조), LIF와 같은 억제 인자들이미분화된 다능성 상태로 마우스 배아 간세포 (ES 세포)를 유지하는 것을 보이고 있다 (문헌 [Zandstra PW et al., Blood, 96 (4):1215-22 (2000)] (본 명세서에 참고로 포함됨)). SCF는 그의 추정 선조들로부터의 닭의 파골세포의 분화를 자극하는 것을 보이지만 (문헌 [van't Hof RJ et al., FASEB J., 1997 Mar; 11 (4):287-93 (1997)] (본 명세서에 참고로 포함됨)), FGF-2는 고정된 GHFT 세포에서 프롤락틴 발현을 유지하고 락토트로프 (lactotrope) 분화를 개시하는 역할을 하여, 간세포의 상이한 뇌하수체전엽 세포로의 분화를 조절하는 메카니즘을 제시한다 (문헌 [Lopez-Fernandez J, et al., J. Biol. Chem. 275 (28):21653-60 (2000)] (본 명세서에 참고로 포함됨)). 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF-AA, -AB 및 -BB)는 신경 분화에 기여하지만, 섬모 신경 영양 인자 및 갑상선 호르몬 T3은 성상세포 및 희돌기교세포의 클론들을 발생시킨다 (문헌 [Johe KK et al., Genes. Dev., 10 (24):3129-40 (1996)] (본 명세서에 참고로 포함됨)).
HS 세포는 생체내, 바람직하게는 원래위치에서의 이식에 의한 분화가 유도될 수 있고, 이 때 상기 세포는 조직학적 및 기능적 분화를 경험하고 숙주세포와 적합한 관계를 형성한다. 이식 부위에 위치한 내생성 조절인자는 간세포가 특정 유형의 분화된 세포 또는 조직으로 분화되게 지시할 수 있다. 또한, 일군의 분기 분화세포 및(또는) 조직이 진피, 복막 및 콩팥피막에 이식된 간세포로부터 생성된다. 신장피막 이식 절차에 대한 상세한 기술에 대해 상기 호간 (Hogan)의 문헌 183 내지 184 페이지를 참고할 수 있다.
다능성 HS 세포의 각종 내배엽 세포형으로의 분화는 이식 목적을 위한 용도를 비롯한 큰 치료적 관련성을 갖거나, 또는 HS 세포를 증진시켜 영양소의 흡수 및 처리를 할 수 있거나, 또는 직접적인 패턴 형성으로 유도되어 고용량의 RA, 또는 골형성 단백질 (BMP)-2를 비롯한 형질전환성장인자 β상과에 속하는 군으로 처리하여 내배엽 전구세포로 분화될 수 있다[Pera and Herzfeld, Reprod, Fert. Dev., 80:551-555 (1998)]. 또한, 일부 HS 세포주는 독특한 배양계로 분화되도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 헥사메틸렌 비스아세트아미드 (HMBA)에 의해 비신경성 분화가 유도될 수 있다 (Andrews, APMIS, 106:158-168 (1998)). BMP-2를 사용해 체벽 (parietal) 또는 내장 내배엽으로의 분화를 특이적으로 촉발시킬 수 있다 (Rogers et al., Mol. Bio. Cell,3:189-196 (1992)). BMP는 연골 및 골의 생체내 성장을 유도할 수 있는 분자이지만, BMP 메시지는 또한 발육하는 심장, 모낭 및 중추신경계를 비롯해 많은 비골 조직에서 발현되며, 이는 세포 운명 및 분화에서의 중추적인 역할을 나타낸다.
F. 예방적 및 치료적 유용성
본 발명의 한 실시양태는 유전적 또는 유전성 질환, 신경계 또는 신경퇴행성 질환, 외상성 상처 및 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환의 치료를 위해 환자에 이식될 수 있는 세포 및 조직을 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 미용적 용도는 모발 치환 (hair replacement)을 위한 식피 및(또는) 다른 그러한 용도이다.
HS 세포는 미국 특허 출원 09/997,240호 및 미국 가출원 60/253,943호에 기재된 바와 같이 피부, 모발, 신경 조직, 췌장 소도 세포, 골, 골수, 뇌하수체, 간,방광, 및 사람을 비롯한 동물에서의 진단 또는 치료적 유용성을 갖는 다른 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는 총 3개의 배엽 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 기원하는 여러가지 유형의 조직들로 분화하도록 유도될 수 있다.
본 발명의 방법은 소정의 면역형 및(또는) 유전자형을 이용하여 단리된 HS 세포로부터 적합한 치환 세포, 세포, 조직 또는 기관 군을 원래위치에서 또는 시험관내에서 발생시킴으로써 장애 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 원래위치에서 또는 시험관내에서 세포의 분화를 지시하는 방법은 본원의 전반부 및 미국 특허 출원 09/997,240호 및 미국 가출원 60/253,943호에 기재되어 있다.
장애 및 질환 상태의 예로는 외상성 상해 (예컨대, 외상후 회복 및 재건, 사지 대체, 척수 상해, 화상 등) 및 출생 결손; 세포, 조직 및 기관의 병리학적 및 악성 증상 (예컨대, 암); 및 근육 세포 및 조직의 퇴행성 및 선천성 질환 (예컨대, 낭성 섬유증, 근이영양증, 심장 이상), 신경 (예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다발성 경화증), 상피 (예컨대, 실명 및 근육병증, 아테롬성경화증 및 기타 혈관 협착 이상, 크론병과 같은 효소 결핍, 및 당뇨병과 같은 호르몬 결핍), 및 결합 조직 (예컨대, 면역 이상 및 빈혈)을 들 수 있으나 이들에 한정되는 것은 아니다. HS 유래 세포 및 조직은 이를 필요로 하는 대상체에게, 바람직하게는 대상체 자신의 공여 물질을 이용하여 식피 또는 이식될 수 있다.
현재까지, 유전성 질환의 치료를 위한 유전자 요법으로는 많은 성공을 거두지 못했다. 여기에는 많은 이유가 있는데, 가장 중요한 것은 정상 DNA가 안정하게 통합되고 발현되도록 환자의 세포에 위치할 수 없다는 것이다. 또한, 유전자-치환요법은 예를 들어, 유전자-보정 T-세포 요법 (여기서 정상 DNA를 갖는 T-세포는 환자에게로 이식될 수 있음)으로 너무 표적화되어 ADA 결핍형을 비롯한 중증혼합 면역결핍증 (SCID)을 치료할 수 없을 수 있다. 여기서 직면한 문제는 보정된 T-세포가 항원의 한가지 유형에만 프라이밍되고, 전체 범위의 면역 반응이 이로부터 유도될 수 없다는 것이다. 유전자 요법에 관한 현재 적용에서 직면한 또다른 문제는 돌연변이 유전자의 산물 또는 유전자의 정확한 기능이 알려질 수 없거나, 유전자 질환이 유전자-치환에 의해 치료될 수 없는 인자의 전체 캐스케이드에 관여할 수 있다는 것이다.
본 발명은 이러한 문제점들을 피할 수 있는 수단을 제공한다. 예를 들어, SCID의 상황에서 HS 세포는 국소 내생성 인자가 전체 범위의 T- 및 B-세포를 유도하도록 환자의 골수로 이식될 수 있다. HLA 적합성 또는 이식편 대 숙주 질환의 문제는 세포가 면역적으로 적합할 수 있기 때문에 본원에서는 문제화되지 않을 수 있다. 마찬가지로, HS 세포는 유전자 산물의 손실 또는 효소 부재를 일으키는 돌연변이에 의한 유전자 질환의 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 현재 페닐케톤뇨증의 치료는 환자가 페닐알라닌을 티로신으로 전환시키는데 필요한 효소를 생성하지 않기 때문에, 환자의 식사에서 페닐알라닌을 제거하는 것이다. 분화된 HS 세포는 이들 환자에게 이식되어 요구되는 효소를 생성할 수 있다. 마찬가지로, HS 세포는 헤모필리아 (Haemophilia) A와 같은 질환에서 이식에 사용되는 것으로 발견되며, 여기서 분화된 HS 세포는 손실된 유전자 산물, 즉, 응고인자 VIII를 생성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 HS 세포를 생체내에서, 바람직하게는 원래위치에서의 이식에 의해 분화되도록 유도함으로써 스템플라즘을 생성하는 방법으로, 여기서 세포는 조직 및 기능 분화를 거쳐 숙주 세포와의 적합한 연관성을 형성한다. 이식 부위에 위치한 내생성 조절 인자는 간세포를 특정 유형의 분화 세포 또는 조직으로 직접 분화시킬 수 있다. 별법으로, 확산 분화된 세포 및(또는) 조직의 군은 피하조직, 복막 및 신장피막으로 이식된 간세포로부터 얻어진다. 이들 및 다른 방법이 미국 특허 출원 제09/997,240호 및 미국 가출원 제60/253,943호에 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 단리된 다능성 HS 세포는 면역손상된 동물에서 생체내 분화에 의해 선택된 조직으로 분화된 다음 다양한 치료 용도를 위해 상기 조직을 단리할 수 있다. 또한, HS 세포는 연구 또는 진단을 목적으로 시험관내에서 배양되고 분화될 수 있다.
G.HLA 분류된 HS 세포의 집합물
HS 세포는 동형접합성이고, HLA 일배체형 하나만을 갖는다. 따라서, 공여자 HS 세포는 이형접합성 간세포에서처럼 2개 대신에, 수용자와 매칭될 HLA 일배체형 하나만을 갖는다. 상기한 바와 같이, 22개의 상이한 HLA A 항원, 42개의 상이한 B 항원, 9개의 상이한 Cw 항원 및 18개의 DR 항원이 존재한다. 이처럼 다수의 다형 HLA 일배체형 때문에, 수용자와 공여자 사이에서 2개의 일배체형간의 완전한 매칭은 상당히 어렵다. 최고 경우의 시나리오에서, 연관 불균형 및 특정 종족의 HLA 일배체형의 존재가 있는 경우와 같이, 2개의 일배체형 매칭을 발견할 가능성은 수백만분의 1 내지 1,000분의 1 범위이다. 그러나, 동일한 시나리오에서, 하나의 일배체형 매칭은 일반적인 일배체형에 대해 200명 중 한명 미만으로 달성될 수 있다 (미국에서 코카서스인 군집에 대해 일반적인 일배체형의 총 불균형이 약 172명으로 나타난 문헌[Martin et al., 상기 문헌] 참조). 따라서, HS 세포는 다인종의 무작위 공여자들로부터 취해져, 군집에서 개개인에 의해 충분히 전달되는 하나 이상의 일배체형과 면역조직적으로 매칭되는 HS 세포 군집의 집합물 또는 뱅크를 제공할 수 있다. 집합물은 각각 별개의 HLA 일배체형을 갖는 약 200개의 상이한 HS 세포주를 단지 함유하여 대부분의 일반 군집을 제공할 필요가 있다 (즉, 이식에 적합한 면역조직적으로 적합한 세포를 제공함).
바람직한 실시양태에서, 집합물의 내용들은 예를 들어, 검색가능한 컴퓨터 데이타베이스로 분류되어 전세계의 의사들에 의한 원거리의 신속한 스크리닝을 촉진한다. 본 발명은 다수의 공여자로부터 유전자형 분류된 동형접합성 간세포 (HS 세포) 군집을 생성하는 방법을 제공한다. 이론적으로, 공여자는 널리 확산된 HLA 일배체형을 가질 가능성이 큰 공여자들에 대해 선별될 것이다. 그 다음, 공여자는 HLA 일배체형 및 유전자형에 대해 분석된다. 그 다음, HS는 공여자의 제1 생식세포분열기 후의 동형접합성 이배체 생식세포가 체세포분열을 하도록 활성화시켜 다수의 배반포-유사 군체를 발생시키고 (이들 각각은 특정 대립유전자에 대해 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM)를 함유함), 선별된 ICM으로부터 HS 세포를 단리하고, 상기 HS 세포를 배양하여 각 HS 세포주를 생성하고, 상기 각각의 HS 세포주의 유전자형을 분석하며, 생성된 각 HS 세포주와 관련된 각각의 HLA 일배체형 및 유전자형을 분류함으로써 상기 공여자로부터 유도된다.
하기 실시예는 실시의 축소를 설명하는 실시예 및 본 발명의 선택된 바람직한 실시양태의 사용을 더 설명하려는 것으로, 이는 본원에 기재된 본 발명의 교시내용 또는 기재내용을 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1. 동형접합성 간세포 형성, 및 스템플라즘 내 3개의 배엽의 선조 세포 및 다양한 조직으로의 그의 분화
실시예 1(a): 제2 극체의 방출의 활성화시킨 후의 차단에 의한 마우스의 제1 생식세포분열기 후의 난모세포로부터의 HS 세포의 유도
8주령 암컷 C57/BDA2 F1 마우스 (메사추세츠주 윌밍톤 소재의 찰스 리버 실험실 (Charles River Laboratories))를 임신한 암말의 혈청 고나도트로핀 (PMS; 텍사스주 휴스톤 소재의 PCCA (29-10001BX)) 5 IU/100 ㎕ 및 인간 융모막 고나도트로핀 (HCG; 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 (C8554)) 5 IU/100 ㎕의 주사제를 복강하 투여하여 과배란을 유도하였다. 73종의 난모세포를 HCG 주사 약 17 시간 이후에 수거하고, 최종 농도 0.3 mg/ml로 M2 배지 (M7167, 시그마)중에 용해시킨 한 방울 (∼300 ㎕)의 히알루로니다제 (시그마, H4272) 중에 새롭게 수득한 난모세포를 인큐베이션함으로써 작은더미 군체를 제거한 후에, 추가로 핸들링하기 전에 HEPES 완충된 M2 배지로 3회 세척하였다. 난모세포를 이어서 5 μM 칼슘 이온운반체 (시그마, C7522) 용액으로 실온에서 5 분 동안 처리한 후에, HEPES 완충된 M2 배지로 2회 세척함으로써 활성화시켰다. 난모세포를 5 mM 6-디메틸아미노푸린 (6-DMAP) (시그마, D2629)을 함유한 M16 중탄산염-완충된 배양 배지 (시그마, M7292)에서 5％ CO2및 37℃에서 3 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 난모세포를 M16 배지로 3회 세척하고, 배반포-유사 군체가 형성될 때 (4 내지 5일)까지 광유하의 1방울의 M16 배지 중에서 인큐베이션하였다. 이어서, 배반포-유사 군체의 둘러싸인 껍질을 자연스럽게 떼어낸 후에 ("헤칭 (hatching)"), 배반포 유사 군체를 이어서 미토마이신-C 처리된 쥐 배아 영양공급 세포층으로 옮기고, 20％ 소 태아 혈청 (기브코 (Gibco), 16141-079) 및 LIF 1,400 U/ml (케미콘 (Chemicon), ESG1106)을 갖는 간세포주 형성용 ES 배지 (DMEM: 메릴랜드주 록빌 (Rockville) 소재의 기브코, 라이프 테크놀로지즈 (Life technologies), 11995-065)에서 15 일 이상 동안 배양하였다.
별법으로, 외과면역학적으로 배반포-유사 군체로부터 영양막 세포를 제거한 후에, 하기 과정으로 영양공급 세포층 상에서 배양하였다. 헤칭된 배반포-유사 군체를 먼저 항-마우스 Thy-1 토끼 혈청 (간세포 배지 중에 1:10 희석, 뉴욕주 웨스트버리 (Westbury) 소재의 아쿠레이트 케미칼 (Accurate Chemical), ACL2001) 및 항-인간 림프구 토끼 혈청 (간세포 배지 중에 1:10 희석, 아쿠레이트 케미칼, CL8010)과 함께 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 배반포-유사 군체를 M2 배지로 3회 세척하고, 이어서 기니픽 보체 (간세포 배지 중에 1:10 희석, 아쿠레이트 케미칼, ACL4051)와 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 보체-처리된 세포 군체를 이어서 M2 배지 중에서 3회 세척하고, 20％ 소 태아 혈청 (기브코-BRL), 1 mM 글루타민, 0.1 mM 메르캅토에탄올 (시그마), 1％ 비필수 아미노산 스톡 (기브코-BRL) 및 1,400 U/ml LIF (케미콘, ES1106)이 보충된 80％ 둘베코 (Dulbecco) 개질된 이글 (Eagle) 배지 (피루베이트 없음, 글루코스 고함량 배합; 기브코-BRL)로 이루어진 간세포 배지 중에 추가로 배양하기 위해 미토마이신-C 처리된 쥐 배아 영양공급 세포층으로 옮겼다.
15일 이후에, 내부 세포 군체-유도된 증식물이 형성되고, 마이크로피펫으로 기계적으로 분리함으로써 응집물로 분리하고, 새로운 간세포 배지 중의 쥐 섬유모 영양공급 세포 상에 다시 플레이팅하였다. 일정한 비분화된 형태를 갖는 개별적인 콜로니를 마이크로피펫으로 개별적으로 선별하고, 기계적으로 응집물로 분리하고, 다시 플레이팅하였다. 일단 정착되고, 확장되면, 트립신/EDTA 용액 (0.05％/0.5％, 기브코-BRL)에 5분 노출시킨 후에 영양공급 세포 및 새로운 간세포 배지 상에서 추가로 배양함으로써 배양물을 계대배양하였다.
쥐 배아 섬유모 영양공급 세포를 스템셀, 인크. (Stemcell, Inc.) (00308)로부터 구입하고, 2 내지 3회 계대배양하였다. 영양공급 세포의 체세포분열을 억제하기 위해 미토마이신-C (시그마, M4287) 10 ㎍/ml를 함유한 DMEM/10％ FBS 배지 5 ml로 37℃에서 3 시간 동안 60 mm 디쉬 1개의 융합성-확장된 영양공급 세포를 처리하였다. 처리된 영양공급 세포를 이어서 DMEM/10％ FBS 5 ml로 3회 세척하고, 37℃에서 5 분 동안 트립신 처리한 후에, DMEM/10％ FBS 배지 5 ml로 중화시키고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 수거하였다. 수득한 미토마이신-처리된 세포 펠렛을 DMEM/10％ FBS 배지 15 ml 중에 재현탁하고, 3개의 60mm 디쉬 (세포 현탁물5 ml/1개의 디쉬) 상에 플레이팅하고, 사용하기 전에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
실시예 1(b) 암컷 C57/DBA2 하이브리드 마우스로부터의 특이적인 유전자형 및 면역형에 대한 HS 세포 동형접합성의 유도
대부분의 유전자 좌위 및 H-2 (마우스 MHC)에 대해 이형접합성인 5마리의 암컷 C57DBA2 하이브리드 마우스를 HS 세포 군집에 대한 실시예 1(a)에 기재된 바와 같이 과배란을 유도하였다. 11개의 세포주를 유도하고, 배양으로 증식하고, 이어서 냉동보관하였다. 약 5 계대배양 때에 각각의 세포주로부터의 세포를 H-2 위치 중의 I-E-베타에 대해 면역형 분류하고 (PCR 프라이머의 서열: Eb1: CAG AAC CTG AGT CCT GGG CG; Eb2: AGC AGA CCA GGA GGT TGT GG), 및 마이크로세텔라이트 마커 (리서치 지네틱스 (Research Genetics))를 사용하여 D2mit42에 대해 유전자형 분류하였다.
게놈 DNA 추출 방법, PCR 증폭 및 마우스 HS 세포의 유전자 분석 (D2mit42 마이크로세텔라이트 마커를 사용함)은 실시예 1(f)에 기재된 바와 같았다. MDE 겔 (FMC 바이오프로덕츠 (Bioproducts)) 상에서 단일-가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석을 사용하여 H-2 대립유전자의 PCR 생성물을 분리함으로써 H-2 (I-E-베타)의 면역형 분류를 수행하였다. C57/DBA2 하이브리드 마우스로부터 유도된 대표적인 HS 세포주 2개의 유전자형 분류 및 면역형 분류의 결과를 도 9A 내지 9F에 나타내며, 이는 C57/DBA2 마우스 (도 9A), 및 그의 과배란된 난모세포-유도된 배반포-유사 군체 (도 9B) 및 2개의 상이한 HS 세포주로부터의 2개의 대표적인 콜로니 (도 9C 및 9D)를 나타낸다. 공여자 마우스 (레인 1), HS 세포주-1 (레인 2) 및 HS-세포주-2 (레인 3)의 유전자형 (도 9E) 및 면역형 (도 9F)를 또한 표시한다.
실시예 1(c): 제2 극체 방출의 활성화시킨 후의 차단에 의한 인간 이배체 난모세포로부터의 배반포-유사 세포 군체의 발생
여성 난자 공여자들을 류프롤라이드 아세테이트 (루프론 (Lupron): 일리노이주 디어필드 (Deerfield) 소재의 TAP 파마슈티컬즈 (Pharmaceuticals))로 하향조절하고, 이어서 300 IU/일의 투여량으로 여포 자극 호르몬 (FSH) (세로노 (Serono), 고나 (Gona)-F) 처리함으로써 COH (조절된 난소 과다자극)를 개시시켜 적절한 다중여포 반응을 유도하였다. 여포 성숙도에 대한 초음파 기준에 부합되는 경우, 단일 10,000 IU 투여량의 인간 융모막 고나도트로핀 (hCG) (세로노, 프로파시 (Profasi))을 투여하고, 질경유 여포 흡인을 hCG 투여 약 36 시간 후에 수행하였다. 회수된 난모세포로부터의 작은더미 군체를 80 IU/ml 히알루로니다제에 약 30초 동안 노출시킨 후 10％ 인간 혈청 알부민 (HEPES-HTF-HSA) (캘리포니아주 샌디에이고 소재의 인비트로케어, 인크 (InVitroCare, Inc.), 2002 및 2101)이 보충된 HEPES-완충된 인간 자궁관액에 노출시킴으로써 제거하였다.
체세포분열 활성화를 이루기 위해, 작은더미 군체 무함유 성숙 M-II 난모세포를 HEPES-HTF-HSA 중의 5 μM 칼슘 이온운반체 (A23187, 시그마)로 5분 동안 33℃에서 처리한 후에, HEPES-HTF-HSA로 3회 세척하고, IVC-2 (인비트로케어, 2008) 중의 1 내지 5 mM 6-디메틸아미노푸린 (6-DMAP, 시그마) 중에서 3 내지 5 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 처리하였다. 세포 분열 및 배반포-유사 군체 형성을위해 활성화된 난모세포를 IVC-1 배지 (인비트로케어, 2006)에서 3 일 동안 인큐베이션하고, 추가로 IVC-3 (인비트로케어) 중에서 2 일 동안 인큐베이션하였다.
별법으로, 난모세포를 STO 마우스 영양공급 세포와 동시 배양하였다. 6일째에, 배반포-유사 군체를 홀딩 피펫 (주사기 흡입 시스템)으로 죄어서 3시 위치에서 산성화된 티로드 용액 (메디-컬트 (Medi-Cult), 1060-0002)으로 충전한 미세-바늘을 빈 위란강에 노출시켜 작은 (30 ㎛) 영역 상의 산성화된 티로드 용액을 이 구역에 매우 가까운 바늘 첨단을 죔으로써 서서히 방출시키는 미세조작기하에 조력 헤칭하였다. 구역의 내부를 꿰뚫거나 또는 연하게하는 경우 산성화된 티로드 용액의 배재는 즉시 중지되었다. 배반포-유사 세포 군체는 이어서 약화된 구역으로부터 방출될 것이다. 배반포-유사 군체를 구역으로부터 이탈시킨 후에, 외과면역학적으로 군체를 항-인간 Thy-1 (IVC-3 중에 1:10 희석, 뉴욕주 웨스트버리 소재의 아쿠레이트 케미칼, CBL415-CD90) 및 항-인간 림프구 (IVC-3 중에 1:10 희석, 아쿠레이트 케미칼, CL8010)와 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 영양막 세포를 제거하였다. IVC-3 배지로 3회 세척한 후에, 배반포-유사 군체를 이어서 LOW-TOX 기니픽 보체 (IVC-3 중에 1:10 희석, 세달란 (Cedarlane), CL4051)과 함께 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 보체-처리된 세포 군체를 이어서 IVC-3 배지 중에서 3회 세척하고, 미토마이신-C 처리된 STO (ATCC) 영양공급 세포층으로 옮기고, 20％ 소 태아 혈청 (기브코-BRL), 1 mM 글루타민, 0.1 mM 메르캅토에탄올 (시그마), 1％ 비필수 아미노산 스톡 (기브코-BRL) 및 1,400 U/ml LIF (케미콘, ES1106)이 보충된 80％ 둘베코 개질된 이글 배지 (피루베이트 없음, 글루코스 고함량 배합; 기브코-BRL)로 이루어진 간세포 배지 중에 배양하였다. 도 10A 참조.
실시예 1(d): 제2 극체 방출 및 게놈 자가복제의 활성화시킨 후의 허용에 의한 인간 제1 생식세포분열기 후의 이배체 난모세포로부터의 배반포-유사 세포 군체의 발생
과배란의 유도 방법, 난모세포 회복 및 작은더미 군체의 차후 제거는 실시예 1(b)에 기재된 바와 같았다. 체세포분열 활성화를 이루기 위해, 작은더미 군체 무함유 성숙 M-II 난모세포를 허위 세포질내 정자 주입 (ICSI)하여 정자로 가짜 활성화시킨 후에, 25 μM 칼슘 이온운반체 (A23187, 시그마)와 함께 5 분 동안 33℃에서 인큐베이션하였다. 이 방식으로 활성화된 난모세포는 제2 극체가 방출되고, 일배체가 되었다. 세포 분열 및 배반포-유사 세포 군체 형성을 위해 이러한 일배체 난모세포를 IVC-1 배지 (인비트로케어, 인크.)에서 3 일 동안 인큐베이션하고, 추가로 IVC-3 (인비트로케어)중에서 2 일 동안 인큐베이션하였다. 배반포-유사 군체의 차후 조작은 실시예 1(b)에 기재된 바와 같았다. 활성화로 발생된 일배체 난모세포는 세포질분열 없이 그의 게놈을 자가 복제할 수 있었고, 이배체 세포로 되었다 (Taylor, A. S., et al., Hum. Reprod. 9(12): 2389-97 (1994); Kaufman, M. H. et al., J. Embryol. Exp. Morphol. 73: 249-61 (1983)). 도 10B 내지 10D 참조.
실시예 1(e): 마우스 HS 세포 성장, 마우스 신장 피막 하에서의 이러한 HS 세포의 분화 및 이러한 세포의 배아체 형성
실시예 1(a)에 기재된 바와 같은 배반포-유사 군체로부터 수득한 HS 세포를, 실시예 1(a)에 기재된 바와 같은 간세포 배지를 포함하는 0.1 ％ 젤라틴 코팅된 디쉬 (10 cm) 내에서 마우스 영양 세포에 시딩하여 콜로니를 형성하였다.
HS 세포의 한 콜로니를 몇몇의 조각으로 절개하고, 26 하이브리드 마우스의 2개의 신장 피막 중 하나에 이식하여 스템플라즘 형성을 유도하였다. 이어서, 이식 1, 3, 6, 9.5, 10.5, 11, 12 및 14주 후에 마우스를 죽여서 스템플라즘을 수거하였다. 형태 연구를 위해 각각의 스템플라즘의 절반을 포르말린 중에서 고정시키고, 분자적 특성화를 위해 다른 절반을 -80℃에서 동결시켰다. 스템플라즘은 대략 3주에서 가시적인 크기로 형성되기 시작하였다. 스템플라즘 수거를 스테거링 (staggering)하여, 스템플라즘 내에서 발생된 다양한 조직 유형을 연구하였다. 본원에서 확인되는 모든 조직 유형은 상기 스템플라즘 내에서 발생되었다. 스템플라즘 유전자형을 상기 C.2.절에 기재된 PCR-기초의 대립유전자 분석으로 확인하였다.
배아체 (EB)를 생성시키기 위해 60 mm 디쉬 상의 HS 세포를 먼저 PBS로 2회 세척하였다. 트립신/EDTA 용액 1 ml를 이어서 첨가하고, 세포를 37℃에서 5 분 동안 두었다. ES 배지 5 ml를 이어서 첨가하고, 세포를 세포 스크래퍼로 들어내고, 1000 rpm에서 5 분 동안 회전 침전시켰다. 이렇게 수득한 세포 펠렛을 이어서 LIF가 없는 5ml 간세포 배지 중에 재현탁하고, 세포수를 세었다. 세포를 이어서 리드 및 벤트를 구비한 현탁 디쉬 (Nalge Nunc International, 171099, 35 x 10 mm) 상에 2 x 106/10 cm 디쉬로 시딩하였다. 세포를 간세포 배지 중에 4 일 동안 공급하며, 15 ml 튜브 내로 세포를 옮기고, 세포가 튜브 바닥에 정치될 때까지 약 5 분 동안 기다린 후 배지를 교환하여, 매 2일마다 배지를 교환하였다. 이어서 세포를원래 디쉬로 옮기고 배아체로 뭉쳐 추가로 분화되도록 하였다.
실시예 1(f): 기형종 내의 인간 HS 세포의 분화 및 이러한 분화된 조직의 유전적 동형접합성
31종의 기형종을 위싱톤, DC 소재의 3군 병리학 연구소 및 뉴욕주 뉴욕 소재의 뉴욕대학교 병리학부 (Dr. J. Liu)의 파일로부터 획득하였다. 다양한 상이한 종류의 독점적으로 분화되는 조직은 여성 환자로부터의 20종의 난소 종양에서 발견되었다. 당업계에 공지된 방법을 사용하는 대표적인 경우에 수행되는 FISH 분석 및 염색체 3 및 8에 대한 알파-세텔라이트 프로브로 확인됨으로써 이 분화되는 조직은 이배체임이 밝혀졌다. 비분화된 조직 및 분화된 조직의 3 내지 12 조직 영역은 여성 환자로부터 7개의 난소 종양에서 발견되었고, 남성 환자로부터의 4개의 고환 종양이 확인되고, 유전 분석을 위해 각각의 경우로부터 선택적으로 미세절개하였다. 각각의 경우에, 분화되는 조직은 유전적으로 동형접합성이고, 비분화되는 조직은 유전적으로 이형접합성으로 밝혀졌다.
미세절개유리 슬라이드 상의 비염색된 6 ㎛ 부분을 크실렌으로 탈파라핀화시키고, 100％ 내지 80％의 에탄올 중에 세정하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 순간 염색하고, TE 완충액 중의 10％ 글리세롤 중에 세정하였다. 직광 현미경 시각화 하에 조직 미세절개를 수행하였다. 각각의 경우로부터, 유전 분석을 위해 상이한 조직 분화의 6 내지 12 영역을 개별적으로 미세절개하였다. 추가로, 정상인 비-종양 조직의 몇몇 영역을 얻었다.
DNA 추출Tris-HCI, pH 8.0; 1.0 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산, pH 8.0;1％ Tween 20 및 0.5 mg/ml 단백질 분해효소 K를 함유한 완충액 25 ㎕ 중에 생성된 세포를 바로 재현탁하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 혼합물을 5 분 동안 끓여서 단백질 분해효소 K를 불활성화시키고, 이 용액 1.5 ㎕를 DNA의 PCR 증폭을 위해 사용하였다.
유전 분석미세절개 후에 입수가능한 제한된 양의 DNA 중에서 동형접합성을 확실하게 확인하기 위해, DIS1646 및 D1S243 (1p), D3S2452 (3p), D5S346 (5q), D7S1822 (7q), Ank-1 (8p), D9S171 (9p), D9S303 (9q), Int-2 및 PYGM (11q), IFNA (9p), D17S250 (17q), CYP2D (22q) 및 AR (Xq)을 포함하는 14종 이하의 별개의 고 다형 마이크로세텔라이트 마커로 다중 상이한 미세절개한 조직 샘플을 분석하였다. 각각의 PCR 샘플은 상술한 바와 같이, 총부피 10 ㎕중에 DNA 주형 1.5 ㎕, 각각의 프라이머 10 pmol, dATP, dCTP, DGTP 및 DTTP 각각 20 nmol, 15 mM MgCl2, 0.1U Taq DNA 중합효소, 0.05 ml [32P]dCTP (6000 Ci/mmol) 및 10 X 완충액 1 ㎕를 함유하였다. PCR에 대해 하기 35 주기를 수행하였다: 95℃에서 1 분 동안 변성시키고, 1 분 동안 어닐링시키고 (마커에 따라 다른 55 내지 60℃의 어닐링 온도) 및 72℃에서 60 초 동안 연장시킴. 최종 연장을 10 분 동안 지속하였다. 표지된 증폭 DNA를 등부피의 포름아미드 로딩 염료 (95％ 포름아미드, 20 mM EDTA, 0.05％ 브로모페놀 블루 및 0.05％ 크실렌 시아놀)와 혼합하였다.
샘플을 5 분 동안 95％에서 변성시키고, 6％ 아크릴아미드 (아크릴아미드:비스아크릴아미드 49:1)로 이루어진 겔 상으로 로딩하고, 1800 V에서 90 분 동안 전기영동할 수 있었다. 전기영동 후에, 겔을 3 mm 왓트만 종이로 옮기고, 건조시킬 수 있었다. 자가방사선 분석을 코닥 X-OMAT 필름 (뉴욕주 로체스터 소재의 이스트만 코닥사 (Eastman Kodak) 제조)으로 수행할 수 있었다.
결과동일한 대립유전자의 일관된 동형접합성을 나타내는 분화되는 암적인 조직은 편평 상피, 아교세포 및 연골의 미세절개된 샘플을 포함하였다 (마커 Ankl (상부) 및 D1S1646 (바닥)로 분석함). 정상 난소 조직은 대조군으로서 포함되었다.
기형종의 서브세트에서, 부정합 동형접합성 대립유전자를 가지는 것으로 발견되는 분화되는 암적인 조직 (마커 Int-2, D9S303, D1S1646, D3S2452 및 Ankl로 분석함)에는 표피, 피지선, 호흡기 상피 및 아교세포의 샘플이 포함되었다. 정상 난소 조직은 대조군으로서 포함되었다. 이러한 종양에서, 생식세포에서 생식세포분열 I 전에 종양형성의 개시로부터 대립 이형접합성이 발생된다고 여겨졌다. 기형발생 종양 세포 개시 이후에, 불규칙적이고 독립적인 일들이 이어서 생식세포분열후 유전자형을 갖는 선조 세포로 유도하였다.
분화되는 조직 및 비분화되는 조직 모두를 함유하는 일련의 난소 기형종 및 고환 생식세포 종양도 또한 분석하였다. 각각의 종양에서, 비분화되는 조직 및 분화되는 조직 성분 모두가 수득되었다. 동형접합성 및 이형접합성 성분을 마커 D3S2452, D3S303, CYP2D 및 D17S250을 사용하여 검출하였다. 정상 난소 및 고환 조직을 대조군으로서 포함하였다. 미성숙 편평 상피, 신경 조직 (때때로 동일한 종양 내에서의 신경 조직의 개별적인 영역으로부터), 연골, 선 (glandular) 구조및 간충질을 포함하는 비분화되는 조직 성분에서 이형접합성 대립유전자가 검출되었다. 미세절개로 동일한 종양으로부터 단리한 분화되는 조직 성분은 동일한 마커에 대해 동형접합성으로 밝혀졌다. 시험되는 성숙 성분은 피지선 조직, 모낭 및 성숙 편평 상피 (때때로 동일한 종양 내에서의 편평 상피의 개별적인 영역으로부터)를 포함하였다. 일부 종양에서, 분화되는 성분은 반대 동형접합성 대립유전자를 나타내며, 이는 재조합을 나타내거나 또는 다양한 성분이 별개의 생식세포분열후 세포로부터 개별적으로 발생된다는 것을 제시하였다.
실시예 1(g): 인간 HS 세포로부터 선조세포의 유도
1차 분화
1차 배아 섬유 배아세포층이 포함된 60 ㎜ 디쉬 (팔콘 (Falcon), #353802) 및(또는) 0.1 ％ 젤라틴 코팅 디쉬에서 성장한 HS 세포를 1.5 ㎖ 트립신/EDTA (인비트로겐 (Invitrogen), #25300-050)으로 트립신 처리하고, 15 ㎖ 원뿔형 튜브 중의 1.5 ㎖ ES-LIF 배지로 옮겼다. 그 다음, 세포를 1200 rpm으로 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛을 2 ㎖ ES-LIF 배지중의 단일 세포 현탁액에 재현탁시키고, 현탁 배양-35 ×10 ㎜-디쉬 (NalgeNunc, #171099)에 1 내지 3 ×106의 세포 밀도로 현탁 세포로서 배양하여, 4 내지 6일 동안 간세포가 배아체 (EB)로 알려진 둥근 구형 클러스터를 형성하게 하였다. 형성된 EB를 15 ㎖ 원뿔형 튜브로 옮겨 2일 마다 세척한 다음 바닥에 정착시켰다. 상층액을 제거하고, 새로운 ES-LIF를 첨가하였다. 그 다음, EB를 다시 현탁액 배양 디쉬로 옮겼다. 배아체로 성장한 HS 세포는 모든 배엽 (외배엽, 내배엽 및 중배엽)으로 이루어졌다.
외배엽 선조세포4 내지 6일 후에, EB를 티로신/EDTA 1 ㎖ 중에서 트립신 처리하고, ES-LIF 배지 4 ㎖에서 세척하고, 10％ 세럼 리플레이스먼트 (Serum Replacement, 인비트로겐, #10828), 및 G5 (인비트로겐, #I7503), N2 (인비트로겐, #I7502-048) 또는 베타 NGF (100 ng/㎖) (알 앤드 디 시스템즈 (R＆D Systems), #256-GF)로 보충된 DMEM/낙아웃 (Knockout) 배지 (인비트로겐, #10829-018) 중 단일 세포 현탁액에 재현탁시켰다. 상기 세포를 10일 동안 피브로넥틴-코팅된 35 ㎜ 디쉬 (50 ㎍/㎖) (시그마 (Sigma), #F-0895) 중에 3 내지 5 x 105/3 ㎖로 배양하고, 배지를 2 내지 3일 마다 교체하였다.
별법으로, EB를 ES-LIF 배지 중 0.1 ％ 젤라틴-코팅된 디쉬에 1 내지 2일 동안 배양한 후, 이 배지를 인슐린 (5 ㎍/㎖), 염화셀레늄 (0.015 nM), 트랜스페린 (50 ㎍/㎖) 및 피브로넥틴 (5 ㎍/㎖) (시그마)가 보충된 혈청 무함유 배지로 6일 동안 교체하였다. 세포를 트립신 처리하고, 단일 세포 현탁액을 N2 배지 (N2 (인비트로겐, #I7502-048), B27 (인비트로겐, #I7504-44) 및 bFGF (lO ng/㎖) (인비트로겐, #13256-029)로 보충된 혈청 무함유-DMEM/F12)에 배양하였다. 이후, 세포를 계수하고, 폴리-L-오르니틴 (15 ㎍/㎖) (시그마, #P36550)으로 예비 코팅된 24-웰 플레이트 중에서 2 내지 5 ×104세포/웰/400 ㎕ N2 배지의 밀도로 접종하고, 6일 동안 팽창시켰다.
이들 선조 세포는 G5, RA, FGF, NGF, GNDF 또는 BNDF를 첨가하여 상이한 유형의 뉴런 세포로 더 분화되었다. 이들은 세포 팽창을 위해 조절된 배지에서 또한 유지되었다.
중배엽 선조 세포. 중배엽 선조 세포에 대해서는, 상기한 바와 같은 10 ％ 세럼 리플레이스먼트 및 베타-NGF가 보충된 DMEM/낙아웃 배지 중의 단일 세포 현탁액을 10일 동안 배양하고, 배지를 2/3일 마다 교체하였다. 이 기간후에, 심장 선조 세포에 대해서 세포를 액티빈 (Activin) A 보충된 (20 ng/㎖) (시그마, #A4941) 조절 배지에서 10일 더 배양하였다. 별법으로, 신장 및 뮬러관 선조 세포를 액티빈 A 보충된 (20 ng/㎖) (시그마, #A4941) 조절 배지에서 4 내지 6일 동안 추가로 배양한 다음 TGF-베타 (알 앤드 디 시스템즈, #) 2 ng/㎖를 배지에 첨가하고, 세포를 4 내지 6일 더 배양하였다.
내배엽 선조 세포. 내배엽 선조 세포에 대해서는, 라미닌-코팅 (10 ㎍/㎖) (시그마, #L2020) 또는 콜라겐 I-코팅 (10 ㎍/㎖) (시그마, #C-7661) 상의 G5 또는 베타-NGF와 함께 10 ％ 세럼 리플레이스먼트가 보충된 DMEM/낙아웃 배지 중의 단일 세포 현탁액을 10일 동안 배양하였다. HGF (20 ng/㎖) 및(또는) TGF-알파 (2 ng/㎖)를 배지에 첨가하여 G5 또는 베타-NGF로 대체하고, 세포를 6 내지 8일 더 배양하였다.
별법으로, EB를 콜라겐 I-코팅 디쉬 상에 플레이팅하고, ES-LIF 배지에서 4일 동안 배양하였다. FGF (20 ng/㎖)를 첨가하고, 세포를 3일 더 배양하였다. 이 기간 후에, HGF (20 ng/㎖) 및(또는) TGF-알파 (2 ng/㎖)를 첨가하고, 6일 더 배양하였다.
또한, EB를 라미닌-코팅 부착 디쉬 (10 ng/㎖) (시그마, #L2020) 또는 0.1 ％ 젤라틴 코팅 35 ×10 ㎜ 부착 디쉬에 옮기고, ES-LIF 배지에서 1 내지 2일 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 혈청 무함유 DMEM/F12 (인비트로겐, #11330-0321) 배지를 인슐린 (5 ㎍/㎖) (인비트로겐, #I1882), 염화셀레늄 (0.015 nM) (시그마, #S5261), 트랜스페린 (50 ㎍/㎖) (시그마, #T-2036) 및 피브로넥틴 (5 ㎍/㎖) (시그마)로 보충하였다. 상기 배지를 ITSFn 배지로 지정하였다. 세포를 ITSFn 배지에서 6일 동안 공급하고, 이 배지를 2일마다 교체하였다.
실시예 1(h): 이식된 HS 세포로부터 동형접합성 선조 세포의 발생 및 단리
동형접합성 선조 세포를 얻기 위해, 상기 설명 및 실시예에서 상기 개시된 방법으로부터 유래된 다능성 HS 세포를 신장 캡슐하에 면역손상된 마우스에 이식하고 4 내지 6주 동안 생체내 배양시켰다. 얻어진 세포 군체를 단일 세포로 나누고 세포주로 추가 증식 및 발생을 위해 영양세포상에서 배양하였다.
계통 운명 결정 (선조 세포의 유형)을 평가하기 위해, 유전자 발현 분석, 예를 들어 RT-PCR, 노던 블롯 (northern blot), 면역조직화학 등을 공지된 계통 특이적 마커, 예를 들어 외배엽을 위한 NF-H, 케라틴, D-베타-H, 중배엽을 위한 에놀라아제, CMP, 레닌, 칼리케레인, WT1, 델타-글로빈, 베타-글로빈, 및 내배엽 선조 계통을 위한 알부민, 알파-1-AT, 아밀라아제, PDX-1, 인슐린, 알파-FP에 대해 수행하였다.
실시예 2: 친족 (예를 들어, 의도된 수용자의 부모)에 의해 공여받은 물질에서 유래한 HS 세포의 군집에서 표적 면역형의 HS 세포 선별
상기 실시예에 기술한 방법을 이용하여 과배란에 의해 수용자의 모계에서 난모세포를 수득하였다. 일단 상기 실시예에 기술된 방법에 따라서 HS 세포 군집을 발생시킨 후, 각각의 HS 군집의 샘플을 HLA 분자 (예를 들어, 조혈 계통)의 최적 발현을 위해 시험관내에서 분화시킬 수 있었고, 이후 각각의 군집에서 HS-유래된 샘플 세포를 미량림프구독성 분석을 이용하여 HLA-A, -B 및 -C 특이성을 시험하였다. 이 시험을 60- 또는 72 웰 미량림프구독성 플레이트에서 수행하였다. 시판품으로부터 수득한 한 패널의 항혈청을 선택하고, 플레이트 상에 먼저 붓고, -40℃ 또는 -70℃ 냉동기로 냉각시켰다. HS 세포 현탁액 (RPMI 중 HS 세포, 또는 분류를 위해 원하는 희석물을 표준 기술을 이용하여 1 밀리리터 당 1.5×106HS 유래된 샘플 세포에 현탁시켜 제조) 0.5 내지 1 ㎕를 플레이트의 각각의 웰에 분배하고, 30 분 동안 20 내지 22℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 보충물 2 내지 5 ㎕를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 60 분 동안 20 내지 22℃에서 인큐베이션하였다. 보충물은 냉동-건조시킨 형태의 채혈한 토끼 혈청으로서 상업적으로 이용가능하다. 5％ 에오신 용액 1 ㎕를 각각의 웰에 첨가한 후, 포름알데히드 1 ㎕를 첨가하였다. 적절한 현미경을 이용하여 세포들에 고정된 염료의 양을 측정함으로써 각각의 웰에서 세포 사멸을 입증하였다. 0 내지 8 스코어 (여기서, 8은 80 내지 100％가 강한 양성을 나타내고, 2는 20 내지 40％가 의심의 여지가 있는 양성을 나타냄)의 표준 스코어링 시스템을 사용하였다.
이후, 샘플 세포를 PCR-RFLP 분석을 이용하여 HLA-DR, -DQ 및 -DB에 대하여시험하였다. 당업계에 공지된 표준 절차를 이용하여 HS 세포로부터 DNA를 추출하였다. 이후, 추출된 DNA 200 내지 300 ㎍을 2.5 U의Taq중합효소로 PCR로 증폭시켰다. HLA 클래스 II의 증폭에 사용한 PCR 프라이머를 도 11에 열거하였다. 증폭시킨 후, 4 내지 7 ㎕의 반응 혼합물을 도 5의 목록에서 선택한 제한 효소 및 적절한 제한 완충액을 함유하는 용액에 첨가하고, 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 29개의 상이한 효소들을 전체 클래스 II 분류에 사용하였다. 이후, 제한 효소에 의해 절단된 증폭된 DNA의 샘플을 소형 장치 (예를 들어, 미국 캘리포니아주 산 마테오 소재 E-Y 레버러토리즈 인크에서 입수한 머피드 (Mupid)-2)로 12％ 폴리아크릴아미드 수평 겔을 이용하여 전기영동하였다. RFLP 단편을 에티듐 브로마이드로 염색하여 검출하였다.
수용자의 면역형을 상기 기술한 혈청학적 및 분자적 방법론을 이용하여 결정하였다. 수용자에서 수득한 20 ㎖의 정맥혈 (표적)을 시트르산나트륨 항응고제 (혈액 10 ㎖ 당 3.3％ 시트르산나트륨 1 ㎖)에 첨가하였다. 이후, 시트르산염화 혈액을 동일한 부피의 헤파린처리한 HBSS로 희석 (1 ㎖의 헤파린 1000U/㎖를 100 ㎖의 HBSS에 첨가)하였다. 희석된 혈액 10 ㎖를 피펫을 이용하여 17 내지 120 mm 스크류 탑 원심분리 튜브 중에 4 ㎖의 피콜-이소파크 (Ficoll-isopaque) 상에 층을 만들었다. 이후, 튜브를 15 내지 20 분 동안 700×g으로 원심분리하였다. 적혈구 세포 및 다형핵 세포는 튜브 끝에서 펠렛을 형성하고, 림프구는 피콜-이소파크의 계면에서 분리된 층을 형성하였다. 림프구 층을 다른 튜브로 흡인하고, HBSS로 상층을 제거하고, 5 분 동안 250 ×g으로 다시 원심분리시켰다. 이후, 림프구 펠렛을 재현탁시키고, HBSS로 세척하고, 5 분 동안 120×g으로 다시 원심분리하였다. 이 단계에서 상층액에 현탁되었던 대부분의 혈소판을 분리하면서, 튜브의 바닥에 림프구를 펠렛화시켰다. HBSS를 따라내고, 림프구 펠렛을 HBSS에 재현탁시키고, 5 분 동안 250×g으로 마지막으로 회전시켰다. 이후, HBSS를 따라내고, 림프구 펠렛을 RPMI 또는 분류를 위해 원하는 희석물에 재현탁시켰다. 샘플 간세포에 대해 상기 기술된 HLA-A, B 및 C 유형 분류 절차를 반복하여 표적 HLA-일배체형을 측정하였다.
다른 20 ㎖ 이하의 정맥혈을 HLA 클래스 II의 분자 분류를 위해 수용자로부터 수득하였다. 당업계에 공지된 기술을 이용하여 수용자의 혈액 세포에서 추출한 게놈 DNA를 PCR을 이용하여 증폭시켰다. 이후, 상기 기술한 RFLP 분석을 수행하였다.
수용자의 HLA 일배체는 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있으며, 각각의 경우에 1개의 HLA 일배체 (예를 들어, 모계 II)는 모계의 난모세포에서 유래한 HS 세포 군집의 1개와 매칭될 것이다. 일단 HS 군집이 표적 면역형을 갖는 것으로 결정되면, 이후 본원 명세서에서 모두 참고 문헌으로 인용하고 있는 미국 특허 계속 출원 제09/997,240호 및 미국 가출원 제60/253,943호에 기재되어 있는 기술을 이용하여 생체내 또는 시험관내에서 분화시키고, 수용자에게 이식시킬 수 있다.
실시예 3: 의도된 수용자 (자가 공여자)에서 추출한 물질에서 유래한 HS 세포의 군집에서 표적 유전자형의 HS 세포 선별
이식편의 의도된 수용자가 돌연변이 유전자 서열의 발현과 연관된 유전자 장애를 앓고 있는 경우, 돌연변이가 아닌 일배체의 동형접합성 HS 세포의 군집 (예를 들어, "표적" 유전자형)을 선별해야 한다. 유전자형의 선별을 위한 프로토콜의 예는 다음과 같다:
본 실시예에서, 의도된 수용자는 겸상 적혈구 빈혈증에 걸린 여성이었다. 겸상 적혈구 빈혈증을 비롯한 다수의 인간 질환 상태는 헤모글로빈 β-쇄 중 점돌연변이로부터 야기되는 하나 이상의 헤모글로빈 펩티드 쇄 코딩 유전자에 영향을 미치는 유전자 돌연변이에 의한 것이다. 겸상 적혈구 빈혈증에 연관된 돌연변이 유전자의 유전자 서열은 공지되어 있으며, 집중적으로 연구되고 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참조로 포함되는 사이끼 (Saiki) 등의 문헌 [1985, Science, 230, 1350-1354]를 참조한다.
HS 세포의 일련의 군집은 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 의도된 수용자로부터 얻은 난모세포로부터 생성하였다. 이어서, 군집의 유전자형에 대해 분석하였다. 표적 유전자형 (예를 들면, 돌연변이 유전자라기 보다는 정상 또는 야생형 유전자)을 균일하게 포함하는 군집만을 추가 발생을 위해 선별하였다.
본 실시예에서, 겸상 적혈구 빈혈증에 연관된 돌연변이 유전자는 대립유전자-특이적 혼성화, 즉 "ASH"에 의해 검출하였다. 이 기술은 염기 짝지움이 완전히 상보적일 경우에만 짧은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 단일-가닥화된 표적 핵산에 안정하게 어닐링하는 것을 기본으로 한다. 이어서, 혼성화는 프로브 상의 방사성 또는 비방사성 표지로부터 검출할 수 있었다 (프로브 및 다른 핵산의 표지 방법은 하기 상세하게 나타냄). ASH 마커는 유일한 대립유전자 (또는 일배체형)의 존재 또는 부재가 유일한 프로브에 의한 혼성화 또는 혼성화의 결핍으로부터 결정될 경우 주요 마커로서 사용하였다. 별도의 대립유전자는 혼성화의 결핍으로부터 추론할 수 있었다.
ASH 마커는 DNA 서열 중 점돌연변이에 의해 야기되는 인간 질환에 대한 감염 용이성을 진단하기 위해 개발되었다. 겸상 적혈구 빈혈증에 연관된 βS-글로빈 대립유전자를 검출하는데 유용한 ASH 마커는 본 명세서에 참조로 포함되는 코너 (Conner) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282, 1983]에 기재되어 있다.
각각의 HS 군집으로부터 세포 샘플을 취하고, 게놈 DNA를 통상의 방법을 사용하여 추출하였다. 코너 등의 상기 문헌에 약술된 방법에 따라, 게놈 DNA를 제한 엔도뉴클레아제로 분해하였다. 생성된 핵산 단편을 PCR을 사용하여 증폭하여 앰플리콘 (amplicon)을 얻었다 (본 명세서에 참조로 포함되는 멀리스 (Mullis) 등의 문헌 [Methods Enzymol. 155:335-350 (1987)]을 참조). 이어서, 도트-블롯 (dot-blot) 형태로 막에 결합된, 겸상 적혈구 빈혈증에 특이적인 결합된 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 갖는 막으로 앰플리콘을 옮겼다. 혼성화 도트는 방사성 분석법으로 검출하였다. 별법으로, 앰플리콘을 표지하고, 프로브와 막을 결합시킬 수 있었다.
샘플이 표적 면역형 및 유전자형을 갖는 것으로 결정되면, 이를 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 제09/997,240호 및 미국 가출원 제60/253,943호에기재된 기술을 사용하여 생체내 또는 시험관내 분화시키고, 의도된 수용자에게로 이식할 수 있었다.
의학적 상태로 인해 자가 공여자로서 부적합한 남성 수용자 및 여성 수용자에 대하여, 표적 면역형 및 유전자형을 모두 갖는 HS 세포는 여성 가족 구성원 공여자로부터 유도할 수 있었다. 샘플 군집이 표적 면역형 및 유전자형을 갖는 것으로 결정되면, 이를 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 제09/997,240호 및 미국 가출원 제60/253,943호에 기재된 기술을 사용하여 생체내 또는 시험관내 분화시키고, 의도된 수용자에게로 이식할 수 있었다.
실시예 4: 무관한 개체 (비자가, 비친족 공여자)에 의해 공여된 물질로부터 유도된 HS 세포의 군집으로부터의 표적 면역형 및 표적 유전자형을 갖는 HS 세포의 선별
특정 일례에서, 공여 물질은 의도된 수용자 또는 친족으로부터 얻을 수 없었다. 이러한 경우, 표적 면역형 및 표적 유전자형 모두에 대한 HS 군집의 스크리닝이 필요할 수 있었다. 표적 면역형 및 표적 유전자형에 대한 선별을 위한 프로토콜의 일례는 하기와 같다.
HS 세포의 군집은 상기 실시예 1에서 언급된 프로토콜을 사용하여 공여자 개인으로부터 추출된 난모세포로부터 유도하였다. HS 세포 군집이 발생하면, 샘플 세포를 상기 실시예 2에 기재한 미량림프구독성 분석을 사용하여 HLA-A, -B 및 -C 특이성으로 분류하였다.
HS 세포를 PCR-SSOP 방법을 사용하여 HLA 클래스 II 항원으로 추가로 분류하였다. DNA를 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 세포로부터 추출하였다. 추출된 DNA 200 내지 300ng를Taq중합효소 2.5U를 사용하는 PCR에 의해 증폭하였다. HLA-DRB/DQB/DPB의 증폭을 위해 사용된 PCR 프라이머, 및 올리고 분류 (oligotyping)를 위한 모든 프라이머의 조합을 위한 주기 조건을 도 14에 나열하였다. 이어서, 반응 혼합물 분취액 2.5 ㎕를 1M NH4-아세테이트 50 ㎕와 혼합하고, 미니폴드 (Minifold) II 스톳 블로터 (stot blotter, Schleicher ＆ Schuell)를 사용하여 필터 (Nytran, Schleicher ＆ Schuell) 상에 수동으로 도포하였다. 막을 0.4N NaOH에 10분 동안 넣어 변성시킨 후, 1M NH4-아세테이트 중에서 10분 동안 중화하고, 이어서 실온에서 건조시켰다. 혼성화에 대한 양성 및 음성 대조군은 각각의 막에 포함되었다.
이어서, 혼성화용 올리고뉴클레오티드를 반응물 10 ㎕ 중에서 [32P]γ-ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나아제로 표지하였다. 반응물은 올리고 6 pmol, ATP 25 μCi, 키나아제 완충액 1 ㎕ (0.5 M 트리스-HCl, pH 7.6, 0.1 M MgCl2, 50 mM 디티오트레이톨 (DTT), 1 mM 스퍼미딘, 1 mM EDTA), 및 5UT4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (파마시아 (Pharmacia))를 함유하였다. 반응물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 표지된 올리고를 DE52 컬럼 (와트만 (Whatman), Cat. No. 4057-050) 상에서 정제하였다. 컬럼을 채운 후, 올리고를 세척 완충액 10 ㎖ (150 mM NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.8, 10 mM EDTA)으로 세척한 후, 용출 완충액 (1 M NaCl, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.8, 1 mM EDTA) 0.2 ㎖ 분획으로 용출하였다.
이어서, 각각의 막을 방사성 올리고를 사용하여 혼성화하였다. 우선, 예비혼성화 단계를 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC) 혼성화 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 3M TMAC (플루카 (Fluka)), 2 mM EDTA, pH 8.0, 5x 덴하르츠 (Denhart's), 0.1 ％ Na-도데실 술페이트, 100 ㎍/㎖ 변성된 연어의 정자 DNA, 와트만 3MM지를 통해 여과됨)를 사용하여 54℃에서 30분 동안 수행하였다. 이어서, 막을 표지된 올리고 0.5 x 106cpm/㎖를 함유하는 TMAC 혼성화 완충액 중 54℃에서 1 내지 3시간 동안 혼성화하였다. 블롯 (blot)을 TMAC 세척 완충액 중 실온에서 10분 동안 2회 세척한 후, 다시 동일한 곳에서 59℃ (19-mer)에서 15분 동안 2회 세척하였다. 이 방법은 본 명세서에 참조로 포함되는 후이 (Hui) 등의 문헌 [Handbook, 119-123]에 상세하게 기재되어 있다.
표적 면역형은 상기 실시예 2에 기재된 혈청학적 및 분자적 방법을 사용하여 측정하였다. 표적 일배체형은 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다. 어떠한 상황에서도, 수용자의 하나 이상의 HLA 일배체형은 수용자와 동일한 종족의 무관한 난모세포 공여자로부터의 세포의 군집으로부터 유도된 샘플 HS 군집의 HLA와 매칭될 가능성이 높다 (상기 참조).
본 발명에서, 유전 질환에 걸린 무관한 여성은 질환 유전자형을 갖는 HS 세포가 유도될 수 있으므로 제외될 필요가 없었다. 예를 들면, 외래 공여자 (예를 들면, 무관한 개체)은 베타-지중해 빈혈에 걸린 여성이었다. 베타-지중해 빈혈은 헤모글로빈 합성이 결함을 갖도록 유전적으로 결정된 것이다. 충분한 양의 글로빈 쇄를 제조할 수 없다. 알파- 및 베타-지중해 빈혈증은 한 유형의 글로빈 쇄의 불완전한 합성에 의해 표현형으로 나타낸 유전자 돌연변이로부터 야기되는 혈액 관련 장애이며, 이로 인해 다른 유형의 글로빈 쇄가 과도하게 합성된다. 일반적으로 웨더올 (Whetherall) 등의 문헌 [The Thalassaemia Syndromes, 3rd ed., Oxford, Blackwell Scientific, 1981] 및 미국 특허 제 5,750,345호를 참조한다. β0-지중해 빈혈과 연관된 β0-지중해 빈혈 대립유전자는 본 명세서에 참조로 포함되는 피라쯔 (Piratsu) 등의 문헌 [New England J. Med. 309:284-287, 1983]에 기재되어 있다. 따라서, 본 실시예의 문맥상, "표적" 유전자형은 β0-지중해 빈혈 대립유전자, 병변과 연관된 돌연변이 일배체형이 없음을 의미할 것이다.
유전자형의 분석에 있어서, 표적 유전자형 (예를 들면, 돌연변이 유전자라기 보다는 정상 또는 야생형 유전자)을 균일하게 포함하는 군집만을 추가 발생을 위해 선별하였다. 표적 유전자형, 예를 들면 베타-지중해 빈혈에 상응하는 유전자의 부재는 베타-지중해 빈혈에 특이적인 ASH 프로브를 사용하여 겸상 적혈구 빈혈증에 대한 상기 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 검출 및 선별되었다 (웨더올 등 및 피라쯔 등의 상기 문헌 참조).
샘플이 표적 면역형 및 유전자형을 갖는 것으로 결정되면, 이를 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 제09/997,240호 및 미국 가출원 제60/253,943호에 기재된 기술을 사용하여 생체내 또는 시험관내 분화시키고, 의도된 수용자에게로 이식할 수 있었다.

Claims (33)

  1. (a) 표적 유전자형을 결정하는 단계;
    (b) 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 체세포분열을 하도록 활성화시켜, 각각의 배반포-유사 군체가 표적 유전자형에 대해 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM; inner cell mass)를 함유하는 다수의 배반포-유사 군체를 발생시키는 단계;
    (c) ICM으로부터 동형접합성 간세포 (HS 세포)를 단리하는 단계;
    (d) 단리된 HS 세포를 배양하여 HS 세포주를 수득하는 단계;
    (e) 각 HS 세포주의 유전자형을 결정하는 단계; 및
    (f) 표적 유전자형에 대해 동형접합성인 세포를 선별하는 단계
    를 포함하는, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포로부터 유래한 표적 유전자형을 갖는 동형접합성 간세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 표적 유전자형이 특정 질환 또는 장애와 관련된 유전자 돌연변이를 함유하지 않는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 표적 유전자형이 특정 질환 또는 장애와 관련된 유전자 돌연변이를 함유하는 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 특정 질환 또는 장애와 관련된 돌연변이체 대립유전자 및 상응하는 야생형 대립유전자를 포함하는 이형접합성 공여자로부터 수득된 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 공여자에 의해 제공된 것이고, 결과의 HS 세포가 이를 필요로 하는 수용자를 위한 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 공여자와 수용자가 동일한 개체이거나, 공여자와 수용자가 서로 관련되어 있거나, 또는 서로 무관한 개체인 방법.
  7. (a) 표적 면역형을 결정하는 단계;
    (b) 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 체세포분열을 하도록 활성화시켜, 각각의 배반포-유사 군체가 표적 면역형에 대해 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM)를 함유하는 다수의 배반포-유사 군체를 발생시키는 단계;
    (c) ICM으로부터 동형접합성 간세포 (HS 세포)를 단리하는 단계;
    (d) 단리된 HS 세포를 배양하여 HS 세포주를 수득하는 단계;
    (e) 각 HS 세포주의 면역형을 결정하는 단계; 및
    (f) 표적 면역형에 대해 동형접합성인 세포를 선별하는 단계
    를 포함하는, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포로부터 유래한 표적 면역형을 갖는 동형접합성 간세포의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 표적 면역형이 특정 질환 또는 장애와 관련된 유전자 돌연변이를 함유하지 않는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 표적 면역형이 특정 질환 또는 장애와 관련된 유전자 돌연변이를 함유하는 것인 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 특정 질환 또는 장애와 관련된 돌연변이체 대립유전자 및 상응하는 야생형 대립유전자를 포함하는 이형접합성 공여자로부터 수득된 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 공여자에 의해 제공된 것이고, 결과의 HS 세포가 이를 필요로 하는 수용자를 위한 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 공여자와 수용자가 동일한 개체이거나, 공여자와 수용자가 서로 관련되어 있거나, 또는 서로 무관한 개체인 방법.
  13. (a) 표적 면역형 및 유전자형을 결정하는 단계;
    (b) 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 체세포분열을 하도록 활성화시켜, 각각의 배반포-유사 군체가 표적 면역형 및 유전자형에 대해 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM)를 함유하는 다수의 배반포-유사 군체를 발생시키는 단계;
    (c) ICM으로부터 동형접합성 간세포 (HS 세포)를 단리하는 단계;
    (d) 단리된 HS 세포를 배양하여 HS 세포주를 수득하는 단계;
    (e) 각 HS 세포주의 유전자형을 결정하는 단계; 및
    (f) 표적 면역형 및 유전자형에 대해 동형접합성인 세포를 선별하는 단계
    를 포함하는, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포로부터 유래한 표적 면역형 및 유전자형을 갖는 동형접합성 간세포의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 표적 유전자형이 특정 질환 또는 장애와 관련된 유전자 돌연변이를 함유하지 않는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 표적 유전자형이 특정 질환 또는 장애와 관련된 유전자 돌연변이를 함유하는 것인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 특정 질환 또는 장애와 관련된 돌연변이체 대립유전자 및 상응하는 야생형 대립유전자를 포함하는 이형접합성 공여자로부터 수득된 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 공여자에 의해 제공된 것이고, 결과의 HS 세포가 이를 필요로 하는 수용자를 위한 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 공여자와 수용자가 동일한 개체이거나, 공여자와 수용자가 서로 관련되어 있거나, 또는 서로 무관한 개체인 방법.
  19. 제1항 또는 제13항에 있어서, 각 HS 세포주의 유전자형이 겔-기초의 검출 방법을 이용하여, 겔-기초의 검출 방법 이외의 방법을 이용하여, 또는 유전자 마커를 사용하여 결정되는 것인 방법.
  20. 제7항 또는 제13항에 있어서, 표적 면역형이 혈청학적 또는 분자적 방법을 이용하여 결정되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 표적 면역형이 HLA 조직 분류에 의해 결정되는 것인 방법.
  22. 제1항, 제7항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 단계가, 단리된 HS 세포를 분화시켜 선조 세포 및(또는) 다른 분화된 세포 및 조직 형태를 발생시키는 것을 더 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 분화가 시험관내에서 인자들에 의해 유도되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 분화가 생체내에서 인자들에 의해 유도되는 것인 방법.
  25. 각각의 HS 세포주가 상이한 공여체로부터 유래한 것이며 유일한 HLA 일배체형에 대해 동형접합성인 것인, 다수 군집의 HLA-분류된 HS 세포주를 포함하는 세포 집합물 (cell depository).
  26. 제25항에 있어서, HS 세포주가 상이한 종족의 공여자들로부터 수득된 것인 세포 집합물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 집합물의 내용이 목록화된 세포 집합물.
  28. (a) 공여자들을 선별하는 단계;
    (b) 각 공여자의 유전자형을 결정하는 단계;
    (c) 각 공여자로부터 수득한 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 체세포분열을 하도록 활성화시켜, 각각의 배반포-유사 군체가 특정 유전자형에 대해 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM)를 함유하는 다수의 배반포-유사 군체를 발생시키는 단계;
    (d) 각 공여체로부터 수득한 ICM으로부터 동형접합성 간세포 (HS 세포)를 단리하는 단계;
    (e) 단리된 HS 세포를 배양하여 HS 세포주를 수득하는 단계;
    (f) 각 HS 세포주의 유전자형을 결정하는 단계; 및
    (g) (e) 단계에서 수득한 각 HS 세포주의 유전자형을 목록화하는 단계
    를 포함하는, 다수의 공여자로부터의 유전자형-분류된 동형접합성 간세포로 구성된 HS 세포 집합물을 제조하는 방법.
  29. (a) 공여자들을 선별하는 단계;
    (b) 각 공여자의 면역형을 결정하는 단계;
    (c) 각 공여자로부터 수득한 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 체세포분열을 하도록 활성화시켜, 각각의 배반포-유사 군체가 특정 면역형에 대해 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM)를 함유하는 다수의 배반포-유사 군체를 발생시키는 단계;
    (d) 각 공여체로부터 수득한 ICM으로부터 동형접합성 간세포 (HS 세포)를 단리하는 단계;
    (e) 단리된 HS 세포를 배양하여 HS 세포주를 수득하는 단계;
    (f) 각 HS 세포주의 면역형을 결정하는 단계; 및
    (g) (e) 단계에서 수득한 각 HS 세포주의 면역형을 목록화하는 단계
    를 포함하는, 다수의 공여자로부터의 면역형-분류된 동형접합성 간세포로 구성된HS 세포 집합물을 제조하는 방법.
  30. (a) 공여자들을 선별하는 단계;
    (b) 각 공여자의 유전자형 및 면역형을 결정하는 단계;
    (c) 각 공여자로부터 수득한 미수정된 제1 생식세포분열기 후의 이배체 생식세포가 체세포분열을 하도록 활성화시켜, 각각의 배반포-유사 군체가 특정 유전자형 및 면역형에 대해 동형접합성인 내부 세포 군체 (ICM)를 함유하는 다수의 배반포-유사 군체를 발생시키는 단계;
    (d) 각 공여체로부터 수득한 ICM으로부터 동형접합성 간세포 (HS 세포)를 단리하는 단계;
    (e) 상기 HS 세포를 배양하여 HS 세포주를 수득하는 단계;
    (f) 각 HS 세포주의 유전자형 및 면역형을 결정하는 단계; 및
    (g) (e) 단계에서 수득한 각 HS 세포주의 유전자형 및 면역형을 목록화하는 단계
    를 포함하는, 다수의 공여자로부터의 유전자형- 및 면역형-분류된 동형접합성 간세포로 구성된 HS 세포 집합물을 제조하는 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 공여자가 포유동물인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 공여자가 인간인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 공여자가 인간 이외의 포유동물인 방법.
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