KR101409412B1 - 성숙 난황낭 유래 배외 내배엽 전구세포 및 이의 분리방법 - Google Patents

성숙 난황낭 유래 배외 내배엽 전구세포 및 이의 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배외 내배엽 전구세포(extraembryonic endoderm precursor)의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 착상 후의 성숙된 난황낭으로부터 유래된 배외 내배엽 전구세포 및 이를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 장배 형성 후 단계에서의 성숙된 난황낭으로부터도 배외 내배엽 전구세포를 수득할 수 있음을 처음으로 규명한 바, 이를 이용하여 세포치료 또는 내장암(gut tumor) 등의 연구에 활용할 수 있다.

Description

성숙 난황낭 유래 배외 내배엽 전구세포 및 이의 분리방법{An Extraembryonic Endoderm Precursor derived from Post―Implantation Yolks Sacs and Isolation Method thereof}
본 발명은 배외 내배엽 전구세포(extraembryonic endoderm precursor)의 분리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 착상 후 장배 형성이 일어난 단계의 성숙된 난황낭으로부터 물리·화학적인 방법을 이용하여 in vitro 상에서 배외 내배엽 전구세포를 분리하는 방법 및 이에 의해 수득되는 배외 내배엽 전구세포와 이의 활용에 관한 것이다.
21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 전구세포, 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다.
세포 연구의 궁극적인 목적은 원하는 종류의 세포나 조직을 만들어 세포 치료나 조직 공학 등의 기술에 활용하는데 있다. 전구세포나 줄기세포를 실제적으로 활용하기 위하여 해결해야 할 당면과제는 원하는 세포로 분화를 유도할 수 있는 기술의 개발이다.
특정 세포계에서 전구세포 또는 줄기세포를 확립하기 위한 기본적 요구는 자기재생(self-renewal) 능력과 동일한 세포계의 자손을 생성하는 능력이다.
동물은 발생 초기에는 광범위하지만 기관형성 동안 연속적으로 특화될 잠재력을 가진 줄기 세포의 계층를 가지고 있다고 생각된다. 배반포 단계에서 포유동물의 배아는 태반의 영양막 (placental trophoblast), 배외 내배엽 (extraembryonic endoderm, 난황의 내배엽) 및 모든 체세포를 이룰 배반엽상층 (epiblast)으로 분화될 예정인 전구세포들로 이루어져 있다. 체외에서 영양막 (trophoblast)과 배반엽상층 (epiblast)의 전구체는 각각 영양막 줄기세포 (TS cell)와 배아줄기세포 (ES cell)에 해당된다.
sobis 등은 난황낭으로부터 줄기세포를 얻기 위해 시도하였으나 성공하지 못하였고, visceral yolk sac (난황낭) tumor를 일으킴을 확인하였다. 또 다른 보고에서는 난황낭의 전구세포가 난황낭 뿐 아니라 내장성 조직(gut)으로도 분화됨을 밝히긴 하였지만, 난황낭은 지금까지 많은 연구가 이루어지지 않은 분야이다.
이에 본 발명자는 난황낭 (yolk sac)으로부터 배외내배엽 전구세포의 표현형을 가진 세포를 바로 분리해 냄으로써 난황낭의 새로운 유용성을 확인하였을 뿐만 아니라, 성숙된 난황낭 유래 배외 내배엽 전구세포의 효과적인 수득방법 및 이의 활용을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 성숙된 난황낭 유래 배외 내배엽 전구세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 성숙된 난황낭 유래 배외 내배엽 전구세포를 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 성숙된 난황낭 유래 배외 내배엽 전구세포의 용도를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 성숙된 난황낭으로부터 유래된 배외 내배엽 전구세포(extraembryonic endoderm precursor)를 제공한다. 특히, 상기 성숙된 난황낭은 배아의 장배형성 후(post-gastrulation) 난황낭인 것이 바람직하다.
상기 배외 내배엽 전구세포는 다음과 같은 특징을 가지고 있다.
(i) 비-무작위 X 염색체의 불활성화를 나타내고,
(ii) Oct4, Gata6 및 Eomes(Eomesodermin) 중 1 이상의 유전자를 발현하며,
(iii) Nanog, Cdx2 및 Gata3는 발현하지 않는다.
또한, 본 발명은
성숙된 난황낭을 수집하는 단계,
트립신/EDTA를 처리하는 단계,
체(sieve)에 통과시켜 세포를 분리하는 단계, 및
분리된 난황낭 세포를 배양하는 단계를 포함하는,
in vitro에서 착상 후 난황낭으로부터 상기 배외 내배엽 전구세포를 분리하는 방법을 제공한다.
이 때, 예를 들어, 상기 체는 30~50 메쉬(mesh)의 금속체를 사용할 수 있고, 분리된 난황낭 세포 배양은 LIF, PDGF, 및 EGF을 함유하는 배지에서 이루어질 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 방법에 따라 수득한 배외 내배엽 전구세포의 내장성 암(gut tumor) 관련 질환 치료용도를 포함한다. 예를 들어, 성숙된 난황 유래 배외 내배엽 전구세포를 유효성분으로 함유하는, 내장성 암(gut tumor) 관련 질환 치료용 세포 조성물 및 이의 이용방법이 포함된다.
본 발명은 배아의 장배형성 이후 (post-gastrulation)의 난황낭으로부터 배외 내배엽 전구세포(XENP) 세포와 유사한 세포주를 효과적으로 분리하는 방법에 관한 것으로, 난황낭의 생물학적 이해, 세포 치료제 개발 또는 암 연구에도 유용할 것이다.
도 1은 난황낭 유래 XENP 유사 (YXL) 세포 및 XENP 세포의 형태학적 특징을 관찰한 결과이다.
도 2는 성숙 난황낭 유래 콜로니들의 정량분석 결과 그래프이다.
도 3은 독립적으로 분리된 YXL 세포주의 초위성체 분석(microsatellite analysis) 결과이다. SRY는 수컷 성(male sex)을 나타냄.
도 4는 1차 배양에서 XENP 유사 콜로니들의 LIF 및 PDGF 요구도를 나타낸 결과이다.
도 5는 XENP 세포(CX1) 및 독립적 YXL 세포에서 마커 유전자들의 발현을 확인한 결과이다.
도 6은 XENP 세포 및 YXL 세포의 Xist발현에 의해 X 염색체 불활성화 특성을 확인한 결과이다.
도 7은 XENP 세포(CX1, MAX6) 및 독립적 YXL 세포(YX3)에서, SNP와 X-링크된 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 8은 F344, WKY, BN 계통의 랫트에서 X-링크된 SNP의 발현을 관찰한 결과이다.
도 9는 YXL 콜로니에서 X-링크된 SNP를 이용한 X 불활성화 패턴에 대한 RT-PCR 결과이다.[(P)는 부성(parternal), (M)은 모성(maternal) SNP를 나타냄]
도 10는 태아(fetus)에서 X-링크된 SNP를 이용한 X 불활성화 패턴에 대한 RT-PCR 결과이다.[(P)는 부성(parternal), (M)은 모성(maternal) SNP를 나타냄]
도 11은 내장성 내배엽(VE) 및 내장성 중배엽(VM) 층에서의 마커 유전자 발현 및 난황낭 분산(spilt)을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 따른 성숙 난황낭 유래 배외 내배엽 전구세포 분리 공정을 모식화한 그림이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"전구세포(precursor cells)"라는 용어는 특정 세포의 형태 및 기능을 갖추기 전 단계의 세포로서, '신경 전구세포(neural precursor cell)'란 중추신경계를 구성하는 신경세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포 등의 신경세포로 분화할 수 있는 전구세포를 의미한다.
"줄기세포(stem cell)"란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)될 수 있는 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행될 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 세포학적 유래에 따라 수정란에서 유래하는 '배아 줄기세포(embryonic stem cells)'와 성체 내에 존재하는 각 기관에서 유래하는 '성체 줄기세포(adult stem cells)'로 나눌 수 있다.
"조직"이라는 용어는 다세포 기관 내에 실질적으로 같은 기능 및/혹은 형태를 가지는 세포의 집합을 의미한다. 전형적으로 기원(origine)이 같은 세포의 집합체이나 같은 기능 및/혹은 형태를 가지는 한 기원이 다른 세포들의 집합체도 될 수 있다.
"분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"동물세포 배양용 배지"는 무기염류, 아미노산, 비타민류 및/또는 보조인자를 포함하는 포유동물 세포배양용 배지로서 동물세포 배양 기술분야에서 동물세포 배양을 위해 통상적으로 사용되는 배지를 의미하며, 상업적으로 입수가능한 동물세포 배양용 배지로 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), MEM(Minimum Essential Medium),IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), α-MEM, RPMI 1640 배지 등이 있다.
"1차 배양배지"는 제대혈 유래 단핵세포로부터 다분화능 전구/줄기세포를 분리하기 위한 초기 단계의 배지로, 제대혈에 포함된 여러 종류의 단핵세포들 중에서 다분화능 전구/줄기세포만이 다층세포군집(multi-layer cell colony)을 형성하도록 유도하는 배지이다. 1차 배양배지는 상기 고농도 포도당 배지에 우태아 혈청(fetal bovine serum,FBS), L-글루타민 및 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor; GMCSF)가 첨가된 배지를 의미한다.
"2차 배양배지"는 상기 1차 배양배지에서 배양된 다층세포군집을 섬유아세포(fibroblast-like cells) 형태의 단층세포군집(mono-layer cell colony)으로 변형시키는 배지이다. 2차 배양배지는 상기 1차 배양배지의 조성에서 GMCSF가 결핍된 배지로 고농도 포도당 배지에 FBS 및 L-글루타민만이 첨가된 배지를 의미한다.
"단리된 또는 분리된(isolated)"은 천연 상태로부터 제거되거나 또는 인간의 처리(manipulation)에 노출되는 것을 의미한다. 단리된 물질은 천연 상태에서 일반적으로 수반되는 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 포함하지 않을 수 있거나 또는 천연 상태에서 일반적으로 수반되는 성분들과 함께 인공적 상태로 존재하도록 처리될 수 있다. 단리된 물질은 원래의(native) 형태 또는 재조합 형태일 수 있다
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 난황낭으로부터, 특히 착상 후 성숙된 난황낭으로부터 배외 내배엽성 전구세포(extraembryonic endoderm precursor)를 분리시키는 방법 및 이에 의한 성숙된 난황낭 유래의 배외 내배엽 전구세포에 관한 것이다.
본 발명의 일 구체예로서, 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다.
(i) 난황낭을 수집하는 단계;
(ii) 트립신/EDTA 처리의 화학적 방법을 실시하는 단계;
(iii) 체를 통과시키는 물리적 방법을 실시하는 단계;
(iv) 분리된 난황낭 세포를 배양하는 단계.
난황낭은 인간을 포함하여, 난황낭을 가지는 어떠한 동물로부터 수집될 수 있다. 예를 들어, 마우스, 개, 고양이, 돼지, 암소, 원숭이 또는 인간의 자궁, 태반, 태아 조직으로부터 수집될 수 있다. 일 실시예에서, 임신중 랫트의 자궁 샘플로부터 수집되었다. 배아로부터 태반, 태아를 제거하고 난황낭만을 수집하였다.
특히, 상기 난황낭은 착상 후의 성숙된 난황낭을 사용하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 성숙된 난황낭은 배아의 장배형성 후(post-gastrulation) 난황낭인 것을 이용할 수 있다.
난황낭 샘플은 인산염완충식염수(phosphatebuffered saline: PBS)와 같은 적절한 용액으로 세척될 수 있고, PBS는 세포를 손상 및 잠재적 감염으로부터 각각 보호하기 위해서, 선택적으로 5% 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)을 포함할 수 있다. 또한, 수집된 난황낭 세포는 확장시켜 사용할 수 있다. 확장은 예를 들어 세포의 적어도 일부가 추가 세포를 생성하기 위해 분열되는 하나 이상의 세포 주기를 통해서 세포가 성장함으로써 달성될 수 있다.
다음으로, 수집한 난황낭만 모아 풀(pool)을 만들고 화학적 방법 및 물리적 방법으로 난황낭 세포를 분리한다.
바람직하게는, 화학적인 방법 중 트립신/EDTA을 처리하고, 물리적 방법으로 금속체(metal sieve)를 통과시켜 난황낭의 세포를 분리시킨다.
EDTA는 세포간의 결합에 필요한 2가 이온을 잡아주어 세포와 세포간의 결합력을 떨어뜨려 주며, 트립신이 세포들 간의 펩티드 결합(peptide bond)을 끊어주며 세포가 조직으로부터 분리될 수 있게 해 준다. 하지만 이때 조직이 매우 단단할 경우 화학적인 방법만으로는 그 결합력을 깨뜨리기가 쉽지 않은데, 금속체를 통과시키게 되면 물리적 힘이 가해지며 세포가 적정 크기로 분리되는 것이다.
이와 같이, 화학적 방법 및 물리적 방법을 조합하여 사용함으로써 보다 효과적으로 난황낭 세포를 분리할 수 있다.
이렇게 분리한 난황낭 세포를 공지의 XENP 배양에 사용되어왔던 배지를 이용하여 배양한다.
XENP 배양에 사용되어왔던 배지는 제한은 없으나, 예를 들어, 이미 XEN-P 세포 배양에 성공적으로 사용되었던 배지로(Debeb et al 2009) DMEM(high-glucose, with glutamine and sodium pyruvate) 0.1 mM 베타 머캅토에탄올, 15% FBS, 및 10ug/ml LIF을 함유하고 있는 것이 바람직하다.
일 구체예로서, 이하와 같은 방법으로 배양할 수 있다.
상기 화학적·물리적 방법을 거쳐 수집된 세포를 배양 용기(culture plate)로 씨딩한 이후, 패시징(passasing), 즉 제 2 배양 용기로의 이동 또는 계대배양(subculture)할 수 있는데, 통상적으로, 번식률에 따른, 기계적 또는 효소 분해, 재씨딩(reseeding), 및 종종 둘 이상의 딸 배양(daughter culture)이 이루어질 수 있다.
이 때, 성장 인자, 다른 미토겐 제제(mitogenic agent), 기타 필요한 물질 등을, 본 발명의 세포의 집단의 증식을 촉진하기 위해서 배양액에 포함시킬 수 있다. XEN-P 배양 조건(Debeb et al 2009) 또는 MAPC 배양 조건을 수립하여 LIF, PDGF, 및 EGF을 함유하는 배지로 바꾸고 피더 세포를 피브로넥틴으로 대체하여 배양하고, 당업계에서 공지되어 있는 적절한 방법을 이용하여 세포주를 분리할 수 있다.
상기와 같은 방법 등에 의해 수득된, 성숙된 난황낭 유래 세포는 다음과 같은 특성을 가진다.
(1) 배외 내배엽 전구세포(extraembryonic endoderm precursor, XENP)의 유전적 및 형태적 특징을 보유하고 있다.
즉, 본 발명에 의해 수득된 세포는 배외 내배엽 전구세포 유사세포로서, 종래 XENP 세포의 분자적 특징으로 알려져 있는 특성들을 가진다. Oct4, Gata6, EOMES(Eomesodermin)을 발현하고, 반면 ES 세포/germ 세포 마커인 Nanog 및 영양막 배엽 마커 Cdx2와 Gata3는 적게 발현한다.
또한, 파운더 콜로니 중 세포들은 굴절성(refractile) 외양을 가지고 있었고, 특징적인 액포(vacuole)를 함유한다.
(2) 본 발명에 의해 수득된 배외 내배엽 전구세포는 비-무작위 X 염색체의 불활성화를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 암컷에서 Xist 유전자가 높은 발현을 나타냈지만 수컷 세포에서는 그러하지 않음을 확인하였다. 즉, X 염색체 불활성을 나타냈다.
따라서, 난황낭 세포가 특정한 유형의 배외 내배엽 전구세포로 분화되었는지의 여부의 결정은 이 세포 유형에 특정한 상기 설명한 유전자 마커의 검출에 의해 달성될수 있다. 그리고, 이러한 세포 유형에 특정한 마커 발현은 예를 들어 면역 조직 화학 및/또는 웨스턴 블롯 분석을 포함하는 임의의 적절한 종래의 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
한편, 본 발명은 상기 수득한 배외 내배엽 전구세포의 용도를 포함한다.
특히, 배외 내배엽 전구세포는 내장성(gut) 조직으로 분화되는 특성을 가지는 바, 이를 이용한 세포 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 질환은, 이에 제한되지 않지만 내장성 암(gut tumor) 관련 질환을 포함한다.
"치료하다"가 본원에서 사용될 때는 환자, 예를 들어 질환의 발병으로 고통을 받거나 질환의 발병 위험성이 있는 환자에 혜택을 주는 모든 유형의 치료를 언급한다. 치료행위는 환자의 상태를 개선하고, 상기 질환의 발병 또는 진행을 지연할 목적으로(예를 들어 하나 이상의 증상의 경감) 취해지는 동작 및 취해지는 것을 삼가는 동작을 포함한다
본 발명에 따르면, 어떤 실시예에서 치료는 예를 들어 미분화된, 분화된, 또는 이들의 혼합의 배외내배엽 전구 세포의 유효한 양을 치료가 필요한 대상체로 투여하는 것을 포함하고, 이로 인해 질환의 증상 또는 대상체의 상태가 양호해지거나 경감된다.
본 발명의 세포가 대상체를 치료하는데 사용될 때, 상기 세포는 약제학적으로 허용 가능한 매개체(vehicle) 또는 운반체(carrier)와 혼합 상태에 있는 세포를 포함하는 약제학적 조성물로 제형(formulate)될 수 있다. 이와 같은 약제학적 제형(pharmaceutical formulation)은 당업계에 충분히 공지되어 있는 기술을 사용하여 조제될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 제형의 제조에서, 세포는 통상적으로 그중에서도 특히 허용 가능한 운반체와 혼합될 수도 있다. 물론, 운반체는 제형에서 어떤 다른 성분과 양립하는 의미에서 허용되어야만 하고 환자에게 유해하지 않아야 한다. 운반체는 고체 또는 액체, 또는 이 둘 다(예를 들어 히드로겔(hydrogel))일 수 있고 단위투여량 제형으로써 세포와 제형될 수 있다. 세포는 세포의 응괴(clumping)를 감소시키기 위해서 운반체에 서스펜션(suspension)으로 제공될 수 있다.
세포의 치료상 효율적인 투여량은 대상체에 따라 다소 변화될 수 있고, 대상체의 나이, 체중 및 상태와 같은 요소 및 전달 루트에 좌우될 수 있다. 이와 같은 투여량은 당업자에게 공지된 절차에 따라 결정될 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 종래 알려지지 않았던, 착상 후 성숙된 난황낭으로부터 배외 내배엽 전구세포 특성을 가지는 세포를 분리해 냄으로써, 또 다른 배외 내배엽 전구세포 세포의 소스(source)를 확보함과 동시에, 아직까지 연구가 많이 이루어지지 않은 난황낭(yolk sac)에 대한 유용성을 발견하였다. 따라서, 난황낭 연구분야에 기여할 뿐만 아니라, 내장성 조직 관련의 세포 치료에서 매우 유용할 것이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 즉, 하기 단계들은 하나의 예시로써 설명되며, 본 발명의 범위가 이에 한정되지 않는다.
실시예 1 : 랫트의 성숙한 난황낭 -유래 XENP 유사세포의 설립
XENP 배지 또는 MAPC 배지를 이용하여 임신한 랫트(E9.5 ~ E14.5)의 자궁으로부터 랫트 난황낭을 분리하였다.
전체 난황낭을 6-웰 플레이트 상에 상이한 농도로 플레이팅하고 5% O2 및 CO2 인큐베이터에서 피브로넥틴-코팅된 웰상에서 배양하였다. 초기의 배아 태아(embryonic fetus) 및 태반으로부터 세포주 분리를 수행하였다. YXL 세포들을 분리한 방법(종래 문헌 기재)을 약간 변형하여 장배 형성 후 (post-gastrulation) 난황낭으로부터 세포를 분리하였다. 이 때, 기계적 분리법 및 화학적 방법, 즉, 트립신처리의 조합을 이용하였다. 상이한 희석률로 플레이팅하고, 난황낭 배양 후 피펫 팁을 이용해서 콜로니들을 수집하였다. 그리고 이들을 새 웰에 옮겼다. 또한, F344 및 BN 랫트 하이브리드 배아들을 동일한 방법으로 배양하였다.
1-1 : XEN -P 유사 난황낭 세포주의 분리 및 유지
전체 난황낭을 사용하였다. 상기 난황낭을 분리하여 태반 접촉 영역에서 배제시키고, PBS (Ca/Mg-free)로 세척한 후, 0.05% trypsin/ 0.53mM EDTA (WelGene, Cat no. LS 015-01)에 침지하였다. 그리고, 10~15분 동안 CO2 인큐베이터에 두었다.
그리고, 이들을 40 메쉬-크기의 금속 체(metal sieve, Sigma)를 부드럽게 통과시키고, 조현탁물을 수득하여 완전한 배양배지로 희석하였다. 피펫으로 적정하여 다양한 농도로 6-웰 플레이트에 분산시켰다. 상기 플레이트를 CO2 인큐베이터(5% CO2, 5% O2)에 두었다. 그리고 XEN-P 배양 조건(Debeb et al 2009)을 수립하여 LIF와 고농도의 serum을 사용하는 배지에 키우고 이루 생긴 콜로니를 분리하고, LIF, PDGF, 및 EGF을 함유하는 배지로 바꾸고 피더 세포를 피브로넥틴으로 대체하였다.
(1) 플레이팅 분석 : 호르몬 영향 분석
60mm 디쉬에서의 세포주 분리 실험의 1차 배양은 5% O2 및 CO2 인큐베이터에서 MAPC 배지에 LIF (ORF GENETICS, 01-AA160) 또는 PDGF (ORF GENETICS, 01-AA130) 없이 이루어졌다.
12일 후 콜로니들을 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 트립신처리된 XENP 세포주 및 YXL 세포주를 5% O2 및 CO2 인큐베이터에서 피브로넥틴 코팅된 웰 상에서 웰당 200 cells의 밀도로 24 웰 플레이트에 씨딩하였다. 상기 플레이트들을 MAPC 배지에서 LIF 또는 PDGF 없이 배양하고, 5일 후 콜로니들을 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
(2) 내장성 ( visceral ) 난황낭의 분열 및 1차 배양
몇몇 경우에, 전체 난황낭 대신 내장성 중배엽(visceral mesodermal) 및 내장성 내배엽(visceral endodermal) 조직을 세포 배양 또는 다른 분석의 출발 물질로 사용하였다.
그 결과, Hudson, Q.J.등의 문헌(Extra-embryonic-specific imprinted expression is restricted to defined lineages in the post-implantation embryo. Dev Biol, 2011. 353(2): p. 420-31.)에 기재되어 있는 바와 같이, 0.5% 디스파아제Ⅱ(sigma, D4693)에 의해 내장성 난황낭이 내장성 중배엽 및 내장성 내배엽으로 분열되었다. 수득한 조직 분획의 순도를, 마커 Afp, Flk-1 (Hudson 등의 문헌)를 이용하여 확인하였다.
세포 배양에서 수득된 분획을 0.05% trypsin/EDTA(WelGene, LS 015-01)로 10분동안 다이제스팅하여 분리하였다.
1-3. RT - PCR 분석
(1) DNA 분리
세포를 Eppendorf 튜브에 넣어 1분동안 최대 속도로 원심분리하였다.
펠렛의 건드림없이 팁으로 상청액을 제거하고 용해버퍼(50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 10mM Tris-Cl pH8.3, 0.5% NP40, 0.5% Tween 20, 100ug/ml proteinase K)를첨가하였다. 볼텍싱 후, 1시간 동안 65℃에서 용해시키고, 액체를 수집하였다. 10분동안 95℃에서 가열하여 proteinase K을 비활성화시키고, 회전수를 줄여 액체를 모으고 다시 볼텍싱하였다.
(2) RT - PCR 분석
총 RNA를 RNeasy Micro Kit (Qiagen, cat#74004) 또는TRI-reagent (Sigma-Aldrich T9424)을 이용하여 분리하였다. RT-kit (Solgent, DR13-R10k) 및 임의의 헥사머 프라이머(Bioneer, N-7051)를 이용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 설명서에 따라 RT-PCR 분석의 최적 조건을 수행하였다(Solgent, DT16-R500).
사용한 프라이머들을 하기 표에 도시하였다.
Figure 112012030869733-pat00001
Figure 112012030869733-pat00002
Figure 112012030869733-pat00003
실시예 2 : 성숙 난황낭으로부터 분리한 XENP -유사 ( YXL ) 세포 확인
실시예 1에서 설명한 방법에 따라, MAPC 배지(도 1) 및 종래의 XENP 배지(데이터 도시 않음) 모두에서 분리된 E11.5 SD(Sprague Dawley) 랫트 난황낭이 빠르게 XENP-유사 세포가 생기게 하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 놀랍게도 YXL 파운더(founder) 세포들이 배양 2일 후 이미 콜로니화되었다. 또한, 이들은 XENP 세포와 다르게, 파운더 콜로니 중 세포들은 굴절성(refractile) 외양을 가지고 있었고, 특징적인 액포(vacuole)를 함유하였다
다만, 둥근형 및 스핀들-모양의 세포들이 섞여 있던 XENP 세포주와 달리, YXL 파운더 콜로니를 이루는 세포들은 더 크고 모두 둥근 원형이었다. 그러나 2대계 배양 후, 상기 YXL들은 형태학적으로 XENP 세포들과 구별되지 않게 되었다.
한편, 여러번 계대를 배양하여 세포들을 수립하였는데, Wistar 랫트, Fisher 344 (F344)/Brown Norway (BN) 랫트 하이브리드 난황낭으로부터 YXL 콜로니들을 수득하였다.
SD 랫트의 처음 3번의 실험 후, 최소 3개 콜로니의 6개의 세포주를 유도하였다. 즉, 한 웰에서 단일 콜로니로부터 각각 유래되었다. 이들 효율은 60%였다.
그리고, 난황낭으로부터 수득한 세포에 대해 체계적인 정량분석을 수행한 결과를도 2에 도시하였다.
이 때, E9.5~14.5 SD 랫트 난황낭을 분리하였고, 난황낭뿐만 아니라 대조군으로 태아(fetus), 태반, 내장(gut)을 배양하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 분리된 태아 및 태반으로부터 YXL 세포들은 나타나지 않았고, 난황낭으로부터는 YXL 세포들이 쉽게 생겨났다. E9.5 ~ E11.5의 난황낭 배양은 많은 콜로니들을 수득케하였다. E11.5와 비교하여 E12.5 ~ E14.5로부터 분리된 콜로니 수들은 현저하게 감소하였다.
이처럼 착상 후 성숙된 난황낭, 특히 장배 형성 후(E9.5 ~ E11.5) 단계에서 수득한 난황낭으로부터 다량의 XENP-유사 (YXL) 세포의 존재를 확인하였다.
실시예 3 : YXL 세포주의 특성
3-1. 분자적 특성
상기 수득한 YXL 세포의 독립적 기원 및 특성을 규명하기 위해, 모든 세포주들에 대해 초위성체 분석(microsatellite analysis)을 수행하였다. 각 세포주들은 독특한 유전적 지문을 나타내었다.
도 3에 도시한 바와 같이, 초기 계대에서 수립한 YXL 세포의 RT-PCR 분석은 이들이 XENP 세포의 분자적 특징을 나타냄을 보여주었다(예를 들어, Oct4, Gata6, Eomesodermin 발현).
상기 YXL 세포들은 XENP 세포들처럼 호르몬 필요성을 보유하였다. 파운더 콜로니(도 4 A) 및 수립된 세포주(도 4 B)들은 LIF에 대한 엄격한 요구를 보였고, XENP와 같이 PDGF에 대해서는 덜 엄격한 요구를 나타냈다.
반면, ES 세포/germ 세포 마커 Nanog 및 영양막배엽 마커 Cdx2와 Gata3의 발현은 적었다(도 5).
3-2. X 염색체 불활성 패턴 분석
한편, 생성된 YXL 세포주가 어떠한 타입의 조직인지 알아보기 위해, 두 가지 방향으로 접근하였다.
장배형성 후(post-gastrulation) 난황낭은 중배엽층(visceral mesoderm) 및 배외 내배엽층(visceral endoderm)으로 구성되어 있다. 본 발명자들은, 랫트를 포함한 설치류에서 암컷 유래 배외 내배엽이 각인된(수컷)-X 염색체 불활성을 나타낸 반면, 암컷 체세포(에피블라스트-유래) 조직은 임의의 X 염색체 불활성화를 보인 사실을 이용하고자 하였다.
XENP 및 YXL 세포주에 대한 RT-PCR을 수행하였다.
우선, 암컷 유래 XENP 세포주 2그룹, 수컷 유래 XENP 세포주 3그룹 및 YXL 세포주 3그룹에 대하여 Xist 발현을 분석하였는데, 설치류에서 이는 "X 염색체 불활성화"를 의미한다. 또한, SRY 유전자의 존재를 분석하였는데, 이는 수컷의 성을 나타낸다.
상기 분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 오직 암컷 유래 세포주 MAX2, MAX8, YX2, YX2.2만이 Xist 유전자를 발현하였고, 수컷 유래 세포주들은 Xist 유전자를 발현하지 않았다.
외배엽 기원임을 의미하는 Xi 패턴의 검출은 부성(pternal) vs 모성(marternal) 발현이 구별되는 발현 마커의 검출을 요한다. SHR 및 BN 랫트 게놈의 서열에서 X-링크된 유전자의 엑손에서 SNPs 및 삽입-결실(indels) 리스트를 수득하였다.
이들 리스트 중에서, Dr. V. Guryev(Hubrecht Institute)로부터 실험적으로 규명된, 43개의 X-링크된 발현 SNPs를 제공받고 RT-PCR을 수행하였다.
도 7에 도시한 바와 같이, 테스트한 11개 중 10개 유전자가 XENP 및 YXL 세포에서 발현되었다.
한편, 3경우의 랫트 계통(F344, WKY, BN)에서 10개의 후보 유전자의 게놈 DNA PCR을 통해, 4 유전자(=Nkap, Hdac6, Uxt, Usp9x)의 X-링크된 SNP 쌍을 발현하여 XENP 세포에서 X 불활성화 패턴을 분석하였다
이를 표 1 및 도 8에 도시하였다.
Figure 112012030869733-pat00004
그리고, 랫트 태아로부터 단일 세포-유래 섬유아세포 클론 및 F344XBN 크로스를 생성하였고, 이를 표 2 및 도 9에 도시하였다.
Figure 112012030869733-pat00005
이처럼, 암컷(female) 클론의 일부는 오직 부성 대립 형질(paternal allele)을 발현한 반면, 다른 암컷 클론은 오직 모성 대립 형질(maternal allele)을 발현하였다.
추가로, YXL 콜로니 또는 세포주들에 대해 상기 분석을 수행하고 도 10에서 RT-PCR 결과(겔 사진 및 qRT-PCR)를 도시하였다.
도 10을 통해 알 수 있는 바와 같이, 6그룹의 독립적인 female YXL 세포주는 항상 모성 대립형질을 발현하였다. 배반포(blastocyst)-유래 XEN-P 세포주에서 동일한 대립형질 분석을 수행하지는 않았지만, XEN-P 세포주 및 YXL 세포주 모두 암컷에서 Xist 유전자가 높은 발현을 나타냈다. 반면, 수컷 세포에서는 그러하지 않았다(도 6). 또한, SRY 유전자의 게놈 DNA PCR을 이용하여 콜로니들의 성(sex)을 조사하였다(데이터 도시 않음)
이는 양 세포주가 X 염색체 불활성화의 동일한 공정을 나타냄을 의미한다.
다음으로, 효소 처리 및 미세분리방법(microdissection)의 조합을 이용하여, Hudson et al (2011) 방법에 따라 난황낭을 내장 중배엽 및 내장 내배엽 층에 처리하였다.그리고 각 층에서 YXL 세포주를 분리하였다.
도 11에 도시한 바와 같이, Afp는 내장 내배엽 마커이고, Flk-1는 내장 중배엽 마커이다. 내장 내배엽으로부터 콜로니를 수득하였다(도 11B). 즉, 해부학적으로 YXL 세포들을 내장 내배엽층으로부터 수득하였음을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 인간을 제외한 포유동물로부터 배아가 착상 후 성숙된, 장배형성 후(post-gastrulation) 난황낭을 수집하는 단계;
    트립신/EDTA를 처리하는 단계;
    30-50 메쉬(mesh)의 금속체(sieve)에 통과시켜 세포를 분리하는 단계; 및
    분리된 난황낭 세포를 배양하는 단계;를 포함하는,
    in vitro에서 인간을 제외한 포유동물 배아의 착상 후 성숙된, 장배형성 후 난황낭으로부터 유래된 배외 내배엽 전구세포를 분리하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 배외 내배엽 전구세포는 비-무작위 X 염색체의 불활성화를 나타내는 것을 특징으로 하는 배외 내배엽 전구세포를 분리하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 배외 내배엽 전구세포는 Oct4, Gata6 및 EOMES(Eomesodermin) 중 1 이상의 유전자를 발현하고, Nanog, Cdx2 및 Gata3 유전자는 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 배외 내배엽 전구세포를 분리하는 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 분리된 난황낭 세포 배양은 LIF, PDGF, 및 EGF을 함유하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 배외 내배엽 전구세포를 분리하는 방법.
  10. 삭제
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