HU220186B - A pooideae alcsaládba tartozó Graminea növények regenerálása protoplasztokból kiindulva - Google Patents

Description

Az alábbi találmány a Pooideae alcsaládból (Subfamilia) való füvekre vonatkozik, amelyeket protoplasztokból, regenerált sejtfalakkal (növényi sejtek) bíró protoplasztokból vagy kalluszokból, amelyek protoplasztokból erednek, regenerálnak, valamint általánosan alkalmazható eljárásra vonatkozik ezeknek a növényeknek a regenerálásához. A jelen találmánynak egy további tárgya embriogén sejttenyészetekre (szuszpenziós tenyészet vagy kallusztenyészet), valamint kalluszokra vonatkozik, amelyek a protoplasztokhoz kiindulási anyagként szolgálnak, amelyeket azután önmagukban teljes növényekké lehet regenerálni. A jelen találmány ugyancsak magában foglalja a fentebb említett embriogén sejttenyészetek előállítására szolgáló eljárásokat, a nevezett embriogén sejttenyészetek és az embriogén kalluszok hidegkonzerválását (krioprezerválás), valamint a Pooideae alcsaládból származó transzgén növényeket, amelyek a genetikailag módosított protoplasztokból regenerálhatok.

A növények többsége, amelyektől az emberi táplálkozás elsősorban függ, a növényeknek ahhoz a csoportjához tartozik, amelyeket a pázsifutfélék gyűjtőfogalma alatt ismerünk, A Gramineae (Poaceae) növényeket kereskedelmi szempontból a legjelentősebb családnak tekinthetjük az egyszikű növények osztályából. A pázsitfűfélékhez tartoznak az alábbi alcsaládok és nemzetségek

Alcsalád	Nemzetség az alcsaládon belül
Bambusoiade	Bamboo
Andropogonoideae	Saccharum (cukornád) Sorghum Zea (kukorica)
Arundineae	Phragmites
Oryzoideae	Oryza (rizs)
Panicoideae	Panicum (* *) Pennisetum (*) Setaria (*)
Pooideae (Festuciadeae)	Poa (**) Festuca (**) Lolium (**) Bromus (**) Trisetum (**) Agrostis (**) Phleum (**) Dactylis (**) Alopecurus(**) Avena (zab λ) Triticum (búza λ) Secale (rozs λ) Hordeum (árpa a)

* kölesfélék * füvek λ kismagvú gabonafélék

A pázsitfűfélék alcsaládjain belül a Pooideae alcsalád gazdasági szempontból nagyon jelentős növényi csoportot képez. Ehhez tartoznak például a füvek és kismagvú gabonafélék igen közeli rokon alcsoportjai.

Érdekes módon éppen a Pooideae alcsaládból származó növények azok, amelyeket a legnehezebb tudományos módszerek segítségével manipulálni. Eddig még nem ismeretes megfelelő általános eljárás, amely a növények, termő növények vagy stabilan beépített exogén DNS-sel bíró transzgén növények regenerálását lehetővé tenné protoplasztokból kiindulva, pedig egy ilyen regenerálás tenyésztett protoplasztokból előfeltétel például a szomatikus hibridizáláshoz és a transzgén növények előállításához a közvetlen génátvitel segítségével. A gabonatranszformálás területéről az ismeretek jelenlegi állása az, amelyet Cocking és Davey (1987) röviden összefoglalva ismertetnek áttekintő közleményükben.

A gabonatenyészetekhez való kiindulási anyagként protoplasztok izolálására szolgáló eljárásnak, valamint ezen protoplasztok tulajdonságainak leírása található például az alábbi közleményben: „Cereal Tissue and Cell Culture” [szerkesztők: Bright S. W. J. és Jones M. G. K. (1985); kiadók: Nijhoff M. és Junk W., Dordrecht],

Pázsitfűfélék stabil transzformálását már el tudták émi DNS kémiai úton vagy elektromosan stimulált felvétele révén protoplasztokba („Direkter gentransfer”, Potrykus és munkatársai, 1985; Lörz és munkatársai, 1985; Fromm és munkatársai, 1986), mindeddig azonban a teljes növény regenerálása az ebben a tanulmányban előállított sejtvonalból kiindulva nem volt lehetséges.

Mindeddig a pázsitfűfélék csoportjából csak olyan növényeket tudtak eredményesen regenerálni, amelyek nem a Pooideae alcsaládba tartoznak. Abdullah és munkatársai (1986) beszámolnak például egy hatásos növényregenerálásról rizsprotoplasztokból (Oryzoideae alcsalád) kiinduló szomatikus embriogenezis révén. Yamada és munkatársai is leírnak növényregenerálást rizsnél kalluszokból kiindulva, amelyek protoplasztokból erednek. Rhodes és munkatársai (1988) leírják nem termő kukoricanövények regenerálását. Cocking és Davey (1987) az eddigi ismeretek állását tárgyalják a génátvitel területén gabonanövényekbe.

A pázsitfűféle növények regenerálása a Pooideae alcsaládban szövettenyészetekből kiindulva ismert. Hanning és munkatársai (1982) leírják az embrió- és csírakifejlődést Dactylis glomerata L.-ből, kalluszszövetből kiindulva, amely levélszegmensekből fejlődött ki.

Az alábbiakban példaként további növényeket adunk meg a Pooideae alcsaládból, amelyek regenerálását tenyésztett sejtekből az alábbi közleményekben írják le:

Lolium rigidum (Skene és munkatársai, 1983); Lolium perenne, Lolium multiflorum (Ahloowalia, 1975); Lolium multiflorum, Festuca arundinacea (Kasperbauer és munkatársai, 1979); Alopecurus arundinaceus, Agropyron crytatum, Stipa viridula, Bromus inermis, Agropyron smithiii (Lo és munkatársai, 1980); és Agrostis palustris (Krans és munkatársai, 1982).

A szövettenyészetekről takarmányfüveknél további áttekintés található Ahloowalianál (1984).

A fentebb megadott esetekben a Pooideae regenerálása nem ugyanabból a kiindulási anyagból indul ki, mint amelyet a jelen találmányban bemutatunk, hanem

HU 220 186 Β más sejttenyészettípusokból. A fentebb megadott példák egyikében sem bizonyítható, hogy a regenerálás de novo szomatikus embriogenezissel menne végbe. A fentebb idézett irodalmi hivatkozások ezenkívül nem tartalmaznak adatokat protoplasztok izolálásáról és tenyésztéséről, vagy növények regenerálásáról protoplasztokból.

Következésképpen annak ellenére, hogy jelentős érdekek fűződnének a Pooideae alcsaládból való pázsitfűfélék genetikai transzformációjához és regenerálásához, a jelen időpontig nincsen olyan in vitro eljárás, amely lehetővé tenné növények vagy termő növények sikeres regenerálását olyan protoplasztokból, amelyek adott esetben transzformálva lehetnek (Cocking és Davey, 1987).

Eddig minden kutatás és erőfeszítés ebben az irányban sikertelen maradt, vagyis vagy nem vezetett embriókhoz, vagy nem életképes növénykékhez vezetett, amelyek már egy korai fejlődési fázisban elpusztultak, és ezért már nem sikerült földbe sem átültetni ezeket (Ahloowalia, 1984).

Következésképpen eddig nem került nyilvánosságra olyan rendelkezésre álló eljárás, amely lehetővé tenné olyan protoplasztok előállítását a Pooideae alcsaládból, amelyek az egész növénnyé, főleg termő növénnyé való differenciálódáshoz, még kevésbé a Pooideae alcsaládból való növények regenerálódására szolgáló eljáráshoz vezetnének protoplasztokból vagy olyan kalluszokból kiindulva, amelyek protoplasztokból erednek.

Ezeket és más feladatokat a jelen találmány keretében megoldottuk, amely eljárás olyan protoplasztok előállítását mutatja be, amelyekből lehet sejt- vagy kallusztelepeket képezni. A protoplasztokat lehet, amennyiben kívánatos, transzformálni, ezenkívül a keletkező kalluszokat egész növényekké (Pooideae) regenerálni. Ez az eljárás a protoplasztok előállítására, amelyek képesek osztódni és olyan kallusszá fejlődni, amelyek azután egész növénnyé fejlődhetnek, kiindulási anyagként újfajta embriogén sejttenyészeteket (szuszpenziós vagy kallusztenyészetek) vagy embriókat tesz szükségessé.

Ezeket az embriogén sejttenyészeteket és embriókat, valamint az eljárásokat ezek előállítására és azonosítására a jelen bejelentésben leírjuk, és ezek a jelen találmány részét képezik.

A protoplasztokhoz kiindulási anyagként ezenkívül olyan embriogén kalluszt alkalmazhatunk, amelyből a szuszpenziók származtathatók. Ezt a kalluszt, valamint a szuszpenziókat, embriókat és eljárásokat ennek előállítására és azonosítására a jelen bejelentésben leíijuk, és ezek a jelen találmány részét képezik.

Ezek az embriogén tenyészetek képezik a protoplasztok forrását, amely protoplasztokat exogén DNSsel lehet transzformálni, és amelyekből lehet sejtosztódást és kallusz képződését elérni. Ezt a kalluszt lehet azután egész növénnyé, ezek között egész termő növénnyé regenerálni, amelyek fóliában növeszthetők.

Mindeddig, amíg ezt a találmányt el nem készítettük, a technika állásából nem lehetett arra következtemi, hogy lehetséges Pooideae alcsaládból származó pázsitfűféléket, különösen termő pázsitfűféléket protoplasztokból vagy pedig olyan sejtekből vagy kalluszokból, amelyek protoplasztokból erednek, regenerálni. Még kevésbé volt előre látható, hogy a Pooideae alcsaládból származó növények olyan protoplasztjait lehet ugyanígy transzgén növényekké, főleg pedig termő transzgén növényekké regenerálni, amelyek genomjukba stabilan beépítve exogén DNS-t tartalmaznak.

A találmány elsősorban tehát olyan embriogén sejttenyészetekre (szuszpenziós vagy kallusztenyészetek) vonatkozik, amelyek a Pooideae alcsaládból való pázsitfűfélékből vezethetők le, és amelyek protoplasztokból izolálhatok, ahol a nevezett protoplasztok először sejtfalakat regenerálnak, osztódnak, végül olyan kalluszt képeznek, amelyek teljes növényekké, teljes termő növényeket is beleértve, regenerálhatok.

A jelen találmány ezenkívül a Pooideae alcsaládból való növények protoplasztjaira és az ezekből (a sejtfal regenerálása után) létrejövő növényi sejtekre is vonatkozik, amelyekből teljes növényeket, előnyösen teljes termő növényeket lehet regenerálni, amelyek sejttenyészetekből vagy embriogén sejtszuszpenzióból származnak.

A jelen találmány további tárgyát képezik azok a növényi sejtek, kalluszok, embriogén sejttenyészetek, embriók, fiatal növények, valamint növények, amelyek a nevezett protoplasztokból erednek.

A jelen találmány körébe tartoznak továbbá a Pooideae alcsaládba tartozó regenerált pázsitfűféle növények, valamint szaporítóanyagaik, különösen azok a növények, amelyek olyan protoplasztokból vagy növényi sejtekből erednek, amelyek genomjukba beépítve exogén DNS-t tartalmaznak, előnyösen olyan exogén DNS-t, amely a növényben kifejezhető. A jelen találmány keretében szaporítóanyagon olyan növényi anyagokat értünk, amelyek szexuálisan vagy aszexuálisan vagy in vitro vagy in vivő képesek szaporodni, ahol előnyösek a protoplasztok, sejtek, kalluszok, szövetek, szervek, zigóták, embriók, virágpor vagy magvak, amelyek a Pooideae alcsaládból való transzgén növényekből nyerhetők. A jelen találmány további tárgyát képezik a Pooideae alcsaládból való nevezett növények utódai, valamint ezek mutánsai és variánsai, beleértve azokat, amelyek olyan növényekből erednek, amelyeket szomatikus sejtfúzió, genetikai módosítás vagy mutánsszelekció révén kapunk.

A jelen találmány továbbá protoplasztok és növényi sejtek előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik a Pooideae alcsaládba való növényekből, amely protoplasztok és sejtek teljes növényekké, előnyösen teljes termő növényekké képesek regenerálódni, vonatkozik továbbá olyan kalluszok előállításának eljárására, amelyek a nevezett protoplasztokból vagy növényi sejtekből erednek, és amelyek képesek teljes növényekké, különösen teljes termő növényekké regenerálódni. A jelen találmány továbbá eljárásra vonatkozik a Pooideae alcsalád növényeinek regenerálására a nevezett kalluszokból kiindulva. Ezeket az eljárásokat később részletesen leírjuk.

A jelen találmánynak ezeket és további tárgyait nyilvánvalóvá tesszük a későbbi részletes leírásban.

HU 220 186 Β

Most röviden ismertetjük az ábrákat.

1. ábra. A kép Dactylis glomerata L. telepeit mutatja, amelyek protoplasztokból erednek, és amelyek olyan agarózközegen nőnek, amelybe valamely folyékony tápközeg van szuszpendálva.

2. ábra. A kép olyan fiatal növényt mutat, amely protoplasztból származó Dactylis glomerata L. kalluszból fejlődött ki, ahol a kallusz SH-O tápközegen nőtt.

3. ábra. A kép tartóedényt mutat egy meggyökeresedett fiatal növénnyel, amely SH-0 tápközegen nőtt olyan Dactylis glomerata L. kalluszból fejlődött ki, amely protoplasztokból ered.

4. ábra. A kép Dactylis glomerata L. növényt mutat, amely protoplasztokból van regenerálva (baloldalt), egy vad típusú Dactylis glomerata L. növénnyel együtt (jobboldalt).

5. ábra. Az ábra a pCIB709 plazmidot mutatja be, amelyet a Dactylis glomerata L. protoplasztok transzformálására lehet alkalmazni abból a célból, hogy rezisztenciát vezessünk be higromicin ellen. A pCIB709 plazmidot a Budapesti Szerződés rendelkezései szerint letétbe helyeztük az American Type Culture Collectionnél (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) ATCC 40428 deponálási számon. A deponálás időpontja 1988. február 12. (A plazmid nukleotidszekvenciáját a 7. ábra mutatja be.)

Magyarázatok:

35S prom.: 35S promotorterület

Hygro-gene: a higromicin-foszfotranszferáz struktúrgénje (APH TypIV)

35Sterm.: CaMV terület a CaMV 35S átirat 3’poliadenilező helyével

6. ábra. Az ábra a különböző Dactylis glomerata L. kalluszok DNS-einek „Southem-folt” elemzése, amely kalluszokat a protoplasztoknak pCIB709 plazmiddal való transzformálása után kapunk. Az elemzést az Xbal-SstI fragmentumok segítségével végezzük, amelyek molekuláris vizsgálómintaként szolgálnak.

7. ábra. Az ábra a pCIB709 plazmid nukleotidszekvenciáját adja meg.

1-2. sor: 10 ng, illetve 2 ng, BamHI restrikciós endonukleázzal hasított pCIB709.

4-8. sor: Dactylis glomerata kallusztenyészetekből származó, BamHI-gyel hasított DNS, ahol a kallusztenyészet olyan protoplasztokból ered, amelyek előzőleg pCIB709-cel voltak transzformálva.

9. és 17. sorok: nem transzformált protoplasztokból eredő Dactylis glomerata L. kalluszból nyert, BamHI-gyel hasított DNS.

10-13. sorok: Dactylis glomerata L. kallusztenyészetekből származó, BamHIgyel hasított DNS, ahol a kallusztenyészet olyan protoplasztokból ered, amelyek előzőleg pCIB709cel voltak transzformálva.

14. sor: Dactylis glomerata L. kallusztenyészetekből származó, BamHI-gyel hasított DNS, ahol a kallusztenyészet olyan protoplasztoktól ered, amelyek előzőleg pCIB709-cel voltak transzformálva.

15., 16. sor: Dactylis glomerata L. kallusztenyészetekből származó, BamHI-gyel hasított DNS, ahol a kallusztenyészet olyan protoplasztokból ered, amelyek előzőleg pCIB709-cel voltak transzformálva.

4. sor: vak.

A 6., 10., 12. és 15. sorokban a film feketedése mutatja az idegen DNS jelenlétét, amely a Dactylis glomerata L. sejtek genomjába van integrálva. Az 1063 bp-t tartalmazó fragmentumot, amely a pCIB709 plazmidban levő integrált higromicingén BamHI-gyel végzett emésztésénél várható (a pCIB709 583-1646. nukleotidjai), nyíllal jelöljük.

Meghatározások

Abból a célból, hogy a leírás és az igénypontok, valamint az ezekben alkalmazott fogalmak világos és egyértelmű megértését biztosítsuk, az alábbi meghatározásokat adjuk meg:

Növényi sejt: egy növény szerkezeti és fiziológiai egysége, amely protoplasztból és sejtfalból áll.

Növényi szövet: növényi sejtek csoportja, amely szerkezeti és funkcionális egység formájában szerveződik.

Növényi szerv: egy növény behatárolt és észrevehetően differenciált területe, mint például gyökér, szár, levelek, virágbimbók vagy embriók. Egy növényi szerv különböző sejt- és szövettípusokból lehet felépítve.

Protoplaszt: izolált növényi sejt sejtfal nélkül.

Sejttenyészet: burjánzó sejttömeg nem differenciált vagy részben differenciált állapotban.

Embrió: egy növény nagyon kicsiny és korai fejlődési stádiuma, amely vagy egy zigótából (szexuális embrió) vagy egy embriogén szomatikus sejtből (szomatikus embrió) fejlődött ki, és már felismerhető morfológiával, szerkezettel és sejtszerveződéssel bíró stádiumban van; ez magában foglalja a celluláris, globuláris, valamint sziklevélstádiumokat. (A kukorica embrionális fejlődését például Randolp 1936-ban írta le, míg a pázsitfűfélék embrionális fejlődését Brown 1960-ban.)

Sejtcsomó: egymáshoz kötött sejtek csoportja, amelyek egymással össze vannak tapadva; a sejtcsomók általában egy vagy több elődsejtből vagy protoplasztból keletkeznek sejtosztódás révén.

Fiatal növény: soksejtes szerkezet, amely hajtásból és gyökérből áll és külső formára kis növénynek mutatkozik.

Dicamba: 3,6-diklór-2-metoxi-benzoesav.

MES: 2-(N-morfolin)-etánszulfonsav.

2,4-D: 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav.

Picloram: 4-amino-3,6,6-triklór-pikolinsav.

Trisz-HCl: a,a,a-trisz(hidroxi-metil)-metil-aminhidroklorid.

EDTA: l-etilén-diamin-N,N,N’,N’-tetraecetsav.

PEG: polietilénglikol.

HU 220 186 Β

Agaróz: Az agaróz előállítását és tisztítását például Guieseley és Renn (1975) írják le. Az agaróz az agar egyik alkotórésze. A kereskedelmi forgalomban kapható agar általában a semleges agaróz és az ionos agaropektin keverékéből áll, amely helyettesítők sokaságával bír. A kereskedelmi agarózt általában ismert eljárásokból lehet agárból kapni. Általában ekkor is megmarad egy sor helyettesítő, amelyek azután meghatározzák az agaróz fizikokémiai tulajdonságait, például a kocsányosodás vagy olvadáspont hőmérsékletét. Az alacsony hőmérsékleten olvadó agaróz („Low-melting Agarose”), különösen a Sea Plaque Agarose, különösen előnyös szilárdítóanyagként a jelen találmány szerinti eljárások keretében.

SH-0 tápközeg: Hormonmentes tápközeg Schenk és Hildebrandt szerint (1972). [Az SH tápközeg lehet folyékony vagy lehet 0,8% (tömeg/térfogat) agarral vagy 0,5% (tömeg/térfogat) GelRite-vel szilárdítva.] A tápközeget normálisan ismert műveletek segítségével melegítéssel vagy autoklávban 128 °C hőmérsékleten és 1,2 kg/cm² (-1,2-10⁵ Pa) nyomáson 15-20 percig végzett kezeléssel sterilezzük.

GelRite: GelRite Gellan Gum, Scott Laboratories, Inc., Fiskerville, Rhode Island, #02823.

SH-30 tápközeg: SH-0 tápközeg 30 pmol/l dicambaval.

SH-45 tápközeg: SH-0 tápközeg 45 pmol/l dicambaval.

KM-8p tápközeg: 8p tápközeg Kao és munkatársai szerint (1975). Ez a tápközeg lehet folyékony formában vagy lehet agarral, agarózzal vagy GelRite-vel megszilárdítva és lehet éppen úgy aszkorbinsav, A-vitamin vagy D-vitamin nélkül is előállítani és alkalmazni. A tápközeg alkotórészeit a szilárdítóanyagok kivételével normálisan lehet 0,2 pm-es szűrőn keresztül szűrve sterilezni.

RY-2 tápközeg: Yamada és társai (1986) szerinti tápközeg.

OMS tápközeg: Tápközeg Murashige és Skoog szerint (1962). A tápközeget lehet például 0,8% (tömeg/térfogat) agarral vagy agarózzal vagy 0,5% (tömeg/térfogat) GelRite-vel szilárdítani. A jelen igénypontokban leírt alkalmazási célhoz ezt a tápközeget olyan módon lehet előállítani, hogy B5 közegek vitaminkiegészítését tartalmazza Gambory és munkatársai (1968) szerint.

Celluláz RS: Celluláz RS, Yakult Hansha Co., Ltd., 1.1.19 Higashi-Shinbasi, Minato-ku, Tokió, 105, Japán.

Pectolyase Y-23: Seishin Pharmaceutical Co., Ltd., 4-13 Koami-cho, Nihanbashi, Tokió, Japán.

Parafilm: Parafilm laboratóriumi film - American Can Co., Greenwich, Connecticut, 06830, Amerikai Egyesült Államok.

Nalgene-Filter: Nalge Co., Division of Sybron Corp., Rochester, New York, 14602, Amerikai Egyesült Államok.

BglII: BglII restrikciós enzim; New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachussets, 01915, Amerikai Egyesült Államok; vagy más tetszés szerinti gyártók.

BamHI: BamHI restrikciós enzim; New England

Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachussets,

01915, Amerikai Egyesült Államok; vagy más tetszés szerinti gyártók.

Kazeinhidrolizátum: Kazeinhidrolizátum - enzimes hidrolizátum tehéntejből; 1. típus; Sigma Co., PO Box 14508, St. Louis, Missouri, 63178, Amerikai Egyesült Államok.

Higromicin B: Citotoxin, higromicin B, tisztított; Calbiochem Behring Diagnostica, 400050 katalógusszám, La Jolla, Kalifornia, 92037, Amerikai Egyesült Államok, 702296. gyártási tétel.

Gene Screen Plus: NEN Research Products, NEF 976 katalógusszám, 549 Albany St., Boston, Massachussets 02118, Amerikai Egyesült Államok.

TBE-puffer: Triszborátpuffer - szokásos puffer elektroforézishez, lásd Maniatis és munkatársai (1982).

Spin Saulé: Sephadex G25 készen csomagolt oszlop, Boehringer Mannheim Biochemicals, 100402 katalógusszám, Piscataway, New Yersey, Amerikai Egyesült Államok.

SDS: nátrium-dodecil-szulfát.

SSC: 1,54 mmol/1 NaCl, 0,154 mmol/1 nátriumcitrát, Maniatis és munkatársai leírása szerint (1982).

CET AB: hexadecil-trimetil-ammónium-bromid.

IBI Random Primer Kit: „Prímé Time” véletlenszerű primer készlet, International Biotechnologies Inc., PO Box 1565, New Haven, Connecticut 07606, Amerikai Egyesült Államok (katalógusszám: 77800; gyártási tételszám: F630-01).

A jelen találmány keretében meglepő módon bemutatjuk, hogy a Pooideae alcsaládból való pázsitfűféle növényeket, különösen termő pázsitfűféle növényeket regenerálni lehet speciális típusú protoplasztokból, valamint az ezekből a protoplasztokból származó sejtekből és kalluszokból.

A növényeknek, különösen a termő növényeknek ez a regenerálása akkor is lehetséges, amikor a protoplasztok exogén DNS-t tartalmaznak. Itt előnyös, ha a protoplasztok genomjába stabilan olyan DNS van beépítve, amely a növényekben kifejezhető.

A Pooideae alcsaládba való bármely pázsitfűféle növényt lehet ennek a találmánynak a keretében alkalmazni. Előnyösek mégis azok a Pooideae alcsaládba való növények, amelyek a fűfélékhez tartoznak, például mindazok a nemzetségek, amelyek az alábbi csoportba tartoznak: Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus és Dactylis. Különösen előnyösek a Dactylis növények.

Hasonlóképpen előnyösek ennek a találmánynak a keretében azok a Pooideae alcsaládba való növények, amelyek a kismagvú gabonafélék csoportjába tartoznak, például az Avena (zab), Triticum (búza), Secale (rozs) és Hordeum (árpa) nemzetség tagjai.

A Pooideae protoplasztok speciális típusa, amely osztódik és olyan sejttenyészeteket képez, amelyek egész növénnyé képesek regenerálódni, sejttenyészetekből, elsősorban pedig embriogén sejttenyészetekből származik. Az embriogén sejttenyészetek közül előnyösek az embriogén szuszpenziós és kallusztenyészetek.

HU 220 186 Β

A sejttenyészeteket a Pooideae alcsaládból való növények megfelelő részeiből lehet előállítani. A megfelelő növényrészeken a jelen találmány keretében például fiatal, belül fekvő levelek alapmetszeteit, éretlen szexuális embriókat, éretlen virágzatot, érett magokat vagy csíraszöveteket értünk, amelyek a Pooideae alcsaládba való növényekből származnak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk eljárásunkat.

A) eljárási lépés: embriogén szuszpenzió előállítása növényi szövetből

Embriogén kallusz előállításához egy, a Pooideae alcsaládba való növény megfelelő metszetéből indulunk ki, általában egy fiatal levél alapmetszetéből. Különösen előnyösek a Pooideae alcsaládba való növények fiatal, belül fekvő levelei. Ezt az eljárási lépést analóg módon lehet elvégezni Hannig és munkatársai (1982) Dactylis glomerata L.-re vonatkozó eljárásával. Az ott leírt eljárás nem korlátozódik az adott fajra, hanem alkalmazható az összes többi növényre, amelyek a Pooideae alcsaládba tartoznak. Ez a közlemény referencia formájában a jelen találmány részét képezi.

A leveleket lehet például 1-5 mm hosszú vagy átmérőjű kis metszetekre vagy szegmensekre aprítani. Ennek a levéldarabnak a formája és nagysága nem kritikus. Ezeket a szegmenseket a kalluszfenntartáshoz alkalmas tápközegre szélesztjük és ott kallusz- és/vagy embriogén szerkezetek keletkezéséig tenyésztjük. Egy erre a célra alkalmas tápközeg például az SH tápközeg (Schenk és Hildebrandt, 1972) 30 pmol/l dicambaval és 0,8% (tömeg/térfogat) agarral vagy agarózzal mint kocsonyásító anyaggal. További alkalmas tápközeget írnak le George és munkatársai (1987). A kalluszés/vagy embriogén szerkezetek általában 2-6 hét után jelennek meg a szélesztéstől számítva. A kallusz beindítását és fenntartását fényben vagy pedig előnyösen sötétben lehet végezni 0-50 °C közötti, előnyösen 20-32 °C közti és egészen különösen előnyös módon 25-28 °C közti hőmérsékleten. Az embriogén kalluszt lehet más ismert eljárások segítségével is előállítani, például Lührs és Lörz eljárásával (1987), valamint az ebben a közleményben megadott referenciák eljárásaival, amelyekben árpára vonatkozó eljárások vannak leírva. Ezeket az eljárásokat más Pooideae növényekhez is lehet alkalmazni, ezek a közlemények tehát referencia formájában ennek a találmánynak részét képezik.

A szuszpenziós tenyészet beindítása azzal kezdődik, hogy embriogén kallusz friss darabjait megfelelő folyékony tápközegbe visszük, például 0,5 g kalluszt 50 ml folyékony tápközegbe [Gray és munkatársai (1985)], amely 45 pmol/l dicambat és 4 g/liter kazeinhidrolizátumot is tartalmaz. A váltogatás a világosság és sötétség fázisok között a tenyésztési periódus során előnyös lehet. A szuszpenziót 5-20 órás, elsősorban 16 órás világosságperiódussal tenyésztjük, amelyet 5-20 órás, előnyösen pedig 8 órás sötétségperiódus követ. A fényintenzitás tipikus módon 0,1 pE/m²s és 100 pE/m²s között van (E=Einstein; m=méter; s=másodperc), előnyösen 30 pE/m²s és 80 pE/m²s között. Éppen úgy előnyös a szuszpenziót a tenyésztési fázis során mozgatni is. A szuszpenzió mozgatását például Delong-lombikban lehet végezni, amely egy fény és gázok által átjárható műanyag filmmel vagy bármilyen más alkalmas zárással van lezárva, a lombikokat kör rázógépen mozgatva 100-150 fordulat/percnél. Mintegy 3-5 hét múlva a nagyobb sejtgócokat mintegy 30 másodpercig ülepítjük, a nagyobb darabokat eltávolítjuk, hogy csak a kisebb sejtcsomók maradjanak meg, és ezeket új tenyészetek beindítására friss tápközegbe visszük át.

Ezeket az eljárási lépéseket periodikusan, előnyösen minden 3-4 héten megismételhetjük, ahol mindig csak a sikerrel kecsegtető tenyészeteket alkalmazzuk, megbecsülve a sejtcsomók kisebb méretét, valamint minőségét. 4-20, általában inkább 6-8 átvitel (transzfer) után a szuszpenzió lényegében mentes a nem embriogén sejtektől, és az embriogén sejtcsomók többsége tipikusan 150-2000 pm nagyság között van.

Ennek a találmánynak a keretei között különösen előnyös egy eljárás, amely olyan embriogén szuszpenziók előállításához vezet, amelyek elsősorban kis preembriogén sejttömegből állnak. A preembriogén sejttömeg arányát még azzal lehet jelentős módon fokozni, hogy a nagyobb anyagot először hagyjuk kiülepedni, és ezután csak a szuszpenziónak fentebb található részét tenyésztjük újból tovább.

A jelen találmány tárgyai közé tartozik tehát egy olyan embriogén sejttenyészet, szuszpenziós tenyészet vagy kallusztenyészet, amely a Pooideae alcsaládba való pázsitfűféle növényekből származik és a protoplasztokból izolálható, ahol a nevezett protoplasztok képesek sejtfalukat regenerálni, osztódni és kalluszt képezni. A nevezett kalluszt magát lehet azután teljes növénnyé, elsősorban pedig teljes termő növénnyé regenerálni.

A jelen találmány keretében különösen előnyösek a füvekből származó sejttenyészetek (szuszpenziós tenyészetek és kallusztenyészetek), különösen az alábbi nemzetségekbe tartozó füvekből: Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus és Dactylis. Különösen előnyösek a Dactylis glomerata L. embriogén sejttenyészetei.

A jelen találmány keretében található további előnyös tárgyak közt találjuk a kismagvú gabonafélék embriogén sejttenyészeteit (szuszpenziós és kallusztenyészetek), különösen az Avena, Triticum, Secale és Hordeum nemzetségbe tartozó gabonafélék tenyészeteit.

A jelen találmány további tárgya az a kallusz, amely a Pooideae alcsaládba való pázsitfűféle növényekből ered, és amely protoplasztokból izolálható, ahol a nevezett protoplasztok képesek sejtfalukat regenerálni, osztódni és kalluszt képezni, amely kalluszt magát azután teljes növénnyé, elsősorban pedig teljes termő növénnyé lehet regenerálni.

Olyan protoplasztokat lehet izolálni, ahol a nevezett protoplasztok képesek sejtfalukat regenerálni, osztódni és kalluszt képezni, amelyet azután ismét teljes növénnyé, elsősorban pedig teljes termő növénnyé lehet regenerálni.

A jelen találmány keretében különösen előnyös a fűfélékből való embriogén kallusz, elsősorban azokból a fűfélékből, amelyek a Poa, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus vagy Dactylis nemzetsé6

HU 220 186 Β gek valamelyikébe tartoznak. Egészen különösen előnyös a Dactylis glomerata L.-ből származó embriogén kallusz.

A jelen találmány keretében található további előnyös tárgy egy olyan kallusz, amely valamely kismagvú gabonából származik, különösen olyan gabonából, amely az Avena, Triticum, Secale vagy Hordeum nemzetségek valamelyikébe tartozik.

Ugyancsak a jelen találmány keretébe tartoznak azok a Pooideae alcsaládba tartozó pázsitfűféle növények, elsősorban pedig termő pázsitfűféle növények és szaporítóanyagaik, amelyek protoplasztokból vagy növényi sejtekből, amelyek embriogén sejttenyészetből származnak, vannak regenerálva.

Eljárás sejttenyészetek (szuszpenziós és kallusztenyészetek) hidegkonzerválására („ Cryopreservation ”) pázsitfűféléknél

Néhány növényi szövetet ismert eljárások segítségével lehet hidegben konzerválni, ilyenek például azok, amelyeket Withers ír le (1986), és az ő közleményében idézett referenciákban találhatók. Ezek az eljárások azonban még általánosan nem alkalmazhatók, és különösen alkalmazhatók pázsitfűfélék embriogén sejttenyészeteinek (szuszpenziós és kallusztenyészeteinek) hidegkonzerválására.

A jelen találmány keretében most meglepő módon kimutatjuk, hogy lehetséges embriogén sejttenyészeteket, ideértve szuszpenziós és kallusztenyészeteket is, a Graminae családból származó összes növényekből szuszpendált formában őrizni, mégpedig hidegkonzerválás („Cryopreservation”) révén alacsony hőmérsékleten.

Az embriogén sejttenyészetek hidegkonzerválására szolgáló eljárás, ideértve a szuszpenziós és kallusztenyészeteket is, amely tenyészetek a Graminae család növényeiből származnak, az alábbi eljárási lépéseket foglalja magában:

(a) aktív, növekvő szuszpenziós tenyészetsejtek vagy kallusz diszpergálása megfelelő folyékony tápközegben;

(b) ennek a tenyészetnek a lehűtése a fagyáspont közelébe (0-5 °C);

(c) a nevezett lehűtött tenyészet összekeverése megfelelő fagyasztási segédanyaggal mintegy azonos hőmérsékleten;

(d) az így létrejött keverék lehűtése mintegy 0,01-20 °C/perc, előnyösen pedig 0,1-5 °C/perc, különösen előnyösen 0,2-2 °C/perc, egészen különösen előnyösen 0,5-1 °C/perc sebességgel (-20)-(-60) °C, előnyösen (-35)-(-50) °C és egészen különösen (-38)-(-44) °C hőmérsékletre;

(e) a lehűtött keverék lökésszerű fagyasztása folyékony levegőben vagy folyékony nitrogénben; és (f) a mélyhűtött keverék tárolása -100 °C hőmérséklet alatt, előnyösen a folyékony nitrogén vagy folyékony levegő hőmérsékletén.

Ez az eljárás embriogén sejttenyészetek (szuszpenziós és kallusztenyészetek) hidegkonzerválására általában minden Graminae családból származó növényre alkalmazható. Magától értetődően tehát a Graminae fogalommal összefüggésben ezek a növények magukban foglalják mind a Bambusoidee (például Bamboo), Andropogonideae (például Saccharum, Sorghum és Zea), Arundineae (például Phragmites), Oryzoideae (például Oryza), Panicoideae (például Panicum és Setaria) alcsaládok növényeit, mind a Pooideae alcsalád növényeit (például a füveket, beleértve a Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus és Dactylis nemzetségek tagjait vagy a kismagvú gabonaféléket, beleértve az Avena, Triticum, Secale és Hordeum nemzetség tagjait), de nem csak ezekre korlátozódnak.

A Graminaen belül különösen előnyös célcsoportot képeznek a Pooideaenek közvetlenül fentebb felsorolt jellegzetes csoportjai, amelyeket füvek és a kismagvú gabonafélék fogalommal foglalhatunk össze.

A jelen találmány szerinti eljárás egyik tipikus kiviteli módjában először aktív, növekvő kallusz vagy aktív, növekvő szuszpenziós tenyészetsejtek (normális esetben 1-40 napos, előnyösen 2-10 napos tenyészetek a sorozattenyészet beindításától) megfelelő mennyiségét megfelelő folyékony tápközegben oldjuk. Megfelelő folyékony tápközeg lehet például az SH-O, SH-30 vagy SH-45 tápközeg, az OMS, KM-8p, RY-2 tápközeg, valamint mannit-, szacharóz- vagy más cukor- és cukoralkohol-oldatok, továbbá valamely aminosav (mint például prolin) oldata vagy akár egyszerűen a víz is, anélkül, hogy a találmányt csak ezekre korlátoznánk. Előnyös az olyan tápközeg, amely a sejtek növesztéséhez is alkalmas vagy a cukrok vagy cukoralkoholok vizes oldata. Tipikusan 1 ml folyékony tápközegben 0,01-0,1 g kalluszt diszpergálunk, és ezt hűtjük le azután jégen.

Megfelelő fagyasztási segédanyag elsősorban ozmotikusán aktív komponensek és DMSO (dimetilszulfoxid) keveréke vízben. Ezeket normális módon a (b) eljárási lépésben leírt, előhűtött diszperzióhoz való hozzáadás előtt jégen ugyancsak lehűtjük, bár ebben az esetben magasabb hőmérséklet is elfogadható egészen szobahőmérsékletig. A hűtési segédanyag oldatának hőmérséklete tehát nem kritikus.

Ezzel összefüggésben alkalmas például 0,5-2 mol/1 glicerin, 0,5-2 mol/1 prolin és 0,5-4 mol/1 dimetilszulfoxid vizes oldata (pH 5,6) vagy 0,5-2 mol/1 glicerin, 0,5-2 mol/1 szacharóz és 0,5-4 mol/1 dimetilszulfoxid vizes oldata (pH 5-7), anélkül, hogy eljárásunkat csak ezekre korlátoznánk. További alkalmas komponensek, amelyek a fagyasztásisegédanyag-oldatokban való alkalmazásra szóba jönnek, a cukrok, cukoralkoholok, aminosavak és polimerek, mint például PEG (polietilénglikol). Azokat az oldatokat, amelyek alkotórészként DMSO-t tartalmaznak, előnyösen minden felhasználás előtt frissen készítjük vagy mélyhűtve tároljuk. Más fagyasztásisegédanyag-oldatokat bizonyos körülmények között ugyan lehet a felhasználás előtt bizonyos idővel elkészíteni, de ebben az esetben is előnyösebbek a frissen készített vagy fagyasztott oldatok.

A fagyasztásisegédanyag-oldatot tipikusan 1 másodperc és 4 hét közti, előnyösen 1 másodperc és 1 nap közti és különösen előnyösen 1 másodperc és 1 óra közti

HU 220 186 Β időtartamon át adjuk ahhoz az oldathoz, amely a diszpergált szuszpenziós tenyészet sejtjeit vagy a diszpergált kalluszt tartalmazza. A sejteket megfelelő ideig jégen ezzel a fagyasztásisegédanyag-oldattal érintkeztetjük, előnyösen 1 perc és 2 nap, különösen előnyösen 5 10 perc és 6 óra, és egészen különösen előnyösen 30 perc és 2 óra közti időtartamon át. Ez alatt az idő alatt vagy ennek az időnek az elteltével a hidegkonzerváláshoz aliquotokat viszünk át megfelelő steril edénybe (csőbe) vagy más megfelelő tartályba és abban szó- 10 kásos módon jégen tároljuk.

Az edényt a nevezett aliquotok beleadása előtt felületileg folyadékfürdőbe meríthetjük, amelynek hőmérséklete 0 °C és 4 °C között van. Ez az eljárási lépés nem feltétlenül szükséges, de bizonyos esetekben elő- 15 nyös lehet. A fürdő etanolból vagy bármilyen más, alkalmas hűtőfolyadékból állhat. A fürdő normális esetben keverőszerkezettel van felszerelve, amely a hűtőközeg állandó átkeveréséról gondoskodik és egy olyan berendezéssel van összekötve, amely a hűtőközeg lehűté- 20 sét meghatározott, szabályozható sebességgel teszi lehetővé.

Mihelyt az edény a hűtőközegben van, a hőmérsékletet meghatározott, megfelelő sebességgel csökkentjük. A megfelelő lehűtési sebesség a 0,01-20 °C/perc 25 tartományban, előnyösen a 0,1-5 °C/perc közti tartományban, különösen előnyösen a 0,2-2 °C/perc közti tartományban, és egészen különösen előnyösen a 0,5-1 °C/perc közti tartományban mozoghat. Amikor a hőmérséklet nagyon alacsony értéket ér el, amely a 30 (-20)-(-60) °C, előnyösen a -35 °C és -50 °C, és egészen különösen előnyösen -38 °C és -44 °C közti tartományban fekszik, az edényt fagyasztási „sokk”nak vetjük alá, amennyiben például folyékony nitrogénbe vagy folyékony levegőbe merítjük. Az optimális ki- 35 indulási hőmérséklet a folyékony nitrogénbe vagy folyékony levegőbe való bemerítéshez változhat az alkalmazott tenyészetek függvényében, de általában a -20 °C és -50 °C értékek között van, és azoknak a szakembereknek a számára, akik ezen a területen járató- 40 sak, nagyon egyszerűen megállapítható. Az edényeket lehet azután folyékony nitrogénben vagy folyékony levegőben tárolni, mégpedig vagy a folyadékban magában vagy az e fölött található gőzfázisban, ahol a hőmérséklet a -100 °C-t nem haladja meg. 45

Némelyik tenyészetnél előnyös lehet az edény hőmérsékletét bizonyos időtartamon át változatlanul alacsony szinten tartani, ahelyett, hogy közvetlenül az optimális hőmérséklet elérése után az edényt folyékony nitrogénbe vagy folyékony levegőbe merítenénk. 50

Abból a célból, hogy ismét életképes sejttenyészeteket kapjunk, az edényeket a kalluszanyaggal a folyékony nitrogénből kivesszük, és előnyösen élénk rázatás közben meleg vizes fürdőbe merítjük, amíg az összes felolvad; a fürdő hőmérséklete 10 °C és 50 °C, előnyö- 55 sen 35 °C és 40 °C között van. Meglepő módon ennek a találmánynak a keretében kimutatjuk, hogy az edények, amelyek a Pooideae alcsaládba való növények hidegkonzervált sejtjeit tartalmazzák, egyszerűen szobahőmérsékletű levegőn való állással olvaszthatok, amíg az 60 összes jég felolvad. Az edényeket végül 1 másodperc és 60 perc, előnyösen 1 és 10 perc közti időtartamon át jégen hagyhatjuk, mielőtt a benne található kalluszanyagot megfelelő tenyésztőközegbe átvinnénk.

Az edények tartalmát megfelelő szilárd tápközegre szélesztjük. Tipikusan 0,5 ml felolvasztott tenyészetet adunk egy 10 cm átmérőjű Petri-csészébe, amely 30-50 ml tenyésztőközeget tartalmaz. A szilárd tápközeget vagy ferde tenyészetként öntjük ki vagy pedig a kerületén kiüregezzük, hogy az adott esetben még megmaradó fagyasztási segédanyagok lefolyását a sejtektől biztosítsuk. A sejteket a megfelelő tápközegre való szélesztés előtt folyékony tápközeggel vagy bármilyen más alkalmas oldattal, például cukor- vagy cukoralkohol-oldattal vagy aminosavoldattal egyszer vagy többször moshatjuk.

A Petri-csészéket, amint ezt korábban az embriogén kallusznál leírtuk, 27 °C hőmérsékleten sötétben inkubáljuk. A kalluszt azután, akárcsak a normál embriogén kalluszt, a jelen leírás szerint továbbtenyésztjük.

B) eljárási lépés. Olyan protoplasztok izolálása és tisztítása, amelyek teljes növényekké, ezen belül teljes termő növényekké regenerálhatok

Az A) lépésben kapott embriogén szuszpenziós tenyészetekből kiindulva protoplasztokat kapunk. A protoplasztok izolálása és tisztítása olyan módon mehet végbe, hogy először a szuszpenziós tenyésztőközegből embriogén sejtcsomókat izolálunk például egy A) eljárási lépés szerint kapott szuszpenziós tenyészet átszűrésével Nalgene-szűrőegységen (0,2 pm), és az így létrejött sejtcsomót végül megfelelő enzimoldattal inkubáljuk, amely képes a sejtfalat a protoplasztok károsodása nélkül eltávolítani. Az enzimet szűrőn sterilezett oldat formájában alkalmazzuk. Az összes manipulációt, amely a sejt- vagy más tenyészettel kapcsolatban áll, steril körülmények között és steril anyagok alkalmazásával végezzük. Alkalmas enzimoldat lehet például az alábbi összetételű oldat:

Enzimoldat:

Celluláz RS CaCl₂.H₂O NaH₂PO₄.H₂O MES (pH 5-7)

Glükóz (végkoncentráció)

2% (tömeg/térfogat) 7 mmol/1 0,7 mmol/1 3,0 mmol/1 550 mOs/kg H₂O

Normálisan ezt a keveréket rázógépen, 50 fordulat/perc forgási sebességnél és gyenge megvilágítás (5 pE/m²s) mellett óvatosan mozgatjuk, anélkül, hogy ez kritikus lenne. Az emésztést 0 °C és 50 °C között, előnyösen 10 °C és 35 °C között, és egészen különösen előnyösen 26 °C és 32 °C között végezzük, amíg a protoplasztok szabaddá nem válnak. Az emésztéshez szükséges idő tipikus módon néhány másodperc és 2 nap, előnyösen 1 óra és 1 nap, és egészen különösen előnyösen 3 és 5 óra között van.

A szabaddá vált protoplasztokat standard eljárások, például szűrés, centrifugálás és kimosás segítségével összegyűjtjük és tisztítjuk. Bizonyos esetekben további tisztítási lépést is be lehet iktatni. A protoplasztokat megfelelő tápközeg felületére visszük fel, ilyen tápközeg lehet például a KM-8p tenyésztőközeg, amelyet

HU 220 186 Β

700 mOs/kg H₂O ozmotikus értékre állítunk be, vagy más alkalmas közeg, például az, amelyet George és munkatársai írtak le (1987).

g-nél végzett 10 perces centrifugálás után a protoplasztokat, amelyeket a határfelületi tartományban találunk, összegyűjtjük. Végül a protoplasztokat azonos tenyésztő tápközegben újraszuszpendálhatjuk és például acélszitán (20 pm lyukszélesség) átszűrhetjük.

E nélkül a pótlólagos tisztítási lépés nélkül a protoplaszt-előkészítési anyag szennyezése teljes, nem emésztett sejtekkel az összes sejtszám 0,001-0,01% közti tartományban van. Ezt az értéket a fentebb leírt tisztítási lépéssel nem lehet tovább csökkenteni. Ez a pótlólagos tisztítási lépés azonban jelentős veszteséghez vezet azokból a protoplasztokból, amelyek nagyon sűrű citoplazmával bírnak. Ez ahhoz vezet, hogy a szélesztési hatékonyság akár tízszer kisebb is lehet, amikor az eljárás a nevezett tisztítási lépést is magában foglalja. A protoplasztokat tehát más ismert eljárásokkal tisztítjuk, például a fentebb leírt flotálással szacharózoldaton vagy más, nagy sűrűségű pufferoldaton, például Percoll-oldaton.

A protoplasztkitermelés és ennek következtében a szélesztési hatékonyság akkor éri el az optimális értéket, amikor a szuszpenziós tenyészethez, amelyet a protoplasztizoláláshoz alkalmazunk, 1-30 nappal, előnyösen 5-10 nappal a protoplasztizolálás előtt készítünk sorozattenyészetet.

Az előbb fentebb bemutatott enzimoldat a Lu és munkatársai (1981) által leírt enzimkeverék módosítása, amely minden más kipróbált enzimoldatnál hatásosabb, és 40 · 10⁶-70 · 10⁶ protoplaszt/gramm friss tömeg hozamot eredményez. Egy másik megoldás szerint lehet 2% (tömeg/térfogat) Cellulase RS-t is alkalmazni KM-8p tápközegben vagy más tetszés szerinti tápközegben, például abban a tápközegben, amelyet George és munkatársai írtak le (1987), hogy figyelemreméltó protoplasztkitermelést érjünk el. Ozmotikumként glükóz alkalmazása egyenértékűnek bizonyul a szacharózos protoplasztizolálással, és mannitnál bizonyos mértékig meg is haladja a kitermelést és később hatással van a szélesztési hatékonyságra. További ismert és megfelelő enzimkeverékeket is lehet a találmány szerinti eljárásban alkalmazni.

A szűrés, vagyis például 20 pm-es szitán való átnyomás után kapott protoplasztok - ahol az átlagos lyukszélesség 12 pm és 15 pm átmérő között van - optikailag sűrű citoplazmát mutatnak.

A jelen találmány tehát eljárással is foglalkozik olyan protoplasztok előállítására, amelyek teljes növénnyé, elsősorban teljes termő növénnyé képesek regenerálódni, amely növények a pázsitfűféle növények Pooideae alcsaládjából erednek. Ezt az eljárást az alábbi eljárási lépések jellemzik:

(a) szövet izolálása a Pooideae alcsaládba tartozó pázsitfűféle növény megfelelő részéből, elsősorban fiatal, belül fekvő levelek alapmetszetéből, éretlen szexuális embriókból, éretlen virágzatból, érett magokból vagy csíraszövetekből, egészen különösen előnyösen pedig a legfiatalabb és legbelül fekvő levelekből;

(b) ezeknek a szöveteknek a tenyésztése, hogy embriogén kallusz és embriók képződését indukálhassuk;

(c) az embriogén kallusz és az embriók másodlagos tenyészetének átvitele időnként friss tápközegbe, amely lehetővé teszi a folytonos burjánzást;

(d) embriogén sejtcsomók izolálása 0-500, előnyösen 0-100, és egészen különösen előnyösen 3-50 átvitel (transzfer) után; és (e) a sejtfalak eltávolítása megfelelő enzimkeverékkel, és az így létrejött protoplasztok izolálása és tisztítása.

A jelen találmány további tárgyai a Pooideae alcsaládba való pázsitfűféle növények protoplasztjai (beleértve a sejtfal regenerálása után kapott növényi sejteket is), amelyek teljes növénnyé, elsősorban teljes termő növénnyé képesek regenerálódni. Előnyösen azok a protoplasztok vagy sejtek, amelyeket vagy sejttenyészetekből vagy embriogén sejtszuszpenziókból nyerünk.

Ugyancsak idetartoznak azok a Pooideae alcsaládba tartozó pázsitfűféle növények, elsősorban termő pázsitfűféle növények és szaporítóanyagaik, amelyek a nevezett protoplasztokból vagy nevezett növényi sejtekből regenerálódtak.

C) eljárási lépés. Protoplaszttenyészetek kialakítása és kallusz felhasználása, amely teljes növénnyé és teljes termő növénnyé képes regenerálódni

A B) eljárási lépésből kapott tisztított protoplasztokat megfelelő folyékony tápközegbe visszük vagy megfelelő szilárd tápközegre szélesztjük, függetlenül attól, vajon a nevezett protoplaszt volt-e exogén DNS-sel kezelve vagy sem. (A kezelést exogép DNS-sel egy későbbi fejezetben részletesen leítjuk.) Megfelelő tápközegen ennek a találmánynak a keretében olyan tápközegeket értünk, amelyek a KM-8p, RY-2 (Potrykus és munkatársai, 1979), SH-30 vagy SH-45 tápközegekre alapozódnak, és megfelelő koncentrációban cukrot és növényi növekedésszabályozókat tartalmaznak. Az előnyös tápközegek a KM-8p és SH-45 tápközeggel, amelyek megfelelő szilárdítóközeget tartalmaznak. Az előnyös szilárdítóközeg az agaróz, elsősorban a Sea Plaque Agarose (FMC Corp. Maríné Colloids Division, P.O.Box, Rockland, ME 04841, USA). A Sea Plaque Agarose alkalmazásánál ennek koncentrációja 0,1% és 2,5% (tömeg/térfogat) között lehet, előnyösen 0,6% és 1,5% (tömeg/térfogat) között.

A protoplaszt szélesztését agaróztartalmú tápközegre analóg módon lehet elvégezni, mint a Shillito és munkatársai (1983), az EP-0,129,688 számú európai szabadalmi bejelentés (Shillito és munkatársai) vagy Adams és munkatársai (1983) által leírt eljárásokat. Ezeket a publikációkat referenciaként ennek a találmánynak a részeként tekintjük.

A tápközegek, amelyekben a protoplasztokat tenyésztjük, további megfelelő alkotórészeket tartalmazhatnak, amelyek a protoplasztok telepképzését és osztódását segítik elő. Ezek közé az anyagok közé tartoznak például a 2,4-D, a Dicamba, a Picloram vagy más növényi növekedésszabályozók. A megfelelő növényi növe9

HU 220 186 Β kedésszabályozók ismertek azok számára, akik ezen a szakterületen járatosak.

Ezeknek az anyagoknak a koncentrációja szokásos módon 0,01 mg/liter és 100 mg/liter közti tartományban van.

A szalicilsav és származékai képesek elősegíteni a Pooideae protoplasztok sejtosztódását és telepképzését. A szalicilsav származékai közé tartoznak (anélkül, hogy eljárásunkat csak ezekre korlátoznánk) az O-acilés O-arilszármazékok. Az O-acilszármazékok közé számítanak (anélkül, hogy eljárásunkat csak ezekre korlátoznánk) a kis szénatomszámú, például 1-7 szénatomszámú, előnyösen 1-4 szénatomszámú, egész különösen előnyösen 2-3 szénatomszámú acilcsoportok. Az O-arilszármazékokon a jelen bejelentés keretében 5 vagy 6 tagú gyűrűket értünk, amelyek egymással fuzionálva lehetnek, de lehetnek nem fuzionáltak is (anélkül, hogy eljárásunkat csak ezekre korlátoznánk). A gyűrűk lehetnek szubsztituálatlanok, vagy lehetnek egy vagy több csoporttal szubsztituálva, ideértve szubsztituensként az 1-5 szénatomos alkil-, 1-4 szénatomos alkoxi-, nitro- és aminocsoportokat, ahol az aminocsoport maga is lehet 1-4 szénatomos alkilcsoporttal helyettesítve, valamint a halogénatomokat, elsősorban a klór- és brómatomot.

A szalicilsav származékai közé értjük a karbonsavésztereket is. Előnyös karbonsav-észterek az aril- és alkil-észterek, ahol az alkilcsoport 1 -4 szénatomos.

A szalicilsavszármazékok közé értjük azokat a vegyületeket is, amelyekben a szalicilsav gyűrűje tovább van szubsztituálva például egy vagy több csoporttal, amelyek között megemlítjük az 1 -4 szénatomos alkilcsoportot, halogénatomot (elsősorban a klór- és brómatomot), nitro- és aminocsoportot, valamint azokat az aminocsoportokat, amelyek maguk is 1 -4 szénatomos alkilcsoporttal vannak helyettesítve.

Előnyös vegyületek, amelyek elősegítik a Pooideae protoplasztok és sejtek osztódását, például az alábbiak:

O-acetoxi-benzoesav (aszpirin, acetil-szalicilsav);

O-hidroxi-benzoesav (szalicilsav);

O-metoxi-benzoesav (metil-szalicilsav);

O-dimetoxi-karbamoil-benzoesav.

A szalicilsavnak vagy valamely származékának a koncentrációja a tápközegben előnyösen 0,1 mg/liter és 3000 mg/liter, előnyösen 10 mg/liter és 300 mg/liter között van, és egészen különösen előnyösen 100 mg/liter.

A tápközeg, amelyben a protoplasztokat tenyésztjük, kiegészítésként tartalmazhat még olyan tápközeget, amely előzőleg megfelelő sejtek, például Zea maysból, Dactylis glomerataból vagy más pázsitfűfélékből származó sejtek növesztése révén lett kondicionálva. Előnyösen az olyan tápközeg, amelyben valamely pázsitfűféle embriogén szuszpenziója volt tenyésztve. Egészen különösen előnyös az a tápközeg, amelyben Dactylis glomerata embriogén szuszpenziója volt tenyésztve. A fentebb leírt módon kondicionált tápközeg 0-100% (térfogat/térfogat), előnyösen 5-50% (térfogat/térfogat) és egészen különösen előnyösen 30-40% (térfogat/térfogat) részt képezhet a teljes tápközegben.

A protoplasztokat szilárd vagy folyékony tápközegben 12 hétig teijedő, előnyösen 6 hétig teijedő és különösen előnyösen 1-3 hétig teijedő időtartamon át tenyésztjük anélkül, hogy időközönként átoltott tenyészeteket készítenénk. A jelen találmány egy különösen előnyös kiviteli formájában a szilárd tápközeget folyékony tápközegbe vezethetjük be, amint ez az EP-0,129,688 számú európai szabadalmi bejelentésben (Shillito és munkatársai) le van írva, vagy valamilyen más alkalmas módon kezelhetjük, hogy a protoplasztok sejtosztódását és/vagy telepképződését elősegítsük.

A protoplasztokat fényben vagy pedig előnyösen sötétben tenyésztjük 0 °C és 50 °C, előnyösen 20 °C és 32 °C és egészen különösen előnyösen 25 °C és 28 °C közti hőmérsékleten. A fényintenzitás tipikusan 0,1 pE/rrPs és 200 pE/m²s, előnyösen pedig 30 pE/m²s és 90 pE/m²s között van.

A szélesztési hatékonyság a KM-8p tápközegek alkalmazásánál 0,5% és 10% között ingadozik a protoplasztkészítés minőségétől függően. 30-40% (térfogat/térfogat) kondicionált szuszpenziós tenyésztő tápközeg (szuszpenziós tápközeg, amely a benne levő sejtek növesztésével van kondicionálva, és 550 mOsm/kg ozmotikus értékre van beállítva glükóz hozzáadásával) hozzáadása a protoplaszttenyésztő tápközeghez ugyan nem vezet jelentős növekedéshez a szélesztési hatékonyságban, de gyorsítja a fiatal, protoplasztokból származó telepek osztódási folyamatát.

A jelen találmány egyik előnyös kiviteli formájában a protoplasztokat agarózzal szilárdított tápközegre szélesztjük. Az első sejtosztódásokat mintegy 2 nappal a protoplasztok szélesztése után figyelhetjük meg. További osztódások alakulnak ki minden 2-3. napon. Ez az osztódási folyamat nem szinkronizálva folyik, ami azzal a ténnyel járhat, hogy az első sejtosztódás csak 7 nap után jelentkezik. 5-20 nappal, előnyösen 10-14 nappal a szélesztés után az agarózzal szilárdított tápközeget szegmensekbe vágjuk, és azokat a szegmenseket, amelyek a sejttelepeket tartalmazzák, folyékony tápközegbe visszük át. Ez az eljárás „bead culture technique” néven általánosan ismert, és ez Shillito és munkatársainál (1983), valamint az EP-0,129,688 számú európai szabadalmi bejelentésben (Shillito és munkatársai) teljes mértékben le van írva.

Ahelyett, hogy a szilárd tápközeget feldarabolnánk, ezt el is folyósíthatjuk, és ebben a folyékony formában vihetjük a folyékony tápközegbe. Ezt a módosítást Adams és munkatársai (1983) írták le, és ezzel analóg módon hajthatjuk végre. Mindkét esetben (feldarabolás vagy elfolyósítás) a glükózt és szacharózt tartalmazó KM-8p tápközeget alkalmazhatjuk, amelynél jó telepnövekedést figyelhetünk meg. Az optimális folyadékkomponens a telepnövekedés szempontjából mégis 4 g/liter kazeinhidrolizátumot tartalmazó SH-45 tápközegből áll. 2-3 héten belül a „bead” tenyészet ráhelyezésétől számítva a lemezeken belül új szuszpenziós tenyészetek ismerhetők fel. Az agarózkorongok mikroszkópos megfigyeléséből kitűnik, hogy normális módon a felülettől legtávolabb fekvő telepek nőnek ki, és kisebb sejtmennyiségek válnak szabaddá a tápközegben,

HU 220 186 Β miközben a többi telepek továbbra is szilárdan rögzítve maradnak az agarózban. Az új szuszpenzió nagyon gyorsan sokszorozódik, és további két hét múlva ezeket azonos módon, mint a szuszpenziós tenyészeteket visszük át, vagy pedig SH-30 tenyészetbe szélesztjük kallusz kifejlesztésére. Egy másik kiviteli formában az agarózt olyan Petri-csészében oszlatjuk el, amely agarózzal szilárdított SH-45 tápközeget tartalmaz, és így tenyésztjük tovább.

A jelen találmány tehát eljárással is foglalkozik sejttenyészetek (szuszpenziós és kallusztenyészetek) előállítására Pooideae alcsaládba való pázsitfűféle növények protoplasztjaiból, amely sejttenyészetek képesek teljes növénnyé, elsősorban pedig teljes termő növénnyé regenerálódni. Ezt az eljárást az alábbi eljárási lépések jellemzik:

(a) protoplasztok, amelyek a Pooideae alcsaládba való pázsitfűfélékből származnak, és amelyek képesek teljes növényekké regenerálódni, tenyésztése megfelelő tenyészközegben sejttelepek képződéséig;

(b) a nevezett sejttelepeknek vagy -részeinek tenyésztése megfelelő tápközegen, amely a sejttenyészetek képződését szolgálja; és (c) az így létrejövő sejttenyészetek izolálása.

A (b) lépés nem feltétlenül szükséges. Ugyanúgy lehetséges a protoplasztokat az (a) lépésben meghatározott tápközegben hagyni, amíg a sejttenyészetek vagy embriók képződnek.

Ugyancsak idetartoznak azok a Pooideae alcsaládba való pázsitfűféle növények, különösen pedig termő pázsitfűféle növények és azok szaporítóanyagai, amelyek a nevezett sejttenyészetekből vannak regenerálva.

A jelen találmány előnyös tárgyai közé tartoznak a protoplasztok szélesztése agarózzal szilárdított tápközegre, az agarózzal szilárdított tápközegek elfolyósítása vagy szétdarabolása, az elfolyósított vagy szétdarabolt tápközegek átvitele folyékony tápközegbe és a tenyésztés sejttelepek képződéséig.

Előnyös az olyan eljárás, ahol a sejttelepek (b) eljárási lépésben említett részei olyan sejtekből vagy sejttömegekből származnak, amelyek a folyékony tápközegből válnak szabaddá.

Az ezekben és más eljárási lépésekben előállított kallusz- és szuszpenziós tenyészeteket az A) eljárási lépésben leírt eljáráshoz analóg módon lehet hidegben konzerválni.

D) eljárási lépés. Fiatal növények regenerálása kalluszból

A kalluszból, amelyet protoplasztokból nyertünk [C) eljárási lépés], különösen ha ez morzsalékos, szemcsés kallusz, egyszer vagy többször, előnyösen minden második héten átoltott tenyészetet készítünk megfelelő friss tápközegre, hogy ezen a módon embrióképződést indukáljunk. Megfelelő indukáló tápközeg például az SH tápközeg megfelelő koncentrációjú cukorral és növényi növekedésszabályozóval.

Minden ilyen módon képzett embriót azután olyan tápközegre viszünk át, amelynek megfelelő feltételeket nyújt az érés és csírázás indukciójához. Megfelelő tápközeg például az SH-30 vagy az OMS tápközeg, amelyek olyan módon vannak módosítva, hogy megfelelő koncentrációban tartalmazzanak cukrokat és növényi növekedésszabályozókat. A lemezek tenyésztése fényben történyik [10 pE/m²s és 200 pE/m²s között; hideg, fehér fény fluoreszkáló lámpából vagy nappali fény és Gro-Lux (Sylvania) fluoreszcens lámpa fényének keveréke]. Magától értetődik, hogy tetszés szerint másfajta fluoreszcens fényt is alkalmazhatunk. A szélesztés után 2-5 héttel figyelhetjük meg az első embriókat. Némely esetben egy vagy több átvitel friss tápközegre az embriók érleléséhez előnyös lehet. Az embriók továbbfejlődnek, és megfelelő idő múlva, tipikusan 1 hét és 6 hónap közti idő, elsősorban pedig 1-3 hónap közti idő múlva fiatal növénykék képződnek.

Egy másik kiviteli formában a protoplasztokból nyert kalluszból [C) eljárási lépés], elsősorban amikor ez morzsalékos, szemcsés kallusz, egyszer vagy többször, előnyösen minden második héten megfelelő friss tápközegre átoltott tenyészetet képzünk, hogy ezen a módon indukáljuk az embriók képződését és érését. Ilyen célra alkalmas tápközeg például (anélkül, hogy eljárásunkat csak erre korlátoznánk) az OMS tápközeg, amely megfelelő koncentrációban tartalmaz cukrokat, de nem tartalmaz növényi növekedésszabályozókat. A lemezek tenyésztését fényben végezzük [10 pE/m²s és 200 pE/m²s közti tartomány; hideg, fehér fény fluoreszkáló lámpából vagy nappali fény és Gro-Lux (Sylvania) fluoreszcens lámpa fényének keveréke vagy bármilyen más, tetszés szerinti, megfelelő fluoreszcens lámpa fénye]. Az embriók tovább fejlődnek, és megfelelő idő múlva, tipikusan 1 hét és 6 hónap közti idő, elsősorban 1 és 3 hónap közti idő múlva fiatal növénykék képződnek.

E) eljárási lépés. Növények, előnyösen termő növények előállítása fiatal növénykékből

Az előző D) eljárási lépésben kapott fiatal növénykéket megfelelő tápközegre visszük át, például olyan SH-O tápközegre vagy OMS tápközegre, amely nem tartalmaz növekedésszabályozókat. Egy másik eljárás szerint lehet olyan növekedésszabályozót hozzáadni, amely a gyökerek vagy szárak növekedését stimulálja. A megfelelő növekedésszabályozókat ismerik azok, akik ezen a szakterületen jártasak. A fiatal növénykéket addig tenyésztjük ezen a tápközegen, amíg gyökerek képződnek. Fontos, hogy a fiatal növénykékből minden kallusz eltávolítódjék, mivel kimutatták, hogy ezek a kalluszok a növények növekedését negatívan befolyásolják. Abból a célból, hogy ezt eléijük, a növényeket például az átvitelek során desztillált vízzel átöblítjük. Azokat a kalluszokat, amelyek utólagosan képződnek, szabályos időközönként, előnyösen 3-30 naponként, különösen előnyösen 1-2 hetenként el kell távolítani. Az időtartam, amely a gyökérképződéshez szükséges, tipikusan 1-4 hét között van, elsősorban 2 hét. Azokat a növénykéket, amelyek jól fejlett gyökérrendszerrel bírnak, át lehet ültetni földbe és melegházba vinni, ahol ez lassanként megedződik. Ezzel összefüggésben elegendőnek tekinthetjük az 1 és 10 cm közti, elsősorban a 2 és 5 cm közti gyökérhossz11

HU 220 186 Β tartományt. Egy másik módszer szerint a növénykéket minden újabb átoltott tenyészetbe átvive meghatározatlan ideig in vitro tenyésztjük tovább, amelynek során a sarjhajtásokat egymástól elválasztjuk, és a növénykéket friss tápközegre, például SH-0 vagy OMS tápközegre visszük át,

A jelen találmány szerinti eljárást tehát a Pooideae alcsaládba való teljes pázsitfűféle növényekké, elsősorban teljes termő pázsitfűféle növényekké való regeneráláshoz az alábbi eljárási lépések jellemzik :

(a) olyan kallusz, amely Pooideae alcsaládba való pázsitfűféle növényekből származik, amelyet protoplasztokból kaptunk, és amely teljes növénnyé képes regenerálódni, tenyésztése embriók keletkezéséig olyan tápközegen, amely embriók képződésének indukálását teszi lehetővé;

(b) az embriók tenyésztése olyan tápközegen, amely alkalmas a nevezett embriók érésének és csírázásának indukálására; és (c) a keletkezett növénykék tenyésztése olyan stádiumig, amelyben ezek földbe ültethetők át és teljes növénnyé érlelhetők.

A virágképződést vagy a Heide (1987) által leírt eljárással vagy más, alkalmas, tetszés szerinti eljárással lehet indukálni, amely mindig az alkalmazott faj vagy változat igényeit elégíti ki. A Pooideae alcsaládnál a virágzás indukálására szolgáló eljárás ismert.

Az ezekből a növényekből előállított magokat megfelelő kezeléssel lehet csírázásra rábírni és/vagy cserépbe ültetni vagy pedig sterilezni, majd Murashige és Skoog tápközegre, amely nem tartalmaz növekedésszabályozókat (OMS tápközeg) és 0,8% ágánál, agarózzal, GelRite-vel vagy bármely más, alkalmas, kocsonyásítószerrel szilárdítva van, széleszteni. A magokat lehet olyan tápközegbe is ültetni, amelyek 10 pg/ml és 1000 pg/ml közti mennyiségben higromicin B-t tartalmaznak, ennek segítségével lehet a higromicinrezisztencia átörökítését bizonyítani.

A találmány szerinti eljárás Pooideae alcsaládba való termő pázsitfűféle növények regenerálására kalluszból tehát az alábbi eljárási lépéseket tartalmazza:

(a) olyan kallusz, amely Pooideae alcsaládba való pázsitfűféle növényekből származik, amelyet protoplasztokból kaptunk, és amely teljes növénnyé képes regenerálódni, tenyésztése embriók keletkezéséig olyan tápközegen, amely embriók képződésének indukálását teszi lehetővé;

(b) az embriók tenyésztése olyan tápközegen, amely alkalmas a nevezett embriók érésének és csírázásának indukálására;

(c) a keletkezett növénykék tenyésztése olyan stádiumig, amelyben ezek földbe ültethetők át és teljes növénnyé érlelhetők; és (d) magok nyerése szabályozott vagy szabad beporzás következményeként.

A jelen találmány további tárgyai közé tartoznak azok a Pooideae alcsaládba való pázsitfűféle növények, elsősorban termő pázsitfűféle növények és szaporítóanyagok, amelyek a nevezett kalluszból vannak regenerálva.

F) eljárási lépés. Protoplasztok kezelése exogén DNS-sel

A Pooideae protoplasztokat lehet exogén DNS-sel kezelni, ahol olyan sejtek keletkeznek, amelyek az exogén DNS egészét vagy egy részét stabilan integrálva tartalmazzák genomjukban. Exogén DNS-en a jelen találmány keretében érthetünk minden olyan DNS-t, amely a protoplasztokhoz hozzáilleszthető. A nevezett DNS lehet vagy homológ vagy pedig heterológ a transzformált növény vonatkozásában. Az exogén DNS tartalmazhat olyan promotort, amely a Graminae családból való növényekben, elsősorban a Pooideae alcsaládba való növényekben aktív, vagy pedig alkalmazhatunk olyan promotort, amely a növény genomjában jelen van. Az exogén DNS ezenkívül tartalmazhat egy vagy több olyan gént, amely a létrejövő sejt vagy a belőle regenerált növény genotípusát, különösen pedig fenotípusát megváltoztatja. Kívánatos azonban, hogy a génszekvencia, amely egy vagy pedig több kívánt fehérje jellegű terméket kódol, kifejeződjék, és egy vagy több funkcionális enzimet vagy polipeptidet termeljen az így létrejött sejtben, illetve növényben. Az exogén DNS lehet egy kiméra gén vagy pedig annak egy része.

Exogén DNS-en a jelen találmány keretében definíció szerint olyan nem kódoló DNS-t is érthetünk, amely szabályozószereppel bír, például olyan, amely az átírás szabályozásában játszik szerepet.

A protoplasztok kezelését exogén DNS-sel az alábbi közleményekben leírt eljárások valamelyikével hajthatjuk végre: Paszkovski és munkatársai (1984); EP-0,164,575 számú európai szabadalmi bejelentés (Paszkovski és munkatársai); Shillito és munkatársai (1985); Potrykus és munkatársai (1985); Loerz és munkatársai (1985); Fromm és munkatársai (1986); GB-2,140,822 számú brit szabadalmi bejelentés (Mettler); és Negrutiu és munkatársai (1987). Ezek a közlemények a jelen találmány keretébe referenciaként vannak beépítve.

Az exogén DNS-t be lehet vinni más, tetszés szerinti formában is a protoplasztokba, például tisztán lineáris vagy kör alakú DNS-ként, liposzómába kapszulázva, szferoplasztokban, más protoplasztok alkotórészeként, sókkal komplexben stb. Az idegen DNS felvételét lehet bármilyen, tetszés szerinti, alkalmas és ismert eljárás segítségével stimulálni, elsősorban azokkal az eljárásokkal, amelyek a fentebb felsorolt közleményekben le vannak írva.

A jelen találmány keretében előnyösek azok a kiméra gének, amelyek a transzformált protoplasztoknak, valamint a kifejlesztett szöveteknek és különösen a növényeknek előnyös tulajdonságokat kölcsönöznek, például megnövekedett rezisztenciát patogének ellen (például fitopatogén gombák, baktériumok, vírusok ellen); rezisztenciát kémiai anyagokkal szemben [például herbicidekkel (például triazinok, szulfonil-karbamidok, imidazolinok, triazol-pirimidinek, Bialaphos, Glyphosate stb.), inszekticidekkel és más biocidekkel szemben]; rezisztenciát káros (endafikus vagy légköri) környezeti befolyások ellen (például hőség, hideg, szél, kedvezőtlen talajviszonyok, nedvesség, szárazság stb.); vagy pedig a tartalék- és tárolóanyagok megemelt kép12

HU 220 186 Β ződéséhez vezetnek a levelekben, magokban, gumókban, gyökerekben, szárakban stb. A kívánt anyagok közé, amelyeket a transzgén növényt termelni képesek, számíthatjuk például a fehérjéket, keményítőket, cukrokat, aminosavakat, alkaloidokat, illatanyagokat, színanyagokat, zsírokat stb.

Citotoxinok elleni ellenállás érhető el például egy gén átvitele révén; ez a növényi sejtekben való kifejeződéshez egy enzimet bocsát rendelkezésre, amely a citotoxint detoxikálja; ilyenek például a neomicin-foszfotranszferáz II. típus vagy az amino-glikozid-foszfotranszferáz IV. típus, amelyek a kanamicin, higromicin és más amino-glükozid antibiotikumok detoxikálását segítik elő vagy a glutation-S-transzferáz, citokrómP-450 vagy más katabolikusan ható enzimek, amelyekről ismert, hogy a triazint, szulfonil-karbamidot és más herbicideket detoxikálják. Citotoxinok elleni rezisztenciát lehet közvetíteni olyan gén segítségével is, amely valamely növényben „célenzim” (a citotoxinhatás támadáspontja) megfelelő formáját fejezi ki, amely ellenálló a citotoxin aktivitásával szemben; ilyen például az acetohidroxisav-szintáz egyik változata, amely érzéketlen a szulfonil-karbamidok, imidazolinonok vagy más herbicidek, amelyek ezzel a speciális anyagcserelépéssel kölcsönhatásban vannak, gátlóhatásával szemben; vagy az EPSP-szintáz egyik változata, amely a Glyphosate gátlóhatásával szemben érzéketlennek mutatkozik. Előnyösnek bizonyulhat ezeket a megváltozott célenzimeket olyan formában kifejezni, hogy szállításuk a korrekt sejtrekeszbe, például a fenti esetben a kloroplasztokba lehetséges legyen.

Meghatározott esetekben előnyös lehet a géntermékeket a mitokondriumba, a vakuolumokba, az endoplazmatikus retikulumba vagy más sejtterületekbe, lehetőleg pedig a sejt közötti térbe (apoplasztok) irányítani.

Rezisztenciát lehet például bizonyos gombafajok ellen elérni olyan gén „bezsilipelés”-ével, amely kitinázt fejez ki a növényi szövetben. Számos növénypatogén gomba tartalmaz kitint integrális alkotórészként hífaés spóraszerkezetében, például Basidiomycetes (üszöggombák és rozsdagombák), Ascomycetes és Fungi imperfecti gombák (ideértve az Altemaria, Bipoláris, Exerophilum turcicum, Collectotricum, Gleocercospora és Cercospora gombákat). A kitináz képes bizonyos patogének micéliumnövekedését in vitro gátolni. Egy olyan növényi levél vagy gyökér, amely kitinázt fejez ki konstitutíven vagy pedig válaszként egy patogén behatolására, nagyszámú különböző gomba támadása ellen van védve. Bizonyos helyzetekben a konstitutív kifejeződés előnyös lehet az indukálható kifejeződéssel összehasonlítva, amely számos növénynél fellép természetes reakcióként patogén betegségeknél, mivel a kitináz itt közvetlenül nagy koncentrációban mutatkozik, anélkül, hogy előbb ki kellene várni az új szintézishez szolgáló log-fázist.

Rovarok elleni rezisztenciát lehet például átvinni egy polipeptidet kódoló gén segítségével, amely polipeptid toxikus rovarokra és lárváikra; ilyen például a Bacillus thuringiensis kristályos fehéijéje [Barton és munkatársai (1987); Valch és munkatársai (1987)]. A fehéij éknek egy másik osztálya, amely rovarrezisztenciát közvetít, a proteázinhibitorok. A proteázinhibitorok a növényi tárolószerkezetek szokásos alkotórészét képezik (Ryan, 1973). Be lehetett bizonyítani, hogy egy szójababból izolált és tisztított Bowman-Birk proteázinhibitor gátolja a Tenebrio lárvák bélproteázát [Birk és munkatársai (1963)]. A gént, amely a tehénborsóból származó tripszininhibitort kódolja, Hilder és munkatársai írták le (1987).

Egy olyan gént, amely proteázinhibitort kódol, alkalmas vektorban növényi promotor, elsősorban konstitutív promotor, mint például CaMV 35S promotor [amelyet Odell és munkatársai írtak le (1985)] szabályozása alatt lehet működtetni. Bizonyos géneket, például a szójababból származó Bowman-Birk proteázinhibitor kódolószekvenciáját a Hammond és munkatársai (1984) által leírt cDNS-klónozási módszerrel kaphatunk meg. További lehetőség proteázinhibitor előállítására ennek szintetikus előállításából áll, amennyiben ez 100-nál kevesebb aminosavból áll, mint például a Lima-bab tripszininhibitoránál. A kódolószekvenciát az aminosavszekvencia visszafordításával jósolhatjuk meg. Utólag mindkét végnél restrikciós hasítási helyet építünk be, amely a mindenkori kívánt vektor számára alkalmas. A szintetikus gént 30-60 bázispáros átfedő oligonukleotid-fragmentumok szintézisével állítjuk elő, ahol ezeket később kinázreakciónak vetjük alá, majd egymással összekapcsoljuk (Maniatis és munkatársai, 1982), végül megfelelő vektorba klónozzuk. DNS-szekvenciaelemzés segítségével lehet azután azonosítani azt a kiónt, amely a beiktatást megfelelő orientációban tartalmazza. A protoplasztba való bezsilipeléshez izolált plazmid-DNS-t alkalmazunk (Ábel és munkatársai, 1986).

Ugyancsak a jelen találmány tárgyai közé tartoznak azok a gének, amelyek gyógyászatilag aktív alkotórészeket kódolnak, például alkaloidokat, szteroidokat, hormonokat és más, fiziológiailag aktív anyagokat, valamint flavinokat, vitaminokat és színanyagokat. Azok közé a gének közé, amelyek a jelen találmány keretében számba jönnek, tartoznak (anélkül, hogy találmányunkat csak ezekre korlátoznánk) a növényspecifikus gének, például a zein gén (Wienand és munkatársai, 1981), az emlősspecifikus gének, mint például az inzulin gén, a szomatosztatin gén, az interleukin gén, a t-PA gén (Pennica és munkatársai, 1983) stb. vagy pedig a mikrobiális eredetű gének, mint például az NPTII gén, valamint a szintetikus gének, mint például az inzulin gén (Itakura és munkatársai, 1975).

A protoplasztok transzformálásához magán a kódoló DNS-en kívül nem kódoló DNS-t is alkalmazhatunk, amely általában szabályozó feladattal bír, és például az átírási folyamat szabályozásában lehet érdekelt.

Vannak egyes növényi gének, amelyekről ismert, hogy különböző belső és külső faktorokkal, mint például növényi hormonokkal, hősokkal, vegyi anyagokkal, patogénekkel, oxigénhiánnyal és fénnyel indukálódnak.

A génszabályozásra növényi hormonnal például felhozhatjuk az abszcisszinsavat (ABS), amelyről ismert,

HU 220 186 Β hogy a késői embrionális fázis során fellépő mRNS-fölösleget indukál gyapotban.

További példaként szolgál a giberellinsav (GA3), amely a ricinusmagban malátszintetáz-átírást indukál, valamint az árpa sikérrétegében az a-amiláz izoenzimjét indukálja.

A szójabab hősokkra érzékeny fehéijegénjének szabályozását részletesen kutatták. A növény többórás kezelése 40 °C hőmérsékleten az úgynevezett hősokkfehérje de novo szintézisét eredményezi. Számos ilyen gént izoláltak időközben és egyenként elemezték szabályozásukat. Ennek a génnek a kifejeződése elsősorban az átírás szintjén szabályozódik [Shoffl és munkatársai, akiket Willmitzer idéz (1988)]. A hps70 gén promotoija a neomicin-foszfotranszferáz II (NPTII) génnel van fuzionálva. Ez bizonyíthatta azt, hogy a kiméra gén hősokkal indukálható (Spona és munkatársai, 1985).

A növényekben indukálható gének másik csoportját képezik a fénnyel szabályozható gének, elsősorban a ribulóz-l,5-bifoszfát-karboxiláz (RUBISCO) kis alegységének nukleáris kódológénje. Morelli és munkatársai (1985), valamint Herrera-Estrella és munkatársai (1984) bebizonyították, hogy a borsóból származó RUBISCO gén 5’-szegélyezőszekvenciája képes a fényindukálhatóságot egy hírvivő génre átvinni, amennyiben ez kiméra formában össze van kapcsolva ezzel a génnel. Ezt a megfigyelést további fényindukálható génekre is ki lehet terjeszteni, például a klorofill a/b kötőfehéijére.

A kukorica alkohol-dehidrogenáz génje (adh gén) intenzív kutatás tárgya volt. Az adh 1-s gént kukoricából izolálták, és bebizonyították, hogy az 5’szegélyező-DNS egy része képes egy kiméra hírvivő gén (például klóramfenikol-acetil-transzferáz; CAT) kifejezésére, amikor az átmenetileg transzformált szövet anaerob körülményeknek van kitéve (Howard és munkatársai, 1987).

A jelen találmány egyik előnyös kiviteli formájában a protoplasztokat, amelyeket a Pooideae alcsaládba való növényekből nyertük, elektroporáció és polietilénglikolos kezelés kombinációjának segítségével transzformáljuk. Közvetlenül a B) eljárási lépés tisztítása után kapott protoplasztokat elektroporációnak vetjük alá [lásd például Shillito és munkatársai (1985), valamint az EP-0,164,575 számú európai szabadalmi bejelentést (Paszkovski és munkatársai)]. A protoplasztokat az utolsó öblítés után elektroporációs pufferben újraszuszpendáljuk. Ennek a találmánynak a keretében megfelelő például a mannitoldat alkalmas MgCl₂koncentrációval. A protoplasztszuszpenzióhoz azután hozzá lehet adni a vizes DNS-oldatot. A találmány egyik speciális kiviteli formájában a pCIB709 plazmidot alkalmazzuk, amelyet előzőleg megfelelő restrikciós endonukleázzal végzett kezeléssel linearizáltunk. A létrejövő keveréket óvatosan megmozgatjuk. A jelen találmány egyik speciális kiviteli formájában fél térfogat 24%-os (tömeg/térfogat), 0,5 mol/liter mannitot és 30 mmol/1 MgCl₂-ot tartalmazó oldatban levő PEG-oldatot adunk hozzá. Alapos átkeverés után a protoplasztokat Dialog-elektroporátor (DIA-LÓG GmbH Haffstrasse 34, D-4000 Düsseldorf 13, NSzK) kamrájába visszük át, és 2-10 lökettel, előnyösen 3 lökettel, mintegy 2000 V/cm és 5000 V/cm kimeneti feszültségnél és 10 ps exponenciális csillapodási konstans mellett 30 másodperces időközönként terheljük. A mintát azután Petri-csészébe visszük át, amely 1-25% (tömeg/térfogat) agarózzal mint kocsonyásító anyaggal van kiegészítve. A protoplasztokat az agaróz megdermedése előtt egyenletesen a tápközegre osztjuk el. A transzformált protoplasztoknak ebből a tenyészetéből regeneráljuk a Pooideae alcsaládba való transzgén növényeket, beleértve a termő transzgén növényeket, a C)-F) fejezetekben található leírás szerint.

A jelen találmány egy további előnyös kiviteli formájában a Pooideae protoplasztokat a Negrutiu és munkatársai (1987) által leírt eljárás szerint transzformáljuk. Ebben az esetben a tisztított protoplasztokat az utolsó öblítés után 0,5 mol/literes mannitoldatban szuszpendáljuk, amely 15 mmol/1 és 45 mmol/1 közti mennyiségben MgCl₂-ot tartalmaz. A DNS-t vizes oldat formájában adjuk hozzá, amelyet azonos térfogatú 36%-os (tömeg/térfogat) PEG-oldat hozzáadása követ (Negrutiu és munkatársai, 1987). Az így létrejött oldatot gondosan összekeveqük és 5-60 perc időtartamon, előnyösen 30 perc időtartamon át 10 °C és 32 °C hőmérsékleten, előnyösen szobahőmérsékleten (körülbelül 25 °C) inkubáljuk. Az inkubálási fázis során az oldatot alkalmanként megmozgatjuk. Az inkubálás befejezése után a protoplasztokat mossuk és megfelelő tenyésztő tápközegre szélesztjük. A megfelelő tenyésztő tápközegek közé számít például a KM-8p tápközeg (anélkül, hogy eljárásunkat csak erre korlátoznánk) 0,3-2,5% (tömeg/térfogat), előnyösen pedig 0,6-2% (tömeg/térfogat) agarózzal, mint szilárdítóanyaggal. A protoplasztokat az agaróz megszilárdulása előtt egyenletesen szétosztjuk a tápközegen. A transzformált protoplasztoknak ebből a tenyészetéből Pooideae alcsaládba való transzgén növényeket, beleértve a termő transzgén növényeket, regenerálunk a C)-F) fejezetekben található leírás szerint.

A jelen találmány keretében előnyös exogén DNS a

7. ábrában bemutatott pCIB709 plazmid linearizált formában.

G) eljárási lépés. Transzformált telepek kiválasztása

Az F) lépésből származó, agarózzal szilárdított tápközeget, amely a transzformált protoplasztokat tartalmazza, fényben vagy pedig előnyösen sötétben 5-30 napos, előnyösen 8-15 napos, és egészen különösen előnyösen 10 napos időtartamon át 0-50 °C, előnyösen 20-32 °C, és egészen különösen előnyösen 25 °C és 28 °C közti hőmérsékleten inkubáljuk. A szilárd tápközeget azután például 5 szeletre vágjuk, és ahogyan ezt Shillito és munkatársai (1983); az EP-0,129,688 számú európai szabadalmi bejelentés (Shillito és munkatársai); Shillito és munkatársai (1985); vagy az EP-0,164,575 számú európai szabadalmi bejelentés (Paszkovski és munkatársai) leírják, „bead type culture system”-ben szelektáljuk. A tápközegszegmensek száma és nagysága nem kritikus. A jelen találmány egy specifikus kiviteli formájában ezekből a szeletekből négyet egyenként megfelelő tápközegre visszük át, például SH-45 tenyésztő tápközegre, amely még 4 g/1 kazeinhidrolizátumot és 20-100 pg/ml

HU 220 186 Β higromicin B-t tartalmaz. Az 5. szeletet ugyanilyen tápközegre visszük át, amely azonban higromicint nem tartalmaz (kontroll).

A körülbelül 4-5. hét után a vélhetően transzformált sejttelepeket az agarózról kivágjuk és megfelelő tenyész- 5 tőközegben, mint például SH-45 tápközegben, amely 20-100 pg/ml higromicint tartalmaz, tenyésztjük úgy, hogy körkörös rázógépen 50-80 fordulat/perc forgási sebességgel mozgatjuk. További 4-5 hét múlva az összes telepet, amely új szuszpenziós tenyészetet szolgáltathat, 10 20 pg/ml higromicint tartalmazó friss tápközegre visszük át. Az új szuszpenzióból legalább két további átoltott tenyészetet készítünk 20 pg/ml higromicin B jelenlétében. Ezeket azonos körülmények közt tenyésztjük, amint fentebb leírtuk, amíg a kallusz képződése beindul. 15

A kalluszt, a szuszpenziós tenyészeteket, valamint azokat a tenyészeteket, amelyeket az ebben az eljárási lépésben készített anyagokból nyerhetünk, az A) eljárási lépésben leírtak szerint hidegben konzerválhatjuk.

H) eljárási lépés. A Pooideae alcsaládba való transzfer- 20 máit növények regenerálása kalluszból

A transzformált kalluszból [G) eljárási lépés] a D) és E) fejezetekben leírt eljárásokkal összhangban lehet Pooideae alcsaládba való transzformált növényeket regenerálni. 25

A találmány szerinti eljárás tehát lehetővé teszi protoplasztok, amelyek Pooideae alcsaládba való pázsitfűféle növényekből származnak, regenerálását teljes növénnyé, elsősorban teljes termő növénnyé. Ez elsősorban azt teszi lehetővé, hogy exogén DNS-t építsünk be 30 stabilan ezeknek a növényeknek a genomjába, és ezáltal megváltoztassuk ezek genotípusát, illetve fenotípusát. Ezenkívül a protoplasztokat intraspecifikusan vagy interspecifikusan fuzionálhatjuk más protoplasztokkal, amelynek segítségével mag-DNS-ek új kombi- 35 nációit alkothatjuk meg. Ezentúl ezeket a protoplasztokat klónozóanyagként alkalmazhatjuk mutációs és szelekciós lépésekben, amikor kívánt fenotípus előállítását kívánjuk végrehajtani.

Kívánt fenotípusos példa lehet a rezisztencia toxi- 40 kus koncentrációjú természetes vagy szintetikus vegyi anyagok ellen, ideértve az inszekticideket, herbicideket, fúngicideket, baktericideket, nehézfémeket, sókat, patotoxinokat, anyagcsere-inhibitorokat, valamint sejtmetabolitok szerkezeti és funkcionális analógjait, anél- 45 kül, hogy eljárásunkat csak ezekre korlátoznánk. Kívánt fenotípusra, amelyre szelektálhatunk, további példák lehetnek a rezisztenciák kedvezőtlen környezeti befolyások ellen, mint például hideg vagy meleg hőmérséklet vagy biológiai hatások, például patogének ellen. 50

Az alábbi kiviteli példák csak a jelen találmány további bemutatásának céljára szolgálnak és semmiképpen nem az a céljuk, hogy a találmány oltalmi körét korlátozzák.

PÉLDÁK

1. példa

Embriogén szuszpenziós tenyészetek előállítása Dactylis glomerata L. (csomós ebír) szöveteiből 60

Az embriogén kalluszhoz kiindulási anyagként az üvegházban kinőtt csomós ebír (Dactylis glomerata L.) legfiatalabb leveleinek alapmetszete szolgál, amint ezt Hanning és munkatársai leírták (1982). A leveleket 10 perces, 1:10 arányban hígított Clorox-oldatba mártással felületükön sterilezzük [a Clorox 5,25%-os (tömeg/térfogat) nátrium-hipoklorit-oldat, előállítja a The Clorox Company, Oakland, Kalifornia 94623, Amerikai Egyesült Államok] és ezután steril körülmények között 1-5 mm hosszúságú vagy átmérőjű darabokra vágjuk. Ezeket a darabokat steril SH-30 tápközegre szélesztjük el, amely 0,8% (tömeg/térfogat) agarózt tartalmaz szilárdítóanyagként. Mintegy 25 °C tenyésztési hőmérsékleten a kallusz- és/vagy az embriogén tenyészetek a szélesztéstől számított 2-6 héten belül megjelennek.

Kiindulási anyagként az embriogén szuszpenziós tenyészetek előállításához az embriogén kallusz szolgál, amelyet mintegy 0,5 g (friss tömeg) mennyiségben adunk 50 ml, Gray és munkatársai által leírt folyékony tápközeghez, amely még 45 pmol/l Dicambat és 4 g/liter kazeinhidrolizátumot tartalmaz. A szuszpenziós tenyészetet 125 ml-es Delong-lombikban, amely fémsapkával és parafilmmel van lezárva, 27 °C hőmérsékleten és 16 óra fény (40 pE/m^{1 2}s) és 8 óra sötétség fény/sötétség ritmusban, körkörös rázógépen mintegy 130 fordulat/percnél inkubáljuk. Mintegy 4 hét múlva a nagy setjcsomókat mintegy 30 másodpercig ülepedni hagyjuk, és ezután a felső részből, amely kis sejtcsomókat tartalmaz, 10 ml-es aliquotokat veszünk, és ezeket 50 ml friss tápközegbe visszük át. Ezt az eljárást minden 3-4. héten megismételjük, ahol mindig a leginkább sikerrel kecsegtető sejtcsomókat alkalmazzuk, a kisebb csomóméret és a jobb minőség szerint, amely a kis, citoplazmában dús sejtek jelenlétéből adódik. 5-8 átoltás után a szuszpenziók lényegében mentesek a nem embriogén sejtektől, és az embriogén sejtcsomók jelentős többsége viszonylag kicsi (150-2000 pm).

2. példa

Dactylis glomerata L. protoplasztok izolálása és tisztítása

Protoplasztokat nyerünk az embriogén szuszpenziós tenyészetből (1. példa), ahol a sejteket először 0,2 pm-es Nalgene-szűrőegységen végzett steril szűréssel elkülönítjük, majd 0,5 g (friss tömeg) mennyiségben 12,5 ml Petri-csészében levő protoplaszt-enzimkeverékhez adjuk. Az enzimoldatot, amely az alábbiakból áll:

Celluláz RS	2% (tömeg/térfogat)
CaCl2.H2O	7 mmol/1
NaH2O4.H2O	0,7 mmol/1
MES (pH 5,6)	3,0 mmol/1
Glükóz
(végső koncentráció)	550 mOs/kg H2O (pH 5

ezután szűréssel sterilezzük. A keveréket 50 fordulat/perc sebességgel működő rázógépen alkonyati fényben (<5 pE/m²s) 4-5 órán át rázatjuk. Az emésztett anyagot azután rozsdamentes acélszitán (100 pm lyukszélesség) szűrjük és 12 ml-es centrifúgacsövecskékbe

HU 220 186 Β osztjuk el, amelyeket 5 percig 60-100 g-nél centrifugálunk. A protoplaszttartalmú üledéket azután háromszor mossuk KM-8p protoplaszttenyésztó tápközeggel, amelyet glükóz segítségével 550 mOs/kg H₂O értékre állítottunk be. Itt be lehet építeni egy flotálási lépést a protoplasztok további tisztításához. Ebben az esetben a mosott protoplasztokat szacharózzal 700 mOs/kg H₂O ozmotikus értékre beállított KM-8p tápközeg (10 ml) felületére helyezzük. 10 perces centrifugálás után 60-100 g-nél a határfelületre koncentrálódott protoplasztokat finom pipetta segítségével összegyűjtjük. Végül a protoplasztokat 1-2 ml KM-8p tenyészközegben újraszuszpendáljuk és rozsdamentes lyukrácson át (20 pm) szűrjük. A szabadon maradt protoplasztokat összegyűjtjük, mossuk és KM-8p tápközegben vagy pedig más ozmotikus, alkalmas tápközegben, amely a 6. példa szerinti transzformáláshoz megfelel, való tenyésztéshez újraszuszpendáljuk.

3. példa

Dactylis glomerata L. protoplaszttenyészete és kallusznövekedés (a) A tisztított protoplasztokat mintegy 5 · 10⁵ protoplaszt/ml sűrűségben KM-8p tenyésztőközegre szélesztjük el, amely 1,3% (tömeg/térfogat) SeaPlaque Agarose-t (FMC Corp. Maríné Colloids Division, Rockland, Maine, Amerikai Egyesült Államok) és 30-40% (térfogat/térfogat) kondicionált tápközeget tartalmaz. A kondicionált tápközeget Dactylis glomerata L. 3-4 hetes embriogén sejttenyészetéből nyerjük, amelyet steril Nalgene-szűrőn (0,2 pm) átszűrünk, a tápközeget glükóz hozzáadásával 550 mOsm/kg H₂O ozmotikus értékre állítjuk be, végül újabb szűréssel sterilezzük. A lemezeket ezután sötétben 28 °C állandó hőmérsékleten sterilezzük. 10-14 nap múlva az agarózt ék alakú darabokra szétvágjuk és „bead culture system”be (gyöngy tenyésztő rendszer) (Shillito és munkatársai, 1983) visszük át, 20 ml, 3% (tömeg/térfogat) szacharózt tartalmazó SH-45 szuszpenziós tenyésztő tápközeget alkalmazva 3 ml eredeti, agarózzal szilárdított tenyészetre. A lemezeket rázógépre visszük és 50 fordulat/perc mellett és 8 pE/m²s fényintenzitásnál rázatjuk. A sejtek felszabadulása az agarózból a körülvevő folyékony tápközegbe új szuszpenziós tenyészet képződéséhez vezet. Az így létrejövő, szuszpenzióban tenyésztett sejteket agarral szilárdított SH-30 tápközegre szélesztjük és kallusz képződéséig sötétben 25 °C hőmérsékleten tenyésztjük.

(b) A protoplasztokat ugyanúgy tenyésztjük, mint ahogyan az előző 3.(a) példában leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a tenyésztő tápközeg még 100 mg/liter Oacetil-szalicilsavat is tartalmaz.

(c) A protoplasztokat ugyanúgy tenyésztjük, mint ahogyan az előző 3.(a) példában leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a tenyésztő tápközeg még 30 mg/liter Oacetil-szalicilsavat tartalmaz.

(d) A protoplasztokat ugyanúgy tenyésztjük, mint az előbbi 3.(a)-(c) példákban leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a tápközeg nem tartalmaz kondicionált tápközeget.

4. példa

Dactylis glomerata L. növények regenerálása kalluszból, amely maga protoplasztokból származik (a) Dactylis glomerata L. kalluszt (a 3. példa szerint), amelyet protoplasztokból kaptunk, megszilárdított SH-30 tápközegben tenyésztünk. Minden második héten másodlagos tenyészetbe visszük át. Minden embriót, amely ez alatt az idő alatt kifejlődik, kiemelünk, csíráztató tápközegre (SH-O) szélesztjük és fényben (45 pE/m²s és 55 pE/m²s) inkubáljuk. Ezeknek az embrióknak a csírázása 1-4 hét alatt megy végbe. Az így létrejövő fiatal növénykéket gyökérrendszer kialakítása érdekében SH-O tápközegre visszük át és fényben inkubáljuk. A 6-12 leveles stádium elérése után ezeket melegházba visszük át és ott lassanként megerősödnek.

(b) Kalluszt (a 3. példa szerint), amelyet protoplasztokból kaptunk, 0,24% (tömeg/térfogat) GelRite-vel szilárdított SH-O tápközegen fényben (45 pE/m²s és 55 pE/m²s között) tenyésztünk. Minden második héten másodlagos tenyészetbe visszük át. Az így létrejövő fiatal növénykéket gyökérrendszer kialakítása érdekében SH-O és OMS tápközegek 1:1 arányú keverékére, amely 0,12% (tömeg/térfogat) GelRite és 0,4% (tömeg/térfogat) agar kombinációjával van megszilárdítva, visszük fel és fényben tenyésztjük. A 6-12 leveles stádium elérése után ezeket melegházba visszük át és ott lassanként megerősödnek.

(c) Kis fiatal növénykéket, amelyeket úgy kapunk meg, amint ezt a 4.(a) és 4.(b) példákban leírtuk, 0,8% (tömeg/térfogat) agart tartalmazó OMS tápközegre viszünk fel és gyökérrendszer kialakítása érdekében fényben tenyésztjük. A 6-12 leveles stádium elérése után ezeket melegházba visszük át és ott lassanként megerősödnek.

(d) Kis fiatal növénykéket, amelyeket úgy kapunk meg, amint ezt a 4.(a) példában leírtuk, gyökérképződés érdekében SH-O és OMS tápközeg 1:1 arányú keverékére, amely 0,12% (tömeg/térfogat) GelRite és 0,4% (tömeg/térfogat) agar kombinációjával van megszilárdítva, viszünk fel és fényben tenyésztjük. A 6-12 leveles stádium elérése után ezeket melegházba visszük át és ott lassanként megerősödnek.

5. példa pCIB709 plazmid megalkotása, E. coli replikon növényben kifejezhető higromicinrezisztencia génnel (35S/Hyg>)

A higromicinrezisztenciához szolgáló struktúrgének kódolandó szekvenciáját a pLG90 plazmidból (Gritz és Davies, 1983) izoláljuk egy mintegy 1150 bázist magában foglaló BamHI fragmentum formájában. A pLG9 plazmidot Linda Gritztől [Applied Biotechnology, 80 Rogers Street, Cambridge, Massachussets 02141, Amerikai Egyesült Államok] szerezhetjük be. A pCIB709 plazmid megalkotásához az izolált BamHI fragmentumot a pCIB710 (Rothstein és munkatársai, 1987) BamHI hasítóhelyénél beiktatjuk. A pCIB710 plazmid tartalmazza a CaMV (karfiol-mozaikvírus) 35S átiratának szabályozóterületét, ahol a

HU 220 186 Β promotor- és terminátorterület egyedi BamHI hasítóhellyel van elválasztva.

A létrejött pCIB709 plazmidot az American Type Culture Collectionnél (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) ATCC 40428 számon deponáltuk.

A transzformáláshoz való alkalmazás előtt a pCIB709 plazmidot PvuII restrikciós enzimmel végzett kezelés révén linearizálni lehet. Ez a konstrukció tartalmaz azután egy higromicinrezisztencia gént (amino-glikozid-foszfotranszferáz IV. típus) a karfiol-mozaikvírusból származó CaMV 35S átirat 5’- és 3’-kifejezőszignáljaival együtt egy pCU plazmidban. A pCIB709 szekvenciáját a 7. ábrában mutatjuk be.

6. példa

Dactylis glomerata L. protoplasztok transzformálása elektroporáció segítségével (a) Közvetlenül a protoplasztok tisztításához csatlakozva elektroporációt végzünk Shillito és munkatársai (1985) szerint, a 7. ábrában bemutatott, linearizált formájú pCIB709 plazmid alkalmazásával. A protoplasztokat az utolsó átöblítés után 7 · 10⁶ protoplaszt/ml sűrűségben elektroporációs pufferben (0,4 mol/1 mannit, 6 mmol/1 MgCl₂) újraszuszpendáljuk. A protoplasztokat azután 0,7 ml-es aliquotokban műanyag centrifugacsövekbe (10 ml) visszük át. Ezután a plazmid-DNS-t [62 μΐ víz PvuII-vel emésztett pCIB709 plazmiddal és ultrahanggal kezelt borjútimusz-DNS-sel (Sigma) 10 pg/ml (pCIB709), illetve 50 pg/ml (borjútimusz-DNS) végkoncentrációban] a csövecskékhez adjuk. Ezután 0,38 ml polietilénglikol-oldatot (PEGoldat) [24% (tömeg/térfogat) PEG 6000, 0,4 mol/liter mannitot, 30 mmol/1 MgCl₂-ot és 0,1% (tömeg/térfogat) MES-t tartalmazó oldatban (pH 5,6)] adunk hozzá, és az oldatot óvatosan összekeverjük. A protoplasztszuszpenziót azután Dialóg elektroporátorkamrájába visszük és 10 lökettel, amelyeknek 3250 V/cm kimenőfeszültsége és 10 ps-os exponenciális csillapodási állandója van, és amelyek közt 30 másodperces intervallumokat alkalmazunk, kezeljük. A mintát azután a kamrából kivesszük és 10 cm átmérőjű Petri-csészére visszük át. 10 ml, 1,2% SeaPlaque agarózt tartalmazó KM-8p tápközeg hozzáadása után a protoplasztokat az agaróz megdermedése előtt az egész tápközegben egyenletesen eloszlatjuk.

(b) A 6.(a) példát ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a kimenőfeszültség ebben az esetben 3500 V/cm.

(c) A 6.(a) példát ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a kimenőfeszültség ebben az esetben 4000 V/cm.

(d) A 6.(a) példát ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a kimenőfeszültség ebben az esetben 5000 V/cm.

(e) A 6.(a) példát ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a kimenőfeszültség ebben az esetben 3000 V/cm.

(f) A 6.(a) példát ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a kimenőfeszültség ebben az esetben 2500 V/cm.

(g) A 6.(a)-(f) példák bármelyikét ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy 4000 molekulatömegű PEG-et alkalmazunk.

(h) A 6.(a)-(f) példák bármelyikét ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy 8000 molekulatömegű PEG-et alkalmazunk.

(i) A 6.(a)-(h) példák bármelyikét ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a PEG végkoncentrációja a 10% és 30% (tömeg/térfogat) közötti tartományban van.

(j) A 6.(a)-(i) példák bármelyikét ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy kiegészítésképpen hősokkkezelést is végzünk Shillito és munkatársai (1985) és Potrykus és munkatársai (1985) leírása szerint.

7. példa

Dactylis glomerata L. transzformálása polietilénglikolkezelés segítségével (a) A PEG-gel közvetített közvetlen génátvitelt Negrutiu és munkatársai (1987) leírása szerint hajtjuk végre. Az alkalmazott DNS a pCIB709 linearizált formája.

A protoplasztokat az utolsó átöblítés után 15 mmol/1 MgCl₂-t tartalmazó 0,5 mol/l-es mannitoldatban 2 · 16⁶/ml koncentrációban szuszpendáljuk. A protoplaszt-szuszpenziókat 1 ml-es aliquotok formájában műanyag centrifugacsövekbe (10 ml) osztjuk szét. A PEG-oldat [40% (tömeg/térfogat)] hozzáadása előtt először is, amint ezt a 6. példában részletesen leírtuk, a DNS-t adjuk be. Az oldatokat óvatosan összekeverjük és 30 perces időtartamon át szobahőmérsékleten alkalmanként megrázogatva inkubáljuk. Ezután 1,4 ml mosóoldatot adunk hozzá, és a csövecskék egyes alkotórészeit óvatosan összekeveijük. A mosóoldat 87 mmol/1 mannitból, 15 mmol/1 CaCl₂-ból, 27 mmol/1 MgCl₂ból, 39 mmol/1 KCl-ból, 7 mmol/1 trisz-HCl-ból és 1,76 g/liter m-inozitból áll (pH 9,0). 4 perces állás után a mosóoldat további 1,4 ml-es aliquotját adjuk hozzá, és az összes réteget alaposan összekeveijük. A csövecskéket azután 10 percig mintegy 60 g-nél centrifugáljuk, és a felülúszót eldobjuk. Az üledéket képző protoplasztokat 1 ml KM-8p tápközegben felvesszük és 10 cmes Petri-csészére visszük át. 10 ml, 1,2% (tömeg/térfogat) SeaPlaque Agarose-t tartalmazó tápközeg hozzáadása után, még az agaróz megdermedése előtt a protoplasztokat egyenletesen elosztjuk a teljes tápközegben.

(b) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 7.(a) példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a mosóoldat pH-ját 5,6 értékre állítjuk be.

(c) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 7.(a) példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a mosóoldat pH-ját 7,0 értékre állítjuk be.

(d) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 7.(a)-(c) példák bármelyikénél leírtuk, azzal a különbséggel, hogy PEG-ként 6000 molekulatömegű PEG-et alkalmazunk.

(e) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 7.(a)-(c) példák bármelyikénél leírtuk, azzal a különbséggel, hogy PEG-ként 2000 molekulatömegű PEG-et alkalmazunk.

ί

HU 220 186 Β (f) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 7.(a)-(c) példák bármelyikénél leírtuk, azzal a különbséggel, hogy PEG-ként 8000 molekulatömegű PEG-et alkalmazunk.

(g) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 7.(a)-(f) példák bármelyikénél leírtuk, azzal a különbséggel, hogy legelőször hősokk-kezelést alkalmazunk Shillito és munkatársai (1985) és Potrykus és munkatársai (1985) leírása szerint.

(h) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 7.(a)-(g) példák bármelyikénél leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a mosóoldat 154 mmol/1 NaCl-ból, 125 mmol/1 CaCl₂-ból és 5 mmol/1 glükózból áll és KOH-val pH 6,0 értékre van beállítva.

(i) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 7.(a)-(g) példák bármelyikénél leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a mosóoldat 0,2 mol/1 CaCl₂-ból és 0,1% (tömeg/térfogat) MES-ból áll és KOH-val pH 6,0 értékre van beállítva.

(j) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 7.(a)-(g) példák bármelyikénél leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a mosóoldat 0,2 mol/1 CaCl₂-ból és 7 mol/1 trisz-HCl-ból áll és KOH-val pH 9,0 értékre van beállítva.

8. példa

Dactylis glomerata L. protoplasztok transzformálása elektroporáció vagy polietilénglikolos kezelés segítségével (a) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 6. vagy 7. példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a pCIB709 plazmidot BglII restrikciós enzimmel hasítjuk, mielőtt transzformálás céljára felhasználnánk.

(b) A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a 6. vagy 7. példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a pCIB709 plazmidot HindlII restrikciós enzimmel hasítjuk, mielőtt transzformálás céljára felhasználnánk.

9. példa

Dactylis glomerata L. protoplasztok transzformálása elektroporáció vagy polietilénglikolos kezelés segítségével

A transzformálást ugyanúgy végezzük, ahogyan a

6. vagy 7. példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a protoplasztokat az aliquotok szétosztása előtt egyedi centrifugacsövecskékbe az ezt követő transzformáláshoz vagy pedig az aliquotok szétosztása után és a PEG hozzáadása előtt 5 percen át 45 °C hőmérsékleten kezeljük.

10. példa

A transzformált telepek szelektálása (a) A tenyésztőlemezeket (Petri-csészéket) a protoplasztokkal 10 napon át 25 °C hőmérsékleten sötétben inkubáljuk, majd az ezt követő tenyésztéshez [„bead culture”; Shillito és munkatársai (1983)], 5 egyenlő nagyságú darabra vágjuk. 4 darabot 20-20 ml, 4 g/liter kazeinhidrolizátumot és 20 pg/ml higromicin B-t is tartalmazó SH-45 tenyésztőközegbe viszünk be. Az 5. darabot szintén 20 ml csaknem azonos tápközegbe visszük át, amely azonban nem tartalmaz higromicin B-t, ezáltal nem szelektív kontrollként szolgál. 4-5 hét múlva a protoplasztokból nyert, vélhetően transzformált sejttelepeket, amelyeket higromicin B jelenlétében mosunk, az agarózból kivágjuk és 19 mm átmérőjű Petri-csészébe visszük át, amely 2 ml, 20 pg/ml higromicin B-t is tartalmazó folyékony SH-45 tápközeget tartalmaz. A Petricsészéket rázógépen mintegy 50 fordulat/perc forgási sebességgel rázatjuk. További 4-5 hét múlva az összes olyan telepet, amely növekedést mutat és új szuszpenzióhoz vezet, 125 ml-es Erlenmeyer-lombikba visszük át és - eltekintve a higromicintartalomtól (20 pg/ml) - azonos módon tenyésztjük, mint a kiindulási tenyészetet.

Az új szuszpenzióból minden 1-3. héten átoltott tenyészetet készítünk 4 g/liter kazeinhidrolizátumot és 20 pg/ml higromicin B-t is tartalmazó SH-45 tápközeget alkalmazva. Az ebből a szuszpenzióból származó sejteket 20 pg/ml higromicin B-t is tartalmazó SH-30 szilárd tápközegre szélesztjük és 25 °C hőmérsékleten sötétben inkubáljuk. A kalluszokból, amelyek ezekből a szélesztett sejtekből kifejlődnek, minden 2-3. héten átoltott tenyészetet készítünk friss tápközegen. Ebből következik, hogy mindazok a sejtek, amelyek higromicin B jelenlétében nőnek, transzformánsok.

(b) A szelektálást úgy végezzük, mint ahogyan ezt a

10. (a) példában leírtuk, ahol azonban ebben az esetben a protoplasztokból kapott sejttelepeket, amelyek higromicintartalmú tápközegen nőnek, 20 pg/ml higromicin B-t is tartalmazó SH-30 tápközeggel ellátott agarlemezre visszük át és 25 °C hőmérsékleten sötétben inkubáljuk.

11. példa

Transzformált Dactylis glomerata L. növények regenerálása

A növényeket azonos módon regeneráljuk, mint ahogyan a 4. példában, a nem transzformált anyagnál leírtuk.

12. példa

DNS kivonása kalluszból és levélszövetből

A DNS-t a regenerált növények kalluszából és leveleiből egy módosított CETAB-módszer (Roger és Bendich, 1985) alkalmazásával vonjuk ki. Ezt az eljárást itt példaként Dactylis glomerata L. növényre újuk le, de azonos hatékonysággal alkalmazhatjuk bármilyen kívánt, Pooideae alcsaládba tartozó növény szöveteihez. A DNS előállításához a fentebb leírt anyagból azonban bármilyen más, szokásos módon alkalmazott DNS-extrakciós eljárás is alkalmazható.

Az SH-0 és SH-30 tápközegen kinőtt kalluszt szárazjégen mélyhútjük és azután folyékony nitrogén hőmérsékletén finom porrá szétdörzsöljük. Az így kapott port azután folyékony nitrogén hőmérsékletén előhűtött polipropilén centrifugacsövecskékbe (5 ml) visszük át. Arra kell ügyelni, hogy a por ennek az eljárási lépésnek a kivitelezése során sohase engedjen ki. A port azután egy éjszakán át fagyasztva szárítjuk és végül 2,2 ml-es Eppendorf-csövecskékbe osztjuk szét, ahol minden csö18

HU 220 186 Β vecskébe <0,5 ml port adunk. Minden csövecskéhez 1 ml CETAB extrakciós puffért adunk, végül a csöveket 60 °C hőmérsékleten 30-45 percig inkubáljuk. Szobahőmérsékletre való visszahűtés után kloroform-izoamilalkohol 24:1 arányú keverékét adjuk hozzá (1 ml), és az egészet alaposan összekeverjük. Ezt 30 másodperces centrifúgálás követi 3000 fordulat/percnél Eppendorfcentrifúgában. Miután a vizes fázist friss csövecskékbe átvittük, 1/10 térfogat 10%-os (tömeg/térfogat) CETABoldatot adunk hozzá, és a kloroformos extrahálást megismételjük. A vizes fázist újból friss csövecskékbe visszük át és azonos térfogatú kicsapópufferral keveijük össze. Ez szobahőmérsékleten a DNS és RNS kicsapódásához vezet. Ezt ezután 30 perc-1 óra időtartamon át hagyjuk végbemenni, mielőtt a csövecskéket újracentrifúgálnánk. A felülúszót eldobjuk, és a csapadékot nagy sókoncentrációjú TE-pufferban (lásd alább), 65 °C hőmérsékleten 30 percen át újraszuszpendáljuk.

Alkalmazottpufferok és oldatok CETAB extrakciós puffer 1% (tömeg/térfogat)

10% CETAB	CETAB trisz (pH 8,0; 50 mmol/liter) EDTA (10 mmol/liter) NaCl (0,7 mol/liter) 0,5% (tömeg/térfogat) PVP, 360 000 móltömeg [PVP=poli(vinil-pirrolidon)] 10% (tömeg/térfogat) CETAB
Kicsapópuffer	NaCl (0,7 mol/liter) 1% (tömeg/térfogat) CETAB
Nagy sókoncentrációjú	trisz (pH 8,0; 50 mmol/liter) EDTA (1 mmol/liter) trisz (pH 8,0; 10 mmol/liter)
TE-oldat	EDTA (1 mmol/liter)
TE-puffer	NaCl (1 mol/liter) trisz (pH 8,0; 10 mmol/liter)
1/10 TE	EDTA (1 mmol/liter) trisz (pH 8,0; 1 mmol/liter)
13. példa A DNS tisztítása	EDTA (0,1 mmol/liter)

A 12. példában leírt eljárás vagy bármely más, alkalmas eljárás segítségével előállított DNS-t bármilyen tetszés szerinti, ismert eljárás alkalmazása segítségével tisztíthatjuk. Alkalmas eljárások például (anélkül, hogy eljárásunkat csak ezekre korlátoznánk): etidium-bromid-CsCl gradienscentrifúgálás, kezelés fenol/kloroformmal, valamint tisztítás etidium-bromid nélküli lépcsőzetes gradiensen. Ezeket az eljárásokat Maniatis és munkatársai (1982) írják le.

(a) Tisztítás fenol/kloroformos kezeléssel

A 12. példában kapott nukleinsavakat 2 térfogatrész hideg (-20 °C) etanollal kicsapjuk, és a csövecskéket 2-3 percig 5000 g-nél centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk, és a csapadékot 70%-os és 100%-os etanollal mossuk. A nukleinsavakat ezután steril légárammal részlegesen kiszárítjuk. A DNS-t egy éjszakán át oldjuk 200 μΐ 1/10 TE-pufferban. A DNS-oldatot Eppendorf-centrifugacsövekbe visszük át és 10 μΐ RNázoldatot (2 mg/ml), amelyet előzőleg felmelegítettünk, hogy az esetleges jelen levő DNáz dezaktiválódjék, adunk hozzá, mielőtt a csövecskéket 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubálnánk. Ezután 0,25 térfogatrész 5 mol/literes NaCl-oldatot adunk hozzá, és a DNS-t 0,4 térfogatrész 30%-os PEG-oldat (molekulatömeg 6000 és 8000 között), amely 1,5 mol/liter NaCl-ot is tartalmaz, hozzáadásával, valamint 1 órás, -20 °C hőmérsékleten végzett inkubálással kicsapjuk. A csövecskéket azután 5 percen át centrifugáljuk, a felülúszót eldobjuk, és a csapadékot hideg abszolút etanollal mossuk. Rövid, steril légáramlattal végzett szárítás után az üledéket 0,3 ml TE-pufferban újraszuszpendáljuk. Az oldatot fenol/kloroform/izoamil-alkohol (25:24:1) keverékkel, amely TE-pufferral van kiegyensúlyozva, extraháljuk és 30 másodpercig Eppendorf-centrifúgával centrifugáljuk. A vizes fázist ezután friss csövecskékbe visszük át. Az oldatot kloroform/izoamil-alkohol (24: l)-gyel extraháljuk és 30 percig centrifugáljuk, és a vizes fázist végül friss csövecskékbe visszük át. A kloroformos extrakciót megismételjük. Ezután a DNS kicsapásához 1/10 térfogat, 3 mol/l-es nátrium-acetátot adunk hozzá, ezt követi 70%-os és 100%-os etanol hozzáadása. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, 70%-os és 100%-os etanollal mossuk, rövid ideig steril légáramlatban szárítjuk és elegendő mennyiségű TE-pufferban oldjuk úgy, hogy a „Southem-blot”(Southem-folt-) elemzéshez megfelelő oldatot kapjunk, amelynek DNS-koncentrációja 0,25 pg/l és 1 pg/l között van.

(b) Tisztítás lépcsőzetes gradienssel etidiumbromid nélkül

A nukleinsavakat CsCl lépcsőzetes gradienssel tisztítjuk, amely 5,7 mol/l CsCl (TE-pufferban) fenékrétegből és e felett levő, 1,0 mol/liter CsCl-ből (TE-pufferban) áll. A nukleinsavakat a felső rétegbe építjük be. A csövecskéket, amelyek a lépcsőzetes gradienst tartalmazzák, egy éjszakán át centrifugáljuk excentrikusán forgó rotorral (például Beckman SW 50.1; 45 000 fordulat/percnél). A DNS-t a határfelületi területről izoláljuk, míg az RNS-t a csövecskék fenekéről kaphatjuk meg. A DNS-t két térfogatrész vízzel hígítjuk és 2 térfogatjéghideg etanollal, ahogyan ezt a 13.(a) példában leírtuk, kicsapjuk. A csapadékot azután TE-pufferban újraszuszpendáljuk, etanollal újból kicsapjuk és a Southem-folt-elemzéshez használjuk fel.

14. példa

Idegen DNS-szekvencia kimutatása a transzformált Dactylis glomerata L. növények genomjában a Southern-folt-elemzés segítségével

A Southem-hibridizálást lényegében a Maniatis és munkatársai (1982) által leírt eljárással végezzük. Dactylis glomerata L. növényekből kapott DNS-t [amelyet a 13.(a) és 13.(b) példákban leírt eljárással tisztítottunk] BamHI restrikciós enzimmel hasítunk. Ebből 5 pg-ot 1%-os agarózgélre viszünk fel és fragmentumnagyságaik szerint elválasztjuk. A gélt mintegy 20 percre 0,25 mol/l HCl-be visszük, majd H₂O-val öblítjük és további 30 percre 0,4 mol/l NaOH-ba helyezzük.

HU 220 186 Β

A DNS-t azután egy éjszakán át a szokásos módon GeneScreen Plusra (NEN Rés. Product., NEF 976 katalógusszám, 3300GP62 tételszám) visszük fel (ahogyan a használati utasítás írja, amelyet a termékkel együtt szállítanak), ahol 0,4 mol/1 NaOH-t alkalmazunk átvivőpufferként. Az egy éjszakán át tartó átvitel után a szűrót eltávolítjuk, 2xSSC-vel (0,3 mol/liter NaCl, 0,03 mol/1 nátrium-citrát) 5 percig mossuk, majd levegőn szárítjuk. A foltot 4 órás időtartamon át 65 °C hőmérsékleten pufferral előhibridizáljuk, ahol a puffer 10 g/liter szarvasmarha-szérumalbumint (zsírmentes, Sigma, A-4503 katalógusszám), 7% SDS-t, 1 mmol/1 Na-EDTA-t és 0,52 mol/1 nátrium-foszfát-puffert (pH 7,0) tartalmaz. A „Random Primer” (véletlenszerű primer) módszer segítségével azután az IBI „Prímé Time” jelzőkészlet alkalmazásával vagy bármely tetszés szerinti alkalmas módszerrel radioaktívan jelzett vizsgálómintát állítunk elő, amely egy „Spin”-oszlopon a fölösleges nukleotidoktól megszabadul. A DNS-vizsgálóminta egy pCIB709 fragmentumból áll, amely a 35S promotorterületet, valamint a IV. típusú aminoglikozid-foszfotranszferáz struktúrgénjét tartalmazza. A hibridizálóreakció egy éjszaka alatt megy végbe 65 °C hőmérsékleten. A foltot azután négyszer SW mosópufferral mossuk, ahol mindkét utolsó öblítést 65 °C hőmérsékleten hajtjuk végre. Ezután a foltot további öblítéseknek vetjük alá, mégpedig 2 órás időtartamon át, 65 °C hőmérsékleten, 0,2 χ SSC-ben, amely 1% SDS-t és 5 mmol/1 Na-EDTA-t tartalmaz. A nedves foltot fényáteresztő háztartási fóliába (Saranwrap) vagy bármilyen más, tetszés szerinti alkalmas fóliába becsomagoljuk és röntgenfilm (Kodak X-Omat AR film, Eastman Kodak, Rochester, New York 14650, 165 1454 katalógusszám) segítségével előhívjuk. Az előhívott röntgenfilm kiértékelése lehetővé teszi a hibridizálás egyértelmű kimutatását a vizsgálóminta és a DNS között, amelyet a pCIB709-cel transzformált kalluszból vagy egy pCIB709-cel transzformált növényből kaptunk. A pCIB709 DNS tehát egyértelműen a transzformáns nagy molekulájú DNS-ébe van beépítve.

Oldatok és pufferok

SW hibridizálópuffer 1% (tömeg/térfogat) szarvasmarha-szérumalbumin (zsírmentes);

0,52 mol/liter nátrium-foszfát, pH 7,0;

7% (tömeg/térfogat) SDS;

mmol/1 EDTA

Mosóoldat 0,04 mol/1 nátrium-foszfát, pH 7,0;

mmol/1 Na-EDTA 1% (tömeg/térfogat) SDS; 0,125 mol/liter SDS.

15. példa

Dactylis glomerata L. kallusztenyészet hidegkonzerválása (1) Dactylis glomerata L. növényekből származó aktívan növekvő kalluszt folyékony SH-0 tápközegbe viszünk át. A kallusz mennyisége szokásos módon mintegy 0,5-1 g kallusz között van 20 ml tenyésztőközegre számítva. A lombikokat a kalluszokkal óvatosan mozgatjuk és kevertetjük, hogy a kalluszcsomókat szétoszlassuk és diszpergáljuk. A tenyészetet, valamint a fagyasztást segédanyagot azután elválasztjuk egymástól jégen hűtve.

(2) Ezután azonos térfogatú P fagyasztást segédanyagot adunk hozzá 5 perces időtartam alatt, és a keveréket órán át jégen tartjuk. Ez alatt az idő alatt 1,0 ml-es aliquotokat megjelölt és előhűtött, 18 ml-es műanyag fiolákba osztunk, amelyek hidegkonzerváláshoz alkalmasak (például Vangard Cryos Cryogenic Vials, Sumimoto-Bakelite Co., Ltd., Japán, katalógusszám: M S4502) és jégen inkubálunk. A P fagyasztási segédanyag 1 mol/1 glicerinből, 1 mol/1 L-prolinból és mol/liter dimetil-szulfoxidból (DMSO) (Sigma, 02650 katalógusszám, 57F-8816 tételszám) áll vízben (pH 5,6). Ezt az oldatot minden felhasználáshoz frissen állítjuk elő (a glicerin/prolin/víz keveréket mélyhűtve őrizhetjük).

(3) A sejtek és a fagyasztási segédanyag egyórás együttes inkubálása után az edényt egy 0 °C hőmérsékletű folyadékfurdő felületére helyezzük. A fürdő etanolból vagy más, tetszés szerinti, ismert és megfelelő hűtőanyagból állhat. A fürdő keverőberendezéssel van ellátva, amely a hűtőanyag állandó átkeveredését biztosítja és egy olyan berendezéssel van összekötve, amely a hűtőanyag lehűtését szabályozható sebességgel teszi lehetővé.

(4) Mihelyt az edény a hűtőanyagban van, a hőmérsékletet 0,5 °C/perc sebességgel csökkenteni kezdjük. Amikor a hőmérséklet eléri a -40 °C-t, az edényt folyékony nitrogénbe helyezzük, és ott vagy a folyadékban magában vagy pedig a fölötte levő gázatmoszférában tároljuk, ahol a hőmérsékletnek nem szabad meghaladnia a-100 °C-t.

16. példa

A Dactylis glomerata L. embriogén sejttenyészeteinek hidegkonzerválása (A) 1. Dactylis glomerata L. sejtek szuszpenziós tenyészetét 2-10 nappal egy másodlagos tenyészet beoltása után jégre helyezzük és lehűtjük. A fagyasztásisegédanyag-oldatot szokásos módon ugyancsak lehűtjük jégen. A fagyasztási segédanyag 1 mol/1 glicerinből, 1 mol/1 L-prolinból, 2 mol/1 dimetil-szulfoxidból (DMSO) áll vízben (pH 5,6). A fagyasztásisegédanyag-oldatot minden alkalmazás előtt frissen állítjuk elő (a glicerin/prolin/víz keveréket lehet mélyhűtve is tárolni).

2. A fagyasztási segédanyagot 5 perc időtartam alatt adjuk a szuszpenzióhoz. A sejtek ezután állandó jeges hűtés alatt maradnak 1 órán át a hűtőanyagban. Ez alatt az idő alatt vagy ez után az idő után aliquotokat veszünk ki, edényekbe osztjuk el és jégen tartjuk. Az edényeket azután azonos módon kezeljük tovább, ahogyan ezt a kalluszhoz a 15. példában leírtuk.

(B) A hidegkonzerválást a 16.(a) példában leírtak szerint hajtjuk végre, azzal a kivétellel, hogy a hűtőanyag

HU 220 186 Β az (1) eljárási lépésben 1 mol/1 glicerinből, 1 mol/1 szacharózból és 2 mol/1 DMSO-ból áll vízben (pH 5,6).

17. példa

Növekedni képes tenyészetek visszanyerése hidegkonzervált Dactylis glomerata L. anyagból (A) 1. Egy 15. példa szerint kezelt edényt a folyékony nitrogénből kiveszünk.

2. Az edényt addig olvasztjuk, miközben szobahőmérsékleten állni hagyjuk, amíg az összes jég felolvad.

3. Az edények tartalmát GelRite-vel vagy agarral szilárdított SH-0 tenyésztőközegre osztjuk el. Ekkor általában 0,5 ml felengedett anyagot osztunk el egyegy 10 cm átmérőjű Petri-csészén, amely 30-50 ml tenyésztő tápközeget tartalmaz. A szilárd tápközeget vagy ferde formában osztjuk ki vagy pedig a szélein kiüregezzük, hogy az esetleg megmaradó fagyasztási segédanyag lefutása a sejtektől biztosítva legyen.

4. Az anyagot a tápközegen 27 °C hőmérsékleten sötétben inkubáljuk. A növekedés 1-4 hét múlva indul be. Ezekből a kalluszokból azután, amint ezt előzőleg a normális, embriogén kallusznál leírtuk, másodlagos tenyészetet készítünk.

(B) A növekedni képes tenyészetek visszanyerését a hidegkonzervált Dactylis glomerata L. anyagból a 17.(A) példában található leírás szerint végezzük. Az edények felengedtetése a (2) lépésben ez esetben mindig nagyon gyorsan történik, miközben az edényt mintegy 40 °C hőmérsékletű vízfürdőbe helyezzük és addig tartjuk ott, amíg az összes jég felolvad.

18. példa

Zea mays kallusz hidegkonzerválása

Az aktívan növekvő Zea mays kallusz hidegkonzerválását ugyanúgy hajtjuk végre, amint ezt a 15. példában Dactylis glomerata L.-hez leírtuk.

19. példa

Zea mays embriogén szuszpenziós sejttenyészetének hidegkonzerválása

A Zea mays embriogén szuszpenziós sejttenyészetének hidegkonzerválását ugyanúgy hajtjuk végre, amint ezt a 16.(A) és 16.(B) példákban Dactylis glomerata L.hez leírtuk.

20. példa

Növekedni képes tenyészetek visszanyerése hidegkonzervált Zea mays anyagból

A növekedni képes tenyészetek visszanyerését hidegkonzervált Zea mays anyagból ugyanúgy hajtjuk végre, mint ahogyan ezt a 17.(A) és 17.(B) példákban Dactylis glomerata L.-hez leírtuk.

Irodalomjegyzék

1. Abdullah R. és munkatársai: Bio/Technology, 4,

1087-1090(1986);

2. Ábel P. P. és munkatársai: Science, 233, 738 (1986);

3. Adams T. L. és munkatársai: Plánt Cell Reports, 2,

165-168 (1983);

4. Ahloowalia B. S.: Crop Science, 15, 449-452 (1975);

5. Ahloowalia B. S.: „Handbook of Plánt Cell Culture”: szerkesztők: Ammirato és munkatársai; Macmillan kiadó, New York, 91-125. oldal (1984);

ó.Barton K. A. és munkatársai: Plánt Physiol., 85, 1103-1109 (1987);

7. Birk Y. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta, 67, 326-328 (1963);

8. Bright S. W. J. és Johnes M. G. K.: „Cereal Tissue and Cell Culture”, 204-230. oldal (1985); szerkesztők: NijofTM./Junk W. Dr.; Dordrecth;

9. Brown W. V.: Phytomorphology, 10, 215-233 (1960);

10. Cocking E. C. és Davey M. R.: Science, 236, 1259-1262(1987);

11. Fromm Μ. E. és munkatársai: Natúré, 319, 791-793(1986);

12. Gamborg O. és munkatársai: Exp. Cell Rés., 50, 151-158(1968);

13. George E. F. és munkatársai szerkesztésében; kiadó: Exgetics Ltd., Edington, Westbury, Wiltshire, Anglia (1987);

14. Gray D. J. és munkatársai: Plánt Cell Tissue Organ Cult.,4, 123-133 (1985);

15. Gritz L. és Davis I : Gene, 25, 179-188 (1983);

16. Guiseley és Renn: „The Agarose Monograph” Maríné Colloids Division, FMC Corp. (1975);

17. Hammond és munkatársai: J. Bioi. Chem., 259, 9883-9890 (1984);

18. Hanning G. E. és munkatársai: Theor. Appl. Génét., 63, 155-159(1982);

19. Heide: Physiol. Plantarum, 70, 523-529 (1987);

20. Herrera-Estrella L. és munkatársai: Natúré, 310, 115(1984);

21. Hilder V. A. és munkatársai: Natúré, 330, 160-163(1987);

22. Howard és munkatársai: Planta, 170, 535 (1987); 23.1takura K. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc., 97,

7327(1975);

24. Kao N. N. és munkatársai: Planta, 126, 105-110 (1975);

25. Kasperbauer M. J. és munkatársai: Crop Science, 19, 457-460 (1979);

26. Krans J. V. és munkatársai: Crop Science, 22, 1193-1197(1982);

27. Lipke H. és munkatársai: J. Agr. Food Chem., 2, 410-414(1954);

28. Lo P. F. és munkatársai: Crop Science, 20, 363-367 (1980);

29. Loerz H. és munkatársai: Mól. Gén. Génét., 199, 178-182(1985);

30. Lu Ch. és munkatársai: Z. Pflanzenphysiol., 104, 311-318(1981);

31. Luehrs R. és Loerz H.: Theor. Appl. Génét., 75, 16-25 (1987);

32. Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory (1982);

33. Mettler I. J.: GB-2, 140,822 lajstromszámú nagybritanniai szabadalmi leírás;

34. Morelli és munkatársai: Natúré, 315, 200 (1985);

HU 220 186 Β

35. Murashige T. és munkatársai: Physiol. Plánt., 473-479 (1962);

36. Negrutiu I. és munkatársai: Plánt Mól. Biology, 8, 363-373 (1987);

37. Odell J. T. és munkatársai: Natúré, 313, 810 (1985);

38. Paszkowski J. és munkatársai: The EMBO Journal, 3, 2717-2722 (1984);

39. Paszkowski J. és munkatársai: EP 0,164,575 lajstromszámú európai szabadalmi leírás;

40. Pennica P. és munkatársai: Natúré, 301, 214 (1983);

41. Potrykus I. és munkatársai: Theor. Appl. Génét., 199, 209-214 (1979);

42. Potrykus I. és munkatársai: Gén. Génét., 199, 183-188(1985);

43. Randolph L. F.: J. Agric. Research, 53, 881-916 (1936);

44. Rhodes C. és munkatársai: Biotechnology, 6, 56-60 (1988);

45. Roger és Bendich: Plánt Mól. Biology, 5, 69-76 (1985);

46. Rothstein S. és munkatársai: Gene, 53, 153-161 (1987);

47. Ryan C. és munkatársai: Ann. Rév. Plánt Physiol., 24, 173-196(1973);

48. Shillito R. D. és munkatársai: Plánt Cell Reports, 2, 244-247 (1983);

49. Shillito R. D. és munkatársai: Bio/Technology, 3, 1099-1103(1985);

50. Shillito R. D. és munkatársai: EP-0,129,688 lajstromszámú európai szabadalmi leírás;

51. Shoffl F. és munkatársai: Plánt Cell Environ. [idézve Willmitzer L. közleményében: Trends in Genetics, 4, 13 (1988)];

52. Skene K. G. M. és munkatársai: Zeitschr. Pflanzenzüchtung, 90, 130-135 (1983);

53. Spena és munkatársai: EMBO J., 4, 2736 (1985); 54.Stephien P. és munkatársai: Gene, 24, 281-297 (1983);

55.Schenk R. U. és Hildebrandt A. C.: Can. J. Bot., 50,199-204 (1972);

56. Vaeck M. és munkatársai: Natúré, 328, 33-37 (1987);

57. Vasil V. és munkatársai: Z. Pflanzenphysiol., 111, 233-239 (1983);

58. Wienand U. és munkatársai: Mól. Gén. Génét., 182,440-444 (1981);

59. Withers L. A.: Plánt Tissue Culture and Its Agricultural Application;

60. Withers L. A. és Alderson P. G. (szerkesztők), University Press (kiadó), Cambridge, Anglia, 261-276 (1986);

61. Yamada Y. és munkatársai: Plánt Cell Reports, 5, 85-88 (1986).

Claims (33)

1. Embriogén sejttenyészet, amely a Pooideae alcsalád pázsitfűféle növényeiből származik és a protoplasztokból izolálható, amely protoplasztok regenerálják a sejtfalat, osztódnak és végül kalluszt képeznek, amelyből a teljes növény regenerálható, azzal jellemezve, hogy a sejttenyészet előállítására (i) a Pooideae alcsaládból való növények megfelelő részeiből szövetet izolálunk;

(ii) ezt a szövetet egy embriogén kallusz vagy embriók képződését indukáló tápközegben tenyésztjük;

(iii) az embriogén kalluszból, illetve az embriókból periodikus átoltással utódtenyészeteket hozunk létre friss tápközegen, citoplazmadús sejteket tartalmazó kis sejtcsomók friss táptalajba való átvitelével, amely tápközeg folyamatos szaporodást tart fenn, és (iv) 0-500 átvitel után izoláljuk a 150-2000 nm méretű embriogén sejtcsomókat.

2. Az 1. igénypont szerinti embriogén sejttenyészet, azzal jellemezve, hogy a regenerált növények termő növények.

3. Az 1. igénypont szerinti embriogén sejttenyészet, azzal jellemezve, hogy a Pooideae alcsaládbeli növények füvek vagy kismagvú gabonafélék.

4. A 3. igénypont szerinti embriogén sejttenyészet, azzal jellemezve, hogy a füvek a Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus vagy Dactylis nemzetség valamelyikébe tartoznak.

5. A 3. igénypont szerinti embriogén sejttenyészet, azzal jellemezve, hogy a kismagvú gabonafélék az Avena, Triticum, Secale vagy Hordeum nemzetségek valamelyikébe tartoznak.

6. Eljárás protoplasztok előállítására, amelyek teljes növényekké regenerálhatok, a Pooideae alcsalád pázsitfűféle növényeiből kiindulva, azzal jellemezve, hogy (i) a Pooideae alcsaládból való növények megfelelő részeiből szövetet izolálunk;

(ii) ezt a szövetet embriogén kallusz vagy embriók képződését indukáló tápközegben tenyésztjük;

(iii) az embriogén kalluszból, illetve az embriókból periodikus átoltással utódtenyészeteket hozunk létre friss tápközegen, citoplazmadús sejteket tartalmazó kis sejtcsomók friss táptalajba való átvitelével, amely tápközeg folyamatos szaporodást tart fenn;

(iv) 0-500 átvitel (transzfer) után izoláljuk a 150-2000 nm méretű embriogén sejtcsomókat; és (v) megfelelő enzimek segítségével a sejtfalakat eltávolítjuk, és a kapott protoplasztokat izoláljuk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan Pooideae protoplasztokat állítunk elő, amelyek teljes termő növényekké regenerálhatok.

8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépéshez a szövetet a Pooideae alcsaládba tartozó növények fiatal, belül fekvő leveleinek alapmetszeteiből, ivaros úton kapott éretlen embrióiból, éretlen virágzatából, érett magjaiból vagy csíraszöveteiből izoláljuk.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépéshez a szövetet a legfiatalabb, leginkább belül fekvő levelekből izoláljuk.

10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az embriogén sejtcsomókat 0-100 átvitel után izoláljuk.

HU 220 186 Β

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az embriogén sejtcsomókat 3-50 átvitel után izoláljuk.

12. Eljárás sejttenyészet előállítására, amely teljes növényekké regenerálható, a Pooideae alcsalád pázsitfűféle növényeiből kiindulva, azzal jellemezve, hogy (i) a Pooideae alcsaládból való növények megfelelő részeiből szövetet izolálunk;

(ii) ezt a szövetet egy embriogén kallusz vagy embriók képződését indukáló tápközegben tenyésztjük;

(iii) az embriogén kalluszból, illetve az embriókból periodikus átoltással utódtenyészeteket hozunk létre friss tápközegen, citoplazmadús sejteket tartalmazó kis sejtcsomók friss táptalajba való átvitelével, amely tápközeg folyamatos szaporodást tart fenn;

(iv) 0-500 átvitel után izoláljuk a 150-2000 nm méretű embriogén sejtcsomókat;

(v) adott esetben megfelelő enzimek segítségével a sejtfalakat eltávolítjuk, és a kapott protoplasztokat izoláljuk;

(vi) a (v) lépésben kapott protoplasztokat vagy az (iv) lépésben kapott növényi sejteket sejttelepek képződéséig megfelelő tenyésztő tápközegben tenyésztjük;

(vii) a sejttelepeket vagy ezek részeit megfelelő tápközegen, amely elősegíti sejttenyészetek képződését, tenyésztjük; és (viii) az így kapott sejttenyészeteket izoláljuk.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás sejttenyészetek előállítására, amelyek teljes növényekké regenerálhatok, a Pooideae alcsalád pázsitfűféle növényeiből kiindulva azzal jellemezve, hogy (ix) a 12. (v) szerinti protoplasztokat vagy a 12. (iv) szerinti növényi sejteket megfelelő tenyészközegben tenyésztjük sejttenyészetek képződésének elősegítéséhez elegendő időn át, sejttelepek kialakulásáig; és (x) a keletkezett sejttenyészeteket izoláljuk.

14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttenyészet teljes termő növénnyé regenerálható.

15. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttenyészetet szuszpenziós tenyészetként alakítjuk ki.

16. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttenyészetet kallusztenyészetként alakítjuk ki.

17. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (ix) lépést agaróz mint szilárdítóanyagjelenlétében hajtjuk végre.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az agarózzal szilárdított tenyészközeget elfolyósítjuk vagy feldaraboljuk, és az elfolyósított vagy feldarabolt tenyészközeget valamely folyékony tápközegbe visszük át, és ott sejttelepek képződéséig tovább tenyésztjük.

19. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (vii) lépésben a sejttelep részei sejtek, amelyek a sejttelepekből szabadulnak ki.

20. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztok vagy növényi sejtek olyan exogén DNS-t tartalmaznak genomjukba stabilan beépítve, amely természetes úton nem iktatható be a genomba.

21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan exogén DNS-t integrálunk, amely növényi sejtekben kifejezhető.

22. Eljárás a Pooideae családba tartozó pázsitfűféle növények regenerálására, azzal jellemezve, hogy (i) a 12. igénypont szerint előállított sejttenyészeteket embriók képződéséig tenyésztjük;

(ii) az embriókat az ezek érését és csírázását indukáló tápközegben tenyésztjük; és (iii) a kapott fiatal növénykéket olyan fejlődési stádium eléréséig tenyésztjük tovább, amely a földbe való átültetést lehetővé teszi.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás a Pooideae alcsaládba tartozó termő pázsitfűféle növények regenerálására, azzal jellemezve, hogy (i) a 12. igénypont szerint előállított sejttenyészeteket embriók képződéséig tenyésztjük;

(ii) az embriókat ezek érését és csírázását indukáló tápközegben tenyésztjük;

(iii) a kapott fiatal növénykéket tovább tenyésztjük olyan fejlődési stádium eléréséig, amely a földbe való átültetést lehetővé teszi; és (iv) szabályozott vagy nyitott beporzás segítségével magokat nyerünk ki.

24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejttenyészetek olyan exogén DNS-t tartalmaznak genomjukba stabilan beépítve, amely természetes úton nem integrálható a genomba.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtekben kifejezhető exogén DNS-t integrálunk.

26. Eljárás a Pooideae alcsaládba tartozó transzgénikus pázsitfűféle növények előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) a 6. igénypont szerint előállított protoplasztokat ismert transzformációs eljárások segítségével olyan exogén DNS-sel transzformáljuk, amely természetes úton nem építhető be a genomba;

(ii) a transzformált protoplasztokból a 12. vagy 15. igénypont szerint sejttenyészeteket állítunk elő; és (iii) a 22. vagy 23. igénypont szerint teljes növényeket regenerálunk.

27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén DNS-ként egy vagy több olyan kiméra gént alkalmazunk, amely(ek) a transzformált protoplasztoknak, valamint az ezekből kifejlődött szöveteknek és különösen a növényeknek előnyös tulajdonságokat kölcsönöz(nek).

28. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy exogén DNS-ként egy szabályozófunkcióval rendelkező, nem kódoló DNS-t alkalmazunk.

29. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépésben a protoplaszttranszformációhoz közvetlen génátviteli eljárást alkalmazunk.

30. A Pooideae alcsaládba tartozó pázsitfűféle növények és ezek szaporítóanyaga, azzal jellemezve, hogy a növény termő növény, amelyet az 1-5. igénypontok

HU 220 186 Β bármelyike szerinti embriogén sejttenyészetből kiindulva regenerálással állítottunk elő, és amelynek szaporítóanyaga a növényi genomba stabilan integrálva olyan exogén DNS-t tartalmaz, amely a növényekben vagy növényi sejtekben kifejeződik és természetes úton nem integrálható a genomba.

31. A 30. igénypont szerinti szaporítóanyag, azzal jellemezve, hogy ez olyan növényi anyag, amely szexuálisan vagy aszexuálisan, valamint in vitro vagy in vivő szaporítható.

32. A 31. igénypont szerinti szaporítóanyag, azzal jellemezve, hogy ez olyan protoplaszt, sejt, kallusz, szövet,

5 szerv, zigóta, embrió vagy mag, amely a 30. igénypont szerinti transzgénikus Pooideae növényekből származik.

33. A 30. igénypont szerinti növények utódai, azzal jellemezve, hogy genomjuk exogén DNS-t tartalmazza.