CN118086172A - 一种乌菜原生质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乌菜原生质体的制备方法，步骤如下：(1)取乌菜叶片于酶解液；(2)抽真空，震荡酶解；(3)细胞筛过滤酶解液，同时用WS清洗液洗涤筛上未酶解组织，收集洗涤液；(4)将过滤酶解液与洗涤液合并，离心去上清，用WS清洗液重悬沉淀，重悬后液体细胞筛过滤；留取细胞筛滤液的同时，用WS清洗液洗涤筛上残留组织，收集洗涤液；将细胞筛滤液与洗涤液合并后离心，用WS清洗液重悬沉淀，即得乌菜原生质体；(5)在离心管中加蔗糖与乌菜原生质体，离心后上清为纯化后原生质体。本发明通过比较不同酶解酶种类、浓度、酶解时间、离心率等因素，优化出乌菜原生质体制备的最适条件，为乌菜改良育种提供新途径和新思路。
Description
技术领域
本发明涉及植物细胞学领域，尤其涉及一种乌菜原生质体的制备方法。
背景技术
乌菜(Brassica campestris L.ssp chinensis var.rosularis Tsen et Lee)是十字花科芸薹属不结球白菜的一个变种，有近千年的栽培历史。乌菜口感鲜美，营养价值极高，富含多种维生素、蛋白质、纤维、碳水化合物及矿物质等，具有滑肠、疏肝、利五脏之效，因此具有较高的开发应用价值。目前，乌菜进行新品种选育主要通过自然选育、杂交选育等传统育种手段，这些方法耗时长、且育种效率低。因此，迫切需要利用现有生物技术加快育种进程，利用遗传转化的方法创新种质资源。
植物原生质体，是指去除细胞壁的单细胞，具有一定的繁殖能力，在适当的培养条件下，能够通过再生细胞壁来发育成完整的植株，所以它是一种较好的遗传研究物质和理想的植物育种材料。原生质体的分离方法主要有机械分离法、酶解分离法。目前在植物中应用较多的是酶解法，酶的种类、酶浓度、渗透压、酶解时间、离心力等因素，皆会对原生质体的产量和活率造成一定影响。
目前，关于乌菜原生质体制备的技术信息十分匮乏，因此，需要建立一种乌菜原生质体的制备体系，实现外源基因的高效导入和快速表达，为乌菜改良育种提供新途径和新思路。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种乌菜原生质体的制备方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种乌菜原生质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)取乌菜叶片，置于酶解液中；所述酶解液成分如下：0.5％～2.0％纤维素酶，0.5％～2.0％离析酶，0.1％～0.5％果胶酶，0.4～0.8mol/L甘露醇，10～20mM的MES，4～10mM的KCl，5～10mM的CaCl2，0.3％～0.5％ PVP-40，0.1％～0.5％BSA，0.02％～0.04％的DMSO，2～5mM的MgCl；
(2)将装有组织材料与酶解液的离心管于暗处抽真空；抽提结束后，置于25～30rpm的摇床上震荡酶解1～3h；
(3)酶解结束后，用50～75um细胞筛过滤酶解液；同时，用WS清洗液洗涤细胞筛上的未酶解组织，收集洗涤液；
(4)将步骤(3)所得过滤酶解液与洗涤液合并后，100～300g/min条件下离心4～6min；离心后去上清，并用WS清洗液重悬沉淀，重悬后的液体经30～50um细胞筛过滤；留取细胞筛滤液的同时，用WS清洗液洗涤细胞筛上残留组织，并收集洗涤液；将所述细胞筛滤液与洗涤液合并后，100～300g/min条件下离心4～6min，弃上清，用WS清洗液重悬沉淀，即得乌菜原生质体；
(5)在离心管中加入10％～20％的蔗糖溶液以及步骤(4)所得乌菜原生质体；离心后，上清即为纯化后的原生质体。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，选取苗龄30天的乌菜植株，将其叶片用刀片切成1mm宽细丝，转移至分装有酶解液的离心管中，叶片与酶解液的质量体积比为1：(5～10)。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，酶解液成分具体如下：1.5％纤维素酶，0.75％离析酶，0.2％果胶酶，0.5mol/L甘露醇、10mM的MES，5mM的KCl，10mM的CaCl2，0.4％的PVP-40，0.1％的BSA，0.03％的DMSO，3mM的MgCl。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中，真空抽提压强为0.06Mpa，时间为10min；摇床震荡摇速为25rpm，震荡时间为1.5h。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中，所用细胞筛规格具体为70um。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中，过滤酶解液与洗涤液合并后，具体离心方法为：4℃、150g离心5min后，去上清，沿管壁加入WS清洗液重悬沉淀，重悬后的液体经40um细胞筛过滤。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)和(4)中，WS清洗液成分为：0.2～0.6mol/L甘露醇，0.5％ BSA，0.3％谷胱甘肽；优选为0.4mol/L甘露醇，0.5％BSA，0.3％谷胱甘肽；
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，蔗糖溶液为15％，离心条件为4℃、200g、5min。
作为本发明的优选方式之一，还包括步骤(6)原生质体活力测定和计数；其中，通过台盼蓝溶液检测原生质体活力，通过血细胞计数板检测原生质体浓度。
作为本发明的优选方式之一，通过所述台盼蓝溶液检测原生质体活力时：将0.4％台盼蓝染液与0.8mol/L甘露醇1:1混合，再与原生质体悬浮液以体积比9:1混合均匀。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明通过比较不同酶解酶种类、浓度、酶解时间、离心率等因素，优化出对乌菜原生质体制备提取的最适条件，有效提高乌菜原生质体的产量和活力，为乌菜改良育种提供新途径和新思路；
(2)本发明在相应步骤获得目标细胞筛滤液后，留取细胞筛滤液的同时，进一步采用WS清洗液洗涤细胞筛上残留组织，并收集洗涤液，此方法可获得大量乌菜叶片原生质体；
(3)本发明在初步获得乌菜原生质体后，增加蔗糖界面离心纯化的步骤，可进一步去除微小细胞碎片，所得原生质体纯度较高，后续作为转基因材料进行瞬时转化或作为单细胞测序的基础，将对乌菜耐寒、耐热、耐抽薹等特点的育种研究具有重大意义。
附图说明
图1是实施例3中乌菜叶片材料的外貌图；
图2是实施例3中纯化后乌菜原生质体在10×光学显微镜下形态图；
图3是实施例3中纯化后乌菜原生质体在40×光学显微镜下形态图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例实验前，应进行如下的前期准备：
使用到实验用具如镊子、解剖刀片、玻璃培养皿、细胞筛、滤膜、枪头等需经121℃高温灭菌20分钟；超净工作台用75％的酒精擦拭后，紫外灯照射30min，通风10min。
配置相应配方的酶解液：先将纤维素酶、离析酶、果胶酶、甘露醇、MES、KCl、PVP-40混合酶液于55℃水浴锅中活化10min，冷却至室温后，加入BSA、DMSO、MgCl、CaCl2，调节pH至5.7，经0.45um微孔滤膜过滤除菌后备用。
配置相应配方的WS清洗液、蔗糖溶液、台盼蓝染液。
选取苗龄30天的乌菜植株，确定叶片取样位置后，剪刀剪下，用蒸馏水冲洗干净表面杂质，吸水纸擦干，置于蒸馏水中备用。
实施例1
本实施例的一种乌菜原生质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)酶解液裂解
取苗龄30天的乌菜叶片，经前期处理后，对其表面消毒，随后置于玻璃培养皿上，用刀片切去叶缘叶脉，剩余组织切成1mm宽的细丝；将10mL酶解液加入到50mL离心管中，称取2g叶片细丝放入酶解液中。
本实施例酶解液成分：0.5％％w/v的纤维素酶(R-10)，0.5％w/v的离析酶(R-10)，0.1％w/v的果胶酶(Y-23)，0.4mol/L的甘露醇，10mM的MES(pH5.7)，4mM的KCl，5mM的CaCl2，0.3％的PVP-40，0.1％的BSA，0.02％的DMSO，2mM的MgCl。
将装有组织材料与酶解液的离心管置于真空泵中抽真空，真空抽提压强为0.06Mpa，时间为10min。抽提结束后，用锡纸包裹，置于25rpm的摇床上震荡酶解1h，期间每隔30min用宽口枪头轻柔吹打，并取样于显微镜下观察细胞释放程度。
(2)收集原生质体
把50um细胞筛放置于新50mL离心管上，加入少量WS润洗细胞筛和管；用宽口枪头轻柔吹打酶解结束后的酶解体系10次，以释放原生质体，随后用宽口枪头将其转移至前述润洗后的细胞筛过滤酶解液；全部转移后，用10mL注射器的活塞轻柔上下按压细胞筛上的未酶解组织10次，之后加2mL的WS清洗液(0.2M甘露醇，0.5％w/v的BSA，0.3％的谷胱甘肽)清洗未酶解组织，重复1次，收集洗涤液。
将所得过滤酶解液与洗涤液合并后轻柔颠倒混合均匀，4℃、100g/min条件下离心4min；离心后去上清，用宽口枪头沿管壁加入1mL的WS清洗液(0.2M甘露醇，0.5％w/v的BSA，0.3％的谷胱甘肽)重悬沉淀，重悬后的液体经30um细胞筛过滤；留取细胞筛滤液的同时，继续用WS清洗液洗涤细胞筛上残留组织，并收集洗涤液；将所述细胞筛滤液与洗涤液合并后，4℃、100g/min条件下离心4min，弃上清，用WS清洗液重悬沉淀，即得乌菜原生质体。
(3)纯化原生质体
在15mL尖底离心管中加入5mL10％的蔗糖溶液，将上述步骤所得的乌菜原生质体沿管壁轻柔吸至蔗糖溶液上；4℃、200g/min离心5min后，上清即为纯化后的原生质体，吸入干净管中置于4℃保存备用。
(4)原生质体活力测定和计数
台盼蓝溶液检测原生质体活力：将0.4％台盼蓝染液与0.8M甘露醇1:1混合，再与原生质体悬浮液以体积比9:1混合均匀，反应2min后于显微镜下观察原生质体活力。
血细胞计数板检测原生质体浓度：血细胞计数板先用75％的酒精浸泡，再用蒸馏水冲洗干净，用无尘纸擦干，吸取染色后的原生质体滴加在盖玻片的一端，缓慢充盈整个盖玻片至无气泡出现，静置两分钟后观察。
原生质体数(个/mL)＝(100个小格内原生质体总数/100)×400×1000×稀释倍数，原生质体活率(％)＝4个中方格内绿色原生质体总数/4个中方格内原生质体总数，原生质体产量(个/g)＝(原生质体数×稀释后体积)/叶片总质量。
实施例2
本实施例的一种乌菜原生质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)酶解液裂解
取苗龄30天的乌菜叶片，经前期处理后，对其表面消毒，随后置于玻璃培养皿上，用刀片切去叶缘叶脉，剩余组织切成1mm宽的细丝；将10mL酶解液加入到50mL离心管中，称取1.25g叶片细丝放入酶解液中。
本实施例酶解液成分：1.5％w/v的纤维素酶，0.75％w/v的离析酶，0.2％w/v的果胶酶，0.5mol/L的甘露醇，10mM的MES，5mM的KCl，10mM的CaCl2，0.4％的PVP-40，0.1％的BSA，0.03％的DMSO，3mM的MgCl。
将装有组织材料与酶解液的离心管置于真空泵中抽真空，真空抽提压强为0.06Mpa，时间为10min。抽提结束后，用锡纸包裹，置于28rpm的摇床上震荡酶解1.5h，期间每隔30min用宽口枪头轻柔吹打，并取样于显微镜下观察细胞释放程度。
(2)收集原生质体
把65um细胞筛放置于新50mL离心管上，加入少量WS润洗细胞筛和管；用宽口枪头轻柔吹打酶解结束后的酶解体系10次，以释放原生质体，随后用宽口枪头将其转移至前述润洗后的细胞筛过滤酶解液；全部转移后，用10mL注射器的活塞轻柔上下按压细胞筛上的未酶解组织10次，之后加2mL的WS清洗液(0.4M甘露醇，0.5％w/v的BSA，0.3％的谷胱甘肽)清洗未酶解组织，重复1次，收集洗涤液
将所得过滤酶解液与洗涤液合并后轻柔颠倒混合均匀，4℃、150g/min条件下离心5min；离心后去上清，用宽口枪头沿管壁加入1mL的WS清洗液(0.4M甘露醇，0.5％w/v的BSA，0.3％的谷胱甘肽)重悬沉淀，重悬后的液体经35um细胞筛过滤；留取细胞筛滤液的同时，用WS清洗液洗涤细胞筛上残留组织，并收集洗涤液；将所述细胞筛滤液与洗涤液合并后，4℃、150g/min条件下离心5min，弃上清，用WS清洗液重悬沉淀，即得乌菜原生质体。
(3)纯化原生质体
在15mL尖底离心管中加入5mL15％的蔗糖溶液，将上述步骤所得的乌菜原生质体沿管壁轻柔吸至蔗糖溶液上；4℃、200g/min离心5min后，上清即为纯化后的原生质体，吸入干净管中置于4℃保存备用。
(4)原生质体活力测定和计数
台盼蓝溶液检测原生质体活力：将0.4％台盼蓝染液与0.8M甘露醇1:1混合，再与原生质体悬浮液以体积比9:1混合均匀，反应2min后于显微镜下观察原生质体活力；
血细胞计数板检测原生质体浓度：血细胞计数板先用75％的酒精浸泡，再用蒸馏水冲洗干净，用无尘纸擦干，吸取染色后的原生质体滴加在盖玻片的一端，缓慢充盈整个盖玻片至无气泡出现，静置两分钟后观察。
其中，原生质体数(个/mL)＝(100个小格内原生质体总数/100)×400×1000×稀释倍数，原生质体活率(％)＝4个中方格内绿色原生质体总数/4个中方格内原生质体总数，原生质体产量(个/g)＝(原生质体数×稀释后体积)/叶片总质量。
实施例3
本实施例的一种乌菜原生质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)酶解液裂解
取苗龄30天的乌菜叶片，经前期处理后，对其表面消毒，随后置于玻璃培养皿上，用刀片切去叶缘叶脉，剩余组织切成1mm宽的细丝；将10mL酶解液加入到50mL离心管中，称取2g叶片细丝放入酶解液中。
本实施例酶解液成分：1.5％w/v的纤维素酶，0.75％w/v的离析酶，0.2％w/v的果胶酶，0.5mol/L的甘露醇，10mM的MES，5mM的KCl，10mM的CaCl2，0.4％的PVP-40，0.1％的BSA，0.03％的DMSO，3mM的MgCl。
将装有组织材料与酶解液的离心管置于真空泵中抽真空，真空抽提压强为0.06Mpa，时间为10min。抽提结束后，用锡纸包裹，置于25rpm的摇床上震荡酶解1.5h，期间每隔30min用宽口枪头轻柔吹打，并取样于显微镜下观察细胞释放程度。
(2)收集原生质体
把70um细胞筛放置于新50mL离心管上，加入少量WS润洗细胞筛和管；用宽口枪头轻柔吹打酶解结束后的酶解体系10次，以释放原生质体，随后用宽口枪头将其转移至前述润洗后的70μm细胞筛过滤酶解液；全部转移后，用10mL注射器的活塞轻柔上下按压细胞筛上的未酶解组织10次，之后加2mL的WS清洗液(0.4M甘露醇，0.5％w/v的BSA，0.3％的谷胱甘肽)清洗未酶解组织，重复1次，收集洗涤液
将所得过滤酶解液与洗涤液合并后轻柔颠倒混合均匀，4℃、150g/min条件下离心5min；离心后去上清，用宽口枪头沿管壁加入1mL的WS清洗液(0.4M甘露醇，0.5％w/v的BSA，0.3％的谷胱甘肽)重悬沉淀，重悬后的液体经40um细胞筛过滤；留取细胞筛滤液的同时，用WS清洗液洗涤细胞筛上残留组织，并收集洗涤液；将所述细胞筛滤液与洗涤液合并后，4℃、150g/min条件下离心5min，弃上清，用WS清洗液重悬沉淀，即得乌菜原生质体。
(3)纯化原生质体
在15mL尖底离心管中加入5mL的15％蔗糖溶液，将上述步骤所得的乌菜原生质体沿管壁轻柔吸至蔗糖溶液上；4℃、200g/min离心5min后，上清即为纯化后的原生质体，吸入干净管中置于4℃保存备用。
(4)原生质体活力测定和计数
台盼蓝溶液检测原生质体活力：将0.4％台盼蓝染液与0.8M甘露醇1:1混合，再与原生质体悬浮液以体积比9:1混合均匀，反应2min后于显微镜下观察原生质体活力；
血细胞计数板检测原生质体浓度：血细胞计数板先用75％的酒精浸泡，再用蒸馏水冲洗干净，用无尘纸擦干，吸取染色后的原生质体滴加在盖玻片的一端，缓慢充盈整个盖玻片至无气泡出现，静置两分钟后观察。
其中，原生质体数(个/mL)＝(100个小格内原生质体总数/100)×400×1000×稀释倍数，原生质体活率(％)＝4个中方格内绿色原生质体总数/4个中方格内原生质体总数，原生质体产量(个/g)＝(原生质体数×稀释后体积)/叶片总质量。
实施例4
本实施例的一种乌菜原生质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)酶解液裂解
取苗龄30天的乌菜叶片，经前期处理后，对其表面消毒，随后置于玻璃培养皿上，用刀片切去叶缘叶脉，剩余组织切成1mm宽的细丝；将10mL酶解液加入到50mL离心管中，称取1g叶片细丝放入酶解液中。
本实施例酶解液成分：2.0％w/v的纤维素酶(R-10)，2.0％w/v的离析酶(R-10)，0.5％w/v的果胶酶(Y-23)，0.8mol/L的甘露醇，20mM的MES(pH5.7)，10mM的KCl，10mM的CaCl2，0.5％的PVP-40，0.5％的BSA，0.04％的DMSO，5mM的MgCl。
将装有组织材料与酶解液的离心管置于真空泵中抽真空，真空抽提压强为0.06Mpa，时间为10min。抽提结束后，用锡纸包裹，置于30rpm的摇床上震荡酶解3h，期间每隔30min用宽口枪头轻柔吹打，并取样于显微镜下观察细胞释放程度。
(2)收集原生质体
把75um细胞筛放置于新50mL离心管上，加入少量WS润洗细胞筛和管；用宽口枪头轻柔吹打酶解结束后的酶解体系10次，以释放原生质体，随后用宽口枪头将其转移至前述润洗后的细胞筛过滤酶解液；全部转移后，用10mL注射器的活塞轻柔上下按压细胞筛上的未酶解组织10次，之后加2mL的WS清洗液(0.6M甘露醇，0.5％w/v的BSA，0.3％的谷胱甘肽)清洗未酶解组织，重复1次，收集洗涤液
将所得过滤酶解液与洗涤液合并后轻柔颠倒混合均匀，4℃、300g/min条件下离心6min；离心后去上清，用宽口枪头沿管壁加入1mL的WS清洗液(0.6M甘露醇，0.5％w/v的BSA，0.3％的谷胱甘肽)重悬沉淀，重悬后的液体经50um细胞筛过滤；留取细胞筛滤液的同时，用WS清洗液洗涤细胞筛上残留组织，并收集洗涤液；将所述细胞筛滤液与洗涤液合并后，4℃、300g/min条件下离心6min，弃上清，用WS清洗液重悬沉淀，即得乌菜原生质体。
(3)纯化原生质体
在15mL尖底离心管中加入5mL20％的蔗糖溶液，将上述步骤所得的乌菜原生质体沿管壁轻柔吸至蔗糖溶液上；4℃、200g/min离心5min后，上清即为纯化后的原生质体，吸入干净管中置于4℃保存备用。
(4)原生质体活力测定和计数
台盼蓝溶液检测原生质体活力：将0.4％台盼蓝染液与0.8M甘露醇1:1混合，再与原生质体悬浮液以体积比9:1混合均匀，反应2min后于显微镜下观察原生质体活力；
血细胞计数板检测原生质体浓度：血细胞计数板先用75％的酒精浸泡，再用蒸馏水冲洗干净，用无尘纸擦干，吸取染色后的原生质体滴加在盖玻片的一端，缓慢充盈整个盖玻片至无气泡出现，静置两分钟后观察。
其中，原生质体数(个/mL)＝(100个小格内原生质体总数/100)×400×1000×稀释倍数，原生质体活率(％)＝4个中方格内绿色原生质体总数/4个中方格内原生质体总数，原生质体产量(个/g)＝(原生质体数×稀释后体积)/叶片总质量。
为了进一步说明本发明提取乌菜原生质体的技术效果，采用同一来源的乌菜叶片，进行以下试验，每组试验重复3次，测定乌菜原生质体产量和活力。
实验例1
本实验例用以说明酶解液组成对乌菜原生质体分离的影响：
实验方法：设置12组不同浓度的纤维素酶、离析酶和果胶酶组合，酶解液组合为变量，其余方法及试验参数与实施例3相同。
实验结果：见表1。
表1酶解液组成对乌菜叶片原生质体制备的影响
由表1可知：本实验条件下，T7的酶解液组合对制备乌菜原生质体的综合效果最优，即1.5％的纤维素酶、0.75％的离析酶和0.2％的果胶酶，获得原生质体产量为16.8×104个/g，活率为98.62％。
实验例2
本实验例用以说明WS清洗液中甘露醇浓度对乌菜原生质体分离的影响：
实验方法：以WS清洗液中甘露醇浓度为变量，其余方法及试验参数与实施例3相同。
实验结果：见表2。
表2甘露醇浓度对乌菜叶片原生质体制备方法的影响
| 甘露醇浓度/mol/L | 产量(×104个/g) | 活率(％) |
| 0.2 | 2.4 | 98.82 |
| 0.3 | 6.7 | 97.15 |
| 0.4 | 14.6 | 97.63 |
| 0.5 | 13.8 | 99.22 |
| 0.6 | 10.5 | 99.71 |
由表2可知：本试验条件下，WS清洗液中甘露醇浓度以0.4mol/L时乌菜叶片原生质体的产量最高，可达14.6×104个/g，活率为97.63％。
实验例3
本实验例用以说明酶解时间对乌菜原生质体分离的影响：
实验方法：以酶解时间为变量，其余方法及试验参数与实施例3相同。
实验结果：见表3。
表3酶解时间对乌菜叶片原生质体制备方法的影响
| 酶解时间/h | 产量(×104个/g) | 活率(％) |
| 1 | 6.2 | 98.66 |
| 1.5 | 12.7 | 99.12 |
| 2 | 14.5 | 98.82 |
| 2.5 | 17.8 | 96.35 |
| 3 | 18.4 | 92.64 |
由表3可知：本试验条件下，酶解1.5h的技术方案综合最佳，获得乌菜原生质体产量达12.7×104个/g，活率为99.12％。
实验例4
本实验例用以说明离心速率对乌菜原生质体分离的影响：
实验方法：以离心速率为变量，依次为100g/min、150g/min、200g/min、250g/min、300g/min条件下离心5min，其余方法及试验参数与实施例3相同。
实验结果：见表4。
表6离心速率对乌菜叶片原生质体制备方法的影响
由表4可知：本实验条件下，离心条件为150g/min离心5min的技术方案综合最佳，获得乌菜原生质体产量达14.3×104个/g，活率为99.35％。
此外，以实施例3为例，采用2g的乌菜叶片组织(如图1所示)可获得活性高达98.46％的原生质体约18.5×104个。使用该实施例方案提取的原生质体于光学显微镜下进行镜检观察，结果如图2、图3所示，所得原生质体结构清晰，形态完整。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取乌菜叶片，置于酶解液中；所述酶解液成分如下：0.5％～2.0％纤维素酶，0.5％～2.0％离析酶，0.1％～0.5％果胶酶，0.4～0.8mol/L甘露醇，10～20mM的MES，4～10mM的KCl，5～10mM的CaCl2，0.3％～0.5％PVP-40，0.1％～0.5％BSA，0.02％～0.04％的DMSO，2～5mM的MgCl；
(2)将装有组织材料与酶解液的离心管于暗处抽真空；抽提结束后，置于25～30rpm的摇床上震荡酶解1～3h；
(3)酶解结束后，用50～75um细胞筛过滤酶解液；同时，用WS清洗液洗涤细胞筛上的未酶解组织，收集洗涤液；
(4)将步骤(3)所得过滤酶解液与洗涤液合并后，100～300g/min条件下离心4～6min；离心后去上清，并用WS清洗液重悬沉淀，重悬后的液体经30～50um细胞筛过滤；留取细胞筛滤液的同时，用WS清洗液洗涤细胞筛上残留组织，并收集洗涤液；将所述细胞筛滤液与洗涤液合并后，100～300g/min条件下离心4～6min，弃上清，用WS清洗液重悬沉淀，即得乌菜原生质体；
(5)在离心管中加入10％～20％的蔗糖溶液以及步骤(4)所得乌菜原生质体；离心后，上清即为纯化后的原生质体。
2.根据权利要求1所述的乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，选取苗龄30天的乌菜植株，将其叶片用刀片切成1mm宽细丝，转移至分装有酶解液的离心管中，叶片与酶解液的质量体积比为1：(5～10)。
3.根据权利要求1所述的乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，酶解液成分具体如下：1.5％纤维素酶，0.75％离析酶，0.2％果胶酶，0.5mol/L甘露醇，10mM的MES，5mM的KCl，10mM的CaCl2，0.4％的PVP-40，0.1％的BSA，0.03％的DMSO，3mM的MgCl。
4.根据权利要求1所述的乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，真空抽提压强为0.06Mpa，时间为10min；摇床震荡摇速为25rpm，震荡时间为1.5h。
5.根据权利要求1所述的乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所用细胞筛规格具体为70um。
6.根据权利要求1所述的乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，过滤酶解液与洗涤液合并后，具体离心方法为：4℃、150g离心5min后，去上清，沿管壁加入WS清洗液重悬沉淀，重悬后的液体经40um细胞筛过滤。
7.根据权利要求1所述的乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)和(4)中，WS清洗液成分为：0.2～0.6mol/L甘露醇，0.5％BSA，0.3％谷胱甘肽。
8.根据权利要求1所述的乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，蔗糖溶液为15％，离心条件为4℃、200g、5min。
9.根据权利要求1～8任一所述的乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，还包括步骤(6)原生质体活力测定和计数；其中，通过台盼蓝溶液检测原生质体活力，通过血细胞计数板检测原生质体浓度。
10.根据权利要求9所述的乌菜原生质体的制备方法，其特征在于，通过所述台盼蓝溶液检测原生质体活力时：将0.4％台盼蓝染液与0.8mol/L甘露醇1:1混合，再与原生质体悬浮液以体积比9:1混合均匀。
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