SK283603B6 - Embryogénna bunková kultúra odvodená od lipnicových rastlín podčeľade Pooideae, spôsob prípravy protoplastov a bunkovej kultúry schopných regenerácie na kompletné rastliny, spôsob regenerácie uvedených lipnicových rastlín, lipnicovité rastliny, ich propaguly a potomstvo - Google Patents

Abstract

Je opísaná regenerácia rastlín z čeľade Gramineae z podčeľade Pooideae z protoplastov. Uvedené sú embryogénne bunkové kultúry, ako aj kalusy, ktoré slúžia ako východiskový materiál pre protoplasty, ktoré potom môžu regenerovať na celé rastliny. Taktiež je opísaný spôsob výroby uvedených embryogénnych bunkových kultúr, ako aj transgénne rastliny z podčeľade Pooideae, ktoré sa regenerujú z geneticky modifikovaných protoplastov. ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka tráv z podčeľade (Subfamilia) Pooideae, ktoré sa regenerujú z protoplastov, ktoré pochádzajú z protoplastov s regenerovanými bunkovými stenami (rastlinných buniek) alebo z kalusov, ktoré pochádzajú z protoplastov, ako aj všeobecne použiteľného spôsobu regenerácie týchto rastlín. Ďalším predmetom vynálezu sú embryogénne bunkové kultúry (suspenzné kultúry alebo kultúry kalusu), ako aj kalusy, ktoré slúžia ako východiskový materiál pre protoplasty, ktoré potom môžu regenerovať na celé rastliny. Vynález taktiež zahrnuje spôsob výroby uvedených embryogénnych bunkových kultúr, konzerváciu chladením (kryokonzerváciu) embryogénnych bunkových kultúr a embryogénneho kalusu, ako aj transgénne rastliny z podčeľade Pooideae, ktoré sa regenerujú z geneticky modifikovaných protoplastov.

Doterajší stav techniky

Väčšina rastlín, od ktorých je prvom rade závislá výživa ľudí, patrí ku skupine rastlín, ktoré sú známe pod hromadným názvom Graminaea. Graminaea (Poaceae - lipnicovité) sú z hľadiska komerčného pohľadu najvýznamnejšou čeľaďou vnútri Linného sústavy jednoklíčnolistových rastlín. K trávam patria napríklad nasledujúce podčeľade a rody:

Podčeľaď	Rod vnútri podčeľade
Bambusoideae	Bamboo
Andropogonoideae	Saccharum (cukrová trstina) Sorghum Zea (kukurica)
Arundineae	Phragmites
Oryzoideae	Oryza (ryža)
Panicoideae	Panicum (*) Pennisetum (*) Setaria (*)
Pooideae (Festuciadeae)	Poa (**) Festuca (**) Lolium (**) Bromus (**) Trisetum (**) Agrostis (**) Phleum (**) Dactylis (**) Alopecurus (**) Avena (ovos Λ) Triticum (pšenica Λ) Secale (raž Λ) Hordeum (jačmeň Λ)

* proso ** trávy ^Λ obilie s malým zrnom

Vzhľadom na ekonomické hľadiská tvorí Pooideae vnútri podčeľade Gramineae veľmi významnú podskupinu rastlín. K tomu patria napríklad aj obidve veľmi blízko príbuzné pododrody tráv a obilia s malým zrnom.

Je zaujímavé, že práve rastliny z tejto podčeľade Pooideae patria k rastlinám, s ktorými sa pomocou vedeckých metód dá najnamáhavejšie manipulovať. V súlade s tým, nie sú až dodnes známe žiadne všeobecné spôsoby, ktoré dovoľujú regeneráciu rastlín, fertilných rastlín alebo trans génnych rastlín so stabilne včlenenou exogénnou DNA z podčeľade Pooideae vychádzajúc z protoplastov, aj keď takáto regenerácia z kultivovaných protoplastov, napríklad na použitie na somatickú hybridizáciu a na výrobu transgénnych rastlín pomocou priameho prenosu génu, je predpokladom. Terajší stav vedomostí v oblasti transformácie obilia bol krátko zhrnutý v prehľadnom článku Cocking a Davey, 1987.

Opis východiskového materiálu pre kultúry obilia, protoplastov, ako aj spôsobu izolácie protoplastov z obilia a o ich vlastnostiach je zverejnený napríklad v publikácii „Cereal Tissue and Celí Culture“, Bright SWJ a Jones MGK, (eds) (1985) Nijhoff K., Junk W„ Dordrecht.

Stabilná transformácia sa dala dosiahnuť už chemicky a elektricky stimulovaným včlenením DNA do protoplastov („Direkter Gentransfer“, Potrykus a kol., 1985; Lórz a kol., 1985; Fomm a kol., 1986), zatiaľ čo regenerácia celej rastliny, vychádzajúc v tejto štúdii z línie buniek, nebola možná.

Až doteraz sa dali s úspechom regenerovať len také rastliny zo skupiny Gramineae, ktoré nepatria k podčeľadi Pooideae. Abdullah a kol. (1986) informujú o eficientnej regenerácii rastlín pomocou somatickej embryogenézy, pričom vychádzajú z protoplastov ryže (podčeľaď Oryzoideae). Aj Yamada a kol. (1986) opisujú regeneráciu rastlín pri ryži vychádzajúc z kalusov, ktoré sa odvodzujú z protoplastov. Rhodes a kol. (1988) opisujú regeneráciu nefertilných rastlín kukurice. Cocking a Davey (1987) diskutujú o prítomnom stave vedomostí v oblasti prenosu génov pri rastlinách obilia.

Regenerácia rastlín čeľade Gramineae a podčeľade Pooideae vychádzajúca z tkanivových kultúr je známa. Hanning a kol. (1982) opisujú vývoj embrya a klíčkov pri Dactylis glomerata L., pričom vychádzajú z tkaniva kalusu, ktoré sa vyvíja z listových segmentov.

Ďalej sú uvedené príklady ďalších rastlín z podčeľade Pooideae, ktorých regenerácia z kultivovaných buniek je opísaná v nasledujúcich článkoch:

Loliuin rigidum (Skene a kol., 1983); Lolium perenne, Lolium multiflorum (Ahloowalia, 1975); Lolium multiflorum, Festuca arundinaceae (Kasperbauer a kol., 1979); Alopecurus arundinaceus, Agropyron erystatum, Stipa viridula, Bromus inermis, Agropyron smithii (Lo a kol., 1980) a Agrostis palustris (Krans a kol., 1982).

Ďalší prehľad o tkanivových kultúrach sa nachádza v Ahloowalia, 1984.

V uvedených prípadoch regenerácia nevychádza z rovnakého východiskového materiálu, ktorý je uvedený v predloženom vynáleze, ale z iného typu bunkovej kultúry. V žiadnom z uvedených príkladov sa nedokázalo, že sa regenerácia uskutočňuje de novo cez somatickú embryogenézu. Citované referencie okrem toho neobsahujú žiadne údaje o izolácii a kultivácii protoplastov alebo regenerácii rastlín z protoplastov.

Z toho vyplýva, že napriek veľkému záujmu o genetickú transformáciu a regeneráciu tráv z podčeľade Pooideae, až dodnes neexistuje žiadny spôsob in vitro, ktorý dovoľuje úspešne regenerovať rastliny alebo fertilné rastliny z protoplastov, ktoré môžu byť prípadne transformované (Cocking a Davey, 1987).

Až doteraz zostal celý výskum a snahy vyvíjané v tomto smere bez výsledkov, to znamená, že vedú buď iba k embryám alebo aj k rastlinám, ktoré nie sú schopné života, a ktoré už v ranej vývojovej fáze odumierajú, a preto nie je možné úspešne ich presádzať do zeme (Ahloowalia, 1984).

Vzhľadom na uvedené fakty, až doteraz nemala verejnosť k dispozícii žiadny spôsob, ktorý by umožňoval výro bu protoplastov z podčeľade Pooideae, ktoré by boli schopné diferenciácie na celé rastliny a výhodne na celé fertilné rastliny, ako aj spôsob regenerácie rastlín z podčeľade Pooideae vychádzajúc z protoplastov alebo z kalusov, ktoré pochádzajú z protoplastov.

Tieto a iné úlohy by mohli byť teraz vyriešené v rámci predloženého vynálezu, ktorý opisuje spôsob výroby protoplastov, ktoré sú schopné vytvoriť kolónie buniek a kolónie kalusu. Protoplasty sa môžu, ak sa to požaduje, transformovať, pričom vznikajúce kalusy sú schopné regenerovať sa na celé rastliny (Pooideae). Uvedený spôsob výroby protoplastov, ktoré sú schopné deliť sa a vyvinúť kalus, ktorý sa potom môže regenerovať na celé rastliny, vyžaduje nové embryogénne bunkové kultúry (suspenzné kultúry alebo kalusové kultúry) alebo embryá ako východiskový materiál. Tieto embryogénne bunkové kultúry a embryá, ako aj spôsob ich výroby a identifikácia sú opísané v predloženom vynáleze a tvoria taktiež súčasť tohto vynálezu.

Ako východiskový materiál pre protoplasty sa môže okrem toho používať embryogénny kalus, z ktorého sa odvodzujú suspenzie. Tento kalus, ako aj suspenzie, embryá a spôsob ich výroby a identifikácie sú opísané v predloženom vynáleze a tvoria taktiež súčasť vynálezu.

Tieto embryogénne kultúry tvoria zdroj protoplastov, ktoré sa môžu transformovať exogénnou DNA, a z ktorých sa potom delia bunky a vytvára sa kalus. Tento kalus sa môže potom regenerovať na celé rastliny vrátane celých fertilných rastlín, ktoré sú schopné rásť v zemi.

V čase, keď vznikal tento vynález, nebolo možné odvodiť zo stavu techniky, že je možné regenerovať trávy, najmä fertilné trávy z podčeľade Pooideae vychádzajúc pritom od protoplastov alebo aj od buniek alebo kalusov, ktoré pochádzajú z protoplastov. Ešte menej sa dalo predvídať, že sa protoplasty rastlín z podčeľade Pooideae, ktoré obsahujú exogénnu DNA stabilne včlenia do ich genómu, a taktiež regenerovať za vzniku transgénnych rastlín, ale najmä za vzniku fertilných transgénnych rastlín.

Podstata vynálezu

Tento vynález sa týka v prvom rade embryogénnych bunkových kultúr (suspenzných alebo kalusových kultúr), ktoré sa odvodzujú od tráv z podčeľade Pooideae, z ktorých sa môžu izolovať protoplasty, pričom uvedené protoplasty najskôr regenerujú bunkové steny, delia sa a ľahko vytvárajú kalus, ktorý sa môže regenerovať na celú rastlinu vrátane celých fertilných rastlín.

Predmetom vynálezu je teda embryogénna bunková kultúra, ktorá je odvodená od lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, a z ktorej ktorých dochádza k regenerácii bunkových stien, a ktoré sa oddelia a nakoniec vytvoria kalus schopný regenerácie na kompletnú rastlinu, ktorá sa dá získať:

a) izoláciou tkaniva z vhodných častí rastlín podčeľade Pooideae;

b) kultiváciou tohto tkaniva v médiu, ktoré je schopné indukovať vytvorenie embryogénneho kalusu alebo embryí;

c) periodickou subkultiváciou kalusu a embryí na čerstvom médiu prenesením malých bunkových zhlukov obsahujúcich bunky bohaté na cytoplazmu na čerstvé médium schopné udržať kontinuálnu proliferáciu; a

d) po 0 až 500 prenosoch izoláciou zhlukov embryogénnych buniek s veľkosťou od 150 pm do 2000 pm.

Predložený vynález sa okrem toho opisuje protoplasty rastlín z podčeľade Pooideae a z nich rezultujúce rastlinné bunky (po regenerácii bunkových stien), ktoré sa môžu re generovať na celé rastliny, a výhodne na celé fertilné rastliny, a najmä aj protoplasty, ktoré pochádzajú z bunkových kultúr alebo embryogénnych suspenzii buniek.

Vynález sa ďalej týka aj rastlinných buniek, kalusov, embryogénnych suspenzií buniek, embryí, mladých rastlín, ako aj rastlín, ktoré sa odvodzujú z uvedených protoplastov.

Okrem toho zahrnuje predložený vynález regenerované rastliny tráv z podčeľade Pooideae, ako aj ich rozmnožovacie materiály, ktoré sa odvodzujú z protoplastov alebo rastlinných buniek, ktoré obsahujú exogénnu DNA včlenenú do ich genómu, a výhodne exogénnu DNA, ktorá sa môže v rastlinách exprimovať. Pod pojmom rozmnožovací materiál sa v rámci tohto vynálezu rozumie každý materiál, ktorý sa dá sexuálne alebo asexuálne, alebo aj in vitro alebo in vivo rozmnožovať, pričom výhodné sú protoplasty, bunky, kalusy, tkanivá, zygoty, embryá, pele alebo semená, ktoré sa môžu získať z transgénnych rastlín podčeľade Pooideae, ako aj mutanty a varianty odvodené z týchto rastlín vrátane tých, ktoré sa odvodzujú z rastlín, ktoré sa získali somatickou fúziou rastlín, genetickou modifikáciou alebo selekciou mutantov.

Okrem toho sa tento vynález týka aj spôsobu výroby protoplastov a rastlinných buniek rastlín z podčeľade Pooideae, ktoré sa môžu regenerovať na celé rastliny, výhodne na celé fertilné rastliny, ďalej sa týka spôsobu výroby kalusov, ktoré sa odvodzujú z uvedených protoplastov alebo rastlinných buniek a sú schopné regenerovať, pričom vznikajú celé rastliny, najmä celé fertilné rastliny. Ďalej sa predložený vynález týka spôsobu regenerácie rastlín z podčeľade Pooideae vychádzajúc z uvedených kalusov. Tento spôsob je ďalej podrobne opísaný.

Tieto a ďalšie predmety predloženého vynálezu sú zverejnené v nasledujúcom opise.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: ukazuje kolónie Dactylis glomerata L., ktoré pochádzajú z protoplastov, a ktoré rastú v agarózovom klatráte, ktorý je suspendovaný v kvapalnom médiu.

Obrázok 2: ukazuje mladú rastlinu, ktorá sa vyvinie z protoplastov odvodených od kalusu Dactylis glomerata L., ktorý rastie na médiu SH-0.

Obrázok 3: ukazuje nádobu s mladou rastlinou s korienkami, ktorá sa vyvíja z kalusu Dactylis glomerata L. rastúcom na médiu SH-0, ktorý sa odvodzuje z protoplastov.

Obrázok 4: ukazuje rastlinu Dactylis glomerata L., ktorá bola regenerovaná protoplastov (vľavo) spolu s divým typom rastliny Dactylis glomerata L. (vpravo).

Obrázok 5: ukazuje plazmid pCIB709, ktorý sa môže použiť na transformáciu protoplastov Dactylis glomerata L., aby im prepožičal odolnosť proti hygromycínu. Plazmid pCIB709 bol 12. februára 1988 uložený podľa ustanovenia Budapeštianskej zmluvy v „Američan Type Culture Collection“ v Rockville, Maryland, USA pod depozitným číslom ATCC40428.

Legenda: 35S: 35S oblasť promótora

Hygro-gény: štruktúrny gén hygromycínfosfotransferáza (APH typ IV)

35S term.: oblasť CaMV s miestom 3'polyadenylácie 35S transkriptu CaMV

Obrázok 6: ukazuje „Southern bloť* analýzu DNA rôznych kalusov Dactylis glomerata L., ktoré boli získané po transformácii protoplastov s plazmidom pCIB709. Analýza sa uskutočnila pomocou fragmentu Xbal-Ssl, ktorý slúžil ako molekulárna sonda.

rad 1,2 10 ng a 2 ng pCIB709 štiepené reštrikčnou endonukleázou BamHl rad 4-8 DNA z kultúr kalusov Dactylis glomerata L., štiepená BamHl, odvodených z protoplastov, ktoré boli predtým transformované pCIB709 rad 9,17 DNA štiepená BamHl. z netransformovaného kalusu odvodeného z protoplastov Dactylis glomerata L.

rad 10,13: DNA štiepená BamHl z kultúr kalusov Dactylis glomerata L. odvodených z protoplastov, ktoré boli predtým transformované pCIB709 rad 14 DNA štiepená BamHl z kultúr kalusov Dactylis glomerata L. odvodených z protoplastov, ktoré boli predtým transformované pCIB709 rad 15,16 DNA štiepená BamHl z kultúr kalusov Dactylis glomerata L. odvodených z protoplastov, ktoré boli predtým transformované pCIB709 rad 4 prázdny

V radoch 6, 10 a 12 možno pozorovať sčernenie filmu na prítomnosť cudzej DNA, ktorá je včlenená do genómu buniek Dactylis glomerata L.. Fragment obsahujúci 1063 bp, ktorý sa dá očakávať pri štiepení integrovaného génu hygromycínu z plazmidu pCIB709 endonukleázou BamHl (nukleotidy 583-1646 sú z pCIB709), je označený šípkou.

Definície

Na jasné a jednoznačné porozumenie opisu a definícii predmetu vynálezu, ako aj uvedeným pojmom, stanovia sa nasledujúce definície.

Rastlinná bunka: štruktúrna a fyziologická jednotka rastliny, ktorá pozostáva z protoplastu a bunkovej steny.

Rastlinné tkanivo: skupina rastlinných buniek, ktorá je organizovaná do formy štruktúrnej a funkčnej jednotky.

Rastlinný orgán: vymedzená a viditeľne diferencovaná oblasť rastliny, ako napríklad koreň, stonka, listy, puky alebo embryá.

Rastlinný orgán môže byť vybudovaný z rôznych typov buniek a tkaniva.

Protoplast: izolovaná rastlinná bunka bez bunkovej steny.

Bunková kultúra: proliferačná bunková hmota v nediferencovanom alebo čiastočne diferencovanom stave.

Embryo: veľmi malé a včasné vývojové štádium rastliny, ktoré sa vyvíja buď zo zygoty (sexuálne embryo) alebo z embryogénnej somatickej bunky (somatické embryo) a vykazuje už štádiá s rozoznateľnou morfológiou, štruktúrou a bunkovou organizáciou, ktorá zahrnuje bunkové, globuláme, ako aj kotyledónne štádiá (vývoj embrya kukurice je napríklad opísaný Randolphom, 1936, vývoj embrya tráv Brownom, 1960).

Bunkový klaster: skupina navzájom spojených buniek, ktoré sú k sebe pripútané, obvykle vznikajú tieto bunkové klastre z jednej alebo niekoľkých prvotných buniek alebo prvotných protoplastov delením bunky.

Mladá rastlina: viacbunková štruktúra, ktorá pozostáva z výhonku a koreňa a vykazuje vonkajšiu formu malej rastliny.

Dicamba: 3,6-dichlór-2-metoxybenzoová kyselina.

MES: 2-(N-morfolín)etánsulfónová kyselina.

2,4-D: dichlórfenoxyoctová kyselina.

Picloram: 4-amino-3,6,6-trichlórpikolínová kyselina.

Tris-HCl: a,a,a-tris(hydroxymetyl)nietylammohydrochlorid.

EDTA: l-etyldiamín-N,N,N',N'-tetraoctová kyselina.

PEG: polyetylénglykol.

Agaróza: výroba a čistenie agarózy je opísané Guisele ym a Rennom (1975). Agaróza je súčasť agaru. Komerčne získateľný agar normálne pozostáva zo zmesi neutrálnej agarózy a iónového agaropektínu, ktorý obsahuje viac bočných skupín. Predávaná agaróza sa obvykle získava známym spôsobom z agaru. Pritom zostane obvykle zachovaný rad bočných reťazcov, ktoré potom určujú fyzikálnochemické vlastnosti agarózy, ako napríklad teplotu gélovatenia a teplotu topenia. Agaróza topiaca sa pri nízkych teplotách (Low-melting Agarose), najmä Sea Plaque® Agarose, sa hodí obzvlášť dobre ako stužovací prostriedok v rámci spôsobu podľa vynálezu.

SH-0 médium: médium bez hormónov podľa Schenka a Hildebrandta (1972). (SH-médium môže byť kvapalné alebo spevnené 0,8 % (hm./obj.) agarom alebo 0,5 % (hm./obj.) GelRite®.) Médium sa normálne sterilizuje pomocou známych postupov teplom alebo v autokláve pri teplote 121 °C a pri tlaku 1,2 kg/cm² počas 15 až 20 minút.

GelRite®: GelRite Gellan Gum, Scott Laboratories Inc., Feskersville, RI, # 02823.

SH-30 médium: SH-0 médium s 30 μΜ dicambou. SH-45 médium: SH-0 médium s 45 μΜ dicambou. KM-8p médium: 8p médium podľa Kao a kol. (1975). Toto médium môže existovať kvapalné alebo spevnené agarom, agarózou alebo GelRite® a môže sa vyrobiť a používať práve tak dobre bez kyseliny askorbovej, vitamínu A a vitamínu D. Súčasti média s výnimkou stužovacieho prostriedku, sa obvykle sterilizujú pomocou filtrácie filtrom s veľkosťou pórov 0,2 pm.

RY-2 médium: médium podľa Yamada a kol. (1986).

OMS médium: médium podľa Murashige a Skooga (1962). Médium sa môže stužiť napríklad 0,8 % (hm./obj.) agarom alebo agarózou alebo 0,5 % (hm./obj.) GelRite®. Na použitie opísané v predloženej prihláške sa môže vyrobiť aj tak, že má vitamínové zloženie B5 média podľa Gramborga a kol. (1968).

Celuláza RS: Cellulase RS, Yakult Honsha Co., Ltd., 1,1,19 Highashi-Shinbashi, Minato-ku, Tokyo 105, Japonsko.

Pectolyase Y-23®: Seishín Pharmaceutical Co., Ltd., 413 Koami-cho, Nihonbashi, Tokyo, Japonsko.

Parafilm®: Parafilm® laboratory film - Američan Can Co., Greenwich, CT, 06830, USA.

Nalgene®-Filter: Nalge Co., Division of Sybron Corp. Rochester, New York, 14602, USA.

RglII: reštrikčný enzým RglII, New England Biolabs 32 Tozer Road, Beverley, MA, 01915, USA alebo akýkoľvek iný výrobca.

BamHl: reštrikčný enzým BamHl, New England Biolabs 32 Tozer Road, Beverley, MA, 01915, USA alebo akýkoľvek iný výrobca.

Hydrolyzát kazeínu: enzymatický hydrolyzát z kravského mlieka, typ I, Sigma Co., PO BOX 14508, St. Louis, MO 63178, USA.

Hygromycín B: cytotoxín: hygromycín B, čistený, kat. č. 400050 Calbiochem Behring Diagnostica, La Jola, CA 92037, USA, č. šarže 702296.

GeneScreen Plus®: kat. č. NEF 976, NEN Research Products 549 Albany St., Boston, MA 02118, USA.

TBE pufor: Tris-borátový pufor - obvykle používaný pufor pri elektroforézach (pozri Maniatis a kol. (1982).

Spin stĺpec: Sephadex® G25, hotový balený stĺpec, kat. č. 100402, Boehringer Mannheim Biochemicals, Pistcataway, NJ, USA.

SDS: dodecylsulfát sodný.

SSC: 1,54 mM NaCl, 0,154 mM citrát sodný, podľa opisu v Maniatis a kol. (1982).

CETAB: hexadecyltrimetylamónium bromid.

IBI Random Primer Kit: „Prime Time“ Random Primer Kit, Intemational Biotechnologies Inc., PO BOX 1565, New Haven, CT 0706, USA (kat. č. 77800, č. šarže F630-01).

V rámci tohto vynálezu bolo teraz možné s prekvapením ukázať, že rastliny z čeľade Gramineae, najmä fertilné rastliny z tejto čeľade z podčeľade Pooideae, je možné regenerovať, pričom sa vychádza z špecifického typu protoplastov, ako aj buniek a kalusov, ktoré pochádzajú z týchto protoplastov.

Táto regenerácia rastlín, najmä fertilných rastlín, je možná aj vtedy, keď protoplasty obsahujú exogénnu DNA. Pritom ide výhodne o DNA včlenenú stabilne do genómu protoplastov, ktorú možno v rastlinách exprimovať.

Všetky lipnicovité rastliny z podčeľade Pooideae je možné použiť v rámci tohto vynálezu. Výhodné sú ale rastliny z podčeľade Pooideae, ktoré patria k trávam, tak napríklad všetky rody vybrané zo skupiny zahrnujúcej Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus a Dactylis. Výhodné sú najmä rastliny Dactylis.

V rámci tohto vynálezu sú takisto výhodné rastliny z podčeľade Pooideae, ktoré patria ku skupine obilia s malými zrnami, tak napríklad všetky rody vybrané zo skupiny zahrnujúcej Avena (ovos), Triticium (pšenicu), Secale (raž) aHordeum (jačmeň).

Špecifický typ protoplastov z Pooideae, ktorý sa delí a vytvára bunkové kultúry, ktoré sú schopné regenerovať sa na celé rastliny, pochádza z bunkových kultúr, najmä z embryogénnych bunkových kultúr. Pri embryogénnych bunkových kultúrach ide výhodne o embryogénne suspenzné kultúry a kalusové kultúry. Bunkové kultúry sa môžu pripraviť z vhodných častí rastlín z podčeľade Pooideae. Pod pojmom vhodné časti rastlín sa v rámci tohto vynálezu rozumejú napríklad bazálne časti mladých vnútri ležiacich listov, nezrelé sexuálne embryá, nezrelé kvetenstvo, zrelé semená alebo tkanivá klíčkov, ktoré pochádzajú z podčeľade Pooideae, pričom sa neobmedzujú len na tieto.

Spôsobový krok A: výroba embryogénnych suspenzií z rastlinného tkaniva

Pri príprave embryogénneho kalusu sa vychádza z vhodnej časti rastliny z podčeľade Pooideae, spravidla z bazálnej časti mladého listu. Obzvlášť vhodné sú mladšie vnútri ležiace listy rastlín z podčeľade Pooideae. Uvedený spôsobový krok uskutočňovať analogicky, ako to opísal Hanning a kol. (1982) pre Dactylis glomerata L.. Spôsob, ktorý opisuje, nie je obmedzený len na tento druh, ale môže sa použiť aj pre ostatné rastliny z podčeľade Pooideae. Uvedená publikácia je vo forme referencie časťou predloženého vynálezu.

Listy sa rozrežú napríklad na malé úseky alebo segmenty 1 mm až 5 mm dlhé alebo s priemerom 1 mm až 5 mm. Tvar ani veľkosť týchto kúskov listov nie je kritická. Segmenty sa vložia do média vhodného na indukciu a zachovanie kalusu a na tomto médiu sa kultivujú až do vytvorenia kalusu a/alebo embryogénnych štruktúr. Médium vhodné na tento účel je napríklad SH médium (Shenk a Hildebrandt, 1972) s 30 μΜ dicambou a 0,8 % (hm./obj.) agarom alebo agarózou ako prostriedkom na gélovatenie. Ďalšie vhodné médiá sú opísané Georgom a kol. (1987). Kalus a/alebo embryogénne kultúry sa objavia spravidla 2 až 6 týždňov po vložení do média. Iniciácia a uchovávanie kalusu sa môže uskutočňovať na svetle, ale výhodne za tmy, pri teplote medzi 0 °C až 50 °C, výhodne pri teplote medzi 20 °C až 32 °C a úplne výhodne pri teplote medzi 25 °C až 28 °C. Embryogénny kalus sa môže pripraviť aj pomocou iných známych spôsobov, ktoré sú opísané naprí klad Lúhrsom a Lorzom (1987), ako aj v referátoch obsiahnutých v tejto práci pre jačmeň. Uvedené spôsoby sa môžu používať aj pre iné rastliny z podčeľade Pooideae a tvoria v zodpovedajúcej forme referátu súčasť tohto vynálezu.

Základ embryogénnych suspenzných kultúr začína tým, že sa čerstvé kusy embryogénneho kalusu dajú do vhodného kvapalného média, napríklad 0,5 g kalusu do 50 ml kvapalného média podľa Graya a kol. (1985), ktoré obsahuje 45 μΜ dicambu a 4 g/1 hydrolyzátu kazeínu. Ďalšie vhodné médiá sú opísané napríklad Georgom a kol. (1987). Suspenzné kultúry rástli pri teplote medzi 10 °C až 40 °C, výhodne medzi 20 °C až 32 °C, a obzvlášť výhodne pri teplote medzi 25 °C až 30 °C. Počas kultivačnej periódy môže byť vhodné striedanie fáz svetla a tmy. Suspenzia sa výhodne kultivuje pri 5 až 20 hodinovej perióde svetla, výhodne ale pri 16 hodinovej perióde svetla, nasledované 5 až 20 hodinovou, výhodne ale 8 hodinovou periódou tmy. Intenzita svetla sa pohybuje charakteristicky medzi 0,1 pE/'m²s až 100 μΕ/ m²s (E=einstein, m=meter, s=sekunda), výhodne ale medzi 30 μΕ/nrs až 80 pE/m²s. Taktiež je výhodné, keď sa suspenzia počas fázy kultivácie pohybuje. Pohyb suspenziou sa môže uskutočňovať v Delongových fľašiach, ktoré sú utesnené filmom z plastu prepúšťajúcim pre svetlo a plyn alebo akýmkoľvek iným ľubovoľným vhodným uzáverom, na kruhovej trepačke pri rýchlosti otáčok 100 Upm až 150 Upm. Asi po troch až piatich týždňoch sa nechajú väčšie aglomeráty buniek asi 30 sekúnd sedimentovať, horná vrstva, ktorá obsahuje len malé zhluky buniek sa odstráni a zvyšok sa prenesie na iniciáciu nových kultúr do čerstvého média.

Tieto spôsobové kroky sa môžu periodicky, výhodne každé 3 až 4 týždne opakovať, pričom sa používajú len tie kultúry, ktoré sľubujú najväčší úspech, merané vzhľadom na malú veľkosť, ako aj kvalitu bunkových hrudiek. Po 4 až 20, spravidla po 6 až 8 prenosoch sú suspenzie v podstate zbavené neembryogénnych buniek a väčšina embryogénnych aglomerátov vykazuje charakteristickú veľkosť 150 pm až 2000 μηι.

V rámci vynálezu je obzvlášť výhodný spôsob, ktorý vedie k príprave embryogénnych suspenzií, ktoré vykazujú v prvom rade malé preembryonálne hmoty buniek. Podiel preemryonálnych bunkových hmôt sa môže významne zvýšiť ešte tým, že sa najskôr nechá sedimentovať väčší materiál a nakoniec sa znovu kultivuje len časť suspenzie nachádzajúca sa hore.

Predmet vynálezu sa teda týka embryogénnej bunkovej kultúry, suspenznej kultúry alebo kalusovej kultúry, ktoré sa odvodzujú od lipnicovitých rastlín z podčeľade Pooideae a môžu sa izolovať z protoplastov, pričom uvedené protoplasty sú schopné regenerovať bunkové steny, deliť sa a vytvárať kalus. Uvedený kalus sa potom môže regenerovať na celú rastlinu, najmä ale na celú fertilnú rastlinu.

Obzvlášť výhodné sú v rámci predloženého vynálezu embryogénne bunkové kultúry (suspenzné kultúry a kalusové kultúry) tráv, najmä tráv vybraných z rodov zahrnujúcich Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus a Dactylis. Výhodné sú najmä bunkové kultúry Dactylis glomerata L.

Ďalšie výhodné predmety v rámci predloženého vynálezu sa týkajú embryogénnych bunkových kultúr (suspenzných a kalusových kultúr) obilia s malými zrnami, najmä obilia vybraného z rodov Avena, Triticum, Secale a Hordeum.

Ďalší predmet predloženého vynálezu sa týka embryogénneho kalusu, ktorý' sa odvodzuje od lipnicovitých rastlín z podčeľade Pooideae a môže sa izolovať z protoplastov, pričom uvedené protoplasty sú schopné regenerovať bun kove steny, deliť sa a vytvárať kalus, ktorý sa potom sám môže regenerovať na celé rastliny, výhodne na celé fertilné rastliny.

Obzvlášť výhodný je v rámci predloženého vynálezu kalus tráv, najmä tráv vybraných z rodov zahrnujúcich Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus a Dactylis. Obzvlášť výhodný je embryogénny kalus Dactylis glomerata L.

Ďalší predmet v rámci predloženého vynálezu sa týka embryogénneho kalusu, ktorý sa odvodzuje od tráv s malými zrnami, najmä z obilia vybraného z rodov zahrnujúcich A vena, Triticum, Secale aHordeum.

Predkladaný vynález zahrnuje taktiež lipnicovité rastliny, najmä fertilné lipnicovité rastliny z podčeľade Pooideae a ich rozmnožovací materiál, ktorý sa dá regenerovať, pričom sa vychádza z protoplastov alebo z rastlinných buniek, ktoré pochádzajú z embryogénnej bunkovej kultúry.

Spôsob konzervácie v chlade (kryokonzervácia) bunkových kultúr (suspenzných a kalusových kultúr) u lipnicovitých

Niektoré rastlinné tkanivá sa môžu pomocou známych spôsobov, ktoré sú opísané napríklad Withersom a kol. (1986) a v ňom citovaných referenciách, konzervovať v chlade. Tieto spôsoby nie sú ale všeobecne použiteľné, najmä nie na konzervovanie v chlade embryogénnych bunkových kultúr (suspenzných a kalusových kultúr) lipnicovitých.

V rámci predloženého vynálezu sa teraz s prekvapením ukázalo, že je možné uchovávať embryogénne bunkové kultúry vrátane suspenzných a kalusových kultúr, všetkých rastlín z čeľade Gramineae v suspendovanej forme, a síce konzerváciou v chlade (kryokonzerváciou) pri nízkych teplotách.

Tieto spôsoby konzervácie embryogénnych bunkových kultúr vrátane suspenzných a kalusových kultúr, ktoré sa odvodzujú z rastlín čeľade Gramineae, v chlade zahrnujú nasledujúce kroky:

a) dispergovanie aktívne rastúcich buniek suspenzných kultúr alebo kalusov vo vhodnom kvapalnom médiu,

b) ochladenie tejto kultúry až do blízkosti teploty mrazu (asi 0 až 5 °C),

c) zmiešanie uvedenej vopred ochladenej kultúry s vodným roztokom vhodného prostriedku chrániaceho kultúru pred mrazom pri približne rovnakej teplote,

d) ochladzovanie výslednej zmesi v pravidelných časových intervaloch asi 0,01 °C až asi 20 °C za minútu, výhodne asi o 0,2 °C až asi 2 “C za minútu a úplne najvýhodnejšie o asi 0,5 °C až asi 1 °C za minútu, na teplotu medzi asi -20 °C až asi 60 °C, výhodne na teplotu medzi asi -35 °C až asi 50 °C a najvýhodnejšie na teplotu medzi asi -38 °C až asi 44 °C.

e) zmrazenie vopred ochladenej zmesi šokom v kvapalnom dusíku alebo v kvapalnom vzduchu, a

f) uchovávanie hlboko zmrazenej zmesi pri teplote pod -100 °C, výhodne pri teplote kvapalného dusíka alebo kvapalného vzduchu.

Uvedený spôsob konzervácie embryogénnych bunkových kultúr (suspenzných a kalusových kultúr) v chlade je všeobecne použiteľný pre všetky rastliny z čeľade Gramineae, ako sú rastliny z podčeľade Bambusoideae (napríklad bambus), Andropogonoideae (napríklad Saccharum, Sorghum a Zea), Arundineae (napríklad Pharmites), Oryzoideae (napríklad Oryza), Panicoideae (napríklad Panicum, Pennisetum a Setaria), tak aj rastliny z počeľade Pooideae (napríklad trávy vrátane Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus a Dactylis alebo obilie s malými zrnami vrátane A vena, Triticum, Secale a

Hordeum, pričom sa neobmedzuje len na vymenované rastliny.

Obzvlášť výhodnú cielenú skupinu vnútri čeľade Gramineae tvoria uvedené bližšie charakterizované skupiny Pooideae, ktoré sa skladajú z tráv a obilia z malými zrnami.

Pri typickom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa najskôr vhodné množstvo aktívne rastúceho kalusu alebo aktívne rastúcich buniek suspenzných kultúr (normálne 1 až 40 dní, výhodne 2 až 10 dní po nasadení kultúry) rozpustí vo vhodnom kvapalnom médiu. Vhodné kvapalné médiá sú napríklad SH-0, SH-30 alebo SH-45 médium, OMS, KM-8p, RY-2 médium, ako aj roztoky manitu, sacharózy alebo iného cukru a alkoholických cukrov, ďalej roztok aminokyseliny (ako je napr. prolín) alebo aj voda, pričom sa neobmedzujú len na tieto. Výhodné je médium, ktoré je vhodné pre rast buniek alebo roztok cukru alebo alkoholického cukru vo vode. Obvykle sa v 1 ml kvapalného média disperguje 0,01 g až 0,1 g kalusu a tento sa potom chladí na ľade.

Vhodné prostriedky na ochranu proti zamrznutiu sú v prvom rade zmesi osmoticky aktívnych zložiek DMSO vo vode. Tieto sa normálne pred prídavkom k vopred ochladenej disperzii, opísanej v spôsobovom kroku b, taktiež predchladia na ľade, pričom v tomto prípade sú prípustné aj vyššie teploty, ktoré môžu dosiahnuť až teplotu miestnosti. Teplota roztoku mrazuvzdorného prostriedku nie je kritická. V tejto súvislosti je vhodný napríklad roztok 0,5 N až 2 N glycerínu, 0,5 M až 2 M L-prolínu a 0,5 M až 4 M roztok dimetylsulfoxidu (DMSO) vo vode, pH 5,6 alebo 0,5 M až 4 M roztok DMSO vo vode pri pH 5 až 7, pričom toto neznamená žiadne obmedzenie. Ďalšie vhodné zložky, ktoré prichádzajú do úvahy na použitie v roztokoch mrazuvzdorných prostriedkoch, zahrnujú cukor, alkoholické cukry, aminokyseliny a polyméry ako napríklad roztoky PEG, ktoré obsahujú ako súčasť DMSO, výhodne sa pripravujú pred každým použitím čerstvé alebo sa uchovávajú aj hlboko zmrazené. Iné roztoky prostriedkov chrániacich proti zamrznutiu môžu byť podľa okolností pripravené krátko pred použitím, pričom ale aj v tomto prípade sú výhodné čerstvo pripravené roztoky alebo zmrazené roztoky.

Roztok prostriedku chrániaceho pred zmrznutím sa obvykle pridáva počas 1 sekundy až 4 týždňov, výhodne počas 1 sekundy až 1 dňa a obzvlášť výhodne počas 1 sekundy až 1 hodiny k roztoku, ktorý obsahuje dispergované bunky suspenznej kultúry alebo dispergovaného kalusu. Bunky sa privádzajú do styku s roztokom prostriedku chrániaceho proti zamrznutiu počas vhodného časového úseku na ľade výhodne 1 minúty až 2 dni, obzvlášť výhodne počas 10 minút až 6 hodín a najvýhodnejšie počas 30 minút až 2 hodín. Počas tohto času alebo po uplynutí tohto času sa alikvotné časti na konzerváciu v chlade prenesú do vhodných sterilných fioliek alebo do iných vhodných nádob, a tam sa uchovávajú obvykle na ľade.

Povrch týchto nádob sa môže pred prídavkom uvedených alikvotných častí ponoriť do kvapalného kúpeľa, ktorý má teplotu medzi 0 °C až 4 °C. Tento spôsobový krok nie je bezpodmienečne nutný, môže sa ale ukázať v určitých prípadoch ako výhodný. Kúpeľ môže pozostávať z etanolu alebo ľubovoľnej inej chladiacej látky. Kúpeľ je normálne vybavený miešadlom, pomocou ktorého sa chladiaca látka stále premiešava a je spojená so zariadením, ktoré umožňuje kontrolovať jej chladenie tak, aby sa udržiavalo na určitom bode.

Ak sa nádoby nachádzajú v chladiacej látke, redukuje sa teplota na určitú vhodnú hodnotu. Vhodná hodnota chladenia sa môže pohybovať v rozmedzí asi 0,01 °C až asi 20 °C za minútu, výhodne v rozmedzí asi 0,1 °C až asi 5 °C

SK 283603 Β6 za minútu úplne výhodne v rozmedzí asi 0,2 °C až asi 2 °C a najvýhodnejšie v rozmedzí asi 0,5 °C až asi 1 °C za minútu. Keď teplota dosiahne veľmi nízkej hodnoty, ktorá sa obvykle pohybuje v rozmedzí medzi -20 °C až asi -60 °C, výhodne medzi asi -35 °C až asi -50 °C a obzvlášť výhodne medzi asi -38 °C až asi -44 °C, nádoby zmrznú šokom tým, že sa ponoria napríklad do kvapalného dusíka alebo kvapalného vzduchu. Optimálna východisková teplota na ponorenie do kvapalného dusíka alebo kvapalného vzduchu sa môže meniť v závislosti od požitých kultúr, spravidla sa ale pohybuje pri hodnotách medzi 20 “C až -50 °C a odborník v odbore ju môže veľmi jednoducho zistiť. Nádoby sa potom uchovávajú v kvapalnom dusíku alebo v kvapalnom vzduchu a síce buď v kvapaline samotnej alebo v plynnej fáze, ktorá sa nachádza nad ňou, pričom teplota by nemala byť pod -100 °C.

Pri mnohých kultúrach môže byť výhodné, keď sa teplota nádoby udržuje určitý čas na trvalo nízkej hladine namiesto toho, aby sa nádoby bezprostredne po dosiahnutí optimálnej teploty ponorili do kvapalného dusíka alebo kvapalného vzduchu.

Aby sa opäť získali bunkové kultúry schopné života, vyberú sa nádoby s kalusovým materiálom z kvapalného dusíka a výhodne počas intenzívneho pretrepávania sa nechajú roztopiť v teplom kúpeli pri teplote medzi 10 °C až 50 °C, výhodne medzi 35 °C až 40 °C, až sa všetok ľad rozpustí. Prekvapením sa v rámci tohto vynálezu ukazuje, že nádoby, ktoré obsahujú chladom konzervované bunky rastlín z podčeľade Pooideae, môžu sa roztopiť aj ponechaním na vzduchu pri teplote miestnosti, až sa všetok ľad rozpustí. Konečne je tiež možné ponechať nádoby počas niekoľkých sekúnd až 60 minút, výhodne 1 až 10 minút, na ľade, predtým, ako sa v nich nachádzajúci materiál kalusu prenesie na vhodné kultivačné médium.

Obsah nádoby sa rozdelí na vhodnom pevnom médiu. Obvykle sa 0,5 ml roztopenej kultúry prenesie na Petriho misku s priemerom 10 cm, ktorá obsahuje 30 ml až 50 ml kultivačného média. Pevné médiá sa buď nalejú na zošikmenie alebo sa na obvode vyhĺbi žliabok, aby sa zaistil odtok eventuálne zostávajúcich zvyškov mrazuvzdorného prostriedku od buniek. Bunky sa môžu pred nanesením na platne, na vhodné médium, jeden alebo viackrát premyť aj kvapalným kultivačným médiom alebo akýmkoľvek iným ľubovoľným roztokom, ako napríklad roztokom cukru alebo roztokom alkoholického cukru alebo roztokom aminokyseliny.

Petriho misky sa potom, ako už bolo opísané pre embryogénny kalus, inkubujú pri teplote 27 °C v tme. Kalus sa potom ďalej kultivuje ako normálny embryogénny kalus podľa predloženého vynálezu.

Spôsobový krok B: izolácia a čistenie protoplastov, ktoré sa môžu regenerovať na celé rastliny vrátane celých fertilných rastlín

Vychádzajúc z embryogénnych suspenzných kultúr získateľných spôsobovým krokom A pripravia sa protoplasty. Izolácia a čistenie protoplastov sa uskutočňuje tak, že sa najskôr zo suspenzného kultivačného média izolujú embryogénne aglomeráty buniek, napríklad filtráciou suspenznej kultúry zo spôsobového kroku A, cez filtračnú jednotku Nalgene® (0,2 pm) a výsledný bunkový aglomerát sa potom inkubuje vhodným enzymatickým roztokom, ktorý je schopný oddeliť bunkové steny bez poškodenia protoplastov. Enzýmy sa používajú vo forme roztoku sterilizovaného filtráciou. Všetky manipulácie súvisiace s bunkovými alebo inými kultúrami sa uskutočňujú v sterilných podmienkach a s použitím sterilného materiálu. Vhodný enzy matický roztok môže mať napríklad nasledujúce zloženie. Enzymatický roztok:

Celuláza 2 % (hm./obj.)

CaCl₂.H₂O 7 mM

0,7 mM

NaH₂PO₄.H₂O

MES (pH 5-7)

3,0 mM glukóza (výsledná koncentrácia) 550 mOS/kg H₂O

Normálne sa touto zmesou opatrne pohybuje na trepačke pri rýchlosti asi 50 otáčok za minútu a slabého osvetlenia (asi 5 pE/m²s), pričom toto nie je kritické. Natrávenie pokračuje pri teplote medzi 0 °C až 50 °C, výhodne medzi 10 °C až 35 °C a najvýhodnejšie medzi 26 °C až 32 °C, až sa protoplasty uvoľní. Čas potrebný na natrávenie predstavuje obvykle niekoľko sekúnd až 2 dni, výhodne 1 hodinu až 1 deň a najvýhodnejšie 3 až 5 hodín.

Uvoľnené protoplasty sa zbierajú a čistia pomocou štandardných spôsobov ako napríklad filtráciou, odstreďovaním a prepieraním.

Na tomto mieste sa môže zaviesť ďalší čistiaci krok.

Pritom sa protoplasty nanášajú na povrch vhodného média ako napríklad KM-8p kultivačného média, ktoré je nastavené sacharózou na osmotickú hodnotu 700 mOs/kg H₂O alebo na povrch iných vhodných médií, ktoré sú opísané napríklad Georgom a kol. (1987).

Po 10 minútovom odstreďovaní pri asi 60 g sa protoplasty, ktoré sa nachádzajú v oblasti hraničnej plochy, zbierajú. Potom sa môžu protoplasty resuspendovať v rovnakom kultivačnom médiu a napríklad pasážou oceľovým sitom (veľkosť ôk 20 pm) filtrovať.

Bez tohto dodatočného čistiaceho kroku sa kontaminácia prípravku protoplastov s celými, nenatrávenými bunkami pohybuje v oblasti 0,001 % až 0,01 %. Táto hodnota sa môže už opísaným čistiacim krokom ďalej redukovať. Uvedený dodatočný spôsobový krok vedie ale k značnej strate protoplastov, ktoré majú veľmi hustú protoplazmu. Z toho vyplýva, že účinnosť platinovania sa môže znížiť až o desaťnásobok, keď sa pripojí uvedený čistiaci krok. Protoplasty sa môžu čistiť aj pomocou iných známych spôsobov, ako napríklad už opísanou flotáciou na roztoku sacharózy alebo na iných vhodných pufračných roztokoch s veľkou mernou hmotnosťou, ako napríklad roztoku Percollu®.

Výťažok protoplastov a v dôsledku účinnosti platinácie dosahuje optimálnych hodnôt, keď sa zo suspenzných kultúr, ktoré sa používajú na izoláciu protoplastov, 1 až 30 dní, výhodne 5 až 10 dní pred izoláciou protoplastov založia nasledujúce kultúry.

Pri uvedenom bližšie charakterizovanom enzymatickom roztoku ide o modifikáciu zmesi enzýmov, ktoré opísal Lu a kol. (1981), ktorá prevyšuje všetky ostatné testované roztoky enzýmov a poskytuje výťažok 40 x 10⁶ až 70 x 10⁶ protoplastov na gram čerstvej hmotnosti. Alternatívne k tomu sa dajú aj použitím 2 % (hm./obj.) cclulázy RS v KM-8p médiu alebo inom ľubovoľnom médiu alebo inom ľubovoľnom médiu, ktoré sú opísané Georgom a kol. (1987) pozoruhodné výťažky protoplastov. Pritom sa ukazuje, že použitie glukózy ako osmotika pri izolácii protoplastov jednoznačne vyniká nad použitím sacharózy, a v určitej miere aj nad použitím manitolu, čo sa týka výťažku a dôsledku účinnosti platinovania. Ďalšie známe a vhodné enzymatické zmesi sa môžu taktiež používať pri spôsobe podľa vynálezu.

Protoplasty, ktoré možno získať po filtrácii, t. j. napríklad po pasáži 20 pm sitom s priemernou veľkosťou ôk 12 pm až 15 pm v priemere, vykazujú opticky hustú protoplazmu.

Predložený vynález sa teda týka aj spôsobu prípravy protoplastov, ktoré sa dajú regenerovať na celé rastliny a najmä na celé fertilné rastliny vychádzajúc z lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae. Tento spôsob je charakterizovaný nasledujúcimi spôsobovými krokmi:

a) izolácia tkaniva z vhodných častí lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, výhodne z bazálnych úsekov mladých vnútri ležiacich listov, z nezrelých sexuálnych embryí, z nezrelého kvetenstva, zo zrelých semien alebo tkaniva klíčkov, najvýhodnejšie ale z najmladších a z najvnútornejšie ležiacich listov,

b) kultivácia tohto tkaniva v médiu, ktoré je schopné indukovať tvorbu embryogénneho kalusu a embryí,

c) periodické zakladanie následných kultúr embryogénneho kalusu a embryí na čerstvom médiu, ktoré zaisťuje kontinuálnu proliferáciu,

d) izoláciu zhlukov embryogénnych buniek s veľkosťou od 150 pm do 2000 pm po 0 až 500 prenosoch, výhodne po 0 až 100 a najvýhodnejšie po 3 až 50 prenosoch, a

e) odstránenie bunkových stien s pomocou vhodných enzýmov a izoláciu a čistenie výsledných protoplastov.

Ďalší predmet vynálezu zahrnuje protoplasty (vrátane rastlinných buniek získateľných po regenerácií bunkových stien) lipnicovitých rastlín z podčeľade Pooideae, ktoré možno regenerovať na celé rastliny a najmä na celé fertilné rastliny. Výhodné sú protoplasty alebo bunky, ktoré sa získajú buď z bunkových kultúr alebo z embryogénnych bunkových suspenzií.

Zahrnuté sú taktiež lipnicovité rastliny, najmä fertilné lipnicovité rastliny z podčeľade Pooideae a ich rozmnožovací materiál, ktoré sa regenerujú z uvedených protoplastov alebo z uvedených rastlinných buniek.

Spôsobový krok C: vypestovanie kultúr protoplastov a vypestovanie kalusu, ktoré je možné regenerovať na celé rastliny a na celé fertilné rastliny

Vyčistené protoplasty zo spôsobového kroku B rozotrú na platniach vo vhodnom kvapalnom médiu alebo vo vhodnom pevnom médiu cez seba, nezávisle od toho, či boli uvedené protoplasty predtým spracované s exogénnou DNA alebo nie. (Spracovanie s exogénnou DNA je podrobne opísané v nasledujúcom oddiele.) Pod pojmom vhodné médiá sa v rámci tohto vynálezu rozumejú napríklad také médiá, ktorých základ tvorí KM-8p médium, RY-2 médium (Potrykus a kol., 1979), SH-30 médium alebo SH-45 médium, a ktoré vykazujú vhodnú koncentráciu cukrov a rastlinných rastových regulátorov. Výhodné médiá sú KM-8p a SH-45 médium, ktoré obsahujú vhodný stužovací prostriedok. Výhodným stužovacím prostriedkom je agaróza, najmä Sea Plaque® agaróza (FMC Corp. Marine Colloids Division, P.O. Box, Rockland, ME 04841, USA). Pri použití Sea Plaque® agarózy môže byť jej koncentrácia 0,1 % až 2,5 % (hm./obj.), výhodne 0,6 % až 1,5 % (hm./obj.).

Rozotretie protoplastov na médium obsahujúce agarózu cez seba sa môže uskutočňovať analogicky ako Shillito a kol. (1983), v európskom patente EP 0 129 688 (Shillito a kol.) alebo Adams a kol. (1983). Tieto publikácie sú ako referencie súčasťou tohto vynálezu.

Médium, v ktorom sa kultivujú protoplasty, môže obsahovať ďalšie vhodné zložky, ktoré podporujú delenie a tvorbu kolónie protoplastov. K týmto látkam patrí napríklad 2,4-D, dicamba, picloram alebo iné rastlinné rastové regulátory. Vhodné rastlinné rastové regulátory sú odborníkovi v odbore známe. Koncentrácia týchto látok sa obvykle pohybuje v rozmedzí 0,001 mg/1 až 100 mg/1.

Kyselina salicylová a jej deriváty môžu podporovať delenie buniek a tvorbu kolónií protoplastov z podčeľade Pooideae. K derivátom kyseliny salicylovej patrí, ale bez toho, aby sa obmedzovali len na tieto, O-acylderiváty a O

-arylderiváty. K O-acylderivátom sa radia, ale bez toho, aby sa obmedzovali len na tieto, nízkoacylové skupiny s 1 až 7, výhodne 1 až 4 a najvýhodnejšie s 2 až 3 atómami uhlíka. Pod pojmom O-arylové deriváty sa v rámci tohto vynálezu rozumejú 5- alebo 6-členné kruhy, ktoré môžu byť navzájom spojené alebo sú samostatné bez toho, aby sa tieto O-arylové deriváty obmedzovali iba na ne. Kruhy môžu byť nesubstituované alebo substituované jednou alebo viacerými skupinami vrátane alkylov s 1 až 5 atómami uhlíka, O-alkylov s 1 až 4 atómami uhlíka, halogénov (najmä chloridov a bromidov), nitroskupín, aminoskupín a aminoskupín, ktoré sú samy substituované alkylom s 1 až 4 atómami uhlíka.

Deriváty kyseliny salicylovej obsahujú aj karboxyester. Výhodné karboxyestery sú arylestery a alkylestery, kde alkylová skupina obsahuje 1 až 4 atómy uhlíka.

Okrem toho sa pod pojmom deriváty kyseliny salicylovej rozumejú aj tie zlúčeniny, pri ktorých je kruh kyseliny salicylovej ešte ďalej substituovaný, napríklad jednou alebo viacerými skupinami vrátane alkylov s 1 až 4 atómami uhlíka, O-alkylov s 1 až 4 atómami uhlíka, halogénov (najmä chloridov a bromidov), nitroskupín, aminoskupín a aminoskupín, ktoré sú samy substituované alkylom s 1 až 4 atómami uhlíka.

Výhodné zlúčeniny, ktorc podporujú delenie a/alebo tvorbu kolónií protoplastov z podčeľade Pooideae a buniek tejto čeľade sú:

kyselina O-acetoxybenzoová (Aspirín, kyselina acetylsalicylová), kyselina O-hydroxybenzooová (kyselina salicylová), kyselina O-metoxybenzoová (kyselina metylsalicylová) a kyselina O-dimetylkarbamoylbenzoová (kyselina O-(CO-dimetyl)-salicylová.

Koncentrácia kyseliny salicylovej alebo jej derivátov v kultivačnom médiu sa pohybuje výhodne v rozmedzí 0,1 mg/1 až 3000 mg/1, výhodne 10 mg/1 až 300 mg/1 a najvýhodnejšie okolo 100 mg/1.

Médium, v ktorom sa kultivujú protoplasty, môže ešte dodatočne obsahovať médium, ktoré bolo predtým kondicionované rastom vhodných buniek, ktoré pochádzajú napríklad zo Zea Mays, Dactylis glomerata alebo iných tráv alebo od iných (dvojklíčnolistových) rastlín. Výhodné je médium, v ktorom bola kultivovaná embryogénna suspenzia druhu lipnicovitých. Najvýhodnejšie je médium, v ktorom bola kultivovaná suspenzia Dactylis glomerata. Médium kondicionované už uvedeným spôsobom môže mať podiel medzi 0 % až 100 % (obj./obj.), výhodne medzi 5 % až 50 % (obj./obj.) a najvýhodnejšie medzi 30 % až 40 % (obj./obj.) celkového média.

Protoplasty sa môžu kultivovať na pevnom alebo v kvapalnom médiu až 12 týždňov, výhodne až 6 týždňov a najvýhodnejšie 1 až 3 týždne bez toho, aby sa medzi tým založili následné kultúry. V zvláštnej forme uskutočnenia predloženého vynálezu sa môže pevné médium preniesť do kvapalného média, ako je to opísané v európskej prihláške vynálezu EP 129 688 (Shillito a kol.) alebo môže byť spracované iným ľubovoľným spôsobom, ktorý podporuje delenie buniek a/alebo tvorbu kolónií protoplastov.

Protoplasty sa kultivujú na svetle, ale výhodne v tme pri teplote medzi 0 °C až 50 °C, výhodne medzi 20 °C až 32 °C a najvýhodnejšie medzi 25 °C až 28 °C. Intenzita svetla je obvykle 0,1 pE/m’s až 200 pE/m²s, výhodne 30 pE/m²s až 90 pE/nTs.

Účinnosť nanášania na platne pri použití KM-8p média kolíše medzi 0,5 % až 10 % v závislosti od prípravy protoplastov. Prísada 30 % až 40 % (obj./obj.) kondicionovaného suspenzného kultivačného média (suspenzné kulti

SK 283603 Β6 vačné médium, kondicionované rastom v ňom sa nachádzajúcich buniek a nastavené na osmotickú hodnotu 550 mOsm/kg H₂O prísad pri glukóze) ku kultivačnému médiu protoplastov nevedie síce k významnému vzostupu účinnosti nanášania na platne, ale urýchľuje proces delenia v mladých kolóniách vzídených z protoplastov.

Vo výhodnej forme uskutočnenia predloženého vynálezu sa protoplasty nanesú na platne na médiu stuženom agarózou. Prvé delenie buniek je potom možné pozorovať asi dva dni po nanesení protoplastov na platne. Ďalšie delenia nasledujú každé 2 až 3 dni. Tento proces delenia prebieha asynchrónne, čo sa dá doložiť skutočnosťou, že k prvému deleniu buniek môže dôjsť aj až po 7 dňoch. 5 až 20 dní, výhodne ale 10 až 14 dní po nanesení protoplastov na platne, sa médium stužené agarózou rozreže na segmenty a segmenty, ktoré obsahujú kolónie buniek sa prenesú do živného média. Tento spôsob je pod označením „bead culture technique“ všeobecne známy a je úplne opísaný Shillitom a kol. (1983), ako aj v európskej patentovej prihláške vynálezu EP 0 129 688 (Shillito a kol.).

Miesto toho, aby sa médium spevnené agarózou rozrezalo na segmenty, môže sa aj skvapalniť a v tejto kvapalnej forme preniesť do kvapalného živného média. Táto modifikácia je opísaná Adamsom a kol. (1983) a môže sa uskutočniť analogicky. V oboch prípadoch (segmentovanie alebo skvapalnenie) sa môže používať KM-8p médium s glukózou a sacharózou ako kvapalnými zložkami médií, pričom možno pozorovať dobrý rast kolónií. Optimálna kvapalná zložka s ohľadom na rast kolónií pozostáva zo SH-45 média so 4 g/1 hydrolyzátu kazeínu. Počas asi 2 až 3 týždňov od začatia spôsobu „bead culture“ možno rozoznať vnútri platní nové suspenzné kultúry. Mikroskopické skúmanie agarózových diskov vypovedá, že niekoľko kolónií položených na najvzdialenejšom povrchu vrastá do kvapalného média a v médiu uvoľňuje menšie množstvo buniek, zatiaľ čo zvyšok kolónie zostáva ďalej pevne zakotvený v agaróze. Nová suspenzia sa veľmi rýchlo rozmnožuje a po ďalších dvoch týždňoch sa bežným spôsobom ako normálna suspenzná kultúra transferuje alebo sa rozotrie cez seba na SH-30 médiách, aby sa vyvinul kalus. V alternatívnej forme uskutočnenia sa môže agaróza rozdeliť aj na Petriho misky, ktoré obsahujú SH-45 médium stužené agarózou a potom kultivovať.

Predložený vynález sa týka aj spôsobu prípravy kultúr (suspenzných kultúr a kalusových kultúr) z protoplastov lipnicovitých rastlín z podčeľade Pooideae, ktoré sa môžu regenerovať na celé rastliny, najmä na celé fertilné rastliny. Tento spôsob je charakterizovaný nasledujúcimi spôsobovými krokmi:

a) kultivácia protoplastov, ktoré pochádzajú z lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, a ktoré sa môžu regenerovať na celé rastliny, vo vhodnom kultivačnom médiu až vytvorenie kolónií buniek,

b) kultivácia uvedených kolónií buniek alebo ich častí na vhodnom médiu, ktoré podporuje tvorbu bunkových kultúr, a

c) izolácia výsledných kultúr buniek.

Spôsobový krok b) nie je bezpodmienečne nutný. Rovnako tak je možné ponechať protoplasty v médiu definovanom v spôsobovom kroku a), až do vytvorenia kultúr buniek alebo embryí.

Taktiež sú zahrnuté lipnicovité rastliny, najmä fertilné lipnicovité rastliny z podčeľade Pooideae a ich rozmnožovací materiál, ktoré sa regenerujú z uvedených kultúr buniek.

Výhodný predmet vynálezu predstavuje nanášanie protoplastov na platne na médium stužené agarózou, skva palnenie alebo segmentáciu média stuženého agarózou, prenos skvapalneného alebo na segmenty rozrezaného média do kvapalného živného média a kultiváciu až do vytvorenia kolónií buniek.

Výhodný je spôsob, pri ktorom časti kolónií buniek, spomínané v spôsobovom kroku b) pochádzajú z buniek alebo bunkových hmôt, ktoré boli uvoľnené do kvapalného kultivačného média.

Kultúry kalusu a suspenzné kultúry pripravené v tomto alebo v iných spôsobových krokoch sa môžu analogicky k tomu čo už bolo uvedené v spôsobovom kroku A konzervovať v chlade.

Spôsobový krok D: regenerácia mladých rastlín z kalusu

Z kalusu, ktorý sa získal z protoplastov (spôsobový krok C), najmä ide o drobivý, granulámy kalus, sa zakladajú jeden alebo viackrát, výhodne každé 2 týždne, následné kultúry na čerstvom vhodnom médiu, aby sa takto indukovala tvorba embryí. Vhodným indukujúcim médiom je napríklad SH médium s vhodnou koncentráciou cukrov a regulátorov rastu rastlín.

Všetky takto vzniknuté embryá sa potom prenesú na médium, ktoré poskytuje dobré predpoklady na indukciu zrenia a klíčenia. Vhodné médiá sú napríklad SH-30 médium alebo OMS médium, ktoré sú modifikované tak, že vykazujú vhodné koncentrácie cukrov a regulátorov rastu rastlín. Kultivácia platní sa uskutočňuje na svetle (10 μΕ/nrs až 00 pE/m²s, studené biele svetlo fluorescenčných lámp alebo zmes denného svetla a svetla Gro-Lux® (Sylvania) fluorescenčného svetla. Samozrejme môže sa používať aj akékoľvek iné vhodné fluorescenčné svetlo. 2 až 5 týždňov po rozotretí na platne sa dajú pozorovať prvé embryá V mnohých prípadoch môže byť výhodné uskutočniť jeden alebo viac dodatočných prenosov embryí na čerstvé médium, aby dozreli. Embryá sa ďalej vyvíjajú a tvoria po určitom čase, obvykle po 1 týždni až 6 mesiacoch, najmä ale po 1 až 3 mesiacoch, mladé rastlinky.

V alternatívnej forme uskutočnenia sa z kalusu získaného z protoplastov (spôsobový krok C), najmä keď ide o drobivý granulámy kalus, založia raz alebo viackrát, výhodne každé dva týždne, následné kultúry na čerstvom vhodnom médiu, aby sa takto indukovala tvorba a zrenie embryí. Jedným z médií vhodným na tento účel je napríklad OMS médium, ktoré vykazuje vhodnú koncentráciu cukrov, ale žiadne regulátory rastlinného rastu bez toho, aby sa médiá obmedzili len na toto médium. Kultivácia platní sa robí na svetle (10 pE/m²s až 200 pE/m²s, studené svetlo fluorescenčnej lampy alebo zmes denného svetla a svetla Gro-Lux® (Sylvania) fluorescenčného svetla alebo akéhokoľvek iného vhodného fluorescenčného svetla). Embryá sa vyvíjajú ďalej a vytvoria po určitom čase, obvykle po 1 týždni až po 6 mesiacoch, najmä ale po 1 až 3 mesiacoch, mladé rastlinky.

Spôsobový krok E: získanie rastlín, výhodne fertilných rastlín mladých rastliniek

Mladé rastlinky získané predtým pri spôsobovom kroku D) sa prenesú na vhodné médium, napríklad na SH médium alebo OMS médium bez regulátorov rastu rastlín. Alternatívne k tomuto spôsobu sa môže tiež pridať regulátor rastu, ktorý stimuluje vytvorenie koreňov alebo výhonkov.

Vhodné rastové regulátory sú odborníkovi v odbore známe. Mladé rastlinky sa kultivujú na tomto médiu tak dlho, až vytvoria korene. Pritom je dôležité, aby sa každý kalus z mladých rastliniek odstránil, lebo sa ukázalo, že tento kalus negatívne ovplyvňuje rast rastliniek. Na dosiahnutie tohto sa rastlinky môžu, napríklad počas prenosu, opláchnuť destilovanou vodou. Kalus ktorý sa vytvára až dodatočne, sa musí v pravidelných odstupoch, výhodne každé 3 až 30 dní a najvýhodnejšie každý 1 až 2 týždne, odstraňovať. Čas potrebný na vytvorenie koreňa je obvykle 1 až 4 týždne, najmä ale 2 týždne. Rastlinky s dobre vyvinutým systémom koreňov sa môžu presadiť do zeme a preniesť do skleníka, kde sa pomaly otužujú. Ako dostatočná sa v tejto súvislosti považuje dĺžka koreňov v rozmedzí medzi 1 cm až 10 cm, najmä 2 až 5 cm. Pri výhonkoch sa zodpovedajúci rozsah pohybuje taktiež medzi 1 cm až 10 cm a najmä 2 až 5 cm. Alternatívne k tomu sa môžu rastlinky aj založením vždy nových následných kultúr ďalej kultivovať in vitro v bližšie neurčenom časovom rozmedzí tým, že sa výhonky oddeľujú od seba a rastlinky sa prenesú na čerstvé médium, napríklad SH-0 médium alebo OMS médium.

Spôsob regenerácie lipnicovitých rastlín, najmä celých lipnicovitých rastlín z podčeľade Pooideae, podľa vynálezu, je charakterizovaný nasledujúcimi krokmi:

a) kultiváciou kalusu, ktorý sa odvodzuje od lipnicovitých rastlín, ktorý sa získa z protoplastov a môže sa regenerovať na celé rastliny, na médiu, ktoré je schopné indukovať tvorbu embryí až vytvárať embryá,

b) kultiváciou embryí na médiu, ktoré je vhodné na indukciu zrenia a klíčenie uvedených embryí, a

c) kultiváciou vzniknutých rastliniek až do štádia, v ktorom sa tieto presadia do zeme a môžu sa nechať dozrieť na celé rastliny.

Tvorba kvetov sa môže indukovať buď podľa spôsobu, ktorý je opísaný Heidem (1987) alebo aj akýmkoľvek iným ľubovoľným spôsobom, ktorý zodpovedá požiadavkám práve použitého druhu alebo odrody. Spôsoby na indukciu kvetov u Pooideae sú známe.

Semená produkované týmito rastlinami možno pomocou vhodného ošetrenia priviesť ku klíčeniu a buď ich zasiať do kvetináčov, alebo aj sterilizovať nanesením na plochu Mureshigeho a Skoogovho média, ktoré nevykazuje žiadne rastové regulátory (OMS médium) a je stužené 0,8 % agarom alebo agarózou, GelRite® alebo akýmkoľvek iným ľubovoľným želatinačným prostriedkom. Semená možno vysiať aj na médium, ktoré obsahuje 10 pg/ml až 1000 pg/ml hygromycínu B, pomocou ktorého sa môže preukázať dedičnosť rezistencie proti hygromycínu.

Spôsob regenerácie ťertilných lipnicovitých rastlín z podčeľade Pooideae podľa vynálezu z kalusu obsahuje teda nasledujúce kroky:

a) kultiváciu kalusu, ktorý sa odvodzuje od rastlín z podčeľade Pooideae, ktorý· sa získa z protoplastov a môže sa regenerovať na celé rastliny, na médiu, ktoré je schopné indukovať tvorbu embryí až vytvárať embryá,

b) kultiváciu embryí na médiu, ktoré je vhodné na indukciu zrenia a klíčenie uvedených embryí,

c) kultiváciu vzniknutých rastliniek až do štádia, v ktorom sa tieto presadia do zeme a môžu sa nechať dozrieť na celé rastliny, a

d) získanie semien v dôsledku kontrolovaného alebo otvoreného opelenia.

Ďalší predmet vynálezu sa týka lipnicovitých rastlín, najmä ale ťertilných lipnicovitých rastlín, z podčeľade Pooideae a ich rozmnožovacieho materiálu, ktoré sa môžu regenerovať z uvedeného kalusu.

Spôsobový krok F: ošetrenie protoplastov exogénnou DNA

Protoplasty rastlín z podčeľade Pooideae sa môžu ošetrovať exogénnou DNA, pričom vzniknú bunky, ktoré obsahujú celú alebo časť exogénnej DNA stabilne včlenenú do ich genómu. Pod pojmom exogénna DNA sa v rámci tohto vynálezu rozumie každá DNA, ktorá sa môže pripojiť k protoplastom. Uvedená DNA môže byť buď homológna alebo aj heterológna vzhľadom na transformovanú rastlinu. Exogénna DNA môže obsahovať promótor, ktorý je aktívny v rastlinách čeľade Gramineae, najmä ale v rastlinách podčeľade Pooideae, alebo sa môže použiť aj promótor, ktorý je už prítomný v genóme rastliny. Exogénna DNA môže okrem toho obsahovať jeden alebo viac génov, ktoré menia genotyp, najmä ale fenotyp výslednej bunky alebo z nej regenerovanej rastliny, aleje žiaduce, aby sa sekvencia génu, ktorá kóduje jeden alebo viac požadovaných proteínových produktov, exprimovala a produkovala jeden alebo viac funkčných enzýmov alebo polypeptidov vo výslednej bunke, prípadne v rastline. Pri exogénnej DNA môže ísť o chimérny gén alebo aj jeho časť.

Pod pojmom exogénna DNA sa v rámci tohto vynálezu rozumie aj nekódujúca DNA s funkciou regulátora, ktorá hrá určitú úlohu napríklad v regulácii transkripcie.

Spracovanie protoplastov s exogénnou DNA sa môže uskutočniť jedným zo spôsobov opísaných v nasledujúcich publikáciách: Paszkowski a koľ, 1984; európska patentová prihláška EP 0 164 575 (Paszkowski a kol.); Shilltito a koľ, 1985; Potrykus a koľ, 1985; Loerz a kol., 1985; Fromm a kol., 1986; britská patentová prihláška GB 2,140, 822 (Mettler) a Negrutiu a koľ, 1987). Tieto publikácie tvoria vo forme referencií súčasť tohto vynálezu.

Exogénna DNA sa môže k protoplastom pridávať v akejkoľvek forme, napríklad DNA s lineárnou štruktúrou alebo DNA vo forme slučky, zapuzdrená do lipozómov, sféroplastov, ako súčasť iných protoplastov, vytvárajúca komplex so soľami, atď. Včlenenie cudzej DNA sa môže akýmkoľvek vhodným spôsobom vrátane tých, ktoré sú opísané v uvedených publikáciách, stimulovať.

V rámci tohto vynálezu sú výhodné chiméme gény, ktoré prepožičiavajú transformovaným protoplastom, rovnako tak, ako z nich vyvinutým tkanivám, najmä rastlinám, výhodné vlastnosti, napríklad zvýšenú rezistenciu proti patogénom (napríklad proti fytopatogénnym plesniam, baktériám, vírusom, atď.), rezistenciu proti chemikáliám (napríklad proti herbicídom, napríklad triazínom, sulfonylmočovinám, imidazolom, triazolpyrimidínom, Bialophosu, Glyphosatu, atď., insekticídom alebo iným biocídom), rezistenciu proti nepriaznivým (endafickým alebo atmosférickým) vplyvom životného prostredia (napríklad teplu, chladu, vetru, nepriaznivým pomerom pôdy, vlhku, suchu, atď.), alebo môžu viesť aj k zvýšeniu tvorby rezervných a zásobných látok a listoch, semenách, hľuzách, koreňoch, stonkách, atď. K žiaducim látkam, ktoré môžu produkovať transgénne rastliny, možno počítať napríklad proteíny, škroby, cukry, aminokyseliny, alkaloidy, aromatické látky, farbivá, tuky, atď.

Rezistenciu proti cytotoxínom možno dosiahnuť napríklad prenosom génu, ktorý' je schopný pri expresii v rastlinnej bunke poskytnúť enzým, ktorý detoxifikuje cytotoxín, ako napríklad neomycíntransferázu typu II alebo aminoglykozidfosfotransferázu typu IV, ktorá prispieva k detoxikácii kanamycínu, hygromycínu alebo iných aminoglykozidových antibiotík alebo glutation-S-transferázu, cytochróm P-450 alebo iné katabolicky účinné enzýmy, o ktorých je známe, že detoxifikujú triazíny, sulfonylmočoviny alebo iné herbicídy. Rezistencia proti cytotoxínom sa dá sprostredkovať pomocou génu, ktorý v rastline exprimuje určitú formu „cieleného enzýmu“ (pôsobisko účinku cytotoxínu), ktorá je rezistentná proti aktivite cytotoxínu, ako napríklad variant syntázy acetohydroxykyseliny, ktorá je necitlivá proti inhibičnému účinku sulfonylmočovín, imidazolínom alebo iným herbicídom, ktoré vzájomne pôsobia s týmto špecifickým krokom látkovej výmeny, alebo variant EPSP syntázy, ktorá sa javí ako necitlivá proti inhibičnému účinku glyphosatu. Môže byť vhodné, keď sa tieto zmenené cielené enzýmy exprimujú vo forme, ktorá dovolí jej prenos do správneho bunkového kompartmentu, ako to bolo napríklad v už uvedenom prípade do chloroplastov.

V určitých prípadoch môže byť výhodné smerovať produkty génov do mitochondrií, vakuol, endoplazmatického retikula alebo do inej oblasti buniek, dosť možné, že dokonca aj do intercelulámych priestorov.

Rezistenciu proti určitým triedam húb možno dosiahnuť napríklad včlenením génu, ktorý exprimuje v rastlinných tkanivách chitinázu. Mnohé pre rastlinu patogénne huby obsahujú chitín ako integrálnu súčasť vo svojich štruktúrach hýf a spór, tak napríklad Basidiomycetes (napríklad snete a Uredinales), Ascomycetes a Fungi imperfecti (vrátane Alternaria a Bipolaris, Exerophillum turcicum, Colletotricum, Gleocercospora a Cercospora). Chitináza je schopná brániť in vitro rastu mycélia určitých patogénov. Rastlinný list alebo koreň, ktorý exprimuje chitinázu konštitutívne alebo aj ako odpoveď vniknutie patogénu je chránený proti ataku veľkého množstva rôznych húb. Vždy podľa situácie môže byť konštitutívna expresia výhodná v porovnaní s indukovateľnou expresiou, ktorá pri mnohých rastlinách vzniká ako reakcia na atak patogénu, lebo chitináza je prítomná bezprostredne vo vysokej koncentrácii bez toho, aby sa muselo najprv čakať na lag-fázu pre novú syntézu.

Rezistencia proti hmyzu sa môže preniesť napríklad génom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý je toxický pre hmyz a/alebo larvy, ako napríklad kryštalický proteín Bacillus thuringiensis (Barton a kol., 1987; Vaeck a kol., 1987). Druhou triedou proteínov, ktoré sprostredkovávajú rezistenciu proti hmyzu sú inhibítory proteázy. Inhibítor proteázy tvorí obvykle súčasť rastlinných zásobných štruktúr (Ryan, 1973). Možno preukázať, že Bowman-Birkov inhibítor proteázy, izolovaný zo sójových bôbov a vyčistený, inhibuje črevnú proteázu lariev Tenebrio (Brick a kol., 1963). Gén, ktorý kóduje inhibítor trypsínu z kŕmneho hrachu, je opísaný Hiderom a kol, (1987).

Gén, ktorý kóduje inhibítor proteázy, môže byť zavedený vo vhodnom vektore pod kontrolou promótora rastliny, najmä konštitutívneho promótora, ako napríklad CaMV 35S promótora (ktorý je opísaný Odellom a kol., 1985). Gén, napríklad kódujúci sekvenciu z Bowman-Birkovho inhibítora proteázy zo sójových bôbov, sa môže získať pomocou sDNA klonovacej metódy (Hammond a kol., 1984). Ďalšia možnosť výroby inhibítora proteázy spočíva v jej syntéze, ak vykazuje menej ako 100 aminokyselín, ako napríklad inhibítor trypsínu Phaseolus lunatus. Kódujúca sekvencia sa dá predpovedať spätným preložením sekvencie aminokyseliny. Dodatočne sú na oba konce vložené reštrikčné miesta, ktoré sú vhodné pre práve požadovaný vektor. Syntetický gén sa vyrobí syntézou prekrývajúcich sa fragmentov oligonukleotidov s 30 až 60 pármi báz tým, že sa tieto najskôr podrobia reakcii kinázy, potom sa navzájom spoja (Maniatis a kol.) a potom sa klonujú vo vhodnom vektore. Pomocou sekvenovania DNA sa môže potom kloň, ktorý obsahuje inzert v správnej orientácii, identifikovať. Na včlenenie do protoplastov sa používa izolovaný plazmid DNA (Ábel a kol., 1986).

Predložený vynález zahrnuje taktiež gény, ktoré kódujú farmaceutický aktívne súčasti, napríklad alkaloidy, steroidy, hormóny a iné fyziologicky aktívne látky, ako aj flavóny, vitamíny a farbivá. Ku génom, s ktorými sa uvažuje v rámci tohto vynálezu, patria preto bez toho, aby sa obmedzovali len na ne, gény špecifické pre rastliny, ako naprí klad zeingy (Wienand a kol., 1981), špecifické gény cicavcov ako napríklad inzulínový gén, somatostatínový gén, interleucínové gény, t-PA-gén (Penica a kol., 1983), atď. alebo gény mikrobiálneho pôvodu, ako napríklad ΝΤΡ II gén, ako aj syntetické gény ako inzulínový gén (Itakura a kol., 1975).

Na transformáciu protoplastov sa môže vedľa kódujúcej DNA samozrejme používať aj nekódujúca DNA, ktorá spravidla vykazuje funkciu regulátora a napríklad môže byť zahrnutá pri regulácii procesu transkripcie.

Existujú niektoré rastlinné gény, o ktorých je známe, že sú indukované rôznymi vnútornými a vonkajšími faktormi, ako sú rastlinné hormóny, tepelný šok, chemikálie, patogény, nedostatok kyslíka a svetla.

Ako príklad regulácie génov rastlinnými hormónmi možno uviesť kyselinu abscisínovú (ABS), o ktorej je známe, že indukuje prebytok mRNA vznikajúcu v bavlne počas embryonálnej fázy.

Ďalší príklad poskytuje kyselina giberelinová (GA3), ktorá indukuje v ricínových semenách malátsyntázy, ako aj vo vrstvách aleuronu jačmeňa izoenzýmy a-amylázy.

Podrobne sa skúmala regulácia citlivých proteínových génov sójových bôbov tepelným šokom. Viachodinové spracovanie rastlín pri teplote 40 °C rezultuje do syntézy de novo takzvaných proteínov teplotného šoku. Medzitým sa izolovali mnohé z týchto génov a ich regulácia sa podrobne skúmala. Expresia týchto génov sa v prvom rade kontroluje na úrovni transkripcie (Shoffl a kol., citované vo Willmitzer, 1988). Promótor hps génu bol fúzovaný s génom neomycíntransferázy II (NPT II). Pri tom mohlo byť dokázané, že chimémy gén sa môže indukovať tepelným šokom (Spena a kol., 1985).

Iná trieda génov indukovateľných v rastlinách obsahuje svetlom regulované gény, najmä nukleárne kódovaný gén malej podjednotky ribulózo-l,5-bifosfátkarboxylázy (RUBISCO), Morell a kol. (1985) a Herrera-Estrella a kol. preukázali, že 5' obojstranne terminálna (flankujúca) sekvencia RUBISCO génu hrachu je schopná preniesť indukovateľnosť svetlom na reportérový gén, ak je v chimémej forme spojený s touto sekvenciou. Toto pozorovanie sa mohlo rozšíriť aj na iné svetlom indukovateľné gény, ako napríklad chlorofyl a/b - väzbový proteín.

Alkoholdehydrogenázové gény (adh gény) kukurice boli predmetom intenzívneho bádania. Izolovaný bol adh 1-s gén kukurice a dokázalo sa, že časť 5-flankujúcej DNA je schopná indukovať expresiu chimémeho reportérového génu (napríklad chloramfenikolacetyltransferázy, CAT), keď sa transferované tkanivo prechodne vystaví anaeróbnym podmienkam (Howard a kol., 1987).

Vo výhodnej forme uskutočnenia predloženého vynálezu sa protoplasty, ktoré sa získali z rastlín podčeľade Pooideae, transformujú pomocou kombinácie elektroporácie a spracovania polyetylénglykolom. Bezprostredne po čistení protoplastov získaných pri spôsobovom kroku B sa tieto podrobia elektroporácii (porovnaj s Shillito a kol., 1985, ako aj EP 0 164 575, Paszkowski a kol.). Protoplasty sa po poslednom opláchnutí môžu resuspendovať v elektroporačnom pufri. V rámci tohto vynálezu je vhodný napríklad roztok manitu s primeranou koncentráciou chloridu draselného. K suspenzii protoplastov sa potom pridáva vodný roztok DNA. Pri špecifickej forme uskutočnenia tohto vynálezu ide pritom o plazmid pCIB709, ktorý bol predtým linearizovaný spracovaním s vhodnou reštrikčnou endonukleázou. Výsledná zmes sa opatrne mieša. Pri špecifickej forme uskutočnenia vynálezu sa pridá polovičný objem 24 % (hm./obj.) roztoku PEG v 0,5 M roztoku manitu a 30 mM chloridu horečnatého. Po dôkladnom premiešaní sa protoplasty prenesú do komory Dialóg® elektroporátora (DIA-LOG G.m.b.H., Haffstrasse 34, D-4000 Dússeldorf 13, FRG) a zaťažia sa 2 až 10 pulzmi, výhodne ale 3 pulzmi asi 2000 V/cm až 5000 V/cm východiskového napätia a exponenciálnymi konštantami tlmenia 10 ps v 30 sekundových intervaloch. Vzorka sa potom prenesie do Petriho misky, kde sa pridá 1 % (hm./obj.) až 25 % (hm./obj.) agarózy ako želatinačného prostriedku. Protoplasty sa pred stužením agarózy rozdelia rovnomerne na médium. Z tejto kultúry transformovaných protoplastov sa regenerujú transgénne rastliny vrátane fertilných transgénnych rastlín z podčeľade Pooideae podľa opisu v krokoch C až F.

Pri ďalšom výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu sa transformujú protoplasty Pooideae podľa metódy opísanej Negrutiom a kol. (1987). V tomto prípade sa vyčistené protoplasty suspendujú po poslednom opláchnutí v 0,5 M roztoku manitu, ktorý obsahuje 15 mM až 45 mM chlorid horečnatý. DNA sa pridáva vo forme vodného roztoku, ďalej potom rovnaký objem 36 % (hm./obj.) roztoku PEG (Negrutiu a kol., 1987). Roztok sa opatrne premieša a inkubuje 5 až 60 minút, výhodne asi 30 minút, pri teplote 10 °C až 32 °C, výhodne pri teplote miestnosti (asi 25 °C). Počas fázy inkubácie sa roztokom príležitostne pohybuje. Po ukončení inkubácie sa protoplasty premyjú a rozložia sa na platne na vhodnom kultivačnom médiu. K vhodným kultivačným médiám patrí napríklad Km-8p médium bez toho, aby sa spôsob obmedzil len na toto médium, s 0,3 % (hm./obj.) až 2,5 % (hm./obj.), výhodne 0,6 % (hm./obj.) až 2 % (hm./obj.) agarózy ako stužovacieho prostriedku. Protoplasty sa pred stuhnutím agarózy rozdelia rovnomerne po médiu. Z tejto kultúry transformovaných protoplastov sa regenerujú transgénne rastliny vrátane fertilných transgénnych rastlín z podčeľade Pooideae podľa opisu v krokoch C až F.

Exogénna DNA výhodná v rámci tohto vynálezu je plazmid pCIB709, ktorý je znázornený na obrázku 7, v lineárnej forme.

Spôsobový krok G: selekcia transformovaných kolónií

Médium spevnené agarózou (zo spôsobového kroku F), ktoré obsahuje transformované protoplasty, sa inkubuje na svetle alebo výhodne v tme 5 až 30 dní, výhodne 8 až 15 dní a najvýhodnejšie 10 dní, pri teplote 0 °C až 50 °C, výhodne 20 °C až 32 °C a najvýhodnejšie 25 °C až 28 °C. Pevné médium sa rozreže potom napríklad v 5 úsekoch a selektuje sa tak, ako je opísané Shillitom a kol. (1983); v európskej patentovej prihláške EP P 129 688 (Shillito a kol.); Shillitom a kol. (1985) alebo v európskej patentovej prihláške EP 0 164 575 (Paszkowski a kol.) v „bead type culture systém“. Počet a veľkosť segmentov média nie sú kritické. Pri špecifickej forme uskutočnenia tohto vynálezu sa prenesú 4 z týchto segmentov jednotlivo do vhodného média, ako napríklad do SH-45 kultivačného média so 4 g/1 hydrolyzátu kazeínu a 20 pg/ml až 100 pg/ml hygromycínu B. Piaty segment sa prenesie do rovnakého média bez hygromycínu (kontrola).

Asi po 4 až 5 týždňoch sa podľa predpokladu transformované bunkové kolónie z agarózy vyrežú a kultivujú sa vo vhodnom kultivačnom médiu, ako napríklad v SH-45 médiu, s 20 pg/ml až 100 pg/ml hygromycínu B, ktorým sa pohybuje pomocou kruhovej trepačky pri rýchlosti 50 až 80 otáčok za minútu. Po ďalších 4 až 5 týždňoch sa všetky kolónie, ktoré poskytujú novú suspenznú kultúru, prenesú na čerstvé médium s 20 pg/ml hygromycínu B. Z novej suspenzie sa založia minimálne 2 ďalšie kultúry v prítomnosti 20 pg/ml hygromycínu B. Tieto sa kultivujú v podmienkach, ktoré už boli opísané, až do vytvorenia kalusu.

Kalus, suspenzné kultúry ako aj kultúry, ktoré sa môžu získať z materiálu, vyrobeného pri tomto spôsobovom kroku, sa konzervujú chladom pomocou spôsobu opísanom v kroku A.

Spôsobový krok H: regenerácia transformovaných rastlín z podčeľade Pooideae z kalusu

Z transformovaného kalusu (spôsobový krok G) sa dajú v súlade so spôsobovým krokom D regenerovať transformované rastliny z podčeľade Pooideae.

Spôsob podľa vynálezu dovoľuje tak regenerovať protoplasty, ktoré pochádzajú z lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, na celé rastliny, najmä ale na celé fertilné rastliny. Tým sa prvýkrát podarilo včleniť exogénnu DNA do genómu týchto rastlín, a tým zmeniť ich genotyp, prípadne fenotypy. Okrem toho sa môžu protoplasty spájať intrašpecificky alebo interšpecificky s inými protoplastmi, čím sa produkujú nové kombinácie nukleovej DNA alebo aj nové kombinácie z nukleovej a extranukleovej DNA. Ďalej sa tieto protoplasty môžu používať ako materiál schopný klonovania, na ktorom je možné uskutočňovať mutačné a selekčné kroky na prípravu požadovaného fenotypu.

Príklady žiaducich fenotypov zahrnujú rezistenciu proti toxickým koncentráciám prirodzených alebo syntetických chemikálií vrátane insekticídov, herbicídov, fúngicídov, baktericídov, ťažkých kovov, solí, patotoxínov, inhibítorov látkovej výmeny, ako aj štruktúrnych a funkčných analógov celulámych metabolitov bez toho, aby sa tento výpočet obmedzil len na uvedené chemikálie. Ďalšie príklady žiaducich fenotypov, na ktoré možno selektovať, obsahujú rezistenciu proti vplyvom životného prostredia ako studeným a teplým teplotám alebo biotickým agensom ako patogénom.

Ďalšie príklady uskutočnenia vynálezu slúžia iba na ilustráciu a vôbec nemajú obmedzovať predmet vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Výroba embryogénnych suspenzných kultúr z tkanív Dactylis glomerata L.

Ako východiskový materiál pre embryogénny kalus slúžia bazálne úseky najmladších listov rastlín Dactylis glomerata L. pestovaných v skleníku, ako je to opísané Hanningom a kol. (1982). Listy sa povrchovo sterilizujú 10-minútovým namáčaním do Cloroxovho roztoku zriedeného 1:10 (roztok 5,25 % (hm./obj.) chlómanu sodného, the Clorox Company, Oakland, CA94623, USA) a potom sa v sterilných podmienkach rozrežú na malé segmenty dlhé 1 až 5 mm alebo s priemerom 1 až 5 mm. Tieto segmenty sa nanesú na platne sterilného SH-30 média, ktoré obsahuje 0,8 % (hm./obj.) agarózy ako stužovacieho prostriedku. Pri kultivačnej teplote asi 25 °C sa počas 2 až 6 týždňov po nanesení segmentov na platne objaví kalus a/alebo embryogénne štruktúry.

Ako východiskový materiál na výrobu embryogénnych suspenzných kultúr slúži embryogénny kalus, z ktorého sa asi 0,5 g (hmotnosť čerstvého materiálu) prenesie do 50 ml kvapalného média opísaného Grayeom a kol. (1985), ktoré obsahuje 45 μΜ dicambu a 4 g/1 hydrolyzátu kazeínu. Suspenzné kultúry sa inkubujú v Delongových fľašiach, ktoré sú uzavreté kovovými viečkami a parafilmom®, pri teplote 27 °C a rytmu svetlo/tma 16 hodín svetlo (40 pE/m²s) a 8 hodín tma na kruhovej trepačke asi pri 130 otáčkach za minútu. Asi za 4 týždne sa nechajú asi 30 sekúnd sedimentovať veľké bunkové aglomeráty a potom sa odoberie 10 ml alik votnej časti z prebytku, ktorý obsahuje malé zhluky buniek a tieto sa prenesú na 50 ml čerstvého média. Tento postup sa opakuje každé 3 až 4 týždne, pričom sa vždy použije zhluk buniek sľubujúci najväčšiu úspešnosť, merané na menšiu veľkosť zhluku a lepšiu kvalitu, ktorú je možné docieliť v prítomnosti malých buniek bohatých na cytoplazmu. Po 5 až 8 prenosoch sú suspenzie v podstate zbavené preembryogénnych buniek a prevažná väčšina embryogénnych bunkových klastrov je relatívne malá (150 až 2000 pm).

Príklad 2

Izolácia a čistenie protoplastov Dactylis glomerata L.

Protoplasty sa získajú z embryogénnej suspenznej kultúry (príklad 1), pričom sa najskôr oddelia bunky pomocou sterilizačnej filtrácie cez Nalgene® s 0,2 pm filtračnou jednotkou a potom sa pridajú v množstve 0,5 g (hmotnosť čerstvého materiálu) k 12,5 ml zmesi protoplastov a enzýmov obsiahnutej v Petriho miske. Zmes enzýmov, ktorá pozostáva z

celulázy RS	2 % (hm./obj.)
CaCl2 x H2O	7 mM
NaH2PO4 x H2O	0,7 mM
MES (pH 5,6)	3,0 mM
glukóza (výsledná koncentrácia)	550 mOs/kg H2O (pH 5,6)

sa potom sterilizuje filtráciou. Zmes sa pohybuje na trepačke pri rýchlosti asi 500 otáčok za minútu za šera (< 5 pE/m²s) 4 až 5 hodín. Natrávený materiál sa potom filtruje cez sito z nerezovej ocele (veľkosť ôk 100 pm) a rozdelí sa do 12 centrifugačných skúmaviek, ktoré sa odstreďujú 5 minút asi pri 60 až 100 g. Sediment obsahujúci protoplasty sa potom trikrát premyje kultivačným médiom KM-8p protoplastov, ktoré je nastavené pomocou glukózy na osmotickú hodnotu 550 mOs/kg H₂O. Na tomto mieste je možné na ďalšie čistenie protoplastov zaradiť flotáciu. V tomto prípade sa premyté protoplasty nanesú na povrch KM-8p média nastaveného sacharózou na osmotickú hodnotu 700 Mos/kg H₂O. Po 10 minútovom odstreďovaní pri 60 až 100 g sa protoplasty koncentrované na spojovacej ploche odoberú pomocou jemných pipiet. Potom sa protoplasty resuspendujú v 1 až 2 ml KM-8p kultivačného média a sfiltrujú sa cez nerezové sito (20 pm). Uvoľnené protoplasty sa odoberú, premyjú a resuspendujú na kultiváciu v KM-8p médiu alebo aj v osmoticky prispôsobenom médiu, ktoré je vhodné na transformáciu podľa príkladu 6.

Príklad 3

Kultúra protoplastov Dactylis glomerata L. a rast kalusu

a) Vyčistené protoplasty sa nanesú v hustote asi 5 x 10⁵ protoplastov/ml na platne kultivačného KM-8p média, ktoré obsahuje 1,3 % (hm./obj.) Sea Plaque® Agarose (FMC Corp., Marine Colloids Division, Rockland, mame, USA) a 30 % až 40 % (obj./ obj.) kondicionovaného média). Kondicionované médium sa získa z 3 až 4 týždne starých embryogénnych suspenzných kultúr Dactylis glomerata L. tým, že sa tieto sfiltrujú cez sterilný Nalgene® filter (0,2 pm). Médium sa nastaví prísadou glukózy na osmotickú hodnotu 550 mOsm/kg H₂O a potom sa znovu sterilizuje pomocou filtrácie. Platne sa potom inkubujú v tme pri konštantnej teplote 28 °C. Po 10 až 14 dňoch sa agaróza rozreže na kúsky klinového tvaru a vnesie sa do „bead culture systém (Shillito a kol., 1983) použitím 20 ml SH-45 suspenzného kultivačného média s 3 % (hm./obj.) sacharózy na 3 ml pôvodnej kultúry stuženej agarózou. Platne sa dajú na trepačku a pohybuje sa nimi asi pri 50 otáčkach za minútu a pri intenzite osvetlenia 8 pE/m²s. Uvoľnením buniek z agarózy do kvapalného média, ktoré ju obklopuje, dôjde k vytvoreniu nových suspenzných kultúr. Výsledné bunky kultivo vané v suspenzii sa nanesú na platne SH-30 média stuženého agarózou a kultivujú sa až do vytvorenia kalusu v tme pri 25 °C.

b) Protoplasty sa kultivujú tak, ako to bolo opísané v príklade 3 a) s výnimkou, že kultivačné médium obsahuje prísadu 100 mg/l kyseliny O-salicylovej.

c) Protoplasty sa kultivujú tak, ako to bolo opísané v príklade 3 a) s výnimkou, že kultivačné médium obsahuje prísadu 30 mg/l kyseliny O-salicylovej.

d) Protoplasty' sa kultivujú tak, ako to bolo opísané v príklade 3 a) až c) s výnimkou, že kultivačné médium neobsahuje žiadne kondicionované médiu.

Príklad 4

Regenerácia rastlín Dactylis glomerata L. z kalusu, ktorý sa odvodzuje z protoplastov

a) Kalus Dactylis glomerata L. (môže sa získať spôsobom podľa príkladu 3), ktorý bol získaný z protoplastov, sa kultivuje na stuženom SH-30 médiu. Každé dva týždne sa zakladajú následné kultúry. Všetky embryá, ktoré sa za tento čas vyvinú, sa odoberú, nanesú sa na platňu média na klíčenie (SH-0) a inkubujú sa na svetle (45 pE/m²s). Klíčenie týchto embryí začne po 1 až 4 týždňoch. Rezultujúcc mladé rastlinky sa prenesú na SH médium, aby sa vytvoril systém koreňov, a tam sa na svetle inkubujú. Po dosiahnutí štádia 6 až 12 listov sa prenesú do skleníka a tam sa pozvoľne otepľujú.

b) Kalus, (môže sa získať spôsobom podľa príkladu 3), ktorý bol získaný z protoplastov, sa kultivuje na SH-0 médiu stuženom 0,24 % (hm./obj.) GelRite® na svetle (45 pE/m²s až 55 pE/m²s). Každé dva týždne sa zakladajú následné kultúry. Rezultujúce mladé rastlinky sa na tvorbu koreňov prenesú na médium, ktoré pozostáva zo zmesi SH0 média a OMS média v pomere 1:1, ktorá je spevnená kombináciou pozostávajúcou z 0,12 % (hm./obj.) GelRite® a 0,4 % (hm./obj.) agaru a kultivujú sa na svetle. Po dosiahnutí štádia 6 až 12 listov sa prenesú do skleníka a tam sa pozvoľne otužujú.

c) Mladé malé rastlinky sa získavajú spôsobom podľa príkladu 4 a) a b), prenesú sa na OMS médium s 0,8 % (hm./obj.) agaru a na tvorbu systému koreňov sa kultivujú na svetle. Po dosiahnutí štádia 6 až 12 listov sa prenesú do skleníka a tam sa pozvoľne otužujú.

d) Mladé malé rastlinky sa získavajú spôsobom podľa príkladu 4 a), na tvorbu koreňov sa prenesú na zmes médií, ktorá pozostáva z SH-0 média a OMS média a bola predtým stužená kombináciou pozostávajúcou z 0,12 % (hm./obj.) GelRite® a 0,4 % (hm./obj.) agaru a kultivujú sa na svetle. Po dosiahnutí štádia 6 až 12 listov sa prenesú do skleníka a tam sa pozvoľne otužujú.

Príklad 5

Konštrukcia plazmidu pCIB709, replikónu E. coli s génom rezistencie proti hygromycínu exprimovateľným v rastlinách (358/Hyg¹)

Kódujúca sekvencia štruktúrneho génu pre rezistenciu proti hygromycínu sa izoluje z plazmidu pLG90 (Gritz a Davies, 1983) vo forme BamHl fragmentu zahrnujúceho asi 1150 báz. Plazmid pLG90 sa môže pestovať spôsobom podľa Lindy Gritz (Applied Biotechnology, 80 Rogers St., Cambridge, Mass. 02141). Na konštrukciu plazmidu pCIB709 sa izolovaný BamHi fragment včlení do BamHl štiepacieho miesta pCIB709 (Rohstein a kol., 1987). Plazmid pCIB709 obsahuje regulačnú oblasť CaMV (Cauliílower Mosaic Vírus) 35S transkriptu, pričom oblasti promótora a terminátora sú oddelené singulárnymi BamHI štiepacími miestami.

Výsledný plazmid pCIB709 bol uložený v zbierke American Type Culture Collection (Rockville, Maryland,

USA) pod depozitným číslom ATCC 40428.

Pred použitím plazmidu na transformáciu sa plazmid pCIB709 môže linearizovať spracovaním s reštrikčným enzýmom PvuII. Tento konštrukt potom obsahuje gén rezistencie proti hygromycínu (aminoglykozidfosfotransferázu typu IV) spolu s 5' a 3' signálmi expresie CaMV 35S transkriptu z Cauliflower Mosaic Vírus (CaMV) v pCU plazmide. Sekvencia plazmidu pCIB709 je znázornená na obrázku 7.

Príklad 6

Transformácia protoplastov Dactylis glomerata L. pomocou elektroporácie

a) Bezprostredne po čistení protoplastov sa uskutoční elektroporácia podľa opisu v publikácii Shillita a kol. (1985), použitím plazmidu pCIB709 znázorneného na obrázku 7 v linearizovanej forme. Protoplasty sa po poslednom oplachovaní resuspendujú v hustote 7 x 10⁶ protoplastov/ml v elektroporačnom pufri (0,4 M manit, 6 mM MgCl₂). Protoplasty sa potom prenesú v alikvotnej časti 0,7 ml do plastových skúmaviek na odstreďovanie (10 ml). Potom sa k skúmavkám pridá plazmid-DNA (62 μΐ vody s PVUII naštiepeným plazmidom pCIB709 a teľacím brzlíkom-DNA spracovaný ultrazvukom (Sigma) vo výslednej koncentrácii 10 pg/ml (pCIB709), prípadne 50 pg/ml (teľací brzlík-DNA). Ďalej sa pridá 0,38 ml roztoku polyetylénglykolu (roztok PEG, 24 % (hm./obj.)) PEG 6000 v 0,4 M manite, 30 mM MgCl₂, 0,1 % (hm./obj.) MES (pH 5,6) a roztok sa starostlivo premieša. Suspenzia protoplastov sa potom prenesie do komory Dialóg® elektroporátora a pôsobí sa 10 pulzmi, ktoré vykazujú východiskové napätie 3250 V/cm a exponenciálnou konštantou tlmenia 10 psek a aplikujú sa v intervaloch 30 sekúnd. Vzorka sa potom vyberie z komory a prenesie sa do Petriho misiek s priemerom 10 cm. Po pridaní 10 ml KM-8p média s 1,2 % Sea Plaque® agarózou sa protoplasty rozdelia pred stuhnutím agarózy rovnomerne cez celý povrch média.

b) Príklad 6 a) sa opakuje s výnimkou, že východiskové napätie je v tomto prípade 3500 V/cm.

c) Príklad 6 a) sa opakuje s výnimkou, že východiskové napätie je v tomto prípade 4000 V/cm.

d) Príklad 6 a) sa opakuje s výnimkou, že východiskové napätie je v tomto prípade 5000 V/cm.

e) Príklad 6 a) sa opakuje s výnimkou, že východiskové napätie je v tomto prípade 3000 V/cm.

f) Príklad 6 a) sa opakuje s výnimkou, že východiskové napätie je v tomto prípade 2500 V/cm.

g) Príklady 6 a) až f) sa opakujú s výnimkou, že sa použije PEG s molekulárnou hmotnosťou 4000.

h) Príklady 6 a) až í) sa opakujú s výnimkou, že sa použije PEG s molekulárnou hmotnosťou 8000.

i) Príklady 6 a) až h) sa opakujú s výnimkou, že výsledná koncentrácia PEG sa pohybuje v rozmedzí 10 % až 30 % (hm./obj.).

j) Príklady 6 a) až i) sa opakujú s výnimkou, že sa dodatočne uskutoční spracovanie tepelným šokom podľa opisu Shillita a kol. (1985) a Potrykusa a kol. (1985).

Príklad 7

Transformácia protoplastov Dactylis glomerata L. pomocou spracovania polyetylénglykolom

a) Priamy prenos génu sprostredkovaný PEG sa uskutočňuje podľa opisu Negrutia a kol. (1987). Pri použitej DNA ide o linearizovaný plazmid pCIB709.

Protoplasty sa po poslednom opláchnutí suspendujú v

0,5 M roztoku manitu, ktorý obsahuje 15 mM chlorid horečnatý, v koncentrácii 2 x 10⁶ na ml. Suspenzia protoplastov sa rozdelí vo forme 1 ml alikvotnej časti do plastových centrifugačných skúmaviek (10 ml). Pred pridaním roztoku PEG (40 % (hm./obj.)) sa najskôr pridá, ako už bolo opísané v príklade 6, DNA. Roztoky sa starostlivo premiešajú a inkubujú 30 minút pri teplote miestnosti za občasného pretrepania. Potom sa pridá 1,4 ml premývacieho roztoku a jednotlivé súčasti vnesené do skúmavky sa starostlivo zmiešajú. Premývací roztok pozostáva z 87 mM manitu, 115 mM chloridu vápenatého, 27 mM chloridu horečnatého, 39 mM chloridu draselného, 7 mM Tris/HCl a 1,7 g/1 m-inozitu (pH 9,0). V odstupoch 4 minút sa pridajú ďalšie 1,4 ml alikvotné časti premývacieho roztoku a celá šarža sa teraz dobre premieša. Skúmavky sa potom odstreďujú 10 minút pri asi 60 g a horná oddelená časť sa vyhodí. Sedimentované protoplasty sa vyberú do 1 ml KM-8p média a prenesú do Petriho misiek s priemerom 10 cm. Po prídavku 10 ml KM-8p média s 1,2 % (hm./obj.) Sea Plaque® agarózou sa protoplasty rozdelia pred stuhnutím agarózy rovnomerne po celom médiu.

b) Transformácia sa uskutoční rovnako, ak to bolo opísané v príklade 7 a) s výnimkou, že pH premývacieho roztoku sa nastaví na hodnotu 5,6.

c) Transformácia sa uskutoční rovnako, ak to bolo opísané v príklade 7 a) s výnimkou, že pH premývacieho roztoku sa nastaví na hodnotu 7,0.

d) Transformácia sa uskutoční rovnako, ak to bolo opísané v príkladoch 7 a) až c) s výnimkou, že sa použije PEG, ktorý má molekulárnu hmotnosť 6000.

e) Transformácia sa uskutoční rovnako, ak to bolo opísané v príkladoch 7 a) až c) s výnimkou, že sa použije PEG, ktorý má molekulárnu hmotnosť 2000.

f) Transformácia sa uskutoční rovnako, ak to bolo opísané v príkladoch 7 a) až c) s výnimkou, že sa použije PEG, ktorý má molekulárnu hmotnosť 8000.

g) Transformácia sa uskutoční rovnako, ak to bolo opísané v príkladoch 7 a) až f) s výnimkou, že sa dodatočne uskutoční spracovanie tepelným šokom podľa Shillita a kol. (1985) a Potrykusa a kol. (1985).

h) Transformácia sa uskutoční rovnako, ak to bolo opísané v príkladoch 7 a) až g) s výnimkou, že premývací roztok pozostáva zo 154 mM chloridu sodného, 125 mM chloridu vápenatého a 5 mM glukózy aje nastavený hydroxidom draselným na pH 6,0.

i) Transformácia sa uskutoční rovnako, ak to bolo opísané v príkladoch 7 a) až g) s výnimkou, že premývací roztok pozostáva z 0,2 M chloridu vápenatého a 0,1 % (hm./obj.) MES a je nastavený hydroxidom draselným na pH 6,0.

j) Transformácia sa uskutoční rovnako, ak to bolo opísané v príkladoch 7 a) až g) s výnimkou, že premývací roztok pozostáva z 0,2 M chloridu vápenatého a 7 mM Tris/HCl aje nastavený hydroxidom draselným na pH 9,0.

Príklad 8

Transformácia protoplastov Dactylis glomerata L. pomocou elektroporácie alebo spracovaním polyetylénglykolom

a) Transformácia sa uskutoční rovnako, ako to bolo opísané v príkladoch 6 a 7 s výnimkou, že sa plazmid pCIB709, predtým než sa použije na transformáciu, štiepi reštrikčným enzýmom Bgl\.

b) Transformácia sa uskutoční rovnako, ako to bolo opísané v príkladoch 6 a 7 s výnimkou, že sa plazmid pCIB709, predtým než sa použije na transformáciu, štiepi reštrikčným enzýmom HindUl.

Príklad 9

Transformácia protoplastov Dactylis glomerata L. pomocou elektroporácie alebo spracovaním polyetylénglykolom

Transformácia sa uskutoční rovnako, ako to bolo opísané v príkladoch 6, 7 alebo 8 s výnimkou, že sa protoplasty pred rozdelením alikvotnej časti do jednotlivých centrifugačných skúmaviek na nasledujúcu transformáciu alebo aj po rozdelení alikvotnej časti a pred pridaním PEG spracovávajú 5 minút pri teplote 45 °C.

Príklad 10

Selekcia transformovaných kolónií

a) Kultivačné platne (Petriho misky) s protoplastmi sa inkubujú 10 dní pri teplote asi 25 °C v tme a potom sa na následnú kultiváciu („bead culture“, Shillito a kol., 1983) rozrežú na 5 rovnako veľkých kúskov. 4 kusy sa dajú do 20 ml SH-45 kultivačného média so 4 g/1 hydrolyzátu kazeínu a 20 pg/ml hygromycínu B. Piaty kus sa taktiež prenesie do 20 ml rovnakého média, ktoré ale neobsahuje hygromycín B a slúži ako neselektívna kontrola. Po 4 až 5 týždňoch sa pravdepodobne transformované kolónie buniek získané z protoplastov, ktoré rástli v prítomnosti hygromycínu B, vyrežú z agarózy a prenesú do Petriho misky s priemerom 19 mm, ktorá obsahuje 2 ml kvapalného SH-45 média s 20 pg/ml hygromycínu B. Petriho miskami sa pohybuje na trepačke s rýchlosťou asi 50 otáčok za minútu. Po ďalších 4 až 5 týždňoch sa všetky kolónie, ktoré vykazujú rast a vedú k novým suspenziám, prenesú do 125 ml Erlenmayerových fliaš a bez ohľadu na prídavok hygromycínu (20 pg/ml) sa kultivujú rovnako ako štartovacia kultúra.

Z nových suspenzií sa každý 1 až 3 týždne založia následné kultúry použitím SH-45 média so 4 g/1 hydrolyzátu kazeínu a 20 pg/ml hygromycínu B. Okrem toho sa bunky z týchto suspenzií nanesú na platne pevných médií s 20 pg/ml hygromycínu B a inkubujú sa pri 25 °C v tme. Z kalusov, ktoré sa vyvinú z týchto buniek nanesených na platniach, sa každé 2 až 3 týždne založia následné kultúry na čerstvom médiu. Vychádza sa z toho, že pri týchto bunkách, ktoré rástli v prítomnosti hygromycínu B, ide o transformanty.

b) Selekcia sa uskutočňuje tak, ako to je opísané v príklade 10 a), pričom sa ale v tomto prípade kolónie buniek získané z protoplastov, ktoré rástli v médiu obsahujúcom hygromycín B, prenesú na agarové platne s SH-30 médiom, ktoré obsahuje 20 pg/ml hygromycínu B, a inkubujú sa pri teplote 25 °C v tme.

Príklad 11

Regenerácia transformovaných rastlín Dactylis glomerata L.

Rastliny sa regenerujú rovnako, ako to bolo opísané v príklade 4, na netransformovaný materiál.

Príklad 12

Extrakcia DNA z kalusu a listového tkaniva

DNA sa extrahuje z kalusu a listov regenerovaných rastlín použitím modifikovanej CETAB metódy (Roger a Bendich, 1985). Tento spôsob je tu opísaný na príklade rastlín Dactylis glomerata L., ale môže sa rovnako úspešne používať aj pre tkanivo ľubovoľných iných rastlín z podčeľade Pooideae. Na získanie DNA z už opísaného materiálu možno však použiť aj akýkoľvek iný obvyklý spôsob extrakcie DNA.

Kalus vyrastený na SH-0 médiu a SH-30 médiu sa hlboko zmrazí suchým ľadom a potom sa pri teplote kvapalného dusíka rozotrie na jemný prášok. Takto získaný prášok sa potom prenesie na polypropylénové centrifugačné skúmavky (5 ml), ktoré boli vopred vychladené na teplotu kvapalného dusíka. Pritom je nutné dbať na to, aby sa prášok v žiadnom časovom okamihu počas tohto kroku nerozpustil. Prášok sa potom cez noc suší vymrazovaním a potom sa rozdelí do 2,2 ml Eppendorfových skúmaviek, pričom do každej skúmavky sa dá 0,5 ml prášku. Do každej skúmavky sa pridá 1 ml CETAB extrakčného pufra, potom sa skúmavky inkubujú pri teplote 60 °C asi 30 až 45 minút. Po ochladení na teplotu miestnosti sa pridá 1 ml zmesi chloroformu a izoamylalkoholu v pomere 24 : 1 a obsah sa dôkladne premieša. Potom nasleduje odstreďovanie, ktoré sa uskutočňuje 30 sekúnd pri 3000 otáčkach za minútu v Eppendorfovej centrifúge. Vodná fáza sa prenesie do novej skúmavky, pridá sa 1/10 objemu 10 % (hm./obj.) CETAB roztoku a opakuje sa extrakcia chloroformom. Vodná fáza sa znovu vnesie do novej skúmavky a doplní sa rovnakým objemom precipitačného pufra. Potom dôjde pri teplote miestnosti k vyzrážaniu DNA a RNA. Zrážanie sa nechá pokračovať 30 minút až 1 hodinu, kým sa skúmavky opäť necentriťugujú. Horná oddelená časť sa vyhodí a precipitát sa resuspenduje v TE pufri (pozri ďalej), ktorý· vykazuje vysokú koncentráciu soli, pri teplote 65 °C počas 30 minút. Použité pufre a roztoky:

CETAB extrakčný pufer	1 % (hm./obj.) CETAB Tris pH 8,0 (50 ml) EDTA (10 mM) NaCl (0,7 mM)
0,5 % (hm./obj.) PVP MG 360000 (PVP: polyvinylpyrolidín) 10% CETAB	10 % (hm./obj.) CETAB NaCl (0,7 mM)
precipitačný pufer	1 % (hm./obj.) CETAB Tris pH 8,0 (50 mM) EDTA (10 mM)
TE roztok (vysoká koncentrácia solí)	Tris pH 8,0 (10 mM) EDTA (1 mM)
NaCl(l M) TE pufor EDTA (1 mM)	Tris pH 8,0 (10 mM)
1/10 TE	Tris pH 8,0(1 mM) EDTA (0,1 mM)

Príklad 13 Čistenie DNA

DNA vyrobená spôsobom opísaným v príklade 12 alebo akýmkoľvek vhodným spôsobom sa môže čistiť použitím ľubovoľného známeho spôsobu. Príklady vhodných spôsobov sú bez toho, aby sa ich výpočet akokoľvek obmedzoval len na ne, etídiumbromid-CsCl gradientové odstreďovanie, spracovanie so zmesou fenolu a chloroformu, ako aj čistenie stupňovitým gradientom bez etídiumbromidu. Tieto spôsoby sú opísané Maniatisom a kol. (1982).

a) Čistenie spracovaním zmesou fenolu a chloroformu

Nukleové kyseliny z príkladu 12 sa vyzrážajú 2 objemovými dielmi studeného etanolu (-20 °C) a skúmavky sa odstreďujú 2 až 3 minúty pri 5000 g. Horná časť sedimentu sa odstráni a precipitát sa premyje 70 % a 100 % etanolom. Potom sa nukleové kyseliny sčasti usušia sterilným prúdom vzduchu. DNA sa cez noc rozpustí v 200 μί 1/10 TE pufru. Roztok DNA sa prenesie do Eppendorfových centriíugačných skúmaviek a pridá sa 10 μΐ roztoku RNAázy (2 mg/ ml), ktorá bola pred tým zahriata, aby sa prípadne prítomná DNAáza deaktivovala, predtým ako sa skúmavky inkubujú pri 37 °C asi 1 hodinu. Potom sa pridá 0,25 objemového dielu 5 M roztoku chloridu sodného a DNA sa vy zráža prídavkom 0,4 objemového dielu 30 % roztoku PEG (MG 6000 až 8000), ktorý obsahuje 1,5 M roztok chloridu sodného, ako aj jednohodinovou inkubáciou pri -20 °C. Skúmavky sa potom odstred’ujú 5 minút, horná oddelená časť sa vyhodí a precipitáty sa premyjú studeným absolútnym etanolom. Po krátkom sušení v sterilnom prúde vzduchu sa pelety resuspendujú v 0,3 ml TE pufra. Tento roztok sa extrahuje zmesou fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu (25 : 24 : 1), ktorá je ekvilibrovaná TE pufrom, a 30 sekúnd sa odstred’uje v Eppendorfovej odstredivke. Potom sa vodná fáza prenesie do novej skúmavky. Roztok sa extrahuje zmesou chloroformu a izoamylalkoholu (24:1) a 30 sekúnd sa odstred’uje a potom sa vodná fáza prenesie do novej skúmavky. Extrakcia chloroformom sa opakuje. Potom sa na vyzrážanie DNA pridá 1/10 objemu 3 M roztoku acetátu sodného a potom 2 objemové diely ľadom ochladeného etanolu. Precipitát sa zbiera pomocou odstreďovania, premyje sa 70 % a 100 % etanolom, krátky čas sa suší v sterilným prúdom vzduchu a potom sa rozpustí v dostatočnom množstve TE pufra, takže sa získa roztok na analýzu Southern blot, ktorá vykazuje koncentráciu DNA medzi 0,25 pg/μΐ až 1 pg/μΐ.

b) Čistenie cez stupňové gradienty bez etídiumbromidu

Nukleové kyseliny sa čistia cez CsCl stupňový gradient, ktorý pozostáva z 5,7 M CsCl (v TE pufri) dolnej vrstvy a nad ňou uloženej vrstvy z 1,0 M CsCl v TE pufri. Nukleové kyseliny sa inkorporujú v hornej vrstve. Skúmavky, ktoré obsahujú stupňový gradient a odstred’ujú cez noc v odstredivke s excentrický rotujúcim rotorom (napríklad Beckmann SW 50.1, 45000 otáčok za minútu). DNA sa izoluje z oblasti hraničných plôch, zatiaľ čo RNA sa môže získať z dna skúmavky. DNA sa zriedi 2 objemovými dielmi vody a vyzráža sa tak, ako to bolo opísané v príklade 13 a), 2 objemovými dielmi ľadovo studeného etanolu. Precipitáty sa potom resuspendujú v TE pufri, znovu sa precipitujú etanolom a použijú sa na analýzu Southem blot.

Príklad 14

Dôkaz cudzorodých sekvencií DNA v genóme transformovaných rastlín Dactylis glomerata L. pomocou analýzy Southem blot

Southemova hybridizácia sa v podstate uskutočňuje podľa spôsobu opísaného Maniatisom a kol. (1982). DNA z rastlín Dactylis glomerata L. (vyčistená spôsobmi opísanými v príkladoch 13 a) a 13 b)) sa štiepi reštrikčným enzýmom BamHl. 5 pg rozštiepeného materiálu sa nanesie na 1 % agarózový gél a rozdelí sa podľa veľkosti fragmentov. Na gél sa pôsobí asi 20 minút 0,25 M kyselinou chlorovodíkovou, potom sa opláchne vodou a ďalších 30 minút sa pôsobí 0,4 M hydroxidom sodným. DNA sa potom cez noc prenesie obvyklým spôsobom na Gene Screen Plus® (NEN Res. Products Kat. Nr. NEF 976, šarža č. 330GP62), (ako to bolo opísané v návode, ktorý sa dodáva spolu s produktom), pričom sa ako prenosový pufor použije 0,4 M hydroxid sodný. Po nočnom prenose sa odstráni filter, dvakrát sa premýva SSC (0,3 M roztok chloridu sodného, 0,03 M roztok citrátu sodného) asi 5 minút a potom sa usuší na vzduchu. Blot sa prehybridizováva 4 hodiny pri teplote 65 °C pufrom, ktorý obsahuje 10 g/1 albumínu hovädzieho séra (Fat Free Sigma, Kat. č. A-4503), 7 % SDS, 1 mM NaED-TA a 0,52 M nátrium fosforečnanový pufer (pH 7,0). Pomocou metódy „Random Printer“ sa potom pripraví použitím IBI „Printer Time“ značiaceho kitu alebo ľubovoľnej inej metódy, rádioaktívne značená vzorka, ktorá sa pomocou „Spin“ stĺpca zbaví prebytočných nukleotidov. Vzorka DNA pozostáva z fragmentu pCIB709, ktorý obsa huje oblasť promótora 35S, ako aj štruktúrny gén aminoglykozidtransferázy typu IV. Hybridizačná reakcia sa uskutočňuje cez noc pri teplote 65 °C. Blot sa potom štyrikrát opláchne SW premývacím pufrom, pričom 2 posledné opláchnutia sa uskutočnia pri teplote 65 °C. Potom sa blot ešte ďalej oplachuje počas 2 hodín v 0,2 x SSC s 1 % SDS a 5 mM NaEDTA pri 65 °C. Mokrý blot sa zabalí do svetlo priepustnej fólie pre domácnosť (Saranwrap®) alebo do ľubovoľnej inej vhodnej fólie a vyvíja sa pomocou rontgenového filmu (Kodak X-Omat AR film, Eastman Kodak, Rochester, NY 14650, kat. č. 165 1454). Vyhodnotenie vyvolaného rôntgenového filmu jednoznačne ukazuje na hybridizáciu medzi vzorkou a DNA, ktorá bola získaná z kalusu transformovaného pCIB709 alebo z rastliny transformovanej pC!B709. pCIB709 je teda jednoznačne včlenená do vysokomolekulárnych DNA transformantov.

Roztoky a pufre
SW hybridizačný pufer	1 % (hm./obj.) albumín hovädzieho séra (bez tuku) 0,52 M fosforečnan sodný, pH 7,0 7 % (hm./obj.) SDS 1 mM NaEDTA
premývací roztok	0,04 M fosforečnan sodný, pH 7,0 1 mM NaEDTA 1 % (hm./obj.) SDS 0,123 M chlorid sodný

Príklad 15

Konzervácia kultúr kalusu Dactylis glomerata L. chladom

1. Aktívne rastúci kalus rastlín Dactylis glomerata L. sa prenesie do kvapalného média SH-0. Množstvo kalusu sa obvykle pohybuje okolo 0,5 g až 1 g kalusu na 20 ml kultivačného média. Fľaškami s kalusom sa opatrne pohybuje a mieša, aby sa hrudky kalusu dezintegrovali a dispergovali. Kultúry, ako aj prostriedok chrániaci proti mrazu sa potom ochladí oddelene na ľade.

2. Potom sa počas 5 minút pridáva rovnaký objem roztoku P prostriedku proti zamŕzaniu a zmes sa ponechá 1 hodinu na ľade. Počas tohto času sa 1,0 ml alikvotné časti rozdelia do označených predchladených plastových fľaštičiek, ktoré sú vhodné na konzerváciu chladom (napríklad Vangard Cryos Cryogenic Vials, Sumitomo Bakelite Co. Ltd., Japan, kat. č. MS4502) a inkubujú sa na ľade. Mrazuvzdorný roztok P obsahuje 1 M glycerín, 1 M L-prolín, 2 M dimetylsulfoxid (DMSO, Sigma, kat. č. D2650, č. šarže 57F-8816) vo vode, pH 5,6. Tento roztok sa pred každým použitím pripravuje čerstvý (glycerín/prolín/voda - zmes sa môže uchovávať hlboko zmrazená).

3. Po jednohodinovej spoločnej inkubácii buniek a prostriedku chrániaceho proti zamrznutiu sa nádoby ponoria do kvapalného kúpeľa s teplotou 0 °C. Kúpeľ môže pozostávať buď z etanolu alebo akéhokoľvek iného, ľubovoľného, známeho a vhodného chladivá. Kúpeľ je vybavený miešadlom, ktoré zaisťuje stále premiešavanie chladivá a je spojené so zariadením, ktoré umožňuje ochladenie chladivá na kontrolovateľnú hodnotu.

4. Ak sa nádoby nachádzajú v chladivé, redukuje sa teplota asi na hodnotu 0,5 °C/minútu. Hneď ako teplota dosiahne -40 °C, ponoria sa nádoby do kvapalného dusíka a tam sa uchovávajú buď samotné alebo aj v plynnej atmosfére, ktorá sa nachádza nad ňou, pričom by teplota nemala prestúpiť-100 °C.

Príklad 16

Konzervácia embryogénnych buniek bunkových kultúr Dactylis glomerata L. v chlade

a) 1. Suspenzná kultúra buniek Dactylis glomerata L. sa prenesie po 2 až 10 dňoch po založení následnej kultúry na ľad a chladí sa. Roztok prostriedku chrániaceho pred zamrznutím sa obvykle taktiež chladí na ľade. Prostriedok chrániaci pred zamrznutím obsahuje 1 M glycerín, 1 M L-prolín, 2 M dimetylsulfoxid (DMSO) vo vode, pH 5,6. Tento prostriedok sa pred každým použitím pripravuje čerstvý (glycerín/prolín/voda - zmes sa môže uchovávať hlboko zmrazená).

2. Prostriedok chrániaci pred zamŕzaním sa pridáva počas 5 minút k suspenzii. Bunky zostanú potom v chladivé 1 hodinu za stáleho chladenia ľadom. Počas tohto času alebo po jeho uplynutí sa odoberú alikvotné časti, rozdelia sa do nádob a ponechajú sa na ľade. Nádoby sa potom ďalej spracovávajú, ako to bolo opísané v príklade 15 pre kalus.

b) Konzervácia v chlade sa uskutočňuje podľa opisu, ktorý je uvedený v príklade 16 a) s výnimkou, že chladivo v spôsobovom kroku 1 pozostáva z 1 M glycerínu, 1 M sacharózy a 2 M DMSO vo vode, pH 5,6.

Príklad 17

Spätné získanie kultúr schopných rastu z materiálu Dactylis glomerata L. konzervovaného v chlade

a) 1. Obsah nádoby spracovaný podľa príkladu 15 sa vyberie spolu s nádobou z kvapalného dusíka.

2. Obsah nádoby sa nechá rozpustiť tým, že sa nechá stáť pri teplote miestnosti až sa všetok ľad nerozpustí.

3. Obsah nádoby sa rozdelí na SH-0 kultivačnom médiu spevnenom GelRite® alebo agarom. Pritom sa spravidla rozdelí po 0,5 ml roztopeného materiálu na jednu Petriho misku (10 cm priemer), ktorá obsahuje 30 ml až 50 ml kultivačného média. Pevné médiá sa buď nalejú na šikmý agar alebo sa nalejú do vyhĺbených otvorov, aby sa umožnil odtok prípadne ešte zvyšného prostriedku chrániaceho pred zamrznutím z buniek.

4. Materiál sa inkubuje na médiu pri teplote 27 °C v tme. Rast začne po 1 až 4 týždňoch. Potom sa z tohto kalusu, ako už bolo opísané pre normálny kalus, založia následné kultúry.

b) Spätné získanie kultúr schopných rastu z materiálu Dactylis glomerata L. konzervovaného v chlade sa uskutočňuje podľa opisu v príklade 17 a). Roztopenie nádob pri spôsobovom kroku 2) prebieha v tomto prípade rýchlejšie tým, že sa nádoba vloží do vodného kúpeľa asi s teplotou asi 40 °C a tam sa nechá kým sa všetok ľad nerozpustí.

Príklad 18

Konzervácia Zea mays kalusu v chlade

Konzervácia aktívne rastúceho kalusu Zea mays v chlade sa uskutočňuje podľa opisu uvedeného pre Dactylis glomerata L. v príklade 15.

Príklad 19

Konzervácia embryogénnych buniek suspenzných kultúr Zea mays v chlade

Konzervácia embryogénnych buniek suspenzných kultúr Zea mays v chlade sa uskutočňuje podľa opisu uvedeného pre Dactylis glomerata L. v príkladoch 16 a) a 16 b).

Príklad 20

Spätné získanie rastu schopných kultúr z materiálu Zea mays konzervovaného v chlade sa uskutočňuje podľa opisu uvedeného pre Dactylis glomerata L. v príkladoch 17 a) a 17 b).

Claims (33)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Embryogénna bunková kultúra, ktorá je odvodená od lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, a z ktorej sa môžu izolovať protoplasty, pri ktorých dochádza k regenerácii bunkových stien, a ktoré sa oddelia a nakoniec vytvoria kalus schopný regenerácie na kompletnú rastlinu, ktorá sa dá získať:

   a) izoláciou tkaniva z vhodných častí rastlín podčeľade Pooideae;

   b) kultiváciou tohto tkaniva v médiu, ktoré je schopné indukovať vytvorenie embryogénneho kalusu alebo embryí;

   c) periodickou subkultiváciou kalusu a embryí na čerstvom médiu prenesením malých bunkových zhlukov obsahujúcich bunky bohaté na cytoplazmu na čerstvé médium schopné udržať kontinuálnu proliferáciu; a

   d) po 0 až 500 prenosoch izoláciou zhlukov embryogénnych buniek s veľkosťou od 150 pm do 2000 pm.
2. 2. Embryogénna bunková kultúra podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že regenerované rastliny sú fertilné rastliny.
3. 3. Embryogénna bunková kultúra podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že rastliny Pooideae sú trávy alebo obilniny s malými zrnami.
4. 4. Embryogénna bunková kultúra podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že uvedené trávy sa vyberú z rodov zahrnujúcich Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus a Dactylis.
5. 5. Embryogénna bunková kultúra podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že uvedené obilniny s malými zrnami sa vyberú z rodov J vena, Triticum, Secale a Hordeum.
6. 6. Spôsob prípravy protoplastov schopných regenerácie na kompletné rastliny, pochádzajúcich z lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

   a) izoláciu tkaniva z vhodných častí rastlín podčeľade Pooideae;

   b) kultiváciu tohto tkaniva v médiu, ktoré je schopné indukovať vytvorenie embryogénneho kalusu alebo embryí;

   c) periodickú subkultiváciu embryogénneho kalusu a embryí na čerstvom médiu, prenesením malých zhlukov buniek obsahujúcich bunky bohaté na cytoplazmu na čerstvé médium schopné udržať kontinuálnu proliferáciu; a

   d) po 0 až 500 prenosoch izoláciu zhlukov embryogénnych buniek s veľkosťou od 150 pm do 2000 pm; a

   e) odstránenie bunkových stien pomocou vhodných enzýmov a izoláciu výsledných protoplastov.
7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že protoplasty Pooideae sú schopné regenerácie na kompletné fertilné rastliny.
8. 8. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že tkanivo z kroku (a) sa izoluje z bazálnych častí mladých vnútorných listov, nezrelých sexuálnych embryí, nezrelých súkvetí, zrelých semien alebo tkaniva výhonkov rastlín podčeľade Pooideae.
9. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že tkanivo z kroku (a) sa izoluje z najmladších najvnútornejších listov.
10. 10. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že izolácia zhlukov emryogénnych buniek sa uskutočňuje po 0 až 100 prenosoch.
11. 11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že izolácia zhlukov emryogénnych buniek sa uskutočňuje po 3 až 50 prenosoch.
12. 12. Spôsob prípravy bunkovej kultúry schopnej regenerácie na kompletné rastliny pochádzajúcej z lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    a) izoláciu tkaniva z vhodných častí rastlín podčeľade Pooideae·,

    b) kultiváciu tohto tkaniva v médiu, ktoré je schopné indukovať vytvorenie embryogénneho kalusu alebo embryí;

    c) periodickú subkultiváciu embryogénneho kalusu a embryí na čerstvom médiu prenesením malých zhlukov buniek obsahujúcich bunky bohaté na cytoplazmu na čerstvé médium schopné udržať kontinuálnu proliferáciu;

    d) po 0 až 500 prenosoch izoláciou zhlukov embryogénnych buniek s veľkosťou od 150 pm do 2000 pm;

    e) odstránenie bunkových stien s pomocou alebo bez pomoci vhodných enzýmov a izoláciu výsledných protoplastov;

    f) kultiváciu protoplastov z kroku (e) alebo rastlinných buniek z kroku (d) vo vhodnom kultivačnom médiu, pokiaľ sa nevytvoria bunkové kolónie;

    g) kultiváciu bunkových kolónií alebo ich častí na vhodnom médiu, ktoré podporuje vytvorenie bunkovej kultúry; a

    h) izoláciu výsledných bunkových kultúr.
13. 13. Spôsob prípravy bunkovej kultúry podľa nároku 12, ktorá je schopná regenerácie na kompletné rastliny, pochádzajúcej z lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    a) kultiváciu protoplastov alebo rastlinných buniek vo vhodnom kultivačnom médiu v čase dostatočnom na to, aby sa podporilo vytvorenie bunkovej kultúry, až kým sa nevytvoria bunkové kolónie; a

    b) izoláciu výsledných bunkových kultúr.
14. 14. Spôsob prípravy bunkovej kultúry podľa jedného z nárokov 12 alebo 13, vyznačujúci sa tým, že bunková kultúra je schopná regenerácie na kompletné fertilné rastliny.
15. 15. Spôsob podľa jedného z nárokov 12 až 14, vyznačujúci sa tým, že bunková kultúra je suspenzná bunková kultúra.
16. 16. Spôsob podľa jedného z nárokov 12 až 14, vyznačujúci sa tým, že bunková kultúra je kalusová kultúra.
17. 17. Spôsob podľa jedného z nárokov 12 alebo 13, vyznačujúci sa tým, že krok (a) sa uskutočňuje v prítomnosti agarózy ako činidla na tuhnutie.
18. 18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa roztavenie stuhnutého agarózového média z kroku (a) alebo jeho segmentáciu, prenesenie taveného alebo segmentovaného agarózového média do tekutého média a pokračovanie kultivácie až kým sa nevytvoria bunkové kolónie.
19. 19. Spôsob podľa jedného z nárokov 12 alebo 13, vyznačujúci sa tým, že časti bunkovej kolónie v kroku (b) sú bunky uvoľnené z bunkových kolónií.
20. 20. Spôsob podľa jedného z nárokov 12 alebo 13, vyznačujúci sa tým, že protoplasty alebo bunky obsahujúce exogénnu DNA stabilne integrovanú do ich genómu, pričom táto DNA sa nemôže integrovať do genómu prirodzeným spôsobom.
21. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že integrovaná exogénna DNA sa môže exprimovať v rastlinných bunkách.
22. 22. Spôsob regenerácie lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    a) kultiváciu bunkových kultúr podľa nároku 12, až kým sa nevyvinú embryá;

    b) kultiváciu embryí na médiu vhodnom na indukciu zrenia a pučania embryí; a

    c) ďalšiu kultiváciu výsledných rastliniek, až kým sa nevyvinú dostatočne na to, aby sa preniesli do pôdy.
23. 23. Spôsob regenerácie fertilných lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    a) kultiváciu bunkových kultúr podľa nároku 12 až kým sa nevyvinú embryá;

    b) kultiváciu embryí na médiu vhodnom na indukciu zrenia a pučania embryí; a

    c) ďalšiu kultiváciu výsledných rastliniek, až kým sa nevyvinú dostatočne na to, aby sa preniesli do pôdy; a

    d) získanie semien nasledujúce po kontrolovanom alebo otvorenom opelení.
24. 24. Spôsob podľa jedného z nárokov 22 alebo 23, vyznačujúci sa tým, že rastlinné bunky tvoriace kalus obsahujú exogénnu DNA stabilne integrovanú do ich genómu, pričom táto DNA sa nemôže integrovať do genómu prirodzeným spôsobom.
25. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že integrovaná exogénna DNA sa môže exprimovať v rastlinných bunkách.
26. 26. Spôsob prípravy transgénnych lipnicovitých rastlín podčeľade Pooideae, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    a) transformáciu protoplastov podľa nároku 6 exogénnou DNA použitím známych transformačných metód, pričom táto DNA sa nemôže integrovať do genómu prirodzeným spôsobom,

    b) kultiváciu transformovaných protoplastov podľa jedného z nárokov 12 alebo 13, a

    c) regeneráciu kompletných rastlín podľa jedného z nárokov 22 alebo 23.
27. 27. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že exogénna DNA obsahuje jeden alebo viac chimérických génov, ktoré poskytujú transformovaným protoplastom a tkanivám odvodeným od týchto protoplastov obzvlášť rastlinám výhodné vlastnosti.
28. 28. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že exogénna DNA obsahuje nekódujúcu DNA s regulačnou funkciou.
29. 29. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že spôsob na priamy prenos génu sa použije v kroku (a) na transformáciu protoplastov.
30. 30. Lipnicovité rastliny podčeľade Pooideae a ich propaguly, pričom uvedená rastlina je fertilná rastlina získaná regeneráciou začínajúcou z embryogénnej bunkovej kultúry podľa jedného z nárokov 1 až 5 a ktorých propaguly obsahujú exogénnu DNA stabilne inkorporovanú do rastlinného genómu, pričom DNA sa môže exprimovať v rastlinách alebo rastlinných bunkách a nemôže sa integrovať do genómu prirodzeným spôsobom.
31. 31. Propaguly podľa nároku 30, vyznačujúce sa tým, že obsahujú rastlinný materiál schopný rozmnožovať sa sexuálne alebo asexuálne, a in vitro alebo in vivo.
32. 32. Propaguly podľa nároku 31, vyznačujúce sa tým, že zahrnujú protoplasty, bunky, kalusy, tkanivo, orgány, zygoty, embryá alebo semená, ktoré pochádzajú z transgénnych rastlín Pooideae podľa nároku 30.
33. 33. Potomstvo rastlín podľa nároku 30, ktorého genóm obsahuje uvedenú exogénnu DNA.