CN113841614A - 一种植物超低温脱毒方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种植物茎尖热处理结合超低温脱毒技术，与传统脱毒方法相比，此方法效率脱毒效率高、操作简单、快速有效，为以后的脱毒技术提供有力的参考价值，具有很好的技术效果和推广前景。

Description

一种植物超低温脱毒方法
技术领域
本发明属于植物病毒防治技术领域，具体地，涉及一种植物超低温脱毒的方法。
背景技术
植物病毒病害在全球及我国广泛发生，目前已报道了600种以上病毒可引起植物病害。特别是无性繁殖的植物，很容易受到一种或多种病毒的侵染。随着种质资源交换范围的扩大，生态条件的改变，各种植物侵染病毒的种类越来越多，侵染范围日益扩大，侵染程度日趋严重。植物病毒感染植物后会导致植物营养生长期变短，叶片早衰，产量下降，品质变差。
传统植物脱毒常用方法包括茎尖培养、热处理、热处理结合茎尖培养、化学疗法，其中以茎尖培养应用最为广泛。然而，茎尖培养脱毒技术受茎尖大小的限制，脱毒的成功率与所切下茎尖分生组织的大小成反比，为了提高脱毒率必须切下足够小的茎尖分生组织（0.2～0.5mm），太小的茎尖分生组织再生成植株很困难，因而限制了茎尖培养脱毒技术的使用。热处理脱毒技术的局限性在于并非所有病毒都对热处理敏感，一般对球状的病毒（如葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒）或线状的病毒（如马铃薯X、Y病毒及康乃馨病毒）有效果，而对杆状病毒（如牛蒡斑驳病毒、千日红病毒）效果甚微。化学疗法能够不同程度地脱除植物病毒，可在某种程度抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但尚不能完全抑制病毒使其失活。
超低温脱毒是一种新建立的脱毒方法，它的基本原理是植物茎尖在经过液氮处理后，带病毒区域的细胞被杀死，不带病毒的细胞成活再生的过程。研究发现其脱毒率不受茎尖大小的影响，也不受冷冻方法的影响，取材容易，脱毒速度快而简单，也能取得较高的脱毒率，超低温处理这种新兴的技术在脱毒效率上占有优势，而且操作起来更方便，是极有发展潜力的脱毒新技术。但是，超低温脱毒技术也存在种间差异大、茎尖成活率低的问题。
鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种植物茎尖热处理结合超低温脱毒技术，与传统脱毒方法相比，此方法效率脱毒效率高、操作简单、快速有效，为以后的脱毒技术提供有力的参考价值，具有很好的技术效果和推广前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物超低温脱毒方法，采用植物茎尖热处理结合超低温脱毒技术，克服了传统方法存在的缺陷，具有效率脱毒效率高、操作简单、快速有效的优势。
为实现上述目的，本发明提供了一种植物超低温脱毒方法，包括以下步骤：
步骤（1）携带病毒的植物材料的采集：对经过病毒检测的具有病毒的植物材料进行幼芽采集；
步骤（2）离体材料无菌组培苗初代培养获得无菌组培苗；
步骤（3）继代培养：将步骤（2）获得的无菌组培苗转接到继代培养基中进行增殖培养，连续扩繁几代，获得足够多的丛生芽，用于脱毒处理材料；
步骤（4）植物茎尖热处理结合超低温脱毒：选取步骤（3）中试管苗带腋芽的茎段培养在继代培养基上，在普通继代的环境下培养2周后，将试管苗转入光照培养箱中进行热处理，热处理培养一段时间后，选取顶芽进行超低温脱毒，超低温脱毒步骤为：茎尖取下后在继代培养基上稳定0.5-2天后进行预培养0.5-2天，预培养结束后将茎尖转入PVS-2中在冰上处理30-60min后转在灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻，冷冻保存0.5-2h后将铝箔条快速取出并浸入解冻用培养基中进行解冻处理，解冻10-30min后将茎尖取出，用滤纸短暂干燥后转入继代培养基中进行再生培养。
步骤（5）将步骤（4）处理过再生苗进行病毒检测。
在一些实施方案中，步骤（2）中，所述的离体材料无菌组培苗初代培养为：将采集的植物材料，经过消毒试剂消毒后，接种到初代培养基中，然后置于培养室中，培养10-30天，获得无菌组培苗。
在一些实施方案中，步骤（2）中，所述的消毒试剂为75%的酒精和0.1%氯化汞。
在一些实施方案中，步骤（2）中，所述的培养时间为20天。
在一些实施方案中，步骤（2）中，所述的初代培养基配方为：MS + 0.6mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA + 5.8g/L 琼脂 + 30g/L 蔗糖，pH=5.8。
在一些实施方案中，步骤（3）中，所述的继代培养基配方为：MS + 0.4mg/L 6-BA +0.1mg/L NAA + 5.8g/L 琼脂 + 30g/L 蔗糖，pH=5.8。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的选取步骤（3）中试管苗带腋芽的茎段为选取步骤（3）中试管苗的长度为1-2cm带2-3个腋芽的茎段。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的普通继代培养环境为温度为22 ± 2℃，14h光培养，10小时暗培养。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的热处理条件为：培养箱所设定的光周期为16小时，温度为‘白天’36℃，‘夜间’32℃。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的热处理培养时间为2-8周。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的热处理培养时间为2-6周。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的热处理培养时间为4-6周。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的预培养的培养基为MS + 2.0M甘油+0.8M蔗糖的液体培养基。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的PVS-2溶液的配方为：MS + 30％(v/v)甘油+ 15％(W/V，g/100ml)聚乙二醇 + 15％(v/v)DMSO + 0.4mol/L蔗糖，pH=5.8。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的冰上处理时间为40min。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的冷冻保存时间为1h。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的解冻用的培养基为MS + 1.2M蔗糖的液体培养基。
在一些实施方案中，步骤（4）中，所述的解冻时间为20min。
在一些实施方案中，步骤（5）中，所述的病毒检测方法为RT-PCR方法。
在一些实施方案中，步骤（5）中，所述的RT-PCR的方法为：利用RNA提取试剂盒法提取材料总RNA，反转录成cDNA，利用引物进行RT-PCR检测。
本发明的有益效果如下：
采用本发明的热处理结合超低温脱毒技术，能够同时具有较高的成活率和较好的脱毒率；
本发明的植物茎尖热处理结合超低温脱毒最佳体系对应的茎尖脱毒率达93％以上，与传统脱毒方法相比，此方法效率脱毒效率高操作简单，快速有效；
提供了高效的脱毒技术体系，为以后的脱毒技术提供有力的参考价值，具有很好的技术效果和推广前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细描述，但下例实施例不应看作对本发明范围的限制。
实施例1
步骤1.携带病毒的植物材料的采集：苹果栽培品种‘Gala’经过RT-PCR病毒检测后，将具有病毒的植物幼芽材料进行采集。
步骤2.离体材料无菌组培苗初代培养：将采集的植物材料，无菌水冲洗3遍，在超净工作台中经过75%的酒精消毒30s和0.1%氯化汞消毒8min后，再用无菌水冲洗4-6遍，接种到初代培养基中，培养基配方为MS + 0.6mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA + 5.8g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，pH=5.8，然后置于培养室中，温度22±2℃，光照3000lx，光照14h/d，培养20天，获得无菌组培苗。
步骤3.继代培养：将步骤2获得的无菌组培苗转接到继代培养基中进行增殖培养，继代培养基配方为MS + 0.4mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA + 5.8g/L 琼脂 + 30g/L 蔗糖，pH=5.8，连续继代4-6代，获得足够的丛生芽，用于脱毒处理材料。
步骤4.植物茎尖热处理结合超低温脱毒：选取步骤3中试管苗的长度为1-2cm带2-3个腋芽的茎段培养在继代培养基上。在普通继代的环境下培养2周后，将试管苗转入光照培养箱中进行热处理。培养箱所设定的光周期为16小时，温度为‘白天’36℃，‘夜间’32℃。培养2周后，选取顶芽进行超低温脱毒。茎尖取下后在继代培养基上稳定1天后转入MS +2.0M 甘油 + 0.8M 蔗糖的液体培养基上预培养1天。预培养结束后将茎尖转入PVS-2（MS +30％(v/v)甘油 + 15％(w/v, g/100ml)聚乙二醇 + 15％(v/v)DMSO + 0.4mol/L 蔗糖，pH=5.8）中在冰上处理40min后转在灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻。冷冻保存1h后将铝箔条快速取出并浸入MS + 1.2M蔗糖的液体培养基中进行解冻。解冻20min后将茎尖取出，用滤纸短暂干燥后转入继代培养基中进行再生培养。
步骤5.分别用RT-PCR的方法对步骤3的试管苗材料以及经步骤4脱毒处理后的再生苗在转入温室条件下10个月后进行ASGV病毒的检测。
步骤6.统计脱毒效率。
其中，RT-PCR检测病毒步骤如下：
（1）使用RNA提取试剂盒提取植物幼芽的总RNA，采用Thermo反转录试剂盒进行RNA反转录，获得cDNA产物。
（2）病毒检测扩增ASGV病毒的引物为上游引物（5’-3’）CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC;下游引物（5’-3’）CTGCAAGACC-GCGACCAAGTTT目标条带大小分别为524bp，由上海生工合成。
（3）以cDNA为模板，在Taq酶的催化下，使用正反引物进行双链DNA的扩增。PCR温度体系为94℃下预变性3min，接着94℃变性30s，53℃下退火45s，72℃下延伸50s并重复35个循环，最后在72℃延伸10min后结束PCR反应。
实施例2
与实施例1相比，在步骤4中热处理培养4周，然后进行超低温处理，其他步骤与实施例1相同。
实施例3
与实施例1相比，在步骤4中热处理培养6周，然后进行超低温处理，其他步骤与实施例1相同。
对照组
与实施例1相比，在步骤4中热处理培养0周，然后进行超低温处理，其他步骤与实施例1相同。
不同处理方式对植物脱毒效果比较，如表1所示：
表1
处理方式 成活率（%） 脱毒率（%）
实施例1 55.5±3.3 23
实施例2 44.4±6.3 93
实施例3 20.0±4.8 100
对照组 62.2±3.2 0
由表1可知，采用本发明的热处理结合超低温脱毒技术，能够同时具有较高的成活率和较好的脱毒率，对照组只经过超低温处理无法消除苹果茎沟病毒（ASGV）。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种植物超低温脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）携带病毒的植物材料的采集：对经过病毒检测的具有病毒的植物材料进行幼芽采集；
（2）离体材料无菌组培苗初代培养获得无菌组培苗；
（3）继代培养：将步骤（2）获得的无菌组培苗转接到继代培养基中进行增殖培养，连续扩繁几代，获得足够多的丛生芽，用于脱毒处理材料；
（4）植物茎尖热处理结合超低温脱毒：选取步骤（3）中试管苗带腋芽的茎段培养在继代培养基上，在普通继代的环境下培养2周后，将试管苗转入光照培养箱中进行热处理，热处理培养4周后，选取顶芽进行超低温脱毒，超低温脱毒步骤为：茎尖取下后在继代培养基上稳定0.5-2天后进行预培养0.5-2天，预培养结束后将茎尖转入PVS-2中在冰上处理30-60min后转在灭菌铝箔条上的小滴中，然后浸入液氮中进行冷冻，冷冻保存0.5-2h后将铝箔条快速取出并浸入解冻用培养基中进行解冻处理，解冻10-30min后将茎尖取出，用滤纸短暂干燥后转入继代培养基中进行再生培养；
（5）将经步骤（4）处理过的再生苗进行病毒检测；所述的病毒检测为苹果茎沟病毒的检测；
其中，步骤（2）中，所述的离体材料无菌组培苗初代培养为：将采集的植物材料，经过消毒试剂消毒后，接种到初代培养基中，然后置于培养室中，培养10-30天，获得无菌组培苗；所述的消毒试剂为75%的酒精和0.1%氯化汞；所述的初代培养基配方为：MS + 0.6mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA + 5.8g/L 琼脂 + 30g/L 蔗糖，pH=5.8；步骤（4）中，热处理条件为：培养箱所设定的光周期为16小时，温度为‘白天’36℃，‘夜间’32℃；步骤（4）中，所述的PVS-2溶液的配方为：MS + 30％(v/v)甘油 + 15％(w/v, g/100ml)聚乙二醇 + 15％(v/v)DMSO+ 0.4mol/L蔗糖，pH=5.8。
2.根据权利要求1所述的植物超低温脱毒方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的继代培养基配方为：MS + 0.4mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA + 5.8g/L 琼脂 + 30g/L 蔗糖，pH=5.8。
3.根据权利要求1所述的植物超低温脱毒方法，其特征在于，步骤（4）中，普通继代的环境为温度为22 ± 2℃，14h光培养，10小时暗培养。
4.根据权利要求1所述的植物超低温脱毒方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的预培养的培养基为MS + 2.0M甘油+0.8M蔗糖的液体培养基。
5.根据权利要求1所述的植物超低温脱毒方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的选取步骤（3）中试管苗带腋芽的茎段为选取步骤（3）中试管苗的长度为1-2cm带2-3个腋芽的茎段；冰上处理时间为40min；冷冻保存时间为1h；解冻时间为20min；所述的解冻用的培养基为MS+ 1.2M蔗糖的液体培养基。
6.根据权利要求1所述的植物超低温脱毒方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的病毒检测方法为RT-PCR方法；所述的RT-PCR的方法为：利用RNA提取试剂盒法提取材料总RNA，反转录成cDNA，利用引物进行RT-PCR检测。
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