CZ143889A3 - Regenerace rostlin z čeledi Gramineae z podčeledi Pooideae vycházeje z protoplastů - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká trav z poděeledi /subfamilia / looidiae , které se regenerují z protoplas tů , které pochází z protoplastů. s regenerovanými buněčnými stěnami / rostlinných buněk / nebo z kalusů , které pocházejí z protoplastů , jakož i obecně použitelného způsobu regenerace těchto rostlin . Další předmět vynálezu se týká embryogenových buněčných kultur /suspensní kultury nebo kultury kalusu / , jakož i kalusů, které slouží jako výchozí materiál pro protoplasty,které se pak mohou regenerovat na vele rostliny .Vynález zahrnuje rovněž způsob výroby shora zmíněných embryogenových buněčných kultur, konservaci za chlazení / kryokonzervace / uvedených embryogennových buněčných kultur a embryogenového kalusu, jakož i transgenových rostlin z poděeledi Dooideae, které se regenerují z geneticky modifikovaných proto2plastů.

Většina rost?tin, na kterých je v první řadě zá vislá výživa lidí,patří ke skupině rostlin, které jsou známé pod hromadným názvem Gramineae / lipnicovité/.

Graminae / Poaceae - lipnicovité / jsou z hlediska komerčního pohledu nejvýznamnější čeledí uvnitř linnéovy soustavy monokotyledonních rostlin. K travám patří například následující podčeledi a rody:

podčeled rod uvnitř podčeledi

Bambusoideae

Andropogonoideae

Arundineae

Oryzoideae

Panicoideae

PaAdeae / Pestuciadeae/ bamboo

Sanharum /třtina cukrová/ sorghum zea /kukuřice/

Phragmites /rákos obecný/ Oryza / rýže/

Panicům /*/

Pennisetům /* /

Setaria /+/

Poa /++/

Pestuea /⁺⁺/ lolium /++/

Bromus /** /

Trisetum /++/

-3pódčeleá. rod uvnitř podčeledi

Agrostis /⁺⁺/

Phleum /⁺⁺/

Dactylis /⁺⁺/

Alopecurus /⁺⁺/ az ,

Avena /6 ves / Triticum / pšenice ~/ Secale / žito / Hordeum ječmen*^/ + proso ++ trávy malozmé obilí

Uvnitř podčeledi Gramineae tvoří Pooideae posuzováno z ekonomických hledisek vylmi významnou skupinu rostlin.K tomu patří například i obě blízce příbuzné podrody trav a malozrných obilí.

Je zajímavé, že právě rostliny z této podčeledi Pooideae pětří k rostlinám,s nimiž se dá pomocí vědeckých metod nejobtížněji manipulovat.U souladu s tím, nejsou až dodnes známy žádné generelní způsoby,které dovolují regeneraci rostlin,fertilních rostlin nebo transgenových rostlin se stabilně vestavěnou exogeno-4vou DNA z podčeledi Pooideae vycházeje od protoplastů, ačkoliv taková regenerace z kultivovaných protoplastů, například pro použití somatické hybridizace a pro výrobu trensgenových rostlin pomocí přímého transferu ge nu je předpokladem«Nynější stav vědomostí v oblasti transformace obilí byl krátce shrnut v přehledném elán ku napsaném Cocking a Davey,l987·

Ppis výchozího materiálu pro kultury obilí,protoplastů jakož i způsobu izolace protoplastů z obilí a o jejich vlastnostech je zveřejněn například v publika ci :Cereal Tissue and Cell Culture ;Bright SWJ a Jones MGK,/eds//1985/ Hijhoff M; Junk W., Dordreeht*

Stabilní transformace se dala dosáhnout již chemicky a elektricky stimulovaným včleněním DNA do protoplastů / Direkter Gentransfer”,Potrykus et al.,1985 Ib’rz et al., 1985; Promm et al.,1986/ ,zatím co regenerace celé rostliny, vycházeje linie buněk v této studii,nebyla možná.

Až dosud se daly s úspěchem regenerovat jan takové rostliny ze skupiny Graminae, které nepatří k podčeledi Pooideae . Abdullah et al. /1986/ zpravují například o eficientní regeneraci rostlin pomocí somatické embryogené ze vycházeje z protoplastů rýže /poďčeleů Oryzoideae /. I lamada et al. /1986/ popisují

-5regeneraci rostlin u rýže vycházeje od kalusů, které se odvozují od protoplastů. Rhodes et al.,/1988/ po pisují regeneraci nefertilních rostlin kukuřice, Cocking a Davey /1987/ diskutují o přítomném stavu vědomostí v oblasti txaBsferu genů u rostlin obilí.

Regenerace rostlin čeledi Graminae a poděeledi Dooideae vycházeje od tkáňových kultur je známa. Han ning et al. /1982/ popisují vývoj embrya a klíčků u Dactylis glomerata 1., vycházeje o tkáně kalusu,které se vyvíjí z listových segmentů.

Dále jsou uvedeny příkladně další rostliny z podčeledi Tooideae,jejichž regenerace z kultivovaných buněk je popsána v následujících článcích:

lolium rigidum /Skene et al.,1983/» lolium perenne ,lolium multiflorum /Ahloowalia,1975/} lolium multiflorum,Festuca arundinacea /Kasperbauer et al.,

3-979/5 Alopecurus arundinaceus ,Agropyron crystatum, Stipa viridula,Bromus inermis,Agropyron smithii /lo et al.,1980/ a Agrostis palustris /Krans et al.,1982/.

Další přehled o tkáňových kulturách u krmných trav se nachází u Ahloowalia,/1984/.

Ve shora uvedených případech nevychází regenerace ze stejného výchozího materiálu ,který je uveden

-6v předloženém vynálezu , nýbrž z jiného typu buněčné kultury . V žádném ze shora uvedených příkladů nemohlo být prokázáno, že se regenerace provádí de novo přes somatickou embryogenezi · Shora citované reference kromě toho neobsahují žádné údaje o izolaci a kultivaci protoplastů nebo β regeneraci rostlin z protoplastů.

Z toho vyplýbá ,že navzdory velkému zájmu o genetickou transformaci a regeneraci trav z pod čeledi looideae až dodnes neexistuje žádný způsob in vitro , který dovoluje úspěšně regenerovat rostliny nebo fertilní rostliny z protoplastů , které mohou být popřípadě transformovány... Gocking a Davey, 1987/.

Až dosud zůstal veškerý výzkum a snahy vyvíjené v tomto směru bezvýsledné, tzn., že vedou bučí. pouze k embryím ,nebo ale i k rostlinám, které nejsou chopny života, a které již v ranné vývojové fázi odumírají a proto není možné je úspěšně přesazovat do země /Ahloowalia, 1984/.

Vzhledem k tomu tedy až dosud neměla veřejnost k dispozici žádný způsob , který by dovoloval výrobu protoplastů z podčeledi 3?ooidaeeae ,které by byly schopné diferenciace na celé rostliny a s výhodou na celé fertilní rostliny, natož pak způsob regenerace

-7rostlin z poděeledi Pooideae vycházeje z protoplastů nebo z kalusů,které pocházejí z protoplastů.

Tyto a jiné úlohy mohly být nyní vyřešeny v rámci předloženého vynálezu,který zveřejňuje způ sob výroby protoplastů,které jsou schopny vytvořit kolonie buněk a kolonie kalusu. Protoplasty se mohou, pokud to je požadováno ,transformovat,přičemž vznikající kalusy jsou schopny se regenerovat na celé rostliny /Pooideae/. Uvedený způsob výroby protoplastů,které jsou schopné se dělit a vyvinout kalus,který se pak může regenerovat na celé rostliny, vyžaduje nové embryogenní buněčné kultury /suspensní kultury nebo kalusové kultury / nebo embrya jako výchozí materiál.Tyto embryogenní buněčné kultury a embrya jakož i způsob jejich výroby a identifikace jsou popsány v předloženém vynálezu a tvoří rovněž součást tohoto vynálezu.

Jako výchozí materiál pro protoplasty se může kromě toho používat embryogenní kalus,z něhož se odvozují suspense.Tento kalus jakož i suspense, embrya a způsob jejich výroby^. identifikace jsou popsányv předložené přihlášce vynálezu a tvoří rovněž součást vynálezu.

Tyto embryogenní kultury tvoří zdroj proto -8plastů, které se mohou transformovat exogenní DNA a které jsou s to dělit buňky a vytvářet kalus.Tento kalus se může potom regenerovat na celé rostliny , včetně celých fertilních rostlin, které jsou schopné růst v zemi.

V době,kdy vznikal tento vynález,nebylo možné odvodit ze stavu techniky,že je možné regenerovat trávy, zejména fertilní trávy z podčeledi Pooideae vycházeje od protoplastů nebo i od buněk nebo kalusů, které pocházejí z protpplastů. Ještě méně se dalo předvídat,že se protoplasty rostlin z podčeledi Pooideae,které obsahují exogenní DNA stabilně vestavěnou do jejich genomu, rovněž regenerovat za vzniku trahsgenových rostlin, zejména ale za vzniku fertilních transgenových rostlin.

Tento vynález se týká v první řadě embryogenních buněčných kultur / suspensních nebo kalusových kultur/, které se odvozují od travz podčeledi Pooideae,od nichž se mohou izolovat protoplasty, přičemž uvedené protoplasty nejdříve regenerují buněčné stěny,dělí se a posléze vytváří kalus,který se může regenerovat na celou/ rostlinu, včetně celých fertilních rostlin.

Předložený vynález se kromě toho týká protoplastů rostlin z podčeledi Pooideae a z nich rezultujících

-9xostlinných buněk /po regeneraci buněčných stěn/, které se mohou regenerovat na celé rostliny, s výhodou na eelé fertilní rostliny, zejména ale i protoplastů, které pochází z buněčných kultur nebo z embryo genních suspensí buněk.

Další předmět vynálezu tvoří rostlinné buňky , kalusy, embryogenní suspense buněk, embrya,mladé rostliny jakož i rostliny, které se odvozují od uvedených protoplastů.

Kromě toho zahrnuje předložený vynález regenerované rostliny tráv z podčeledi Pooideae, jakož i jejioh rozmnožovací materiály,které se odvozují od protoplastů nebo rostlinných buněk, které obsahují exogenní DNA vestavěnou do jejich genomu, s výhodou ale exogenní DNA, která se může v rostlinách exprimovat. íod pojmem rozmnožovací materiál se v rámci toho vynálezu rozumí každý rostlinný materiál, který se dá sexuálně nebo asexuálně nebo i in Vitro nebo in vivo rozmnožovat, přičemž výhodné jsou protoplasty, buňky, kaluyy, tkáně,orgány, zygoty,embrya,pyly nebo semena,která se mohou získat z transgenových rostlin podčeledi íooideae. Další předmět tohoto vynálezu tvoří potomstvo uvedených rostlin z podčeledi Dooideae,jakož i mutanty a varianty odvozené od těchto rostlin, včetně těch,kte-10ré se odvozují od rostlin,které byly získány somatickou fúzí rostlin,genetickou modifikací nebo selekcí mu tantů.

Tento vynález se kromě toho týká způsobu výroby protoplastů a rosllinných buněk rostlin z podceledi Pooideae, které se mohou regenerovat na celé rostliny, s výhodou na oelé fertilní rostliny, dále se týká způsobu výroby kalusů,které se odvozují od uvedených protoplastů nebo rostlinných buněk a jsou schopny se regenerovat zá vzniku celé rostliny, zejména celé fertilní rostliny. Dále se předložený vynález týká způsobu regenerace rostlin z poděeledi Dooideae,vycházeje od uvedených kalusů.Tento způsob je dále podrobně popsán.

Tyto a další předměty předloženého vynálezu jsou zveřejněny v následujícím podrobném popisu»

Obrázky

- obr. 1 : ukazuje kolonie Daotylis glomerata 1., které pocházejí z protoplastů a které rostou v agarozovém klatrátu,který je suspendován v kapalném médiu.

obr. 2 ukazuje mladou rošt linu, která se vyvine ..........z............... j .......... v <

z protoplastů odvozených od Dactylis glomerata 1. ka-11lusu,který roste na médiu SH-O.

Obr. 3 ukazuje nádobu s mladou rostlinou s kořínky,která se vyvíjí z kalusu Dactylis glomerata 1.,rostoucím na médiu SH-O, který se odvozuje od protoplastň.

obr. 4 ukazuje rostlinu Dactylis glomerata X., která byla regenerována z protoplastů / vlevo/ spolu s divokým typem rostliny Dactylis glomerata X. /vpravo/.

obr. 5 ukazuje plasmid pCIB7O9 ,který se může použít pro transformaci protoplastů Dactylis glomerata X., aby jim propůjčil odolnost vůči Hygromycinu. Plasmid pCIB7O9 byl uložen podle ustanovení Budapešťské úmluvy u American Type Culture Collection * v Rockville ,Maryland,USA pod ukládaoím číslem ATCC40428 Datum uložení je 12.únor 1988.

legenda :

35S s 35S oblast promotoru Hygro-geny : strukturní gen hygromycinfosfotransferázy /APH £yp IV/

35S term. s oblast CaMV s místem 3*polyadenylace 35S transkriptoru CaMV

-12obr. 6 ukazuje :Southern bio analýzu DUA růz ných kalusů Lactylis glomerata l·., které byly po transformaci protoplastů s plasmidem pCIB709»z toho to získány. Analýza byly prodedena pomocí fragmentu Xbal-SsI , který sloužil jako molekulární sonda.

Rada 1,2 10 ng a 2 ng pCIB709 štěpeno restrikční endonukleázou BamHI

Řada 4-8 LNA z kultur kalusů Lactylis glomerata I.,štěpená BamHI,které de odvozují od protoplastů,které byly předtím transformovány pCIB7O9

Řada 9,17 : LNA štěpená BamHI , z netransformovaného kalusu odvozeného od protoplastů Lactylis glomerata 1.

Řada 10,13 i LNA,štěpená BamHI, z kultur kalusů Lactylis glomerata 1., které se odvozují od protoplastů,které byly předtím transformovány pCIB709

Řada 14 : LNA štěpená BamHI,z Lactylis glomerata L., a to kultur jako kalusů,které se odvozují z protoplastů, které byly předtím transformovány pCIB709.

Řada 15,16: LHA štěpená BamHI z kultur kalusu Lactylis glomerata I.,které se odvozují od protoplastů,které byly předtím transformovány s pCIB7O9

Sada 4 : je prázdná na V řadách 6,10,12 ukazuje zčernání filmu/příto» mnost cizí LHA,která je integrována do genomu buněk Lactylis glomerata l..Pragment obsahující 1063 Bp, který se dá očekávat přinatrávení integrovaného genu Hygromycinu plasmidem pCIB7O9 s BamHI / nukleotidy 583-1646 náležející pCIB7O9/ , je označen šipkou.

Lefinice

Pro jasné a jednoznéčné porozumění popisu a definici předmětu vynálezu jakož i v ní obsaženým pojmům, stanoví se následující definice :

Eostlinná buňka : strukturní a fyziologická jednotka rostliny, která sestává z protoplastů a buněč né stěny.

Eostlinná tkáň : skupina rostlinných buněk,která je organizována do formy strukturní a funkční jednotky.

Eostlinný orgán : omezená a viditelně diferenco

-14vaná oblast rostliny,jako například kořen,stonek, listy,poupata nebo embrya.Rostlinný orgán může být vybudován z různých typů buněk a tkání.

Protoplast : izolovaná rostlinná buňka bez buňková stěny.

Buněčná kultura: proliferanční buněčná hmota v nediferencovaném nebo částečně diferencovaném stavu.

Embryo: velmi malé a časné vývojové stádium rostliny,které se vyvíjí bučí ze zygoty / sexuální embryo/ nebo z embryogenní somatické buňky /somatické embryo / a vykazuje již stádia s rozeznatelnou morfologií, strukturou a buněčnou organizací, která zahrnuje buněčná, globulérní ^kož i kotyledonní stádia / vývoj embrya kukuřice je například popsán u Randolpha,1936, vývoj embrya tráv u Browna, 1960/.

Buněčný kluster : skupina navzájem spojených buněk,které lpí na sobě; obvykle vznikají tyto buněčné klustry z jedné nebo několika málo prvotních buněk nebo prvotních protoplastů dělením buňky.

Mladá rostlina: mnohobuněěná strktura,která sestává z výhonku a kořene a vykazuje vnější formu malé rostliny.

-15Dicamba : 3,6-diohlor-2-methoxybenzoová kyselí· na

MES ϊ 2-/H-morfolin/ethansulfonová kyselina

2,4-33 : dichlorfenoxyoctová kyselina

Picloram : 4-amino-3,6,6-trichlorpikolinová ky selina

Tris-HCl: & tris/hydroxymethyl/methylaminohydro chlorid

EDTA : l-ethyldiamin-N,H,H*,E*-tetraoctová ky selina

PEG : polyethylenglykol

Agaróza : výroba a čištění agarózy je popsáno například u Guiseley a Eenn /1975/· Agaróza je součást agaru. Komerčně získatelný agar sestává normál ně ze směsi neutrální agarózy a iontového agaropek tinu,který vykazuje více bočních skupin. Prodávaná agaróza se obvykle získává známým způsobem z agaru. Při tom zůstaně obvykle zachována řada bočních řetězců, které pak určují fyzikálněchemické vlastnosti agarózy, jako například teplotu gelovatění a teplotu tání.Agaróza tající při nízkých teplotách /:low-melt ing Agarose **/ zejména Sea Plaque®^ Agarose se hodí obvzláště dobře jako ztužovací pro -16středek a rámci způsobu podle vynálezu.

SH-0 médium s médium prosté hormonů podle Schenka a Hildebrandta /1972/. /SH-médium může být kapalné nebo zpevněné 0,8 $ /hm/o agarem nebo 0,5$ / hm/o/ GelEit^ . / · Médium se normálně sterilizuje pomocí známých opatření teplem nebo v autoklávech při teplotě 121 °C a za tlaku 1,2 kg/cm² po dobu 15 až 20 minut/.

GelEit^ : GelEite Gellan Gum,Svott Laboratories lne, Teskerville, El, $ 02823

SH-30 médium : SH-0 médium se 30 uM Dicamba

SH-45 médium : SH-0 médium se 45 ůM Dicamba

KM-8p-médium : 8p médium podle Kao et al. /1975/. Toto médium může existovat kapalné nebo zpevněné agarem, agarózou nebo GelEit^ a může se vyrobit i používat právě tak dobře bez kyseliny askorbové, vitaminu A a vitamínu D.Součásti média,s výjimkou ztuíovaeího prostředku, se obvykle sterilizují pomocí filtrace filtrem s velikostí pórů 0,2 um.

EY-2-médium : médium podle Yamada et al. /1986/

OMS médium : médium podle Murashige a Skooga /1962/. Médium se může ztužit například 0,8$ /hm/o/ agarem nebo agarózou nebo 0,5$ /hm/o/ GelEit^ .

-17Pro účel použití popsaný v předložené přihlášce vynálezu může se vyrobit i tak, že vykazuje vitaminové složení B5 média podle Gamborga et al. /1968/·

Celuláza RS : Cellulase RSyXakult Honsha Co.,ltd., 1,1,19 Higashi-Shinbashi,Minato-ku,Tokyo 105,Jaj3onsko

Peatolyase Y-2^ : Seishin Pharmaceutical Co.,

Itd. ,4-13 Koami-cho,Nihonbashi,Tokyo, Japonsko

Parafili^: Parafila^ laboratory film -American Can Co., Greenwich, CT,06830,USA.

Nalgene®-Pilter /Kalge Co., Division of Sybron Corp. Rochester,New York,14602,USA

BglII : Restrikční enzym BglII $ New England Biolabs,32 Tozer Road,Beverly,MA, O1915,USA, nebo jakýkoliv jiný výrobce.

BamHI : restrikční enzym BamHI ; New Emgland Biolabs,32 Tozer Road,Beverly,MA,Ol915,USA,nebo jakýkoliv jiný výrobce

Hydrolyzát kaseinu : hydrolyzét kaseinu - enzymatický hydrolyzát z toržxxha kravského mléka,typ I, Sigma Co.,£0,Box 14508,St.louiš,M0 63178,USA.

Hygromycin Bs Cyt/otoxin: Hygromycin B,čištěný,

Kat. č. 4000&0 Clbiochem Behring Diagnostica?ha Jolla,

CA 92037,USA,Chargen č. 702296.

-18GeneScreen BluJ^ s kat. č. NEB976,NEN Research BroduJsts 549 Albany St., Boston,MA 02118,USA

TBE pufr : Tris-borátový pufr - obvykle používaný pufr při elektroforéze viz Maniatis et al./ 1982/

Spin sloupec ·. Sephadex® G25 hotový balený sloupec,kat. δ. 100402,Boehringer Mannheim Biochemieals,

B i s cataway,NJ,USA

SDS : dodecylsulfát sodný

SSC : 1,54 mM NaCl, 0,154 mM citrátu sodného,podle popisu u Maniatis et al. /1982/

CETAB : hexadecyltrimethylamoniumbromid

IBI Random Brimer Xit í Brime Time Random Brimer Xit,International Biotechnologies lne. 10,BOX 1565,New Haven,CT 07606,USA /kat. č. 77800; šarže č. 1630-01/.

V rámci tohoto vynálezu bylo možné s překvapením nyní ukázat, že rostliny z čeledi Graminae,zejména fertilní rostliny z této čeledi z podčeledi Booideae, je možné vycházeje od specifického typu protoplastů jakož i buněk a kulusů,které pochází z těchto protoplastů ,regenerovat.

Tato regenerace rostlin, zejména fertilníoh rostlin, je možná i tehdy,když protoplasty obsb^ují

-19exogenní DHA. Při tom se jedná s výhodou o LHA vestavěnou stabilně do genomu protoplastů, kterou lze v rostlinách exprimovat.

Všechny lipnicovité rostliny z podčeledi Pooxdeae je možné v rámci tohoto vynálezu použít. Výhodné jsou ale rostliny z podčeledi Pooideae,které patří k trávám, tak například všechny rody vybrané ze skupiny sestávající z Poa /lipnice/,Pestuca /kostřavy/,Dolium /jxlku/,Bromus /sveřepu/,Trisetum /trojštětu/,Agrostis /psinečku/,Phleum /bojínku/,Alopecurus /psárky/ aLactylis / srhy/.Zejména výhodné jsou rostliny Dactylis·

V rámci tohoto vynálezu jsou rovně výhodné rostliny z podčeledi Pooxdeae,které patří ke skupině málozrných obilí ,tak například všechny rody vybrané ze skupiny sestávající z Avena / oves /, Triticum /pšenice /,Secale / žito/ a Hordeum / ječmen/.

Specifický typ protoplastů >©oideae,který se dělí a vytváří buněčné kultury,které jsou schopné se regenerovat na celé rostliny, pochází z buněčných kultur,zejména z embryogenních buněčných kultur. U embryogenních buněčných kultur se jadná s výhodou o embryogenní suspensní kultury a kalusové kultury. Buněčné kultury se mohou vyrobit ze vhodných částí rostlin z podčeledi Pooxdeae. Pod pojmem vhodné čá-20sti rostlin se v rámci tohoto vynálezu rozumí napři klad bazální části mladých, uvnitř ležících listů , nezralá sexuální embrya , nezralá květenství , zralá semena , nebo tkáně klíčků, které pochází z rošt lin podčeledi Pooideae , aniž by se omezovaly pouze na tyto.

Způsobový krok A: výroba embryogenních suspensí z rostlinné tkáně

Při výrobě embryogenního kalusu se vychází ze vhodné části rostliny z podčeledi Pooideae, zpravidla z bazální části mladého listu. Obvzláště vhodné jsou mladší , uvniř ležící listy rostlin z podčeledi Pooideae. Uvedený způsobový krok se může provádět analogicky jak to popsal Hanning et al. /1982/ pro Dactylis glomerata I. Způsob,který popisuje není omezen na tento druh, nýbrž může se použít i pro ostatní rostliny z podčeledi Pooideae.Uvedená pu blikače je ve formě reference částí předloženého vynálezu.

listy se rozřežou například na malé úseky nebo segmenty 1 mm až 5 nm dlouhé nebo o průměru 1 mm až 5 mm. Tvar ani velikost těchto kousků listů není kritická.Segmenty se rozprostřou na médiu,vhodném pro indukci a zachování kalusu a na tomto médiu se

-21kultivují až do vytvoření kalusu a/nebo embryogenních struktur.Médium vhodné pro tento ušel je například SE-médium /Sohenk a Eildebrandt,l972/ se 30 uM Dieamba a 0,8% /hm/o/ agarem nebo agarózou jako gelatinačním prostředkem.Další vhodná média jsou popsána Georgem et al./1987/. Kalus a/nebo embryogenní struktury se objeví zpravidla 2 až 6 týdnů po rozprostření· Iniciace a uchování kalusu se může provádět na světle, avšak výhodně ža tmy, při teplotě mezi 0 °C až 50 °C , s výhodou při teplotě mezi 20 °G až 32 °C a zcela výhodně při teplcriě mezi 25 °C až 28 °C. Embryogenní kalus se může vyrábět i pomocí jiných známých způsobů,které popsali například Itihrs a 18rz /1987/ jakož i v referátech obsažených v této práoi pro ječmen.Uvedené způ soby se mčhou používat i pro jiné rostliny z poděeledi Pooideae a tvoří v odpovídající formě referátu součást tohoto vynálezu·

Základ embryogenních. suspensních kultur začíná tím,že se čerstvé kusy embryogenního kalusu dají do vhodného kapalného média,například 0,5 g kalusu do 50 ml kapalného média podle Grye et al. / l985/»které obsahuje 45 uM Dicamba a 4 g/1 hydrolyzátu kaseinu. Další vhodná média jsou popsána například u George et al. /l987/.Suspensní kultury rostly při teplotě mezi 10 °C až 40 °C, s výhodou meti 20 °C až 32 °C a obvzláště výhodně pak při teplotě mezi 25 °C až 30 °C. Během kultivační periody může být výhodné střídání fází světla a tmy. Suspense se s výhodou kultivuje při 5 až 20ti hodinové periodě sÝětla, s výhodou ale při 16ti‘ hodinové periodě světla,následované 5 až 20 t4 hodinovou , s výhodou ale 8mi hodinovou periodou tmy.Intenzita světla se pohybuje charakteristicky mezi 0,1 uE/m²s až 100 uE/m²s / E » einsteinjm « metr; s = sekunda / s výhodou ale mezi 30 uE/m s až 80 uE/m s. Eovněž je výhodné když se suspensí během fáze kultivace pohybuje.Pohyb suspensí se může provádět například v Lelongových lahvích,které jsou utěsněny filmem z plastu ptopustným pro světlo a plyn nebo jakýmkoliv jiným libovolným vhodným uzávěrem ,na kruhové třepačce při rychlosti otáček 100 Upm až 150 Upm.Asi po třech až pěti týdnech ée nechají větší aglomeráty buněk asi 30 sekund sedimentovati,horní vrstva,která obsahuje jen malé shluky buněk se odstraní a tento se přenese pro iniciaci nových kultur do čerstvého média.

Tyto způsobové kroky se mohou periodicky, s výhodou každé 3 až 4 týdny opakovat,přičemž se použí-23vají jen ty kultury,které slibují největší úspěch,měřeno co se týká malé velikosti jakož i kvality buněčných hrudek. To 4 až 20, zpravidla po 6 až 8 pěeno šech / transferech / jsou suspense v podstatě prosty neembryogenních buněk a většina embryogenních buněčných aglomerátů vykazuje charakteristickou velikost 150 um až 2*000 um.

Obvzláště výhodný je v rámci vynálezu způsob,kte· rý vede k výrobě embryogenních suspensá ,které vykazují v první řadě malé preembryonální hmoty buněk.Podíl preembryonálních buněčných hmot se může zvýšit významně ještě tím,že se nejdříve nechá sedimentovat větší materiál a nakonee se znovu kultivuje jen část suspense nacházející se nahoře.

Předmět vynálezu se tedy týká embryogenní buněčné kultury, suspensní kultury nebo kalusové kultury, které se odvozují od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae a mohou se izolovat z protoplastů, přičemž uvedené protoplasty jsou schopny regenerovat buněčné stěny, dělit se a vytvářet kalus. Uvedený kalus se pak může regenerovat na celou rostlinu, zejména ale na celou fertilní rostlinu.

Obvzláště výhodné jsou v rámci předloženého vyná lezu embryogenní buněčné kultury / suspensní kultury

-24a kalusové kultury/ trav, zejména trav vybraných z rodů sestávajících z Poa, Pestuca,lolium,Bromus,Trise tum, Agrostis, Phleurn, Alopecurus a Dactylis. Obvzláště výhodné jsou buněčné kultury Dactylis glomerata

Další výhodné předměty v rámci předloženého vynálezu se týkají embryogenníoh buněčných kultur /suspensních a kalusových kultur / malozrných obilí,zejména obilí vybraného z rodů sestávajících z Avena,Triticum, Secale a Hordeum.

Další předmět předloženého vynálezu se týká em bryogenního kalusu,který se odvozuje od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae a může se izolovat z protoplastů,přičemž uvedené protoplasty jsou schopné regenerovat buněčné stěny,dělit se a vytvářet kalus,který se pak sám může regenerovat na celé rostliny s výho duu ale na celé fertilní rostliny.

Obvzláště výhodný je v rámci předloženého vynálezu kalus trav, zejména trav vybraných z rodů sestávajících z Poa, Pestuca,Xolium ,Bromus,Trisetum,Agrostis, Phleurn, Alopecurus a Dactylis. Obvzláště výhodný je embryogenní kalus Dactylis glomerata 1.

Další předmět v rámci předloženého vynálesu se týká embryogenního kalusu,který se odvozuje od malozrných trav, zejména od obilí vybraného z rodů sestá-25vajících-z Avena, Triticum, Seeale a Hordeum.

Předkládaný vynález zahrnuje rovněž lipnicovité restliny, zejména ale fertilní lipnicovité rostliny, z podčeledi Pooideae a jejich rozmnožovací materiál, který se dá regenerovat vycházeje od protoplastů,nebo rostlinných buněk , které pocházejí z embryogenní buněčné kultůry.

Způsob konzervace, za chladu / kryokonzervace / buněčných kultur / suspenzních a kalusových kultur/ u lipnicovitých

Některé rostlinné tkáně se mohou pomocí známých způsobů , které jsou popsány například u Witherse /1986/ a v něm citovaných referencích , konzervovat za chladu. Tyto způsoby nejsou ale všeobecně použi telné, zejména ne pro konzervování embryogenních buněčných kultur / suspenzních a kalusových kul tůr / lipnicovitých za chladu.

V rámci předloženého vynálezu se dalo nyní s překvapením ukázat,že je možné uchovávat embryogenní buněčné kultury, včetně suspenzních a kalusových kultur, všech rostlin z čeledi Gramineae v áuspendované formě a sice konzervací za chladu /kryokonzervací / při hlubokých teplotách.

-26Tyto způsoby konzervace embryogenních buněčných kultur , včetně suspenzních a kalusových kultur, které se odvozují od rostlin čeledi Gramineae , za /chladu , zahrnuje následující kroky ;

a/ dispergování aktivně rostoucích buněk sus penzních kultur nebo kalusu ve vhodném kapalném médiu ;

b/ ochlazení této kultury až do blízkosti teploty mrazu / asi 0 až 5 °C />

c/ smísení uvedené, předem ochlaz.ené kultury s vodným roztokem vhodného prostředku chránícího kulturu před mrazem při přibližně stejné teplotě ;

d/ ochlazování rezultující směsi v pravidelných časervých intervalech asi 0,01 °C až asi 20 °C za minutu, s výhodou ale asi o 0,2 °C až asi 2 °C za minutu a zcela nejvýhodněji o asi 0,5 °C až asi 1 °C za minutu , na teplotu mezi asi - 20 °C až asi 60 °C , s výhodou ale na teplotu mezi asi - 35 °C až asi 50 °C a nejvý hodněji na teplotu mezi asi - 38 °C až asi 44 °C .

e/ šfakové zmrazení předem ochlazené směsi v kapalném dusíku nebo v kapalném vzduchu ; a f/ uchovávání hluboko zmrazené směsi při teplotě pod - 100 °C, s výhodou při teplotě kapalného dusíku nebo kapalného vzduchu.

Uvedený způsob konzervace embryogenních buněčných kultur / suspensních kultur a kalusovýbh kultur/ za chladu je obecně použitelný pro všechny rostliny z čeledi Gramineae, jak rostlin z podčeledi Bambusoi deae / například bambus/ Andropogonideae /například Saocharum,Sorghum a Zea /,Arundineae / například Bhrag mites/,Oryzoideae / například Oryza/, Panicoideae /například Panicům, Pennisetum a Setaria /, tak i rostlin z podčeledi pooideae / například trávy včetně Poa, .lestuca,3jolium,Bromus,Trisetum,Agrostis,Phleum , Alopecurus a Dactylis nebo malozrné obilí včetně Avena Tritieum, Secale, a Hordeum/, aniž by se omezoval pouze na uvedené rostliny.

Obvzláště výhodnou cílenou skupinu uvnitř čeledi Gramineae tvoří shora blíže charakterizované skupiny Pooideae,které se skládají z tráv a maloxrného obilí.

Při typickém provedení způsobu podle vynálezu se nejdříve vhodné množství aktivně rostoucího kalusu nebo aktivně rostoucích buněk suspenzních kultur / normálně 1 až 40 dní, s výhodou ale 2 až 10 dní po nasazení následující kultury /rozpustí ve vhodném kapalném médiu.Vhodná kapalná média jsou na-28 příklad SH-0 , SH-30 nebo SH-45 médium ,OMS,KM- 8p, EY-2-médium jakož i roztoky manitu, saeharózy nebo jiného cukru a alkoholických cukrů, dále roztok aminokyseliny / gako například prolin / nebo i jednoduše i voda, aniž by se na tato uvedená média omezovala.Výhodné je médium,které je vhodné pro růst buněk nebo routok cukru nebo alkoholického cukru ve vodě. Obvykle se v 1 ml kapalného média disperguje 0,01 g až 0,1 g kalusu a tento se pak chladí na ledu.

Vhodné prostředky pro ochranu vůěi zmrznutí jsou v první řadě směsi osmoticky aktivních složek a DMSO ve vodě.Tyto se normálně před přídavkem k předem ochlazené disperzi, popsané ve způsobovém kroku /b/, rovněž předchladí na ledu,přičemž ale v tomto případě jsou přípustné i vyšší teploty,které mohou dosáhnout až teplotu místnosti. Teplota roztoku mrazuvzdorného prostředku není kritická. V této souvi slosti je vhodný například roztok 0,5 M až 2 M glycerinu^^ M až 2 M 1-prolinu a 0,5 M až 4 M roztok dimethylsulfoxidu /DMSO/ ve vodě, pH 5»6 nebo 0,5 M až 2 M glycerin, 0,5 M až 2 M roztok saeharózy a 0,5 M až 4 M roztok DMSO ve vodě při pH 5 až 7 ,aniž by toto znamenalo jakékoliv omezení.Další vhodné složky které přichází v úvahu pro použití v roztoeíoh

-29mrazuvždornýýh prostředků zahrnují cuk±, alkoholi cké cukry,aminokyseliny a polymery jako například roztoky PEG,které obsahují jako součást DMSO, se s výhodou připravují před každým použitím čerstvé nebo se ale uchovávají i hluboko zmrazené.Jiné roztoky prostředků chránících proti zmrznutí mohou být podle okolností připraveny krátce před upotřebením ,přičemž ale i v tomto případě jsou výhodné čerstvě připravené roztoky nebo zmražené roztoky.

Roztfck prostředku chránícího před zmrznutím se obvykle přidává po dobu 1 sekundy až 4 týdnů, s výhodou 1 sekundy až 1 dne a obvzláště výhodně 1 se kundu až 1 hodinu k roztoku, který obsahuje dispergované buňky suspenzní kultury nebo dispergovaného kalusu.Buňky se přivádí do styku s roztokem prostředku chránícího proti zmrznutí po vhodný časový úsek, na ledu, s výhodou 1 minutu až 2 dny, obvzláště výhodně po dobu 10 minut až 6 hodin a nejvýhodněji po dobu 30 minut až dvou hodin.Během této doby nebo po uplynutí této doby se alikvotní části pro konzervaci za chladu převádí do vhodných sterilních nádob /*vials/ nebo do jiných vhodných nádrží a tam se uchovávají obvykle na ledu.

Povrch těchto nádob se můře před přídavkem uve-30dených alikvotních částí ponořit do kapalné lázně, která vykazuje teplotu mezi 0 °C až 4 °C. Tento způsobový krok není bezpodmínečně nutný,může se ale ukázat v určitých případech jako výhodný, lázeň může sestávat z ethanolu nebo libovolného jiného vhodného chladivá, lázeň je normálně vybavena míchadlem,pomocí něhož se chladivo stále promíchává a je spojena se zařízením,které umožňuje kontrolovat chlažení chladivá ,tak aby se toto udržovalo na určité výši®

Pokud se nádoby nachází v chladivu,redukuje se teplota na určitou vhodnou výši. Vhodná výše chlazení se může pohybovat v oblasti asi 0,01 °C až asi 20 °0 za minutu, s výhodou ale v oblasti asi 0,1 °C až asi 5 °C za minutu, zcela výhodně v oblasti asi 0,2 °C až asi 2 °C a nejvýhodněji v oblasti asi 0,5 °C až aái 1 °C za minutu.Když teplota dosáhne velmi nízké hodnoty,která se obvykle pohybuje v rozmezí mezi - 20 °C až asi - 60 °C, s výhodou ale mezi asi - 35 °C až asi - 5θ °C a obvzláště výhodně mezi asi - 33 °C až asi 44 °C nádoby šokem zmrznou, tím še se ponoří například do kapalného dusíku nebo kapalného vzduchu. Optimální výchozí teplota pro ponoření do kapalného dusíku nebo kapalného vzduchu se může měnit v závislosti na použitých kulturách, zpravidla se ale pohybuje při hodnotách mezi -20 °C až - 50 °C a od -31borník v této oblasti je může velmi jednoduše zjistit. Nádoby se potom uchovávají v kapalném dusíku nebo v kapalném vzduchu a sice bučí v kapalině samotné nebo v plynné fázi,která se nachází nad ní,přičemž teplota by neměla přestoupit - 100 °C.

TJ mnoha kultur může být výhodné, když se teplota nádoby udržuje určitou dobu na trvale nízké hladině, místo toho ,aby se nádoby bezprostředně po dosažení optimální teploty,ponořily do kapalného dusíku nebo kapalného vzduchu.

Aby se opět získaly buněčné kultury schopné života,vyjmou se nádoby s kalusovým materiálem z kapalného řádného dusíku a s výhodou za/protřepávání nechají roztát v teplé vodní lázni při teplotě mezi 10 °C až 50 °C , s výhodou mezi 35 °C až 40 °C ,až všechen led roztaje.

S překvapením se v rámci tohoto vynálezu ukazuje,že nádoby,které obsahují za mrazu konzervované buňky rostlin podčeledi Pooideae, mohou roztát i ponecháním na vzduchu při teplotě místnosti,až se všeehen led roztaje .Konečně je také možné ponechat nádoby krátkou dobu několika sekund až 60 minut, s výhodou 1 až 10 minut,na ledu,předtím než se v ní nacházející materiál kalusu přenese na vhodné kultivační médium.

Obsah nádoby se rozdělí na vhodném pevném médiu.

-32Obvykle se 0,5 ml roztálé kultury převede na Petrího misku o průměru 10 cm, která obsahuje 30 ml až 50 ml kultivačního média. Pevná média se buá nalijí na se šikmení nebo se na obvodu vyhloubí vybrání, aby se zajistil odtok eventuelně zbývajících zbytků mrazu vzdorného prostředku od buněk. Buňky se mohau před nanesením na ploty , na vhodné médium, jednou nebo vícekrát promyt i kapalným kultivačním médiem nebo jakýmkoliv jiným libovolným roztokem,jako například roztokem cukru nebo roztokem alkhholického cukru,nebo roztokem aminokyseliny.

Petriho misky se potom,jak bylo shora popsáno pro embryogenní kalus, inkubují při teplotě 27 °C ve tmě .Kalus se potom dále kultivuje jako normální embryogenní kalus ,podle předloženého vynálezu.

Způsobový krok B: izolace a čištění protoplastů, které se mohou regenerovat na celé rostliny včetně celých fertilních rostlin

Vycházeje od embryogenních suspenzních kultur,získatelných způsobovým krokem A/, získají se protoplasty. Izolace a čištění protoplastů se provádí tak,že se nejdříve ze suspenzního kultivačního média izolují embryogenní aglomeráty buněk,například filtrací suspenzi kultury ze způsobového kroku A/ přes filtrační jednotku

potom inkubuje vhodným enzymatickým roztokem,který je schopen oddělit buněčné stěny bez poškození protoplastů.Enzymy se používají ve formě roztoku sterilizovaného filtrací.Všechny manipulace,které stojí v souvislosti s buněčnými nebo jinými kulturami, se provádí za sterilních podmínek a za použití sterilního materiálu. Vhodný enzymatický roztok může mít například následující složení:

Enzymatický roztok :

Celuláza 2 % / hm/o/

CaCl₂ . H₂0 7 mM

NaH/jPO^ . E₂0 0,7 mM

MES /pE 5 - 7 / glukóza / konečná koncentrace

3,0 mM

550 mOs/kg E₂0

Normálně se touto směsí opatrně pohybuje na třepačce při rychlosti otáček asi 50 otpm a slabého osvětlení / asi 5 uE/m s/, aniž by toto bylo kritické. Strá vení pokračuje při teplotě maži 0 °C až 50 °C, s výhodou mezi 10 °C až 35 °0 a nejvýhodněji mezi 26 °C až °C, až se protoplasty uvolní. Doba potřebná pro strávení činí obvykle několik sekund aš 2 dny, s výhodou 1 hodinu až 1 den a nej výhodně ji 3 až 5 hodin.

-34Uvolněné protoplasty se sbírají a čistí pomocí standardních způsobů, jako například filtrací,odstřelováním a propíráním.

Na tomto místě se může zavést další čistící krok. Při tom se protoplasty nanáší na povrch vhodného média, jako například Oí-8p-kultivačního média,které je nastaveno sacharózpu na osrnotickou hodnotu 700 mOs/kg H₂0, nebo na povrch jiných vhodných médií, která jsou popsána například u George et al. /1987/.

Po desetiminutovém odstřeSování při asi 60 g, se protoplasty,které se nacházejí v oblasti mezní plochy, sbírají. 2?otom se mohou protoplasty resuspendovat ve stejném kultivačním médiu a například pasáží ocelovým sítem / velikost ok 20 um / filtrovat.

Bez tohoto dodatečného čistícího kroku se kontaminace přípravku protoplastů s celými,nesřtrávenými buňkami pohybuje v oblasti asi 0,001 $ až 0,01 ¢.Tato hodnota se může shora popsaným čistícím krokem dále redukovat. Uvedený dodatečný způsobový krok vede ale ke značné ztrátě protoplastů,které vykazují velmi husté protoplasma.Z toho vyplývá,že účinnost platinování se může snížit až o desetinásobek,když se připojí uvedený čistící krok. Protoplasty se mohou čistit i pomocí jiných známých způsobů, jako na-35příklad shora popsanou, flotací na roztoku sacharózy nebo na jiných vhodných pufračních roztocích s velkou měrnou hmotností,jako například rozthku P®reollu^E ·

Výtěžek protoplastů a v důsledku účinnosti platinace dosahuje optimálních hodnot, když se ze suspenzní ch kultur,které se používají pro izolaci protoplastů, 1 až 30 dní , s výhodou ale 5 až 10 dní před izolací protoplastů založí následující kultury.

U shora blíže charakterizovaného enzymatického roztoku se jedná o modifikaci směsi enzymů,popsané u lu et al. /1981/,která převyšuje všechny ostatní testované roztoky enzymů a poskytují výtěžek 40 x 1Οθ až 70 χ 10⁶ protoplastů na gram čerstvé hmotnosti. Alternativně k tomu se dají i při použití 2$ /hm/o/ celulózy RS v EM-Sp médiu nebo jiném libovolném médiu,které byly například popsány u George et al. /1987/ pozoruhodné výtěžky protoplastů.Rři tom se ukazuje , že použití glukózy jako osmotika pří izolaci protoplastů jednoznačně vyniká nad použitím sacharózy a v určité míře i nad použitím manitolu_fcož se týká výtěžku a důsledku účinnosti platinování.

-36Další známé a vhodné enzymatické směsi se mohou rovněž používat při způsobu podle vynálezu.

Protoplasty,které lze získat po filtraci t.j. například po pasáži 20 um sítem s průměrnou velikostí ok 12 um až 15 um v průměru, vykazují opticky husté cytoplasma.

Předložený vynález se tedy týká i způsobu výroby protoplastů,které se dají regenerovat na celé rostliny a zejména na celé fertilní rostliny,vycházeje od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae. Tento způsob je charakterizován následujícími způsobovými kroky :

a/ izolací tkáně ze vhodných částí lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae , s výhodou z basálníeh úseků mladých uvniř ležících listů, z nezralých sexuálních embryí,nezralých květenství,zralých semen nebo tkání klíčků,nejvýhodněji ale z nejmladěích a nejvnitřněji ležících listů ;

B/ kultivací této tkáně v médiu,které je schopné indukovat tvorbu embryogenního kalusu a embryí;

c/ periodického zakládání následných kultur embryogenního kalusu a embryí na čerstvém médiu,které zajišťuje kontinuální proliferaci ;

-3Ί&/ izolace embryogenních buněčných aglomerátů po 0 až 100 a nejvýhodněji 3 až 50 přenosech / transferech ;

e/ odstranění buněčných stěn vhodnými enzymovými směsemi a izolace a šištění rezultujících proto plastů.

Další předmět vynálezu zahrnuje protoplasty /včet ně rostlinných buněk získatelných po regeneraci buněčných stěn / lipnicovitých rostlin z podčeledi Pooideae které lze regenerovat na celé rostliny a zejména na celé fertilní rostliny . Výhodné jsou protoplasty nebo buňky,které se získají bul z buněčných kultur nebo z embryogenních buněčných suspensi.

Zahrnuty jsou rovněž lipnicovité rostliny,zejména fertilní lipnicovité rostliny z podčeledi pooideae a jejich rozmnožovací materiál,které se regenerují z uvedených protoplastů nebo z uvedených rostlinných buněk.

Způsobový krok C: vypěstování kultur protoplastů a vypěstování kalusu,které lze regenerovat na celé rostliny a na celé fertilní rostliny

Vyčištěné protoplasty ze způsobového kroku b/ ha , , , se rozprostřouYve vhodném kapalném médiu nebo na Vhod-33-

ty tyty- tyty ném pevném médiu přes sebe, nezávisle na tom, zda byly uvedené protoplasty předtím zpracovány s exogenní IRA nebo ne ,/ Zpracování s exogenní DNA je popsáno podrobné v následujícím oddílu/· Pod pojmem vhodná média se v rámci tohoto vynálezu rozumí například taková média,jejichž základ tvoří KM-3-p -médium, KX-2-médium /potrykus et al·, 1979/»SH-3O médium nebo SH-45médlum a které vykazují vhodnou koncentraci cukrů a rostlinných růstových regulátorů,Výhodná média jsou O-8p«médium a SH-45 · médium,které obsahují vhodný ztužovací prostředek,Výhodným ztužovací® prostředkem je agaróza, zejména Sea Plaqu^ agaróza /BMC Corp. Marině Colloids Division,T.O. Box,Rookland,ME 04341» OSA /IPři použití Sea řlaquc® agarózy může její koncentrace činit 0,1 až 2,5 % / hm/o/, s výhodou ale 0,6 # až 1,5 $ / hm/o/»

Rozprostření protoplastů,pa médium obsahujícím agarózu,přes sebe, se může provádět analogicky jako u Shillito et al / 1983/ « v evropském patentu £p ·

129 633 / Shillito et al/, nebo u Adamse et al. / publikace 'Ί[ /1933/. Tyto rsiaxasee jsou jako reference součástí tohoto vynálezu.

Médium, ve kterém se kultivují protoplasty,může S í

obsahovat další vhodné složky,které podporují děle- í ní a tvorbu kolonie protoplastů^ těmto látkám patří ί

-39například 2,4-D ,Dicamba,Picloram nebo jiné rostlinné růstové regulátory. Vhodné rostlinné růstové regulátory jsou odborníkovi v této oblasti známy. Koncentrace těchto látek se obvykle pohybuje v oblasti 0,001 mg/1 až 100 mg/1·»

Kyselina sylicylová a její deriváty mohou podporovat dělení buněk a tvorbu kolonií protoplastů podčeledi Pooideae. K derivátům kyseliny salicylové patří , aniž by na tyto byly omezeny,0-aoylderiváty a 0-arylderiváty.K O-acyl-derivátům se počítají ,an£ž by se na tyto omezovaly, nízkoaoylové skupiny s 1 až 7, s výhodou 1 až 4 a nejvýhodněji se 2 až 3 atomy uhlíku.Pod pojmem 0-arylové deriváty se v rámci tohoto vynálezu rozumí 5ti nebo 6ti členné kruhy,které mohou být na vzájem spojeny nebo jsou samostatné,aniž by se tyto 0-arylové deriváty omezovaly pouze na ně.Kruhy mohou být nesubstituované nebo mohou být substituované jednou nebo více skupinami,včetně alkyly s 1 až 5 atomy uhlíku, 0-alkyly s 1 až 4 atomy uhlíku,halogeny /ze·, jména chloridy a bromidy/ nitroskupinami, aminoskupinami a amino skupinami, které jsou samy substituovány alkylem, který vykazuje 1 až 4 atomy uhlíku.

Deriváty kysěliny salicylové obsahují i karboxy-40ester.Výhodné karboxylestery jsou arylestery a alkyl estery,kde alkylová skupina obsahuje 1 až 4 atomy uhlí ku.

Kromě toho se pod pojmem deriváty kyseliny salioylové rozumí i ty sloučeniny,u nichž je kruh kyseliny salioylové ještě dále substituován,například jednou nebo více skupinami včetně alkylem s 1 až 4 atomy uhlí ku, 0-alkylem s 1 až 4 atomy uhlíku, halogenem / zejména chloridem a bromidem /, nitroskupinou, aminoskupinou a aminoskupinou, která je sama subtituována alkylem, který vykazuje 1 až 4 atomy uhlíku.

Výhodné sloučeniny, které podporují dělení a/nebo tvorbu kolonií protoplastů podčeledi pooideae a buněk této čeledi jsou :

kyselina O-acetoxybenzoová / Aspirin, kyselina aoetylsalicylová / kyselina O-hydroxybenzzová / kyselina salicylová / kyselina O-methoxybenzoová / kyselina methylsalicylová/ a kyselina O-dimethylkarbamoylbenzeová kyselina Z~0/C0-dí methyl/-salicylová_J7 .

Koncentrace kyseliny salioylové nebo jejich derivátů v kultivačném médiu se pohybuje s výhodou v oblasti 0,1 mg/litr až 3*000 mg/litr, s výhodou 10 mg/litr

-41až 300 mg/litr a nejvýhodně ji okolo 100 mg/litr.

Médium , ve kterém se kultivují protoplasty, múze ještě dodatečně obsahovat médium, které bylo předtím kondicionováno růstem vhodných buněk,které pochází například ze Zeamays, Dactylis glomerata nebo jiných tráv nebo i od jiných / dikotyledonních / rostlin.Výhodné je médium,ve kterém byla kultivována embryogenní suspense druhu lipnioovitých. Nejvýhodnější je médium,ve kterém byla kultivována embryogenní suspense Dactylis glomerata.Médium kondicionované shora popsaným způsobem může činit podíl mezi 0 $ až 100 ^af° / 'o/e/, s výhodou mezi 5 $ až 50 % /0/0/ a nejvýhodněji mezi 30 $ až 40 $ /0/0/ celkového média.

Protoplasty se mohou kultivovat na pevném nebo v kapalném médiu po dobu až 12 týdnů, s výhodou až 6 týdnů a nejvýhodněji I až 3 týdny, aniž by se mezi tím založily následné kultury. Ve zvláštní formě provedení předloženého vynálezu se může pevné médium vnést do kapalného média, jak je to popsáno v evropské přihlášce vynálezu EP 0 129 688 / Shillito et al./, nebo může být zpracováno jiným libovolným způsobem, který podporuje dělení buněk a/nebo tvorbu kolonií protoplastů.

-42Protoplasty se kultivují na světle , ale výhodně ve tmě při teplotě mezi 0 °C až 50 °©> svýhodou mezi 20 °0 až 32 °C a nejvýhodněji mezi 25 °C až 28 °C o χ

Intenzita světla činí obvykle 0,1 uB/m s až 200 uE/m s 2 2 s výhodou ale 30 uE/m s až 90 uE/m s.

Účinnost nanášení na plotny při použití KM-8pmédia kolísá mezi 0,5 i» až 10 v závislosti na přípravě protoplastů .Přísada 30 jž až 40 $ /0/0/ kondicionovaného suspenzního kultivačního média /suspenzní kultivační médium, kondicionované růstem v něm se nacházejících buněk a nastavené na osmotickou hodnotu 550 mOSM/kg HgO přísadou glukózy / ke kultivačnímu médiu protoplastů nevdde sice k významnému vzestupu účinnosti nanášení na plotny,ale urychluje proces dělení v mladých koloniích vzešlých z protoplastů.

U výhodné formy provedení předloženého vynálezu se protoplasty nanesou na plotny na médiu ztuženém aga rózou. První dělení buněk lze potom pozorovat asi dva dny po nanesení protoplastů na plátny . Další dělení následují// každé 2 až 3 dny · Tento pro ces dělení probíhá asynchronně , což se dá doložit skutečností,že k prvnímu dělení buněk může dojít i až po 7 dnech . 5 až 20 dní , s výhodou ale 10 až 14 dní po nanesení protoplastů na plotny , se mé -43dium ztužené agarózou rozřeže v segmenty a segmenty, které obsahují kolonie buněk, se transferují do živného média.Tento způsob je pod označením bead culture technique obecně znám a je zcela popsán u Shillito et al. /1983/» jakož i v evropské patentní přihlášce vynálezu EP 0 129 688 / Shillito et al./.

Místo toho, aby se médium zpevněné agarózou rozřezalo na segmenty, může se toto i zkapalnit a v této kapalné formě převést do kapalného živného média.Tato modifikace je popsána u Adamse et al. /1983/ a může se provádět analogicky. V obou případech / segmentování nebo zkapalnění / se může používat KM-8p-médium s glukózou a sacharózou jako kapalnými složkami médií,přičemž lze pozorovat dobrý růst kolonií.Optimální kapalná složka s ohledem na růst kolonií sestává cle z SH-45 - média se 4 g/litr hydrolyzátu kaseinu.Během asi 2 až 3 týdnů od za culture ^w početí způsobu ”bead/ lze rozeznati uvnitř desek nové suspenzní kultury.Mikroskopické zkoumání agarózových disků vypovídá, že několik kolonií položených na nejvzádlenějěím povrchu vrůstá do kapalného média a v médiu uvolňuje měnší množství buněk, zatím co zbytek kolonie zůstává dále pevně zakotven v agaróze. Nová suspenze se velmi rychle rozmnožuje

-44a po dalších dvou týdnech se tato běžným způsobem jako normální suspenzní kultury transferuje nebo se rozprostírá přes sebe na SH-30 mediích za účelem vyvinutí kalusu. V alternativní formě provedení se může agaróza rozdělit i na Petriho misky,které obsahují SE-45-médium ztužené agarózou a potom kultivovat.

Předložený vynález se týká tedy i způsobu výťoby buněčných kultur / suspensních kultur a kalusových kultur / z protoplastů lipnicovitých rostlin poděeledi Pooideae,které se mohou regenerovat na celé rostliny , zejména na celé fertilní rostliny.Tento způsob je charakterizován následujními způsobovými kroky :

a/ kultivací prtoplastů ,které pochází od lipnicovitých rostlin poděeledi Pooideae,a které se mohou regenerovat na celé rostliny,ve vhodném kultivačním médiu až k vytvoření kolonií buněk 5 b/ kultivace uvedených kolonií buněk nebo jejich částí na vhodném médiu,které podporuje tvorbu huněčnýeh kultur j a o/ izolace rezultujících kultur buněk.

Způsobový krok b/ není bezpodmínečně nutný,Stejně tak je možné poněchat protoplasty v médiu definovaném ve způsobovém kroku a/ , až do vytvoření kultur buněk nebo embryí.

-45Rovněž jsou zahrnuty lipnicovité rostliny,zejména ale fertilní lipnicovité rostliny podčeledi Rooideae a jejich rozmnožovací' materiál, které se regenerují z uvedených kultur buněk.

Výhodný předmět vynálezu představuje nanášení protoplastů na plotny na médium, ztužené agarózou, zkapalnění něho segmentace média ztuženého agarózou, přenos zkapalněného něho na segmenty rozřezaného média do kapalného živného média a kultivace až do vytvoření kolon buněk·

Výhodný je způsob u něhož části kolonií buněk , zmíněné pod způsobovým krokem a/ pocházejí z buněk nebo buněčných hmot,které byly uvolněny do kapalného kultivačního média.

Kultury kalusu a suspenzní kultury vyrobené v tom* to nebo v jiných způsobových krocích se mohou analogicky k tomu co bylo uvedeno u způsobového kroku A/ kon zervovat za chladu·

Způsobový krok D: Regenerace mladých rostlin z kalusu

Z kalusu,který byl získán z protoplastů / způsobový krok C /, zejména se jedná o drolivý, granulární kalus , se zakládají jednou nebo vícekrát, s vý

-46hodou každé dva týdny, následné kultury na čerst vém, vhodném médiu, aby se takto indukovala tvorba embryí. Vhodným indukujícím médiem je například SHmédium, s vhodnou koncentrací cukrů a regulátorů růstu rostlin.

Všechna takto vzniklá embrya, se potom přenesou na médium , které poskytuje dobré předpoklady pro indukci zrání a klíčení. Vhodná média jsou například SH- 30 médium nebo OMS-médium,které jsou modifikovány tak, že vykazují vhodné koncentrace cukrů a regulátorů růstu rostlin.Kultivace ploten se provádí na světle /^- 10 uE/m s až 200 uE/nrs ; studené bílé světlo fluorescenčních lamp nebo směs denního světla a světla Gro-luj^ / Sylvania / fluorescenčního světla. Samozřejmě se může používat i jakékoliv jiné vhodné fluorescenční světlo. 2 až 5 týdnů po rozprostření na desky se dají pozorovat první embrya. V mnoha případech může být výhodné provést jeden nebo více dodatečných transferů embryí na čerstvé médium pro jejich dozrání.Embrya se vyvíjí déle a tvoří po určité době, obvykle po 1 týdnů až 6 měsících, zejména ale po 1 až 3 měsíci, mladé rostlinky.

-47V alternativní formě provedení se z kalusu získaného z protoplastů /způsobový krok C/ ,zejména když se jedná o drolivý ,granulární kalus, se založí jednou nebo vícekrát , s výhodou každé dva týdny, ná sledné kultury, na čerstvém, vhodném médiu, aby se indukovaly takto tvorba a zrání embryí. Jedním z médií vhodným pro tento účel je, například QMS médium,které vykazuje vhodnou koncentraci/ cukrů avšak žádné regulátory rostlinného růstu ,aniž by se média omezila jen na toto médium. Kultivace desek se provádí na světle / 10 uE/m s až 200 ůE/m s; studené světlo fluorescenční lampy nebo směs denního světla a světla Gro la nebo jakéhokoliv jiného vhodného fluorescenčního světla /. Embrya se vyvíjí dále a vytvoří po určité době , obvykle po 1 /// týdnu až 6 měsících , ze jména ale po 1 až 3 měsících , mladé rostlinky.

Způsobový, krok E : Získání rostlin, s výhddou fertilních rostlin mladých rostlinek

Mladé rostlinky získané předtém při způsobovém kroku L/ se přenesou na vhodné médium, napři klad na SH-médium nebo OMS - médium bez regulátorů růstu rostlin. Alternativně k tomuto způsobu se může také přidat regulátor růstu,který stimuluje vytvoření kořenů nebo výhonků.

-48Vhodné růstové regulátory jsou odborníkovi v této oblasti známy.Mladé rostlinky se k^ultivují na tomto médiu tak dlouho,až vytvoří kořeny. Při tom je důležité, aby se každý kalus z mladých rostlinek odstranil nebot se ukázalo, že tento kalus ovlivňuje negativně růst rostlinek. Pro dosažení tohoto se mohou rošt linky ,například během přenosu, opláchnout destilovanou vodou.Kalus,který se vytváří až dodatečně ,se musí v pravidelných odstupech, s výhodou každé 3 až 30 dní a nejvýhodněji každý 1 až 2 týdny odstraňovat. Doba,která je potřebná pro vytvoření kořene, činí obvykle 1 až 4 týdny, především ale 2 týdny. Rošt linky s dobře vyvinutým systémem kořenů, se mohou přesadit do země a přenést do skleníku,kde pomalu otužují.Jako dostatečná se v této souvislosti považuje délka kořenů v rozmezí mezi 1 cm až 10 cm, zejména ale 2 až 5 cm· U výhonků se odpovídající rozsah pohybuje rovněž maži 1 cm až 10 cm a zejména pak mezi 2 cm až 5 cm. Alternativně k tomu se mouhou rostlinky i založením vždy nových následných kultur dále kultivovat in vitro v blíže neurčeném časovém rozmezí, tím že se výhonky oddělují od sebe a rostlin ky přenesou na čerstvé médium , například SH-0 médium nebo OMS médium.

-49Způsob regenerace celých lipnicovitých rostlin, zejména celých fertilních lipnicovitých rostlin z podčeledi Pooideae , podle vynálezu , je charakterizován následujícími kroky způsobu :

a/ kultivací kalusu, který se odvozuje od lipnicovitých rostlin, který se získá z protoplastů a může se regenerovat na celé rostliny , na médiu , které je schopné indukovat tvorbu embryí až vytvářet embrya} b/ kultivací embryyí na médiu,které je vhodné pro indukci zrání a klíčení uvedených embryí } a c/ kultivací vzniklých rostlinek až ke stádiu , ve kterém se tyto přesadí do země a mohou uzrát na celé rostliny.

Tvorba květů se může indukovat bul podle způsobu,který je popsán u Heide /1987/ nebo i jakýmkoliv jiným libovolným způsobem,který odpovídá požadavkům právě použitého druhu nebo odrůdy.Způsoby pro indukci květů u Pooideae jsou známy.

Semena produkovaná těmito rostlinami lze pomocí vhodného ošetření přivést ke klíčení a buč! je zasít do květináčů nebo i sterilizovat a rozprostřeít pž&s na plochu Mureshige a Skoogova média,které nevykazuje z z &

žádné růstové regulátory /QMS médium / a ztuž4JtoO,8$

-50z f© agarem nebo agarozou ,Gel Hite nebo jakýmkoliv jiným libovolným želatinačním prostředkem. Semena lze vysít i na médium,které obsahuje 10 ug/ml až 1*000 ug/ml Hygromycinu B,pomocí něhož se může prokázat dědičnost resistence vůči Hygromycinu.

Způsob regenerace fertilních lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae podle vynálezu z kalusu obsahuje tedy následující kroky způsobu :

a/ kultivaci kalusu,který se odvozuje od rostlin z podčeledi Pooideae,který se získá z protoplastů a může se regenerovat na celé rostliny, na médiu,které je schopné indukovat vytvoření embryí až tvorbu embryí ;

b/ kultivaci embryí na médiu , které je vhodné pro indukování zrání a klíčení uvedených embryí } c/ kultivaci vzniklých rostlinek až do stádia, ve kterém se tyto přesadí do země a mohou se nechat dozrát na celé rostliny j a d/ získání semen v důsledku kontrolovaného nebo otevřeného opylení .

Další předmět vynálezu se týká lipnicovitých rostlin, zejména ale fertilních lipnicovitých rostlin, z podčeledi Pooideae a jejich rozmnožovacího materiálu,které se mohou regenerovat z uvedeného

-51kalusu.

Způsobový krok P: Ošetření protoplastů exogenní LNA

Protoplasty rostlin z podčeledi Poáideae se mohou ošetřovat exogenní LNA,při kterém vzniknou buňky, které obsahují veškerou nebo část exogenní LNA sta bilně integrovanou do jejich genomu. Pod pojmem exo genní LNA ée má v rámci tohoto vynálezu rozumět každá LNA ,která se může xxxést připojit k protoplastům. Uvedená LNA může být bučí homologní nebo i heterologní ve vztahu k transformované rostlině.Exogenní LNA může obsahovat promotor,který je aktivní v rostlinách čeledi Graminae , zejména ale v rostlinách podčeledi Pooideae, nebo se může použít i promotor,který je již přítomný v genomu rostliny.Exogenní DNA může kromě thho obsahovat jeden nebo více genů,které mění genotyp, zejména ale fenotyp, reeultující buňky nebo z ní regenerované rostliny. Avšak je žá doučí,aby se sekvence genu,která kóduje jeden nebo více požadovaných proteinových produktů,exprimovala, a produkovala jeden nebo více funkčních enzymů nebo polypeptidů v rezultující buňce popřípadě rostlině.

U exogenní LNA se může jednat o chimérní gen nebo i o jeho část.

-52«

Pod pojmem exogenní DNA se má v rámci tohoto vynálezu rozumět i nekódující DNA s funkcí regulátoru, která hraje určitou roli například u regulace transkripce.

Zpracování protoplastů s exogenní DNA se může provést jedním ze způsobů popsaných v následujících publikacích :

/“ Paszkowski et al.,1984 ; evropská patentní přihláška EP 0 164 575 / Paszkowski et al/; Shillito et al., 1985 ; Potrykus et al., 1985»Ioerz et al.,1985; Promm et al.,1986 ; britská patentová přihláška GB 2,140 822 /Mettler / a Negrutiu et al., 1981/ .Tyto publikace tvoří ve formě referencí část tohoto vynálezu.

Exogenní DNA se může přidávat v jakékoliv formě, například DNA s lineární strukturou nebo DNA ve formě smyčky,zapouzdřená do liposomů,sferoplastů, jako součást jiných protoplastů,vytvářejících komplex se solemi atd., k protoplastům.Včlenění cizí DNA se může jakýmkoliv vhodným způsobem, včetně těch, které jsou po psány v publikacích uvedených shora,stimulovat.

V rámci tohoto vynálezu jsou výhodné chimér ní geny, které propůjčují transformovaným proto plastům , stejně tak jako z nich vyvinutým tkáním

-53zejména rostlinám výhodné vlastnosti, například zvýšenou rezistenci vůči pathogenům /například vůči fyto pathogenním plísním, bakteriím ,virům atd/; resistenci vůči chemikáliím /“například vůči herbicidům /například triazinům, sulfonylmočovinám, imidazolinům , triazolpyrimidinům, Bialophosu, glyfozátům atd/, insekticitidům nebo jiným biocidňm_7; resistenci vůči nepříznivým / endafiokým nebo atmosferickým / vlivům živčtního prostředí / například horku,chladu, větru, nepříznivým poměrům půdy, vlhku, suchu atd./; nebo X mohou vést i ke zvýšení tvorby rezervních a zásobních látek v listech, semenech, hlízách,kořenech, stoncích, atd. K žádoucím látkám ,které mohou být produkovány transgenovými rostlinami, lze počítat například proteiny, škroby, cukry, aminokyseliny, alkaloidy, aro matické látky, barviva, tuky atd.

Resistence vůči cytoxinům lze dosáhnout napři klad přenosem genu, který je schopen,při expresi v rostlinné buňce, dát k dispozici enzym,který detoxifikuje cytotoxin, jako například neomycintransferázu typu II nebo aminoglykosidfosfotransferázu typů IV,která přispívá k detoxikaci Kanamycinu,Eygro * myoinu nebo jiných aminoglykosidických antibiotik nebo glutathion-S-transf erázu, cytoohrom 1-450 nebo

-54jiný katabolicky účiný enzymy, o nichž je známo, že detoxifikují triaziny, sulfonylmočoviny nebo jiné herbicidy. Resistence vůči cytotoxinům se dá zprosstředkovat pomocí genu,který v rostlině exprimuje určitou formu cíleného enzymu ” / působiště účinku cytotoxinu / ,která je rezistentní vůči aktivitě cytotoxinu, jako například varianta syntázy acetohydroxykyseliny,která je necitlivá vůči inhibitorickému účinku sulfonylmočovin,imidazolinům, nebo jiným herbicidům,které vzájemně působí s tímto spe.Eifickým krokem látkové výměny j nebo varianta EPS? syntázy, která se ukazuje být necitlivá vůči inhibičnímu účin ku glyfozátu. Může být výhodné, kdyý se tyto změněné cílené enzymy exprimují ve formě, která dovolí její přenos do korektního celárního kompaitimentu, jako to bylo například ve shora zmíněném případu do chloroplastů.

V určitých případech může být výhodné,dirigo vat produkty genů do mitochondrií,vakuol,endoplastického retikula nebo do jiné oblasti buněk, dost možná, že dokonce i do interoelulárních prostor / apoplasty/.

Resistence vůči určitým třídám hub,lze dosáh nout například včleněním genu,který exprimuje v rošt·

-55liných tkáních chitinézu. Četné pro rostlinu pathogenní houby obsahují chitin jako integrální součást ve svých trukturách hyfů a spor, tak například Basidiomycetea /například sněti a Uredinales/, Asoomycetes a Bungi imperfecti / včetně Alternaria a Bipolaris,Exerophillum turcicum,Colletotricum, Gleocercospora a Cercospora/.Chitináza je schopna bránit in vitro růstu mycelia určitých pathogenů.Rostlinný který list nebo kořen/exprimuje chitinázu kostitutivně nebo i jako odpověů na vniknutí pathogenu je chráněn proti ataku velkého množství různých hub. Vždy podle situace může být konstitutivní exprese výhodná ve srovnání s indukovatelnou expresí,která u četných rostlin vzniká jako reakce na atak pathogeny, neboi chitináza je přítomna bezprostředně ve vysoké kon centraci, aniž by se muselo nejprve čekat na lag-fázi pro novou syntézu.

Resistence vůči hmyzu se může přenést například genem,který kóduje polypeptid,který je toxický pro hmyz a/iiebo larvy, jako například krystalický protein Bacillus thuringiensis /Bartoň et al., 1987} Vaeck et al. ,1987/· Druhá třída proteinů, které zprostředkovávají resistenci vůči hmyzu jsou inhibitory proteázy. Inhibitory proteázy tvoří obvykle součást rostlinných zásobních struktur /Ryan, 1973/·

-56Bylo možno prokázat , že Bowman-Birkův inhibitor proteázy , izolovaný ze sojových bobů a vyčištěný, in hibuje střevní proteázu larev Tenebrio / Birk et al. I963 /. Gen , který kóduje inhibitor trypsinu z krmné ho hrachu, je popsán Hilderem et al. /1987/.

Gen, který kóduje inhibitor proteázy , může být zaveden ve vhodném vektoru za kontroly promotoru rostliny , zejména konstitutivního promotoru , jako například GaMV 35 S promotoru /, který je popsán Odellem et al. 1985 /. Gen, například kódující sekvence z Bowman-Birkova inhibitoru proteázy ze sojo vých bobů , se může získat pomocí sDNA klonovací methody , popsané Eammondem et al. /1984/. Další možnost výroby inhibitoru proteázy spočívá v její syntéze , pokud tato vykazuje méně než 100 aminokyselin, jako například inhibitor trypsinu Phaseolus lunatus. kódující sekvence se dá předpovědět zpětným přesazením sekvence aminokyseliny. Dodatečně jsou na oba konce vestavěny restrikční místa štěpení,které jsou vhodné pro právě požadovaný vektor. Syntetický gen se vyrobí syntézou překrývajících fragmentů oligohukleotidů se 30 až 60 páry bází, tím, ž^se tyto nejdříve podrobí reakci kinázy, potom se navzájem spo jí / Maniatis et al./ a potom se klonují se vhodným

-57Pomocí sekvencování DNA může potom klon,který vykazuje insert ve správné orientaci ,být identifikován .

Pro včlenění do protoplastů se používá izolovaný plasmid DNA /Ábel, et. al.,1986/

Předložený vynález zahrnuje rovněž geny, které kódují farmaceuticky aktivní součásti,například alkaloidy, steroidy, hormony a jiné fyziologicky aktivní látky jakož i flavony, vitaminy a barviva. Ke genům, které jsou uvažovány v rámci tohoto vynálezu patří proto, aniž by se na ně omezovyla , geny specifické pro rostliny, jako například zeingy /Wienand et al.,1981/,

Specifické geny savců jako například insulinový gen, somajáfcóstatinový gen, interleucinové geny,t-PAgen /Pennica etsal. ,1983/ atd. nebo i geny mikrobiálního původu jako například ΝΤΡ II gen jakož i syn tetické geny jako insulinový gen /Itakura et al., 1975/.

Pro transformaci protoplastů se mohou vedle kódující DNA samozřejmě používat i nekódující DNA ,která vykazuje zpravidla funkci regulátoru a například může být obsažena při regulaci procesu transkripce.

Existují některé rostlinné geny , o kterých je známo, že jsou indukovány různými vnitřními a venkov-58ními faktory jako rostlinnými hormony, tepelným šokem , chemikáliemi ,pathogeny, nedostatkem kyslíku a světla.

Jako příklad regulace genů rostlinnými hormo ny lze uvést kyselinu, abscisinovou /ABS / , o kte ré je známo, že indukuje přebytek mBNAs , vznikající v bavlně během embryonální fáze.

Další příklad poskytuje kyselina giberelino vá /GA3 / , která indukuje v ricinových semenech transkripci malátsyntázy , jakož i ve vrstvách aleuronu ječmene isoenzymy oL-amylázy ·

Regulace citlivých proteinových genů sojových bobů tepelným šokem byla podrobně zkoumána . Vícehodinové zpracování rostlin při teplotě 40 °C rezultuje v syntézu de novo tak zvaných tepelně šokových proteinů. Mezitím byly izolovány mnohé z těchto genů a jejich regulace byla podrobně zkoumána. Exprese těchto genů se v první řadě kontroluje na úrovni transkripce /Shoffl et al. citováno ve Willmitzer 1988 /.Promotor hps genu byl fúzován s neomycin traasferázou II/KPT II/ genem,Při tom mohlo být dokázáno, že chimérní gen se může indukovat tepelným šokem /Spěna et al., 1985/.

Jiná třída genů indukovatelných v rastlinách

-59obsahuje světlem regulované geny, zejména nukleárně kódovaný gen malé podjednotky ribulozo-l,5-bifosfatkarboxylázy /RUBISCO/ ,Morell et al. /1985/ a Herrera -Estrella et al. /1984/ prokázali, že 5'oboustranně terminální /flankující / sekvence RUBISCO genu hrachu je schopná ,přenést indukovatelnost světlem na report éro vý gen,pokud je tenco v chimérní formě spojen s touto sekvencí.Toto pozorování se mohlo rozšířit i na jiné světlem indukované geny, jako například chlorofyl a/b- vazný protein.

Alkoholdehydrogenázové geny /adh geny/ kukuřice byly předmětem intenzivního bádání. Adhl-s gen kukuřice byl izolován a bylo dokázáno,že část 5-flankující-LNA je schopna indukovat expresi chimérního reportérového genu / například chloramfenikolacetyltransferázy; CAT/ , když se trasferovaná tkáň vystaví přechodně anaerobním podmínkám /Howard et al. 1987/.

Ve výhodné formě provedení předloženého vynálezu se protoplasty,které byly získány z rostlin podčeledě Pooideae,transformují pomocí kombinace elektroporace a zpracování polyethylenglykolem.Bezprostředně po čištění protoplastů, získaných při způsobovém kroku B/ se tyto podrobí elektroporaci /sxovn. Shillito et

-60al. ,/1985/, jakož i ER 0 164 575 /Raszkowski et al./ Rrotoplasty se po posledním opláchnutí mohou resuspendovat v elektroporačním pufru.V rámci tohoto vynálezu je vhodný například roztok manitu s přiměřenou koncentrací chloridu draselného KG1. K suspenzi protoplastů se potom přidává vodný roztok DHA. Rři specifické formě provedení tohoto vynálezu se při tom jedná o plasmid p CIB7O9 ,který hyl předem linearizován zpracováním s vhodnou restrikční endonukleázou. Rezultující směs se opatrně míchá. Rři specifické formě provedení vynálezu se přidá poloviční objem 24$ /hm/o/ roztoku REG v 0,5 M roztoku manitu a 30 mM chloridu hořečnatého MgClg. Ro důkladném promíchání se protoplasty přenesou do komory Dialogů elektroporátoru /DIA -DOG G.b.H. ,Eaffstrasse 34,D-4000 Dusseldorf 13,RRG/ a zatíží 2 až 10 pulsy, s výhodou ale 3 pulsy asi 2*000 V/cm až 5*000 cm výhozího napětí a exponenciálními konstatami tlu mění 10 usek ve 30 sekundových intervalech .Vzorek se potom přenese do Retriho misky,kde se přidá 1 $ /hm/o/ až 25 $ /hm/o/ agarózy jako želatinačního prostředku.Rrotoplasty se před ztužením agarózy rozdělí rovnoměrně přes médium. Z této kultury transformovaných protoplastů se regenerují transgenové rostliny,včetně fertilních transgenovýeh rostlin

-61z podčeledi Pooideae podle popisu v odstavcích 0/ až E/.

Při dalším výhodném provedení předloženého vynálezu se transformují protoplasty Pooideae podle methody popsané Negrutiu et al. /1987/. V tomto případě se vyčištěné protoplasty suspendují po posledním oplachu v 0,5 M roztoku manitu,který obsahuje 15 mM až 45 mM chloridu hořečnatého MgClg. DNA se přidává ve formě vodného roztoku , dále pak stejný objem 36$ /hm/o/ roztoku PEG /Negrutiu et al.,1987/. Roztok se pečlivě promíchá a inkubuje 5 až 60 minut s výhodou asi 30 minut , při teplotě 10 °C až 32 °C s výhodou při teplotě místnosti / asi 25 °C /.Během fáze inkubace se roztokem příležitostně pohybuje.

Po ukončení inkubace se protoplasty promyjí a rozloží se na plotny na vhodném kultivačním médiu.Ee vhodným kultivačním médium se počítá například EM8p-médium,aniž by se způsob omezil pouze na toto médium, s 0,3 $ /hm/o/ až 2,5 $ /hm/o/, s výhodou ale 0,6 $ /hm./o/ agarózy jako ztužovacím prostředkem. Protoplasty se před ztuhnutím agarózy rozdělí rovnoměrně po médiu. Z této kultury transformovaných protoplastů se regenerují transgenové rostliny,včetně fertilních transgenových rostlin z podčeledi Pooi deae podle popisu v odstavcích 0/ až P/.

-62Exogenní DNA výhodná v rámci tohoto vynálezu, je plasmid pCIB7O9 , znázorněný na obr. 7» v lineární for mě.

Způsobový krok G: Selekce transformovaných kolonií agarózou

Médium zpevněné/ze způsobového kroku P/ ,které obsahuje transformované protoplasty, se inkubuje na světle nebo s výhodou ve tmě po dobu 5 až 30 dní , s výhodou 8 až 15 dní a nejvýhodněji 10 dní, při teplotě 0°C aě 50 °C , s výhodou 20 °C aě 32 °C a nejvýhodněji 25 °C aě 28 °C. řevné médium se rozřeže potom například v 5 úseků a selektuje jak je popsáno u Shillito et al. /1983/» v evropské pa tentní přihlášce EP 0 129 638 /Shillito et al· /; u Shillito et al.; /1985/ nebo v evropské patentní přihlášce EP 0 164 575 /Paszkowski et al./, v*bead type culture systém '. Počet a velikost segmentů média nejsou kritické. Při specifické formě provedení tohoto vynálezu se přenesou 4 z těchto segmentů jednotlivě do vhodného média, jako například do SH-45 kultivačního média se 4 g/litr hydrolyzátu kaseinu a 20 ug/ml až 100 ug/ml Hygromycinu B. 5· segment se přenese do stejného média bez Hygromycinu / kontrola/.

-63Asi po 4 až 5 týdnech se podle předpokladu trans formované buněčné kolohie z agarózy vyříznou a kultivují se ve vhodném kultivačním médiu,jako například

SH-45 médiu,se 20 ug/ml áž 100 ug/ml Hygromycinu B , kruhové kterým se pohybuje pomocí/třepačky při rychlosti otá ček 50 otáček/min až 80 ot-Min.Po dalších 4 až 5 týdnech se všechny kolonie,které poskytuji novou suspensní kulturu,přenesou na čerstvé médium se 20 ug/ml Hygromycinu B.Z nové suspense se založí minimálně 2 další kultury v přítomnosti 20 ug/ml Hygromycinu B . Tyto se kultivují zají podmínek,které byly shora po psány,až do vytvoření kalusu.

Kalus, suspenzní kultury jakož i kultury,které se mohou získat z materiálu, vyrobeného při tomto způsobovém kroku,se konzervují chladem pomocí methodv popsané u způsobového kroku A/.

Způsobový krok H s regenerace transformovaných rostlin z podčeledi Pooideae z kalusu

Z transformovaného kalusu / způsobový krok G/ se dají s v souladu se způsobem popsaným v úseku B/ regenerovat transformované rostliny z podčeledi Booideae.

Způsob podle vynálezu dovoluje tak regenerovat

-64protoplasty, které pochází z lipnioovitých rošt lin podčeledi Pooideae, na eelé rostliny,zejména ale na celé fertilní rostliny. Tím se poprvé podařilo vestavět exogenní DNA do genomu těchto rostlin a tím změnit jejich genotyp popřípadě fenotypy.Kromě toho mohou se protoplasty spojovat intraspecificky něho interspecificky s jinými protoplasty,čímž se produkují nové kombinace nukleární DNA nebo i nové kombinace z nuklární a ex tranukleární DNA.Dále se tyto protoplasty mohou používat jako materiál schopný klonování,na kterém je možné provádět mutační a selekční kroky pro výrobu požadovaného fenotypu.

Příklady žádoucích fenotypů zahrnují resistenci vůči toxickým koneentracím přirozených nebo syntetických chemikálií, včetně insekticidů,herbicidů, fungicidů, baktericidů, těžkých kovů, solí,pathotoxinů, inhibitorů látkové výměny jakož i strukturních a funkčních analogů eelulárních metabolitů,aniž by se tento výčet omezil pouze na ně. Další příklady žá doucích fenotypů,na které lze selektionovat,obsahují resistenty vůči vlivům životního prostředí jako studeným a teplým teplotám nebo biotickým agenciím jako pathogenům.

Další příklady provedení slouží pouze pro dal-65ší ilustraci předloženého vynálezu a nemají nikterak omezovat předmět vynálezu.

Nelimitující příklady provedení

Příklad 1

Výroba embryogenních suspenzních kultur ze tkání Dactylis glomerata I. /fesHíilg3P«ee/-srha laločnatá/

Jako výchozí materiál pro embryogenní kalus slouží bazální úseky nejmladších listů rostlin srhy laločnaté /Dactylis glomerata 1./ pěstovaných ve skleníku, jak je to popsáno u Hanning et al./ 1982/ listy se povrchově sterilizují 16 ti minutovým namáčením do Cloroxova roztoku ,zředěného 1 : 10 /roztok 5,25 # /hm/o/ chlornanu sodného ; the Clorox Company,Oakland ,CA94623, USA/ a potom se za sterilních podmínek rozřežou na malé segmenty dlouhé 1 mm až 5 nim faefeo o průměru 1 mm až 5 mni. Tyto segmenty se nanesou na plotny sterilního SH-30 média,které obsahuje 0,8 $ /hrn./o/ agarózy jakožto ztužovaoího prostředku.Při teplotě kultivace asi 25 °C se během 2 až 6 týdnů po nanesení segmentů na plotny se objeví kalus a/nebo embryogenní struktury .

Jako výchozí materiál pro výrobu embryogenních suspenzních kultur slouží embryogenní kalus , z něhož

-66se asi 0,5 g / hmotnost čerstvého materiálu / vnese do 50 ml kapalného média , popsaného u Graye et al. /1985/ , které obsahuje 45 uM Licamba a 4 g/litr hydrolyzátu kaseinu.Suspenzní kultury se inkubují v

Delongovýeh lahvích ,které jsou uzavřeny kovovými B. o víčky a parafilmem , při teplotě 27 C a rytmu svět lo/tma 16 hodin světlo /40 uE/m s/ a 8 hodin tma na kruhové třepačce asi při 130 otáčkách za minutu. Asi za čtyři týdny se nechají během asi 30 sekund .sedimentovat velké buněčné aglomeráty a kžfesm potom se odebere 10 ml alikvotní části z přebytku ,který obsahuje malé shluky buněk a tyto se přenesou na 50 ml čerstvého média. Tento postup se opakuje každé 3 až 4 týdny, přičemž se vždy použije shluk buněk slibují cí největší úspěšnost, měřeno na menší velikosti shluku a lepší kvalitě ,kterou lze docílit v pří tomnosti malých buněk, bohatých na cyioplasmu.Po 5 až 8 přenosech jsou suspenze v podstatě prosté neembryogenních buněk a převážná většina embryogenních buněčných klustrů je relativně malé /150 um až 2*000 um/.

Příklad 2

Izolace a čištění protoplastů Dactylis glomerata 1.

-67Protoplasty se získají z embryogenní suspenzní kultury / příklad 1 / ,přičemž se nejdříve oddělí

- (E) buňky pomocí sterilizační filtrace přes Nalgene^ s 0,2 um filtrační jednotkou a potom se přidají v množství 0,5 g / hmotnost čerstvého materiálu / k 12,5 ml směsi protoplastů a enzymů Směs enzymů ,která sestává celulázy RS

CaCl₂ x Η₂θ

NaHgPO^ x H₂0

MES / pH 5,6 / obsažené v Petriho misce.

z mM 0,7 mM 3,0 mM glukóza / konečná koncentrace /

550 mOs/kg fí₂0 /pH 5,6, a potom se steriJ.izug.e filtrací. Směsí se pohybuje na třepačce při rychlosti asi 50 otáček za minutu pa šera /Z. 5 uE/nrs/ 4 až 5 hodin · Natrávený materiál se potom filtruje přes síto z nerez ocie / velikost ok 100 um/ a rozdělí se do 12 trubiček odstředivky,které se odstřelují 5 minut asi při 60 g až 100 g. Sediment obsahující protoplasty se potom promyje třikrát kultivačním médiem KM-8p protoplastů,které je nastaveno pomocí glukózy na osmotickou hodnotu

550 mOs/kg H₂0 . Na tomto místě lze pro další čištění protoplastů zařadit flotaci. V tomto případě se promyté prdttoplasty nanesou na povrch KM-8p-média nastaveného saoharózou na osmotickou hodnotu 700 mOs/kg H₂0

-68Po 10ti minutovém odstřelování při 60 g až 100 g se protoplasty koncentrované na mezní ploše pomocí jemných pipet seberou. Potom se protoplasty resuspendují v 1 ml až 2 ml KM-8p- kultivačního média a zfiltruje se přes sítovou mříž /20 um/ .Uvolněné protoplasty se seberou,promyjí a resuspendují pro kultivaci v KM-8p-médiu nebo i v osmoticky přizpůsobeném médiu,které je vhosné pro transformaci podle příkladu 6.

Příklad 3

Kultura protoplastů Dactylis glomeratus 1. a růst kalusu a/ Vyčištěné protoplasty se nanesou v měrné hmotnosti asi 5 x 10^ protoplastů /ml na plotny kultivačního KM-8p-média,které obsahuje 1,3 fy f&m/e/ Sea Plaqud® Agarose /PMC- Corp. Marině Colloids Diví sion,Rockland,Maine,USA/ a 30 fy až 40 fy /© /o/ kondicionovaného média.Kondicionované médium se získá ze 3 až 4 týdny starých embryogenních suspenzních kultur Dactylis glomerata I»., tím, že/ se tyto zfiltrují přes sterilní Nalgene® filter /0,2 um/, médium se nastaví přísadou glukózy na osmotickou hodnotu 550 mOsm/kg H^O a potom se znovu sterilizuje

-69pomocí filtrace . Plotny se potom inkubují ve tmě při konstantní teplotě 28 °C · Po 10 až 14 dnech se agaróza rozřeže na klínky a vnese se do 'bead culture systém '/ Shillito et al., 1983 / za použití 20 ml SH-45 suspenzního kultivačního média se 3 / hm/o/ sacharózy na 3 ml původní kultury ztužené agarózou. Plotny se dají na třepačku a pohybuje se jimi asi při 50 otáčkách za řinutu a při intenzitě osvětlení 8 ůE/m^s. Uvolněním buněk z agarózy do ji obklopujícího kapalného média dojde k vytvoření nových suspenzních kultur .Rezultující buňky,kultivované v suspenzi, se nanesou na plotny SH-30 média ztuženého agarózou a kultivují se až do vytvoření kalusu ve tmě p>ři 25 °C.

b/ Protoplasty se kultivují tak, jak to bylo prve pppsáno v příkladu 3 A/, s výjimkou, že kultivační médium obsahuje přísadu 30 mg/litr kyseliny 0-salicylové.

d/ Protoplasty se kultivují tak jak to bylo předtím popsáno v příkladech 3 a/ až 3 c/, s tou výjimkou,že kultivační médium neosahuje žádné kondicionované médium.

-70příklad 4

Regenerace rostlin Dactylis glomerata 1. z kalusu, který se odvozuje od protoplastů a/ Kalus Dactylis glomerata 1. / který lze získat způsobem podle příkladu 3/ ,který byl získán z protoplastů se kultivuje na ztuženém SH-30 médiu. Každé dva týdny se zakládají následné kultury. Všechna embrya,která se za tuto dobu vyvinou , se odeberou,nanesou se na plotnu média pro klíčení /SH-0/ p

a inkubují se na světle /45 uE/m s/ · Klíčení těchto embryí začne po 1 aě 4 týdnech. Rezultující mladé rostlinky se přenesou pro vytvoření systému kořenů na SH-médium a tam se na světle inkubují. Po dosažení stádia šesti aě dvanáctí listů přenesou se do skleníku a tam se pozvolna otužují.

b/ Kalus / který lze získat podle příkladu 3/, který býl získán z protoplastů , se kultivuje na SH-0 médiu ztuženém 0,24 / hm/o/ Gel Rite® na světle/uE/m s aě 55 uE/m s /. Každé dva týdny se zakládají následné kultury.Rezultující mladé rostlinky še přenesou tro tvorbu kořenů ma médium,které sestává ze směsi SH-0 média a OMS média v poměru 1:1, která je zpevněna kombinací sestávající z 0,12 $ /hm/o/ Gel Rit^ a 0,4 $ / hm/o/ agaru a kultivuje se na

-71světle. Po dosažení stádia šesti až dvanácti lis tů se přenesou do skleníku a tam se pozvolna otužují.

c/ Malé mladé rostlinky se tískávají , jak to bylo již dříve popsaáno v příkladech 4 a/ a 4 b/ , přenesou se na OMS médium s 0,8 $ / hm./o/ agaru a pro vytvoření systému kořenů se kultivují na světle Po dosaýení stádia šesti až dvanácti listů se přenesou do skleníku a tam se pozvolna otužují.

d/ Malé mladé rostlinky se získávají způso bem ,který byl předtím popsán v příkladu 4 a/ se přenesou pro vytvoření kořenů na směs médií sestávající z SH-0 média a OMS- média , která byla předem ztužena kombinací sestávající z 0,12 $ / hm./ó/ p

Gel Rite a 0,4 / hm./o/ agaru a na světle se kul tivují. Po dosažení stádia šesti až dvanácti listů se přenesou do skleníku a tam se pozvolna otužují.

Příklad 5

Konstrukce plasmidu pCIB7O9 ,replikonu E. coli s resistentním genem Hygromycinu exprimovatelným v rostlinách /35S/Hyg^r/

Kódující sekvence strukturního genu pro resis tenči Hygromycinu se izoluje z plasmidu plG90 Gritz a. Bavies,1983/ ve formě BamHI fragmentu

-72zahrnujícího asi 1150 hází. Plasmid plG90 se může pěstovat způsobem podle linda Gritz /“Applied Biotecknology,80 Rogers St., Cambridge,Mass. 021417 Pro konstrukci plasmidu pCIB709 se izolovaný BamHI fragment včlení do BamHI místa štěpení pCIB7O9 /Eohstein et al.,1987/. Plasmid pCIB7O9 obsahuje regulační oblast CaMV / Cauliflower Mosaic Virus/ 35S transkriptu,přičemž oblasti promotoru a terminátoru jsou odděleny singulárními BamHI místy štěpení.

Rezultující plasmid pCIB709 byl uložen u American Type Culture Collection ^z/Rockville,Mary landjUSA/ pod číslem uložení ATCC 40428.

Před použitím plasmidu pro transformaci, se plasmid pCIB709 může linearizovat zpracováním s restrikčním enzymem PvuII . Tento konstrukt potom obsahuje resistenční gen Hygromycinu / aminoglykosidfosfotransferézu typu IV/ spolu s 5^#a 3' expresAími signály CaMV 35S transkriptu z Cauliflower Mosaik Virus /CaMV/ v pCU plasmidu. Sekvence pCIB7O9 je zn ázorněna na obr. 7.

Příklad 6

Transformace protoplastů Dactylis glomerata

I. pomocí elektroporace

-73a/ Bezprostředně po čištění protoplastů se provádí elektroporace podle popisu v publikaci u Shillito et al. /1985/, za použití plasmidu pCIB7O9 χθ produkovaného na obr. 7 v linearizované formě. Protoplasty se po posledním pochodu oplachování resuspendují v měrné hmotnosti 7 x 10 protoplastů/ml v elektroporačním pufru / 0,4 M manit,6 mMMgClg /. Protoplasty se potom převedou v alikvotní části 0,7 ml do trubiček z plastu pro odstřelování /10 ml/.

Potom se přidá k trubičkám plasmid-BNA / 62 ul vody s PvuII natráveným plasmidem pCIB7O9 a telecím brzlíkem-BNA zpracovaným ultrazvukem /Sigma /v konečné koncentraci 10 ug/ml /pCIB709/ popřípadě 50 ug/ml /telecí brzlík-BNA/. Bále se přidá 0,38 ml roztoku polyethylenglykolu /roztoku PEG/ / 24 % /hm./o//

PEG 6*000 v 0,4 M manitu,30 mM MgClg, 0,1 % /hm./o/ MES / pH 5,6 / a roztok se pečlivě promíchá. Sus penze protoplastů se potom převede do komory Bia lo^ elektroporátoru a naloží 10 pulsy,které vykazují výchozí napětí 3*250 V/cm a exponenciální konstantu tlumení 10 usec a aplikují se v intervalehh 30 sekund.Vzorek se potom vyjme z komory a přenese se do Petriho misky s průměrem 10 ©m. Po přídavku ml KM-8p-média s 1,2 % Sea agarozou se

-74protoplasty rozdělí před ztuhnutím agarózy rovnoměrně přes celý povrch média.

b/ příklad 6 že výchozí napětí a/ se opakuje , s tou výjimkou, činí v tomto případě 3 '500 V/cm c/ příklad 6 a/ se opakuje s tou výjimkou, výchozí napětí činí v tomto případě 4*000 V/cm d/ příklad 6 že výchozí napětí že e/ příklad 6 výchozí napětí a/ se opakuje s tou výjimkou , činí v tomto případě 5*000 V/cm a/ se opakuje s tou výjimkou, činí v tomto případě 3*000 V/cm.

f/ příklad 6 a se opakuje s tou výjimkou, že v tomto případě činí výchozí napětí 2*500 V/cm g/ příklady 6 a až 6 f/ se opakují s tou výjimkou, že se použije PEG s molekulární hmotností 4*000, h/ příklady 6 a/ až 6 f/ se opakují s tou výjimkou, že se použije PEG s molekulární hmotností 8*000 i/ příklady 6 a/ až 6 h se opakují , s tou výjimkou , že se konečná koncentrace PEG pohybuje v roz mezí 10 $ až 30 $ / hm./o/ j/ příklady 6 a/ až 6 i/ se opakují s tuu výjimkou, že se dodatečně provede zpracování tepelným

-75šokem podle popisu u Shillito et al. /1985/ a Potrykus et al. /1935/.

Příklad 7

Transformace protoplastů Dactylis glomerata 1., pomocí zpracování polyethylenglykolem a/ přímý transfer genu zprostředkovaný PEG se provádí podle popisu Negrutiu et al. /1987/ .U použité LNA se jedná o linearizovaný plasmid pCIB7O9·

Protoplasty se po posledním opláchnutí suspendují v 0,5 M roztoku maní tu,který obsahuje 15 mM chlo ridu hořečnatého MgClg, v koncentraci 2 x 10^ na ml. Suspenze protoplastů se rozdělí ve formě 1 alikvotní části do odstředivkových trubiček z plastu /10 ml/. Před přídavkem roztoku PEG /”40 % /hm.o/_7 se nejdříve přidá ,jak bylo podrobně popsáno v příkladu 6, DNA.Roztoky se pečlivě promíchají a inkubují 30 minut při teplotě místnosti za občasného protřepání . Potom se přidá 1,4 ml promývacího roztoku a jedno tlivé součásti vnesené do trubičky se pečlivě smísí. Promývací roztok sestává z 87 mM manitu, 115 mM chloridu vápenatého CaCl₂, 27 mM chloridu hořečnatého MgCl₂39 mM chloridu draselného KOI, 7 mM Tris/HCl a 1,7 g/litr m-inositu /pH 9,0 /. V odstupech čtyř minut se přidají další 1,4 ml alikvotní části pro-76mývacího roztoku a celá šarže se nyní dobře promí chá.Trubičky se potom odstřecLují 10 minut a asi 60 g a horní oddělená část se vyhodí. Sedimentované protoplasty se vyjmou do 1 ml KM-8p-média a převedou do Retriho misek o průměru 10 cm. Ro přídavku 10 ml KM-8p-média s 1,2 $ /hm/o/ Sea Rlaqu^ agarozou se protoplasty rozdělí před ztuhnutím agarózy rovnoměrně po celém médiu.

b/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladu 7a/ , s tou výjimkou,že pE roztoku promývacího se nastaví na hodnotu pH 5,6 c/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladu 7 a/ , s tou výjimkou, že se pH promývacího roztoku nastaví na hodnotu pH 7,0 , d/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 e/, s tou výjimkou , že se použije REG, která vykazuje molekulární hmotnost 6*000 , e/ transformace se provede tak jak to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 c/ , s tou výjimkou, že použitá REG vykazuje molekulární hmotnost 2Ó00, f/ transformace se provede tak jak to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 o/ » s tou výjimkou , že použitá REG vykazuje molekulární hmibtnost

-77β'οοο, g/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 f/ s tou vyjím kou, že se dodatečně provede zpracování tepelným šokem, podle toho jak to popisuje Shillito et al. /1985 / a Potrykus et al., /1985/» h/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 g/ s tou výjimkou, že promývací roztok sestává ze 154 mM chloridu sodného HaCl, 125 mM chloridu vápenatého CaClg a 5 mM glukózy a je nastaven hydroxidem draselným KOH na pH 6,0 , i/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 g/ s tou výjimkou, že promývací roztok sestává z 0,2 M chloridu vápenatého iSaClg a 0,1 % / hm./o/ MBS a je nastaven hydroxidem draselným KOH na hodnotu pH 6,0 · j/ transfotmaoe se provádí stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 g/ s tou vyjím kou, že promývací roztok sestává z 0,2 M chloridu vápenatého CaC^ a 7 mM Tris/HCl , a je nastaven hydroxidem draselným KOH na hodnotu pH 9,0 ·

-78Příklad 8

Transformace protoplastů Dactylis glomerata 1 pomocí elektroporace nebo zpracování polyethylen glykolem a/ Transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 6 a 7 , s tou výjimkou,že se plasmid pCIB7O9 předtím než se použije proúčely transformace,stepí restrikčním enzymem BgH.

b/ Transformace se provede stejně jako to by lo popsáno v příkladech 6 a 7 , s tou výjimkou ,že se plasmid pCIB7O9 ,dříve než se použije pro účely transformace , štěpí restrikčním enzymem HindlII.

Příklad 9

Transformace protoplastů Dactylis glomerata Β. pomocí elektroporace nebo zpracování polyethylenglykolem

Transformace se provádí stejně jako to bylo popsáno v příkladech 6,7 nebo 8 , s tou vyjímkou, že se protoplasty před rozdělenímá alikvotní části do jednotlivých odstře&ovaeích trubiček pro následující transformaci nebo i po rozdělení alikvotní části a př®d přísadou BEG, zpracovávají 5 minut $ři teplotě 45 °C»

-Ί9Příklad 10

Selekce trasformovaných kolonií a/ kultivační plotny / Petriho misky / s protipplasty se inkubují 10 dní při teplotě asi 25 °C ve tmě a potom se pro následující kultivaci /'bead culture Shillito et al.,1983/ rozřežou na 5 stejně velkých kusů. 4 kusy se nyní vnesou do 20 ml SH45 kultivačního média se 4 g/litr hydrolyzátu kaseinu a 20 ug/ml Hygromycinu B. 5. kus se vnese rovněž do 20 ml stejného média,které ale neobsahuje žádný Hygromycin B a slouží jako neselektivní kontrola. Po 4 až 5 týdnech se domněle transformované kčonie buněk, získané z protoplastů, které rostly v přítomnrói Hygromycinu B, vyřežou z agarozy a přenesou do Petriho misky s průměrem 19 mm, která obsahuje 2 ml kapalného SH-45 média se 20 ug/ml Hygromycinu B. Petriho miskgnni se pohybuje na třepačce s rychlostí otáček asi 50 otáček za minutu.Po dalších 4 až 5 týdnech se všechny ty kolonie,které vykazují růst a vedou k novým suspenzím,přenesou do 125 ^ffll Erlenmayerových lahví a nepřihlížeje k přídavku Hygromycinu / 20 ug/ml se kultivují stejně jako startovací kultura.

-803/ Po jednohodinové společné inkubaci buněk a prostředku chránícího proti zamrznutí se nádoby po noří do hladiny kapalné lázně,která vykazuje teplotu 0 °C. lázeň může sestávat buň z ethanolu nebo jakéhokoliv jiného,libovolného, známého a vhodného chladivá lázeň je vybavena míchadlem,které zajištuje stálé pro míchávání chladivá a je spojeno se září zením,kj^teré umožňuje ochlazení chladi-va na kontrolovatelnou hodnotu.

4/ Pfekud se nádoby nacházejí v chladivu, redukuhodnotu je se teplota asi na/0,5 /minutu .Jakmile teplota dosáhne - 40 °C,ponoří se nádoby do kapalného dusíku a tam se uchovávají bučí. v samotné kapalině nfebo i v plynné atmosféře,která se nachází nad ní,přičemž by teplotá neměla přestoupit - 100 °C.

Příklad 16

Konzervace embryogenních buněk buněčných kultur Dactylis glomerata 1. za chladu

A/ 1/ Suspenzní kultura J# buněk Dactylis glomerata i. se přenese po 2 až 10 dnech po založení následné kultury na led a chladí se. Roztok prostředku chránícího proti zmrznutí se obvykle rovněž chladi na ledu. Prostředek chránící proti zmrznutí sestá-81vá z 1 M glycerinu, 1 Μ 1-prolinu, 2 Μ dimethylsulfoxidu /DMSO/ ve vodě,^H 5,6. Roztok chránící před zmrznutím se připravuje před kazdýín použitím čerstvý / směs glycerinu, prolinu a vody se může uchovávat hluboko zmrazená /.

2. Prostředek chránící proti zmrznutí se přidává po dobu 5 minut k suspenzi. Buňky zůstanou potom za stálého chlazení ledem jednu hodinu v chladivu. Během této doby nebo po uplynutí této doby se odeberou alikvotní části, rozdělí se do nádob a ponechají se na ledu. Nádoby se potom dále zpracovávají jak to bylo předtím popsáno v příkladu 15 pro kalus.

B/ Konzervace za chladu se provádí podle popisu který je uveden v příkladu 16 a/, s tou výjimkou, že chladivo ve způsobovém kroku /1/ sestává z 1 M glycerinu, 1 M sacharózy a 2 M DMSO ve vodě , pH 5,6.

Příklad 17

Zpětné získání kultur schopných růstu z materiálu Daotylis glomerata 1., konzervovaného za chladu

A/ 1. Obsah nádoby zpracovaný podle příkladu 15 se vyjme spolu s nádobou z kapalného dusíku.

2. Obsah nádoby se nechá roztát,tím že se nechá stát při teplotě místnosti,až // veškerý led roztaje·

-823. Obsah nádoby se rozdělí na SH-0 kultivačním p

médiu zpevněném Gel Hite nebo agarem.Při tom se zpravidla nyný rozdělí po 0,5 ml roztátého materiálu na jednu Petr ího misku / 10 cm přůměr / ,která obsahuje 50 ml až 50 ml kultivačního média.Pevná média se bučí nalijí na šikmý agar nebo se i nalijí do vyhloubení na obvodě,aby se umožnil odtok eventuelně ještě zbylého prostředku chránícího před zmrznutím od buněk.

4. Materiál se inkubuje na médiu při teplotě °C ve tmě. Růst začne po 1 až 4 týdnech. Potom se z tohoto kalusu, jak to bylo již dříve popsáno pro normální kalus, založí následné kultury.

B/ Zpětné získání kultur schopných růstu z materiálu Dactylis glomerata 1. konzervovaného za chladu se provádí podle popisu v příkladu 17/A/. Roztáni nádob při způsobovém kroku /2/ probíhá v tomto případě ale rychleji,tím že senádoba vloží do vodní lázně asi 40 °C teplé a tam ponechá dokud veškerý led neroztaje.

Příklad 18

Konzervace zea mays kalusu / kalusu kukuřice / za chladu

-83Konzervace aktivně rostoucího kalusu zea mays za chladu se provádí podle popisu uvedeného pro Dactylis glomerata 1. v příkladu 15«

Příklad 19

Konzervace embryogenních buněk suspenzních kultur zea mays za chladu embryogenních

Konzervace/buněk suspenzních kultur zea mays za chladu se provádí podle popisu pro Dactylis glomerata uvedeného v příkladech 16 A/ a 16 B/.

Příklad 20

Zpětné získání růstu schopných kultur z materiá lu zea mays konzervovaného z^chladu se provádí po dle popisu uvedeného pro Dactylis glomerata v příkladech 17 A/ a 17 B/.

Mm?

.10

Claims (52)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Embryogenní buněčná kultura ,která se odvozuje od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae a může se izolovat z protoplastů, vyznačující se tím, že uvedené protoplasty regenerují nejdříve buněčné stěny , dělí se a konečně vytváří kalus,který se může regenerovat na celé rostliny,
2. 2. Embryogenní buněčná kultura podle bodu 1 , vyznačující se tím, že se u uvedených regenerovaných rostlin jedná o fertilní rostliny ,
3. 3. Embryogenní buněčná kultura podle bodu 1 , vyznačující se tím, že se u uvedených rostlin z podčeledi Pooideae jedné o trávy nebo o malozrná obi lí.
4. 4. Embryogenní buněčná kultura podle bodu 3 , vyznačující se tím, že se u uvedených, tráv jedná o trývy vybrané z rodů sestávajících z Poa,Eestuoa ,

   -85lolium , Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum,Alopecurus a Dactylis.
5. 5. Embryogenní buněčná kultura podle bodu 3 , vyznačující se tím, ěe se u uvedených malozrných obilí jedná o obilí vybraná z rodů Avena,Triticum Secale a Hordeum.
6. 6. Protoplast nebo rostlinná buňka lipnicovité rostliny z podčeledi Pooideae, která se může re generovat na celou rostlinu.
7. 7. Protoplast nebo rostlinná buňka podle bo du 6 , vyznačující se tím, že u uvedené celé rošt liny se jedná o fertilní rostlinu.
8. 8. Protoplast nebo rostlinná buňka podle bo du 6 , vyznačující se tím, ěe obsahuje exogenní DNA stabilně vestavěnou do jejího genomu.
9. 9. Protoplast nebo rostlinná buňka podle bodu 6, vyznačující se tím, ěe obsahují exogenní DNA která je v rostlinách exprimovatelné, stabilně vestavěnou do jejich genomu.
10. 10. Protoplast nebo rostlinná buňka pddle bodu 6 , vyznačující se tím, ěe se odvozují od buněč· ných kultur.

    -8611. Protoplast nebo rostlinná buňka podle bodu 6 , vyznačující se tím,že se odvozují od embryogenních buněčných suspenzí.
11. 12. Protoplast nebo rostlinná buňka podle bodu 6 , vyznačující se tím, že pochází z tratt nebo málozraného obilí.
12. 13.Protoplast nebo rostlinná buňka podle bo du 12 , vyznačující se tím, že se u uvedených málo zraných obilí jedná o malozrnná obilí vybraná z druhů Avena, Triticum, Secale a Hordeum.
13. 14. Kalus, který se odvozuje od lipnicovitýeh rostlin z poděeledi Pooideae , vyznačující se tím, že uvedený kalus se regeneruje vycházeje z proto plastů nebo rostlinných buněk podle bodů 6 až 13 a samy o sobě se mohou regenerovat na celé rostliny.
14. 15. Kalus podle bodu 14, vyznačující se tím, že se u uvedených regenerovaných rostlin jedná o fertilní rostliny.
15. 16. Kalus podle bodu 14, vyznačující se tím, že se u uvedených rostlin jedná o rostliny z podčeledi Pooideae a to o trávy nebo malozrnná obi lí.

    -8717. Kalus podle bodu 16 , vyznačující se tím, že se u uvedených malozrnných obilí jedná o málo zraná obilí vybraná z druhů Avena, Triticum, Sebale a Hordeum.
16. 18. Buněčná kultura,která se odvozuje od li pnicovitých rostlin z podčeledi Pooideae, vyznačující se tím, že se uvedené buněčné kultury rege nerují z protoplastů nebo rostlinných buněk podle jednoho z bodů 6 až 13 a samy o sobě mohou být regenerovány na celé rostliny.
17. 19. Buněčná kultura podle bodu 18 , vyznačující se tím, že se u uvedených regenerovaných rošt lin jedná o fertilní rostliny.
18. 20. Buněčná kultura podle bodu 18, vyznačující se tím, že se u uvedených rostlin z podčeledi Pooideae jedná o trávy nebo málozraná obilí.
19. 21. Buněčná kultura podle bodu 20, vyznačující se tím, že se u uvedených malozrnných obilí jedná o málozraná obilí vybraná z druhů Avena , Triticum, Secale a Hordeum.
20. 22. Xipnicovité rostliny z podčeledi Pooideae jakož i jejich rozmnožovací materiál ,vyznačující se tím, že uvedená rostlina se regeneruje vychá-88zeje z embryogenní buněčné kultury podle jednoho z bodů 1 aš 5«
21. 23. lipnioovité rostliny z podčeledi Pooideae jakož i jejich rozmnožovací materiál,vyznačující se tím, že se uvedená rostlina regeneruje z protoplastů nebo rostlinných buněk podle jednoho z bodů 6 až 13.
22. 24. lipnioovité rostliny z podčeledi Pooideae jakož i jejich rozmnožovací materiál , vyznačující se tím, že se uvedená rostlina regeneruje z kalusu podle jednoho z bodů 14 až 17. , '
23. 25. lipnicovité rostliny z podčeledi Pooideae jakož i jejich rozmnožovací materiál,vyznačující se tím, že se uvedená rostlina regeneruje vycházeje z buněčné kultury podle jednoho z bodů 18 až 21.
24. 26. lipnicovité rostliny z podčeledi Pooideae -jakož i jejich rozmnožovací materiál podle jednoho z bodů 22 až 25 _f vyznačující se tím, že se u. uvedené rostliny jedná o fertilní rostlinu.
25. 27. lipnicovité rostliny z podčeledi Pooideae jakož i jejich rozmnožovací materiál podle jednoho z bodů 22 až 26 , vyznačující se tím, že uvedená restlina a její rozmnožovací materiál obsahuje exogenní DNA stabilně integrovanou do rostlinného

    -89genorau.
26. 28. lipnicovité rostliny z poděeledi Pooideae jakož i jejich rozmnožovací materiál podle hodu 27, vyznačující se tím, že exogenní DNA integrovaná stabilně do genomu je v rostlinách nebo rostlinných buňkách exprimovatelná.
27. 29. Rozmnožovací materiálpodle jednoho z bodů 22 až 28 , vyznačující se tím, že se u uvedeného rozmnožovacího materiálu jedná o rostlinný materiál, který se může rozmnožovat sexuelně nebo asexuelně jak in vitro tak in vivo.
28. 30. Rozmnožovací materiál podle bodu 29 , vyzná čující se tím, že se u uvedeného rozmnožovacího materiálu jedná o protoplasty,buňky,kalusy,tkáně,orgány, zygo ty, embrya nebo semena,které pochází z transgenových rostlin z podčeledi Pooideae.
29. 31. Potomstvo rostlin podle jednoho z bodů 22 až 28.
30. 32. Způsob výroby protoplastů,které se mohou regenerovat na celé rostlty ,vycházeje od lipnicovitých rostlin z podčeledi Pooideae, vyznačující se tím, že se a/ izoluje tkáň vhodných částí rostlin z pod čeledi Pooideae ;

    -90b/ tato tkáň se kultivujje v médiu, které je schopné indukovat tvorbu embryogenního kalusu nebo embryí ;

    c/ z uvedeného embryogenního kalusu a uvedených embryí se zakládají peridodicky následné kultury na čerstvém médiu,které je schopné udržet kontinuální proliferaci v chodu j d/ po 0 až 500 přenosech / transferech / se izoluje embryogenní buněčný kluster ; a c/ pomocí vhodných enzymů se odstraní buněčné stěny a izolují se rezultující protoplasty.
31. 33. Způsob podle bodu 32 , vyznačující se tím, že se protoplasty uvedených rostlin z podčeledi Pooideae mohou regenerovat na celé fertilní rošt liny.
32. 34. Způsob podle bodu 32 , vyznačující se tím, že se tkáň z kroku a/ izoluje z bazélních úseků mladých, uvnitř ležících listů, z nezralých se xuálních embryí, nezralých květenství, zralých semen nebo tkáně klíčků rostlin z podčeledi Pooideae.
33. 35. Způsob podle bodu 34, vyznačující se tím, že se tkáň z kroku a/ izoluje z nejmladších, nejvnitřněji ležících listů.

    -9136. Způsob podle bodu 34 , vyznačující se tím, že se izolace embryogenních buněčných klustrů pro vádí po 0 až 100 přenosech / transferech /·
34. 37. Způsob podle bodu 36, vyznačující se tím,

    I že se izolace buněčných klustrů provádí po 3 až 50 přenosech.
35. 38. Způsob výroby buněčné kultury,která se může regenerovat na celé rostliny,vycházeje od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, vyznačující se tím, že se a/ protoplasty nebo rostlinné buňky,které se mohou regenerovat na celé rostliny,kultivují až do vytvoření buněčných kolonií ve vhodném kultivačním médiu:

    uvedené buněčné kolonie nebo jejich části se kultivují na vhodném médiu, které podporuje tvorbu buněčných kultur ; a c/ rezultující buněčné kultury se izolují.
36. 39. Způsob výroby buněčné kultury podle bo du 38, která se může regenerovat na celé rostliny, vycházeje od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, vyznačující se tím, že se

    -92a/ protoplasty nebo rostlinné buňky ,které se mohou regenerovat na celé rostliny, kultivují ve vhod ném kultivačním médiu po dobu,která vystačí k tomu, aby se podpořila tvorba buněčných kultur, až do vytvo ření buněčných kolonií ;

    a b/ rezultující buněčné kultury se izolují.
37. 40. Způsob výroby buněčné kultury podle jednoho z bodů 38 nebo 39»vyznačující se tím, že se uvedená buněčná kultura může regenerovat na celé fertilní rostliny.
38. 41. Způsob podle jednoho z bodů 38 až 40 , vyznačující se tím, že se u uvedené kultury jedná o suspenzní kulturu.
39. 42. Způsob podle jednoho z bodů 38 až 40 , vyznačující se tím, že se u uvedené buněčné kultury jedná o kalusovou kulturu.
40. 43· Způsob podle jednoho z bodů 38 nebo 39 » vyznačující se tím, že se způsobový krok a/ pro vádí v přítomnosti agarózy jakožto ztužovacího prostředku.
41. 44. Způsob podle bodu 43, vyznačující se tím, že se médium ze způsobového kroku a/ ztužené aga-93rózou se zkapalní nebo i rozdělí na segmenty a zkapalněné agarózové médium nebo agarózové médium rozdělené na segmenty ae přenese do kapalného média a tam se dále kultivuje až do vytvoření buněčných kolonií .
42. 45· Způsob podle jednoho z bodů 38 nebo 39 , vyznačující se tím, že se u uvedených částí buněčné kolonie ve způsobovém kroku b/ jedná o buňky, které se uvolní z buněčných kolonií.
43. 46. Způsob podle jednoho z bodů 38 nebo 39 , vyznačující se tím, že // uvedené protoplasty nebo buňky obsahují exogenní DNA stabilně vestavěnou do jejího genomu.
44. 47. Způsob podle bodu 46 , vyznačující se tím, že exogenní DNA integrovaná v rostlinných buňkách je exprimovatelná.
45. 48. Způsob regenerace lipnicovitých rostlin z podčeledi Pooideae,vycházeje z kalusu, vyznačující se tím,že se a/ kalus rostlin z podčeledi Pooideae,který se odvozuje z protoplastů a mohou se regenerovat na celé rostliny,kultivují na médiu,které je schopné indukovat tvorbu embryí, aš do vytvoření emtfcyí ;

    -94b/ embrya se.kultivují na médiu,které je vhodné k indukování zráni a klíčení uvedených embryí ; a c/ rezultující mladé rostlinky se kultivují dále až do dosažení vývojového stádia,které dovolí přesazení do země.
46. 49« Způsob regenerace fertilních lipnicovitých rostlin z poděeledi Pooideae vycházeje z kalusu , vyznačující ee tím, že se a/ kalus rostlin z poděeledi Pooideae,který se odvozuje od protoplastů a může se regenerovat na celé fertilní rostliny kultivuje na médiu, které je schopné indukovat tvorbu embryí, až do vytvoření embryí ;

    b/ embrya se kultivují na médiu,které je vhodné k indukci zrání a klíčení uvedených embryí ;

    c/ rezultující mladé rostlinky se dále kultivují, až do dosázení vývojového stádia,které dovolí přesazení do země ; a d/ v návaznosti na kontrolované nebo otevřené opylení se získají semena.
47. 50. Způsob podle jednoho z bodů 48 nebo 49, vyznačující se, tím, že uvedené rostlinné buňky ,které se podílí na stavbě kalusu, obsahují exogenní DNA

    -95stabilně vestavěnou do jejich genomu.
48. 51. Způsob podle bodu 50, vyznačující se tím, že exogenní LNA integrovaná v rostlinných buňkách je exprimovatelná.
49. 52. Způsob výroby transgenových lipnicovitých restlin z podčeledi Pooideae, vyznačující se tím, že se a/ protoplasty ,které se mohou regenerovat na celé rostliny transformují pomocí známých transfor maóních způsobů s exogenní LNA b/ transformované protoplasty podle jednhho z bodů 38 nebo 39 se kultivují a

    c/ celé rostliny se regenerují podle jednoho z bodů 48 nebo 49·
50. 53. Způsob podle bodu 52, vyznačující se tím, že se u uvedené exogenní LNA jedná o chimérní gen nebo o více chimérních genů,které propůjčují trnas formovaným protoplastům jakož i z nich se vyvíje jícím tkáním a zejména rostlinám výhodné vlastnosti.

    -9654. Způsob podle bodu 52, vyznačující se tím, že se u uvedené exogenní DNA jedná o nekódovanou DNA s regulační funkcí.
51. 55. Způsob podle bodu 52, vyznačující se tím , že se ve způsobovém kroku a/ používá pro transformaci protoplastů způsob přímého přenosu genu.
52. 56. Způsob konzervace embryogenních kultur,včet ně suspenzních kultur a kalusových kultur,za chladu, vyznačující se tím, že se a/ aktivně rostoucí buňky suspenzních kultur ne bo kalus dispergují ve vhodném kapalném médiu;

    b/ tato kultura se ochladí na teplotu 0 °G až

    5 °0 i c/ uvedená předchlazená kultura se smísí při stejné teplotě s vodným roztokem vhodného prostředku chránícího proti zmrznutí;

    d/ rezultující směs se v rozsahu asi G,01 °C až asi 20 °C za minutu ochlazuje až na teplotu mezi asi - 20 °C až asi - 60 °C;

    e/ předchlazená směs se nechá zmrazit šokem v kapalném dusíku nebo v kapalném vzduchu; a f/ hluboko zmražená směs se uchovává při teplotě pod - 100 °C . /

    JUDr· Ivan KQ^ÉČEIf

    Advokátní poradna \ 10

    155 04 PRAHA 1, ?ΜίΫtepu-'

    Referát TV..........·...

    Regenerace lipnicovitých rostlin z podčeledi Tooideae vycházeje z protoplastů

    A^sen-r/ se týká buněčných kultur lipnicovitých rostlin,které se mohou regenerovat na celé rostliny a zejména pak na celé fertilní rostliny.Uvedené řešení popisuje dále provedení způsobu