CN116536242A - 一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法 - Google Patents

一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，本方法：(1)利用光照培养箱进行甘蔗种茎催芽培养，10‑15天即可获得大量试验材料，与利用愈伤组织或常规桶栽相比，大大缩短了材料培养时间，解决材料培养周期长的问题；(2)利用Cellulase‑RS搭配MacerozymeR‑10进行酶解，对甘蔗酶解效率高，酶解4h即可获得大量原生质体，大大缩短了试验操作时间；(3)本方法在酶解前利用0.6mol/L甘露醇进行预质壁分离处理10min，代替常规方法中酶解时用真空泵抽真空30min的处理，缩短了试验操作时间，且简化了仪器设备；(4)本方法全程利用常规角转子离心机即可操作，无需水平离心机。(5)本方法获得的原生质体产率高、每克鲜重组织可获得约1.5×107个原生质体、原生质体活力较高，约为85.7％。

Description

一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法
技术领域
本发明属于植物原生质体技术领域，具体涉及一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法。
背景技术
原生质体是细胞壁以内各种结构的总称,也是组成细胞的一个形态结构单位，活细胞中各种代谢活动均在此进行。原生质体包括细胞膜(cell membrane)、细胞质(cytoplasm)、细胞核(nucleus)和细胞器(organelle)等。植物原生质体具有以下的特点：①无细胞壁的物理障碍；②能获得遗传性状和生理性状较一致的细胞群体；③植物原生质体同样具有全能性；④用组织培养方法可进行大量繁殖。这些有利的特征决定了原生质体是一个极好的实验体系，在植物细胞生物学上有广泛用途。可用于体细胞杂交、遗传转化、功能基因的亚细胞定位、单细胞测序等研究的理想材料。
目前甘蔗原生质体分离制备研究中，对甘蔗原生质体的获得，大多利用愈伤组织、悬浮细胞、尾梢、桶栽种植等材料获得甘蔗原生质体，且需要真空泵、水平离心机等设备。现有技术中，关于甘蔗原生质体制备方法存在下列缺陷：1、试验材料培养周期长、易造成材料浪费；2、需要抽真空、长时间酶解、反复漂洗纯化原生质体细胞等操作，操作繁琐、费时；3、对仪器设备有一定要求，如需要真空泵、水平离心机、对普通实验室不适用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，该方法利用光照培养箱在磁盘内进行甘蔗种茎催芽培养，缩短了试验材料培养周期，解决材料培养周期长的问题；该方法利用‘Onozuka’品牌的Cellulase-RS搭配MacerozymeR-10进行酶解，对甘蔗酶解效果好，酶解效率更高，酶解4h即可获得大量原生质体细胞，缩短了试验中的酶解时间；在酶解前利用0.6mol/L的甘露醇进行预质壁分离处理10min，代替常规方法中酶解时用真空泵抽真空30min的处理，一是缩短了试验操作时间，二是简化仪器设备；全程利用常规角转子离心机即可操作，无需水平离心机等设备。
为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，包括以下步骤：
S1：材料培养与初处理：
利用甘蔗种茎催芽培养获得幼嫩蔗苗，取样时从蔗苗基部切下整株幼苗，剥去外层较老的叶鞘和上部较老叶片后插入装有少量无菌水的烧杯中保鲜，得到初处理材料备用；
S2：材料预质壁分离
取无菌三角瓶，用锡箔纸或报纸包裹避光，加入甘露醇溶液后称重；进一步剥去S1获得的初处理材料的外层较老的组织，将所述材料里面幼嫩的茎叶组织用手速胡刀片快速切成细丝，切好的细丝立即放入甘露醇溶液中，再次称重；然后暗处理，得到预质壁分离材料；
S3：酶解与酶解清洗
弃甘露醇溶液，加入配好的新鲜酶解液到S2得到的预质壁分离材料中，置于黑暗下缓慢振荡酶解，得到酶解细胞液；加入W5清洗液到得到的酶解细胞液中终止酶解反应，轻轻摇晃使解离的原生质体细胞从组织上释放下来，得到原生质体细胞液；将得到的原生质体细胞液经细胞筛过滤到圆管中，加入W5清洗液并轻轻摇晃漂洗瓶内残留细丝，漂洗液经细胞筛过滤到上述圆管中，然后离心，吸弃上清，收集得到原生质体细胞；
S4：细胞低温静置恢复与收集
将上述S3得到的原生质体细胞沉淀用W5清洗液重悬，重悬后静置于冰箱或冰上恢复；然后离心收集获得原生质体细胞沉淀；
S5：原生质体镜检与活力检测
加入W5清洗液到上述S4得到的原生质体细胞沉淀中悬浮细胞获得细胞原液，在显微镜下观察原生质体情况；将获得的细胞原液稀释后，利用血球计数板镜检观察并计算细胞数量和产率；然后利用FDA染料染色，室温避光孵育后进行显微观察，分别计数明场和荧光视野下原生质体总数，并计算原生质体活力。
进一步的，所述S1中催芽培养的具体步骤为：取健康甘蔗种茎，切成单芽；在磁盘内放置两层纱布或报纸，用水湿润；然后将甘蔗种茎均匀摆放于纱布上，芽朝上；加入适量清水后置于光照培养箱进行催芽培养；所述催芽培养的培养条件为30℃；所述催芽培养的光照周期为：光照12h，黑暗12h，10-15天后苗高约为15-20cm,即可使用；所述催芽培养的幼苗，根据苗的大小，每次取5-10棵即可。
进一步的，所述S2中的细丝宽度为0.5-1mm宽；所述甘露醇溶液浓度为0.6mol/L，甘露醇溶液用量为10-15mL；所述称重记为W1,再次称重记为W2；所述暗处理时间为10min，且暗处理后甘露醇溶液弃用。
进一步的，所述S3的酶解液为新鲜配制，包含1.5％Cellulase RS(纤维素霉),0.75％Macerozyme R-10(离析酶),0.6mol/L甘露醇,20mmol/L KCl(氯化钾),10mmol/LCaCl2(氯化钙),0.1％BSA(牛血清白蛋白)，10mmol/LMES(吗啉乙磺酸)，pH＝5.7,且酶解液用量(mL)：组织鲜重(g)≈5:1，约为10-15mL；所述黑暗下缓慢振荡的转速为80-100rpm/min；所述酶解的酶解时间为4-4.5h。
进一步的，所述S3的W5清洗液为154mmol/LNaCl(氯化钠),125mmol/L CaCl2,5mmol/LKCl,2mmol/LMES，pH＝5.7；所述加入终止酶解反应的W5清洗液的体积为与所述S3中加入的酶解液为等体积，约为10-15mL；所述S3中轻轻摇晃时间为5-10s；所述漂洗细丝的漂洗次数为3-5次，每次漂洗所用的W5清洗液体积为3-5mL；所述细胞筛为70μm；所述圆管为50mL圆管；所述离心的离心转速为800-1200rpm/min，离心的离心时间为3-5min；
进一步的，所述S4的W5清洗液的体积为10mL；所述冰箱或冰上的温度为0-4℃；所述恢复的时间为30min；所述离心收集的转速为800-1200rpm/min，所述离心收集的时间为3-5min。
进一步的，所述S5中FDA(荧光素二乙酸盐)的终浓度为0.01％；所述室温避光孵育的时间为5min；所述显微观察计数原生质体数目的视野数为20-30个。
进一步的，所述S5中所述原生质体细胞的数量计数方法为统计血球计数板计数区80个小方格的细胞总数；所述的原生质体产率(Yield)的计算公式为：Yield(cells/g)＝80个小方格的细胞总数/80×400×104×稀释倍数/(W2-W1)；
本发明的另一目的在于，提供的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法在提高原生质体制备效率、获得多数量、高产率、高活力原生质体中的应用；
本发明的另一目的在于，提供的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，简化了试验操作步骤、简化了所需仪器设备，以适用于多数实验室；
本发明的另一目的在于，提供的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，应用该方法可以快速高效的分离制备甘蔗原生质体，以为后续利用原生质体进行瞬时转化验证基因功能、功能基因亚细胞定位、蛋白质互作研究、原生质体再生等奠定前提基础；
本发明的有益效果为：
本发明公开的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，通过利用光照培养箱在磁盘内进行甘蔗种茎催芽培养，10-15天即可获得大量试验材料，与利用愈伤组织、悬浮细胞或甘蔗尾梢为材料相比，与常规桶栽或大田种植培养相比，大大缩短了试验材料的培养时间，有效解决材料培养周期长、材料浪费的问题；
本发明利用‘Onozuka’品牌的Cellulase-RS搭配Macerozyme R-10进行酶解，对甘蔗酶解效率更高，酶解4h即可获得大量原生质体细胞，与常规利用Cellulase R-10搭配Macerozyme R-10进行酶解5-8h相比，进一步缩短了试验中的酶解时间,且可降低长时间酶解对原生质体造成的损伤；
本发明在酶解前利用0.6mol/L的甘露醇进行预质壁分离处理10min，代替常规方法中酶解时用真空泵抽真空30min的处理，进一步缩短了试验操作时间，且简化了仪器设备；
本发明全程利用带冷冻的角转子离心机即可操作，无需水平离心机等设备，与常规方法需要进行水平离心相比，对仪器设备要求低，更适用于大多数实验室条件。
本发明获得的原生质体产率高、每克鲜重组织可获得约1.5×107个原生质体细胞,原生质体完整性好、活性较高，约为85.7％，能满足下游基因功能验证、亚细胞定位等下游试验要求。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1为本发明所述一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法的流程图；
图2a为本发明的所述S1中催芽培养10天得到的幼嫩蔗苗放置于磁盘内的示意图；
图2b为本发明的所述S1中催芽培养10天得到的幼嫩蔗苗放置于桌面上的示意图；
图3a为本发明的所述S1中催芽培养15天得到的单株幼嫩蔗苗；
图3b为本发明的所述S1中催芽培养15天得到的单株幼嫩蔗苗取样时从蔗苗基部切下整株幼苗的示意图；
图4为本发明的所述S1中整株切下后剥去外层较老叶鞘和叶片组织获得的初处理材料的示意图(a为剥去较老叶鞘和叶片组织的爆炸示意图，b为所述S1中获得的初处理材料放置于桌面上的示意图)；
图5为本发明中所述S2中将S1获得的图4的初处理材料进一步剥去外层较老组织后将里面幼嫩的茎叶组织用手速胡刀片快速切成细丝的示意图(a为放置于滤纸上，b为放置于甘露醇溶液内)；
图6a为本发明的所述S5获得的原生质体细胞的细胞原液明场下的镜检示意图；
图6b为本发明的所述S5获得的原生质体细胞的细胞原液稀释10倍后用血球计数板计数的明场镜检示意图；
图7为本发明的所述的S5获得的原生质体细胞利用FDA染色后在荧光视野下观察细胞活力的示意图(其中发绿色荧光的呈圆形的皆为活细胞，即有活力的原生质体细胞)；
图8为本发明的所述的S5获得的原生质体细胞利用FDA染色后荧光视野与明场视野合并后的观察示意图(其中发绿色荧光的为活细胞，无荧光的为死细胞)
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合附图对实施例对本发明进行详细说明。
如图1所示：
一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，包括以下步骤：
S1：材料培养与初处理：
利用甘蔗种茎催芽培养获得幼嫩蔗苗，取样时从蔗苗基部切下整株幼苗，剥去外层较老的叶鞘和上部较老叶片后插入装有少量无菌水的烧杯中保鲜，得到初处理材料备用；
S2：材料预质壁分离
取无菌三角瓶，用锡箔纸或报纸包裹避光，加入甘露醇溶液后称重；进一步剥去S1获得的初处理材料的外层较老的组织，将所述材料里面幼嫩的茎叶组织用手速胡刀片快速切成细丝，切好的细丝立即放入甘露醇溶液中，再次称重；然后暗处理，得到预质壁分离材料；
S3：酶解与酶解清洗
弃甘露醇溶液，加入配好的新鲜酶解液到S2得到的预质壁分离材料中，置于黑暗下缓慢振荡酶解，得到酶解细胞液；加入W5清洗液到得到的酶解细胞液中终止酶解反应，轻轻摇晃使解离的原生质体细胞从组织上释放下来，得到原生质体细胞液；将得到的原生质体细胞液经细胞筛过滤到圆管中，加入W5清洗液并轻轻摇晃漂洗瓶内残留细丝，漂洗液经细胞筛过滤到上述圆管中，然后离心，吸弃上清，收集得到原生质体细胞；
S4：细胞低温静置恢复与收集
将上述S3得到的原生质体细胞沉淀用W5清洗液重悬，重悬后静置于冰箱或冰上恢复；然后离心收集获得原生质体细胞沉淀；
S5：原生质体镜检与活力检测
加入W5清洗液到上述S4得到的原生质体细胞沉淀中悬浮细胞获得细胞原液，在显微镜下观察原生质体情况；将获得的细胞原液稀释后利用血球计数板镜检观察并计算细胞数量和产率；然后利用FDA染色，室温避光孵育后进行显微观察，分别计数明场和荧光视野下原生质体总数，计算原生质体活力。
下面结合具体实施例对本发明进行说明：
实施例1
本实施例中，所述S1中催芽培养的具体步骤为：如图2所示，取健康甘蔗种茎，切成单芽；在磁盘内放置两层纱布，用水湿润；然后将甘蔗种茎均匀摆放于纱布上，蔗芽朝上；加入适量清水后置于光照培养箱进行催芽培养；
本实施例中，所述催芽培养的培养条件为：温度为30℃，光照周期为：光照12h，黑暗12h；15天后苗高约为20cm,即可使用；所述催芽培养的芽苗每次取10棵芽苗即可；
本实施例中，所述甘蔗的品种名称为云蔗05-51；
本实施例中，如图3所示，所述S2中的细丝宽度为0.5-1mm宽；所述甘露醇的浓度为0.6mol/L，用量为10mL；所述第一次称重记为W1,第二次称重记为W2；所述暗处理的时间为10min，且暗处理后甘露醇溶液弃用；
本实施例中，所述S3的酶解液为新鲜配制，包含1.5％Cellulase RS,0.75％Macerozyme R-10,0.6mol/L甘露醇,10mmol/L CaCl2,0.1％BSA，10mmol/L MES,pH＝5.7，且用量为15mL；所述黑暗下缓慢振荡的转速为80rpm/min；所述酶解的酶解时间为4h；
本实施例中，所述S3的W5清洗液为154mmol/L NaCl,125mmol/L CaCl2,5mmol/LKCl,2mmol/LMES,pH＝5.7；所述轻轻摇晃时间为10s；所述漂洗细丝的次数为3次，每次加入W5清洗液漂洗的体积为3mL；所述细胞筛为70μm，所述圆管为50mL圆管，所述离心的离心转速为1200rpm/min，离心的离心时间为5min；
本实施例中，所述S4的W5清洗液为10mL，所述冰箱的温度为4℃，静置恢复的时间为30min；所述离心转速为1200rpm/min，离心时间为5min；
本实施例中，如图所述S5的血球计数板规格为X.B.K 25，所述原生质体细胞数量计数方法为统计血球计数板计数区内四个角和中央的五个中方格(80个小方格)的原生质体细胞总数；所述的原生质体产率(Yield)计算公式为：Yield(cells/g)＝80个小方格的细胞总数/80×400×104×稀释倍数/(W2-W1)＝48/80×400×104×10/(57.2-55.6)＝1.5×107；所述W5清洗液体积为1mL；所述镜检稀释倍数为10；所述FDA染料的终浓度为0.01％，室温避光孵育时间为5min。所述细胞活力评估方法为，于明场下统计原生质体总数，再转到荧光下统计发荧光的原生质体数，即为有活力的原生质体，共统计20个视野，求平均值。原生质体活力计算公式为：原生质体活力(％)＝荧光视野下统计到的有活力的原生质体数/明场视野下统计的原生质体总数×100％＝36/42×100％＝85.7％。
实施例2
本实施例中，所述S2材料预质壁分离中，暗处理的时间为10min，对比公开号为CN202110953590的专利中的暗处理获得预质壁分离材料所需时间为0.4-0.6h，缩短了暗处理的时间。
实施例3
本实施例中，所述S1中利用甘蔗种茎催芽培养获得幼嫩蔗苗，取样时从蔗苗基部切下整株幼苗，剥去外层较老的叶鞘和上部较老叶片后插入装有少量无菌水的烧杯中保鲜，得到初处理材料备用，10-15天即可获得大量试验材料；对比公开号为CN201210391877的专利中的利用愈伤组织，取消毒后的甘蔗心叶组织，无菌条件下切成1-2cm厚的薄片，在MS3固体培养基上，28℃暗培养1-2个月；对比公开号为CN202110953590的专利中从大田采回新台糖22号8-10叶龄的甘蔗植株尾梢；大大缩短了试验材料的培养时间，有效解决材料培养周期长的问题；
实施例4
本实施例中，所述S3的酶解液为新鲜配制，包含1.5％Cellulase RS,0.75％Macerozyme R-10,0.6mol/L甘露醇,20mmol/L KCl，10mmol/L CaCl2,0.1％BSA，10mmol/LMES,pH＝5.7，且用量约为10-15mL；对比公开号为CN201210391877的专利中，需要酶解过夜，进一步缩短了酶解时间。
本实施例中，采用的酶解液对甘蔗酶解效率更高，酶解时间更短，酶解4h即可获得大量原生质体细胞，与常规利用Cellulase R-10搭配Macerozyme R-10进行酶解5-8h相比，进一步缩短了试验中的酶解时间,且可降低长时间酶解对原生质体造成的损伤。
实施例5
史晓明硕士论文“甘蔗原生质体分离与培养体系的建立和优化”，中以甘蔗蔗株尾梢为材料，酶解前利用13％CPW容易进行质壁分离0.5-1h,所用酶液涉及纤维素酶、半纤维素酶、离析酶和果胶酶4种酶，酶解5-10h。
本实施例中，利用0.6mol/L甘露醇进行预质壁分离，仅需10min；采用的酶解液只需要Cellulase RS,和Macerozyme R-10两种酶，酶解4h即可获得大量原生质体，原生质体细胞产率为1.5×107cells/g。本实施例中上述方法有效简化了试验操作、大大缩短了试验时间。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (8)

1.一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：材料培养与初处理：
利用甘蔗种茎催芽培养获得幼嫩蔗苗，取样时从蔗苗基部切下整株幼苗，剥去外层较老的叶鞘和上部较老叶片后插入装有少量无菌水的烧杯中保鲜，得到初处理材料备用；
S2：材料预质壁分离
取无菌三角瓶，用锡箔纸或报纸包裹避光，加入甘露醇溶液后称重；进一步剥去S1获得的初处理材料的外层较老的组织，将所述材料里面幼嫩的茎叶组织用手速胡刀片快速切成细丝，切好的细丝立即放入甘露醇溶液中，再次称重；然后暗处理，得到预质壁分离材料；
S3：酶解与酶解清洗
弃甘露醇溶液，加入配好的新鲜酶解液到S2得到的预质壁分离材料中，置于黑暗下缓慢振荡酶解，得到酶解细胞液；加入W5清洗液到得到的酶解细胞液中终止酶解反应，轻轻摇晃使解离的原生质体细胞从组织上释放出来，得到原生质体细胞液；将得到的原生质体细胞液经细胞筛过滤到圆管中，加入W5清洗液并轻轻摇晃漂洗瓶内残留细丝，漂洗液经细胞筛过滤到上述圆管中，然后离心，吸弃上清，收集得到原生质体细胞；
S4：细胞低温静置恢复与收集
将上述S3得到的原生质体细胞沉淀用W5清洗液重悬，重悬后静置于冰箱或冰上恢复；然后离心收集获得原生质体细胞沉淀；
S5：原生质体镜检与活力检测
加入W5清洗液到上述S4得到的原生质体细胞沉淀中悬浮细胞获得细胞原液，在显微镜下观察原生质体情况；将获得的细胞原液稀释后，利用血球计数板镜检观察并计算细胞数量和产率；然后利用FDA染料染色，室温避光孵育后进行显微观察，分别计数明场和荧光视野下原生质体总数，并计算原生质体活力。
2.根据权利要求1所述的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，其特征在于，所述S1中催芽培养的具体步骤为：取健康甘蔗种茎，切成单芽；在磁盘内放置两层纱布或报纸，用水湿润；然后将甘蔗种茎均匀摆放于纱布上，芽朝上；加入适量清水后置于光照培养箱进行催芽培养；所述催芽培养的培养条件为30℃；所述催芽培养的光照周期为：光照12h，黑暗12h，10-15天后苗高约为15-20cm,即可使用；所述催芽培养的幼苗，根据苗的大小，每次取5-10棵即可。
3.根据权利要求1所述的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，其特征在于，所述S2中的细丝宽度为0.5-1mm宽；所述甘露醇溶液浓度为0.6mol/L，甘露醇溶液用量为10-15mL；所述第一次称重记为W1,第二次称重记为W2；所述暗处理时间为10min，且暗处理后甘露醇溶液弃用。
4.根据权利要求1所述的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，其特征在于，所述S3的酶解液为新鲜配制，包含1.5％Cellulase RS,0.75％MacerozymeR-10,0.6mol/L甘露醇,20mmol/LKCl,10mmol/LCaCl2,0.1％BSA，10mmol/LMES，pH＝5.7,且酶解液用量(mL)：组织鲜重(g)≈5:1，约为10-15mL；所述黑暗下缓慢振荡的转速为80-100rpm/min；所述酶解的酶解时间为4-4.5h。
5.根据权利要求1所述的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，其特征在于，所述S3的W5清洗液为154mmol/LNaCl,125mmol/LCaCl2,5mmol/LKCl,2mmol/LMES，pH＝5.7；所述加入终止酶解反应的W5清洗液的体积为与所述S3中加入的酶解液为等体积，约为10-15mL；所述S3中轻轻摇晃时间为5-10s；所述漂洗细丝的漂洗次数为3-5次，每次漂洗所用的W5清洗液体积为3-5mL；所述细胞筛为70μm；所述圆管为50mL圆管；所述离心的离心转速为800-1200rpm/min，离心的离心时间为3-5min。
6.根据权利要求1所述的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，其特征在于，所述S4的W5清洗液的体积为10mL；所述冰箱或冰上的温度为0-4℃；所述恢复的时间为30min；所述离心收集的转速为800-1200rpm/min，所述离心收集的时间为3-5min。
7.根据权利要求1所述的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，其特征在于，所述S5中FDA的终浓度为0.01％；所述室温避光孵育的时间为5min；所述显微观察计数原生质体数目的视野数为20-30个。
8.根据权利要求1所述的一种快速高效的甘蔗原生质体制备方法，其特征在于，所述S5中所述原生质体细胞的数量计数方法为统计血球计数板计数区80个小方格的细胞总数；所述的原生质体产率(Yield)的计算公式为：Yield(cells/g)＝80个小方格的细胞总数/80×400×104×稀释倍数/(W2-W1)。
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