JPH025857A - プロトプラストからプーイデアエ亜科のイネ科植物の再生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はプロトプラストから、もしくは再生された細胞
壁を有するプロトプラスト（植物細胞）またはプロトプ
ラスト誘導カルスから再生されるプーイデアエ（ｐｏｏ
ｉｄｅａｅ　、イチゴツナギ）亜科のイネ科植物、およ
びこれら植物の再生のための一般的に適用可能な方法に
関する。植物に再生され得るプロトプラストの源を構成
する胚形成性細胞培養体（懸濁培養体またはカルス培養
体）およびカルスにも関する。さらに、上記胚形成性Ｎ
Ｉ胞培養体の作製方法、該胚形成性細胞培養体および胚
形成性カルスの凍結保存、および遺伝的に改変されたプ
ロトプラストから再生されたトランスジェニックプーイ
デアエ植物に関する。

〔従来の技術〕

人類がその食糧の大部分を依存している植物種のほとん
どは、イネ科として一体となって知られている植物の群
に属する。イネ科（Ｇｒａｍｉ−ｎｅａｅ、　Ｐｏａｅ
ｃｅａｅ　）は商業的観点から単子葉植物綱の中で最も
重要な科である。イネ科は例えば以下の亜科および属を
含む。

亜科 パンブソイデ７工（Ｂａｍｂｕｓｏｉｄｅａｅ）アンド
ロボゴノイデアエ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎｏ　−１ｄｅ
ａｅ） アルンジネアｘ（Ａｒｕｎｄｉｎｅａｅ　）オリシイデ
アｘ　（Ｏｒｙｚｏ　１ｄｅａｅ　）バ＝＝＋イデアｘ
　（Ｐａｎｉｃｏｉｄｅａｅ　）プーイデアエ 〔フェストウシアデアエ（Ｆｅｓｔｕｃｉａ　−ｄｅａ
ｅ　）　） 亜科内の属 バンプー（Ｂａｍｂｏｏ） サッカラム（８ａｃｃｈａｒｕｍ） 〔スィートコーン〕 ツルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ） ゼア（Ｚｅａ）（トウモロコシ〕 ７ラグミテス（Ｐｈｒａｇ− ｍｉ　ｔｅｓ　） オリザ（Ｏｒｙｚａ）（イネ〕 パニカＡ　（Ｐａｎｉｃｕｍ）（＊） ペンニセタム（Ｐｅｎｎｉ− ｓｅ　ｔｕｍ）　（＊） セタリア（Ｓｅｔａｒｉａ）（＊） ポア（Ｐｏａ）（＊リ フェストゥ力（Ｆｅｓｔｕｃａ） （＊＊） ロリウム（ＬＯＩ　ｉｕｍ）（傘り ７−Ｅ：ｌ　ムス（Ｂｒｏｍｕｓ）（申りトリセタム（
Ｔｒｉｓｅｔｕｍ） （傘＊） アグロスチス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）（＊＊）ブレラム（
Ｐｈｌｅｕｍ）（申り ダクチリス（Ｄａｃｔｙｌ　１ｓ）（申り７ｏペクルス
（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ　）（申傘） アベナ（Ａｖｅｎａ）［オート麦］←）トリチカム（Ｔ
ｒｉｔｉｃｕｍ）［小麦］（ハ）セカーレ（Ｓｅｃａｌ
ｅ）［ライ麦］（−）ホルデウムσ（ｏｒｄｅｕｍ）状
変〕（ハ）本　　　ミ　リ　ッ　ト　（ｍｉｌｌｅｔ）
＊＊グラス（ｇｒａｓｓｅｓ　） へ　小穀類（ｓｍａｌｌ　ｇｒａｉｎ　ｃｅｒｅａｌｓ
　）イネ科の亜科の中でプーイデアエ亜科が例えばグラ
スと小穀類からなる２つの密接に関連したサブグループ
を包含する経済的に非常に重要な植物の群である。

おもしろいことに、これらのプーイデアエ植物はまた科
学的に操作することが最も難しいものだった。培養され
たプロトプラストからの植物再生は体細胞ハイブリッド
形成の適用および直接遺伝子導入を介するトランスジェ
ニック植物の作製に必須であるけれども、一般に適用可
能な方法はプーイデアエ植物もしくは稔性プーイデアエ
植物の再生、またはプロトプラストからの安定に組入れ
た外因性ＤＮＡ　ｉ含有するプーイデアエ植物には今ま
で知られていない。穀類内への遺伝子導入における分野
の現状はＣｏｃｋｉｎｇａｎｄ　Ｄａｖｅｙ（１９８７
）によシ最近報告された。

穀類培養体の源、プロトプラスト、穀類プロトプラスト
の単離およびそれらの特性は例えば以下の本で報告され
ている：「穀類組織および細胞培養（”Ｃｅｒｅａｌ　
Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ’）
ＪＢｒｉｇｈｔ、　Ｓ、　Ｗ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｊｏｎ
ｅｓ、Ｍ、　Ｇ、　Ｋ、　（１９８５）Ｎｉ　ｊｈｏｆ
ｆ、　Ｍ、　Ｊｕｎｋ、Ｗ、、　Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ　
）。

適当な形質転換はプロトプラスト内へのＤＮＡの化学的
および電気的に刺激された取込みによりイネ科植物にお
いて既に達成されている（［直接遺伝子導入Ｊ　）　（
Ｐｏｔｒｙｋｕｓ等＋　１９８５　；Ｌｏｅｒｚ等。

１９８５；Ｆｒｏｒｒｍ等、１９８６〕カ、ＬかＬｍ物
再生ａ　とｆｌらの研究において使用された系列からは
可能でなかった。

今までイネ科植物はプーイデアエ亜科以外のもののプロ
トプラストからの再生が成功したにすぎず、例えばＡｂ
ｄｕｌｌａｈ等（１９Ｂ６　）は不定胚形成を介してイ
ネ（亜科：オリゾイデアエ）プロトプラストから効率の
良い植物再生を報告している。Ｙａｍａｄａ等（［８６
）もまたプロトプラスト誘導カルスからのイネ植物再生
を記載している。才た、Ｒｈｏｄｅｓ等（１９８８）　
はトウモロコシの非稔性植物の再生を記載している。Ｃ
ｏｃｋｉｎｇａｎｄ　Ｄａｖｅｙ　（１９８７）は穀類
における遺伝子導入におけるこの分野の現状を論じてい
る。

組織培養体からのプーイデアエ亜科のイネ科植物の再生
は公知である。Ｈａｎｎｉｎｇ等（１９８２）はカモガ
ヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ　ｇｌｏｍｅｒａｔａ　Ｌ、　）
の葉片誘導カルスからの胚および小植物体形成を記載し
ている。

培養細胞からのプーイデアエ植物の再生のいくつかのそ
の他の例は以下の文猷に報告されている： ロリウム　リジダム（Ｌｏｌｉｕｍ　ｒｉｇｉｄｕｍ　
）　：　５ｋｅｎｅ等、　　１９８３ ０リウム　ペレンネ（Ｌｏｌｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ）
、ネスミムギ（Ｌｏｌ　ｉｕｍ　ｍｕｌ　ｔｉｆ　Ｉｏ
ｒｕｍ　）　：　Ａｈｌｏｏｗａｌ　ｉａ、　１９７５
ネズミムギ、フェスッヵ　アルンジナセア（Ｆｅ５ｔｕ
ｃａ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ　）　：　Ｋａｓｐｅｒ
ｂａｕｅｒ等、１９７９アロペキユラス　アルンジナセ
ウス（Ａｌｏｐｅｃｕ−ｒｕｓ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅ
ｕｓ　）、アゲロバイロン　　クリスタタム（Ａｇｒｏ
ｐｙｒｏｎ　ｃｒｙｓｔａｔｕｍ　）　、　スチパ　ビ
リシュラ（５ｔｉｐａ　ｖｉｒｉｄｕｌａ　）　、プロ
ムスイネルミス（Ｂｒｏｍｕｓ　ｉｎｅｒｍｉｓ　）、
　　アクロパイロンスミッチー（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ　
５ｍ１ｔｈｉｉ　）　：　Ｌｏ等、　１９８０アグロス
チス　パルストリス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ　ｐａｌｕ−ｓ
ｔｒｉｓ　：　Ｋｒａｎｓ等、　１９８２）牧草の組織
培養の状態はまたＡｈ　ｌ　ｏｏｗａ　ｌ　ｉ　ａ（１
９８４）により報告されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、これらのプーイデアエ植物はこれらの場
合において本発明明細書に記載された出発材料のタイプ
から再生されず、細胞培養体のその他のタイプから再生
された。再生が不定胚形成を介して新たに起こったこと
は、上記の例には示されていなかった。上で引用した参
考文献はプロトプラストの単離および培養またはプロト
プラストから植物の再生を含んでいなかった。

プーイデアエ亜科にあるイネ科植物の遺伝的形質転換お
よび再生には大きな関心があったけれども、再生され、
所望により形質転換されるプロトプラスト誘導植物また
は相性植物に導き得る成功した試験管内法の記載は今日
まで無かッ７’ｃ　（ｃｏｃｋｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄａｖ
ｅｙ　、　１９８７　）。

今までこの方向に向けられた全ての研究およびあらゆる
努力は失敗したが、これは早い段階に死滅し、そしてそ
れ故に成功裡に土に移すことができなかった胚またはせ
いぜい生育できない小植物体を生じたものである（　Ａ
ｈｌｏｏｗａｌｉａ。

１９８４）。

植物体そして好ましくは全体の稔性植物体に分化し得る
プーイデアエのプロトプラストを作製し得る記載はなく
、プロトプラストまたはプロトプラスト誘導カルスから
プーイデアエ植物の再生の記載はなおさらなかった。

〔課題全解決するための手段〕

細胞およびカルスコロニーを形成できるプロトプラスト
を作製する方法を提供する本発明に従って、その他の目
的に関するそれらが達成された。プロトプラストは所望
によシ形質転換され得、そして生成するカルスはプーイ
デアエ植物に再生され得る。分裂し、そしてカルスを形
成し得、次いで植物に再生され得るプロトプラストラ作
製する方法は、出発材料として新規な胚形成性細胞培養
体（懸濁培養体またはカルス培養体）または胚を必要と
する。そのような胚形成性細胞培養体、胚並びにそれら
を作製および同定する方法は記載きれるであろうし、そ
してそれは本発明の一部とみなされる。懸濁体が誘導さ
れる胚形成性カルスはまたプロトプラスト用の出発材料
として使用され得る。そのようなカルスおよび懸濁体、
胚並びにそれらを作製および同定する方法は記載される
であろうし、そしてそれも本発明の一部とみなされる。

これらの胚形成性培養体は外因性ＤＮＡで形質転換され
得るプロトプラストの源であり、そして次いで分裂し、
そして土で生長し得る全体の相性な植物を包含する全体
の植物に再生され得るカルスを形成し得るプロトプラス
トの源である。

プーイデアエ亜科のイネ科植物、特に稔性イネ科植物が
プロトプラストから、プロトプラスト誘導細胞またはプ
ロトプラスト誘導カルスから再生され得ることは、本発
明がなされた時点で従来技術から予測できなかった。

それらのゲノム内に外因性ＤＮＡ　ｔ−安定に組入れら
れて含有するプーイデア二のプロトプラストはまたトラ
ンスジェニック植物、特に相性トランスジェニック植物
に再生され得ることはなおさら予測できなかった。

本発明はそれ故にまず第一に、プロトプラストが単離さ
れ得るプーイデアエ亜科のイネ科植物から誘導された胚
形成性細胞培養体（懸濁培養体またはカルス培養体）に
関し、このプロトプラストは細胞壁を再生し、分裂し、
そして相性植物を含む植物に再生され得るカルスを形成
する。

本発明はまた、好ましくは相性である植物に再生され得
るプーイデアエのプロトプラストおよびそれから生じる
植物細胞（細胞壁再生の後〕にも関し、好ましくは細胞
培養体から、または胚形成性細胞懸濁体から誘導された
プロトプラストに関する。

不発明はまた、前記プロトプラストから誘導てれた植物
細胞、カルス、胚形成性細胞懸濁体、胚、小植物体およ
び植物にも関する。

さらに本発明は再生されたブーイデアエ植物およびそれ
らのムカゴ（ｐｒｏｐａｇｕｌｅ　）、特にそれらのゲ
ノム内に安定に組入れられた植物内で発現可能な外因性
ＤＮＡ　’ｉ金含有るプロトプラストまたは植物細胞か
ら誘導され九上記のものに関する。ムカゴは有性もしく
は無性に増殖されるか、′！！たけ生体内もしくは試験
管内で増殖され得るあらゆる植物材料を包含する。この
材料の中で、トランスジェニック　プーイデアエ植物か
ら得られたプロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官
、接合子、胚、花粉または種子が好ましい。プーイデア
エ植物の突然変異体および変種を包含し、体細胞融合か
ら得られた植物の突然変異体および変種を包含する前記
植物の後代（ｐｒｏｇｅｎｙ　）、遺伝子改変体または
突然変異体選択はさらに本発明の目的である。

本発明はまた、植物、特に稔性植物に再生され得るブー
イデア二のプロトプラストおＩびプーイデアエ植物細胞
を作製する方法、前記グロトプラ２トまたは植物細胞か
ら誘導され、そして植物、好ましくは稔性植物に再生さ
れるプーイデアエのカルス會作製する方法に関する。さ
らに、これらのカルスからブーイデアエ植物の再生方法
に関する。これらの方法全以下に詳しく記載する。

本発明のこれらの目的およびその他の目的は以下の詳細
な記載から明らかになるであろう。

定義 発明の詳細な説明および特許請求の範囲の明確なそして
首尾一貫した理解を提供するために、そのような用語に
与えられた範囲を含めて、以下に定義を与える： 植物細胞：プロトプラストおよび細胞壁からなる植物の
構造的および生理学的単位。

植物組織：構造および機能的単位内に組織化された植物
細胞の群。

植物器官：明確で可視の分化した植物の部分、例えば根
、茎、葉、花、芽または胚。

プロトプラスト：細胞壁のない単離された植物細胞。

細胞培養体：未分化または部分的に分化した状態にある
細胞の増殖集合体。

胚：接合体（生殖圧）または不定胚形成細胞（体細胞圧
）のいずれかから誘導される植物の微小な早期の生長段
階で、球形ないし子葉段階の細胞からなる識別できる形
態、構造および細胞器官の段階にあるもの〔トウモロコ
シの胚生長は例えばＲａｎｄｏｌｐｈ　（１９３６）に
記載され、グラスの胚生長は例えばＢｒｏｗｎ（１９６
０）に記載されている〕。

細胞群：互いに結合した連結細胞の群：細胞分裂により
先祖細胞またはプロトプラストから通常誘導される。

小植物体：小さい植物の形態にある苗条と根からなる多
細胞ＩｒＩ４造体。

ジカムバ（Ｄｉｃａｍｂａ）：　３　、　６−ジクロロ
−２−メトキシ安息香酸。

ＭＥＳ：２−（、Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸。

２．４−Ｄ：　２，４−ジクロロフェノキシ酢酸。

ビクロラム（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）　：　４−アミノ−３
゜６．６−ドリクロロビコリン酸。

トリス塩酸：アルファ、アルファ、アルファートリス（
ヒドロキシメチル）メチルアミン塩酸。

ＥＤＴＡ：　１−エチレンジアミンＮ、　Ｎ、　Ｎ’、
　Ｎ’−四酢酸。

ＰＥＧ　　：ポリエチレングリコール アガロース：アガロースの調製および精製は、例えばガ
イスレーオよびｖ　：ｙ　（Ｇｕｉｓｅｌｅｙ　ａｎｄ
Ｒｅｎｎ　　）、　　［’Ｔｈｅ　　Ａｇａｒｏｓｅ　
　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ　’、　　ＭａｒｉｎｅＣｏｌｌ
ｏｉｄｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ＦＭＣＣｏｒｐ、　（１
９７５年）〕に記載されている。アガロースは寒天の成
分の１つである。市販されて利用できる寒天は通常、多
数の側鎖を有する中性アガロースおよびイオン性アグロ
ペクチンの混合物からなる。市販のアガロースは通常、
慣用の方法で寒天から得られる。通常かなりの側鎖はそ
のまま残り、アガロースの物理化学的特性、例えばゲル
形成温度および融点を決定する。低融点アガロース、特
にジ−プラーク（５ｅａｐｌａｑｕｅ　）■アガロース
は、後記する方法での好ましい固化剤である。

８）１−ｏ培地：ホルモンを含まない８ｃｈｅｎｋお１
　（Ｊ　Ｈｉ　１ｄｅｂｒａｕｄｔ　（１９７２）の培
地。

（ＳＨ培地は液状であるかまたはα８％（Ｗ／Ｖ）寒天
もしくはα５％（Ｗ／Ｖ）登録商標ゲルライ）（Ｇｅｔ
凡１ｔｅ）■で固化され得る）。培地は当該分野で公知
の方法で例えば約１５ないし２０分間、１２１℃および
圧力１５１　ｔｂ／ｉｎ”でオートクレーブすることに
よる加熱または殺菌により通常殺菌される。

ゲルライト：ロードアイランド州、フイスカースヴイレ
にあるスコツト　ラボラトリ−社（８ｃｏｔｔ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ　）のゲルライト　ゲラン
　ガム（Ｇｅ１ｌ（Ｉｉ　ｔｅ　Ｇｅ１ｌａｎ　Ｇｕｍ
　）。

良い。固化剤を除く培地成分は通常０．２μｍフィルタ
ーを通す濾過により滅菌される。

ＲＹ−２培地：　Ｙａｍａｄａ等（１９８６）の培地。

０Ｍ８培地：　ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（
１９６２）の培地。

この培地は例えばα８％（Ｗ／Ｖ）寒天もしくはアガロ
ースまたは０．５％（Ｗ／ｖ）ゲルライトで固化され得
る。本明細書に記載した方法のために、この培地はガム
ポルク等（１９６８）のＢ５培地のビタミン組成を含有
するように調製しても良い。

ＳＨ−ｏ培地。

５Ｒ−ｏ培地。

ＫＭ−８ｐ培地：　Ｋａｏ（１９７５）　ノ培地８ｐこ
の培地は液状であっても、または寒天、アガロースもし
くはゲルライトで固化されても良く、そして同様にアス
コルビン酸、ビタミンＤおよびビタミンＡなしで調製お
よび使用してもあるヤクルト本社（株）製のセルラーゼ
ＩｔｓＱ登録商標ペクトリアーゼＹ−２３（Ｐｅｃｔｏ
ｌｙａｓｅＹ−２３■）：東京都日本橋小網町４−１３
にあるセイシ７　（５ｅｉｓｈｉｎ　）薬品（株）膜。

コネチカット州、グリーンウィッチにあるアメリカン　
カン社（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃａｎ　Ｇｏ、　）製のバ
ラフィルムラボラトリイフィルム。

米国、ニューヨーク、ロチニスターにあるシブロン社（
８ｙｂｒｏｎ　Ｃｏｒｐ−）の小会社のナルゲ社（Ｎａ
ｌｇｅ　Ｃｏ、　）製。

Ｂｇｔｎ　　：制限酵素ＢｇｔＴｉ　；米国、マサチェ
ーセッツ州、ビバリー、ドーザ−ロード３２にあるニュ
ーイングランドバイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ−ｎ
ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）製またはその他。

Ｂ　ａｍ　ＨＩ　：制限酵素ＢａｍＨＩ；上記ニーｓ、
−イ７グランドバイオラブス製まｆｃはその他。

カゼイン氷解物：米国、ミズーリ州、七ントルイーズに
あるシグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、）製のカゼイン氷解
物（牛乳１型からの酵素的氷解物）。

ハイグロマイシンＢ：サイトトキシン：精製ハイグロマ
イシンＢ；米国、カリフォルニア州。

ラ　ジララにあるカルビオケム　ベーリングダイアグ／
７Ｃチカ（ｃａｌｂｊｏｃｈｅｍ　Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄ
ｉａｇ−ｎｏｓｔｉｃａ　）製のカタログ番号４０００
５０、ロット番号７０２２９６゜ ストン、アルパニーストリート５４９にあルニューリサ
ーチプロダクツ（ＮＥＷ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ）製のカタログ番号ＮＥＦ　９７６゜ ＴＢＥ緩衝液ニドリス硼酸塩緩衝液、電気泳動用ノ慣用
緩衝液、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２）参照。

ビカタウェイにあるペーリンガー　マンハイムバイオケ
ミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　
Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）製のカタログ番号１０
０４０２のセファデックスＧ２５の予備充填カラム。

ＳＤＳニドデシル硫醜ナトリウム。

Ｓａｃ：　Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２）　Ｋ記載ｎ
ｕｔ！ウナ１．５４　ｍＭＮａｃｔ、　０．１５４　ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム。

ＣＥＴＡＢ　：　ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
プロミド。

チカット州、ニューヘブンにあるインターナショナルバ
イオテノロジー社（Ｉｎｔｅｒ−ＮａｔｉｏｎａｌＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、　）製の　ゝプ
ライマー　タイム′　ランダムキット（カタログ番号７
７８００；ロット番号Ｆ６３０−０１）。

プーイデアエ亜科のイネ科植物がプロトプラストの特定
の型、およびこれらのプロトプラストから誘導された細
胞またはカルスから再生てれ得ることが驚くべきことに
今見い出された。

稔性植物を包含する植物のこの再生はまた、このプロト
プラストが外因性ＤＮＡ、好ましくは植物ゲノム内に安
定に組入れられ、そして植物内で発現され得る外因性Ｄ
ＮＡを含有する場合も可能である。

ブーイデアエ亜科のあらゆるイネ科植物が本発明におい
て使用され得る。しかしながら、好ましくはプーイデア
エ植物はグラス例えばポア、フェストウカ、ロリウム、
プロムス、トリセタム、アグロスチス、７レウム、アロ
ベクルスおよびダクチリスからなる群から選択されるお
のおのの属に属するものである。ダクテリス属のものが
最も好ましい。また、プーイデアエ植物・で小穀類に属
するものも好ましく、例えばアベナ（オート麦）、トリ
チカム（小麦）、セカーレ（ライ麦）およびホルデウム
（大麦）からなる群から選択されるおのおのの属のもの
である。

分裂し、そして植物に再生され得る細胞培養体を形成す
るプーイデア二のプロトプラストの特定の型は、細胞培
養体、好ましくは胚形成性細胞培養体に由来する。胚形
成性細胞培養体は好ましくは胚形成性懸濁体または胚形
成性カルス培養体である。細胞培養体はブーイデアエ植
物の適当な部分から誘導されても良い。植物の適当な部
分はプーイデアエ植物の幼内葉の基部、成熟生殖胚、未
熟花序、成熟種子または実生組織を包含するが、これに
限定されない。

胚形成カルスはプーイデアエ植物の適当な部分、典型的
にはプーイデアエ植物の幼葉の基部、最も好ましくはよ
シ幼着な内葉の基部から開始される。これはＨａｎｎｉ
ｎｇ等（１９８２）によシカモガヤに対して記載された
ように行われるが、しかしその他の全てのプーイデアエ
植物に対しても利用できる。この刊行物を参照により本
明細書内に編入する。

葉を例えば約１咽ないし５畷の長さまたは直径の小切片
または断片に切る。これらの片の形および大きさは重要
でない。これらの断片を、適当なカルス誘導および維持
培地上に置き、そしてカルスおよび／または胚形成性構
造体ができるまで培養する。適当な培地は例えば３０μ
Ｍジカムバおよびゲル化剤として０．８％（Ｗ／Ｖ）寒
天またはアガロースを含有する８Ｈ培地（８ｃｈ−ｅｎ
ｋオよびＨｉ　Ｉｄｅｂｒａｎｄｔ、　　１９７２　）
である。その他の適当な培地中にはＧｅｏｒｇｅ等（１
９８７）に記載されたものがある。ブレーティング後２
ないし６週間以内にカルスおよび／または胚形成性構造
体が通常現われる。カルスの開始および維持は明所で、
または炒ましくけ暗所で、そして０℃と５０℃、好まし
くは２０℃と３２℃、最も好ましくは２５℃と２８℃の
間の温度で行っても良い。胚形成性カルスはまたこの分
野で公知のその他の方法、例えば弓ｈｒｓおよＱ：Ｌｏ
ｒｚ（１９８７）およびその中の文献により記載された
大麦に対する方法に工９調製されても良い。これらの方
法はその他のプーイデアエに用いることができ、そして
参照により本明細書内に編入される。

胚形成性懸濁培養体は胚形成性カルスの新鮮切片を適当
な液体培地中に置くことにより、例えば・４５μＭジカ
ムバおよび４　ｆｌｔカゼイン氷解物全含有するＧｒａ
ｙ等（１９８５）に記載された液体培地５０＋ｔＪ中に
カルス０５？を置くことにょシ開始される。その他の適
当な培地の中で、Ｇｅｏｒｇｅ等（１９８７）に記載の
ものがある。懸濁培養体を１０℃と４０℃、好ましくは
２０℃と３２℃、最も好筐しくに２５℃と３０℃の間の
温度で生長させる。培養期間の間の明と暗の連続は有利
であり得る。懸濁体を好ましくは、５ないし２０時間、
好ましくは１６時間の明期間、總いて５ないし２０時間
、好ましくは８時間の暗期間で生長させる。光強度は典
型的にはｏ１μＥ／ｍ”ｓと１００μＥ／ｍ’ｓ　（ｇ
＝７（７シユｌ；１イン；ｍ＝メートル；Ｓ＝秒）、好
ましくは３０μＥ／ｍ”　ｓと８０μＢ／ｍ”ｓの間で
ある。培養期間の間の懸濁体の振とうも有利である。振
とうは例えば、回転振とり機上約１１００ｒｐないし１
５０ｒｐｍで、光透過性のプラスチックフィルムおよび
綿栓またはその他の適当な栓で密閉したプロングフラス
コ中で行われる。約３ないし５週後、よシ大きい細胞塊
を約３０秒間静置して、そして小さい細胞群のみを含有
する上清培地を除き、そして新鮮培地に移して新しい培
養を開始させる。

この操作は周期的に、好ましくは３ないし４週毎に、よ
り小さい群の大きさおよび質により判断される最も成功
する培養体を用いて繰返され得る。４ないし２０回、通
常６ないし８回の移し変えの後、懸濁体は胚形成性でな
い細Ｕ’に実質的に含まず、そして胚形成性細胞群の大
部分が典型的には約１５０μｍないし２０００μｍの大
きさである。

胚形成性懸濁体を得るための方法において、懸濁体は小
さい前胚形成性塊から主として構成されることが好まし
い。より大きい材料を静置した後、懸濁体の上部だけを
継代培養することにより、前胚形成性塊の比率を顕著に
高めることも可能である。

従って本発明の１つの目的は、プロトプラストが単離さ
れ得るプーイデアエ亜科のイネ科植物から誘導された胚
形成性細胞培養体、懸濁培養体またはカルス培養体であ
り、前記プロトプラストは細胞壁を再生し、分裂し、そ
して植物および好ましくは稔性植物体に再生され得るカ
ルスを形成する。

グラス、特にポア、フエストウ力、ロリウム、プロムス
、トリセタム、アグロステス、フレウム、アロペクルス
およびダクチリスからなる属から選択されるものから誘
導される胚形成性細胞培養体（懸濁培養体およびカルス
培養体）が本発明の好ましい実施態様である。カモガヤ
の胚形成性懸濁体が最も好ましい。

本発明のその他の好ましい実施態様は小穀類、特にアベ
ナ、トリチカム、セカーレおよびホルデウムからなる属
から選択されるものから誘導される胚形成性細胞培養体
（懸濁培養体およびカルス培養体）からなる。

本発明のその他の目的は、プロトプラストが単離され得
るプーイデアエ亜科のイネ科植物から誘導された胚形成
性カルスであり、前記プロトプラストは細胞壁を再生し
、分裂し、そして植物および好ましくは稔性植物体に再
生され得るカルス全形成する。

グラス、特にポア、フェストウ力、ロリウム、プロムス
、トリセタム、アグロスチス、フレウム、アロペクルス
およびダクチリスからなる属から選択されるものから誘
導される胚形成性カルスが本発明の好ましい実施態様で
ある。カモガヤの胚形成性カルスが最も好ましい。

本発明のその他の好ましい実施態様は小穀類、特にアベ
ナ、トリチカム、セカーレおよびホルデウムからなる属
から選択されるものから誘導される胚形成性カルスから
なる。

本発明のその他の目的は、前記胚形成性細胞培養体から
誘導され、プロトプラストまたは植物細胞から再生され
るプーイデアエ亜科のイネ科植物、好ましくは相性イネ
科植物およびそれらのムカゴである。

イくツカノ植物組織は、例えばＷｉ　ｔｈｅｒｓ　（１
９８６）およびその中に引用された文献に記載されたこ
の分野で公知の方法により凍結保存され得る。

しかしながら、これらの方法は一般的に適用可能ではな
く、特にイネ科植物の胚形成性細胞培養体（懸濁培養体
およびカルス培養体）の凍結保存に適用できない。全て
のイネ科植物の懸濁培養体およびカルス培養体を包含す
る胚形成性細胞培養体は低温での凍結保存により懸濁状
態で保存され得ることが、本発明の範囲内で驚くべきこ
とに金兄い出された。

イネ科植物の懸濁培養体およびカルス培養体全包含する
胚形成性細胞培養体を凍結保存するこの方法は、 （ａ）　　適当な液体培養培地中に活発に生長する懸濁
培養細胞またはカルスを分散し、 （ｂ）　　この培養液全氷点（約Ｄ℃ないし５℃）まで
冷却し、 （ｃ）　　ほぼ同じ温度で前記の予め冷却した培養液を
適当な凍結保護用水溶液と混合し、 （ｄ）　　生成した混合物を毎分約０，０１℃ないし約
２０℃の速度で、好ましくは毎分約０．１℃ないし約５
℃の速度で、より好ましくけ毎分約０２℃ないし約２℃
の速度で、最も好ましくは毎分約０５℃ないし約１℃の
速度で、約−２０℃と約−６０℃の間、好ましくは約−
３５℃と約−５０℃の間、非常に好ましくは約−６８℃
と約−４４℃の間の温度まで冷却し、（ｅ）　　予め冷
却した混合物を液体窒素または液体空気中で衝撃凍結し
く　５ｈｏｃｋ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ　）　、そして （ｆ）　　凍結した混合物’１−１００℃より低い温度
、好ましくは液体窒素または液体空気の温度で貯蔵する
、ことからなる。

胚形成性細胞培養体（ｕ、濁培養体およびカルス培養体
）の凍結保存のこの方法は、全ての植物に一般に適用可
能である。これに関して「イネ科植物」という用語は、
バンブソイデアエ（例えばタケ）、アンドロボゴニデア
エ（例えばサッカラム、ツルガム、およびゼア）、アル
ンジネアエ（例えばフラグミテス）、オリゾイデアエ（
例えばオリザ）、バニコイデアエ（例エハバニカム、ペ
ンニセタムおよびセタリア）およびプーイデアエ（例え
ばポア、フェストウカ、ロリウム、プロムス、トリセタ
ム、アグロスチス、フレウム、ダクチリスおよびアロペ
クルスを包含するグラス、またはアベナ、トリチカム、
セカーレおよびホルデウムを包含する小穀類）全包含す
るが、これに限定されない。

イネ＄＋植物内の好ましい標的群はグラスと小穀類とか
らなるプーイデアエ植物の上記の特徴づけられた群であ
る。

本方法は典型的には以下のように行われる：活発に生長
するカルスまたは懸濁培養細胞（通常、継代培養して１
ないし４０日後、好ましくは２ないし１０日後）の適当
量を適当な液体培地中に分散させる。そのような適当な
培地は５Ｈ−０，８Ｈ−３０もしくは８Ｈ−４５培地、
０Ｍ８．ＫＭ−８１）、Ｉ（Ｙ−２、マンニトール、シ
ョ糖もしくはその他の糖または糖アルコール溶液、アミ
ノ酸（例えばＬ−プロリン）の溶液または水をも包含す
るが、これに限定されない。細胞の生長に適当な培地、
または糖もしくは糖アルコールの水溶液が好ましい。典
型的にはカルス００１２ないし０．１２を液体培地１ｄ
当念９に分散させ、そして次に氷上で冷却する。

適当な凍結保護溶液は典型的には水中の浸透圧的に活性
な成分およびＤＭＳＯの混合物である。

それらを段階（ｂ）の予め冷却した分散液に添加する時
、それらを通常氷上で予め冷却するが、しかしおよそ室
温までのより高い温度であっても良い。凍結保護用溶液
の温度は重要でない。

代表的な凍結保護溶液はｏ、　ｓ　Ｍないし２Ｍグリセ
ロール、０５Ｍないし２ＭＬ−７’ロリン、０．５Ｍな
いし４Ｍジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）からなるｐ
Ｈａ乙の水溶液または０５Ｍないし２Ｍグリセロール、
０．５Ｍないし２Ｍショ糖および０．５　Ｍないし４　
Ｍ　ＤＭＳＯからなるＩ）Ｉ−１５ないし７の水溶液を
包含するが、限定されない。凍結保護溶液用のその他の
適当な成分は糖および糖アルコール、アミノ酸、および
ポリマー例えばＰＥＧを包含する。ＤＭＳＯを含有する
凍結保護溶液は使用前に祈念に調製することが好ましい
が、また凍結貯蔵されても良い。その他の凍結保護溶液
は使用前に調製しても良いが、しかし好ましくは新たに
調製するか凍結しておく。

凍結保護溶液は典型的に分散された懸濁培養細胞または
カルスを含有する溶液に１秒ないし４週間、好ましくは
１秒ないし１８、より好ましくは１秒ないし１時間かけ
て添加される。氷上に適当な期間、好ましくは１分ない
し２日、より好ましくは１０分ないし６時間、非常に好
ましくけ３０分ないし２時間、細胞を凍結保護溶液に晒
す。この時間の間または後に小部分を、殺菌した凍結保
存用バイアルまたはあらゆるその他の適当な容器に分取
し、そして通常氷上に保つ。

上記の小部分の添加に先だってバイアルを好ましくは０
℃と４℃の間の温度である液体浴の表面に浸ける。この
浸漬段階は絶対に必要であるわけでないが、ある場合に
は有利であり得る。

この浴はエタノールまたはその他のあらゆる適当な冷媒
から構成されても良い。浴は通常冷媒全混合した伏仰に
保つために攪拌装置を備えており、制御された速度で冷
媒の冷凍を可能にする装置に連結されている。

バイアルを冷媒内にいったん入れたら、温度を適当な速
度で下げる。適当な速度は、毎分約０．０１℃ないし約
２０℃の速度、好ましくは毎分約０．１℃ないし約５℃
の速度、より好ましくは毎分約０．２℃ないし約２℃の
速度、最も好ましくは毎分約０６５℃ないし約１℃の速
度である。

温度が低温、典型的には約−２０℃と約−６０℃の間、
好ましくは約−３５℃と約−５０℃の間、非常に好まし
くは約−３８℃と約−４４℃の間の温度まで達した時に
、バイアルを例えば液体窒素または液体空気中に落とす
ことにより衝撃凍結させる。それらを液体窒素または液
体空気中に落とす最適温度は、使用した異なる培養体に
より変わるが、しかし一般には一２０℃と一５０℃の間
であり、そして当業者によシ容易に決定され得る。バイ
アルを次に液体窒素または液体空気中、その液体自体の
中かまたはその蒸気中に、−１００℃を超えない温度で
貯蔵する。

いくつかの培養体に関して、最適温度に達したとき液体
窒素中にすぐに落とす代わりにある期間ある安定な低温
にバイアルの温度を保持することは望ましいかも知れな
い。

生存可能な細胞培養体全回収するために、カルス材料を
含有するバイアルを液体窒素から取り出す。バイアルを
約１０℃ないし５０℃、好ましぐは３５℃ないし４０℃
の湯洛中激しく攪拌しながら、全ての氷が融けるまで融
解させる。

プーイデアエ亜科の凍結保存された細胞のバイアルは、
全ての氷が融解するまで室温で空気中にそ；？’Ｌを放
置することにより融解させ得ることが本発明の範囲内で
驚くべきことに見い出された。バイアルを次に数秒ない
し６０分間、より好ましくは１ないし１０分間、その中
に含まれるカルス材料を適当な培地上に移す前に氷上に
保持しても良い。

バイアルの内容物を適当な固化培養培地上に拡げる。典
型的には融解培養液０．５　ａｔ　ｆ培地３０ｍ１ない
し５ｏｍＡ！含有の各々直径１０ｃｆｎのベトリ皿上に
拡げる。凍結保護溶液を細胞から分離させて排出するた
めに固体培地は傾斜をつけて注がれても良いし、また穴
をまわりに堀っても良い。細胞全液体培養培地またはそ
の他の適当な溶液で、例えば糖もしくは糖アルコール、
またはアミノ酸溶液で１回または数回、適当な培養培地
に移す前に洗浄しても良い。

ペトリ皿を上で胚形成性カルスに記載したように２７℃
暗所で培養する。次いで、上記の通常の胚形成性カルス
に対するようにカルスを継代培養する。

上記段階Ａから生じた胚形成性懸濁液からプロトプラス
トを調ｔする。懸濁培養培地から胚形成性細胞群を単離
し、例えばナルデフ０．２μｍフィルターで段階Ａの懸
濁培養液ｆｆｉ濾過し、そして生成した細胞群を、プロ
トプラストを傷っけないで細胞壁を除去し得る適当な酵
素調剤と培養することによシ、単離および精製を行う。

酵素はフィルター滅菌したものを用いる。全ての培養操
作は滅菌材料を用いて滅菌条件下で行う。適当な酵素調
剤は、例えば７ｍＭＣａＣ？１２・Ｈ２Ｏ。

０．７ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，）Ｉ２ｏ　、　３ｍＭ　
ＭＢＳ　（ｐＨ５−７）およびブドウ糖（５５０ｍＯｓ
／ＫｇＨ２０に対して）中の約２％（Ｗ／Ｖ）のセルラ
ーゼＲ８からなってい、ても良い。通常混合物を薄暗い
光（約５μＶｍ２ｓ）の中回転振とり機上、約ｓｏｒｐ
ｍでゆつくシ振とうさせるが、これは重要ではない。プ
ロトプラストが遊離されるまで０℃と５０℃、好ましく
は１０℃と３５℃、最も好ましくは２６℃と３２℃の間
で消化を続ける。消化に要する時間は典型的には数秒と
２日、好ましくは１時間と１８、最も好ましくは３と５
時間の間である。

遊離されたプロトプラストを標準法、例えば濾過、遠心
分離および洗浄により集めそして洗う。

この段階で浮上段階を含めても良い。この場合洗浄した
プロトプラストラ適当な培地、例えば’／ヨ糖で７００
　ｍＯ５７Ｋｇ　Ｈ２Ｏ（！：したＫＭ　−８ｐ培地、
またはもちろんＧｅｒｇｅ等（１９８７）に記載された
その他の適当表培地の上に積層する。

約６０２で約１０分間遠心分離した後、界面に帯状とな
ったプロトプラストラ集める。最後にプロトプラス）１
同じ培養培地中に再懸濁し、濾過を、例えばステンレス
鋼メツシュスクリーン（メツシュサイズ２０μｍ）にそ
れらを通することによシ行うことができる。

ショ糖上に浮上しなかったプロトプラスト調製物の全未
消化細胞の混入は、全体の約０．００１ないし００１％
である。ショ糖浮上段階で包含される細胞混入は最低で
ある。しかしながら、ショ糖浮上段階は最も濃い細胞質
を有するプロトプラストの重大な損失を生じる。結果的
に、浮上段階が包含される場合、プレート効率は１０倍
まで低下し得る。プロトプラストはまたその他の公知方
法、例えばショ糖溶液上への浮上、またはその他の適当
な緩衝化高密度媒体、例えば登録商標パーコール（Ｐｅ
ｒｃｏｌｌ■）を用いて精製することもできる。

プロトプラスト収率および次のプレート効率（ｐｌａｔ
ｉｎｇ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　）は、プロトプラスト
単離に用いた懸濁培養液を予め１ないし３０日、好１し
くは５ないし１０日継代培養する場合に最適である。

上で特徴づけられた酵素混合物はＬｕ等（１９Ｂ１）に
記載されたものの変形であり、そして試験されたその他
の混合物より優れていることがわかり、新鮮重量１２当
次り４０Ｘ１０’ないし７０×１０６個プロトプラスト
の収率を与える。また、しかしながら、ＫＭ−８ｐ培地
またはその他の適当な培地、例えばＧｅｏｒｇｅ等（１
９８７）に記載のものの中の２％（Ｗ／Ｖ）セルラーゼ
Ｒ８もまたプロトプラストのかなり良好な収率を与える
。収率および次のプレート効率に関してブドウ糖はショ
糖より明らかに優れ、そしてプロトプラストの単離の間
に用いられる浸透圧保持剤としてのマンニトールよりい
く分優れている。この分野で公知のその他の適当な酵素
混合物が本発明の方法で使用されても良い。

濾過、例えば２０μｍスクリーン全通過させた後に得ら
れたプロトプラストは平均で直径１２μｍないし１５μ
ｍであり、そして濃密に細胞質性である。

従って、本発明は植物、好ましくは稔性植物に再生され
得るプーイデアエ亜科のイネ科植物のプロトプラストの
作製方法を提供する。この方法は： （ａ）　　プーイデアエ亜科のイネ科植物の適当な部分
、好ましくは幼白菜の基部、未熟生殖胚、未熟花序、成
熟種子または実生組織、最も好ましくは最も幼若な白菜
を単離し、 （ｂ）　　この組織を胚形成性カルスおよび胚の形成を
誘導し得る培地中で培養し、 （ｃ）　　胚形成性カルスおよび胚を連続的増殖を持続
させ得る新鮮培地上で周期的に継代培養し、（ｄ）口な
いし５００回、好ましくは口ないし１００回、最も好ま
しくは６ないし８回の移し換え後に胚形成性細胞群を単
離し、そして （ｅ）　　適当な酵素混合物で細胞壁を除去し、そして
生成したプロトプラストを単離および精製する、ことか
らなる。

本発明のその他の実施態様は、植物、特に稔性植物に再
生され得るブーイデアエ亜科のイネ科植物のプロトプラ
スト（細胞壁再生後の植物細胞を含む）を含む。細胞培
養体または胚形成性細胞懸濁体のいずれかから誘導され
たプロトプラストまたは細胞が好ましい。

前記プロトプラストまたは植物細胞から再生されたプー
イデアエ亜科のイネ科植物、特に相性イネ科植物および
それらのムカゴもまた含まれる。

長 上記段階Ｂの精製プロトプラストを外因性ＤＮＡと処理
するか、またはせずに適当な液体または固化培地中にブ
レーティングする（外因性ＤＮＡとの処理は次のパラグ
ラフに詳しく記載するであろう）。いくつかの適当な培
地は適当な濃度の寒天および植物生長調節剤を含むＫＭ
−８ｐ；ＲＹ　−２（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ等、　１９７９
）；および５Ｈ−３０およびＳＨ−４５に基づいたもの
を包含する。好ましい固化剤は寒天、特にジ−プラーク
アガロース［米国、マイン州、ロックランドにあるＦＭ
Ｃ社、　マリンコロイズディビイジョン（Ｍａｒｉｎｅ
Ｃｏｌｌｏｉｄｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）コである。使用
する場合、ジ−プラークアガロースの濃度は１ｌＬ１チ
と２．５％。

好ましくはＬＬ６％と１．５％（Ｗ／Ｖ）の間である。

アガロース含有培地上でのプロトプラストのグレーティ
ングは５ｈｉ１１ｉｔｏ等（１９８５）、欧州特許出願
ＢＰ−ａ、１２９，６８８（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ等）、ま
たはＡｄａｍｓ等（１９８３）に記載の方法に従って行
うことができる。これらの刊行物は参照によシ本明細書
内に編入する。

プロトプラストを培養する培地はプロトプラストが分裂
し、そしてコロニーを形成することを支持する適当な物
質を含有し得る。これらの物質は、例えば２．４−Ｄ、
ジカムバ、ピクロラム、またはその他の植物生長調節剤
を包含する。適当な植物生長調節剤はこの分野で公知で
ある。

そのような物質の濃度は通常［ＬＯ１ｙ／ｌないし１０
０■／ｌの範囲である。

サリチル酸およびその誘導体は、プーイデアエのプロト
プラストの分裂および／または該プロトプラストからコ
ロニー形成を促進し得る。

サリチル酸の誘導体はＯ−アシルおよび０−アリール誘
導体を包含するが、これに限定されない。０−アシル誘
導体は短鎖アシル基、例えば炭素原子数１ないし７、好
ましくは１ないし４、そして最も好ましくは２もしくは
５を有するものを含むが、これに限定されない。０−ア
リール誘導体は融合していてもいなくても良い１個また
はそれ以上の５または６員環を有するものを含むが、こ
れに限定されない。この環は非置換または炭素原子数１
ないし５のアルキル基、炭素原子数１ないし４の０−ア
ルキル基、ハロゲン原子（特に塩素原子および臭素原子
）、ニトロ基、アミノ基および炭素原子数１ないし４の
アルキル基によジ置換されたアミノ基を含む基１個また
はそれ以上により置換されても良い。

ｆ　ＩＪチル酸の誘導体はまたカルボン酸エステルをも
含む。好ましいカルボン酸エステルはアリールおよび炭
素原子数１ないし４のアルキル基を有するアルキルエス
テルである。

さらに、サリチル酸の誘導体はサリチル酸環が例えば炭
素原子数１ないし４のアルキル基、炭素原子数１ないし
４のＯ−アルキル基、ハロゲン原子（％に塩素原子およ
び臭素原子）、ニトロ基、アミ７基および炭素原子数１
ないし４のアルキル基によジ置換されたアミノ基を含む
基１個またはそれ以上によシさらに置換された化合物を
包含する。

グーイデア二のプロトプラストおよび細胞の分裂および
／ｌたは該プロトプラストからのコロニー形成を促進す
る好ましい化合物は、０−アセトキシ安息香酸（アスピ
リン、アセチルサリチル酸）、 ０−ヒドロキシ安息香酸（サリチル酸）、０−メトキシ
安息香酸（メチルサリチル酸）、および ０−ジメチルカルバモイル安息香酸（０−（ｃ０−ジメ
チル）−サリチル酸〕である。

サリチル酸またはそれらの誘導体の培養培地中の濃度は
、適当には（Ｌ　１　ｔｒｑ７ｔないし３０００■／ｌ
、好ましくは１０　ｑ／ｌないしｓ　ｏ　Ｏｍｙ／Ｌ　
１そして最も好ましくは約１００１ｑ／ｌである。

プロトプラストが培養される培地は適当な細胞、例えば
トウモロコシ、カモガヤまたはその他のイネ科植物、ま
たはその他の（双子葉類）植物の生長によシコンディシ
ョニングを予め行った培地を含有しても良い。イネ科の
種の胚形成性懸濁体を生長させた培地が好ましい。

カモガヤの胚形成性懸濁体を生長させた培地が非常に好
ましい。上記のコンディショニングを行った培地は、全
培地の０％と１００　％（ｖ／ｖ　）、好ましくは５％
と５０％（Ｖ／Ｖ　）、よυ好ましくは３０％と４０％
（ｖ／ｖ　）の間の比率であって良い。

プロトプラストを１２週まで、好ましくは６週まで、最
も好ましくは１ないし３週の間継代培養しない固体また
は液体培地中で培養しても良い。本発明の好ましい実施
態様において、固体培地をＥＰ−Ｑ、１２９，６８８（
Ｓｈｉｌｌｉｔｏ等）に記載すしたように液体培地中に
置いても、またプロトプラストの分裂および／またはコ
ロニー形成を支持するようないくつかのその他の方法で
処理しても良い。

プロトプラストを明所で、または好ましくは暗所で、０
℃と５０℃、好ましくは２０℃と３２℃、最も好ましく
は２５℃と２８℃の間の温度範囲で培養する。光強度は
典型的にはＩ１１μＥ／ｍこと２００μＥ／ｍＳｓ好ま
しくは３０　ｐＥ／ｉｓと９０　μＥ／ｉｓの間である
。

ＫＭ−ａｐ培地を用いて得られたプレート効率は、プロ
トプラスト調策物の質に依存してα５チない鼻 し１０チを変化する。プロトプラスト培養地への３０％
ないし４０％（Ｖ／Ｙ）のコンディショニングした懸濁
培養培ｔｅの添加（それらの中で細胞生長によりコンデ
ィショニングを行い、そしてブドウ糖の添加によｌ）　
５５０　ｙｘ　Ｏｓｍ／１（ｙ　Ｈ２Ｏまでにした懸濁
培養培地）は、プレート効率を顕著に高めないが、しか
し幼プロトプラスト誘導コロニにおける分裂過程を促進
する。

本発明の好ましい実施態様において、プロトプラストは
アガロース固化培地にブレーティングされる。第一細胞
分裂はプロトプラストをブレーティングして約２日後に
現われる。引き続く分裂は２ないし３日毎に起こる。第
一分裂が７日後に観察されることもあるという事実でわ
かるように、この過程は同時ではない。ブレーティング
して５ないし２０日後、好ましくは１０ないし１４日後
、アガロース固化培地を断片に切シ、そして細胞コロニ
ーを含有するその断片を液体栄養培地に移す。この操作
は「ビーズ培養法（ｂｅａｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅ　）Ｊとしてこの分野では公知であシ、そ
して５ｈｉ１１ｉｔｏ等（１９８３）およびＥＰ−０，
１２９，６８８（５ｈｉｌｌｉｔｏ等）に詳しく記載さ
れている。

アガロース同化培地を切断する代わりに、アガロース培
地を液化させ、そしてその液化培地を液体栄養培地に移
すことも可能である。この変法はＡｄａｍｓ等（１９８
３）に従って行うことができる。両方の場合（切断また
は液化）において、液体成分はブドウ糖またはショ糖を
含有するＫＭ−８ｐ培地に観察される良好なコロニー生
長を残し得る。しかしながら、生長速度に関して最適液
体成分は４　ｙ／ｌカゼイン氷解物を有する５Ｈ−４５
培地である。ビーズ培養を開始して約２ないし３週間以
内に、新しい懸濁培養体をプレート中に観察することが
できる。アガローススラブの顕微鏡的観察により、通常
表面に最も近いコロニーのいくつかが、液体中に生長し
だし、そしていまだアガロースに固着している細胞の小
塊を遊離することがわかる。新しい懸濁液は迅速に増え
、そしてもう２週間後、通常の方法で懸濁培養体として
移されるか、またはカルス増殖用の５Ｈ−３０プレート
上にブレーティングされる。またアガロースをアガロー
ス固化５Ｈ−４５培地含有のプレート上に拡げ、そして
コロニーを生長させ得る。

従って本発明はまた細胞培養体が稔性植物を含む植物に
再生され得るブーイデアエ亜科のイネ科植物のプロトプ
ラストから細胞培養体（ｗＡ濁培養体またはカルス培養
体）を作製する方法にも関する。この方法は： （ａ）　　植物体に再生され得るプーイデアエ亜科のイ
ネ科植物のプロトプラストを、それらが細胞コロニーを
形成するまで適当な培地中で培養し、そして Φ）細胞培養体形成を促進するための適当な培地上で前
記細胞コロニーまたはそれらの一部を培養し、そして （ｃ）　　生じる細胞培養体を単離する、ことからなる
。

段階（１））は絶対に必要であるわけではない。細胞培
養または胚が形成されるまでプロトプラストを段階（ａ
）で培地中に留めることもできる。

前記細胞培養体から再生されたプーイデアエ亜科のイネ
科植物、特に相性イネ科植物もまた本発明は包含する。

本発明の好ましい実施態様は、アガロース固化培地上に
プロトプラストをブレーティングし、該アガロース同化
培地を液化または切断し、この液化または切断した培地
を液体栄養培地に移し、そして細胞コロニーが形成され
るまで培養することからなる。

段階伽）の上記細胞コロニーが液体栄養培地に遊離され
た細胞および／または細胞塊から生じる方法が好ましい
。

この段階およびその他の段階で作製されたカルスおよび
懸濁培養体は段階Ａに記載したように凍結保存しても良
い。

段階Ｄ：　カルスから小植物の再生 プロトプラストから誘導されたカルス〔段階Ｃ〕、好ま
しくは砕い球形カルスは、胚形成を誘導するための適当
な新鮮培地上に１度またはそれ以上、好ましくは２週毎
に継代培養される。

適当な誘導培地は適当な濃度で糖および植物生長調節剤
を含有する８Ｈ培地を包含する。

形成されるあらゆる胚を取出し、そしてそれらを成熟さ
せそして発芽させるのに適当な培地上にブレーティング
する。適当な培地は例えば適当量の糖および植物生長調
節剤を含有する変形を含む５Ｈ−３０または０ＭＳ培地
を包含する。

プレートは明所に置く［冷白色螢光燈または日光と登録
商標グローラックス（Ｇｒｏ−１ｕｘ■）（シルバニア
）螢光燈との混合から、またはその他のあらゆる適当な
螢光燈からの１０μＥ／ｒｒｌｓないし２００μＥ／ｍ
’ｓ］。成熟胚はブレーティングして約２ないし５週間
後に観察される。ある場合には、新鮮培地への１回また
はそれ以上の余分な移し変えが胚成熟の完了には有利で
あシ得る。この胚はさらに分化し、適当な期間、典型的
には１週ないし６ケ月、より典型的には１ないし３ケ月
後に小植物体を形成する。

また、プロトプラストから誘導されたカルス〔段階Ｃ〕
、好ましくは砕い球形カルスは、胚形成および成熟を誘
導するための適当な新鮮培地上に１度またはそれ以上、
好ましくは２週毎に継代培養される。適当な誘導培地は
適当な濃度で糖を含みそして植物生長調節剤を含有しな
いＤＭＳ培地を包含するが、これに限定されない。

プレートは明所に置く［冷白色螢光燈または日光と登録
商標グローラックス（Ｇｒｏ　−１ｕｘ（８）（シルバ
ニア）螢光燈との混合から、またはその他のあらゆる適
当な螢光燈からの１０μＥ／ｍ　ｓないし２００μＥ／
ｍｓ］。胚はさらに分化し、適当な期間、典型的には１
週ないし６ケ月、よシ典型的には１ないし３ケ月後に小
植物体を形成する。

段階りに従って得られた小植物体を適当な培地、例えば
生長調節剤を含有しない５Ｈ−０またはＯＭＳに移す。

また、根または苗条生長を刺激する生長調節剤を添加し
ても良い。適当な生長調節剤はこの分野で公知である。

小植物体はそれらが根を形成するまで前記培地上で培養
される。小植物体から全てのカルスを取除くことは重要
であるが、これはこの新しく形成されたカルスが小植物
体の生長に阻害的であることがわかっているからである
。このために、小植物体を移し変えるときに滅菌蒸留水
で洗浄し得る。

続いて生じるカルスは一定間隔、好ましくけ３ないし３
０日毎、より好ましくは１ないし２週毎に除去されなけ
ればならない。板形成に要する時間は典型的には約１な
いし４週間、より典型的には約２週間である。良好な根
糸を有する小植物体を温室中の土に移し、そして徐々に
硬化させる。この段階での根の十分な長さは１１１１１
１Ｆ＋ないし１０ｍ１よシ典型的には１２ｃｒＰｔない
し５αの範囲であシ、そして苗条は１ｃＷ１ないし１０
画、より典型的には２ｃｍないし５ｃＷ１の範囲である
。

また、小植物体は耕作者の分離により不定期に試験管内
で継代培養され、そして小植物体を新鮮培地、例えば５
Ｈ−０または０ＭＳ上に置くことができる。

従って、プーイデアエ亜科のイネ科植物、好ましくは稔
性植物をカルスから再生させる本発明の方法は、 （ａ）　　プロトプラストから誘導され、そして胚形成
を誘導し得る培地上で植物に再生され得るプーイデアエ
植物のカルスを、胚が形成されるまで培養し、 Φ）胚の成熟および発芽の誘導に適当な培地上で胚を培
養し、そして （ｃ）　　得られた小植物体を土に移して成熟植物を形
成するには十分に生長するまで該小植物体を培養する、
ことからなる。

開花はＨｅ１ｄｅ（１９８７）の記載のようにまたは使
用した特定の種または変種に適当なように誘導され得る
。開花を誘導する方法はプーイデアエにおいて公知であ
る。これらの植物から産生された種子を適当な方法で処
理し、発芽を誘導し、そして鉢中に蒔くか、または殺菌
しそして［１８％寒天もしくはアガロース、またはゲル
ライトもしくはその他のあらゆる適当なゲル化剤で固化
した生長調節剤を含まないＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳ
　ｋｏｏｇ培地（ＯＭＳ　）上にブレーティングする。

種子はまたハイグロマイシン耐性特性の遺伝を決定する
ためにハイグロマイシンＢを１０μｇ／ｍｌと１０００
μｇ／ｒａｔの間で含有する培地上に蒔かれても良い。

従って、プーイデアエ亜科の相性イネ科植物をカルスか
ら再生させる本発明の方法は、（ａ）　　プロトプラス
トから誘導され、そして胚形成を誘導し得る培地上で稔
性植物に再生され得るプーイデアエ植物のカルスを、胚
が形成されるまで培養し、 Φ）胚の成熟および発芽の誘導に適当な培地上で胚を培
養し、 （ｃ）　　得られた小植物体を土に移して成熟植物を形
成するには十分に生長するまで該小植物体を培養し、そ
して （ｄ）　　開花調節または野外受粉で種子を得る、こと
からなる。

本発明のその他の実施態様は前記カルスから再生された
ブーイデアエ亜科のイネ科植物、特に稔性植物である。

段階Ｆ：　外因性ＤＮＡでのプロトプラストの処理 遺伝物質内に安定に組込まれた外因性ＤＮＡの全てまた
は一部を含有する細胞を作製するために、ブーイデアエ
のプロトプラストは外因性ＤＮＡで処理され得る。外因
性ＤＮＡは本発明の範囲内ではプロトプラストに添加さ
れたあらゆるＤＮＡからなると理解すべきである。それ
は形質転換される植物のものに相同であっても、また非
相同であっても良い。外因性ＤＮＡはプーイデアエ亜科
のイネ科植物、好ましくは稔性植物中で活性なプロモー
ターを含有しても、または植物ゲノム内に既に存在する
プロモーターを利用しても良い。外因性ＤＮＡは生じた
細胞または形質転換された細胞から再生された植物の遺
伝型および特に表現型を変える遺伝子を１種またはそれ
以上含み得る。しかしながら、１種またはそれ以上の望
ましいタンパク質物質をコードする遺伝子配列が発現さ
れ、そして１種またはそれ以上の機能的な酵素またはポ
リペプチドを、生じた細胞および植物内にそれぞれ産生
ずることが望ましい。

本発明の範囲内で外因性ＤＮＡは例えば転写工程の調節
に包含される非コード性調節ＤＮＡ配列からなると理解
すべきである。

プロトプラストの外因性ＤＮＡでの処理は以下の刊行物
に記載された方法に従って行われ得る：〔パスコウスキ
ー、ジエ−、（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ、　Ｊ、　）　。

等Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ第３巻、第１２号（
１９８４年）第２７１７−２７２２頁；欧州特許出願Ｅ
Ｐ−Ｑ、１６４，５７５　（パスコウスキー、ジュー１
等）；シルリド、アール・デイ−・（５ｈｉｌｌｉｔｏ
、　Ｒ，Ｄ、　）　ｒ等、　　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、第３巻（１９８５年）第１０９９−１１０３頁
；ボトリクス、アイ・（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、　１．）。

等、　　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１９９（
Ｎ）８５）　１８３−１８８；Ｌｏｅｒｚ、　Ｈ，、ｅ
ｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、第
１９９巻（１９８５年）第１７８−１８２頁；フロム、
エム・イー　−（Ｆｒｏｍｍ、　Ｍ、　Ｅ、　）　、等
、　Ｎａｔｕｒｅ、第６１９巻（１９８６年）第７９１
−７９３頁；英国特許出願ＧＢ−２，１４ｃｌ、８２２
〔メトラー、アイ、ジｘ−（Ｍｅｔｔｌｅｒ。

１、　Ｊ、　））　；　オヨヒネグルチウ、アイ、　（
Ｎｅｇｒｕｔｉｕ。

■、）２等、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌｏｇｙ
、第８巻（１９８７年）第５６３−３７５頁〕。

これらの刊行物を参照によ９本明細書に編入する。

外因性ＤＮＡはあらゆる形態、例えば裸の線状または環
状ＤＮＡ　、　　リポソーム内に取シ囲まれたＤＮＡ、
スフェロプラスト内のＤＮＡ　、その他の植物プロトプ
ラスト内のＤＮＡ　１塩と複合したＤＮＡ。

等で添加され得る。ＤＮＡの取込みは、上記の参考文献
に記載された方法を含む当該分野で公知のあらゆる適当
な方法により刺激され得る。

主として本発明において意図されるキメラ遺伝子は、価
値ある特性、病原体（例えば植物病原菌、バクテリア、
ウィルス他）に対する増加した耐性；化学物質〔例えば
除草剤（例えばトリアジン、スルホニル尿素、イミダゾ
リノン、トリアゾロ−ピリミジン、ビアラホス、グリホ
セート他）、殺虫剤またはその他の殺生物剤〕に対する
耐性；細胞毒素（例えば）・イグロマイシン、カナマイ
シン、クロラムフヱニコール他）に対する耐性；不利な
環境の（土壌のまたは大気の）影響（例えば熱、冷たさ
、風、望ましくない土壌状態、水分、乾燥地）に対する
耐性；または葉、種子、塊茎、根、茎他に保存または貯
蔵物質の増加した形成を有する形質転換された植物プロ
トプラスト、プロトプラスト誘導組織および最終的にプ
ロトプラス〜ト誘導植物体を提供する遺伝子である。ト
ランスジェニック植物により産生される望ましい物質は
、例えばタンパク質、デンプン、糖、アミノ酸、アルカ
ロイド、フレーバー、色素、脂肪他を包含する。

細胞毒素に対する耐性は、細胞毒素を解毒する酵素例え
ばカナマイシン、ノ・イグロマイシンおよびその他のア
ミノグリコシド抗生物質の解毒のためのネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ■型またはアミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼ■型またはグルタチオン−８−
）ランスフェラーゼまたはチトクロームｐ　−４５０ま
たはトリアジン、スルホニル尿素またはその他の除草剤
を解毒する公知のその他の異化酵素を細胞内に発現する
遺伝子によυ与えられ得る。

細胞毒素に対する耐性は、細胞毒素に耐性である「標的
酵素」の形態（細胞毒素の活性部位）、例えばスルホニ
ル尿素またはイミダゾリノンまたはこの代謝段階で作用
するその他の除草剤による阻害に感受性でないアセトヒ
ドロキシ酸シンターゼの形態、またはグリホセートによ
る阻害に感受性でない５−エノールビルビルクキメート
−３−ホスフェート（ＥＰＳＰ）シンターゼの形態を植
物体内に発現する遺伝子によっても与えられ得る。植物
細胞内において正しい細胞の区画、即ち上記の例におけ
るクロロプラストへのそれらの移動を可能にする形態の
これらの変更された標的酵素を発現することが有利であ
る。

ある場合において、遺伝子産物をミトコンドリア、液胞
内に、原形質小胞またはその他の細胞部分または細胞間
の（アポプラスティック）空間にさえも打ち込むことは
有利である。

あるクラスの菌に射する耐性は、例えば植物組織内にキ
チナーゼを発現する遺伝子の導入により与えられ得る。

多くの植物病原菌は菌糸および胞子構造の必須部分とし
てキチンを含み、例えばバシジオマイセテス（ｂａｓｉ
ｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）　（悪徳病菌およびさび病菌）
およびアスコマイセテス（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ　）
および不完全菌〔アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉ
ａ　）およびビボラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）を含ミ
、エキセロヒルム　チュルシカム（Ｅｘｅｒｏｈｉｌｕ
ｍｔｕｒｃｉｃｕｍ　）、コレオトリクム（ｃｏＣｏ１
１ｅｔｏｔｒｉｃｕ、グレオセルコスボラ（Ｇｌｅｏｃ
ｅｒｃｏｓｐｏｒａ　）およびセルコスポラ（ｃｅｒｃ
ｏｓｐｏｒａ　）　］である。キチナーゼはある種の病
原体のマイセリア（ｍｙｃｅｌ　ｉａ　）の成長を試験
管内で阻害し得る。キチナーゼを発現する植物の葉また
は根は、構造的にまたは病原体侵入に対応して多くのタ
イプの菌の攻撃に対して保護される。構造的な発現はあ
る種の植物で病原体の攻撃に対して正常な応答である誘
導可能な発現に比べ°て有利にも不利にもなるが、これ
は新たな合成に要求される遅れの時間がなくすぐに高い
レベルで存在するからである。

昆虫耐性は例えば、昆虫および／またはそれらの葉に対
して毒性であるポリペプチド、例えばバチラススリンギ
エンシスの結晶タンパク質（Ｂａｒｔｏｎ等、　　１９
８７　；　Ｖｅａｃｋ等、　　１９８７）をコード化す
る遺伝子により与えられても良い。昆虫耐性を与えるで
おろうタンパク質の第二の類はプロテアーゼ阻害剤であ
る。プロテアーゼ阻害剤は植物貯蔵構造体の共通な構造
物である（　Ｒｙａｎ。

１９７３）。大豆から単離された精製ボウマン−パーク
（Ｂｏｗｍａｎ　−Ｂｉｒｋ　）プロテアーゼ阻害剤は
テネプリオ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ　）幼虫の消化管プロテ
アーゼを阻害することが解っている［　１３ｉｒｋ等、
　１９６３］。

ササゲトリプシン阻害剤をコード化する遺伝子はＨｉｌ
ｄｅｒ等（１９８７）に記載されている。

プロチーアーゼ阻害剤をコード化する遺伝子は植物プロ
モーター、好ましくは構造プロモーター例えばカリフラ
ワーモザイクウィルス（ｃａＭＶ）３ｓｓブ０モーター
（Ｏｄｅｌｌ等（１９８５）に記載〕の制御の下で、適
当なベクター内に挿入され得る。

遺伝子、例えば大豆ボウマン−パークプロテアーゼ阻害
剤のコード配列はＨａｍｍｏｎｄ等（１９８４）に記載
されたｃ　ＤＮＡクローニング法を用いて得られ得る。

アミノ酸を１００個よシ少なく有するプロテアーゼ阻害
剤例えばりママメトリブジン阻害剤の遺伝子を得る別の
方法はそれを合成することである。コード配列はバック
トランスレーションによシ予測され、そして所望のペク
タに適当な制限部位は各端部に包含される。合成遺伝子
は３０ないし６０塩基の重複オリゴヌクレオチドを合成
することにより調製される。

断片にリン酸を添加し、連結しく　Ｍａｎｉａｔｆｓ等
。

１９８２）そして適当なベクター内にクローン化する。

挿入されたクローンが正しい配向にあることは配列決定
により同定され得る。プラスミドＤＮＡを単離し、そし
てプロトプラスト内への組入レニ使用する（　Ａｈｅｌ
等、　　１９８６）。

本発明はまた薬学的に活性な成分、例えばアルカロイド
、ステロイド、ホルモンおよびその他の生理学的に活性
な物質、およびフラビン、ビタミンおよび色素をコード
する遺伝子をも含む。それ故に本発明に意図される遺伝
子は、植物特有の遺伝子、例えばゼイン遺伝子（Ｗ４ｅ
ｎａｎｄ等、　１９８１）、ホ乳類特有の遺伝子、例え
ばインシュリン遺伝子、ソマトスタチン遺伝子、インタ
ーロイキン遺伝子、ｔ−ＰＡ遺伝子（ｐｅｎｎｉｃａ等
、　ｊ９８３）その他、または微生物起源の遺伝子、例
えばＮＰＴＩＩ遺伝子並びに合成起源の遺伝子、例えば
インシュリン遺伝子（Ｉｔａｋｕｒｌ等、　１９７５）
を包含するが、これに限定されない。

当然のこととして、転写過程の制御に包含される非コー
ド性ＤＮＡ配列は、プーイデアエ亜科の植物の植物プロ
トプラストの形質転換のために使用できる。

種々の植物遺伝子は、植物ホルモン、熱ショック、化学
物質、病原体、酸素および光不足を含む種々の内部およ
び外部要因により誘導されることが知られている。

植物ホルモンによる遺伝子調節の例として、アプシジン
酸（ＡＢＡ　）がワタの非常に多くのｍＲＮＡを誘導す
ることが知られている。

もう１つの例において、ジベレリン酸（ＧＣ３）はヒマ
の実の種子におけるマレートシンターゼ転写および大麦
糊粉層におけるα−アミラーゼアイソザイムを誘導する
。

ダイズの熱ショックタンパク質遺伝子の調節は詳細に研
究されている。４０℃で数時間の植物の処理により様々
ないわゆる熱シコックタンパク質が新たに合成される。

様々なそのような遺伝子が単離され、そしてそれらの調
節は詳細に研究されている。これら遺伝子の発現は転写
のレベルで主として制御されている（Ｗｉｌｌｍｉｔｚ
ｅｒに引用された５ｈｏｆｆ１等、　１９８８）。ｈｐ
ｓ７０遺伝子のブロモ−ターはネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ［１（Ｎｐｔ　ＩＩ）遺伝子に融合され
、そして熱ショックにより誘導されることがわかってい
る（　５ｐｅｎａ等、　１９８５）。

植物内の誘導可能な遺伝子のもう一つの類は、光調節化
遺伝子、とりわけリボース１，５−ビスホスフェートカ
ルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニットの
核コード化遺伝子を包含する。

Ｍｏｒｅｌｌｉ等（１９８５）およびＨｅｒｅｒｒａ−
Ｅｓｔｒｅｌ！ａ等（＋９８４）はエントウＲＵＢＩＳ
ＣＯ遺伝子の５′配置配列がキメラ様式で付着した時リ
ポータ−遺伝子に光誘導性を付与し得ることを示してい
る。

この観察はその他の光誘導性遺伝子、例えばクロロフィ
ルａ／ｂ結合タンパク質まで拡大された。

トウモロコシのアルコールデヒドロケナーゼ（ａｄｈ）
遺伝子は広範囲に研究されてきた。トウモロコシからａ
ｄｈｔ−５遺伝子を単離し、そして−時的に形質転換さ
れた組織が嫌気条件にさらされたとき、５′配置ＤＮＡ
の一部がキメラリポータ−遺伝子（例えばクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＣＡＴ）の発現
を誘導し得ることがわかった（Ｈｏｗａｒｄ等、　　１
９８７）。

本発明の好ましい実施態様において、プーイデア二のプ
ロトプラストはエレクトロポレーションとポリエチレン
グリコール処理の組合せにより形質転換される。段階Ｂ
で得られたプロトプラストの精製直後に、エレクトロポ
レーションを５ｈｉｌｌｉｔｏ等（１９８５）またはＢ
Ｐ−０，１６４，５７５（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ等）に
記載のように行う。プロトプラストを最後の洗浄後にエ
レクトロポレーション緩衝液中に再懸濁する。適当々エ
レクトロボレーシコン緩衝液は適量のＭｇｅｔ、含有の
マンニトール水溶液を包含する。ＤＮＡ水溶液をグロト
プラスト懸濁液に添加する。一実施態様において、　Ｄ
ＮＡは適当な制限エンドヌクレアーゼとの処理により線
状化したプラスミドｐｃＩＢ７０９　テある。生成した
混合物をゆっくわと混ぜる。

実施態様において、　［１５Ｍマンニトールおよび３０
　ｔｎＭ　Ｍ９ＣＬ　を中のＰＥＧの２４％（ｗ／り溶
液３１容量を添加する。混合後、プロトプラストを登録
商標ダイアログ（Ｄｉａｌｏｇ）エレクトロボレーター
（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）　［西ドイツ国、　
　Ｄ−４０００デュッセルドルフ１３．ハッ７ストラー
セ３４にあるダイアログゲーエムペーハー〕の室内に移
し、そして約２０００ｖ／副ないし５０００　ｖ／、、
の初期電圧の２ないし５パルス、好ましくは３パルス、
および１０μ秒の指数破壊定数を３０秒間隔で適用する
。試料を次にペトリ皿に移し、そして同化剤として１　
％　（Ｗ／Ｖ）ないし２５　％　（ｗ／りのアガロース
を添加し、プロトプラストを培地に十分に分散させ、そ
してアガロースに固化させる。

形質転換されたプロトプラストのこの培養体からの相性
トランスジェニックプーイデアエ植物ヲ含ムトランスジ
ェニツ７　　プーイデアエ植物は上記段階ＣないしＦに
記載のように再生される。

本発明のその他の好ましい実施態様において、プーイデ
ア二のプロトプラストはＮｅｇｒｕｔｉｕ　等（＋９８
７）に記載の方法に従って形質転換される。

この場合には精製プラスミドを１５　ｍＭと４５ｍＭの
間のＭｙＣｔ、含有のＣＬ５Ｍマンニトール中に最後の
洗浄後懸濁する。ＤＮＡを水溶液中に添加し、そして次
にＰＥＧの５６　％　（ｗ／ｖ）溶液等容量を添加する
［　Ｎｅｇｒｕｔｉｕ等、　１９８７　］。生成混合物
をゆっくシと混合し、そして５ないし６０分、好ましく
は約３０分、１０℃と３２℃の間、好ましくは室温（約
２５℃）で培養する。培養の間、混合物を時々振とうす
る。培養後、プロトプラストを洗浄し、そして適当な培
養培地上にブレーティングする。適当な培養培地は固化
剤としてａ、ｓ％（ｗ／ｖ　）ないし２．５　％　（ｗ
／ｖ）アガロース、好ましくはＱ、”Ｉｔ’　（ｗ／ｙ
）ないし２％（ｗ／ｖ）アガロースを含有するＫＭ−８
ｐ培地を包含するが、これに限定されない。形質転換さ
れたプロトプラストを培地に十分に分散させ、そしてア
ガロースにゲル化させる。この培養体からの相性のもの
を含むトランスジェニックプーイデアエ植物ハ上記段階
ＣないしＥに従って再生される。

本発明の範囲内で好ましい外因性ＤＮＡは線状化された
形態にある以下に示すプラスミドｐＣＩＢ７０９である
。

７°うスミト“　ＣＩＢ’ｌＤ９　Ｉ７１　λりし才＋
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ＴＴＧＭＧＴＧ段階Ｇ：　形質転換されたコロニーの選
択形質転換されたプロトプラストを含有するアガロース
固化培地〔段階Ｆ〕を明所、好ましくは５ないし３０日
間、好ましくσ８ないし１５日間、より好ましくは１０
日間暗所で、０℃と５０℃の間、好ましくは２０℃と３
２℃の間、より好ましくは２５℃と２８℃の間の温度範
囲で培養する。固化培地を、例えば５つの切片に切り、
セして５ｈｉｌｌｉｔｏ等（１９８３）または欧州特許
出願ＥＰ−０，１２９，，６８８（５ｈｉｌｌｉｔｏ等
）または８ｈｔＩＩｉｔｏ等（１９８５）、または欧州
特許出願ＥＰ−０，１６４，５７５（Ｐａｓｚｋｏｗｓ
ｋｔ等）に記載の方法に従って「ビーズタイプ」培養系
で選択する。

切片の数および大きさは問題ではない。一実施例におい
て、これらの切片の４つを別々に適当な培地、例えば４
２／！カゼイン氷解物および２０μ２／ｄないし１００
μり／ｄハイグロマイシンＢｉ言Ｍする５）１−４５培
養培地内に入れる。

第５の切片全ハイグロマイシンＢｉ含まない同様の培地
に入れる（対照）。

約４ないし５週間後、形質転換されたと推定される細胞
コロニーをアガロースから切り出し、そして適当な培養
培地、例えば２０μ２７罰ないし１００μｆ／ｄハイグ
ロフイシンＢｉ含有する５Ｈ−４５内で培養するが、こ
れは例えば回転振とり機上５０ないし８０　ｒｐｍで揺
り動かす。もう４ないし５週間後、新しい懸濁培養体を
作る全テのコロニーを２０μｔ／−ハイグロマイシンＢ
含有の新しい培地に移す。新しい懸濁体全２０μｔ／ｄ
ｊハイグロマイシンＢの存在下で最低２回継代培養し、
セしてカルスが形成されるまで上記と同様に培養する。

カルスおよび懸濁培養体、並びにこの段階で作製された
材料から誘導された培養体σ段階Ａに記載したように凍
結しても良い。

形質転換されたプーイデアエ植物を、上記段階りないし
Ｅの記載の操作に従って段階Ｇのトランスジェニックカ
ルスから再生させる。

本発明の方法はプーイデアエ亜科のイネ科植物のプロト
プラストが植物、そしてより好ましくは相性の植物に再
生されることを可能にする。

この能力はまず第一にそのような植物のゲノム内に外因
性ＤＮＡ　２安定に導入すること、そしてそれらの遺伝
子型および表現型を変えることを可能にする。さらに、
核ＤＮＡの新規な組合せまたは核もしくはオルガネラＤ
ＮＡの新規な組合せを炸裂するために、プロトプラスト
全同一種またげ別種からのプロトプラストと融合するこ
とができる。さらに、プロトプラストハ、所望の表現型
のための突然変異誘発および／または選ｆＪ＜ｋ行うこ
とができるクローン材料の源として使用することができ
る。

所望の表現型の例は、殺虫剤、除草剤、殺菌剤、殺バク
テリア剤、貞金践、塩、病毒素、代謝阻害剤、細胞代謝
物の構造的または機能的類似体を包含する天然″または
合成化学物質の毒性譲厚物に対する耐性を包含するが、
これに限定されない。選択さ？Ｌ得る所望の表現型のそ
の他の例は不利な環境条件、例えば寒いもしくは熱い温
度に対する、または生物物質、例えば病原体に対する耐
性を包含する・ 〔実施例および発明の効果〕 以下の実験および実施例は本発明を詳細にさらに説明す
るが、それらの範囲を限定するものでばない。

裂 胚形成性カルスを温室栽培のカモガヤ植物の最も幼若な
來の基部からＨａｎｎｊｎｇ　＠　（１９８２）に記載
されたように開始する。その葉をクロロックス（ｃ１ｏ
ｒｏｘ）　１：　１ｏ希釈溶液［５，２５％（Ｗ／Ｖ）
欠匝塩素酸ナトリウム溶液：米国、カリフォルニア州、
オークランドにあるタロロソクスカンパニー〕中に約１
０分間浸漬することにより表面殺菌し、そして次に１１
肩ないし５ｆｆｍの長さまたσ直径の小断片に無菌的に
切断する。

これらの断片をゲル化剤として［Ｌ８％（Ｗ／Ｖ）アガ
ロース含有の滅菌５Ｈ−３０培地上にブレーティングす
る。カルスおよび／または胚形成性構造体が約２５℃で
の培養で、ブレーティング２ないし６週後に現われる。

胚形成性カルスを２ないし４週毎の新鮮な８Ｈ−３０培
地上での継代培養および２５℃暗所中での培養により維
持する。

４μＭジカムバおよびＡｔ／ｌカゼイン氷解物を含有す
るＧｒａｙ等（１９８５）に記載の液体培地５０罰中に
胚形成性カルス約０．５２新鮮重量ヲ移す。

懸濁培養体音、金属キャップおよびパラフィルムでシー
ルしｆ１１２５ｒｎｅプロングフラスコ中、回転振とり
機上的１３Ｏｒｐｍで１６時間の明（、ｉｎμＥ／７♂
Ｓ）、８時間暗所中、２７℃で生長させる。約４週後、
大きな細胞群を約３０秒間静置し、そして小さい細胞群
を含有する上清を除き、そして新鮮培地５０ｍＪに移す
。この方法は、小さい細胞５Ｍ細胞の存在に基づいてよ
り小さい群の太きさおよびよシ良い質によシ判断される
工うな最も成功する培養体を用いて３ないし４週毎に繰
り返される。５ないし８回の移し換えの後、懸濁体は胚
形成性でない細胞が実質的になく、そして胚形成性細胞
群の大部分は全く小さい（１５０μｍないし２０００μ
ｍ）。

および精製 ナル７７０２３ｍフィルターユニットで細胞を無菌的に
濾過し、そして次にベト１フ皿中のプロトプラスト酵素
混合物１２．５ｍノに細胞新鮮重量ｏ５ｔを添加するこ
とにより、実施例１の胚形成性懸濁培養体からプロトプ
ラストを調友する。酵素混合物は２％（Ｗ／Ｖ）セルラ
ーゼ）ｔＳ１７ｍＭＣａＣＪ２　ｘＨ２Ｏ，ｏ、　７ｍ
ＭＮａ）１２　ＰＯ４ｘ）１２０．５ｍＭＭＥＳ（ｐＨ
５，６）　、ブドウａ（ｐｉ（５，６の５５０ｍ（Ｊｓ
／＃　ＨｚＯ）からなり、そしてフィルター滅菌する。

混合物を薄暗い（く５μＥ　７ｍ”　ｓ　）ｆｔ、の中
、約４ないし５時間、回転振とり機上で約５Ｏｒｐｍで
回転させる。消化物を次いでステンレス鋼のふるい（メ
ツシュの大きさ１００μｍ）にかけ、そして約６０２な
いし１００ｆで約５分間遠心分離される１２ｍ遠心管に
分取する。プロトプラスト含有沈殿物を次いでブドウ糖
でｓ　５０ｍＯｓ／−１４２ＯＫ調整したプロトプラス
ト培養培地ＫＭ　−８ｐで３回洗浄する。このときに浮
上段階をさらにプロトプラストと・精製するために含め
ても良い。この場合、洗浄したプロトプラスト？、ショ
糖で７００　ｍｉｓ　７ｋｇ　）１２０に調整したＫＭ
−８ｐ培養培地１０ｍ１上に積層する。６０？ないし１
００ノで約１０分間遠心分離後、界面で帯状になってい
るプロトプラストラ細いビベットヲ用いて集める。最後
に、プロトプラストｉ　ｌ（Ｍ−８ｐ培養培地１Ｍない
し２ｄ中にＡ懸濁し、そしてステンレスメツシュスクリ
ーン（メツシュの太き芒２０μｍ）でふるいにかける。

解離したプロトプラストを集め、そして洗浄し、そして
培養用のＫＡ４−８　ｐ甲にまたげ実施例６による形質
転換に適当な戊透圧的に′ｐ４整した培地中に衿懸濁す
る。

よびカルスの生長 （ａ）　　ｔ３％（Ｗ／Ｖ　）シーズラークアガロース
〔本国、メイン州、ロックランドにある上’ＭＣ社、マ
リンコロイズディピイジョン〕および３０％ないし４０
　Ｘ（ｖ／ｖ　）のコンディショニングを行った培地（
滅菌ナルゲ！１０．２μｍフィルターで培地を濾過し、
ブドウ糖の添加にょシ培地ｆｚ　５５０　ｍｕｓ　／ｋ
ｏ　ＨｚＯとし、そして再びフィルター滅菌することに
より３ないし４週令のカモガヤの胚形成性懸濁培養体か
ら得られる）を官有するＫＭ−８ｐ培養培地中に約５Ｘ
１０５個プロトプラスト／−の密度で精製ブロトプラス
トヲプレーティングする。プレートを次に２８℃の一定
温度で暗所に置く。１ｏないし、１４日後、アガロース
をウェッジに割り込ませ、そして５ｈｉ１１ｉｔｏ等（
１９８３）に記載された「ビーズ培養液」内に初期の注
入培養液３ｄ当たり３％（Ｗ／Ｖ）ショ糖を南−するＳ
）ｉ−４５Ｍ濁培養培地２０ｒｎｌを用いてすえる。プ
レートをプラットフォームシェーカー上に載せ、そして
８μＥ／がＳの光中、約５　ＯｒｐｍでＩＬＨ’ｔ’ｆ
る。コロニーがアガロースから生長するように新しい懸
濁培養体が形成され、そして液体培地中Ｋａ胞を解放す
る。生成した懸濁培養細胞を寒天固化８Ｈ−５０培地上
にブレーティングし、セしてカルスが形成されるまで２
５℃で暗所中に置く。

（ｂ）　　培養培地が１００■／ｌ　　Ｏ−アセチル−
サリチル酸の添加を含む以外は上記実施例３（ａ）に記
載したようにプロトプラスト全培養する。

（ｃ）　　培養培地が３０〜／、ｇＯ−アセチル−サリ
チル酸の冷加を含む以外は上記実施例３（ａ）に記載し
たようにプロトプラスト全培養する。

（ｄ）　　培養培地がコンディショニング培地を含有し
ない以外は上記実施？＋１　ｓ　（ａ）ないし３（ｃ）
に記載したようにプロトプラスト全培養する。

ａ）プロトプラストから誘導されたカモガヤのカルス（
実施例３に記載したように得られた）を同化５Ｈ−３０
培地上で生長させ、そして２週間毎に継代培養全行う。

形成されるあらゆる胚を取除き、そして発芽培地（ｓｔ
−ｔ−ｏ）上にブレーティングし、そして光（４５ない
し５５μＥ／ｆｎＰｓ）の中に置く。

これら胚の発芽に１ないし４週で起こシ、そして生じた
小植物体を明所で８１（−（Ｊ培地上に置き、根系を形
成させる。これらを６ないし１２葉期に温室に移し、そ
して徐々に硬化させる。

ｂ）プロトプラストから誘導されたカルス（実施例５に
記載したように得られた）ｔａ２ａ％（Ｗ／Ｖ）ゲルラ
イトで固化させた５）ｉ−０培地上明所（４５ないし５
５μＥ／ｆｎ′Ｓ）で生長させ、そして２週毎に継代培
養する。生じた小植物体ｉ［１１２％（Ｗ／Ｖ）ゲルラ
イトと１４　％　（ｗ／Ｖ　）寒天の組合せで固化させ
た５Ｈ−０培地：　０ＭＳ培地；１：１混合物上に直き
、明所で横系全形成させる。それらを６ないし１２集期
に温室に移し、セして徐々に硬化させる。

Ｃ）上記４（ａ）とＡ　（ｂ）に記載したように小さい
小植物体を得、そしてα８Ｘ（Ｗ／Ｖ）寒天で固化させ
た０ＭＳ培地上に置き、明所で根系を形成させる。これ
ら全６ないし１２葉期に温室に移し、そして徐々に硬化
させる。

ｄ）上記４（ａ）に記載したように小さい小植物体を得
、そして［１１２％（Ｗ／Ｖ）ゲルライトとα４％（Ｗ
／Ｖ）寒天の組合せで固化させた５Ｈ−０培地：　０Ｍ
８培地＝に１１混物上に置き、明所で横系全形成させる
。それらを６ないし１２葉期に温室に移し、そして徐々
に硬化させる。

ハイグロマイシン耐性をコード化する構造遺伝子のコー
ド配列は、プラスミドｐＬＧ９０　（Ｇｒｉｔｚお工び
Ｌ）ａｖｉｅｓ、　１９８３　）から大きさ約１１５０
塩基のＨａｍＨＩ断片で単離される。プラスミドｐＬＧ
９０はＬｉｎｄａ　Ｇｒｉｔｚ　［−ｑサチューセッツ
州、ケンブリッジ、ロジャースストリート８０にあるア
プライド　バイオテクノロジー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　］から入手できる。このＨ
ａｍＨＩ断片ｆ　ｐＣＩＢ　７１　Ｇ　（Ｒ，ｏｔｈｓ
ｔｅｉｎ等、１９８７）のＢａｍＨＩ部位内に挿入し、
プラスミドｐｃＩＢ７０９ヲ構築する。プラスミドｐｃ
　ＩＢ　７１０　ｉｊＣａＭＶの調節領域〔反復Ｂａｍ
ＨＩ部位により分断されたプロモーターとターミネータ
−領域を有するカリフラワーモザイクウィルス３５８転
写物〕を含有する。生成したプラスミドｐｃＩＢ　７０
９　ｑＡＴｃｃに寄託され、ＡＴＣＣ番号ＦＸ４０４２
Ｂである。

形質転換に使用する前に、プラスミドｐｃＩＢ７０９は
制限エンドヌクレアーゼＰｖｕ　１１との処理により線
状化され得る。この構築物はｐＵＣプラスミド内にカリ
フラワーモザイクウィルス（ｃａＭＶ　）からの（、：
ａＭＶ３５８転写物の５′および３′発現信号と共にハ
イグロマイシン耐性（アミングリコシドホスホトランス
フェラーゼ■型）遺伝子を含有する。ｐｃＩＢ７０９の
配列は前に示した通りである。

実施例６：　　エレクトロポレーションによるカ（ａ）
　　プロトプラストの精製後すぐに、上記の線状化した
プラスミドｐＣＩＢ　７０９を用い８ｈｉｌｌｉｔ。

等（１９８５）ニ従ってエレクトロポレーションを行う
。プロトプラストの最後の洗浄後、エレクトロポレーシ
ョン緩衝ｉ　（［ＬＡＭ７７　＝　）−ル、６ｍＭ　Ｍ
ｇＣ１２）中に約７×１０　個プロトプラスト７ｒｒｔ
ｅの密度でプロトプラストに再懸濁する。プロトプラス
トｆｊＯｒｔｔｌプラスチック遠心管中に０．７ｒｒｔ
ｌずつ分注する。プラスミドＤＮＡ（Ｐｕｖｌｌで制限
されｆｃ　ｐｃＩＢ　７０９２會有する水６２μｌと超
音波処理した仔牛胸腺１）ＮＡ　［シグマ〕の最終濃度
がそれぞれ１０μ？／耐と５０μ？　／　ａｔ　）　ｋ
遠心管に添加する。次にｌリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）溶液Ｑ、３８ＲＥ　［０，４Ｍ　−ｑ　／＝トール
、３ｏｍＭＭｇＣ１２，１１１％（ｗ／ｖ）　ＭＥ８　
（ｐＨ５，６）中の２４％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ６０００）
を添加し、そして溶液をゆっくり混合する。プロトプラ
ストｅ濁液全登録商標ダイアログ　エレクトロボレータ
ー （Ｄｉａｌｏｇ■Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ　）ノ
室内に移し、そして初期電圧３２５０　Ｖ／ｃｍの１０
パルスおよび１０μ式の指数破壊定数を３０秒間隔で与
える。試料全室から取出し、そして直径１０ｃｒｎのペ
トリ皿に入れる。１．２％（Ｗ／Ｖ）ジ−プラークアガ
ロース全含有するＫｆｖｌ−８９培地１０−を添加し、
プロトプラストラ培地に十分に分布させ、そしてアガロ
ースにゲル化させる。

■）　初期電圧６３ｓｏｏＶ／ｃｒｎとすることを除い
て実施例６（ａ）を繰り返す。

（ｃ）　　初期電圧′ｆｅ４０００　Ｖ／ｃｍとするこ
とを除いて実施例６（ａ）を繰り返す。

（ｄ）　　初期電圧ｆ　５０００　Ｖｌｏｎとすること
全除いて実施例６（ａ）金繰り返す。

（ｅ）　　初期電圧ｅ　ｓ　ｏ　ｏ　ｏ　Ｖ７ｃｍとす
ることを除いて実施例６（ａ）を繰り返す。

（ｆ）　　初期電圧ｆ　２５００　Ｖ／ｍとすることを
除いて実施例６（ａ）を繰り返す。

（ｇ）　　ＭＷ　４０００のＰＥＧ全用いることを除い
て実施例６（ａ）ないし６（ｆ）ｅ繰り返す。

（ｈ）　　ＭＷ８０００のＰＥＧ金用いることを除いて
実施例６（ａ）ないし６（ｆ）ｅ繰り返す。

（ｉ）最終１’ＥＧ濃度を１０％と３０％（Ｗ／Ｖ）の
間とすることを除いて実施例６（ａ）ないし６（ｈ）ｔ
−繰り返す。

（ｊ）　　５ｈｉ１１ｉｔｏ等（１９８５）およびＰｏ
ｔｒｙｌｃｕｓ等（１９８５）に記載された熱ショック
をさらに用いることを除いて実施例６（ａ）ないし６　
（ｉ）　’ｅ繰り返す。

（ａ）　　ＰＥＧ介在直接遺伝子導入ｉＮｅｇｒｕｔｉ
ｕ等（１９８７）に従って行う。使用するＤＮＡは線状
化プラスミドｐｃＩＢ７０９である。

プロトプラストの最後の洗浄に続いて、１罰当たりプロ
トプラスト約２×１０　個の密度で１５０１Ｍ　ＭｇＣ
Ｊ２宮有α５Ｍマンニトール中にプロトプラスト−ｔｍ
濁する。プロトプラスト懸濁液ｉＩｍＪずつ１０−プラ
スチック遠心管に分注する。上記実施例６ａのようにＤ
ＮＡを添加し、そして次にＰＥＧ溶液〔α４Ｍマンニト
ール、（ＬＩＭ　Ｃａ（Ｎｏ、）２中の４０％（Ｗ／Ｖ
）ＰＥＧ４０００、（ｐ）（７，０）］Ｑ、５−を添加
する。

溶液をゆっくり混合し、そして時々振とうして室温で３
０分間培養する。

洗浄溶液１．４　ｙｔｌ　ｆ次に添加し、そして遠心管
の内容物をゆっくり混合する。洗浄溶液は８７ｍＭ　−
ｒ　ｙ　＝トール、１１５　ｍＭ　ＣａＣｌ２．２７ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２　、　３９　ｍＭ　　ＫＣｌ　　、　
　　７　ｍＭ　　ト　リ　ス／塩酸および１．７ｔ／１
ｍ−イノシトール、（ｐ）Ｌ９．Ｑ）からなる。さらに
４回洗浄溶液１．４　ｍｌ　ｆ　Ａ分間隔で添加し、各
添加後に混せする。遠心管を次に約６０９で約１０分間
遠心分離し、セして上清を捨てる。沈殿したプロトプラ
ストを１−〇ＫＭ−８ｐ培養培地中に採取し、そして１
０ｃｒｎペトリ皿に置く。１．２％（ｗ／ｖ　）　ジ−
プラークアガロース含有のＫＭｉｐ培地１０ｒｎｌ　ｆ
添加する。プロトプラストを培地に十分に平坦に分布さ
せ、そしてアカロースにゲル化させる。

（ｂ）　　洗浄溶液のｐｉ−ｉ−ｉ５．６に調整するこ
とを除いて実施例７（ａ）と同様に形質転換を行う。

（ｃ）　　洗浄溶液のｐ）ｌｉ７．０に調整することを
除いて実施例７（ａ）と同様に形質転換を行う。

（ｄ）　　使用するＰＥＧがＭ昏６０００のＰＥＧであ
ることを除いて実施例７（ａ）ないし７（ｃ）と同様に
形質転換を行う。

（ｅ）　　使用するＰＥＧがＭＷ２０００のＰＥｏテあ
ることを除いて実施例７（ａ）ないし７（ｃ）と同様に
形質転換を行う。

（ｆ）　　使用するＰＥＧがＭＷ８０００のＰＥＧであ
ることを除いて実施例７（ａ）ないし７（ｃ）と同様に
形質転換を行う。

（毅　５ｈｉ１１ｉｔｏ等（１９８５）に記載されたよ
うな熱ショックをさらに用いることを除いて実施例７（
ａ）ないし７（ｆ）と同様に形質転換を行う。

（ｈ）　　洗浄媒体がＫＯＨでｐＨ６，０としたもので
、１５４ｍＭ　ＮａＣＣ１２５ｍＭ　ＣａＣｌ２．５ｍ
Ｍ　ＫＣｊ。

５ｍＭブドウ糖からなることを除いて実施例７（ａ）な
いし７（ｇ）と同様に形質転換全行う。

（１）洗浄媒体がＫＯＨでｐＨ６，０としたもので、０
２ＭＣａＣｌ２、（１１％（ｗ／ｖ）　ＭＥＳからなる
ことを除いて実施例７（ａ）ないし７（ｇ）と同様に形
質転換を行う。

（ｊ）　　洗浄媒体がＫＯＨでｐＨ９，０としたもので
、α２　Ｍ　ＣａＣｌ２．７ｍＭ）リス／塩ｆｆカらな
ることを除いて実施例７（ａ）ないし７（ｇ）と同様に
形質転換を行う。

（ａ）　　形質転換に使用する前Ｋ　ｐＣＩＢ　７０９
プラスミドＤＮＡｆ、制限酵素Ｂｇｌ　ｌで制限するこ
と金除いて、実施例６および７に記載したように形質転
換全行う。

（ｂ）　　形質転換に使用する前にｐｃＩＢ７０９プラ
スミド１）ＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで制限するこ
とを除いて、実施例６および７に記載したように形質転
換全行う。

実施例９二 エレクトロポレーションまたは 形質転換用の遠心管に分注前またはその後に、およびＰ
ＥＧの添加前に、プロトプラストラ４５℃で約５分間処
理することを除いて実施例６゜７または８に記載したよ
うに形質転換を行う。

（ａ）　　プロトプラストを含有する培養プレート（ペ
トリ皿）を約２５℃で暗所中１０日間培養し、そし２て
次に［ビーズ培養Ｊ　（８ｈｉｌｌｉｔ。

等、１９８３）用に５等分の切片に切る。４つの切片ｉ
　４　ｔ　／　ｌカゼイン氷解物および２０μｒ／ｄハ
イグロマイシンＢ含有の５ｌ−１−４５培養培地２０ｄ
中に各々入れる。第５の切片を非選択対照としてハイグ
ロマイシンＢ１に含まない上記培地２０ｐｔｌｃＰＶＣ
入れる６４ないし５週間後、ハイグロマイシンＢ中で生
長する形質転換されたと推定されるプロトプラスト誘導
細胞コロニーをアガロースから切シ取し、そして２０μ
ｆ／１１ハイグロマイシン含有の液体５）ｌ−４５培地
２ｄを有する１９咽ベトリ皿甲に入れ、回転振とう機上
約ｓ　ｏ　ｒｐｍで揺り動かす。さらに４ないし５週間
後、新しい懸濁液を作るために生長する全てのコロニー
全１２５−三角フラスコ中に移し、そしてハイグロマイ
シンＢ２０μｒ／ｄｋ培地に包含することを除いて親懸
濁培養液と同様に生長させる。

新しい懸濁ｇ、ヲ、４２／Ｅカゼイン氷解物および２０
μＰ７．１ハイグロマイシンＢ含有の８Ｈ−４５培地を
用いて１ないし３週毎に継代培養する。これらの懸濁液
からの細胞全２０μｆ／ｄハイグロマイシンＢ含有の固
化８Ｈ−３０培地にブレーティングし、そして暗所巾約
２５℃で培養する。ブレーティングした細胞から生長し
たカルスを２週毎に新鮮培地上に継代培養する。ハイグ
ロマイシンＢの存在下で生長する細胞を形質転換体であ
ると見なす。

（ｂ）　　ハイグロマイシンＢ含有培地中に生長するプ
ロトプラスト誘導細胞コロニーを２０μｔ／ｄハイグロ
マイシンＢ含有の８Ｈ−３０培地の寒天プレート上に置
き、そして暗所巾約２５℃で培養することを除いて実施
例１０（ａ）に記載したように選択を行う。

再生 形質転換されていない材料のために実施例４に記載した
のと同様に形質転換されたカルスから植物全再生させる
。

抽出 ＣＥＴＡＢ法（ＲｏｇｅｒおよびＢｅｎｄｉｃｈ　、　
１９８５　）の変法を用いて再生された植物のカルスお
よび葉から１）ＮＡ　ｉ抽出する。この方法はここでは
カモガヤについて記載しているが、しかしその他のあら
ゆるブーデアエ植物の組織についても有効に利用するこ
とができる。１）ＮＡ油抽出その他の慣用方法もまたこ
の材料からＬＪＮＡを得るために用いることができる。

５Ｈ−Ｕ培地お工び５Ｈ−３０培地上に生長したカルス
をドライアイスで凍結させ、そして次いで乳鉢およびモ
ーター中、液体窒素温度で微粉末に破砕する。生成した
粉末を液体窒素温度罠予め冷却した５１！Ｌｌポリエチ
レン遠心管に移す（管１本当たり粉末２２）。操作の間
、粉末が決して融解しない様に注意する。粉末を１晩凍
結乾燥させ、そして次に２．２ｄエツペンドルフチユー
ブ内に分取する（チューブ当たｐ１５ｄ工り少い粉末）
。ＣＥＴＡＢ　抽出緩衝液１ｄ’ｉ各チユーブＫｆＡ加
し、そしてそれら′ｔ−６０℃で約３０ないし４５分間
培養する。チューブを室温まで冷却させ、そしてクロロ
ホルム／イソアミルアルコール（２ａ　：　１）　　１
ｒｄ　’ｆｒ　添加する。混合後、溶液をエッペンドル
フ遠心分離機中３０００ｒｐｍで約３０秒間遠心分離し
、セして水相を新（、イチｓ−７−に取出す。１０９６
（ｗ／　ｖ　）　ＣＥＴＡＢ溶液１／１０容量を添加し
、そしてクロロホルム抽出１０返す。水相を新しいチュ
ーブに取り出し、そして等容量の沈殿緩衝液を添加する
。

Ｌ）ＮＡおよび１（ＮＡ　’ｉ室温で沈殿させる。沈殿
のための約３０分ないし１時間の期間の後、チューブを
再び遠心分離し、セして上清を捨てる。沈殿を高塩濃度
ＴＥ緩衝液（以下参照）中に６５℃で約３０分間再懸濁
させる。

トリスｐＨ＆０　（５０ｍＭ） ＥＤＴＡ（１０ｍＭ） ＮａＣｊｔ（０，７Ｍ） α５％（ｗ／　ｖ　）　ｋ’　ＶＰ、分子量３６万（１
−’ＶＰ：ボリビニルピロリジン〕１ｏ％ＣＥＴＢＢ：
１ｏ％（ｗ／ｖ）ＣＥＴＡＢＮａｅＪ（０，７Ｍ） 沈殿緩衝液：１％（ｗ／　ｖ　）　ＣＥＴＡＢトリスｐ
ＨａＯ（５０ｍＭ） ＥＤＴＡ（１０ｍＭ） 高塩濃ｉ’ｌ’Ｅ　　：　　トリスｐＨＦ１．０　（１
０ｍＭ　）Ｊ２Ｄ’ｌ’Ａ　（１ｍＭ　） ＮａＣ７＋（ＩＭ） ＴＥ緩圃液：　トリスｐ）ｉａＯ（１［１ｍＭ）Ｅｌ）
ＴＡ（１ｍｍ） １／１０′ｒＥ：　　トリスｐＨａＯ（１ｍＭ）Ｅｌ）
ＴＡ（α１ｍＭ） 実施例１２でまたはその他のあらゆる適当な方法で調製
したＬ）ＮＡを多くの公知方法のいずれかにより精製し
得る。適当な方法の例は、エチジウムプロミドＣ５ＣＪ
グラジ工ント遠心分離、フェノール／クロロホルムでの
処理、およびエチジウムプロミドなしのステップグラジ
ェントでの精製を包含するが、これに限定されない。

そのような方法ｔｊＭａｎｉａＨｓ等（１９８２）に記
載されている。

（ａ）　　上６ピ実施例１２からの核酸を冷エタノール
（−２０℃）２容轍で沈殿させる。チューブを５０００
ｆで２ないし３分間遠心分離する。上清を除去して、そ
して沈殿を７０％エタノールおよヒ１００％エタノール
で洗浄する。滅菌フローベンチからの空気流で核＃Ｒ全
部分的に乾燥す？ル、　Ｌ）ＮＡ’ｉ　１／１０　’Ｉ
’　ＨＮｋＪ液２　ｏ　Ｏｐｉ中に１晩溶かす。１）Ｎ
Ａ浴溶液エッペンドルフ遠心チューブに移し、セしてＲ
Ｎａｓｅ（予め煮沸してＤＮＡａｓｅ　ｆ：不活性化す
る）の２η／ｒｔｔｌ溶液１０μｉｆ添加し、そしてチ
ューブを３７℃で１時間培養する。５Ｍ　Ｎａｅｊｌα
２５容量を添加し、そし１１．５Ｍ　ＮａＣ１含有の３
０　Ｎ　）’ＥＧ（分子量６００口ないしａｏｏｏ）全
α４容爺を添加することＫより１）ＮＡ　全沈殿させ、
そしてチューブを一２０℃で約１時間保持する。チュー
ブ′ｆＩ：５分間遠心分離し、上清を除去し、そして沈
殿全冷熱水エタノールで洗浄する。

滅菌フローペンチからの空気流で簡単に乾燥膜、ペレッ
トをＴ　Ｅ緩衝液０．３−中に再懸濁する。溶液を’１
’　Ｅ緩衝液で平衡化したフェノール／クロロホルム／
インアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、エ
ソペンドルア遡心分ｌ１ｉｌ＠で３０秒間遠心し、セし
て水相全所しいチューブに移す。溶？？！’ｔクロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、３
０秒間遠心分離し、セして水相を新しいチューブに取出
す。クロロホルム抽出を繰夛返す。３Ｍ酢酸ナトリウム
１／１０容量全添加し、続いて水冷無水エタノール２容
量を添加して、Ｉ）ＮＡ全沈殿させる。沈殿を遠心分離
により集め、そして７０％および１００％エタノールで
洗浄し、滅菌空気流中で簡単に乾燥させ、そして十分量
のＴＥ緩衝液中に溶かし、サザン分析に使用のためにα
２５μｆ／−ないし１μｔ／ゴの濃度とする。

下層が′ＰＥ緩衝液中の５．７　Ｍ　Ｃｓ　Ｃｌおよび
上１１ｍが′１゛Ｅ中の１．０Ｍ　ＣｓＣ１からなるＣ
ｓＣ７Ｉステツプグラジエントで核酸を精製する。核酸
全上層に混入させる。ダラシエンドを営むチューブをス
ウィングローター（例えばペックマン（１３ｅｃｋｍａ
ｎｎ　）　　ＳＷ５α１．４５０００ｒｐｍ）で１晩遠
心分離する。界面領域からＬＩＮＡ　’！Ｉ−集め、そ
して）ｔＮＡｉチューブの底から回収し得る。Ｌ）ＮＡ
を水２容鉗で希釈（２、そして上ｄじ実施例１３（ａ）
のように水冷エタノール２容童で沈殿させる。沈殿をＴ
Ｅ緩衝液中に再懸濁させ、エタノールで再び沈殿させ、
そしてサザン分析に使用する。

による検出 サザンハイブリッド分析ヲ実質的に〜Ｉａｎｉａｔｉｓ
等（１９８２）に従って行う。カモガヤのＩ）ＮＡ　［
実施例１３（ａ）および１３（ｂ）に従って精製］を制
限ｅ＃素ＢａｍｋＬＩで切断し、そしてそれらの５μ２
を１列当たり載せ、１９６アガロースゲル上で電気泳動
し、断片の大きさに基づいて１）ＮＡ　ｉ分離する。そ
のゲルをα２５Ｍ）ｉＣＪ　　中に約２０分間置き、そ
して次Ｋ　１ｉ２０ですすぎ、そして仄いでα４Ｍ　Ｎ
ａ（ＪＨ中に３０分間装＜　。１）ＮＡ　’にシーンス
クリーンプラス（ＮＥ８リサーチ　プロダクツ、カタロ
グ番号ＮＥＦ９７６、ロフト番号５３０（ｊＰ６２）に
通常の方法で（製品に添付される指示書の記載に沿って
）移″＠緩僧液としてＱｊｔνＩ　　Ｎａ（ＪＨ金用い
て１晩移動させる。１晩の移動の後、フィルターヲ取出
し、２×５ＳＣ（α５Ｍ　ＮａＣｊ！％０．０３Ｍクエ
ン酸ナトリウム）で洗浄し、そして次に風乾する。１（
１／Ｊウシ血清アルブミン（ファツトフリーシグマ、カ
タログ番号Ａ−４５０３）、７％ＳＤ８．１　ｍＭ　Ｎ
ａＥＤ’ｌｌ’Ａ、およびＣＬ５２Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液ｐ）１７．０ｉ含有する緩衝液とプロットとを６
５℃で４時間予めハイブリッド形成させる。放射標識さ
Ｊまたプローブをｌ１１１プライム　タイム”標識キッ
トまたはあらゆるその他の方法ケ用い、そし７てスピン
カラム内でヌクレオチドからプローブを分離することに
よるランダムプライマー法により調製する。プローブ１
）ＮＡＨ３ｓＳプロモーターおよびアミングリコシドホ
スホトランスフェラーゼ■型構造遺伝子領域を含有する
ｐｅｌＢ７０９の断片からなる。

ハイブリッド形成は６５℃で１晩行う。プロットを次に
５Ｗ１５Ｉｌ：浄緩衝液を用いて４回洗浄するが、鏝の
２回の洗＃を６５℃で行う。プロットを次に１％８１１
８および５ｍＭ　ＮａＥＤ’Ｉ’Ａ含有の０、２　Ｘ　
ＳＳｃ中６５℃で２時間洗浄する。湿ったプロッ＋−ｉ
食品用フィルム（登録商標サランラップ）で包むか、ま
たはその他のあらゆる適当なフィルムで包ミ、そしてＸ
線フィルム〔ニューヨーク、ロチニスターにあるイース
トマンコダック（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｃ　）のコ
ダックＸ−ＯｍａｔＡ　Ｒフィルム〕に暴露する。現像
するとｐｃｉｐ７０９で形質転換されたカルスおよび植
物由来のＤＮＡに対するプローブの明確なハイブリッド
形成カ見う？ｌ　、７）、　ｐＣＩＰ７０９　ＤＮＡは
形質転換体の高分子＃−ＤＮＡ内に明らかに組込１れて
いる。

１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン（脂肪なし）０５２
Ｍ　リン酸ナトリウム　ｐＨ７，０７、！％　（Ｗ／　
’／　）　ｂ　Ｄ　５１ｍＭ　　ＮａＥｌ）ＴＡ 洗浄溶液： ０．０１１　　リン酸ナトリウム　ｐ）１７．０１　ｍ
　Ｍ　Ｎ　ａ　ＥＩＪ’ｌ’Ａ １％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ α１２５Ｍ　　ＮａＣＪ 実施例１５：　カモガヤのカルス培養体の凍結保存 （１）　　カモガヤの活発に生長するカルス’ｉ　８Ｈ
−Ｕ液体培地中に置く。典型的にはカルスＱ、５ないし
１ｆを培地２０ｘｌ中に置く。カルスを含有するフラス
コをゆっくりと振とうし、そして回転させてカルスの群
を別々にし、そして分散させる。培養液を次に氷で冷却
する。凍結保護溶液も氷上で冷却する。

（２）凍結保護溶液Ｐ等容ｆ１１に５分間かけて添加し
、そして混合物を１時間氷上に保つ。この間に、ラベル
を貼った予備冷却した１、８−プラスチック凍結保存バ
イアル（住友ベークライト■のパンガード　クリオス　
クリオゲニック　バイア／ｌ／　ス（Ｖａｎｇａｒｄ　
Ｃｒｙｏｓ　ｃｒｙｏｇｅｎｌｃｖｉａｌｓ　）、カタ
ログｈ号ＭＳ４５０２）に１．　Ｏｔｒｔｌずつ分取シ
フ、そして氷上に保つ。凍結保護溶液Ｐは１Ｍグリセロ
ール、ｉＭｈ−プロリン、２Ｍジメチルスルホキシド（
ＤＭＳＯ，シグマ、カタログ番号ＩＪ２６２５、ロット
番号５７１＋“−８８１６）からなるｐＨ５，６の水溶
液であシ、そし、て各々の使用の前に新たに訓與する（
グリセロール／プロリン／水混合物は凍結保存しても良
い）。

（３）約１時間凍結保護溶液に細胞を晒した後、バイア
ルを温度０°　である液浴の表面に浸漬する。この浴は
エタノールからなっていても、またこの分野で公知のそ
の他のあらゆる適当な冷媒からなっていても良い。浴は
冷［を混甘し、でおくための攪拌装置を備え、そして制
御さｆした速度で冷媒を冷却できる装置に連結されてい
る。

（４）バイアルをいったん冷媒に入れたら、温度を約α
５℃／分の速度で下げる。温度が一４０℃に達した時、
バイアルを液体窒素内に落とし、そして次いで液体窒素
自体の中か、またはその蒸気中のいずれかに一１００℃
−を超えない温度で貯蔵する。

（ａ）　（１）　　継代培養して２ないし１０日後に採
取したカモガヤ懸濁培養体を氷上で冷却する。

凍結保護溶液は通常氷上で冷却する。凍結保護溶液は１
Ｍグリセロール、ＩＭＬ−プロリン、２Ｍジメチルスル
ホキシド（１）ＭＳ　Ｏ）からなるｐＨ５，６の水溶液
である。この凍結保護溶液を使用の前に新たに調卵する
が、またはクリセロール／プロリン／水を凍結保存して
おいても良い。

（２）凍結保護溶液を５分かけて懸濁液に添加する。細
胞を凍結保護溶液中に氷上で１時間放置する。この時間
の間または後、凍結保存バイアルに分取し、氷上に保つ
。このバイアルを次いで実施例１５におけるカルス材料
に対する上記の方法と同様に処理する。

（ｂ）　　段階（１）での凍結保護溶液が１Ｍグリセロ
ール、１ＭシーＩ糖および２Ｍ　ＤＭＥＯからなるｐＨ
５，６の水溶液であることを除いて凍結保存を実施例１
６（ａ）の記載のように行う。

（ａ）　（１）　　実施例１５で調製したバイアルを液
体窒素から取出す。

（２）　　このバイアルを全ての氷が融けるまで室温に
放置することにより融解させる。

（３）　　バイアルの内容物全ゲルライトまたは寒天で
固化させｆｃ−８Ｈ−０培養培地上に拡ける。

典型的には融解した培養体Ｏ，Ｓゴを培地３０ｄなＩｙ
　ｌ、　５０　ｔｎｌ含有の直径１０ｃｒｎのペトリ皿
上に拡ける。残りの凍結保護溶液全細胞から分離排出の
ために固体培地を傾斜させて注ぐか、またに穴を培地の
周辺に掘る。

（４）　　材料を培地上２７℃で暗所中＃ｌ養する。

生長は１なｚ　Ｌ　４週間で容易に現われる。

カルスを次すで上記の通常の胚形成性カルスと同様に継
代培養する。

（ｂ）　　凍結保存されたカモガヤから生長する培養体
の回復を、段階（２）でのバイアルを全ての氷が融ける
まで約４０℃の湯浴中で七ねを振シ勧かすことにより迅
速に融解させることを除いて、実施例１７（ａ）の記載
と同様に行う。

存 活発に生長するトウモロコシのカルスの凍結保存を実施
例１５においてカモガヤに対して記載したのと同様に行
う。

トウモロコシの胚形成性懸濁培養細胞の凍結保存を実施
例１６（ａ）および１６（ｂ）においてカモガヤに対し
て記載したのと同様に行う。

凍結保存されたトウモロコシから生長する培養体の回復
を実施例１７（ａ）および１７（ｂ）においてカモガヤ
に対して記載したのと同様に行う。

【図面の簡単な説明】

第１図は液体培地中に懸濁したアガロースピーズ中で生
長するカモガヤのプロトプラスト誘導コロニーである生
物の形態を示す写真である。 第２図は５ｉ−ｉ−ｏ培地上に生長するカモガヤのプロ
トプラスト誘導カルスから生じる小植物体である生物の
形態を示す写真である。 第５図は容器内の５）ｉ−Ｕ培地上に生長するカモガヤ
のプロトプラスト誘導カルスからの根づいた小植物体で
ある生物の形態を示す写真である。 第４図はカモガヤの植物体である生物の形態を示す写真
であって、左側の鉢の植物体はプロトプラストから再生
された本ので、右側の鉢の植物体は野生型のものである
。 第５図はハイグロマイシンに対する耐性を付与するため
のカモガヤの形質転換に用い得るプラスミドｐｃ：ＩＢ
７０９を示す、プラスミドｐｅｌＢ７０９はブダペスト
条約の要請に従って、米国、メリーランド、ロックヴイ
レにあるアメリカンタイプ　カルチャー　コレクション
（ＡＴｅＣ）に寄託され、セしてＡ　Ｔ　ＣＣ番号４０
４２８′ｆｔ有する。寄託日１１９８８年２月１２日で
ある。 図中、 ３５Ｓｐｒｏｍ−・−５５Ｓプ０％−ター領域Ｈｙｇｒ
ｏ−ｇｅｎｅ・・・ハイグロマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ（Ａ）’）１　■型）構造遺伝子 ５５　Ｓｔｅｒｍ　・−・ＣａＭＶのＳＳＳ転写の３′
ボリアテニル化部位を含有するＣａＭＶの領 域 第６図はプロトプラストをｐｅｌＢ７（１９で形質転換
した後に回収きれる異なるカモガヤからのＬ）ＮＡのサ
ザン分析後の生物の形態を示す写真である。 第１．２列：制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切断
され＆　ｐｅｌＢ　７０９　１０および２且ｇ　。 第４−８列：ｐＣ：ＩＢ７０９でプロトプラストを形質
転換した後に回収されたカモガヤのカルス培養体からの
ＤＮＡ　ｆ　Ｂａｍ１且で切断し次もの。 ｉ％９．１７列：プロトプラストから誘導された形質転
換さｔｒでいないカモガヤの対照カルスからのＤＮＡ　
ｆ　ＢａｍＨＩで切断したもの。 第１０−１３列：　ｐｃｉＢ７０９でプロトプラストを
形質転換した後に回収されたカモガヤのカルス培養体か
らのＤＮＡ　ｆ　ＢａｍＨＩで切断したもの。 第１４列：ｐｅＩＢ７Ｑ９でプロトブラストヲ形質転換
した後に回収されたカモガヤのカルス培養体からの１）
ＮＡ　２　ＢａｍＨＩで切断したもの。 第１５．１６列：　Ｉ）ＣＩＢ７０９でプロトプラスト
を形質転換した後に回収されたカモガヤのカルス培養体
からのＤＮＡ　ｆ　Ｂ　ａ　ｍＨＩで切断したもの。 第４列ニブランク 第６．１０．１２および１５列甲のＤＮＡは、フィルム
の黒化により明らかなようにカモガヤのゲノム同に組込
１れた外来ｆ）ＮＡの存在を示す。 ｐｃＩＢ　７０９の組込まれたハイグロマイシン遺伝子
（ｐｅｌＢ７０９のヌクレオチド５８３−１６４６）の
ＢａｍＨＩ　　消化から予想される１０６３ｂｐ断片を
矢印で示す。 第２１囚 第３ 第 図 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）細胞壁を再生し、分裂し、そして植物体に再生さ
   れ得るカルスを形成するプロトプラストを単離すること
   ができるプーイデアエ亜科のイネ科植物から誘導された
   胚形成性細胞培養体。 （２）前記の再生される植物体が稔性植物体である請求
   項１記載の胚形成性細胞培養体。（３）前記プーイデア
   エ植物がグラスまたは小穀類である請求項１記載の胚形
   成性細胞培養体。 （４）グラスがポア、フェストウカ、ロリウム、プロム
   ス、トリセタム、アグロスチス、フレウム、アルペクル
   スおよびダクチリスからなる属から選択される請求項５
   記載の胚形成性細胞培養体。 （５）小穀類がアベナ、トリチカム、セカーレおよびホ
   ルデウムからなる属から選択される請求項３記載の胚形
   成性細胞培養体。 （６）植物体に再生され得るプーイデアエ亜科のイネ科
   植物のプロトプラストまたは植物細胞。 （７）前記再生される植物体が稔性植物体である請求項
   ６記載のプロトプラストまたは植物細胞。 （８）それらのゲノム内に外因性ＤＮＡを安定に組入れ
   た請求項６記載のプロトプラストまたは植物細胞。 （９）それらのゲノム内に植物内で発現可能な外因性Ｄ
   ＮＡを安定に組入れた請求項６記載のプロトプラストま
   たは植物細胞。 （１０）細胞培養体から誘導された請求項６記載のプロ
   トプラストまたは植物細胞。 （１１）胚形成性細胞懸濁体から誘導された請求項６記
   載のプロトプラストまたは植物細胞。 （１２）グラスまたは小穀類から誘導された請求項６記
   載のプロトプラストまたは植物細胞。 （１３）小穀類がアベナ、トリチカム、セカーレおよび
   ホルデウムからなる属から選択される請求項１２記載の
   プロトプラストまたは植物細胞。 （１４）請求項６ないし１３のいずれか１項に記載のプ
   ロトプラストまたは植物細胞から再生され、そして植物
   体に再生され得るプーイデアエ亜科のイネ科植物から誘
   導されたカルス。 （１５）前記再生される植物体が稔性植物体である請求
   項１４記載のカルス。 （１６）プーイデアエ植物がグラスまたは小穀類である
   請求項１４記載のカルス。 （１７）小穀類がアベナ、トリチカム、セカーレおよび
   ホルデウムからなる属から選択される請求項１６記載の
   カルス。 （１８）請求項６ないし１３のいずれか１項に記載のプ
   ロトプラストまたは植物細胞から再生され、そして植物
   体に再生され得るプーイデアエ亜科のイネ科植物から誘
   導された細胞培養体。 （１９）前記再生される植物体が稔性植物体である請求
   項１８記載の細胞培養体。 （２０）プーイデアエ植物がグラスまたは小穀類である
   請求項１８記載の細胞培養体。 （２１）小穀類がアベナ、トリチカム、セカーレおよび
   ホルデウムからなる属から選択される請求項１８記載の
   細胞培養体。 （２２）請求項１ないし５のいずれか１項に記載の胚形
   成性細胞培養体から再生されたプーイデアエ亜科のイネ
   科植物およびそれらのムカゴ。 （２３）請求項６ないし１３のいずれか１項に記載のプ
   ロトプラストまたは植物細胞から再生されたプーイデア
   エ亜科のイネ科植物およびそれらのムカゴ。 （２４）請求項１４ないし１７のいずれか１項に記載の
   カルスから再生されたプーイデアエ亜科のイネ科植物お
   よびそれらのムカゴ。 （２５）請求項１８ないし２１のいずれか１項に記載の
   細胞培養体から再生されたプーイデアエ亜科のイネ科植
   物およびそれらのムカゴ。 （２６）前記再生される植物体が稔性植物体である請求
   項２２ないし２５のいずれか１項に記載のプーイデアエ
   亜科のイネ科植物。 （２７）それらのゲノム内に外因性ＤＮＡを安定に組入
   れたプロトプラストまたは植物細胞からなるプーイデア
   エ亜科のイネ科植物およびそれらのムカゴ。 （２８）安定に組入れられた外因性ＤＮＡが植物または
   植物細胞内で発現可能である請求項２７記載のプーイデ
   アエ亜科のイネ科植物およびそれらのムカゴ。 （２９）有性的にまたは無性的に、そして生体内でまた
   は試験管内で増殖され得る植物材料からなる請求項２２
   ないし２８のいずれか１項に記載のムカゴ。 （３０）トランスジェニックプーイデアエ植物から得ら
   れたプロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、接合
   子、胚、花粉または種子からなる請求項２２ないし２８
   のいずれか１項に記載のムカゴ。 （３１）請求項２２ないし２８のいずれか１項に記載の
   植物の後代。 （３２）（ａ）プーイデアエ植物の適当な部分から組織
   を単離し、 （ｂ）この組織を胚形成性カルスおよび胚の形成を誘導
   し得る培地中で培養し、 （ｃ）胚形成性カルスおよび胚を連続的増殖を持続させ
   得る新鮮培地上で周期的に継代培養し、 （ｄ）０ないし５００回の移し換え後に胚形成性細胞群
   を単離し、そして （ｅ）適当な酵素混合物で細胞壁を除去し、そして生成
   したプロトプラストを単離することからなる、 植物体に再生され得るプーイデアエ亜科の イネ科植物のプロトプラストを作製する方法。 （３３）プーイデアエのプロトプラストが稔性植物体に
   再生され得る請求項３２記載の方法。 （３４）段階（ａ）の組織がプーイデアエ植物の幼内葉
   の基部、未熟生殖胚、未熟花序、成熟種子または実生組
   織から単離される請求項３２記載の方法。 （３５）段階（ａ）の組織が最も幼若な内葉から単離さ
   れる請求項３４記載の方法。 （３６）胚形成性細胞群の単離を０ないし１００回の移
   し換え後に行う請求項３４記載の方法。 （３７）胚形成性細胞群の単離を３ないし５０回の移し
   換え後に行う請求項３６記載の方法。 （３８）（ａ）植物体に再生され得るプロトプラストま
   たは植物細胞を、それらが細胞コロニーを形成するまで
   適当な培養培地中で培養し、 （ｂ）細胞培養体形成を促進するための適当な培地上で
   前記細胞コロニーまたはそれらの一部を培養し、そして （ｃ）生じる細胞培養体を単離する、ことからなる植物
   体に再生され得るプーイデアエ亜科のイネ科植物の細胞
   培養体を作製する方法。 （３９）（ａ）植物体に再生され得るプロトプラストま
   たは植物細胞を、それらが細胞コロニーを形成するまで
   培養体形成を促進するために十分な期間、適当な培養培
   地中で培養し、 そして （ｂ）生じる細胞培養体を単離することからなる植物体
   に再生され得る請求項３８記載のプーイデアエ亜科のイ
   ネ科植物の細胞培養体を作製する方法。 （４０）前記細胞培養体が稔性植物体に再生され得る請
   求項３８または３９のいずれかに記載の細胞培養体を作
   製する方法。 （４１）細胞培養体が懸濁培養体である請求項３８ない
   し４０のいずれか１項に記載の方法。 （４２）細胞培養体がカルス培養体である請求項３８な
   いし４０のいずれか１項に記載の方法。 （４３）段階（ａ）が固化剤としてアガロースの存在下
   で行われる請求項３８または３９のいずれかに記載の方
   法。 （４４）段階（ａ）のアガロース固化培地の液化または
   該培地の切断を行い、液化アガロース培地またはアガロ
   ース培地の断片を液体栄養培地に移し、そして細胞コロ
   ニーが形成されるまで培養することからなる請求項４３
   記載の方法。 （４５）段階（ｂ）において細胞コロニーの一部が細胞
   コロニーから遊離された細胞である請求項３８または３
   ９のいずれかに記載の方法。 （４６）プロトプラストまたは細胞がそれらのゲノム内
   に安定に組込まれた外因性ＤＮＡを含有する請求項３８
   または３９のいずれかに記載の方法。 （４７）組込まれた外来ＤＮＡが植物細胞内で発現可能
   である請求項４６記載の方法。 （４８）（ａ）プロトプラストから誘導され、そして胚
   形成を誘導し得る培地上で植物に再生され得るプーイデ
   アエ植物のカルスを、胚が形成されるまで培養し、 （ｂ）胚の成熟および発芽の誘導に適当な培地上で胚を
   培養し、そして （ｃ）得られた小植物体を土に移して成熟植物を形成す
   るには十分に生長するまで該小植物体を培養する、 ことからなるカルスからプーイデアエ亜科のイネ植物を
   再生させる方法。 （４９）（ａ）プロトプラストから誘導され、そして胚
   形成を誘導し得る培地上で稔性植物に再生され得るプー
   イデアエ植物のカルスを、胚が形成されるまで培養し、 （ｂ）胚の成熟および発芽の誘導に適当な培地上で胚を
   培養し、 （ｃ）得られた小植物体を土に移して成熟植物を形成す
   るには十分に生長するまで該小植物体を培養し、そして （ｄ）開花調節または野外受粉で種子を得る、ことから
   なるカルスからプーイデアエ亜科の稔性イネ科植物を再
   生させる方法。 （５０）カルスを形成する植物細胞がそれらのゲノム内
   に安定に組込まれた外因性ＤＮＡを含有する請求項４８
   または４９のいずれかに記載の方法。 （５１）組込まれた外因性ＤＮＡが植物細胞内で発現可
   能である請求項５０記載の方法。（５２）（ａ）全体の
   植物体に再生され得るプロトプラストを外因性ＤＮＡで
   この分野では公知の形質転換法を用いて形質転換し、 （ｂ）請求項３８または３９のいずれかの記載に従って
   形質転換されたプロトプラストを培養し、そして （ｃ）請求項４８または４９のいずれかの記載に従って
   全体の植物体を再生させることからなるプーイデアエ亜
   科のトランスジェニックイネ科植物を作製する方法。 （５３）前記外因性ＤＮＡが、価値ある特性を有する形
   質転換された植物プロトプラスト、プロトプラスト誘導
   組織および最終的にプロトプラスト誘導植物体を提供す
   る１種またはそれ以上のキメラ遺伝子からなる請求項５
   ２記載の方法。 （５４）前記外因性ＤＮＡが、調節機能を示す非コード
   性ＤＮＡ配列からなる請求項５２記載の方法。 （５５）直接遺伝子導入法がプロトプラストの形質転換
   のために段階（ａ）で用いられる請求項５２記載の方法
   。 （５６）（ａ）適当な液体培養培地中に活発に生長する
   懸濁培養細胞またはカルスを分散し、 （ｂ）この培養液を約０℃ないし５℃まで冷却し、 （ｃ）ほぼ同じ温度で前記の予め冷却した培養液を適当
   な凍結保護用水溶液と混合し、 （ｄ）生成した混合物を毎分約０．０１℃ないし約２０
   ℃の速度で、約−２０℃と約−６０℃の間の温度まで冷
   却し、 （ｅ）予め冷却した混合物を液体窒素または液体空気中
   で衝撃凍結し、そして （ｆ）凍結した混合物を−１００℃より低い温度で保存
   することからなる、 イネ科植物の懸濁培養体およびカルス培養体を包含する
   胚形成性細胞培養体を凍結保存する方法。