CN107667857A - 一种茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，包括以下步骤：(1)携带病毒无菌组培苗的获得；(2)继代扩繁培养；(3)茎尖玻璃化超低温处理脱毒：取继代扩繁培养后的组培苗，切取茎尖，接种于预培养基上进行预培养；将预培养过的茎尖放在装载溶液中，20～25℃条件下装载5～120min；然后转至PVS‑2溶液中，0～2℃下进行5～150min PVS‑2玻璃化处理；然后进行液氮冷冻处理；最后进行水浴解冻处理；将解冻处理后的茎尖放入MS+1.2mol/L的蔗糖溶液中浸泡处理；(4)后期增殖扩繁培养。本发明的优点在于：①使脱毒效率大为提高，操作简单，快速有效；②提供了从材料选取到获得无病毒茎尖再生植株整个详细过程的高效技术体系；③具有很好的技术效果和推广前景。

Description

一种茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法

技术领域

本发明属于果树脱毒种苗培育技术领域，具体涉及一种茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，该方法对苹果常见病毒ACLSV和ApMV有较好的脱除效果，对苹果其他常见病毒可能同样具有较好的脱除效果。

背景技术

苹果(Malus pumila Mill.)是蔷薇科苹果亚科苹果属多年生落叶乔木，原产于欧洲和亚洲中部，是世界四大水果之一，总面积和总产量仅次于柑橘和香蕉。苹果中含有丰富的矿物质和维生素等营养成分，且是一种低热量水果，营养成分可溶性大，易被人体吸收，更是健康佳品。苹果品种繁多，数以千计，全世界有93个国家和地区生产苹果，我国是世界第一大苹果生产国。

我国栽培的苹果普遍感染多种病毒，在生产上，苹果病毒病是阻碍苹果优质高产的重大因素之一。早在19世纪40年代，欧美各国已开始对苹果进行调查鉴定工作。Bradford和Joley(1933)首次报道了苹果病毒—苹果花叶病的症状(Bradford FC,JoleyL.1933.Infectious variegation in the apple.J Agric Res 46:901-908)。2015年李世访团队与意大利病毒专家合作，从苹果中鉴定出一种新的双生病毒AGV(Liang PB,NavarroB,Zhang ZX,Wang HQ,Lu M,Xiao H,Wu QF,Zhou XP,Serio FD and LiSH.2015.Identification and characterization of a novel geminivirus with amonopartite genome infecting apple trees.Journal of General Virology,96:2411-2420)；Noda等(2017)在中国和日本的苹果栽培区发现了一种新病毒—苹果坏死性花叶病毒(ApNMV)(Noda H,Yamagishi N,Yaegashi H,Xing F,Xie J,Li S,Zhou T,Ito T,Yoshikawa N.2017.Apple necrotic mosaic virus,a novel ilarvirus frommosaicdiseased apple trees in Japan and China.J Gen Plant Pathol,83:83-90)，截止目前世界上报道的苹果病毒病41种有余，我国苹果主产区已鉴定出19种苹果病毒，其中对苹果品种危害较大的主要有苹果花叶病毒(Apple Mosaic Virus,ApMV)、苹果锈果类病毒(Apple Scar Skin Viroid,ASSVd)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple Chlorotic Leaf SpotVirus,ACLSV)、苹果茎痘病毒(Apple Stem Pitting Virus,ASPV)和苹果茎沟病毒(AppleStem Grooving Virus,ASGV)。苹果病毒病具有极强的危害性，并且传播速度快，发病后难治愈。它对果树的危害会直接表现在果实上，降低苹果产量、品质、贮藏性和耐运力，造成直接的经济损失，另一种则在感染后不直接表现在果实上，而是表现在叶片、枝条和主干上，影响树体根系对土壤营养的吸收和利用，影响树体生长，逐渐削弱树势。

热处理脱毒法、茎尖培养脱毒法、热处理结合茎尖培养脱毒法和药剂处理等都是传统的脱毒方法，不仅脱毒率低且药剂脱毒对植物遗传稳定性有潜在的影响。超低温脱毒是一种新兴的植物脱毒技术，是以超低温保存和植物组织培养为基础的一种方法，超低温脱毒是将超低温保存、组织培养相结合来达到病毒脱除目的(Wang QC,Panis B,EngelmannF,Lambardi M and Valkonen J P T.2009.Cryotherapy of shoot tips:a techniquefor pathogen eradication to produce healthy planting materials and preparehealthy plant genetic resources for cryopreservation.Ann Appl Biol.2009,154:351-363)。病毒在植物体中不均匀分布，一般距茎尖分生组织越远，病毒含量越高，而分生组织等端的几层细胞含毒量很少甚至不含毒(White P P.1934.Multiplication of theviruses of tobacco and aucuba mosaic in growing excised tomatoroots.Phytopathology,24:1003-1011)。超低温处理正是利用液氮-196℃的超低温对植物细胞进行选择性杀伤，茎尖和根尖的顶端分生组织得到存活，而病毒细胞被杀死，从而再生出无毒苗。近年来，国内外研究发现超低温处理后的植物材料如愈伤组织、胚轴、茎尖、花粉、根尖、休眠芽、茎段、悬浮细胞、原生质体等病毒含量大为降低，大部分材料中病毒得到完全脱除，而在分生组织分化程度较小、遗传性较为稳定的茎尖中表现尤甚。茎尖超低温技术脱除植物病毒不但避免了切取茎尖过程的操作困难，免除了在切取分生组织时由于时间过长和多酚氧化而导致的茎尖黑化问题，而且脱毒率高，具有传统方法无可比拟的优点。研究表明，对茎尖进行超低温保存是脱除植物病毒的一种简单、快速而有效的方法，不仅耗时短，而且不需要特殊仪器设备，超低温处理后的茎尖不经愈伤组织直接快速成苗，是植物脱毒的一种新途径。

目前研究表明超低温脱毒已成功应用于草莓、苹果、梨、东方百合、马铃薯、柑桔、非洲菊、木茼蒿等园艺作物。然而，超低温脱毒技术尚未完备，脱毒一体化进程有待进一步优化，从而最大程度上提高脱毒效率，降低成本，为人们提供一种便捷实用、简单易行的高效脱毒方法。为此，试验选取‘烟富3号’、‘烟富10号’、‘M9’、‘M9T337’四种不同品种的苹果及砧木材料，从材料选择、病毒检测、初代培养、继代扩繁、茎尖剥离到茎尖超低温处理以及茎尖再生等过程进行深入研究，建立苹果茎尖超低温脱毒技术体系，以期为苹果无毒苗生产提供核心技术支持。同时，也可为超低温脱毒技术体系的进一步优化提供参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型茎尖玻璃化超低温脱除苹果常见病毒、获得脱毒苗的方法体系，使脱毒过程简单易行，高效一体化，最佳超低温脱毒体系对应的茎尖存活率为78.33％，脱毒率可达95.74％，很大程度上解决了一些传统脱毒方法如热处理脱毒法、茎尖培养脱毒法、热处理结合茎尖培养脱毒法、药剂处理等方法不仅脱毒率低且对植物遗传稳定性有潜在影响等问题，使得脱除苹果病毒的过程高效、简单、快速有效且实用性强，不仅耗时短，且不需要特殊仪器设备，超低温处理后的茎尖不经愈伤组织直接快速成苗，是植物脱毒的一种新途径，具有广阔的市场和应用前景。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，包括以下步骤：

(1)携带病毒无菌组培苗的获得：将经过检测含病毒的苹果材料进行初代培养，获得无菌组培苗；

(2)继代扩繁培养：对所述的无菌组培苗进行继代扩繁培养，为后期茎尖玻璃化超低温处理提供充足的材料；

(3)茎尖玻璃化超低温处理脱毒：取继代扩繁培养后的组培苗，切取茎尖，接种于预培养基上进行预培养；将预培养过的茎尖放在装载溶液中，20～25℃条件下装载5～120min；然后转至PVS-2溶液中，0～2℃下进行5～150min PVS-2玻璃化处理；然后进行液氮冷冻处理；最后进行水浴解冻处理；将解冻处理后的茎尖放入MS+1.2mol/L的蔗糖溶液中浸泡处理；

(4)后期增殖扩繁培养：将玻璃化超低温处理后的茎尖接种在茎尖再生培养基上暗培养后转为光照培养，最后将再生植株进行继代扩繁。

步骤(3)中所述预培养的培养基中蔗糖的浓度为0.25～1.0mol/L；优选为0.25～0.5mol/L；最优选为0.5mol/L；所述预培养的条件为25℃下暗培养2天。

步骤(3)中所述装载的时间为30～90min，优选为30～60min，最优选为30～60min。

步骤(3)中所述PVS-2玻璃化处理的时间为60～150min，优选为90～120min，最优选为90min。

步骤(3)中所述液氮冷冻处理的时间为30～90min；所述水浴解冻处理的条件为：40℃水浴2min解冻，解冻速率为200℃/min；将解冻处理后的茎尖放入MS+1.2mol/L的蔗糖溶液中浸泡处理的时间5～15min。

步骤(3)中所述继代扩繁培养后的组培苗为继代五次的组培苗。

步骤(4)中将超低温处理后的茎尖接种在茎尖再生培养基上暗培养1周后，转为光照培养，光照培养一个月后再将再生植株进行继代扩繁。

本发明所述技术方案中所涉及的培养基的配方如下：

步骤(1)中所述初代培养所用的初代培养基配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LIBA+500mg/L PVP+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH＝5.8；

步骤(2)中所述继代扩繁培养所用的继代扩繁培养基配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH＝5.8；

步骤(4)中所述茎尖再生培养基的配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+500mg/L PVP+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.8；将再生植株进行继代扩繁所用的继代扩繁培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8。

步骤(3)中所述茎尖预培养基配方为：MS+蔗糖+5.5g/L琼脂粉；其中，所述蔗糖的浓度为0.25～1.0mol/L；优选为0.25～0.5mol/L；最优选为0.5mol/L。

所述装载溶液的配方为：MS+2mol/L甘油+0.75mol/L蔗糖，pH＝5.8；

所述PVS-2溶液的配方为：MS+30％(v/v)甘油+15％(W/V，g/100ml)聚乙二醇+15％(v/v)DMSO+0.4mol/L蔗糖，pH＝5.8。

本发明技术方案中，最佳超低温处理体系为：预培养基中蔗糖浓度为0.5mol/L，预培养处理2d，25℃下装载60min，0℃下PVS-2溶液中玻璃化处理90min，液氮冷冻1h，40℃水浴2min解冻。最优选技术方案中苹果茎尖的存活率为78.33％，脱毒率可达95.74％。

本发明方法的步骤(1)中含病毒的苹果材料的检测过程为：提取携带病毒材料的总RNA提取，设计引物，进行RT-PCR检测病毒。对超低温处理后茎尖再生植株进行病毒检测，可以得出本发明方法的病毒脱除效果，其病毒检测方法与含病毒的苹果材料的检测过程相同。

本发明茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，具体包括以下操作步骤：

1、携带病毒材料的总RNA提取、引物设计及RT-PCR检测病毒

分别提取‘烟富3号’、‘烟富10号’、‘M9’、‘M9T337’四种苹果材料叶片RNA(图1)，经总RNA浓度及电泳检测质量较好后，采用TaKaRa反转录试剂盒依次进行基因组DNA的除去反应、反转录反应合成cDNA，将设计的ACLSV、ASGV、ASPV、ApMV、ASSVd引物，结合苹果内参基因TUB特异性片段分别进行PCR扩增。

2、携带病毒无菌组培苗的获得：

将经RT-PCR检测携带病毒的‘烟富3号’、‘M9’、‘M9T337’苹果材料进行初代、继代扩繁培养。选择芽饱满、木质化较高的枝条进行水培促萌，当芽萌至1-2cm长时，可剪下用于初代培养，污染率大幅度降低。

(1)水培促萌：外植体消毒前先采用水培促萌法对采集来经检测携带苹果病毒的枝条进行水培促萌，获得幼嫩新芽，水培液配方为：1/8MS+10g/L蔗糖，放置在组培间，25℃，约10天可观察新芽萌发1-2cm(或取苹果树枝条上刚萌发的1-2cm嫩芽)(图2)。

(2)初代前期准备：超净工作台下配置75％酒精、0.1％升汞。

(3)外植体的消毒、灭菌与接种：剪下嫩芽进行初代培养，75％酒精处理45s，0.1％升汞处理5min。

3、继代扩繁培养：

继代扩繁培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH＝5.8。约四周继代一次。

4、茎尖玻璃化超低温脱除病毒

(1)在超净工作台解剖镜下切取2mm茎尖；

(2)茎尖预培养：预培养基为：MS+蔗糖+5.5g/L琼脂粉，其中蔗糖设置0.25mol/L、0.5mol/L、0.75mol/L和1.0mol/L系列浓度梯度，培养基中不加任何激素，25℃下暗培养2天。

(3)装载：将预培养过的茎尖放在装载溶液(MS+2mol/L甘油+0.75mol/L蔗糖，pH＝5.8)中，20～25℃条件下分别装载0min、30min、60min、90min和120min。

(4)玻璃化超低温处理：将装载过的茎尖转移到PVS-2溶液(MS+30％甘油+15％聚乙二醇+15％DMSO+0.4mol/L蔗糖,pH＝5.8)中，0～2℃下分别进行0min、60min、90min、120min、150min的玻璃化处理。然后转入10mL冻存管，投入液氮中冷冻1h。

(5)解冻：取出冻存管并快速转移到40℃的水浴锅中水浴2min，解冻速率为200℃/min。将茎尖取出放入MS+1.2mol/L的蔗糖溶液中浸泡10min后，用镊子轻微搅拌，至茎尖漂浮在液体表面。

5、茎尖再生及后期扩繁培养：将处理后的茎尖接种在再生培养基上暗培养1周，之后转为光照培养。茎尖再生培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+500mg/L PVP+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.8。一个月后统计存活率，并将再生株系进行继代扩繁。继代扩繁培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8。

6、再生株系的病毒检测：参照“1”中的总RNA提取、引物设计及RT-PCR检测病毒方法。

本发明的有益效果：

本发明的优点在于：①茎尖玻璃化超低温处理避免了传统脱毒方法如热处理脱毒脱毒效率低、茎尖培养脱毒茎尖切取困难以及药剂脱毒对植物遗传稳定性有潜在影响的弊端，使脱毒效率大为提高，操作简单，快速有效；②提供了从材料选取到获得无病毒茎尖再生植株整个详细过程的高效技术体系；③苹果茎尖玻璃化超低温脱毒最佳体系对应的茎尖成活率为78.33％，脱毒率达95.74％，具有很好的技术效果和推广前景。

附图说明

图1四种苹果及砧木总RNA提取电泳图

注：1.‘烟富3号’；2.‘烟富10号’；3.‘M9’；4.‘M9T337’。Note:1.‘Yanfu 3’；2.‘Yanfu 10’；3.‘M9’；4.‘M9T337’

图2‘烟富3号’RT-PCR病毒检测图

M.2000Maker；1.ACLSV；2.gACLSV；3.cACLSV；4.ASGV；5.gASGV；6.cASGV；7.ASPV；8.gASPV；9.cASPV；10.ApMV；11.mApMV；12.cApMV；13.ASSVd；14.lASSVd；15.yASSVd；16.TUB

图3‘烟富10号’RT-PCR病毒检测图

1.ACLSV；2.gACLSV；3.cACLSV；4.ASGV；5.gASGV；6.cASGV；7.ASPV；8.gASPV；9.cASPV；10.ApMV；11.mApMV；12.cApMV；13.ASSVd；14.lASSVd；15.yASSVd；16.TUB；M.2000Maker

图4‘M9’砧木RT-PCR病毒检测图

M.2000Maker；1.ACLSV；2.gACLSV；3.cACLSV；4.ASGV；5.gASGV；6.cASGV；7.ASPV；8.gASPV；9.cASPV；10.ApMV；11.mApMV；12.cApMV；13.ASSVd；14.lASSVd；15.yASSVd；16.TUB

图5‘M9T337’砧木RT-PCR病毒检测图

M.2000Maker；1.ACLSV；2.gACLSV；3.cACLSV；4.ASGV；5.gASGV；6.cASGV；7.ASPV；8.gASPV；9.cASPV；10.ApMV；11.mApMV；12.cApMV；13.ASSVd；14.lASSVd；15.yASSVd；16.TUB

图6‘烟富3号’水培促萌获得幼嫩新芽

图7获得的三种苹果无菌组培苗

注：1.‘烟富3号’；2.‘M9’；3.‘M9T337’。

图8解剖镜下切取2mm茎尖

注：1.三片叶原基；2.圆亮生长点

图9不同蔗糖浓度的预培养对苹果茎尖存活率的影响

图10不同装载时间对苹果茎尖存活率的影响

图11不同玻璃化处理时间对苹果茎尖存活率的影响

图12再生植株RNA提取结果

注：M.2000Maker；1.健康‘烟富10号’；2.原带病毒的‘烟富3号’；3-10为超低温处理后再生植株。

图13再生植株ACLSV、ApMV病毒RT-PCR检测电泳结果

注：M.2000Maker；1.健康‘烟富10号’；2.原带病毒的‘烟富3号’；3-8为超低温处理后的脱毒再生植株(3,4为‘烟富3号’；5,6为‘M9’；7,8为‘M9T337’)；9.超低温处理后未脱除ACLSV再生植株；10.超低温处理后未脱除ACLSV、ApMV病毒再生植株；11.苹果内参基因TUB。

图14苹果茎尖超低温脱毒体系过程简图

具体实施方式

下面结合实施例和附图作进一步说明。应该理解这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

实施例1

1、携带病毒材料的总RNA提取、引物设计及RT-PCR检测病毒：

试验以‘烟富3号’、‘烟富10号’、‘M9’、‘M9T337’四种苹果及砧木为材料，均取自江苏省徐州果树研究所。根据赵玲玲等对苹果ACLSV、ASGV、ASPV、ApMV、ASSVd五种主要苹果病毒病表观症状的描述(赵玲玲,宋来庆,刘美英,Atanas Blagov,唐岩,孙燕霞,姜中武.2013.苹果病毒病的主要症状、危害及传播途径分析.烟台果树,(03):5-6)，选择具有相应带毒症状的‘烟富3号’、‘M9’、‘M9T337’植株以及不带毒症状的‘烟富10号’，分别对其叶片进行总RNA提取，并反转录得到cDNA。根据GenBank登录的ACLSV、ASGV、ASPV、APMV、ASSVd五种病毒蛋白外壳序列并结合前人的研究结果设计引物，每种病毒设计三套引物，(表1)，采用TUB作为苹果内参基因，利用RT-PCR进行病毒检测。

表1 RT-PCR检测苹果病毒和内参基因的引物序列

Table 1 The nucleotide sequences of the primers used in RT-PCR forviruses and apple reference genes

采用CTAB法(蔡斌华,张计育,高志红,渠慎春,佟兆国,靡林,乔玉山,章镇.2008.一种改良的提取草莓属叶片总RNA的方法.江苏农业学报,24(6):875-877)分别提取‘烟富3号’、‘烟富10号’、‘M9’、‘M9T337’四种苹果材料叶片RNA(图1)，经总RNA浓度及电泳检测质量较好后，采用TaKaRa反转录试剂盒依次进行基因组DNA的除去反应、反转录反应合成cDNA，将设计的ACLSV、ASGV、ASPV、ApMV、ASSVd引物，结合苹果内参基因TUB特异性片段分别进行PCR扩增。均采用25μL反应体系(1μL cDNA、1μL Primer-F、1μL Primer-R、2μL dNTP、0.2μL rTaq酶、2.5μL buffer和17.3μL ddH₂O)。PCR特异性扩增程序为：94℃预变性2min；94℃50s，退火温度50s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸10min，冷却至4℃保存。经权衡ACLSV、ASGV、ASPV、APMV、ASSVd及TUB各自设计的所有引物Tm值，其特异性退火温度分别为58.6℃、58℃、56℃、53.2℃、55℃、56℃。ACLSV、ASGV、ASPV、APMV、ASSVd、TUB的特异性片段引物见表1。PCR扩增产物用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，然后利用Bio-Rad凝胶成像分析系统拍照保存。

图2-图5四种苹果材料病毒检测电泳图表明，四种苹果材料电泳后均可看到清晰的苹果内参基因TUB条带，说明没有假阴性结果出现。苹果‘烟富3号’检测含ACLSV、ApMV；砧木‘M9’和‘M9T337’检测均含有ACLSV，而苹果‘烟富10号’检测结果和采集时不带病毒症状一致，不含上述五种病毒。

2、携带病毒无菌组培苗的获得：

将检测含苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果花叶病毒(ApMV)的‘烟富3号’苹果品种、只含ACLSV的苹果砧木‘M9’和‘M9T337’三种苹果材料进行初代培养，获得无菌组培苗。初代培养基配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+500mg/LPVP+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH＝5.8。

对于苹果枝条，选择饱满芽、木质化程度较高的枝条先进行水培促萌，当芽萌发出1-2cm长时，可剪下用于初代培养，污染率大幅度降低。

(1)水培促萌：外植体消毒前先采用水培促萌法，对采集来经检测携带苹果病毒的枝条进行水培促萌，获得幼嫩新芽，水培液配方为：1/8MS+10g/L蔗糖，放置组培间，25℃下约10天可观察新芽萌发(图6)。

(2)初代前期准备：超净工作台下配置75％酒精、0.1％升汞。

(3)外植体的消毒、灭菌及接种：①用75％酒精擦拭剪刀，将苹果枝条上通过水培促萌获得的1-2cm芽剪下，放入底部打孔的塑料杯中，加入适量洗洁精或洗衣粉，流水下冲洗20min以上。②在超净工作台上，使用75％酒精处理45s后无菌水清洗3遍，0.1％升汞处理5min后清洗5遍以上。③在酒精灯火焰旁，用灭过菌的滤纸吸干苹果幼芽上的水分，并剪去底部约1mm，准备接种。图7为通过初代获得的三种苹果无菌组培苗。

3、继代扩繁培养：

对‘2’中获得的无菌组培苗进行继代扩繁培养，继代扩繁培养基为：MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH＝5.8，约四周继代一次。

4、茎尖玻璃化超低温脱除病毒

(1)切取2mm茎尖：选择继代5次的组培苗，在超净工作台解剖镜下切取2mm的茎尖(图8)进行预培养。在解剖镜下切取茎尖时一只手用尖头镊子将茎芽按住，一手用解剖针将叶片和部分叶原基剥掉，直至露出圆亮的生长点(王蒂,陈劲枫.2013.植物组织培养(第二版).北京:中国农业出版社)。茎尖生长发育的内源生长素和细胞分裂素由叶原基提供，留下2-3片叶原基有助于茎尖的成活和生长。此时可将带有2-3片叶原基、露出圆亮生长点的茎尖切下。‘烟富3号’、‘M9’、‘M9T337’三个苹果品种的每个处理各切取20个茎尖。

(2)确定最佳茎尖预培养蔗糖浓度：选择‘烟富3号’、‘M9’、‘M9T337’继代5次的组培苗各切取20个2mm的茎尖，接种在预培养基(MS+蔗糖+5.5g/L琼脂粉)上25℃暗培养2天，品种间视为3次重复(即60个样本，下同)。预培养基蔗糖设置0.25mol/L、0.5mol/L、0.75mol/L和1.0mol/L系列浓度梯度。预培养后依次进行装载、PVS-2玻璃化处理，装载时间、PVS-2处理时间均保持60min。然后转入10mL冻存管，直接投入液氮中冷冻1h。将处理后的茎尖接种在茎尖增殖培养基上暗培养1周，之后转为光照培养。一个月后统计茎尖存活率，并进行继代扩繁。待茎尖长大后，对成活株系进行RT-PCR病毒检测。由图9可以看出，超低温处理后的存活率随蔗糖浓度的增加先升高后降低：当蔗糖浓度从0.25mol/L上升到0.5mol/L时，存活率从18.33％上升到28.33％，并达到最高，继续升高至0.75mol/L和1.0mol/L时，存活率反而大幅度降低至11.67％和6.67％。这可能是由于蔗糖浓度对细胞渗透压造成的影响，从而影响了存活率。由表2数据统计可知，因不同预培养蔗糖浓度所对应的脱毒植株和存活数的基数不同，预培养四种蔗糖浓度下茎尖脱毒率相似，0.25mol/L和0.75mol/L所对应的脱毒率较高，可能是脱毒植株和存活数较少的缘故，而0.5mol/L蔗糖对应茎尖存活率显著高于其他情况。由此可知，0.5mol/L预培养蔗糖浓度在实验中最为适宜。

表2 不同处理对苹果茎尖存活率及脱毒率的影响

Table 2 Effect of different treatments during cryopreservation onsurvival ratio and detoxification ratio

(3)确定最佳装载时间：选择‘烟富3号’、‘M9’、‘M9T337’三个苹果及砧木品种继代5次的组培苗各切取20个2mm茎尖，接种在预培养基上25℃暗培养2天，品种间视为3次重复。预培养基中蔗糖浓度设置为0.5mol/L。预培养2天后放入装载溶液(MS+2mol/L甘油+0.75mol/L蔗糖，pH＝5.8)中，25℃下分别处理为0min、30min、60min、90min和120min。装载结束后转入PVS-2溶液中，0℃下处理60min，然后转入10mL冻存管，直接投入液氮中冷冻1h。将处理后的茎尖接种在茎尖增殖培养基上暗培养1周，之后转为光照培养，一个月后统计存活率，并进行继代扩繁。待茎尖长大后，对成活株系进行RT-PCR病毒检测。图10显示，超低温处理后茎尖存活率随装载时间的延长先升高后降低：当装载时间从0min增加到60min时，存活率逐步递增，并在60min时达到最高30％，当继续装载至90min及120min时，存活率反而大幅度下降，原因可能是装载时间过长对茎尖产生伤害，不利于茎尖生长。由表2数据统计可知，五种不同装载时间下的茎尖脱毒率和预培养蔗糖浓度所对应的脱毒率走势相似，即脱毒率大小相近，90min和120min所对应的脱毒率均为100％，可能是脱毒植株和存活数较少的缘故，而装载60min下茎尖存活率显著高于其他情况。60min为实验中最适宜的装载时间。

(4)确定最佳PVS-2玻璃化处理时间：选择‘烟富3号’、‘M9’、‘M9T337’三个苹果及砧木品种继代5次的组培苗各切取20个2mm茎尖，接种在预培养基上预培养2天，品种间视为3次重复。预培养基中蔗糖浓度设置为0.5mol/L。预培养2天后25℃下装载60min。然后0℃下在PVS-2溶液中分别处理0min、60min、90min、120min、150min，其后转入10mL冻存管，直接投入液氮中冷冻1h。将处理后的茎尖接种在茎尖增殖培养基上暗培养1周，之后转为光照培养，一个月后统计存活率，并进行继代扩繁。待茎尖长大后，对成活株系进行RT-PCR病毒检测。图11表明，超低温处理后的存活率随PVS-2处理时间的增长先显著升高而后缓慢降低：在90min时，存活率达到最高78.33％，之后随时间的延长存活率降低，这可能是PVS-2溶液中DMSO对茎尖的毒害以及时间过长导致茎尖过度脱水的原因。表2数据表明，PVS-2处理时间下的茎尖脱毒率情况和预培养蔗糖浓度所对应的脱毒率同样相识，脱毒率大小相近，而PVS-2处理90min下茎尖存活率显著高于其他情况。90min为实验中最适宜的PVS-2处理时间。

所述PVS-2溶液的配方为：MS+30％甘油+15％聚乙二醇+15％DMSO+0.4mol/L蔗糖，pH＝5.8。

(5)确定脱毒因素：①茎尖培养(对照)。选择继代5次的‘M9T337’组培苗，切取2mm茎尖30个，直接接种于茎尖再生培养基中，不做预培养、装载、PVS-2、液氮冷冻等处理。待茎尖长大后对成活株系进行病毒检测。②茎尖预培养。选择继代5次的‘M9T337’组培苗，切取2mm茎尖30个，接种于蔗糖浓度为0.5mol/L的预培养基上，预培养2天。然后转至茎尖增殖培养基上，不做装载、PVS-2、液氮冷冻等处理。待茎尖长大后对成活株系进行病毒检测。③装载处理。选择继代5次的‘M9T337’组培苗，切取2mm茎尖30个，直接进行60min装载处理，然后投入液氮中冷冻1h，转至茎尖再生培养基上，不做预培养、PVS-2处理。待茎尖长大后，对成活株系进行病毒检测。④PVS-2处理。选择继代5次的‘M9T337’组培苗，切取2mm茎尖30个，不做预培养、装载处理，直接进行90min PVS-2处理，然后液氮冷冻1h，最后接种至茎尖再生培养基上。待茎尖长大后，对成活株系进行病毒检测。

表3苹果茎尖脱毒因素的确立

Table 3 Establishment of virus-free factors in stem tip of apple

表3表明，只进行茎尖培养和茎尖预培养的茎尖存活率为100％，而脱毒率均为0，说明茎尖预培养没有直接的脱毒效果。只进行装载后直接液氮冷冻，不进行预培养和PVS-2处理，茎尖全部死亡；只进行PVS-2处理，不进行预培养和装载，然后液氮冷冻，茎尖存活率比对照显著降低，说明只进行装载处理后液氮冷冻对茎尖造成的伤害极为严重，装载处理在超低温处理过程中对茎尖起到重要的保护作用，而只进行PVS-2处理也会对茎尖造成很大伤害，PVS-2在整个超低温脱毒过程中也起着非常关键的茎尖抗冻保护作用。同时也表明玻璃化超低温处理(装载+PVS-2+液氮冷冻)是产生脱毒效果的直接原因。

综上，最佳超低温处理体系为：预培养采用0.5mol/L蔗糖浓度处理2d，25℃下装载60min，0℃下PVS-2溶液中玻璃化处理90min，液氮冷冻1h，40℃水浴2min解冻。苹果茎尖的存活率为78.33％，脱毒率可达95.74％。

(6)解冻：取出冻存管并快速转移到40℃的水浴锅中水浴2min，解冻速率为200℃/min。将茎尖取出放入MS+1.2mol/L的蔗糖溶液中浸泡10min后，用镊子轻微搅拌，至茎尖漂浮在液体表面。

5、茎尖再生及后期扩繁培养

将处理后的茎尖接种在茎尖再生培养基上暗培养1周，之后转为光照培养。茎尖再生培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+500mg/L PVP+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.8。一个月后统计存活率，并将再生株系进行继代扩繁。继代扩繁培养基为：MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8。

6、再生植株的病毒检测及存活率、脱毒率统计

再生植株的病毒检测参照“1”中设计的引物及病毒检测方法，待茎尖长大后，对成活株系进行RT-PCR病毒检测，检测经预培养、装载、PVS-2、超低温冷冻等处理后的脱毒效果。使用‘Excel 2013’软件统计茎尖存活率、脱毒率，并制作相应图表。统计脱毒率时，将脱毒植株视为ACLSV和ApMV病毒全部脱除的植株。

选取原检测不含病毒的‘烟富10号’、原检测携带病毒的‘烟富3号’材料作为指示植物，代表性地选取8株超低温处理后茎尖再生植物，分别提取RNA(图12)，所有材料提取RNA的OD_260/280均在1.9至2.1之间，说明提取的RNA比较纯，含杂质少，RNA质量合格，适合进行病毒检测等后续操作。

选择PCR产物为217bp的ACLSV引物、417bp的ApMV引物和129bp的内参TUB引物(表1)，进行RT-PCR病毒检测(图13)，检测方法参照“1”中内容。

图13表明：泳道1“健康‘烟富10号’”和泳道2“原携带病毒的‘烟富3号’”作为阴性和阳性对照均符合预期结果；泳道3-8分别为玻璃化超低温处理后脱除病毒的植株(3,4为‘烟富3号’；5,6为‘M9’；7,8为‘M9T337’)；泳道9为未脱除ACLSV病毒的‘M9T337’植株，泳道10为未脱除ACLSV和ApMV病毒的‘烟富3号’植株。

7、苹果茎尖超低温脱毒体系操作全过程简图如图14中步骤①-⑧所示。

Claims (9)

1.一种茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)携带病毒无菌组培苗的获得：将经过检测含病毒的苹果材料进行初代培养，获得无菌组培苗；

(2)继代扩繁培养：对所述的无菌组培苗进行继代扩繁培养；

(3)茎尖玻璃化超低温处理脱毒：取继代扩繁培养后的组培苗，切取茎尖，接种于预培养基上进行预培养；将预培养过的茎尖放在装载溶液中，20～25℃条件下装载5～120min；然后转至PVS-2溶液中，0～2℃下进行5～150min PVS-2玻璃化处理；然后进行液氮冷冻处理；最后进行水浴解冻处理；将解冻处理后的茎尖放入MS+1.2mol/L的蔗糖溶液中浸泡处理；

(4)后期增殖扩繁培养：将玻璃化超低温处理后的茎尖接种在茎尖再生培养基上暗培养后转为光照培养，最后将再生植株进行继代扩繁。

2.根据权利要求1所述的茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，其特征在于：所述预培养的培养基中蔗糖的浓度为0.25～1.0mol/L；优选为0.25～0.5mol/L；最优选为0.5mol/L；所述预培养的条件为25℃下暗培养2天。

3.根据权利要求1所述的茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，其特征在于：步骤(3)中所述装载的时间为30～90min，优选为30～60min，最优选为30～60min。

4.根据权利要求1所述的茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，其特征在于：步骤(3)中所述PVS-2玻璃化处理的时间为60～150min，优选为90～120min，最优选为90min。

5.根据权利要求1所述的茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，其特征在于：步骤(3)中所述液氮冷冻处理的时间为30～90min；所述水浴解冻处理的条件为：40℃水浴2min解冻，解冻速率为200℃/min；将解冻处理后的茎尖放入MS+1.2mol/L的蔗糖溶液中浸泡处理的时间5～15min。

6.根据权利要求1所述的茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，其特征在于：步骤(3)中所述继代扩繁培养后的组培苗为继代五次的组培苗。

7.根据权利要求1所述的茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，其特征在于：步骤(4)中将超低温处理后的茎尖接种在茎尖再生培养基上暗培养1周后，转为光照培养，光照培养一个月后再将再生植株进行继代扩繁。

8.根据权利要求1所述的茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述初代培养所用的初代培养基配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+500mg/L PVP+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂粉，pH＝5.8；

步骤(2)中所述继代扩繁培养所用的继代扩繁培养基配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH＝5.8；

步骤(4)中所述茎尖再生培养基的配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+500mg/LPVP+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH＝5.8；将再生植株进行继代扩繁所用的继代扩繁培养基为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8。

9.根据权利要求1所述的茎尖玻璃化超低温脱除苹果病毒的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述茎尖预培养基配方为：MS+蔗糖+5.5g/L琼脂粉；其中，所述蔗糖的浓度为0.25～1.0mol/L；优选为0.25～0.5mol/L；最优选为0.5mol/L。

所述装载溶液的配方为：MS+2mol/L甘油+0.75mol/L蔗糖，pH＝5.8；

所述PVS-2溶液的配方为：MS+30％甘油+15％聚乙二醇+15％DMSO+0.4mol/L蔗糖，pH＝5.8。