CZ289790B6 - Embryogenní buněčná kultura a způsob regenerace lipnicovitých rostlin (Gramineae) podčeledi Pooideae z protoplastů - Google Patents

Abstract

e en se t²k embryogenn ch bun n²ch kultur lipnicovit²ch rostlin, ze kter²ch se mohou regenerovat ·pln rostliny, zejm na ·pln fertiln rostliny. Poskytuje zp sob regenerace rostlin a zp sob p° pravy transgenn ch rostlin, fertiln lipnicovit rostliny pod eledi Pooideae a jejich rozmno ovac materi l.\

Description

Embryogenní buněčná kultura a způsob regenerace lipnicovitých rostlin (Gramineae) podčeledi Pooideae z protoplastů

Předkládaný vynález se týká využitelného způsobu regenerace trav z podčeledi (subfamilia) Pooideae z protoplastů, připravených z protoplastů s regenerovanými buněčnými stěnami (rostlinných buněk) nebo z kalusů, získaných z protoplastů, a dále se týká takto připravených rostlin a jejich rozmnožovacího materiálu.

Vynález se konkrétně týká embryogenních buněčných kultur (suspenzní kultura nebo kalus) a kalusů, které jsou vhodné jako výchozí materiál pro přípravu protoplastů, ze kterých se pak regenerují celé rostliny. Vynález se dále týká způsobu přípravy embryogenních kultur a embryogenního kalusu, a způsobu přípravy transgenních rostlin podčeledi Pooideae, a sice regenerací geneticky modifikovaných protoplastů.

Většina rostlin, na kterých je v první řadě závislá výživa lidí, patří ke skupině rostlin, které jsou známé pod hromadným názvem Gramineae /lipnicovité/. Graminae /Poaceae - lipnicovité/ jsou z hlediska komerčního pohledu nejvýznamnější čeledí uvnitř Linnéovy soustavy monokotyledonních rostlin. K travám patří například následující podčeledi a rody:

podčeleď	rod uvnitř podčeledi
Bambusoideae Andropogonoideae Arundineae Oryzoideae Panicoideae Pooideae /Festuciadeae/	bamboo Sacharum /třtina cukrová/ sorghum zea /kukuřice/ Phragmites /rákos obecný/ Oryza /rýže/ Panicům Λ/ Pennisetum Λ/ Setaria /+/ Poa ΓΊ Festuca T+! Lolium T*/ Bromus / Trisetum Λ1/ Agrostis Λ7 Phleum Λ7 Dactylis Λ7 Alopecurus Λ7 Avena /oves -/ Triticum /pšenice ~/ Secale /žito ~/ Hordeum /ječmen -/

+ proso ++ trávy ~ malozmé obilí

Uvnitř podčeledi Gramineae tvoří Pooideae posuzováno z ekonomických hledisek velmi významnou skupinu rostlin. Ktomu patří například i obě blízce příbuzné podrody tráv a malozmých obilí.

Je zajímavé, že právě rostliny z této podčeledi Pooideae patří k rostlinám, s nimiž se dá pomocí vědeckých metod nejobtížněji manipulovat. V souladu s tím, nejsou až dodnes známy žádné generální způsoby, které dovolují regeneraci rostlin, fertilních rostlin nebo transgenových rostlin se stabilně vestavěnou exogenní DNA z podčeledi Pooideae vycházeje od protoplastů, ačkoliv taková regenerace z kultivovaných protoplastů, například pro použití somatické hybridizace a pro výrobu transgenových rostlin pomocí přímého transferu genu je předpokladem. Nynější stav vědomostí v oblasti transformace obilí byl krátce shrnut v přehnaném článku napsaném Cocking aDavey, 1987.

-1 CZ 289790 B6

Popis výchozího materiálu pro kultury obilí, protoplastů jakož i způsobu izolace protoplastů z obilí a jejich vlastnostech je zveřejněn například v publikaci: „Cereal Tissue and Cell Culture“; Bright SWJ a Jones MGK, /eds/ /1985/ Nijhoff M; Junk W., Dordrecht.

Stabilní transformace se dala dosáhnout již chemicky a elektricky stimulovaným včleněním DNA do protoplastů /“Direkter Gentransfer“, Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 1986/, zatím co regenerace celé rostliny, vycházeje z linie buněk v této studii, nebyla možná.

Až dosud se daly s úspěchem regenerovat jen takové rostliny ze skupiny Graminae, které nepatří kpodčeledi Pooideae. Abdullah et al. /1986/ zpravují například o eficientní regeneraci rostlin pomocí somatické embryogenéze vycházeje z protoplastů rýže /podčeleď Oryzoideae/. I Yamada et al., /1986/ popisují regeneraci rostlin u rýže vycházeje od kalusů, které se odvozují od protoplastů. Rhodes et al., /1988/ popisují regeneraci nefertibilních rostlin kukuřice. Cocking a Davey /1987/ diskutují o přítomném stavu vědomostí v oblasti transferu genů u rostlin obilí.

Regenerace rostlin čeledi Graminae a podčeledi Pooideae vycházeje od tkáňových kultur je známa. Hanning et al. /1982/ popisují vývoj embrya a klíčků u Dactylis glomerata L., vycházeje o tkáně kalusu, která se vyvíjí z listových segmentů.

Dále jsou uvedeny příkladně další rostliny z podčeledi Pooideae, jejichž regenerace z kultivovaných buněk je popsána v následujících článcích:

Lolium rigidum /Skene et al., 1983/; Lolium perenne, Lolium multiflorum /Ahloowalia, 1975/; Lolium multiflorum, Festuca arundinacea /Kaperbauer et al., 1979/; Alopecurus arundimaceus, Agropyron crystatum, Štípa viridula, Bromus inermis, Agropyron amithii /Lo et al., 1980/ a Agrostis palustris /Krans et al., 1982/.

Další přehled o tkáňových kulturách u krmných trav se nachází u Ahloowalia, /1984/.

Ve shora uvedených případech nevychází regenerace ze stejného výchozího materiálu, který je uveden v předloženém vynálezu, nýbrž z jiného typu buněčné kultury. V žádném ze shora uvedených příkladů nemohlo být prokázáno, že se regenerace provádí de novo přes somatickou embryogenezi. Shora citované reference kromě toho neobsahují žádné údaje o izolaci a kultivaci protoplastů nebo regeneraci rostlin z protoplastů.

Z toho vyplývá, že navzdory velkému zájmu o genetickou transformaci a regeneraci trav z pod čeledi Pooideae až dodnes neexistuje žádný způsob in vitro, který dovoluje úspěšně regenerovat rostliny nebo fertilní rostliny z protoplastů, které mohou být popřípadě transformovány /Cocking a Davey, 1987/.

Až dosud zůstal veškerý výzkum a snahy vyvíjené v tomto směru bezvýsledné, tzn., že vedou buď pouze k embryím, nebo ale i k rostlinám, které nejsou schopny života, a které již v ranné vývojové fázi odumírají, a proto není možné je úspěšně přesazovat do země /Ahloowalia, 1984/.

Vzhledem k tomu tedy až dosud neměla veřejnost k dispozici žádný způsob, který by dovoloval výrobu protoplastů z podčeledi Pooideae, které by byly schopné diferenciace na celé rostliny a s výhodou na celé fertilní rostliny, natož pak způsob regenerace rostlin z podčeledi Pooideae vycházeje z protoplastů nebo z kalusů, které pocházejí z protoplastů.

Tyto a jiné úlohy mohly být nyní vyřešeny v rámci předloženého vynálezu, který zveřejňuje způsob výroby protoplastů, které jsou schopny vytvořit kolonie buněk a kolonie kalusu. Protoplasty se mohou, pokud to je požadováno, transformovat, přičemž vznikají kalusy jsou schopny se regenerovat na celé rostliny /Pooideae/. Uvedený způsob výroby protoplastů, které jsou schopné se dělit a vyvinout kalus, který se pak může regenerovat na celé rostliny, vyžaduje nové embryogenní buněčné kultury /suspenzní kultury nebo kalusové kultury/ nebo embrya jako

-2CZ 289790 B6 výchozí materiál. Tyto embryogenní buněčné kultury a embrya jakož i způsobu jejich výroby a identifikace jsou popsány v předloženém vynálezu a tvoří rovněž součást tohoto vynálezu.

Jako výchozí materiál pro protoplasty se může kromě toho používat embryogenní kalus, z něhož se odvozují suspenze. Tento kalus jakož i suspenze, embrya a způsob jejich výroby a identifikace jsou popsány v předložené přihlášce vynálezu a tvoří rovněž součást vynálezu.

Tyto embryogenní kultuiy tvoří zdroj protoplastů, které se mohou transformovat exogenní DNA a které jsou schopny dělit buňky a vytvářet kalus. Tento kalus se může potom regenerovat na celé rostliny, včetně celých fertilních rostlin, které jsou schopné růst v zemi.

V době, kdy vznikal tento vynález, nebylo možné odvodit ze stavu techniky, že je možné regenerovat trávy, zejména fertilní trávy z podčeledi Pooideae vycházeje od protoplastů nebo i od buněk nebo kalusů, které pocházejí z protoplastů. Ještě méně se dalo předvídat, že se protoplasty rostlin z podčeledi Pooideae, které obsahují exogenní DNA stabilně vestavěnou do jejich genomu, rovněž regenerovat za vzniku transgenových rostlin, zejména ale za vzniku fertilních transgenových rostlin.

Tento vynález se týká v první řadě embryogenních buněčných kultur /suspenzních nebo kalusových kultur/, které se odvozují od trav z podčeledi Pooideae, od nichž se mohou izolovat protoplasty, přičemž uvedené protoplasty nejdříve regenerují buněčné stěny, dělí se a posléze vytváří kalus, který se může regenerovat na celou rostlinu, včetně celých fertilních rostlin.

Předložený vynález se kromě toho týká protoplastů rostlin z podčeledi Pooideae a z nich rezultujících rostlinných buněk /po regeneraci buněčných stěn/, které se mohou regenerovat na celé rostliny, s výhodou na celé fertilní rostliny, zejména ale i protoplastů, které pochází z buněčných kultur nebo z embryogenních suspenzí buněk.

Další předmět vynálezu tvoří rostlinné buňky, kalusy, embryogenní suspenze buněk, mladé rostliny jakož i rostliny, které se odvozují od uvedených protoplastů.

Kromě toho zahrnuje předložený vynález regenerované rostliny tráv z podčeledi Pooideae, jakož i jejich rozmnožovací materiály, které se odvozují od protoplastů nebo rostlinných buněk, které obsahují exogenní DNA vestavěn do jejich genomu, s výhodou ale exogenní DNA, která se může v rostlinách exprimovat. Pod pojmem rozmnožovací materiál se v rámci toho vynálezu rozumí každý rostlinný materiál, který se dá sexuálně nebo asexuálně nebo in vitro nebo in vivo rozmnožovat, přičemž výhodné jsou protoplasty, buňky, kalusy, tkáně, orgány, zygoty, embrya, pyly nebo semena, která se mohou získat z transgenových rostlin podčeledi Pooideae. Další předmět tohoto vynálezu tvoří potomstvo uvedených rostlin z podčeledi Pooideae, jakož i mutanty a varianty odvozené od těchto rostlin, včetně těch, které se odvozují od rostlin, které byly získány somatickou fůzí rostlin, genetickou modifikací nebo selekcí mutantů.

Tento vynález se kromě toho týká způsobu výroby protoplastů a rostlinných buněk rostlin z podčeledi Pooideae, které se mohou regenerovat na celé rostliny, s výhodou na celé fertilní rostliny, dále se týká způsobu výroby kalusů, které se odvozují od uvedených protoplastů nebo rostlinných buněk a jsou schopny se regenerovat za vzniku celé rostliny, zejména celé fertilní rostliny. Dále se předložený vynález týká způsobu regenerace rostlin z podčeledi Pooideae, vycházeje od uvedených kalusů. Tento způsob je dále podrobně popsán.

Tyto a další předměty předloženého vynálezu jsou zveřejněny v následujícím podrobném popisu.

-3CZ 289790 B6

Přehled obrázků:

obr. 1: ukazuje kolonie Dactylis glomerata L., které pocházejí zprotoplastů a které rostou v agarózovém klatrátu, který je suspendován v kapalném médiu.

obr. 2 ukazuje mladou rostlinu, která se vyvine z protoplastů odvozených od kalasu Dactylis glomerata L., který roste na médiu SH-O.

Obr. 3 ukazuje nádobu s mladou rostlinou s kořínky, která se vyvíjí z kalasu Dactylis glomerata L., rostoucím na médiu SH-O, který se odvozuje od protoplastů.

obr. 4 ukazuje rostlinu Dactylis glomerata L., která byla regenerována z protoplastů /vlevo/ spolu s divokým typem rostliny Dactylis glomerata L. /vpravo/.

obr. 5 ukazuje plazmid pCIB709, který se může použít pro transformaci protoplastů Dactylis glomerata L., aby jim propůjčil odolnost vůči Hygromycinu. Plazmid pCIB709 byl uložen podle ustanovení Budapešťské úmluvy u ,,Američan Type Culture Collection“ v Rockville, Maryland, USA pod ukládacím číslem ATCC40428. Datum uložení je 12. únor 1988.

Legenda:

35S: 35S oblast promotoru

Hydro-geny: strukturní gen hydromycinfosfotransferázy /APH typ IV/

35S term: oblast CaMV s místem 3'polyadenylace 35S transkriptoru CaMV obr. 6 ukazuje: „Southem blott“ analýzu DNA různých kalusů Dectylis glomerata L., které byly po transformaci protoplastů s plazmidem pCIB709, z tohoto získány. Analýza byly provedena pomocí fragmentu Xbal-SsI, který sloužil jako molekulární sonda.

Řada 1,2 10 ng a 2 ng pCIB709 štěpeno restrikční endonukleázou BamHl

Řada 4-8 DNA z kultur kalusů Dactylis glomerata L., štěpená BamHl, které se odvozují od protoplastů, které byly předtím transformovány pCIB709

Řada 9,17: DNA štěpená BamHl, z netransformovaného kalusu odvozeného od protoplastů Dactylis glomerata L.

Řada 10,13: DNA, štěpená BamHl, z kultur kalusů Dactylis glomerata L., které se odvozují od protoplastů, které byly předtím transformovány pCIB709

Řada 14: DNA štěpená BamHl, z Dactylis glomerata L., a to kultur jako kalusů, které se odvozují z protoplastů, které byly předtím transformovány pCIB709.

Řada 15,16: DNA štěpená BamHl z kultur kalusu Dactylis glomerata L., které se odvozují od protoplastů, které byly předtím transformovány s pCIB709

Řada 4: je prázdná

V řadách 6,10, 12 ukazuje zčernání filmu na /přítomnost cizí DNA, která je integrována do genomu buněk Dactylis glomerata L.. Fragment obsahující 1063 Bp, který se dá očekávat přinatrávení integrovaného genu Hydromycinu plazmidem pCIB709 s BamHl /nukleotidy 583-1646 náležející pCIB709/, je označen šipkou.

-4CZ 289790 B6

Definice

Pro jasné a jednoznačné porozumění popisu a definici předmětu vynálezu jakož i v ní obsaženým pojmům, stanoví se následující definice:

Rostlinná buňka: strukturní a fyziologická jednotka rostliny, která sestává zprotoplastu a buněčné stěny.

Rostlinná tkáň: skupina rostlinných buněk, která je organizována do formy strukturní a funkční jednotky.

Rostlinný orgán: omezená a viditelně diferencovaná oblast rostliny, jako například kořen, stonek, listy, poupata nebo embrya. Rostlinný orgán může být vybudován z různých typů buněk a tkání.

Protoplast: izolovaná rostlinná buňka bez buňkové stěny.

Buněčná kultura: proliferanční buněčná hmota v nediferencovaném nebo částečně diferencovaném stavu.

Embryo: velmi malé a časné vývojové stádium rostliny, které se vyvíjí buď ze zygoty /sexuální embryo/, nebo zembryogenní somatické buňky /somatické embryo/ a vykazuje již stádia s rozeznatelnou morfologií, strukturou a buněčnou organizací, která zahrnuje buněčná, globulámí jakož i kotyledonní stádia/ vývoj embrya kukuřice je například popsán u Randolpha, 1936, vývoj embrya tráv u Browna, 1960/.

Buněčný kluster: skupina navzájem spojených buněk, které lpí na sobě; obvykle vznikají tyto buněčné klustry z jedné nebo několika málo prvotních buněk nebo prvotních protoplastů dělením buňky.

Mladá rostlina: mnohobuněčná struktura, která sestává z výhonku a kořene a vykazuje vnější formu malé rostliny.

Dicamba: 3,6-dichlor-2-methoxybenzoová kyselina

MES: 2-/N-morfolin/ethansulfonová kyselina

2,4-D: dichlorfenoxyoctová kyselina

Picloram: 4-amino-3,6,6-trichlorpikolinová kyselina

Tris-HCl: α,α,α-tris/hydroxymethyl/methylaminohydrochlorid

EDTA: l-ethyldiamin-N,N,N'-tetraoctová kyselina

PEG: polyethylenglykol

Agaróza: výroba a čištění agarózy je popsáno například u Guiseley a Renn /1975/. Agaróza je součást agaru. Komerčně získatelný agar sestává normálně ze směsi neutrální agarózy a iontového agaropektinu, kteiý vykazuje více bočních skupin. Prodávaná agaróza se obvykle získává známým způsobem z agaru. Při tom zůstane obvykle zachována bočních řetězců, které pak určují fyzikálněchemické vlastnosti agarózy, jako například teplotu gelovatění a teplotu tání. Agaróza tající při nízkých teplotách /“Low-metling Agarose“/ zejména Sea Plaque® Agarose se hodí obzvláště dobře jako ztužovací prostředek a rámci způsobu podle vynálezu.

-5CZ 289790 B6

SH-O médium: médium prosté hormonů podle Schenka a Hildebrandta /1972/. /SH-médium může být kapalné nebo zpevněné 0,8 % /hm/ o agarem nebo 0,5 % /hm/o/ GelRite®./. Médium se normálně sterilizuje pomocí známých opatření teplem nebo v autoklávech při teplotě 121°C a za tlaku 1,2 kg/cm² po dobu 15 až 20 minut/.

GelRite®: GelRite Gellan Gum, Scott Laboratories lne, Feskerville, RI, # 02823

SH-30 médium: SH-0 médium se 30 uM Dicamba

SH-45 médium: SH-0 médium se 45 uM Dicamba

KM-8p-médium: 8p médium podle Kao et al. /1975/.Toto médium může existovat kapalné nebo zpevněné agarem, agarózou nebo GelRite® a může se vyrobit i používat právě tak dobře bez kyseliny askorbové, vitaminu A a vitamínu D. Součásti média, s výjimkou ztužovacího prostředku, se obvykle sterilizují pomocí filtrace filtrem s velikostí pórů 0,2um.

RY-2-médium: médium podle Yamada et al. /1986/

OMS médium: médium podle Murashire a Skooga /1962/. Médium se může ztužit například 0,8 % /hm/o/ agarem nebo agarózou nebo 0,5 % /hm/o/ GelRite®.

Pro účel použití popsaný v předložené přihlášce vynálezu může se vyrobit i tak, že vykazuje vitaminové sloučení B5 média podle Gamborga et al. /1968/.

Celulóza RS: Cellulase RS, Yakult Honsha Co., Ltd., 1,1,19 Higashi-Shinbashi, Minato-ku, Tokyo 105, Japonsko

Pectolyase Y-23®: Seishin Pharmaceutical Co., Ltd., 4-13 Koami-cho, Nihonbaschi, Tokyo, Japonsko

Parafilm®: Parafilm® laboratory film - Američan Can Co., Greenwich, CT, 06830, USA.

Nalgene®-Filter /Nalge Co., Division of Sybron Corp. Rochester, New York, 14602, USA

BglII: Restrikční enzym BglII; New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA, 01915, USA, nebo jakýkoliv jiný výrobce.

BamHI: restrikční enzym BamHI; New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA, 01915, USA, nebo jakýkoliv jiný výrobce

Hydrolyzát kaseinu: hydrolyzát kaseinu - enzymatický hydrolyzát z kravského mléka, typ I, Sigma Co., PO, Box 14508, St. Louis, MO 63178, USA.

Hygromycin B: Cytotoxin: Hygromycin B, čištěný, Kat. č. 400050 Clbiochem Behring Diagnostica?La Jolla, Ca 92037, USA, Chargen č. 702296.

GeneScreen Plus®: kat. č. NEF976, NEN Research Products 549 Albany St., Boston, MA 02118, USA

TBE pufr: Tris-borátový pufr-obvykle používaný pufr při elektroforéze viz Maniatis et al. /1982/

Spin sloupec: Sephadex® G25 hotový balený sloupec, kat. č. 100402, Boehringer Mannheim Biochemicals, Piscataway, NJ, USA

-6CZ 289790 B6

SDS: dodecylsulfát sodný

SSC: 1,54 mM NaCl, 0,154 mM citrátu sodného, podle popisu u Maniatis et al. /1982/

CETAB: hexadecy ltrimethy lamon iumbromid

IBI Random Primer Kit: „Prime Time“ Random Primer Kit, Intemational Biotechnologies lne. PO, BOX1565, New Haven, CT 07606, USA /kat. č. 77800; šarže č. F630-01/.

V rámci tohoto vynálezu bylo možné s překvapením nyní ukázat, že rostliny z čeledi Graminae, zejména fertilní rostliny z této čeledi z podčeledi Pooideae, je možné vycházeje od specifického typu protoplastů jakož i buněk a kulusů, které pochází z těchto protoplastů, regenerovat.

Tato regenerace rostlin, zejména fertilních rostlin, je možná i tehdy, když protoplasty obsahují exogenní DNA. při tom se jedná s výhodou o DNA vestavěnou stabilně do genomu protoplastů, kterou lze v rostlinách exprimovat.

Všechny lipnicovité rostliny z podčeledi Pooideae je možné v rámci tohoto vynálezu použít. Výhodné jsou ale rostliny z podčeledi Pooideae, které patří k trávám, tak například všechny rody vybrané ze skupiny sestávající zPoa /lipnice/, Festuca /kostřavy/, Lolium /jílku/, Bromus /sveřepu/, Trisetum /trojštětu/, Agrostis /psinečku/, Phleum /bojínku/, Alopecurus /psárky/ a Dactylis /srhy/. Zejména výhodné jsou rostliny Dactylis.

V rámci tohoto vynálezu jsou rovně výhodné rostliny z podčeledi Pooideae, které patří ke skupině malozmých obilí, tak například všechny rody vybrané za skupiny sestávající zAvena /oves/, Triticum /pšenice/, Secale /žito/ a Hordeum /ječmen/.

Specifický typ protoplastů Pooideae, který se dělí a vytváří buněčné kultury, které jsou schopné se regenerovat na celé rostliny, pochází z buněčných kultur, zejména z embiyogenních buněčných kultur. U embryogenních buněčných kultur se jedná s výhodou o embryogenní suspenzní kultury a kalusové kultury. Buněčné kultury se mohou vyrobit ze vhodných částí rostlin z podčeledi Pooideae. Pod pojmem vhodné části rostlin se v rámci tohoto vynálezu rozumí například bazální části mladých, uvnitř ležících listů, nezralá sexuální embrya, nezralá květenství, zralá semena, nebo tkáně klíčků, které pochází z rostlin podčeledi Pooideae, aniž by se omezovaly pouze na tyto.

Způsobový krok A: výroba embiyogenních suspenzí z rostlinné tkáně.

Při výrobě embryogenního kalusu se vychází ze vhodné části rostliny z podčeledi Pooideae, zpravidla z bazální části mladého listu. Obzvláště vhodné jsou mladší, uvnitř ležící listy rostlin a podčeledi Pooideae. Uvedený způsobový krok se může provádět analogicky jak to popsal Hanning et al. /1982/ pro Dactylis glomerata L. Způsob, který popisuje není omezen na tento druh, nýbrž může se použít i pro ostatní rostliny z podčeledi Pooideae. Uvedená publikace je ve formě reference částí předloženého vynálezu.

Listy se rozřežou například na malé úseky nebo segmenty 1 mm až 5 mm dlouhé nebo o průměru 1 mm až 5 mm. Tvar ani velikost těchto kousků listů není kritická. Segmenty se rozprostřou na médiu, vhodném pro indukci a zachování kalusu a na tomto médiu se kultivují až do vytvoření kalusu a/nebo embryogenních struktur. Médium vhodné pro tento účel je například SH-systém /Schenk a Hildebrandt, 1972/ se 30 uM Dicamba a 0,8 % /hm/o/ agarem nebo agarózou jako gelatiančním prostředkem. Další vhodná média jsou popsána Georgem et al. /1987/. Kalus a/nebo embryogenní struktury se objeví zpravidla 2 až 6 týdnů po rozprostření. Iniciace a uchování kalusu se může provádět na světle, avšak výhodně za tmy, při teplotě mezi 0 °C až 50 °C, s výhodou při teplotě mezi 20 °C až 32 °C a zcela výhodně při teplotě mezi 25 °C až 28 °C.

-7CZ 289790 B6

Embryogenní kalus se může i pomocí jiných známých způsobů, které popsali například Lůhrs a Lorz /1987/ jakož i v referátech obsažených v této práci pro ječmen. Uvedené způsoby se mohou používat i pro jiné rostliny z podčeledi Pooideae a tvoří v odpovídající formě referátu součást tohoto vynálezu.

Základ embryogenních suspenzních kultur začíná tím, že se čerstvé kusy embryogenního kalusu dají do vhodného kapalného média, například 0,5 g kalusu do 50 ml kapalného média podle Grye et al. /1985/, které obsahuje 45 uM Dicamba a 4 g/1 hydrolyzátu kaseinu. Další vhodná média jsou popsána například u George et al. /1987/. Suspenzní kultury rostly při teplotě mezi 10 °C až 40 °C, s výhodou mezi 20 °C až 32 °C a obzvláště výhodně pak při teplotě mezi 25 °C až 30 °C. Během kultivační periody může být výhodné střídání fází světla a tmy. Suspenze se s výhodou kultivuje při 5 až 20ti hodinové periodě světla, s výhodou ale při 16ti hodinové periodě světla, následované 5 až 20ti hodinovou, s výhodou ale 8mi hodinovou periodou tmy. Intenzita světla se pohybuje charakteristicky mezi 0,1 uE/m²s až 100uE/m²s/ E = einstein;m = metr; s = sekunda/ s výhodou ale mezi 30 uE/m²s až 80 uE/m²s. Rovněž je výhodné když se suspenzí během fáze kultivace pohybuje. Pohyb suspenzí se může provádět například v Delongových lahvích, které jsou utěsněny filmem z plastu propustným pro světlo a plyn nebo jakýmkoliv jiným libovolným vhodným uzávěrem, na kruhové třepačce při rychlosti otáček 100 Upm až 150 Upm. Asi po třech až pěti týdnech se nechají větší aglomeráty buněk asi 30sekund sedimentovati, homí vrstva, která obsahuje jen malé shluky buněk se odstraní a tento se přenese pro iniciaci nových kultur do čerstvého média.

Tyto způsobové kroky se mohou periodicky, s výhodou každé 3 až 4 týdny opakovat, přičemž se používají jen ty kultury, které slibují největší úspěch, měřeno co se týká malé velikosti jakož i kvality buněčných hrudek. Po 4 až 20, zpravidla po 6 až 8 přenosech /transferech/jsou suspenze v podstatě prosty neembryogenních buněk a většina embryogenních buněčných aglomerátů vykazuje charakteristickou velikost 150 um až 2 000 um.

Obzvláště výhodný je v rámci vynálezu způsob, který vede k výrobě embryogenních suspenzí, které vykazují v první řadě malé preembryonální hmoty buněk. Podíl preembryonálních buněčných hmot se může zvýšit významně ještě tím, že se nejdříve nechá sedimentovat větší materiál a nakonec se znovu kultivuje jen část suspenze nacházející se nahoře.

Předmět vynálezu se tedy týká embryogenní buněčné kultury, suspenzní kultury nebo kalusové kultury, které se odvozují od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae a mohou se izolovat z protoplastů, přičemž uvedené protoplasty jsou schopny regenerovat buněčné stěny, dělit se a vytvářet kalus. Uvedený kalus se pak může regenerovat na celou rostlinu, zejména ale na celou fertilní rostlinu.

Obzvláště výhodné jsou v rámci předloženého vynálezu embryogenní buněčné kultury /suspenzní kultury a kalusové kultury/ trav, zejména trav vybraných z rodů sestávajících z Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus a Dactylis. Obzvláště výhodné jsou buněčné kultury Dactylis glomerata L.

Další výhodné předměty v rámci předloženého vynálezu se týkají embryogenních buněčných kultur /suspenzních a kalusových kultur/ malozmných obilí, zejména obilí vybraného zrodů sestávajících z Avena, Triticum, Secale a Hordeum.

Další předmět předloženého vynálezu se týká embryogenního kalusu, který se odvozuje od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae a může se izolovat z protoplastů, přičemž uvedené protoplasty jsou schopné regenerovat buněčné stěny, dělit se a vytvářet kalus, který se pak sám může regenerovat na celé rostliny s výhodou ale na celé fertilní rostliny.

-8CZ 289790 B6

Obzvláště výhodný je v rámci předloženého vynálezu kalus tráv, zejména tráv vybraných z rodů sestávajících zPoa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus a Dactylis. Obzvláště výhodný je embryogenní kalus Dactylis glomerata L.

Další předmět v rámci předloženého vynálezu se týká embryogenního kalusu, který se odvozuje od malozmných trav, zejména od obilí vybraného z rodů sestávajících z Avena, Triticum, Secale a Hordeum.

Předkládaný vynález zahrnuje rovněž lipnicovité rostliny, zejména fertilní lipnicovité rostliny, zpodčeledi Pooideae a jejich rozmnožovací materiál, který lze regenerovat zprotoplastů nebo rostlinných buněk, získaných z embryogenní buněčné kultury.

Konzervace za chladu (kryokonzervace) buněčných kultur (suspenzních a kalusových kultur) lipnicovitých rostlin.

Některé rostlinné tkáně se mohou konzervovat za chladu, jak je známo z publikace Witherse (1986) a dalších publikací v ní citovaných. Tyto metody však nejsou obecně použitelné, zejména ne pro konzervaci buněčných kultur (suspenzních a kalusových kultur) lipnicovitých rostlin.

Při provedení předkládaného vynálezu se ukázalo, že je možné uchovávat embryogenní buněčné kultury, včetně suspenzních a kalusových kultur, všech rostlin z čeledi Gramineae v suspendované formě, a sice konzervací za chladu (kryokonzervací) při velmi nízkých teplotách.

Tyto způsoby konzervace embryogenních buněčných kultur, včetně suspenzních a kalusových kultur, které se odvozují od rostlin čeledi Gramineae, za chladu, zahrnuje následující kroky:

a/ dispergování aktivně rostoucích buněk suspenzních kultur nebo kalusu ve vhodném kapalném médium;

b/ ochlazení této kultury až do blízkosti teploty mrazu /asi 0 až 5 °C/;

c/ smísení uvedené, předem ochlazené kultury svodným roztokem vhodného prostředku chránícího kulturu před mrazem při přibližně stejné teplotě;

d/ ochlazování rezultující směsi v pravidelných časových intervalech asi 0,01°C až asi 20 °C za minutu, s výhodou ale asi o 0,2 °C až asi 2 °C za minutu a zcela nejvýhodněji o asi 0,5 °C až asi 1 °C za minutu, na teplotu mezi asi - 20 °C až asi 60 °C, s výhodou ale na teplotu mezi asi - 35 °C až asi 50 °C a nejvýhodněji na teplotu mezi asi - 38 °C až asi 44 °C.

e/ šokové zmrazení předem ochlazené směsi v kapalném dusíku nebo v kapalném vzduchu; a f/ uchování hluboko zmrazené směsi při teplotě pod-100 °C, nebo ještě lépe při teplotě kapalného dusíku nebo kapalného vzduchu.

Konzervace embryogenních kultur (suspenzních a kalusových kultur) je obecně použitelná pro všechny lipnicovité rostliny (čeleď Gramineae), tedy např. podčeledi Bambusoideae, jako je např. bambus, podčeledi Andropogonideae, jako je např. Saccharum, Sorghum a Zea, Arundineae, jako je např. Phragmites, Oryzoideae, např. Oryza, Panicoideae, např. Panicům, Pennisetum a Setaria, a také z podčeledi Pooideae, jako jsou např. trávy včetně rodů Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus a Dactylis, a nebo malozmné obiloviny včetně Avena, Triticum, Secale a Hordeum.

Konzervaci embryogenních kultur za chladu lze užít zejména pro skupinu z čeledi Gramineae a podčeledi Pooideae, tvořenou travami a malozmnými obilovinami.

-9CZ 289790 B6

Pro konzervaci za chladu se nejdříve vhodné množství aktivně rostoucího kalusu nebo aktivně rostoucích buněk suspenzní kultury (zpravidla 1 až 40 dní, lépe 2 až lOdní, po nasazení následující kultury), suspenduje ve vhodném kapalném médiu. Vhodná kapalná média jsou například SH-O, SH-30 nebo SH—45 médium, OMS, KM- 8p, RY-2-médium jakož i roztoky manitu, sacharózy nebo jiného cukru a alkoholických cukrů, dále roztok aminokyseliny /jako například prolin/ nebo i jednoduše i voda, aniž by se na tato uvedená média omezovala. Výhodné je médium, které je vhodné pro růst buněk nebo roztok cukru nebo alkoholického cukru ve vodě. Obvykle se v 1 ml kapalného média disperguje 0,01 g až 0,1 g kalusu a tento se pak chladí na ledu.

Vhodné prostředky pro ochranu vůči zmrznutí jsou v první řadě směsi osmoticky aktivních složek a DMSO ve vodě. Tyto se normálně před přídavkem k předem ochlazené disperzi, popsané ve způsobovém kroku /b/, rovněž předchladí na ledu, přičemž ale v tomto případě jsou přípustné i vyšší teploty, které mohou dosáhnout až teplotu místnosti. Teplota roztoku mrazuvzdomého prostředku není kritická. V této souvislosti je vhodný například roztok 0,5 M až 2 M glycerinu, 0,5 M až 2 M L-prolinu a 0,5 M až 4 M roztok dimethylsulfoxidu /DMSO/ ve vodě, pH 5,6 nebo 0,5 M až 2 M glycerinu, 0,5 M až 2 M roztok sacharózy a 0,5 M až 4 M roztok DMSO ve vodě při pH 5 až 7, aniž by toto znamenalo jakékoliv omezení. Další vhodné složky které přichází v úvahu pro použití v roztocích mrazuvzdomých prostředků zahrnují cukr, alkoholické cukry, aminokyseliny a polymery jako například roztoky PEG, které obsahují jako součást DMSO, se s výhodou připravují před každým použitím čerstvé nebo se ale uchovávají i hluboko zmrazené. Jiné roztoky prostředků chránících proti zmrznutí mohou být podle okolností připraveny krátce před upotřebením, přičemž ale i v tomto případě jsou výhodné čerstvě připravené roztoky nebo zmražené roztoky.

Roztok prostředku chránícího před zmrznutím se obvykle přidává po dobu 1 sekundy až 4 týdnů, s výhodou 1 sekundy až 1 dne a obzvláště výhodně 1 sekundu až 1 hodinu k roztoku, který obsahuje dispergované buňky suspenzní kultury nebo dispergovaného kalusu. Buňky se přivádí do styku s roztokem prostředku chránícího proti zmrznutí po vhodný časový úsek, na ledu, s výhodou 1 minutu až 2 dny, obzvláště výhodně po dobu 10 minut až 6 hodin a nej výhodněji po dobu 30 minut až dvou hodin. Během této doby nebo po uplynutí této doby se alikvotní části pro konzervaci za chladu převádí do vhodných sterilních nádob nebo do jiných vhodných nádrží a tam se uchovávají obvykle na ledu.

Povrch těchto nádob se může před přídavkem uvedených alikvotních částí ponořit do kapalné lázně, která vykazuje teplotu mezi 0 °C až 4 °C. Tento způsobový krok není bezpodmínečně nutný, může se ale ukázat v určitých případech jako výhodný. Lázeň může sestávat z ethanolu nebo libovolného jiného vhodného chladivá. Lázeň je normálně vybavena míchadlem, pomocí něhož se chladivo stále promíchává a je spojena se zařízením, které umožňuje kontrolovat chlazení chladivá, tak aby se toto udržovalo na určité výši.

Pokud se nádoby nachází v chladu, redukuje se teplota na určitou vhodnou výši. Vhodná výše chlazení se může pohybovat v oblasti asi 0,01 °C až asi 20 °C za minutu, s výhodou ale v oblasti asi 0,1 °C až asi 5 °C za minutu, zcela výhodně v oblasti asi 0,2 °C až asi 2 °C a nejvýhodněji v oblasti asi 0,5 °C až asi 1 °C za minutu. Když teplota dosáhne velmi nízké hodnoty, která se obvykle pohybuje v rozmezí mezi - 20 °C až asi - 60 °C, s výhodou ale mezi asi - 35 °C až asi - 50 °C a obzvláště výhodně mezi asi - 38 °C až asi 44 °C nádoby šokem zmrznou, tím že se ponoří například do kapalného dusíku nebo kapalného vzduchu. Optimální výchozí teplota pro ponoření do kapalného dusíku nebo kapalného vzduchu se může měnit v závislosti na použitých kulturách, zpravidla se ale pohybuje při hodnotách mezi -20 °C až - 50 °C a odborník v této oblasti je může velmi jednoduše zjistit. Nádoby se potom uchovávají v kapalném dusíku nebo v kapalném vzduchu a sice buď v kapalině samotné, nebo v plynné fázi, která se nachází nad ní, přičemž teplota by neměla přestoupit - 100 °C.

-10CZ 289790 B6

U mnoha kultur může být výhodné, když se teplota nádoby udržuje určitou dobu na trvale nízké hladině, místo toho, aby se nádoby bezprostředně po dosažení optimální teploty, ponořily do kapalného dusíku nebo kapalného vzduchu.

Aby se opět získaly buněčné kultury schopné života, vyjmou se nádoby s kalusovým materiálem z kapalného dusíku a s výhodou za řádného protřepávání nechají roztát v teplé vodní lázni při teplotě mezi 10 °C až 50 °C, s výhodou mezi 35 °C až 40 °C, až všechen led roztaje. S překvapením se v rámci tohoto vynálezu ukazuje, že nádoby, které obsahují za mrazu konzervované buňky rostlin podčeledi Pooideae, mohou roztát i ponecháním na vzduchu při teplotě místnosti, až se všechen led roztaje. Konečně je také možné ponechat nádoby krátkou dobu několika sekund až 60 minut, s výhodou 1 až 10 minut, na ledu, předtím než se v ní nacházející materiál kalusu přenese na vhodné kultivační médium.

Obsah nádoby se rozdělí na vhodném pevném médiu. Obvykle se 0,5 ml roztálé kultury převede na Petriho misku o průměru 10 cm, která obsahuje 30 ml až 50 ml kultivačního média. Pevná média se buď nalijí na sešikmení, nebo se na obvodu vyhloubí vybrání, aby se zajistil odtok eventuálně zbývajících zbytků mrazuvzdomého prostředku od buněk. Buňky se mohou před nanesením na ploty, na vhodné médium, jednou nebo vícekrát promýt i kapalným kultivačním médiem nebo jakýmkoliv jiným libovolným roztokem, jako například roztokem cukru nebo roztokem alkoholického cukru, nebo roztokem aminokyseliny.

Petriho misky se potom, jak bylo shora popsáno pro embryogenní kalus, inkubují při teplotě 27 °C ve tmě. Kalus se potom dále kultivuje jako normální embryogenní kalus, podle předloženého vynálezu.

Způsobový krok B: izolace a čištění protoplastů, které se mohou regenerovat na celé rostliny včetně celých fertilních rostlin.

Vycházeje od embryogenních suspenzních kultur, získatelných způsobovým krokem A/, získají se protoplasty. Izolace a čištění protoplastů se provádí tak, že se nejdříve ze vstupního kultivačního média izolují embryogenní aglomeráty buněk, například filtrací suspenzní kultury ze způsobového kroku A/ přes filtrační jednotku Nalgene® /0,2 um/ a rezultující buněčný aglomerát se potom inkubuje vhodným enzymatickým roztokem, který je schopen oddělit buněčné stěny bez poškození protoplastů. Enzymy se používají ve formě roztoku sterilizovaného filtrací. Všechny manipulace, které stojí v souvislosti s buněčnými nebo jinými kulturami, se provádí za sterilních podmínek a za použití sterilního materiálu. Vhodný enzymatický roztok může mít například následující složení:

Enzymatický roztok:

Celulóza 2 % /hm/o/

CaCl₂. H₂O7 mM

NaH₂PO₄. H₂O 0,7mM

MES /pH 5-7/ 3,0mM glukóza /konečná koncentrace 550 mOs/kg H₂O

Normálně se touto směsí opatrně pohybuje na třepačce při rychlosti otáček asi 50 ot/m a slabého osvětlení /asi 5 uE/m²s/, aniž by toto bylo kritické. Strávení pokračuje při teplotě mezi 0 °C až 50 °C, s výhodou mezi 10 °C až 35 °C a nejvýhodněji mezi 26 °C až 32 °C, až se protoplasty uvolní. Doba potřebná pro strávení činí obvykle několik sekund až 2 dny, s výhodou 1 hodinu až 1 den a nejvýhodněji 3 až 5 hodin.

Uvolněné protoplasty se sbírají a čistí pomocí standardních způsobů, jako například filtrací, odstřeďováním a propíráním.

-11 CZ 289790 B6

Na tomto místě se může zavést další čistící krok. Při tom se protoplasty nanáší na povrch vhodného média, jako například KM-8p-kultivačního média, které je nastaveno sacharózou na osmotickou hodnotu 700 m ²s/kg H₂O, nebo na povrch jiných vhodných médií, která jsou popsána například u George et al. /1987/.

Po desetiminutovém odstřeďování při asi 60 g, se protoplasty, které se nacházejí v oblasti mezní plochy, sbírají. Potom se mohou protoplasty resuspendovat ve stejném kultivačním médiu a například pasáží ocelovým sítem /velikosti ok 20 um/ filtrovat.

Bez tohoto dodatečného čisticího kroku se kontaminace přípravku protoplastů s celými, nenatrávenými buňkami pohybuje v oblasti asi 0,001 % až 0,01 %. Tato hodnota se může shora popsaným čisticím krokem dále redukovat. Uvedený dodatečný způsobový krok vede ale ke značné ztrátě protoplastů, které vykazují velmi husté protoplasma. Z toho vyplývá, že účinnost platinování se může snížit až o desetinásobek, když se připojí uvedený čisticí krok. Protoplasty se mohou čistit i pomocí jiných známých způsobů, jako například shora popsanou flotací na roztoku sacharózy nebo na jiných vhodných pufračních roztocích s velkou měrnou hmotností, jako například roztoku Peroollu^R.

Výtěžek protoplastů a v důsledku účinnosti platinace dosahuje optimálních hodnot, když se ze suspenzních kultur, které se používají pro izolaci protoplastů, 1 až 30 dní, s výhodou ale 5 až 10 dní před izolací protoplastů založí následující kultury.

U shora blíže charakterizovaného enzymatického roztoku se jedná o modifikaci směsi enzymů, popsané u Lu et al. /1981/, která převyšuje všechny ostatní testované roztoky enzymů a poskytují výtěžek 40 x 10⁶ až 70 x 10⁶ protoplastů na gram čerstvé hmotnosti. Alternativně k tomu se dají i při použití 2 % /hm/o/ celulózy RS v KM-8p médiu nebo jiném libovolném médiu, které byly například popsány u George et al. /1987/ pozoruhodné výtěžky protoplastů. Při tom se ukazuje, že použití glukózy jako osmotika při izolaci protoplastů jednoznačně vyniká nad použitím sacharózy a v určité míře i nad použitím manitolu, což se týká výtěžku a následku účinnosti platinování.

Další známé a vhodné enzymatické směsi se mohou rovněž používat při způsobu podle vynálezu.

Protoplasty, které lze získat po filtraci tj. například po pasáži 20 um sítem s průměrnou velikostí ok 12 um až 15 um v průměru, vykazují opticky husté cytoplasma.

Předložený vynález se tedy týká i způsobu výroby protoplastů, které se dají regenerovat na celé rostliny a zejména na celé fertilní rostliny, vycházeje od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae. Tento způsob je charakterizován následujícími způsobovými kroky:

a/ izolací tkáně ze vhodných částí lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, s výhodou z bazálních úseků mladých uvnitř ležících listů, z nezralých sexuálních embryí, nezralých květenství, zralých semen nebo tkání klíčků, nejvýhodněji ale z nejmladších a nejvnitřněji ležících listů;

b/ kultivací této tkáně v médiu, které je schopné indukovat tvorbu embryogenního kalusu a embryí;

c/ periodického zakládání následných kultur embryogenního kalusu a embryí na čerstvém médiu, které zajišťuje kontinuální proliferaci;

d/ izolace embryogenních buněčných aglomerátů po 0 až 100 a nejvýhodněji 3 až 50 přenosech /transferech;

-12CZ 289790 B6 e/ odstranění buněčných stěn vhodnými enzymovými směsemi a izolace a čištění rezultujících protoplastů.

Další předmět vynálezu zahrnuje protoplasty /včetně rostlinných buněk získatelných po regeneraci buněčných stěn/ lipnicovitých rostlin z podčeledi Pooideae, které lze regenerovat na celé rostliny a zejména na celé fertilní rostliny. Výhodné jsou protoplasty nebo buňky, které se získají buď z buněčných kultur, nebo z embryogenních buněčných suspenzi.

Zahrnuty jsou rovněž lipnicovité rostliny, zejména fertilní lipnicovité rostliny z podčeledi Pooideae a jejich rozmnožovací materiál, které se regenerují z uvedených protoplastů nebo z uvedených rostlinných buněk.

Způsobový krok C: vypěstování kultur protoplastů a vypěstování kalusu, které lze regenerovat na celé rostliny a na celé fertilní rostliny.

Vyčištěné protoplasty ze způsobového kroku b/ se rozprostřou na plotnách ve vhodném kapalném médiu nebo na vhodném pevném médiu přes sebe, nezávisle na tom, zda byly uvedené protoplasty předtím zpracovány s exogenní DNA nebo ne. /Zpracování s exogenní DNA je popsáno podrobně b následujícím oddílu/. Pod pojmem vhodná média se v rámci tohoto vynálezu rozumí například taková média, jejichž základ tvoří KM-8p-médium, RY-2-médium /Potrykus et al., 1979/, SH-30 médium nebo SH-45-médium a které vykazují vhodnou koncentraci cukrů a rostlinných růstových regulátorů. Výhodná média jsou KM-8p-médium a SH-45 - médium, které obsahují vhodný ztužovací prostředek. Výhodným ztužovacím prostředkem je agaróza, zejména Sea Plaque® agaróza /FMC Corp. Marině Colloids Division, P.O. Box, Rockland, ME 04841, USA /Při použití Sea Plaque® agarózy může její koncentrace činit 0,1% až 2,5 % /hm/o/, s výhodou ale 0,6 % až 1,5 % /hm/o/.

Rozprostření protoplastů, na médium obsahujícím agarózu, přes sebe, se může provádět analogicky jako u Shillito et al /1983/, v evropském patentu EP 0 129 688 /Shillito et al/, nebo u Adamse et al. /1983/. Tyto publikace jsou jako reference součástí tohoto vynálezu.

Médium, ve kterém se kultivují protoplasty, může obsahovat další vhodné složky, které podporují dělení a tvorbu kolonie protoplastů. K těmto látkám patří například 2,4-D, Dicamba, Picloram nebo jiné rostlinné růstové regulátory. Vhodné rostlinné růstové regulátory jsou odborníkovi v této oblasti známy, Koncentrace těchto látek se obvykle pohybuje v oblasti 0,001 mg/1 až 100 mg/1.

Kyselina sylicylová a její deriváty mohou podporovat dělení buněk a tvorbu kolonií protoplastů podčeledi Pooideae. K derivátům kyseliny salicylové patří, aniž by na tyto byly omezeny, 0-acylderiváty a 0-arylderiváty. K 0-acyl-derivátům se počítají, aniž by se na tyto omezovaly, nízkoacylové skupiny s 1 až 7, s výhodou 1 až 4 a nej výhodněji se 2 až 3 atomy uhlíku. Pod pojmem Q-arylové deriváty se v rámci tohoto vynálezu rozumí 5ti nebo 6ti členné kruhy, které mohou být navzájem spojeny nebo jsou samostatné, aniž by se tyto 0-arylové deriváty omezovaly pouze na ně. Kruhy mohou být nesubstituovaná nebo mohou být substituované jednou nebo více skupinami, včetně alkyly s 1 až 5 atomy uhlíku, 0-alkyly s 1 až 4 atomy uhlíku, halogeny /zejména chloridy a bromidy/ nitroskupinami, aminoskupinami a aminoskupinami, které jsou samy substituovány alkylem, který vykazuje 1 až 4 atomy uhlíku.

Deriváty kyseliny salicylové obsahují i karboxyester. Výhodné karboxyestery jsou arylestery a alkylestery, kde alkylová skupina obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku.

Kromě toho se pod pojmem deriváty kyseliny salicylové rozumí i ty sloučeniny, u nichž je kruh kyseliny salicylové ještě dále substituován, například jednou nebo více skupinami včetně alkylem s 1 až 4 atomy uhlíku, 0-alkylem s 1 až 4 atomy uhlíku, halogenem /zejména chloridem

-13CZ 289790 B6 abronidem/, nitroskupinou, aminoskupinou a aminoskupinou, která je sama substituována alkylem, který vykazuje 1 až 4 atomy uhlíku.

Výhodné sloučeniny, které podporují dělení a/nebo tvorbu kolonií protoplastů podčeledi pooideae a buněk čeledi jsou:

kyselina 0-acetoxybenzoová /Aspirin, kyselina acetylsalicylová/ kyselina 0-hydroxybenzoová /kyselina salicylová/ kyselina 0-methoxybenzoová /kyselina methylsalicylová / a kyselina O-dimethylkarbamoybenzoová kyselina [0-/CO-dimethyl/-salicylová].

Koncentrace kyseliny salicylové nebo jejich derivátů v kultivačním médiu se pohybuje s výhodou v oblasti 0,1 mg/litr až 3'000 mg/litr, s výhodou 10 mg/litr až 300 mg/litr a nejvýhodněji okolo 100 mg/litr.

Médium, ve kterém se kultivují protoplasty, může ještě dodatečně obsahovat médium, které bylo předtím kondicionováno růstem vhodných buněk, které pochází například ze Zeamyas, Dactylis glomerata nebo jiných tráv nebo i od jiných /dikotyledonních/ rostlin. Výhodné je médium, ve kterém byla kultivována embryogenní suspenze druhu lipnicovitých. Nejvýhodnější je médium, ve kterém byla kultivována embryogenní suspenze Dactylis glomerata. Médium kondicinované shora popsaným způsobem může činit podíl mezi 0 % až 100 % /0/0/, s výhodou mezi 5 % /0/0/ a nej výhodněji mezi 30 % /0/0/ celkového média.

Protoplasty se mohou kultivovat na pevném nebo v kapalném médiu po dobu až 12 týdnů, s výhodou až 6 týdnů a nej výhodněji 1 až 3 týdny, aniž by se mezi tím založily následné kultury. Ve zvláštní formě provedení předloženého vynálezu se může pevné médium vnést do kapalného média, jak je to popsáno v evropské přihlášce vynálezu EP 0 129 688 /Shillito et al./, nebo může být zpracováno jiným libovolným způsobem, který podporuje dělení buněk a/nebo tvorbu kolonií protoplastů.

Protoplasty se kultivují na světle, ale výhodně ve tmě při teplotě mezi 0 °C až 50 °C, s výhodou mezi 20 °C až 32 °C a nejvýhodněji mezi 25 °C až 28 °C. Intenzivita světla činí obvykle 0,1 uE/m²s až 200 uE/m²s s výhodou ale 30 uE/m²s až 90 uE/m²s.

Účinnost nanášení na plotny při použití KM-8p-média kolísá mezi 0,5 % až 10 %, v závislosti a přípravě protoplastů. Přísada 30 % až 40 % /0/0/ kondicionovaného suspenzního kultivačního média /suspenzní kultivační médium, kondicionované růstem vněm se nacházejících buněk a nastavené na osmotickou hodnotu 550 mOSM/kg H₂O přísadou glukózy /ke kultivačnímu médiu protoplastů nevede sice k významnému vzestupu účinnosti nanášení na plotny, ale urychluje proces dělení v mladých koloniích vzešlých z protoplastů.

U výhodné formy provedení předloženého vynálezu se protoplasty nanesou na plotny na médiu ztuženém agarózou. První dělení buněk lze potom pozorovat asi dva dny nanesení protoplastů na plotny. Další dělení následují každé 2 až 3 dny. Tento proces dělení probíhá asynchronně, což se dá doložit skutečností, že k prvnímu dělení buněk může dojít i až po 7 dnech. 5 až 20 dní, s výhodou ale 10 až 14 dní po nanesení protoplastů na plotny, se médium ztužené agarózou rozřeže v segmenty a segmenty, které obsahují kolonie buněk, se transferují do živného média. Tento způsob je pod označením „bead culture technique“ obecně znám a je zcela popsán u Shillito et al. /1983/, jakož i v evropské patentní přihlášce vynálezu EPO 129 688 /Shillito et al./.

Místo toho, aby se médium zpevněné agarózou rozřezalo na segmenty, může se toto i zkapalnit a v této kapalné formě převést do kapalného živného média. Tato modifikace je popsána u Adamse et al. /1983/ a může se provádět analogicky. V obou případech /segmentování nebo zkapalnění/ se může používat KM-8p-médium s glukózou a sacharózou jako kapalnými

-14CZ 289790 B6 složkami médií, přičemž lze pozorovat dobrý růst kolonií. Optimální kapalná složka s ohledem na růst kolonií sestává ale z SH-45 - média se 4 g/litr hydrolyzátu kaseinu. Během asi 2 až 3 týdnů od započetí způsobu „bead/culture“ lze rozeznati uvnitř desek nové suspenzní kultury. Mikroskopické zkoumání agarózových disků vypovídá, že několik kolonií položených na nejvzdálenějším povrchu vzrůstá do kapalného média a v médiu uvolňuje menší množství buněk, zatím co zbytek kolonie zůstává dále pevně zakotven v agaróze. Nová suspenze se velmi rychle rozmnožuje a po dalších dvou týdnech se tato běžným způsobem jako normální suspenzní kultury transferuje nebo se rozprostírá přes sebe na SH-30 médiích za účelem vyvinutí kalusu. V alternativní formě provedení se může agaróza rozdělit i na Petriho misky, které obsahují SH-45-médium ztužené agarózou a potom kultivovat.

Předložený vynález se týká tedy i způsobu výroby buněčných kultur /suspenzních kultur a kalusových kultur/ z protoplastů lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, které se mohou regenerovat na celé rostliny, zejména na celé fertilní rostliny. Tento způsob je charakterizován následujícími způsobovými kroky:

a/ kultivací protoplastů, které pochází od lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, a které se mohou regenerovat na celé rostliny, ve vhodném kultivačním médiu až k vytvoření kolonií buněk;

b/ kultivace uvedených kolonií buněk nebo jejich částí na vhodném médiu, které podporuje tvorbu buněčných kultur; a c/ izolace rezultujících kultur buněk.

Způsobový krok b/ není bezpodmínečně nutný, stejně tak je možné ponechat protoplasty v médiu definovaném ve způsobovém kroku a/, až do vytvoření kultur buněk nebo embryí.

Rovněž jsou zahrnuty lipnicovité rostliny, zejména ale fertilní lipnicovité rostliny podčeledi Pooideae a jejich rozmnožovací materiál, které se regenerují z uvedených kultur buněk.

Výhodný předmět vynálezu představuje nanášení protoplastů na plotny na médium, ztužené agarózou, zkapalnění nebo segmentace média ztuženého agarózou, přenos zkapalněného nebo na segmenty rozřezaného média do kapalného živného média a kultivace až do vytvoření kolon buněk.

Výhodný je způsob u něhož části kolonií buněk, zmíněné pod způsobovým krokem a/pocházejí z buněk nebo buněčných hmot, které byly uvolněny do kapalného kultivačního média.

Kultury kalusu a suspenzní kultury vyrobené vtom, to nebo v jiných způsobových krocích se mohou analogicky k tomu co bylo uvedeno u způsobového kroku AJ konzervovat za chladu.

Způsobový krok D: Regenerace mladých rostlin z kalusu

Z kalusu, který byl získán z protoplastů /způsobový krok C/, zejména se jedná o drolivý, granulámí kalus, se zakládají jednou nebo vícekrát, s výhodou každé dva týdny, následné kultury na čerstvém, vhodném médiu, aby se takto indukovala tvorba embryí. Vhodným indukujícím médiem je například SH-médium, s vhodnou koncentrací cukrů a regulátorů růstů rostlin.

Všechna takto vzniklá embrya, se potom přenesou na médium, které poskytuje dobré předpoklady pro inkubaci zrání a klíčení. Vhodná média jsou například SH-30 médium nebo OMS-médium, které jsou modifikovány tak, že vykazují vhodné koncentrace cukrů a regulátorů růstu rostlin. Kultivace ploten se provádí na světle [10 uE/m²s až 200 uE/m²s]; studené bílé světlo fluorescenčních lamp nebo směs denního světla a světla Gro-Lux® /Sylvania/ fluorescenčního světle. Samozřejmě se může používat i jakékoliv jiné vhodné fluorescenční světlo. 2 až 5 týdnů

-15CZ 289790 B6 po rozprostření na desky se dají pozorovat první embrya. V mnoha případech může být výhodné provést jeden nebo více dodatečných transferů embryí na čerstvé médium pro jejich dozrání. Embrya se vyvíjí dále a tvoří po určité době, obvykle po 1 týdnů až 6 měsících, zejména ale po 1 až 3 měsíci, mladé rostlinky.

V alternativní formě provedení se z kalusu získaného z protoplastů /způsobový krok C/, zejména když se jedná o drolivý, granulámí kalus, se založí jednou nebo vícekrát, s výhodou každé dva týdny, následné kultury, na čerstvém, vhodném médiu, aby se inkubovala takto tvorba a zrání embryí. Jedním z médií vhodným pro tento účel je, například OMS médium, které vykazuje vhodnou koncentraci cukrů avšak žádné regulátory rostlinného růstu, aniž by se média omezila jen na toto médium. Kultivace desek se provádí na světle /10 uE/m²s; studené světlo fluorescenční lampy nebo směs denního světla a světla Gro-Lux® /Sylvania/ fluorescenčního světla nebo jakéhokoliv jiného vhodného fluorescenčního světla/. Embrya se vyvíjí dále a vytvoří po určité době, obvykle po 1 týdnu až 6 měsících, zejména ale po 1 až 3 měsících, mladé rostlinky.

Způsobový krok E: Získávání rostlin, s výhodou fertilních rostlin mladých rostlinek

Mladé rostlinky získané předtím při způsobovém kroku D /se přenesou na vhodné médium, například na SH-médium nebo OMS- médium bez regulátorů růstu rostlin. Alternativně k tomuto způsobu se může také přidat regulátor růstu, který stimuluje vytvoření kořenů nebo výhonků.

Vhodné růstové regulátory jsou odborníkovi v této oblasti známy. Mladé rostlinky se kultivují na tomto médiu tak dlouho, až vytvoří kořeny. Při tom je důležité, aby se každý kalus z mladých rostlinek odstranil, neboť se ukázalo, že tento kalus ovlivňuje negativně růst rostlinek. Pro dosažení tohoto se mohou rostlinky, například během přenosu, opláchnout destilovanou vodou. Kalus, který se vytváří až dodatečně, se musí v pravidelných odstupech, s výhodou každé 3 až 30 dní a nejvýhodněji každý 1 až 2 týdny odstraňovat.Doba, která je potřebná pro vytvoření kořene, činí obvykle 1 až 4 týdny, především ale 2 týdny. Rostlinky s dobře vyvinutým systémem, se mohou přesadit do země a přenést do skleníku, kde pomalu otužují. Jako dostatečná se v této souvislosti považuje délka kořenů v rozmezí mezi 1 cm až 10 cm, zejména ale 2 až 5 cm. U výhonků se odpovídající rozsah pohybuje rovněž mezi 1 cm až 10 cm a zejména pak mezi 2 cm až 5 cm. Alternativně k tomu se mohou rostlinky i založením vždy nových následných kultur dále kultivovat in vitro v blíže neurčeném časovém rozmezí, tím že se výhonky oddělují od sebe a rostlinky přenesou na čerstvé médium, například SH-0 médium nebo OMS médium.

Způsob regenerace celých lipnicovitých rostlin, zejména celých fertilních lipnicovitých rostlin z podčeledi Pooideae, podle vynálezu, je charakterizován následujícími kroky způsobu:

a/ kultivací kalusu, který se odvozuje od lipnicovitých rostlin, který se získá z protoplastů a může se regenerovat na celé rostliny, na médiu, které je schopné inkubovat tvorbu embryí až vytvářet embrya;

b/ kultivací embryí na médiu, které je vhodné pro inkubaci zrání a klíčení uvedených embryí; a c/ kultivací vzniklých rostlinek až ke stádiu, ve kterém se tyto přesadí do země a mohou uzrát na celé rostliny.

Tvorba květů se může indukovat buď podle způsobu, který je popsán u Heide /1987/, nebo i jakýmkoliv jiným libovolným způsobem, který odpovídá požadavkům právě použitého druhu nebo odrůdy. Způsoby pro indukci květů u Pooideae jsou známy.

Semena produkovaná těmito rostlinami lze pomocí vhodného ošetření přivést ke klíčení a buď je zasít do květináčů, nebo i sterilizovat a rozprostřít na plochu Mureshige a Skoogova média, které

-16CZ 289790 B6 nevykazuje žádné růstové regulátoiy /OMS médium/ a je ztuženo 0,8 % agarem nebo agarózou, Gel Rita® nebo jakýmkoliv jiným libovolným želatinačním prostředkem. Semena lze vysít i na médium, které obsahuje lOug/ml až 1 000 ug/ml Hygromycinu B, pomocí něhož se může prokázat dědičnost resistence vůči Hygromycinu.

Způsob regenerace fertilních lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae podle vynálezu z kalusu obsahuje tedy následující kroky způsobu:

a/ kultivaci kalusu, který se odvozuje od rostlin z podčeledi Pooideae, který se získá z protoplastů a může se regenerovat na celé rostliny, na médiu, které je schopné indukovat vytvoření embryí až tvorbu embryí;

b/ kultivaci embryí na médiu, které je vhodné pro indukování zrání a klíčení uvedených embryí;

c/ kultivaci vzniklých rostlinek až do stádia, ve kterém se tyto přesadí do země a mohou se nechat dozrát na celé rostliny; a d/ získání semen v důsledku kontrolovaného nebo otevřeného opylení.

Další předmět vynálezu se týká lipnicovitých rostlin, zejména ale fertilních lipnicovitých rostlin, z podčeledi Pooideae a jejich rozmnožovacího materiálu, které se mohou regenerovat z uvedeného kalusu.

Způsobový krok F: Ošetření protoplastů exogenní DNA

Protoplasty rostlin z podčeledi Pooideae se mohou ošetřovat exogenní DNA, při kterém vzniknou buňky, které obsahují veškerou nebo část exogenní DNA stabilně integrovanou do jejich genomu. Pod pojmem exogenní DNA se má v rámci tohoto vynálezu rozumět každá DNA, která se může připojit k protoplastům. Uvedená DNA může být buď homogenní, nebo i heterologní ve vztahu k transformované rostlině. Exogenní DNA může obsahovat promotor, který je aktivní v rostlinách čeledi Graminace, zejména ale v rostlinách podčeledi Pooideae, nebo se může použít i promotor, který je již přítomný v genomu rostliny. Exogenní DNA může kromě toho obsahovat jeden nebo více genů, které mění genotyp, zejména ale fenotyp, rezultující buňky nebo zní regenerované rostliny. Avšak je žádoucí, aby se sekvence genu, která kóduje jeden nebo více požadovaných proteinových produktů, exprimovala, a produkovala jeden nebo více funkčních enzymů nebo polypeptidu v rezultující buňce popřípadě rostlině. U exogenní DNA se může jednat o chimémí gen nebo i o jeho část.

Pod pojmem exogenní DNA se má v rámci tohoto vynálezu rozumět i nekódující DNA s funkcí regulátoru, která hraje určitou roli například u regulace transkripce.

Zpracování protoplastů s exogenní DNA se může provést jedním ze způsobů popsaných v následujících publikacích:

[Paszkowski et al., 1984; evropská patentní přihláška EP 0 164 575 /Paszkowski et al/; Shillito et al., 1985; Potrykus et al., 1985, Loerz et al., 1985; Fromm et al., 1986; britská patentová přihláška GB 2 140 822 /Mettler/ a Nergutiu et al., 1987]. Tyto publikace tvoří ve formě referencí část tohoto vynálezu.

Exogenní DNA se může přidávat v jakékoliv formě, například DNA s lineární strukturou nebo DNA ve formě smyčky, zapouzdřená do liposomů, sferoplastů, jako součást jiných protoplastů, vytvářejících komplex se solemi atd., k protoplastům. Včlenění cizí DNA se může jakýmkoliv vhodným způsobem, včetně těch, které jsou popsány v publikacích uvedených shora, stimulovat.

-17CZ 289790 B6

V rámci tohoto vynálezu jsou výhodné chimémí geny, které propůjčují transformovaným protoplastem, stejně tak jako z nich vyvinutým tkáním, zejména rostlinám výhodné vlastnosti, například zvýšenou rezistenci vůči patogenům /například vůči fytopatogenním plísním, bakteriím, virům atd/; resistenci vůči chemikáliím [například vůči herbicidům/ například triazinům, sulfonylmočovinám, imidazolinům, triazolpyrimidinům, Bialophosu, Glyfozátům atd./, insekticitidům nebo jiným biocidům]; resistenci vůči nepříznivým /endafíckým nebo atmosferickým/ vlivům životního prostředí/ například horku, chladu, větru, nepříznivým poměrům půdy, vlhku, suchu atd./; nebo mohou vést i ke zvýšení tvorby rezervních a zásobních látek v listech, semenech, hlízách, kořenech, stoncích, atd. K žádoucím látkám, které mohou být produkovány transgenovými rostlinami, lze počítat například proteiny, škroby, cukry, aminokyseliny, alkaloidy, aromatické látky, barviva, tuky atd.

Resistence vůči cytotoxinům lze dosáhnout například přenosem genu, který je schopen, při expresi v rostlinné buňce, dát k dispozici enzym, který detoxifikuje cytotoxin, jako například neomycintransferázu typu II nebo aminoglykosidfosfotransferázu typu IV, která přispívá kdetoxikaci Kanamycinu, Hygromycinu nebo jiných aminoglykosidických antibiotik nebo glutathion-S-transferázu, cytochrom P-450 nebo jiný katabolicky účinné enzymy, o nichž je známo, že detoxifíkují triaziny, sulfonylmočoviny nebo jiné herbicidy. Resistence vůči cytotoxinům se dá zprostředkovat pomocí genu, který v rostlině exprimuje určitou formu „cíleného enzymu“ /působiště účinku cytotoxinu/ , která ke rezistentní vůči aktivitě cytotoxinu, jako například varianta syntázy acetohydroxykyseliny, která je necitlivá vůči inhibitorickému účinku sulfonylmočovin, imidazolinům, nebo jiným herbicidům, které vzájemně působí s tímto specifickým krokem látkové výměny; nebo varianta EPSP syntázy, která se ukazuje být necitlivá vůči inhibičnímu účinku glyfozátu. Může být výhodné, když se tyto změněné cílené enzymy exprimují ve formě, která dovolí její přenos do korektního celámího kompartimentu, jako to bylo například ve shora zmíněném případu do chloroplastů.

V určitých případech může být výhodné, dirigovat produkty genů do mitochondrií, vakuol, endoplastického retikula nebo do jiné oblasti buněk, dost možná, že dokonce i do intercelulámích prostor /apoplasty/.

Resistence vůči určitým třídám hub, lze dosáhnout například včleněním genu, který exprimuje v rostlinných tkáních chitinázu. Četné pro rostlinu patogenní houby obsahují chitin jako integrální součást ve svých strukturách hyfů a spor, tak například Basidiomycetes /například sněti a Uredinales/, Ascomycetes a Fungi imperfecti /včetně Altemaria a Bipolaris, Exorophillum turcicum, Colletotricum, Colletotricum, Gleocercospora a Cercospora/. Chitináza je schopna bránit in vitro růstu mycelia určitých patogenů. Rostlinný list nebo kořen, který exprimuje chitinázu konstitutivně nebo i jako odpověď na vniknutí patogenů je chráněn proti ataku velkého množství různých hub. Vždy podle situace může být konstitutivní exprese výhodná ve srovnání s indukovatelnou expresí, která u četných rostlin vzniká jako reakce na atak patogeny, neboť chitináza je přítomna bezprostředně ve vysoké koncentraci, aniž by se muselo nejprve čekat na lag-fázi pro novou syntézu.

Resistence vůči hmyzu se může přenést například genem, který kóduje polypeptid, který je toxický pro hmyz a/nebo larvy, jako například krystalický protein Bacillus thuringiensis /Bartoň et al., 1987; Vaeck et al., 1987/. Druhá třída proteinů, které zprostředkovávají resistenci vůči hmyzu jsou inhibitory proteázy. Inhibitory proteázy tvoří obvykle součást rostlinných zásobních struktur/Ryan, 1973/. Bylo možno prokázat, že Bowman-Birkův inhibitor proteázy, izolovaný ze sojových bobů a vyčištěný, inhibuje střevní proteázu larev Tenebrio /Birk et al. 1963/. Gen, který kóduje inhibitor trypsinu z krmného hrachu, je popsán Hilderem et al. /1987/.

Gen, který kóduje inhibitor proteázy, může být zaveden ve vhodném vektoru za kontroly promotoru rostliny, zejména konstitutivního promotoru, jako například CaMV 35 S promotoru, /který je popsán Odellem et al. 1985/. Gen, například kódující sekvence z Bowman-Birkova inhibitoru proteázy ze sojových bobů, se může získat pomocí sDNA klonovací metody, popsané

-18CZ 289790 B6

Hammondem et al. (1984/. Další možnost výroby inhibitoru proteázy spočívá v její syntéze, pokud tato vykazuje méně než 100 aminokyselin, jako například inhibitor trypsinu Phaseolus lunatus. Kódující sekvence se dá předpovědět zpětným přesazením sekvence aminokyseliny. Dodatečně jsou na oba konce vestavěny restrikční místa štěpení, která jsou vhodná pro právě požadovaný vektor. Syntetický gen se vyrobí syntézou překrývajících fragmentů oligonukleotidů se 30 až 60 páry bází, tím, že se tyto nejdříve podrobí reakci kinázy, potom se navzájem spojí (Maniatis et al. /potom se klonují do vhodného vektoru. Pomocí sekvencování DNA může potom klon, který vykazuje insert ve správné orientaci, být identifikován. Pro včlenění do protoplastů se používá izolovaný plazmid DNA /Ábel, et. al., 1986/

Předložený vynález zahrnuje rovněž geny, které kódují farmaceuticky aktivní součásti, například alkaloidy, steroidy, hormony a jiné fyziologicky aktivní látky jakož i flavony, vitaminy a barviva. Ke genům, které jsou uvažovány v rámci tohoto vynálezu patří proto, aniž by se na ně omezovala, geny specifické pro rostliny, jako například zeingy /Wienand et al., 1981/.

Specifické geny savců jako například insulinový gen, somatistatinový gen, interleucinové geny, t-PA-gen /Pennica et al., 1983/ atd. nebo geny mikrobiálního původu jako například ΝΤΡ Π gen jakož i syntetické geny jako insulinový gen /Itakuta et al., 1975/.

Pro transformaci protoplastů se mohou vedle kódující DNA samozřejmě používat i nekódující DNA, která vykazuje zpravidla funkci regulátoru a například může být obsažena při regulaci procesu transkripce.

Existují některé rostlinné geny, o kterých je známo, že jsou indukovány různými vnitřními a venkovními faktory jako rostlinnými hormony, tepelným šokem, chemikáliemi, patogeny, nedostatkem kyslíku a světla.

Jako například regulace genů rostlinnými hormony lze uvést kyselinu abscisinovou /ABS/, a které je známo, že indukuje přebytek mRNAs, vznikající v bavlně během embryonální fáze.

Další příklad poskytuje kyselina giberelinová /GA3/, která indukuje v ricinových semenech transkripci malátsyntázy, jakož i ve vrstvách aleuronu ječmene izoenzymy a-amylázy.

Regulace citlivých proteinových genů sójových bobů tepelným šokem byla podrobně zkoumána. Vícehodinové zpracování rostlin při teplotě 40 °C rezultuje v syntézu de novo tak zvaných tepelně šokových proteinů. Mezitím byly izolovány mnohé z těchto genů a jejich regulace byla podrobně zkoumána. Exprese těchto genů se v první řadě kontroluje na úrovni transkripce /Shoffl et al. citováno ve Willmetzer 1988/. Promotor hps genu byl fúzován s neomycintransferázou II/NPTII/ genem. Při tom mohlo být dokázáno, že chimémí gen se může indukovat tepelným šokem/Spěna et al., 1985/.

Jiná třída genů indukovatelných v rostlinách obsahuje světlem regulované geny, zejména nukleárně kódovaný gen malé podjednotky ribulozo-l,5-bifosfokarboxylázy /RUBISCO/, Morell et al. /1985/ a Herrera-Estrella et al. /1984/ prokázali, že 5'oboustranně terminální /flankující/ sekvence RUBISCO genu hrachu je schopné, přenést indukovatelnost světlem na reportérový gen, pokud je tento v chimémí formě spojen s touto sekvencí. Toto pozorování se mohlo rozšířit i na jiné světlem indukované geny, jako například chlorofyl a/b-vazný protein.

Alkoholdehydrogenázové geny /adh geny/ kukuřice byly předmětem intenzivního bádání. Adhls gen kukuřice byl izolován a bylo dokázáno, že část 5-flankující-DNA je schopna indukovat expresi chimémího reportérového genu /například chloramfenikolacetyltransferázy; CAT/, když se transferovaná tkáň vystaví přechodně anaerobním podmínkám /Howard et al. 1987/.

Ve výhodné formě provedení předloženého vynálezu se protoplasty, které byly získány z rostlin podčeledě Pooideae, transformují pomocí kombinace elektroporace a zpracování polyethylen

-19CZ 289790 B6 glykolem. Bezprostředně po čištění protoplastů, získaných při způsobovém kroku B/ se tyto podrobí elektroporaci /srovn. Shillito et al., /1985/, jakož i EP 0 164 575 /Paszkowski et al.] Protoplasty se po posledním opláchnutí mohou resuspendovat v elektroporačním pufru. V rámci tohoto vynálezu je vhodný například roztok manitu s přiměřenou koncentrací chloridu draselného KC1. K suspenzi protoplastů se potom přidává vodný roztok DNA. Při specifické formě provedení tohoto vynálezu se při tom jedná o plazmid pCIB709, který byl předem lineerizován zpracováním s vhodnou restrikční endonukleázou. Rezultující směs se opatrně míchá. Při specifické formě provedení vynálezu se přidá poloviční objem 24 % /hm/o/ roztoku PEG v 0,5 M roztoku manitu a 30 mM chloridu hořečnatého MgCl₂. Po důkladném promíchání se protoplasty přenesou do komory Dialog® elektroporátoru /DIA -LOG G.B.H., Haffstrasse 34,D-4000 Důsseldorf 13,FRG/ a zatíží 2 až 10 pulsy, s výhodou ale 3 pulsy asi 2 000 V/cm až 5 000 cm výchozího napětí a exponenciálními konstantami tlumení 10 us ve 30 sekundových intervalech. Vzorek se potom přenese do Petriho misky, kde se přidá 1 % /hm/o/ až 25 % /hm/o/ agarózy jako želatinačního prostředku. Protoplasty se před ztužením agarózy rozdělí rovnoměrně přes médium. Z této kultury transformovaných protoplastů se regenerují transgenové rostliny, včetně fertilních transgenových rostlin z podčeledi Pooideae podle popisu v odstavcích C/ až F/.

Při dalším výhodném provedení předloženého vynálezu se transformují protoplasty Pooideae podle metody popsané Negrutiu et al. /1987/. V tomto případě se vyčištěné protoplasty suspendují po posledním oplachu v 0,5 M roztoku, který obsahuje 15 mM až 45 mM chloridu hořečnatého MgCl₂. DNA se přidává ve formě vodného roztoku, dále pak stejný objem 36 % /hm/o/ roztoku PEG /Negrutiu et al., 1987/. Roztok se pečlivě promíchá a inkubuje 5 až 60 minut, s výhodou asi 30 minut, při teplotě 10 °C až 32 °C, s výhodou při teplotě místnosti /asi 25 °C/. Během fáze inkubace se roztokem příležitostně pohybuje. Po ukončení inkubace se protoplasty promyjí a rozloží se na plotny na vhodném kultivačním médiu. Ke vhodným kultivačním médium se počítá například KM-8p-médium, aniž by se způsob omezil pouze na toto médium, s 0,3 % /hm/o/ až 2,5 % /hm/o/, s výhodou ale 0,6 % /hm/o/ agarózy jako ztužovacím prostředkem. Protoplasty se před ztuhnutím agarózy rozdělí rovnoměrně po médiu. Z této kultury transformovaných protoplastů se regenerují transgenové rostliny, včetně fertilních transgenových rostlin z podčeledi Pooideae podle popisu v odstavcích C/ až F/.Exogenní DNA výhodná v rámci tohoto vynálezu je plazmid pCIB709, znázorněný na obr. 7, v lineární formě.

Způsobový krok G: Selekce transformovaných kolonií

Médium zpevněné agarózou /ze způsobového kroku F/, které obsahuje transformované protoplasty, se inkubuje na světle nebo s výhodou ve tmě po dobu 5 až 30 dní, s výhodou 8 až 15 dní a nej výhodněji 10 dní, při teplotě 0 °C až 50 °C, s výhodou 20 °C až 32 °C a nejvýhodněji 25 °C až 28 °C. Pevné médium se rozřeže potom například v 5 úseků a selekuje jak je popsáno u Shillito et al. /1983/; v evropské patentní přihlášce EP 0 129 688 /Shillito et al./; u Shillito et al.; /1985/ nebo v evropské patentní přihlášce EP 0 164 575 /Paszkowski et al./, v “bead type culture systém“. Počet a velikost segmentů média nejsou kritické. Při specifické formě provedení tohoto vynálezu se přenesou 4 z těchto segmentů jednotlivě do vhodného média, jako například do SH-45 kultivačního média se 4 g/litr hydrolyzátu kaseinu 20 ug/ml až 100 ug/ml Hygromycinu B. 5. segment se přenese do stejného média bez Hygromycinu /kontrola/.

Asi po 4 až 5 týdnech se podle předpokladu transformované buněčné kolonie z agarózy vyříznou a kultivují se ve vhodném kultivačním médiu, jako například SH-45 médiu, se 20 ug/ml až 100 ug/ml Hygromycinu B, kteiým se pohybuje pomocí kruhové třepačky při rychlosti otáček 50 otáček/min až 80 ot-Min. Po dalších 4 až 5 týdnech se všechny kolonie, které poskytují novou suspenzní kulturu, přenesenou na čerstvé médium se 20 ug/ml Hygromycinu B. Z nové suspenze se založí minimálně 2 další kultury v přítomnosti 20 ug/ml Hygromycinu B. Tyto se kultivují za podmínek, které byly shora popsány, až do vytvoření kalusu.

Kalus, suspenzní kultury jakož i kultury, které se mohou získat z materiálu, vyrobeného při tomto způsobovém kroku, se konzervují chladem pomocí metody popsané u způsobového kroku A/.

-20CZ 289790 B6

Způsobový krok H: regenerace transformovaných rostlin z podčeledi Pooideae z kalusu

Z transformovaného kalusu /způsobový krok G/ se dají s v souladu se způsobem popsaným v úseku D/ regenerovat transformované rostliny z podčeledi Pooideae.

Způsob podle vynálezu dovoluje tak regenerovat protoplasty, které pochází z lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, na celé rostliny, zejména ale celé fertilní rostliny. Tím se poprvé podařilo vestavět exogenní DNA do genomu těchto rostlin a tím změnit jejich genotyp popřípadě fenotypy. Kromě toho mohou se protoplasty spojovat intraspecificky nebo interspecificky s jinými protoplasty, čímž se produkují nové kombinace nukleární DNA nebo i nové kombinace z nuklámí a ex tranukleámí DNA. Dále se tyto protoplasty mohou používat jako materiál schopný klonování, na kterém je možné provádět mutační a selekční kroky pro výrobu požadovaného fenotypu.

Příklady žádoucích fenotypů zahrnují resistenci vůči toxickým koncentracím přirozených nebo syntetických chemikálií, včetně insekticidů, herbicidů, fungicidů, baktericidů, těžkých kovů, solí, pathotoxinů, inhibitorů látkové výměny jakož i strukturních a funkčních analogů celulámích metabolitů, aniž by se tento výčet omezil pouze na ně. Další příklady žádoucích fenotypů, na které lze selektionovat, obsahují resistenty vůči životního prostředí jako studeným a teplým teplotám nebo biotíckým agenciím jako patogenům.

Další příklady provedení slouží pouze pro další ilustraci předloženého vynálezu a nemají nikterak omezovat předmět vynálezu.

Nelimitující příklady provedení

Příklad 1

Výroba embiyogenních suspenzních kultur ze tkání Dactylis glomerata L. /-srha laločnatá/

Jako výchozí materiál pro embryogenní kalus slouží bazální úseky nejmladších listů rostlin srhy laločnaté /Dactylis glomerata L./, pěstovaných ve skleníku, jak je to popsáno u Hanning et al. /1982/ Listy se povrchově sterilizují 10ti minutovým namáčením do Cloroxova roztoku, zředěného 1 : 10 /roztok 5,25% /hm/o/ chlornanu sodného; the Clorox Company, Oakland, CA94623, USA/ a potom se za sterilních podmínek rozřežou na malé segmenty dlouhé 1 mm až 5 mm nebo o průměru 1 mm až 5 mm. Tyto segmenty se nanesou na plotny sterilního SH-30 média, které obsahuje 0,8% /hm./o/ agarózy jakožto ztužovacího prostředku. Při teplotě kultivace asi 25 °C se během 2 až 6 týdnů po nanesení segmentů na plotny se objeví kalus a/nebo embryogenní struktury.

Jako výchozí materiál pro výrobu embryogenních suspenzních kultur slouží embryogenní kalus, z něhož se asi 0,5 g /hmotnost čerstvého materiálu/ vnese do 50 ml kapalného média, popsaného u Graye et al. /1985/, které obsahuje 45 uM Dicamba a 4 g/litr hydrolyzátu kaseinu. Suspenzní kultury se inkubují v Delongových lahvích, které jsou uzavřeny kovovými víčky a parafilmem^R, při teplotě 27 °C a rytmu světlo/tma 16 hodin světlo /40 uE/m²s/ a 8 hodin tma na kruhové třepačce asi při 130 otáčkách za minutu. Asi za čtyři týdny se nechají během asi 30 sekund sedimentovat velké buněčné aglomeráty a potom se odebere 10 ml alikvotní části z přebytku, který obsahuje malé shluky buněk a tyto se přenesou na 50 ml čerstvého média. Tento postup se opakuje každé 3 až 4 týdny, přičemž se vždy použije shluk buněk slibující největší úspěšnost, měřeno na menší velikosti shluku a lepší kvalitě, kterou lze docílit v přítomnosti malých buněk, bohatých na cytoplasmu. Po 5 až 8přenosech jsou suspenze v podstatě prosté neembryogenních buněk a převážná většina embiyogenních buněčných klustrů je relativně malá /150 um až 2'000 um/.

-21 CZ 289790 B6

Příklad 2

Izolace a čištění protoplastů Dactylis glomerata L.

Protoplasty se získají z embiyogenní suspenzní kultury /příklad 1/, přičemž se nejdříve oddělí buňky pomocí sterilizační filtrace přes Nalgene® s 0,2 um filtrační jednotkou a potom se přidají v množství 0,5 g /hmotnost čerstvého materiálu /k 12,5 ml směsi protoplastů a enzymů obsažené v Petriho misce. Směs enzymů, která sestává z celulázy RS 2 % /hm/o/

CaCl₂ x H₂O 7 mM

NaH₂PC>4 x H₂O 0,7 mM

MES /pH 5,6/ 3,0 mM glukóza /konečná koncentrace/ 550 mOs/kg H₂O/ /pH 5,6/ a potom se sterilizuje filtrací. Směsí se pohybuje na třepačce při rychlosti asi 50 otáček za minutu za šera / < 5 uE/m²s/ 4 až 5 hodin. Natrávený materiál se potom filtruje přes síto z nerez ocele /velikost ok 100 um/ a rozdělí se do 12 trubiček odstředivky, které se odstřeďují 5 minut asi při 60 g až 100 g. Sediment obsahující protoplasty se potom promyje třikrát médiem KM-8p protoplastů, které je nastaveno pomocí glukózy na osmotickou hodnotu 550 mOs/kg H₂O. Na tomto místě lze pro další čištění protoplastů zařadit flotaci. V tomto případě se promyté protoplasty nanesou na povrch KM-8p-média nastaveného sacharózou na osmotickou hodnotu 700 mOs/kg H₂O. Po 10ti minutovém odstřeďování při 60 g až 100 g se protoplasty koncentrované na mezní ploše pomocí jemných pipet seberou. Potom se protoplasty resuspendují v 1 ml až 2 ml KM-8p- kultivačního média a zfiltruje se přes sítovou mříž /20 um/. Uvolněné protoplasty se seberou, promyjí a resuspendují pro kultivaci v KM-8p-médiu nebo i v osmoticky přizpůsobeném médiu, které je vhodné pro transformaci podle příkladu 6.

Příklad 3

Kultura protoplastů Dactylis glomeratus L. a růst kalusu a/ Vyčištěné protoplasty se nanesou v měrné hmotnosti asi 5 x 10⁵ protoplastů /ml na plotny kultivačního KM-8p-média, které obsahuje 1,3 % /hm/o/ Sea Plaque® Agarose /FCM- Corp. Marině Colloids Division, Rockland, Maine, USA/ a 30 % až 40 % /0/0/ kondicionovaného média. Kondicionované médium se získá ze 3 až 4 týdny starých embryogenních suspenzních kultur Dactylis glomerata L., tím, že se tyto zfiltrují přes sterilní Nalgene® fílter /0,2 um/, médium se nastaví přísadou glukózy na osmotickou hodnotu 550 mOsm/kg H₂O a potom se znovu sterilizuje pomocí filtrace. Plotny se potom inkubují ve tmě při konstantní teplotě 28 °C. Po 10 až 14 dnech se agaróza rozřeže na klínky a vnese se do „bead culture systém“ /Shillito et al., 1983/ za použití 20 ml SH-45 suspenzního kultivačního média se 3 % /hm/o/ sacharózy na 3 ml původní kultury ztužené agarózou. Plotny se dají na třepačku a pohybuje se jimi asi při 50 otáčkách za minutu a při intenzitě osvětlení 8 uE/m²s. Uvolněním buněk z agarózy do ji obklopujícího kapalného média dojde k vytvoření nových suspenzních kultur. Rezultující buňky, kultivované v suspenzi, se nanesou na plotny SH-30 média ztuženého agarózou a kultivují se až do vytvoření kalusu ve tmě při 25 °C.

b/ Protoplasty se kultivují tak, jak to bylo prve popsáno v příkladu 3 A/, s výjimkou, že kultivační médium obsahuje přísadu 30 mg/litr kyseliny O-salicylové.

c/ protoplasty se kultivují tak, jak to bylo předtím popsáno v příkladech 3 a/ až 3 c/, stou výjimkou, že kultivační médium neobsahuje žádné kondicionované médium.

-22CZ 289790 B6

Příklad 4

Regenerace rostlin Dactylis glomerata L. z kalusu, který se odvozuje od protoplastů a/ Kalus Dactylis glemerata L. /který lze získat způsobem podle příkladu 3/, který byl získán z protoplastů se kultivuje na ztuženém SH-30 médiu. Každé dva týdny se zakládají následné kultury. Všechna embrya, která se za tuto dobu vyvinou, se odeberou, nanesou se na plotnu média pro klíčení /SH-0/ a inkubují se na světle /45 uE/m²s/. Klíčení těchto embryí začne po 1 až 4 týdnech.Rezultující mladé rostlinky se přenesou pro vytvoření systému kořenů na SH-médium a tam se na světle inkubují. Po dosažení stádia šesti až dvanácti listů přenesou se do skleníku a tam se pozvolna otužují.

b/ Kalus /který lze získat podle příkladu 3/, který byl získán z protoplastů, se kultivuje na SH-0 médiu ztuženém 0,24 /hm/o/ Gel Rite® na světle /uE/m²s až 55 uE/m²s/. Každé dva týdny se zakládají následné kultury. Rezultující mladé rostlinky se přenesou pro tvorbu kořenů na médium, které sestává ze směsi SH-0 média a OMS média v poměru 1:1, která je zpevněna kombinací sestávající z 0,12 % /hm/o/ Gel Rite® a 0,4 % /hm/o/ agaru a kultivuje se na světle. Po dosažení stádia šesti až dvanácti listů se přenesou do skleníku a tam se pozvolna otužují.

c/ Malé mladé rostlinky se získávají, jak to bylo již dříve popsáno v příkladech 4 a/ a 4 B/, přenesou se na OMS médium s 0,8 % /hm./o/ agaru a pro vytvoření systému kořenů se kultivují na světle. Po dosažení stádia šesti až dvanácti listů se přenesou do skleníku a tam se pozvolna otužují.

d/ Malé mladé rostlinky se získávají způsobem, který byl předtím popsán v příkladu 4 a/ se přenesou pro vytvoření kořenů na směs médií sestávající z SH-0 a OMS- média, která byla předem ztužena kombinací sestávající z 0,12 % /hm./o/ Gel Rite® a 0,4 /hm./o/ agaru a na světle se kultivují. Po dosažení stádia šesti až dvanácti listů se přenesou do skleníku a tam se pozvolna otužují.

Příklad 5

Konstrukce plazmidu pCIB709, replikonu E. coli s resistentním genem Hygromycinu exprimovatelným v rostlinách /35S/Hyg7

Kódující sekvence strukturního genu pro resistenci Hygromycinu se izoluje z plazmidu pLG90 Gritz a. Davies, 1983/ ve formě BamHI fragmentu zahrnujícího asi 1 150 bází. Plazmid pLG90 se může pěstovat způsobem podle Linda Gritz [Applied Biotechnology, 80 Rogers St., Cambridge, Mass. 02141]. Pro konstrukci plazmidu pCIB709 se izolovaný BamHI fragment včlení do BamHI místa štěpení pCIB709 /Rohstein et al., 1987/. Plazmid pCIB709 obsahuje regulační oblast CaMV/ Cauliflower Mosaic Virus/ 35S transkriptu, přičemž oblasti promotoru a terminátoru jsou odděleny singulárními BamHI místy štěpení.

Rezultující plazmid pCIB709 byl uložen u „Američan Type Culture Collection“ /Rockville, Maryland, USA/ pod číslem uložení ATCC 40428.

Před použitím plazmidu pro transformaci, se plazmid pCIB709 může linearizovat zpracováním s restrikčním enzymem PvuII. Tento konstrukt potom obsahuje restrikční gen Hygromycinu /aminoglykosidfosfotransferázu typu IV/ spolu s 5'a 3' expresními signály CaMV 35S transkriptu z Cauliflower Mosaik Virus /CaMV/ vpCU plazmidu. Sekvence pCIB709 je znázorněna na obr. 7.

-23CZ 289790 B6

Příklad 6

Transformace protoplastů Dactylis glomerata L. pomocí elektroporace a/ Bezprostředně po čištění protoplastů se provádí elektroporace podle popisu v publikaci u Shillito et al. /1985/, za použití plazmidu pCIB709 reprodukovaného na obr. 7 v linearizované formě. Protoplasty se po posledním pochodu oplachování resuspendují v měrné hmotnosti 7 x 10⁶ protoplastů/ml v elektroporačním pufru /0,4 M manit, 6 mMMgCl₂/. Protoplasty se potom převedou v alikvotní části 0,7 ml do trubiček z plastu pro odstřeďování /10 mlž. Potom se přidá k trubičkám plazmid-DNA /62 ul vody s PvuII natráveným plazmidem pCIB709 a telecím brzlíkem-DNA zpracovaným ultrazvukem /Sigma/ v konečné koncentraci 10 ul/ml /pCIB709/ popřípadě 50ug/ml /telecí brzlík-DNA/. Dále se přidá 0,38 ml roztoku polyethylenglykolu /roztoku PEG/ /24 % /hm./o// PEG 6'000 v 0,4 M manitu, 30 mM MgCl₂, 0,1 % /hm./o/ MES /pH 5,6/ a roztok se pečlivě promíchá. Suspenze protoplastů se potom převede do komory Dialog® elektroporátoru a naloží 10 pulsy, které vykazují výchozí napětí 3'250 V/cm a exponenciální konstantu tlumení 10 usec a aplikují se v intervalech 30 sekund. Vzorek se potom vyjme z komory a přenese se do Petriho misky s průměrem 10 cm. Po přídavku 10 ml KM-8p-média s 1,2% Sea Plaque® agarózou se protoplasty rozdělí před ztuhnutím agarózy rovnoměrně přes celý povrch média.

b/ příklad 6 a/ se opakuje, s tou výjimkou, že výchozí napětí činí v tomto případě 3'500 V/cm c/ příklad 6 a/ se opakuje s tou výjimkou, že výchozí napětí činí v tomto případě 4'000 V/cm d/ příklad 6 a/ se opakuje s tou výjimkou, že výchozí napětí činí v tomto případě 5'000 V/cm e/ příklad 6 a/ se opakuje s tou výjimkou, že výchozí napětí činí v tomto případě 3'000 V/cm.

f/ příklad 6 a/ se opakuje s tou výjimkou, že v tomto případě činí výchozí napětí 2'500 V/cm g/ příklady 6 a až 6 f/ se opakují s tou výjimkou, že se použije PEG s molekulární hmotností 4'000, h/ příklady 6 a/ až 6 f/ se opakují s tou výjimkou, že se použije PEG s molekulární hmotností 8'000 i/ příklady 6 a/ až 6 h/ se opakují, s tou výjimkou, že se konečná koncentrace PEG pohybuje v rozmezí 10 % až 30 % /hm./o/ j/ příklady 6 a/ až 6 i/ se opakují s tou výjimkou, že se dodatečně provede zpracování tepelným šokem podle popisu u Shillito et al. /1985/ a Potrykus et al. /1985/.

Příklad 7

Transformace protoplastů Dactylis glomerata L., pomocí zpracování polyethylenglykolem a/ přímý transfer genu zprostředkovaný PEG se provádí podle popisu Negrutiu et al. /1987/. U použité DNA se jedná o linearizovaný plazmid pCIB709.

Protoplasty se po posledním opláchnutí suspendují v 0,5 M roztoku manitu, který obsahuje 15 mM chloridu hořečnatého MgCl₂, v koncentraci 2 x 10⁶ na ml. Suspenze protoplastů se rozdělí ve formě 1 alikvotní části do odtředivkových trubiček z plastu /10 ml/. Před přídavkem roztoku PEG [40 % /hm./o/J se nejdříve přidá, jak bylo podrobně popsáno v příkladu 6, DNA. Roztoky se pečlivě promíchají a inkubují 30 minut při teplotě místnosti za občasného protřepání. Potom se

-24CZ 289790 B6 přidá 1,4 ml promývacího roztoku a jednotlivé součásti vnesené do trubičky se pečlivě smísí. Promývací roztok sestává z 87 mM manitu, 115 mM chloridu vápenatého CaCl₂,27 mM chloridu hořečnatého MgCl₂39mM chloridu draselného Kel, 7 mM Tris/HCl a 1,7 g/litr m-inositu /pH9,0/. V odstupech čtyř minut se přidají další 1,4 ml alikvotní části promývacího roztoku a celá šarže se nyní dobře promíchá. Trubičky se potom odstřeďují 10 minut a asi 60 g a horní oddělená část se vyhodí. Sedimentované protoplasty se vyjmou do 1 ml KM-8p-média a převedou do Petriho misek o průměru 10 cm. Po přídavku 10 ml KM-8p-média s 1,2 % /hm/o/ Sea Plaque® agarózou se protoplasty rozdělí před ztuhnutím agarÓ2y rovnoměrně po celém médiu.

b/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladu 7a/, stou výjimkou, že pH roztoku promývacího se nastaví na hodnotu pH 5,6.

c/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladu 7 al, s tou výjimkou, že se pH promývacího roztoku nastaví na hodnotu pH 7,0.

d/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až c/, s tou výjimkou, že se použije PEG, která vykazuje molekulární hmotnost 6'000, e/ transformace se provede tak, jak to bylo popsáno v příkladech 7 a! až 7 cl, s tou výjimkou, že použitá PEG vykazuje molekulární hmotnost 2'000, f/ transformace se provede tak, jak to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 c/, s tou výjimkou, že použitá PEG vykazuje molekulární hmotnost 8'000, g/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 al až 7 f/ s tou výjimkou, že se dodatečně provede zpracování tepelným šokem, podle toho jak to popisuje Shillito et al. /1985/ a Potrykus et al., /1985/, h/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 g/ stou výjimkou, že promývací roztok sestává ze 154 mM chloridu sodného NaCl, 125 mM chloridu vápenatého CaCl₂ a 5 mM glukózy a je nastaven hydroxidem draselným KOH na pH 6,0, i/ transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 a/ až 7 g/ stou výjimkou, že promývací roztok sestává z 0,2 M chloridu vápenatého CaCl₂ a 0,1 % /hm./o/ MES a je nastaven hydroxidem draselným KOH na hodnotu pH 6,0.

j/ transformace se provádí stejně jako to bylo popsáno v příkladech 7 al až 7 g/ s tou výjimkou, že promývací roztok sestává z 0,2 M chloridu vápenatého CaCl₂ a 7 mM Tris/HCl, a je nastaven hydroxidem draselným KOH na hodnotu pH 9,0.

Příklad 8

Transformace protoplastů Dactylis glomerata L. pomocí elektroporace nebo zpracování polyethylenglykolem al Transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 6 a 7, s tou výjimkou, že se plazmid pCIB709 předtím než se použije pro účely transformace, štěstí restrikčním enzymem BgH.

b/ Transformace se provede stejně jako to bylo popsáno v příkladech 6 a 7, s tou výjimkou, že se plazmid pCIB709, dříve než se použije pro účely transformace, štěpí restrikčním enzymem HindlII.

-25CZ 289790 B6

Příklad 9

Transformace protoplastů Dactylis glomerata L. pomocí elektroporace nebo zpracování polyethylenglykolem

Transformace se provádí stejně jako to bylo popsáno v příkladech 6, 7 nebo 8, s tou výjimkou, že se protoplasty před rozdělením alikvotní části do jednotlivých odstřeďovacích trubiček pro následující transformaci nebo i po rozdělení alikvotní části a před přísadou PEG, zpracovávají 5 minut při teplotě 45 °C.

Příklad 10

Selekce transformovaných kolonií a/ kultivační plotny /Petriho misky/ s protoplasty se inkubují 10 dní při teplotě asi 25 °C ve tmě a potom se pro následující kultivaci /“bead culture“, Shillito et al., 1983/ rozřežou na 5 stejně velkých kusů. 4 kusy se nyní vnesou do 20 ml SH-45 kultivačního média se 4 g/litr hydrolyzátu kaseinu a 20 ug/ml Hygromycinu B. 5. kus se vnese rovněž do 20 ml stejného média, které ale neobsahuje žádný Hygromycin B a slouží jako neselektivní kontrola. Po 4 až 5 týdnech se domněle transformované kolonie buněk, získané z protoplastů, které rostly v přítomnosti Hygromycinu B, vyřežou zagarózy a přenesou do Petriho misky s průměrem 19 mm, která obsahuje 2 ml kapalného SH-45 média se 20 ug/ml Hygromycinu B. Petriho miskami se pohybuje na třepačce s rychlostí otáček asi 50 otáček za minutu. Po dalších 4 až 5 týdnech se všechny ty kolonie, které vykazují růst a vedou k novým suspenzím, přenesou do 125 ml Erlenmayerových lahví a nepřihlížeje k přídavku Hygromycinu /20 ug/ml se kultivují stejně jako startovací kultura.

Z nových suspenzí se každý 1 až 3 týdny založí následné kultury za použití SH-45- média se 4 g/litr hydrolyzátu kaseinu a 20 ug/ml Hygromycinu B. Kromě toho se buňky z těchto suspenzí nanesou na plotny pevných médií se 20 ug/ml Hygromycinu B a inkubují se při 25 °C ve tmě. Z kalusů, které se vyvinou z těchto buněk nanesených na plotnách, se každé 2 až 3 týdny založí následné kultury na čerstvém médiu. Vychází se z toho, že se u těchto buněk, které rostly v přítomnosti Hygromycinu B, jedná o transformanty.

b/ selekce se provádí tak, jak to bylo popsáno v příkladu 10 a/, přičemž se ale v tomto případě kolonie buněk, získané z protoplastů, které rostly v médiu obsahujícím Hygromycin, přenesou na agarové plotny s SH-30 médiem, které obsahuje 20 ug/ml Hygromycinu B a inkubují se při teplotě 25 °C ve tmě.

Příklad 11

Regenerace transformovaných rostlin Dactylis glomerata L.

Rostliny se regenerují stejně jako to bylo popsáno v příkladu 4 pro netransformovaný materiál.

Příklad 12

Extrakce DNA z kalusu a listové tkáně

DNA se extrahuje z kalusu a listů regenerovaných rostlin za použití modifikované CETAB metody /Roger a Bendich, 1985/. Tento způsob je zde popsán na příkladu rostlin Dactylis

-26CZ 289790 B6 glomerata L., ale může se stejně úspěšně používat i pro tkáně libovolných jiných rostlin z podčeledi Pooideae. Pro získání DNA ze shora popsaného materiálu lze ale použít i jakýkoliv jiný obvyklý způsob extrakce DNA.

Kalus vyrostlý na SH-O-médiu a SH-30 médiu se hluboko zmrazí suchým ledem a potom se při teplotě kapalného dusíku rozetře na jemný prášek, takto získaný prášek se potom přenese na polypropylenové odstředivkové trubičky /5 ml/, předem ochlazené na teplotu kapalného dusíku. Při tom je nutné dbát na to, aby prášek v žádném časovém okamžiku během provádění tohoto kroku neroztál. prášek se potom suší přes noc vymrazováním a potom se rozdělí na 2,2 ml Eppendorfovy trubičky, přičemž na každou trubičku se dá 0,5 ml prášku. Na každou trubičku se přidá 1 ml CETAB extrakčního pufru; potom se trubičky inkubují při teplotě 60 °C asi 30 až 45 minut. Po ochlazení na teplotu místnosti se přidá 1 ml směsi chloroformu a izoamylalkoholu v poměru 24 : 1 a obsah se důkladně promíchá. Potom následuje odstřeďování, které se provádí 30 sekund při 3'000 otáčkách za minutu v Eppendorfově odstředivce. Potom se vodná fáze převede do čerstvé trubičky, přidá se 1/10 objemu 10 % /hm/o/ CETAB roztoku a opakuje se extrakce chloroformem. Vodná fáze se znovu vnese do čerstvé trubičky a doplní se stejným objemem precipitačního pufru. Poté dojde při teplotě místnosti k vyloučení DNA a RNA. Toto vylučování se nechá pokračovat 30 minut až 1 hodinu, než se trubičky podrobí opětovnému odstřeďování. Homí oddělená část se vyhodí a precipitát se resuspenduje v TE pufru /viz dole/, který vykazuje vysokou koncentraci soli, při teplotě 65 °C během 30 minut.

Použité pufry a roztoky

CETAB extrakční pufr

10% CETAB

Precipitační pufr

TE-roztok /vysoká koncentrace solí/

TE-pufr

1/10 TE % /hm/o/ CETAB Tris pH 8,0 /50 mM/ EDTA /10 mM/ NaCl /0,7 mM/

0,5 % /hm/o/ PVP MG 360'000 /PVP: polyvinylpyrolidin/ 10 % /hm/o/ CETAB NaCl /0,7 mM/ %/hm/o/CETAM Tris pH 8,0 /50 mM/ EDTA/10 mM/ Tris pH 83,0 /10 mM/ EDTA /1 mM/ NaCl /1 M/ Tris pH 8,0 /10 mM/ EDTA /1 mM/ Tris pH 8,0 /1 mM/ EDTA/0,1 mM/

Příklad 13

Čištěná DNA

DNA vyrobená způsobem popsaným v příkladu 12 nebo jakýmkoliv jiným vhodným způsobem se může čistit za použití libovolného, známého způsobu. Příklady vhodných způsobů jsou, aniž by jejich výčtem se tyto jakkoliv omezily pouze na uvedené způsoby: ethidiumbromid-CsCl gradientově odstřeďování; zpracování se směsí fenolu a chloroformu jakož i čištění stupňovitým gradientem bez ethidiumbromidu. tyto způsoby jsou popsány u Maniatis et al. /1982/.

-27CZ 289790 B6 a/ Čištění zpracováním směsí fenolu a chloroformu

Nukleové kyseliny z příkladu 12 se vysráží 2 objemovými díly studeného ethanolu /-20 °C/ a trubičky se odstřeďují 2 až 3 minuty při 5'000 g. Horní část nad sedimentem se odstraní aprecipitát se promyje 70% a 100% ethanolem. Potom se nukleové kyseliny zčásti usuší ve sterilním proudu vzduchu. DNA se přes noc rozpustí ve 200 ul 1/TE pufru. Roztok DNA se přenese do Eppendorfových odstředivkových trubiček a přidá se 10 ul roztoku RNAázy /2 mg/ml/, která byla předem zahřáta, aby se popřípadě přítomná DNAáza dezaktivovala, předtím než se trubičky inkubují při 37 °C asi 1 hodinu. Potom se přidá 0,25 objemového dílu 5 M roztoku chloridu sodného NaCl a DNA se vysráží přídavkem 0,4 objemového dílu 30 % roztoku PEG /MG 6'000 až 8'000/, který obsahuje 1,5 M roztok chloridu sodného NaCl, jakož jednohodinovou inkubací při -20 °C. Trubičky se potom odstřeďují 5 minut, horní oddělená část se vyhodí a precipitáty se promyjí studeným absolutním ethanolem. Po krátkém sušení ve sterilním proudu vzduchu se pelety resuspendují v 0,3 ml TE-pufru. Tento roztok se extrahuje směsí fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu /25 :24 : 1/, která je ekvilibrována TE-pufrem, 30 sekund se odstřeďuje v Eppedorfově odstředivce. Potom se vodná fáze na čerstvé trubičky. Roztok se extrahuje směsí chloroformu a izoamylalkoholu /24: 1/ a 30 sekund odstřeďuje a potom se vodná fáze přenese na čerstvé trubičky. Extrakce chloroformem se opakuje. Potom se pro vysrážení DNA přidá 1/10 objemu 3 M roztok natriumacetátu, a potom 2 objemové díly leden ochlazeného ethanolu. Precipitát se sbírá pomocí odstřeďování, promyje se 70 % a 100 % ethanolem, krátkou dobu se suší ve sterilním proudu vzduchu a potom se rozpustí v dostatečném množství TE-pufru, takže se získá roztok pro 'Southem bloť analýzu, která vykazuje koncentraci DNA mezi 0,25 ug/ul až 1 ug/ul.

b/ Čištění přes stupňové gradienty bez ethidiumbromidu

Nukleové kyseliny se čistí přes CsCl stupňový gradient, který sestává z 5,7 M CsCl /v TE-pufru/ dolní vrstvy a nad ní uložené vrstvy z 1,0 M CsCl v TE-pufru. Nukleové kyseliny se inkorporují v horní vrstvě. Trubičky, které obsahují stupňový gradient se odstřeďují přes noc v odstředivce s excentricky rotujícím rotorem /například Beckmann SW 50.1; 45'000 otáček za minutu/. DNA se izoluje z oblasti mezních ploch, zatím co RNA se může získat ze dna trubičky. DNA se zředí objemovými díly vody a vysráží se, tak jak to bylo předtím popsáno v příkladu 13 a/, 2 objemovými díly ledově studeného ethanolu. Precipitáty se potom resuspendují v TE-pufru, znovu se precipitují ethanolem a použijí se pro 'Southem blotť analýzu.

Příklad 14

Důkaz cizorodých sekvencí DNA v genomu transformovaných rostlin Dactylis glomerata L., pomocí 'Southem bloť analýzy

Southemova hybridizace se v podstatě provádí podle způsobu popsaného u Maniatis et al. /1982/. DNA z rostlin Dactylis glomerata L-. /vyčištěná způsoby popsanými v příkladech 13 a/ a 13 b/ se štěpí restrikčním enzymem BamHL 5 ug rozštěpeného materiálu se nanese nyní na 1 % agarózový gel a rozdělí se podle velikosti jejích fragmentů. Gel se vnese na dobu asi 20 minut do 0,25 M kyseliny chlorovodíkové HC1, potom se opláchne vodou a na dobu dalších 30 minut se dá do 0,4 M hydroxidu sodného NaOH. DNA se potom přes noc přenese obvyklým způsobem na Gene Screen Plus® /NEN Res. Products Kat. Nr. NEF 976, šarže č. 330GP62, jak je to popsáno v sešitě s návodem, kteiý se dodává spolu s produktem/, přičemž se jako přenosový pufr použije 0,4 M hydroxid sodný NaOH. Po nočním přenosu se odstraní filtr, 2 x se promývá SSC /0,3 M roztok chloridu sodného NaCl, 0,03 M roztok citrátu sodného/ asi 5 minut a potom se usuší na vzduchu. Blot se předhybridizovává po dobu 4 hodin při teplotě 65 °C pufrem, který obsahuje 10 g/litr albuminu hovězího séra /Fat Free Sigma, Kat. č. A-4503/, 7 % SDS, 1 mM NaEDTA a 0,52 M natrium fosforečnanového pufru /pH 7,0/. Pomocí 'Random Přimeť metody se potom vyrobí za použití IBI 'PrimeTime' značícího kitu nebo libovolné jiné metody, radioaktivně

-28CZ 289790 B6 značený vzorek, který se pomocí ' Spin' sloupce zbaví přebytečných nukleotidů. Vzorek DNA sestává z fragmentu pCIB709, který obsahuje oblast promotoru 35S jakož i strukturní gen aminoglykosidtransferázy typu IV. Hybridizační reakce se provádí přes noc při teplotě 65 °C. Blot se potom opláchne 4x SW promýchávacím pufrem, přičemž dva poslední oplachy se provádí při teplotě 65 °C. Potom se Blot ještě dále oplachuje a sice po dobu 2 hodin v 0,2 x SSC s 1 % SDS a 5 mM EDTA při 65 °C. Mokrý blot domácnost /Saranwrap®/ nebo do libovolné jiné vhodné fólie a vyvíjí se pomocí rentgenového filmu /Kodak X-Omat AR film, Eastman Kodak, Rochester, NY 14650, Kat. č. 165 1454/. Vyhodnocení vyvinutého rentgenového filmu ukazuje jednoznačně na hybridizaci mezi vzorkem a DNA, která byla získána z kalusu transformovaného pCIB709 nebo z rostliny transformované pCIB709. pCIB709 je tedy jednoznačně vestavěna do vysokomolekulámí DNA transformantů.

Roztoky a pufr

SW hybridizační pufr	1 % /hm/o/ albuminu hovězího séra /prosté tuku 0,52 M fosforečnan sodný; pH 7,0 7 % /hm/o/ SDS 1 mMNaEDTA
promývací roztok	0,04 M fosforečnan sodný; pH 7,0 1 mMNaEDTA 1 % /hm/o/ SDS 0,125 M chlorid sodný NaCl

Příklad 15

Konzervace kultur kalusu Dactylis glomerata L. chladem

1/ Aktivně rostoucí kalus rostlin Dactylis glomerata L. se převede do kapalného SH-O-média. Množství kalusu se obvykle pohybuje asi okolo 0,5 g až 1 g kalusu na 20 ml kultivačního média. Lahvemi s kalusem se opatrně pohybuje a míchá, aby se hrudky kalusu dezintegrovaly a dispergovaly. Kultury, jakož i prostředek chránící proti mrazu se potom ochladí odděleně na ledu.

b/ Potom se po dobu 5 minut přidává stejný objem roztoku P prostředku proti zamrzání a směs se ponechá jednu hodinu na ledu. Během této doby se 1,0 ml alikvotní části rozdělí do označených a předchlazených plastových lahviček, které se hodí pro konzervaci chladem /například Vangard Cryos Cryogenic Vials, Sumitomo Bakelite Co. Ltd, Japan, Kat. č. MS4502 /a inkubuje se na ledu. Mrazuvzdomý roztok P sestává z 1 M glycerinu, 1 M L-prolinu, 2 M dimethylsulfoxidu /DMSO, Sigma, kt. č. D2650, šarže č. 57F—8816/ ve vodě, pH5,6. Tento roztok se před každým použitím připravuje čerstvý /glycerin/prolin/voda-směs se může uchovávat hluboko zmrazená/.

3/ Po jednotlivé společné inkubaci buněk a prostředku chránícího proti zmrznutí se nádoby ponoří do hladiny kapalné lázně, která vykazuje teplotu 0 °C. Lázeň může sestávat buď z ethanolu, nebo jakéhokoliv jiného, libovolného, známého a vhodného chladivá. Lázeň je vybavena míchadlem, které zajišťuje stálé promíchávání chladivá a je spojeno se zařízením, které umožňuje ochlazení chladivá na kontrolovatelnou hodnotu.

4/ Pokud se nádoby nacházejí v chladivu, redukuje se teplota asi na hodnotu /0,5 °C/minutu. Jakmile teplota dosáhne -40 °C, ponoří se nádoby do kapalného dusíku a tam se uchovávají buď v samotné kapalině, nebo i v plynné atmosféře, která se nachází nad ní, přičemž by teplota neměla přestoupit -100 °C.

-29CZ 289790 B6

Příklad 16

Konzervace embryogenních buněk buněčných kultur Dactylis glomerata 1. za chladu

A/ 1/ Suspenzní kultura buněk Dactylis glomerata L. se přenese po 2 až 10 dnech po založení následné kultury na led a chladí se. Roztok prostředku chránícího proti zmrznutí se obvykle rovněž chladu na ledu. Prostředek chránící proti zmrznutí sestává z 1 M glycerinu, 1 M 1-prolinu, 2 M dimethylsulfoxidu /DMSO/ ve vodě, pH 5,6. Roztok chránící před zmrznutím se připravuje před každým použitím čerstvý /směs glycerinu, prolinu a vody se může uchovávat hluboko zmrazená/.

2. Prostředek chránící proti zmrznutí se přidává po dobu 5 minut k suspenzi. Buňky zůstanou potom za stálého chlazení ledem jednu hodinu v chladivu. během této doby nebo po oplynutí této doby se odeberou alikvotní části, rozdělí se do nádob a ponechají se na ledu. Nádoby se potom dále zpracovávají jak to bylo předtím popsáno v příkladu 15 pro kalus.

B/ Konzervace za chladu se provádí podle popisu který je uveden v příkladu 16 a/, stou výjimkou, že chladivo ve způsobovém kroku /1/ sestává z 1 M glycerinu, 1 M sacharózy a 2 M DMSO ve vodě, pH 5,6.

Příklad 17

Zpětné získání kultur schopných růstu z materiálu Dactylis glomerata L., konzervovaného za chladu

A/ 1. Obsah nádoby zpracovaný podle příkladu 15 se vyjme spolu s nádobou z kapalného dusíku.

2. Obsah nádoby se nechá roztát, tím že se nechá stát při teplotě místnosti, až veškeiý led roztaje.

3. Obsah nádoby se rozdělí na SH-0 kultivačním médiu zpevněném Gel Rite® nebo agarem. Přitom se zpravidla nyní rozdělí po 0,5 ml roztálého materiálu na jednu Petriho misku /10 cm průměr/, která obsahuje 30 ml až 50 ml kultivačního média. Pevná média se buď nalijí na šikmý agar, nebo se i nalijí do vyhloubení na obvodě, aby se umožnil odtok eventuálně ještě zbylého prostředku chránícího před zmrznutím od buněk.

4. Materiál se inkubuje na médiu při teplotě 27 °C ve tmě. Růst začne po 1 až 4 týdnech. Potom se z tohoto kalusu, jak to bylo již dříve popsáno pro normální kalus, založí následné kultury.

B/ Zpětné získání kultur schopných růstu z materiálu Dactylis glomerata L. konzervovaného za chladu se provádí podle popisu v příkladu 17/A/. Roztáni nádob při způsobovém kroku /2/ probíhá v tomto případě ale rychleji, tím že se nádoba vloží do vodní lázně asi 40 °C teplé a tam ponechá dokud veškerý led neroztaje.

Příklad 18

Konzervace Zea myas kalusu /kalusu kukuřice/ za chladu

Konzervace aktivně rostoucího kalusu Zea mays za chladu se provádí podle popisu uvedeného pro Dactylis glomerata L. v příkladu 15.

-30CZ 289790 B6

Příklad 19

Konzervace embryogenních buněk suspenzních kultur Zea mays za chladu

Konzervace embryogenních buněk suspenzních kultur Zea mays za chladu se provádí podle popisu pro Dactylis glomerata uvedeného v příkladech 16 A/ a 16 B/.

Příklad 20

Zpětné získání růstu schopných kultur z materiálu Zea mays konzervovaného za chladu se provádí podle popisu uvedeného pro Dactylis glomerata L. v příkladech 17 A/ a 17 B/.

Seznam literatury

1. Abdullah, R., et al., Bio/Technology, 4/1986/ 1 087-1 090;

2. Ábel, P. P., et al., Science, 233 -L986/738;

3. Adams, T. L. et al., Plant Cell Reports, 2 /1983/ 165-168;

4. Ahloowalia, B. S., Crop Science, 15 /1975/ 449-452;

5. Ahloowalia, B. S., Handbook of Plant Cell Culture, Ammirato, et al. /eds/ Macmillan NY, /1984/91-125;

6. Bartoň, K. A., et al., Plant Physiol., 85 /1987/ 1 103-1 109;

7. Birk, Y., et al., Biochim. Biophys. Acta, 67 /1983/ 326-328;

8. Bright, S. W. J. and Johnes, M. G. K. „Cereal Tissue and Cell Culture“ /1985/, 204-230, Nijoff, M/Junk, W. Dr. Dordrecht;

9. Brown, W. V., Phytomorphology, 10 /1960/ 215-223;

10. Cocking, E. C., and Davey, M. R., Science, 236/1987/ 1 259-1 262;

11. Fromm, Μ. E., et al., Nátuře, 319 /1986/ 791-793;

12. Gamborg, O. et al., Exp. Cell Res. 50, /1968/ 151-158;

13. George, E. F., et al. /eds/, Exgetics Ltd., Edington, Westbury, Wiltshire, England /1987/;

14. Gray, D. J., et al., Plant Cell Tissue Organ cult., 4 /1985/ 123-133;

15. Gritz L. and Davis, J., Gene, 25/1983/ 179-188;

16. Guiseley and Renn, „The Agarose Monograph“, Marině Colloids Division, FMC Corp. /1975/;

17. Hammond et al., J. Biol. Chem., 259 /1984/ 9 883-9 890;

18. Hanning, G. E., et al., Theor. Appl. Genet. 63/1982/ 155-159;

19. Heide, Physiol. Plantarum, 70 /1987/ 523-529;

20. Herrere-Estrella L., et al., Nátuře, 310 /1984/115

21. Hilder, V. A., et al., Nátuře, 330 /1987/ 160-163;

22. Howard, et al., Planta, 170 /1987/ 535;

23. Itakura, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 97 /1975/ 7 327;

24. Kao, K. N., et al., Planta, 126 /1975/105-110;

25. Kasperbauer, M. J., et al., Crop Science 19 /1979/ 457-460;

26. Krans, J. V., et al., Crop Science, 22 /1982/ 1 193-1 197;

27. Lipke, H. et al., J. Agr. Food Chem., 2 /1954/ 410-414;

28. Lo, P. F., et al., Crop Science, 20 /1980/ 363-367;

29. Loerz, H. et al., Mol. Gen. Genet.. 199/1985/ 178-182;

30. Lu, Ch„ et al., Z. Pflanzenphvsiol. 104/1981/311-318;

31. Luehrs, R., and Loerz, H. Theor. Appl. Genet. 75/1987/ 16-25;

32. Maniatis et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Habor Laboratory /1982/;

33. Mettler, I. J., British Patent Application GB-2,140.822;

34. Morelli, et al., Nátuře, 315 /1985/ 200;

35. Murashire, T. et al., Physiol. Plant., /1962/ 473-497;

-31 CZ 289790 B6

36. Negrutiu, I. et al., Plant Mol. Biology, 8 /1987/ 363-373;

37. Oděli, J. T., et al., Nátuře. 313/1985/ 810;

38. Paszkowski, J., et al., The EMBO Jomal, 3 /1984/ 2 717-2 722;

39. Paszkowski, J., et al., European Patent Applikation EP 0,164 575;

40. Pennica, P. et al., Nátuře, 301 /1983/ 214;

41. Potrykus, I. et al., Theor. Appl. Genet·. 54 /1979/ 209-214;

42. Potrykus, I. et al., Mon. Gen. Geret., 199 /1985/ 183-188;

43. Randolph, L. F., J. Agric. Research. 53, /1936/ 881-916;

44. Rhodes, C. et al., Biotechnology, 6 /1988/ 56-60;

45. Roger and Bendich, Plant Mol. Biology, 5 /1985/ 69-76;

46. Rothstein, S. et al., Gene, 53 /1987/ 153-161;

47. Ryan, C. et al., Ann. Rev. Plant Physiol., 24 /1973/ 173-196;

48. Shillito, R. D., et al., Plant cell Reports, 2 /1983/ 244-247;

49. Shillito, R. D., et al., Bio/Technology, 3 /1985/ 1 099-1 103;

50. Shillito, R. D., et al., European Patent Applikation EP-0 129 688;

51. Shoffl, F. et al., Plant Cell Environ, cited in Willmetzer L., Trends in Genetics, 4,13 /1988/;

52. Skene, K. G. M., et al., Zeitschrift Pflanzenzuchtung, 90 /1983/ 130-135;

54. Stephien, P. et al., Gene, 24 /1983/ 281-297;

55. Schenk, R. U. and Hildebrandt, A. C., Can, J. Bot., 50 /1972/ 199-204;

56. Vaeck, M. et al., Nátuře, 328 /1987/ 33-37;

57. Vasil, V. et al., Z. Pflanzenphysiol., 111 /1983/ 233-239;

58. Wienand, U. et al., Mol. Gen. Genet., 182 /1981/ 440-444;

59. Withers, L. A., Plant Tissue Culture and its Agricultural Applikation;

60. Withers, L. A., and Alderson, P. G. /eds/, University Press, Cambridge, England /1986/ 261-276;

61. Yamaha, Y. et al., Plant Cell Reports, 5 /1986/ 85-88.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (33)

1. Embryogenní buněčná kultura pocházející z lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, ze které mohou být izolovány protoplasty, které regenerují buněčné stěny, dělí se a nakonec vytvářejí kalus schopný regenerace na úplnou rostlinu, přičemž tato embryogenní buněčná kultura je připravitelná tak, že:

a) izoluje se pletivo z vhodných částí rostlin podčeledi Pooideae,

b) pletivo se kultivuje v médiu schopném indukovat tvorbu embryogenního kalusu nebo embryí,

c) z kalusu nebo embryí se periodicky zakládají následné kultury přenesením malých klusterů buněk na Čerstvé médium, přičemž tyto buněčné klustery obsahují buňky bohaté na cytoplazmu a čerstvé médium je schopné udržet kontinuální proliferaci, a

d) po 0 až 500 přenosech se izoluje kluster embryogenních buněk mající velikost 150 až 2000 pm.

2. Embryogenní buněčná kultura podle nároku 1, kde regenerované rostliny jsou fertilní rostliny.

3. Embryogenní buněčná kultura podle nároku 1, kde rostliny podčeledi Pooideae jsou trávy nebo malozmné obilniny.

-32CZ 289790 B6

4. Embryogenní buněčná kultura podle nároku 3, kde trávy jsou vybrány ze skupiny obsahující rody Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus a Dactylis.

5. Embryogenní buněčná kultura podle nároku 3, kde malozmné obilniny jsou vybrány ze skupiny obsahující rody Avena, Triticum, Secale a Hordeum.

6. Způsob přípravy protoplastů schopných regenerace na celé rostliny vycházející z lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) izoluje se pletivo z vodných částí rostlin podčeledi Pooideae,

b) pletivo se kultivuje v médiu schopném idukovat tvorbu embryogenního kalusu nebo embryí,

c) z kalusu nebo embryí se periodicky zakládají následné kultury přenesením malých klusterů buněk na čerstvé médium, přičemž tyto buněčné klustery obsahují buňky bohaté na cytoplazmu a čerstvé médium je schopné udržet kontinuální proliferaci,

d) po 0 až 500 přenosech se izoluje kluster embryogenních buněk mající velikost 150 až 2 000 pm, a

e) pomocí vhodných enzymů se odstraní buněčné stěny a vzniklé protoplasty se izolují.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že protoplasty zPooideae jsou schopné regenerace na úplné fertilní rostliny.

8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že pletivo z kroku a) se izoluje z bazálních úseků mladých vnitřních listů, nezralých pohlavních embryí, nezralých květenství, zralých semen nebo pletiv klíčících rostlin podčeledi Pooideae.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že pletivo z kroku a) se izoluje z nejmladších, co nejvíce uvnitř rostoucích listů.

10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že izolace klusterů embryogenních buněk se provede po 0 až 100 přenosech.

11. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že izolace klusterů embryogenních buněk se provede po 3 až 50 přenosech.

12. Způsob přípravy buněčné kultury schopné regenerace na úplné rostliny odvozené z lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) izoluje se pletivo z vhodných částí rostlin podčeledi Pooideae,

b) pletivo se kultivuje v médiu schopném indukovat tvorbu embryogenního kalusu nebo embryí,

c) z kalusu nebo embryí se periodicky zakládají následné kultury přenesením malých klusterů buněk na čerstvé médium, přičemž tyto klustery obsahují buňky bohaté na cytoplazmu a čerstvé médium je schopné udržet kontinuální proliferaci,

d) po 0 až 500 přenosech se izoluje kluster embrygenních buněk mající velikost 150 až 2 000 pm,

e) pomocí vhodných enzymů se odstraní buněčné stěny a vzniklé protoplasty se izolují,

-33CZ 289790 B6

f) protoplasty z kroku e) nebo rostlinné buňky z kroku d) se kultivují ve vhodném médiu až do vytvoření buněčných kolonií,

g) buněčné kolonie nebo jejich části se kultivují ve vhodném médiu, které podporuje tvorbu buněčných kultur, a

h) výsledné buněčné kultury se izolují.

13. Způsob přípravy buněčné kultury podle nároku 12 schopné regenerace na úplné rostliny vycházející z lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) protoplasty nebo rostlinné buňky se kultivují ve vhodném médiu až do vytvoření buněčných kolonií po dobu dostatečnou k tomu, aby se podpořila tvorba buněčných kultur,

b) vzniklé buněčné kultury se izolují.

14. Způsob přípravy buněčné kultury podle nároků 12 nebo 13,vyznačující se tím, že buněčná kultura je schopná regenerace na úplné fertilní rostliny.

15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 12ažl 4, vyznačující se tím, že buněčná kultura je suspenzní kultura.

16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 12ažl 4, vyznačující se tím, že buněčná kultura je kalusová kultura.

17. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se tím, že krok a) se provádí v přítomnosti agarózy jakožto ztužovacího činidla.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že obsahuje zkapalnění nebo segmentaci média ztuženého agarózou z kroku a), přenesení kapalného nebo segmentového agarózového média do kapalného média a pokračování kultivace až do vzniku buněčných kolonií.

19. Způsob podle nároků 12 nebo 13, vyznačující se tím, že části buněčných kolonií z kroku b) jsou buňky uvolněné z kolonií.

20. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačující se tím, že protoplasty nebo buňky obsahují exogenní DNA integrovanou trvale do jejich genomu, přičemž DNA nemůže být integrována do jejich genomu přirozeným způsobem.

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že integrovaná exogenní DNA je exprimovatelná v rostlinných buňkách.

22. Způsob regenerace lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:

a) kultivují se buněčné kultury podle nároku 12 až do vývinu embiyí,

b) embrya se kultivují na médiu vhodném k indukci zrání a klíčení embryí, a

c) výsledné rostlinky se dále kultivují, dokud nejsou vyvinuty dostatečně k přesazení do půdy.

-34CZ 289790 B6

23. Způsob regenerace fertilních lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, vyznačující s e t í m, že obsahuje kroky, kdy:

a) kultivují se buněčné kultury podle nároku 12 až do vývinu embryí,

b) embrya se kultivují na médiu vhodném k indukci zrání a klíčení embryí,

c) výsledné rostlinky se dále kultivují, dokud nejsou vyvinuty dostatečně k přesazení do půdy,

d) semena se získají řízeným nebo volným opylením.

24. Způsob podle nároku 22 nebo 23, v y z n a č u j í c í se tí m, že rostlinné buňky tvořící kalus obsahují exogenní DNA trvale integrovanou do jejich genomu, přičemž DNA nemůže být integrována do jejich genomu přirozeným způsobem.

25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že integrovaná exogenní DNA je exprimovatelná v rostlinných buňkách.

26. Způsob přípravy transgenních lipnicovitých rostlin podčeledi Pooideae, vyznačující se t í m , že obsahuje kroky, kdy:

a) protoplasty podle nároku 6 se transformují exogenní DNA známými metodami transformace, přičemž DNA nemůže být integrována do jejich genomu přirozeným způsobem,

b) transformované protoplasty se kultivují podle nároku 12 nebo 13, a

c) úplné rostliny se regenerují podle nároku 22 nebo 23.

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že exogenní DNA obsahuje jeden nebo více chimérických genů, které poskytují transformovaným protoplastům a pletivům pocházejícím z protoplastů, a zejména pak rostlinám, výhodné vlastnosti.

28. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že DNA obsahuje nekódující DNA s regulační funkcí.

29. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že v kroku a) se užije pro transformaci protoplastů metoda přímého přenosu genu.

30. Lipnicovité rostliny z podčeledi Pooideae a jejich veškerý rozmnožovací materiál, přičemž rostliny jsou fertilní rostliny připravitelné regenerací z embryogenní buněčné kultury podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a jejich rozmnožovací materiál obsahuje exogenní DNA trvale integrovanou do jejich genomu, přičemž DNA je exprimovatelná v rostlinách nebo rostlinných buňkách a nemůže být integrována do jejich genomu přirozeným způsobem.

31. Rozmnožovací materiál podle nároku 30, který obsahuje rostlinný materiál schopný pohlavního nebo nepohlavního rozmnožování a sice in vitro nebo in vivo.

-35CZ 289790 B6

32. Rozmnožovací materiál podle nároku 30, který obsahuje protoplasty, buňky, kalusy, pletivo,, orgány, zygoty, embrya nebo semena, která pocházejí z transgenních rostlin podčeledi Pooideae podle nároku 30.

33. Potomstvo rostlin podle nároku 30, jejichž genom obsahuje exogenní DNA.