CN117165622A - 一种马铃薯抑制不定根生长和块茎萌发基因StPR4b的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马铃薯抑制不定根生长和块茎萌发基因StPR4b的应用，属于植物生物技术领域。在马铃薯Désirée中利用强启动子驱动StPR4b基因的表达，StPR4b稳定转基因株系其不定根系生长受到显著抑制，同时直接影响与其对峙的Désirée根系生长发育，且这种抑制作用可被NAA回补。体外施加原核表达的StPR4b蛋白也能抑制马铃薯、水稻组培苗不定根系生长。StPR4b组成型过表达和外源喷施处理也能抑制马铃薯薯块的萌发，可以延长马铃薯仓储时间。本发明证明StPR4b基因在马铃薯生长发育中发挥重要作用，可以应用于调控马铃薯组培苗出苗周期和种薯、鲜食块茎仓储周期，从而更好地适应市场需求和供应链的安排。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种马铃薯抑制不定根生长和块茎萌发基因StPR4b的应用。
背景技术
根是高等植物为了适应陆上生活进化出的营养器官，它具有吸收、输送、贮藏、固着的功能，少数植物根也有繁殖的作用。根据发生部位不同，根可以分为主根、侧根和不定根三类。其中主根和侧根都属于从植物固定部位生长出来的定根，此外很多植物还能从茎、叶、胚轴或其它组织上生出不定根，不定根在提供吸收能力、增加支撑、繁殖和适应环境等方面发挥着重要的作用，有助于植物的生长和生存。
马铃薯种薯是马铃薯种植和繁殖的起点，种薯质量对于保证马铃薯产量和品质非常重要。为了帮助马铃薯育种者大量繁殖优良的品种，并确保种薯的质量和数量，马铃薯种薯生产一般采用“组培苗-微型薯-种薯”的三段模式，即培养良种的脱毒组培苗，经过微型薯培养，最终在高原地区放大生产繁殖得到生活力强、带毒携菌率低的种薯，这种模式具有扩繁效率高、可持续性强、脱毒脱菌、资源节约、品种保持效果优良等诸多优点。其中在组培苗培养阶段，离体培养的马铃薯茎尖或叶片组织萌发不定根，促进根和芽的协同生长。合理的不定根发育调控是实现马铃薯组培苗快速按需繁殖的关键，具体调控方法包括激素处理、营养调控、光照控制、温度调控等。
目前马铃薯组培苗不定根生长发育相关调控方法和机制研究主要关注促进生根缩短苗期的正向调控因子。然而在实际生产加工过程中，往往需要根据具体的应用场景和需求来确定是否需要减缓组培苗的出苗速度。例如对于需要长时间存储或远距离运输的组培苗，减缓出苗速度可以降低组培苗的代谢活性，减少营养消耗，从而提高存活率和质量。同时针对大规模的组培苗生产和销售场景，减缓组培苗的出苗速度也可以更好地管理和控制组培苗的数量和出苗周期，从而更好地适应市场需求和供应链的安排，这就要求我们掌握更精细的不定根生长发育调控手段。
除了生产环节，马铃薯种薯窖藏对于保持种薯的质量、控制病虫害的传播、保存优良品种以及应对气候条件等方面均有重要作用。例如种薯窖藏可以延长种薯的保鲜期，使得种植者可以在下一季度或下一年继续使用优良品种来种植。种薯窖藏可以为种薯提供一个相对稳定的环境，防止极端气候条件导致种薯质量下降或损失，这对于保持产量和质量的稳定非常重要。马铃薯种薯窖藏需要综合考虑温度、湿度、病虫害、窖藏环境管理等多重因素，进行及时的监测和调整，方能确保种薯的质量。除了种薯萌发需要调控，鲜食马铃薯发芽后更容易变质腐烂，口感发苦发涩，还会产生苏丹红素、龙葵碱等有毒有害物质。出于食品安全和口感考虑，商家通常使用低温窖藏方法(-7至-10℃)抑制鲜食马铃薯发芽。然而在售出后，暴露在室温环境中的马铃薯会解除休眠，快速发芽，影响食用。如何根据窖藏期的要求，灵活调整窖藏环境和管理措施，精密调控马铃薯出芽时间和数量，这仍然是一项挑战。
有研究发现马铃薯晚疫病非寄主植物龙葵的SnPR4b与马铃薯StPR4b(WIN2)高度同源(氨基酸序列完全一致)，均属于含有几丁质结合结构域(Chitin-binding domain,CBDdomain)的I类PR4b蛋白，SnPR4b可以与病原识别受体SnLRR1以及三个不同的致病疫霉RxLR效应因子PITG_16245.2HLJ、PTIG_04194.1HLJ和PTIG_20301.2HLJ互作(王娇，2019)，原核表达的SnPR4b对致病疫霉有体外抑菌活性(王娇，2019)，马铃薯StPR4b与SnPR4b类似，可以正向调控马铃薯对晚疫病的抗性，然而抗病短肽PR4b在马铃薯的生长发育方面的功能和应用还需要进一步探究。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺点与不足，提供一种马铃薯抑制不定根生长和块茎萌发基因StPR4b的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明在马铃薯Désirée中利用强启动子驱动StPR4b基因的表达，构建了StPR4b稳定转基因株系。与野生型马铃薯Désirée相比，StPR4b稳定转基因株系不定根系生长受到显著抑制，同时抑制对峙组野生型组培苗根系生长，且这种抑制作用能够被NAA处理特异性恢复；体外施加原核表达的StPR4b蛋白也能抑制马铃薯、水稻等植物组培苗不定根系生长。此外，与野生型马铃薯Désirée相比，StPR4b稳定转基因株系薯块的萌发也受到抑制，薯块的休眠期变长，可以延长马铃薯种薯和鲜食块茎的仓储周期；外源喷施StPR4b蛋白也能达到相同的目的。基于所述发现，本发明提供马铃薯StPR4b基因或StPR4b蛋白的如下应用：
马铃薯StPR4b基因在抑制马铃薯组培苗不定根系生长中的应用，该应用可通过在马铃薯中过表达StPR4b基因实现。
马铃薯StPR4b蛋白在抑制植物组培苗不定根系生长中的应用，该应用可通过在植物组培苗的培养基中添加StPR4b蛋白实现。所述的植物包括马铃薯、水稻。
马铃薯StPR4b蛋白在制备抑制植物组培苗不定根系生长的药剂中的应用。所述的植物包括马铃薯、水稻。
马铃薯StPR4b基因或StPR4b蛋白在调控马铃薯组培苗出苗周期中的应用，将马铃薯StPR4b基因过表达或体外添加StPR4b蛋白与NAA组合使用，实现调控马铃薯组培苗出苗周期的应用。
马铃薯StPR4b基因或StPR4b蛋白在抑制马铃薯块茎萌发中的应用，该应用可通过在马铃薯中过表达StPR4b基因或喷施StPR4b蛋白实现。
马铃薯StPR4b基因或StPR4b蛋白在调控马铃薯块茎仓储周期中的应用。
上述马铃薯StPR4b基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，马铃薯StPR4b蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明至少具有如下技术效果或优点：
本发明通过稳定转基因鉴定StPR4b基因在马铃薯抗晚疫病过程中发挥的作用。同时证明StPR4b对马铃薯组培苗不定根生长发育及薯芽萌发的调控功能，从生长发育和抗病性双层面解析了马铃薯StPR4b的功能，提供了StPR4b在马铃薯“组培苗-微型薯-种薯”三段种子生产及种薯、鲜食块茎仓储过程中的应用。
本发明证明StPR4b基因在马铃薯生长发育中发挥重要作用，可以应用于调控马铃薯组培苗出苗周期和薯块的仓储周期，从而更好地适应市场需求和供应链的安排。
附图说明
图1为StPR4b过表达抑制马铃薯不定根生长结果图；分别在MS培养基中对峙培养StPR4b-OE转基因株系和野生型，培养14d后观察生长状况。
图2为外源StPR4b处理抑制马铃薯不定根生长结果图；(A)StPR4b原核表达蛋白检测，使用anti-His进行Western blotting检测。(B)外源StPR4b蛋白处理抑制马铃薯根系生长。(C)株高和根长统计。(D)地上部鲜重和根重。t-test(ns P≥0.05；*P<0.05；**P<0.01；)。
图3为外源StPR4b处理抑制水稻不定根生长结果图；(A)和(B)外源StPR4b蛋白处理抑制水稻不定根生长。(C)株高和根长统计，t-test。
图4为NAA回补StPR4b过表达对马铃薯不定根生长的抑制结果图；在MS培养基中添加NAA(0.2mg/L)，培养马铃薯组培苗14d后观察生长状况。
图5为StPR4b转基因株系薯块萌发受到抑制；薯块收获后于室温避光处理30d后观察薯芽萌发情况。
图6为喷施体外表达的StPR4b蛋白抑制马铃薯薯块萌发；薯块收获后于室温避光处理15d，喷施原核表达蛋白10d后观察薯芽萌发情况。
具体实施方式
以下实施例中进一步说明本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术。
实施例1：StPR4b的稳定转基因株系创制
1.克隆StPR4b基因
根据NCBI数据库中的基因序列(登录号NM_001288699)，设计引物扩增StPR4b基因(见表1中的引物1和引物2)。使用Plant RNA kit(OMEGA Bio-tek,Norcross,USA)，取新鲜马铃薯叶片材料50-100mg提取RNA，采用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(CWBIO，北京)试剂盒进行cDNA第一链合成。目的片段扩增使用KOD-Plus-Neo(TOYOBO,Osaka,Japan)，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，将纯化DNA片段连接中间载体，连接反应使用T4 DNA ligase，使用热激法转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序由生工生物工程有限公司完成。结果以马铃薯Désirée的cDNA为模板，经过PCR扩增后，获得一个长度为636bp的CDS片段，片段序列见SEQ ID NO.1。
表1
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| 引物1 | ATGGTTAAGCTAAGTTGTGCTC(SEQ ID NO.1) |
| 引物2 | TCATTCTTTGTCAACTACAGAAAG(SEQ ID NO.2) |
2.构建并转化StPR4b-GFP载体
为了确定StPR4b对马铃薯抗性的影响，使用Gateway克隆方法将StPR4b全长CDS序列构建进含有GFP标签的超量表达载体pEarleyGate 103，将构建的载体命名为StPR4b-GFP。片段扩增使用KOD-Plus-Neo(TOYOBO,Osaka,Japan)进行，所使用引物见表2引物3和引物4，载体构建技术参照User Guide:Gateway Technology(Thermo Fisher scientific，USA)进行，涉及BP反应载体构建参考pDONRTMVectors(12536017，Invitrogen ofThermo Fisher scientific)；LR反应载体构建pEarleyGate 103(CD3-685，Invitrogen ofThermo Fisher scientific)，挑取阳性克隆测序成功后转化农杆菌AGL1用于创制稳定转基因株系。
表2
3.StPR4b-OE稳定转基因株系创制及阳性鉴定
使用茎段法进行马铃薯的遗传转化，将携带StPR4b-GFP表达载体的农杆菌AGL1扩繁培养。切取无生长点的马铃薯Désirée组培苗茎段，置于MS培养基于22℃预培养2-3d。用MS液体培养液重悬农杆菌，调至OD600＝0.5，将茎段浸泡于侵染液，于水平摇床40rpm震荡侵染15min，用无菌滤纸吸干水分后将茎段均匀放置在共培养培养基(MS培养基，含添加GA30.2mg/L，NAA 0.02mg/L，ZT 2.5mg/L)上，于18℃暗培养2d。使用添加特美汀(50μg/mL)的无菌水清洗完成共培养的茎段5次，每次5min，将茎段用无菌滤纸吸干水分后置于愈伤培养基(MS培养基，添加GA3 0.2mg/L，NAA 0.02mg/L，trans-ZT 2.5mg/L，特美汀50μg/mL)培养两周左右直至形成良好愈伤组织，将愈伤组织转入分化培养基(MS培养基，添加GA30.02mg/L，NAA0.02mg/L，trans-ZT 2.5mg/L，特美汀50μg/mL)培养至分化出芽，待幼芽长到1cm左右，切取幼芽转移到MS生根培养基中诱导生根和进行抗性筛选，移栽成苗后对其进行阳性鉴定，获得一系列StPR4b-OE阳性株系。本研究中组培室环境为光照16h、黑暗8h、22℃、光照强度2000Lux。
实施例2：StPR4b过表达株系根系生长受到抑制
以野生型为对照，在MS培养基中分别对峙扦插Désirée和StPR4b过表达株系(OE-11、OE-8)，于光照16h、黑暗8h、22℃、光照强度2000Lux的环境培养14d后观察生长状况如图1，两个StPR4b过表达株系根系生长明显受到抑制，且能直接影响与其对峙的Désirée根系生长发育。
实施例3：外源StPR4b处理抑制马铃薯根系生长，NAA可以回补该抑制作用
1.pET28a-StPR4b载体构建
设计引物扩增StPR4b全长CDS序列(见表3引物5和引物6)，采用酶切连接的克隆方法将StPR4b片段连入pET28a载体，挑选阳性克隆转化大肠杆菌原核表达感受态BL21，筛选阳性克隆用于后续原核表达。
表3
| 引物名称 | 序列(5’-3’) |
| 引物5 | CGGGATCCGTTAAGCTAAGTTG(SEQ ID NO.5) |
| 引物6 | CCCAAGCTTTTCTTTGTCAAC(SEQ ID NO.6) |
2.StPR4b原核表达
用灭菌牙签挑取活化好的pET28a-StPR4b单克隆于加有相应抗生素(Kana)的LB培养基中，于37℃/2000rpm培养过夜，按1:100的比例将培养好的菌液加入到新鲜的LB培养基中，扩大培养3-4小时，至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于20℃继续培养20小时，4℃/5000rpm离心10min收集菌体。
用缓冲液A(50mM Tris-HCL,pH＝8.0；2mM EDTA；100mM NaCL)洗菌体两次，再用缓冲液B(50mM Tris-HCL,pH＝8.0；1mM EDTA；100mM NaCL；1％ NP-40)重悬菌体，加入溶菌酶(终浓度为1mg/mL)，于4℃反应30min，将处理好的悬浮液超声破碎(超声10s，停顿10s，震荡幅38％，重复60-70次)，使菌体充分破碎，菌液清亮粘稠；15000g离心30min收集沉淀。沉淀和上清均留样待检；将所有收集的样品加入5×Loading buffer，95℃变性10min，使用anti-His抗体进行WB检测如图2A，在上清液可以检测到24kDa大小的StPR4b-His清晰条带。
3.外源StPR4b处理抑制马铃薯不定根生长
以pET28a空载体原核表达产物为对照，在MS培养基中添加StPR4b-His蛋白粗提液(原核表达破碎富集的上清液)，分别对峙扦插Désirée组培苗，于光照16h、黑暗8h、22℃、光照强度2000Lux的环境培养14d后观察生长状况如图2，与对照组相比，外源添加StPR4b蛋白处理的Désirée组培苗根系生长受到显著抑制，根长缩短43.04％，根重降低32.91％，地上部差异不显著。
4.外源StPR4b处理抑制水稻不定根生长
在MS培养基中培养水稻ZH11，种子萌发一周后切除主根系，转移至新的MS培养基中，以pET28a空载体原核表达产物为对照，在MS培养基中添加StPR4b-His蛋白粗提液(原核表达破碎富集的上清液)，于光照16h、黑暗8h、22℃、光照强度2000Lux的环境培养14d后观察生长状况如图3，与对照组相比，外源添加StPR4b蛋白处理的ZH11不定根生长受到显著抑制。
5.NAA回补StPR4b对马铃薯根系生长的抑制作用
在MS培养基中添加0.2mg/L的NAA，以Désirée为对照扦插StPR4b过表达株系组培苗，于光照16h、黑暗8h、22℃、光照强度2000Lux的环境培养14d后观察生长状况如图4，外源添加NAA处理可以回复StPR4b过表达株系的根系生长缺陷。
实施例4：StPR4b抑制马铃薯薯块萌发
将生长两周的马铃薯Désirée组培苗移栽至小钵子中，在基质中继续培养2个月后收获微型薯，将收获的微型薯置于室温避光条件放置30天，发现相较于野生型，StPR4b三个超量转基因株系薯块休眠期变长(图5)。
将收获的微型薯置于室温避光条件放置15天，分别使用His和StPR4b-His蛋白喷施马铃薯微型薯，处理10天后观察薯块萌发情况，相较于对照组38.00％的发芽率，StPR4b-His处理后的微型薯萌发率降至9.68％(图6)。
无论是内源StPR4b基因的过表达还是外源StPR4b蛋白的喷施处理，均能显著抑制马铃薯薯块的萌发。
Claims (10)
1.马铃薯StPR4b基因在抑制马铃薯组培苗不定根系生长中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的应用通过在马铃薯中过表达StPR4b基因实现。
3.马铃薯StPR4b蛋白在抑制植物组培苗不定根系生长中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的应用通过在植物组培苗的培养基中添加StPR4b蛋白实现。
5.马铃薯StPR4b蛋白在制备抑制植物组培苗不定根系生长的药剂中的应用。
6.马铃薯StPR4b基因或StPR4b蛋白在调控马铃薯组培苗出苗周期中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将马铃薯StPR4b基因过表达或体外添加StPR4b蛋白与NAA组合使用，实现调控马铃薯组培苗出苗周期的应用。
8.马铃薯StPR4b基因或StPR4b蛋白在抑制马铃薯块茎萌发中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的应用通过在马铃薯中过表达StPR4b基因或喷施StPR4b蛋白实现。
10.马铃薯StPR4b基因或StPR4b蛋白在调控马铃薯种薯和鲜食块茎仓储周期中的应用。
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