PT89914B - Regeneracao de plantas gramineas da subfamilia pooideae a partir de protoplastos - Google Patents

Description

De entre as subfamilias das Gramineae a subfamilia Pooideae é um grupo de plantas da mais alta importância económica que inclui, por exemplo, os dois grupos estreitamente relacionados constituídos pelas ervas e pelos cereais de grão pequeno.

Interessante o facto de estas plantas Pooideae serem também as mais dificâs de manifestar cientificamente. Até agora, não é conhecido nunhum método aplicável na generalidade para a regeneração de plantas Pooideae, ou de plantas Pooideae férteis, ou de plantas Pooideae que contenham DNA exógeno estávelmente incorporado a partir de protoplastos, apesar da regeneração da planta a partir de protoplastos em cultura ser essencial para a aplicação de hibridização somática e para a produção de plantas transgénicas via transferência directa de genes. A situação presente na arte da transferência de genes para os cereais foi revista recentemente por Cocking and Davey, (1987). As fontes para as culturas de cereal, os protoplastos, o isolamento de protoplastos de cereal e as suas propriedades são relatadas, por exemplo, no seguinte livro: / Cereal Tissue and Cell Culture , Bright, S.W.J. and Jones, M.G.K., (eds) (1985) Nijhoff, M., Junk, W., Dordrecht7.

Tem sido já alcançado uma transformação estável nas Gramineae por captação de DNA estimulado químico e electricamente para o interior de protoplastos (transferência directa de genes) /^_Potrykus et al., 1985²; Loerz et al. , 1985; Fromm et al., 19867, mas a regeneração de plantas não foi possivel a partir das linhas de procedimento usadas nestes estudos.

Até agora, as plantas gramineas apenas têm sido regeneradas com sucesso a partir de protoplastos que não sejam da subfamilia Pooideae: Por exemplo, Abdullah et al. (1986), relatam a eficiente regeneração de plantas a partir de protoplastos do arroz (subfamilia: Oryzzoideae) através de em-5-

briogénese somática. Yameda et al., (1986) também descrevem a regeneração da planta do arroz a partir de calli derivados de protoplasto. Também Rhodes et al., (1988) descrevem a regeneração de plantas não férteis de milho. Cocking e Davey (1987) discutem o estado presente da arte na transferência de genes em cereais

A regeneração de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae a partir de culturas de tecidos é conhecida. Hanning et al. , (1982) descreveu a formação de plântulas e embriões a partir de callus derivados de segmentos da folha de Dactylis glomerata L..

Mais alguns exemplos de regeneração de plantas Pooideae a partir de células de cultura são relatadas nos artigos seguintes:

Lolium rigidum: Skene et al, 1983.

Lolium perenne, Lolium multiflorum: Ahloowalia, 1975.

Lolium multiflorum, Festuca arundinacea: Kasperbauer et al., 1979 .

Alopecurus arundinaceus, Agropyron crystatum, Stipa viridula, Bromus inermis , Agropyron smithii: Lo et al, 1980,

Agrostis palustris: Krans et al., 1982.

O estado da cultura de tecidos em ervas forrageiras também tem sido por Ahloowalia (1984).

Contudo,estas plantas Pooideae não foram regeneradas nestes casos a partir de material de partida descrito no presente pedido de Patente, mas a partir de outros tipos de culturas de células. Não tem sido demonstrado nos exemplos acima mencionados que a regeneração tivesse sido de-novo por via da embriogénese somática. A referência acima citada não compreendeu o isolamento e a cultura de protoplastos ou a regeneração de plantas a partir de protoplastos.

-6Não obstante haver um grande interesse na transformação genética e na regeneração de plantas gramíneas na subfamilia Pooideae, até à data não houve nenhuma descrição de um método in-vitro com sucesso que possa conduzir a planta ou plantas férteis regeneradas, facultativamente transformadas, derivadas de protoplastos (Cocking e Davey, 1987).

Até agora todas as investigações e todos os esforços feitos neste sentido falharam, na medida em que resultaram em embriões ou quando muito em plântulas não viáveis que morreram num estádio precoce e por conseguinte não puderam ser transferidas com sucesso para o solo (Ahloowalia, 1984) .

Não tem aparecido nenhuma descrição de um processo para a produção de protoplastos Pooideae capazes de passar por uma diferenciação para plantas e de preferência para plantas férteis completas, e muito menos da regeneração de plantas Pooideae a partir de protoplastos ou de calli derivados de protoplastos.

Estes ou outros objectivos têm sido alcançados de acordo com o presente invento que proporciona um método para a produção de protoplastos que podem formar colónias de células e de calli. Os protoplastos podem, se for desejado, ser transformados, e os calli resultantes são capazes de ser regenerados para plantas Pooideae. 0 processo para a produção de protoplastos capazes de divisão e de formação de callus, que em seguida podem ser regenerados para plantas, requer como material de partida novas culturas de células embrionárias (culturas em suspensão ou culturas de calli) ou embriões. Estas culturas de células embrionárias, embriões e métodos para a suaprodução e identificação serão descritos, e são considerados parte do invento. O callus embrionário a partir do qual as suspensões são derivadas pode também ser usa do com um material de partida para protoplastos. Tais callus suspensões, embriões e métodos para a sua produção e identificação serão descritos e são também considerados parte do presente invento.

Estas culturas embrionárias são a fonte de protoplastos capazes de serem transformados com DNA exógeno, e da divisão e formação de callus, que podem ser regenerados para plantas completas, incluindo plantas completas férteis que podem crescer no solo.

Não se podia predizer a partir da arte precedente à época em que este invento foi feito, que plantas gramíneas em particular plantas gramíneas férteis, da subfamilia Pooideae pudessem ser regeneradas a partir de protoplastos, a partir de células derivadas de protoplastos ou de calli derivados de protoplastos.

De igual modo, muito pouco ou nada predictível era que protoplastos Pooideae contendo estávelmente incorporado nos seus genomas DNA exógeno pudessem também ser regenerados para plantas transgénicas, em particular para plan tas transgénicas férteis.

Este invento é, por conseguinte, primáriamente dirigido a culturas de células embrionárias (culturas em suspensão ou culturas de calliZ derivadas a partir de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae a partir das quais podem ser isolados protoplastos, em que os protoplastos regeneram paredes de células, dividem-se e formam callus capaz de ser regenerado em plantas, incluindo plantas férteis.

invento também se refere a protoplastos Pooideae e às células de planta resultante (após regeneração das paredes de células) que podem ser regeraradas em plantas que são de preferência férteis, preferivelmente aos protoplastos derivados de culturas de células ou de suspensões de células embrionárias.

Este invento também se refere a células de planta, suspensões de células embrionárias, embriões, plântulas e plantas derivadas dos referidos protoplastos.

Outrossim, este invento refere-se às plantas Pooideae regeneradas e aos seus propágulos, em especial às derivadas de protoplastos ou de células de planta que contêm estávelmente incorporado no seu genoma DNA exógeno exprimivel em plantas. Os propágulos incluem qualquer material de planta que possa ser sexuado ou assexuadamente propagado ou propagado in-vivo ou in-vitro. Entre este material, sao preferidos protoplastos, células, calli, tecidos, 'orgãos , zigotos, embriões, pólen ou sementes obtidas a partir de plantas Pooideae transgénicas. A progénie das referidas plantas Pooideae, incluindo mutantes e suas variantes, incluindo os de plantas obtidas a partir de fusão de células somáticas, modificação genética ou selecção de mutantes, são objectivos adicionais deste invento.

Este invento também se refere a um método de produção de protoplastos Pooideae e de células de plantas Pooideae que podem ser regeneradas para plantas, particularmente para plantas férteis, bem como a um método de produção de calli Pooideae derivados dos referidos protoplastos õu de células de planta e que são capazes de regeneração para plantas, de preferência para plantas férteis. Além disso, refere-se a um método de regeneração de plantas Pooideae, a partir destes calli. Estes métodos são descritos em detalhe de aqui em diante.

Estes e demais objectivos do presente invento tornar-se-ão disponíveis a partir da descrição detalhada que se segue.

-9DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Mostra colónias derivadas de protoplastos de Dactylis glomerata L. a õrescer num rosário de agarose suspenso num meio líquido.

Figura 2: Mostra uma plântula a originar-se a partir de callus derivados de protoplastos de Dactylis glomerata L. crescendo num meio SH-O.

Figura 3: Mostra uma plântula enraizada a partir de callus derivados de protoplastos de Dactylis glomerata L. a crescer num meio de SH-0 num recipiente.

Figura 4: Mostra uma planta de Dactylis glomerata L. regenerada a partir de protoplastos (à esquerda) conjuntamente com uma planta Dactylis glomerata L. do tipo silvestre (à direita).

Figura 5: Mostra o plasmideo pCIB709 que pode ser usado para a transformação de protoplastos de Dactylis glomerata L. para conferir resistência à higromicina. 0 plasmideo pCIB709 tem sido depositado de acordo com as exigências do Budapeste Treaty com o American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, Maryland, USA e com o número de acesso ATCC 40428. A data de depósito é de 12 de Fevereiro de 1988.

Legenda: 35S prom: região promotora 35S.

Hygro-gene: gene estrutural da hidromicina fosfotranferase (APH tipo IV)

35S term: região de CaMV que contém o local de 3' poliadenilação do 35S transcrito de CaMV.

Figura 6: Mostra a análise Meridional (Southern) do DNA de calli Dactylis glomerata L. diferente recuperado após trnasformação de protoplastos com pCIB709. O

-10DNA foi soudado com o fragmento Xbal-SstI de CIB709.

Pistas 1,2: 103 e 23 pCIB709 cortado com endonuclease BamHI de restrição.

Pistas 4-8: DNA de culturas de calli de Dactylis glomerata L.

recuperada após transformação de protoplastos com pCIB709, cortado com BamHI.

Pistas 9,17: DNA de callus Dactylis glomerata L. não transformado de controlo derivado de protoplastos com BamHI.

Pistas 10-13: DNA de culturas de callus Dactylis glomerata L.

recuperado após transformação de protoplastos com pCIB709, cortado com BamHI.

Pista 14: Dna de cultura de callus Dactylis glomerata L. recuperado após transformação de protoplastos com pCIB709, cortado com BamHI.

Pistas 15,16: DNA de culturas de callus Dactylis glomerata L.

recuperado após transformação de protoplastos com pCIB709, cortado com BamHI.

Pista 4: está vazia.

O DNA nas pistas 6, 10,12 e 15 mostra a presença de DNA estranho no genoma das células Dactylis glomerata L. como é evidenciado pelo escurecimento do filme. O fragmento 1063bp esperado da digestão de BamHI do gene higromicina integrado de pCIB709 (nucléotidos 583-1646 de pCIB709) é indicado pela seta.

DEFINIÇÕES

Em ordem a proporcionar uma compreensão clara e consistente das especificações e das reivindicações, incluindo o âmbito a dar a tais termos, são proporcionadas as seguintes definições:

Célula de planta: A unidade estrutural e fisiológica de plantas, que consiste num protoplasto e na parede da célula.

Tecido de planta: Um grupo de células de planta organizadas numa unidade estrutural e funcional.

Orgão de planta: Uma parte distinta e visivelmente diferenciada de uma planta tal como raiz, caule, folha, botão de flor, ou embriões. Um orgão de planta pode consistir de diferentes tipos de células de planta ou de tecidos de planta.

Protoplasto: Célula de planta isolada sem uma parede de célula .

Cultura de células: Proliferação de uma massa de células num estádio indiferenciado ou parcialmente diferenciado .

Embrião: Um momento inicial de estádio de desenvolvimento de uma planta, quer derivado de um zigoto (embriões sexual), quer de uma célula somática embrionária (embrião somático), com estádios de reconhecível morfologia, estrutura ecrganizaçao celular compreendendo estádios celular a globular a cotiledonário. /~0 desenvolvimento do embrião do milho é, por exemplo, descrito em Randolph (1936); o desenvolvimento do embrião da erva é, por exemplo, descrito em Brown (1960) 7.

-12Agrupamento ou aglomeração de células (cell cluster): um grupo de células interconectadas presas umas às outras; usualmente derivado de uma ou de várias células ancestrais ou de protoplastos por divisão celular.

Plântula: Uma estrutura multicelular composta por um gomo ou rebento e de uma raiz na forma de uma pequena planta .

Dicamba: ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzóico.

MES: ácido 2-/ N-mor£olino7etano-sulfónico

2,4-D: ácido 2,4-diclorof ercxi-acético .

Picloram: ácido 4-amino-3,6,6-tricloropicolínico.

Tris-HCl

Hidrocloreto de alfa,alfa,alfa-tris(hidroximetil)metilamina.

EDTA: ácido 1-etilenodiamina Ν,Ν,Ν,Ν'- tetra-acético.

PEG: Polietileno glicol.

Agarose: A preparação e a purificação de agarose são descritas, por exemplo, por Guiseley e Renn, (1975). A agarose é um dos constituintes de ágar. O ágar disponível comercialmente consiste de uma mistura de agarose natural e agaropectina iónica com um grande número de grupos laterais. A agarose comercial é normalmente obtida a partir do ágar por métodos convencionais. Usualmente um certo número de cadeias laterais permanece intacta e determina as propriedades físico-químicas da agarose, tal como a forração de gel e a temperatura de fusão. A agarose de fusão baixa em especial a agarose SeaPlaque , é um agente de solidificação preferido entre os processos descri-13-

tos de aqui em diante.

Meio	SH-O:
GelRite®:
meio	SH-30:
Meio	SH-45:
Meio	KM-8P:

Meio de Schenk e Hildebrandt (1972); sem hormonas. (0 meio SH pode ser líquido ou solidificado com ágar a 0,8% (p/v) oucom GelRite® a0,5% (p/v)). O meio é normalmente esterilizado pelo calor ou em autoclasse a 121°C e 151 lb/in^ de pressão durante cerca de 15 a 20 minutos como é conhecido na arte.

GelRite Gellan Gum, Scott Laboratories, Inc., FisKersville, RI 02823.

meio	SH-0	que	contém	Dicamba	30 ^iM.
meio	SH-0	que	contém	Dicamba	45 ^iM.
Meio	8p de	Kao	, (1975).

Este meio pode ser líquido ou solidificado com ágar, agarose ou GelRite^, e pode igualmente bem ser preparado ou usado sem ácido ascórbico, vitamina D, e vitamina A. Os componentes do meio exceptuando o agente de solidificação são normalmente esterilizados por filtração através de um filtro de 0,2 ^im.

Meio RY-2: Meio de Yamada et al., (1986).

Meio OMS: Meio de Murashige e Skoog (1962).

O meio pode ser solidificado, por exemplo, com água a 0,8% (r?

(p/v) ou agararose ou com GelRite¹ a 0,5% (p/v). Para os propósitos descritos neste pedido de Patente, este meio pode também ser preparado de modo tal que contenha a composição em vitaminas do meio B5 de Gamborg et al., (1968).

Celulose RS:

Celulose RS, Yakult Honsha Co. Ltd., 1.1.19 Higashi-Shinbashi, Minato-Ku, Tokyo 105, Japão.

Pectoliase

Y-2

Seishin Pharmaceutical Co. Ltd., 4-13 Koami-cho, Nihonbashi, Tóquio, Japão.

Parafilnru Filme de laboratório Parafilme -American Can Co., Greenwich, CT, 06830, USA.

/&Λ

Filtro Nalgene . Nalge Co., Division of Sybron Corp. Rochester, New York, 14602, USA.

BglII: Enzima de restrição BglII; New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA, 01915, USA, ou qualquer outro fornecedor comercial.

BamHI: Enzima de restrição BamHI; New England Biolabs, 32 Tbzer Road, Beverly, MA, 01915, USA, ou qualquer outro fornecedor comercial

Hydrolisato de caseína: Casein Hydrolysate-Enzimatic Hydrolysate a·partir de leite bovino, Type I, Sigma Co. PO. Box 14508, St. Louis, MO 63178, USA.

Higromicina B: Citotoxima: Higromicina B purificada; Cat. N° 400050; Calbiochem Behring Diagnostica, La Jolla, CA 92037, USA, Lote N° 702296.

Gene Screen Plus®: Cat. Νθ NEF 976, NEN Research Products, 549 Albany St., Boston, MA 02118, USA.

Tampão TBE: Tampão tris-borato-tampão comum para electroforese, ver Maniatis et al, (1982).

» (ÍÒ

Coluna rotativa: Coluna pré-embalada Sephadex^ G25 , Νθ . Cat.

100402 , Boehringer Mannheim Biochemicals, Piscataway, NJ, USA.

SDS: Dodecil-sulfato de sódio.

SSC: NaCl 1,54 mM; citrato de Na 0,154 mM; como descrito em

Maniatis et al. , (1982).

CETAB: Brometo de hexadecil-trimetilamónio.

-15Conjunto iniciador aleatório IBI: International Biotechnologies Inc. , PO. Box 1565, New Hanover, CT 07606,

USA (N° Catálogo 77800; Lote NS F630-01).

Surpreendentemente foi agora encontrado para plantas gramíneas da subfamilia Pooideae podem ser regeneradas a partir de um tipo especifico de protoplastos e a partir de células ou callus derivados destes protoplastos.

Esta regeneração de plantas, incluindo plantas férteis também é possível se os protoplastos contiverem DNA exógeno, de preferência DNA exógeno que está estávelmente incorporado no genoma da planta e capaz de ser exprimível em plantas.

quaisquer plantas gramíneas, da subfamilia Pooideae, podem ser usadas no presente invento. São contudo preferidas plantas Pooideae que pertencem às ervas, por exemplo, cada género escolhido de entre o grupo constituído por Poa Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phleum, Alopecurus e Dactylis. O meio preferido é Dactylis. Também preferidas são as plantas, Pooideae que pertencem aos cereais de grão pequeno, por exemplo, aos géneros escolhidos do grupo constituído por Avena (aveias), Triticum (trigo), Secale (centeio) e Hordeum (cevada).

O tipo especifico de plotoplastos Povideae que dividem e formam culturas de células capazes de serem regeneradas para plantas originam-se a partir de culturas de células, preferivelmente de culturas de células embrionárias.

As culturas de células embrionárias são de preferência culturas de suspensões embrionárias ou de callus embrionário. As culturas de células podem ser derivadas de partes adequadas de plantas Pooideae. As partes adequadas das plantas incluem mas não limitadas às partes básicas das folhas interiores jovens, embriões sexuais imaturos, inflorescênciais imaturos, sementes maduras ou tecidos de sementes de plantas Pooideae.

-16Passo A: Preparação de suspensões embrionárias a partir de tecidos de planta

Inicia-se um callus embrionário a partir de uma parte adequada de uma planta Pooideae, tipicamente a partir de uma porção basal de folhas jovens, mais preferivelmente a partir de folhas jovens interiores de uma planta Pooideae. Isto pode ser levado a cabo como se descreve para Dactylis glomerata L. por Hanning et al., (1982) mas também pode ser usado para todas as outras plantas Pooideae. Esta publicação é incorporada incluso por referência.

As folhas são, por exemplo, cortadas em pequenas secções ou segmentos de cerca de 1 mm a 5 mm de comprimento ou diâmetro. A forma e tamanho destes pedaços não é critica. Estes segmentos são cultivados num meio de manutenção e indução de callus adequado e cultivadas até se desenvolverem estruturas embrionárias e/ou callus. Um meio adequado é, por exemplo o meio SH / Schenk e Hildebrandt, 19727 contendo dicamba 30 ^iM e agarose ou ágar a 0,8% (p/v) como um agente gelificante. De entre outros meios adequados estão os descritos em Geoge et al., (1987). Callus e/ou estruturas embrionárias aparecem normalmente entre 2 a 6 semanas apés o início da cultura. A iniciação e manutenção do coelho pode ser levada a cabo à luz ou de preferência no escuro e a temperaturas entre os OSC e 50SC, de preferência 20QC e 32SC, mais preferivelmente entre os 25SC e 28SC. Pode também ser preparado callus embrionário por outro método conhecido na arte, tal como aqueles que são para a cevada descritos por Luhrs e Lors (1987) e estão incluidos nas referências inclusas. Estes métodos podem ser usados para outras Pooideae e são aqui indicadas por referência.

As culturas de suspensões embrionárias são iniciadas colocando fragmentos frescos de callus embrionários num meio líquido embrionário, por exemplo, 0,5 g de callus em 50 ml de um meio líquido como descrito por Gray et al.,

-17(1985), contendo dicamba 45 ^jM e 4 g/litro de hidrolisato de caseína. De entre outros meios adequados estão os descritos em Georg et al., (1987). As culturas em suspensão vão crescendo a temperaturas entre 10°C e 40°C, de preferência entre 20QC e 32°C, mais preferivelmente entre 25°C e 302C. Uma sucessão de fases luminosas e escuras durante o período de cultura pode ser vantajosa. De preferência a suspensão vai crescendo durante um período de luz de 5 a 20 horas, de preferência 16 horas, seguido por um período escuro de 5 a 20 horas, de preferência 8 horas. A intencidade da luz situa-se tipi2 2 camente entre 0,l^jE/m s e 100^iE/m s (E=Einstein; m=metro;

S = segundo), de preferência entre 30^iE/m²s e 80^iE/m²s. A agitação da suspensão durante o período de cultura é também vantajosa. A agitação pode ser levada a cabo, por exemplo, num agitador/batedor giratório a cerca de 100 rpm a 150 rpm em frascos Delong selados com um filtro plástico gue seja permeível à luz e gases ou gualquer outro processo de encerramento adequado. Aproximadamente após três a cinco semanas os tufos celulares maiores são deixados assentar durante cerca de 30 segundos e o meio sobrenadanadante que contém apenas pequenos agrupamentos de células é removido para um meio fresco para iniciar novas culturas.

Este procedimento pode ser repetido periodicamente, de preferência todas as 3 a 4 semanas, usando as culturas melhor sucedidas julgadas pela qualidade e pelo menor tamanho dos tufos. Após 4 a 20 transferências, usualmente após 6 a 8 transferências, as suspensões estão no essencial livres de células não embrionárias e a maioria dos agrupamentos de células embrionárias têm tipicamente um tamanho de cerca de 100 pm a 2.000 ^im.

No processo para a obtenção de suspensões embrionárias é preferido que as suspensões consistam predominantemente de pequenas massas pré-embrionárias. Por subcultura de apenas a parte superior da suspensão após se deixar o material maior assentar é possível enriquecer significativamente a proporção de massas pré-embrionárias.

-18Assim, um objectivo do presente invento é a cultura de células embrionárias, a cultura de suspensões ou a cultura de callus (calli), derivados de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae a partir das quais podem ser isolados protoplastos, em que os protoplastos regeneram paredes celulares, dividem e formam callus capaz de ser regenerado para plantas e de preferência para plantas férteis.

As culturas de células embrionárias (cul turas em suspensão e cultura de callus) derivadas de ervas, em especial das seleccionadas de entre os géneros Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agrostis, Phlem, Alopecurus e Dactylis, são incorporações preferidas do presente invento. Principalmente preferidas são as suspensões embrionárias de Dactylis glomerata L..

Incorporações adicionais preferidas do presente invento constam de culturas de células embrionárias (culturas em suspensão e culturas de callus) derivadas de cereais de grão pequeno, em especial dos seleccionados de entre os géneros Avena, Triticum, Secale e Hordeum.

Um objectivo adicional do presente inven to é o callus embrionário derivado de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae a partir do qual podem ser isolados protoplastos, em que os protoplastos regeneram paredes de células, dividem-se e formam callus capaz de ser regenerados em plantas e de preferência em plantas férteis.

Callus embrionário derivado de ervas, em especial das seleccionadas de entre os géneros Poa, Festuca, Lolium, Promus, Trisetum, Agrostis, Phlem, Alopecurus e Dacty lis são incorporações prefe-idas do presente invento. Principalmente preferido é o callus embrionário de Dactylis glomera ta L. .

Uma incorporação adicional preferida do

-19presente invento consta de callus embrionário derivado de cereais de grão pequeno, em especial dos seleccionados de entre os géneros Avena, Triticum, Secale e Hordeum.

Um objectivo adicional do presente invento são plantas gramíneas de preferência plantas gramíneas férteis da subfamilia Pooideae e seus propágulos que são regenerados a partir de protoplastos ou de células de planta, que são derivados da mencionada cultura de células embrionárias .

Métodos para a crioconservação de culturas de células (culturas em suspensão e culturas de callus) de todas as plantas gramíneas

Alguns tecidos de planta podem ser crioconservados por métodos conhecidos na arte que são, por exemplo, descritos por Withers, (1986) e na referência aqui citada. Contudo, estes métodos não são em igual aplicáveis, em especial não são aplicáveis à crioconservação de culturas de células embrionárias (culturas em suspensão e culturas de callus) de plantas gramíneas.

foi agora surpreendentemente encontrado no âmbito do presente invento que culturas de células embrionárias incluindo culturas em suspensão e culturas de callus de todas as plantas gramíneas podem ser conservadas num estado suspenso por conservação por congelação (crioconservação) a baixas temperaturas.

Este método para a crioconservação de culturas de células embrionárias, incluindo culturas em suspensão e culturas de callus de plantas gramíneas compreende:

(a) a dispersão activa de callus ou de células de culturas em suspensão em crescimento num meio de cultura liquido adequado ,

(b) o arrefecimento desta cultura para temperatura de gelo (cerca de 0°C a 5°C), (c) a mistura, a cerca da mesma temperatura, da dita cultura pré-arrefecida com uma solução aquosa crioprotectora adequada , (d) o arrefecimento da mistura resultante a uma velocidade de de cerca de 0,0lsc a cerca de 20SC por minuto, de preferência cerca de 0,2°C a cerca de 2°C por minuto, mais preferivelmente 0,55C a cerca de 1QC por minuto, para uma temperatura entre cerca de -20QC e cerca de -60SC, de preferência entre cerca de -35SC e cerca de -50SC, mais preferivelmente cerca de -382C a cerca de -44QC, (e) o congelamento-choque da mistura pré-arrefecida em azoto líquido ou ar líquido, e (f) o arrefecimento da mistura congelada a uma temperatura d inferior a -100QC, de preferência à temperatura do azoto líquido ou ar líquido.

Este método para a crioconservaçâo de cultura de células embrionárias (culturas em suspensão e culturas de callus) é em geral aplicável para todas as plantas gramíneas. É entendido que neste contexto o termo plantas gramíneas inclui mas não se limita a Bambusoideae ( por exemplo, Bambu), a Andropogonideae (por exemplo, Saccharum, Sorghum e Zea), a Arundineae (por exemplo, Phragmites), a Oryzoideae (por exemplo, Oryza), a Penicoideae (por exemplo, Panicum, Pennisetum e Setaria) e a Pooideae (por exemplo, ervas que incluem Poa, Festuca, Lolium, Bromus , Trisetum, Agrostis, Phlem, Dactylis e Alopecurus, ou cereais de grão pequeno incluindo Avena, Triticum, Secale e Hordeum).

Um grupo alvo preferido de entre as plantas gramíneas é o acima caracterizado grupo de planta Pooideae

que consta das ervas e dos cereais de grão pequeno.

Tipicamente este inventivo método é levado a cabo como segue:

Uma quantidade adequada de callus em crescimento activo ou de células de cultura em suspensão (normalmente de 1 a 40 dias, de preferência 2 a 10 dias após a subcultura) é dispersada num meio líquido adequado. Tal meio liquido adequado inclui mas não é limitado a meios SH-O, SH-30 ou SH-45, soluções OMS, KM-8p, RY-2, mannitol, sacarose, ou outro açúcar ou açúcar-álcool, uma solução de um aminoácido (por exemplo, L-prolina) ou mesmo água. Preferível é um meio adequado para o crescimento das células, ou uma solução de um açúcar ou de açúcar-álcool em água. Tipicamente, 0,01g a 0,lg de callus é dispersado em cada ml de meio líquido e em seguida arrefecido em gelo.

As soluções crioconservantes adequadas, são tipicamente a mistura de componentes osmoticamente activos e DMSO em água. Quando eles são adicionados à dispersão pré-arrefecida do passo (b) elas normalmente são também pré-arrefecidas em gelo, mas também podem ter temperaturas mais altas até cerca de temperatura ambiente. A temperatura de solução crioconservante não é crítica.

As soluções crioconservantes representativas incluem mas não estão limitadas a soluções que compreendem glicerol 0,5M a 2M, L-prolina 0,5M a 2M, dimetilsulfóxido (DMSO) 0,5M a 4M em água, pH 5,6; ou glicerol 0,5 a 2M, sacarose 0,5M a 2M e dimetilsulfóxido 0,5M a 4M em água a pH 5 a 7. Outros componentes adequados para soluçoes crioconservantes incluem açúcares e açúcar-álcoois, aminoácidos, e polímeros tal como PEG. As soluções crioconservantes que contêm DMSO são de preferência preparadas de fresco antes de cada uso ou podem ser armazenadas congeladas. Outras soluções crioconservantes podem ser preparadas algum tempo antes de usar, mas

são de preferência preparadas de fresco ou congeladas.

Uma solução crioconservante é tipicamente adicionada à solução que contém callus ou células de cultura em suspensão dispersos durante um periodo de 1 segundo a 4 semanas, de preferência, 1 sefundo a 1 dias, mais preferivelmente 1 segundo a 1 hora. As células sao expostas à solução crioconservante durante um periodo adequado de tempo sobre gelo, de preferência 1 minuto a 2 dias, com maior preferência 10 minutos a 6 horas, mais preferivelmente 30 minutos a 2 horas. Durante ou depois deste tempo, são distribuídas partes alíquotas por frascos de crioconservação estéril adequados ou qualquer outro recipiente adequado e usualmente guardados em gelo.

Antes da adição das referidas partes alíquotas os frascos podem ser imersos à superficie de um banho liquido que está de preferência a uma temperatura entre os OSC e os 42C. Este processo de imersão não é absolutamente necessário mas em certos casos pode ser vantajoso. O banho pode ser constituido por etanol ou qualquer outro refrigerante adequado. O banho está normalmente equipado com um dispositivo de agitação para manter o refrigerante misturado, e é ligado a um aparelho que pode arrefecer o refrigerante aa uma velocidade controlada.

Uma vez os frascos no refrigerante, a temperatura é reduzida a uma velocidade adequada. Uma velocidade adequada pode situar-se numa gama cerca de 0,0l2C até cerca de 20°C por minuto, de preferência cerca de 0,l2C a cerca de 52C por minuto, com maior preferência desde cerca de 0,22C a cerca de 22C por minuto, mais preferivelmente desde cerca de 0,52C até cerca de 12C por minuto. Quando a temperatura atinge uma baixa temperatura, tipicamente numa gama entre cerca de -202C e cerca de -602C, de preferência entre cerca de -352C a cerca de -502C, mais, preferivelmente entre cerca de -382C até cerca de -442C, os frascos são submetidos a um

congelamento choque, por exemplo, metgulendo-os em azoto líquido ou ar líquido. A temperatura óptima para os mergulhar em azoto líquido ou ar líquido pode variar com as diferentes culturas usadas mas situa-se geraimente entre -202C e -50SC e pode ser fácilmente determinada por uma pessoa perita na arte. Os frascos são então armazenados em azoto líquido ou ar líquido, quer no próprio líquido quer no vapor acima dele, a uma temperatura que não exceda os -1009C.

culturas pode ser útil manter temperatura baixa constante duem lugar de serem imediatamenenquanto a temperatura óptima

Com algumas a temperatura dos frascos a uma rante um certo período de tempo te mergulhados em azoto líquido é alcançada.

Com o fim de retomar culturas de células viáveis, os frascos que contêm o material de callus são removidos do azoto líquido. O frasco é descongelado, tipicamente, com rápida agitação num banho de água quente a cerca de 102C a 502C , de preferência 35°C a 402C, até todo o gelo ter fundido. Surpreendentemente, tem-se verificado no âmbito do presente invento que os frascos de células crioconservadas da subfamilia Pooideae podem ser descongelados deixando-os ao ar à temperatura ambiente até todo o gelo ter fundido. Os frascos podem então ser guardados em gelo durante um período de poucos segundos a 60 minutos, mais preferivelmente de 1 a 10 minutos antes do material de callus nele contido ser colocado num meio de cultura adequado.

Os conteúdos do frasco são espalhados num meio de cultura solidificado adequado. Tipicamente, 0,5 ml de cultura descongelada é derramada em cada caixa de Petri de 10 cm de diâmetro contendo 30 ml a 50 ml de meio. O meio sólido pode ser vertido num plano inclinado ou numa cavidade pode ser vazado do meio que envolve a sua periferia com o fim de ajudar a drenagem do crioprotector remanescente para longe das células. As células podem ser lavadas uma ou mais vezes

com meio de cultura líquido, ou outra solução adequada, por exemplo, um açúcar ou solução açúcar álcool, ou uma solução de um aminoácido antes de serem colocadas num meio de cultura adequado.

As caixas de Petri são incubadas no escuro a 27°C, como descrito para o mencionado callus embrionário. O callus é então subcultivado como foi acima descrito para callus embrionário normal.

Passo B:

Isolamento e purificação de protoplastos capazes de serem regenerados em plantas incluindo plantas¹ incluindo plantas férteis

Os protoplastos são preparados a partir de culturas de suspensões embrionárias que resultam do passo A acima descrito. 0 isolamento e a purificação são levados a cabo pelo isolamento de aglomerações de células embrionárias do meio de cultura em suspensão, por exemplo, por filtração da cultura em suspensão do passo A numa unidade de filtração Nalgene^ de 0,2 ^pm, e por incubação das aglomerações de células resultantes com uma preparação de enzima adequada capaz de remover as paredes celulares sem danificar os protoplastos. A enzima é usada como uma solução esterilizada por filtração. Todas as manipulações das culturas são levadas a cabo sob condições de esterilização usando materiais estéreis. Uma preparação de enzima adequada pode ser constituida, por exemplo, por cerca de 2% (p/v) de celulose RS em CaC^.F^O 7 mM, NaF^PO^.F^O 0,7 mM, MES 3 mM /~pH 5-7 7 θ glicose (para 550 mOs/Kg F^O). Usualmente a mistura é suavemente agitada num agitador orbital a cerca de 50 rpm era obsemidade (cerca 2 de 5 ^iE/m s) mas isto não é crítico. A digestão é continuada entre os OSC e os 50QC, de preferência entre os 10QC e os 35SC mais preferivelmente entre os 26SC e os 32SC, e até os protoplastos estarem limitados. 0 tempo requerido para a digestão situa-se tipicamente entre alguns segundos e 2 dias, de preferência entre 1 hora e 1 dia, mais preferivelmente entre 3 e

e 5 horas.

Os protoplastos libertados são recolhidos e limpos por métodos padronizados tal como filtração, centrifugação e lavagem.

Neste estádio pode ser incluído um passo de flutuação. Neste caso os protoplastos lavados são postos em camada no cimo de um meio adequado, tal como o meio de cultura KM-8p feito a 700 mOs/Kgf^O com sacarose, ou de outros meios adequados como descrito em George et al, (1987).

Após centrifugação durante cerca de 10 minutos a cerca de 60 g os protoplastos congregados na interface são recolhidos. finalmente os protoplastos podem ser ressuspensos no mesmo meio de cultura e filtrados, por exemplo, passando-os através de um crivo de malha de aço puro (malha de tamanho 20 jjm) .

A contaminação com células não digeridas por completo da preparação de protoplastos não flutuadas na sacarose é cerca de 0,001 a 0,01% do total. Com o passo de flutuação em sacarose incluido a contaminação de células é mínima. Contudo, o passo de flutuação em sacarose resulta numa perda significativa de protoplastos com o citoplasma mais denso. Consequentemente a eficiência pode descrever até 10 vezes quando o passo de flutuação é incluido. Os protoplastos também podem ser purificados usando outros métodos conhecidos na arte, tal como flutuação numa solução de sacarose, ou outros meios de alta densidade tamponizados adequados , tal como Percoll®.

Os rendimentos em protoplastos e as subsequentes eficiências são óptimas se as culturas em suspensão usadas para o isolamento de protoplastos foram previamente subcultivadas 1 a 30 dias, de preferência 5 a 10 dias.

A mistura de enzima acima caracterizada é uma modificação da descrita por Lu et al, (1981) e verificou-se ser superior a outras misturas testadas, dando rendimentos de 40x10^ a 70χ10θ protoplastos por grama de peso em fresco. Alternativamente, contudo, 2% (p/v) de celulose RS em meio de cultura KM-8p ou outro meio adequado tal como ém George et al, (1987) também dá rendimentos respeitáveis de protoplastos.

A glucose é claramente superior à sacarose e um tanto superior ao material como o osmótico usado durante o isolamento de protoplastos relativamente ao rendimento e subsequente eficiência. Outras misturas de enzima adequadas conhecidas na arte podem também ser usadas no processo do invento.

Os protoplastos obtidos após filtração, por exemplo, após passagem através de um crivo de 20 ^im média 12 |im a 15 jjm em diâmetro são densamente citoplásmicos .

Por isso, o presente invento proporciona um método de produção de protoplastos de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, protoplastos esses que são capazes de serem regenerados em plantas, de preferência em plantas férteis. Este método compreende:

(a) o isolamento de tecido de partes adequadas de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, de preferência as partes basais das folhas interiores jovens , embriões sexuais imaturos, inflorescência imaturas, sementes maduras ou te eido de semente, mais preferivelmente as folhas interiores mais jovens , (b) a cultura deste tecido num meio capaz de induzir a formação de callus embrionários e de embriões, (c) periodicamente a subcultura de callus embrionário e de embriões num meio fresco capaz de sustentar uma proliferação continua, (d) o isolamento de aglomerações de células embrionárias após 0 a 500 transferências, de preferência após 0 a 100 transferências, mais preferivelmente após 6 a 8 transferências, e (e) a remoção de paredes de células com misturas de enzima adequadas e o isolamento e purificação dos protoplastos resultantes.

Uma incorporação adicional do invento abrange protoplastos (incluindo as células de planta após regeneração das paredes celulares) de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae capazes de serem regenerados em plantas, especialmente em plantas férteis. São preferidos os protoplastos ou células quer derivadas de culturas de células quer de suspensões de células embrionárias.

Estão também compreendidas plantas gramíneas, de preferência plantas gramíneas férteis, da subfamilia Pooideae e seus propágulos regenerados a partir dos ditos protoplastos ou células de planta.

Passo C: Estabelecimento de cultura de protoplastos e crescimento de callus capazes de serem regenerados em plantas e plantas férteis

Os protoplastos purificados do passo B) acima descrito são empratados com ou sem tratamento com DNA exógeno num líquido adequado ou num meio solidificado. (O tratamento com DNA exógeno será descrito em detalhe num parágrafo subsequente. Alguns dos meios adequados incluem os baseados em KM-8p; RY-2 /Potrykus et al, 19797; e SH-30 e SH-45 , com concentrações apropriadas de açúcares e de reguladoras de crescimento de plantas. O agente de solidificação preferida é (Si agarose, em especial agarose SeaPlaque^ / FMC Corp. Marine

Colloids Division, P.O. Box 308, Rockland, ME-04841, USA7 . Onde usada,a concentração de agarose SeaPlaque® pode situar-se entre 0,1% e 2,5% (p/v), de preferência entre 0,6% e 1,5% (p/v).

O empratamento de protoplastos num meio que contém agarose pode ser levado a cabo de acordo com os métodos descritos por Shillito et al., (1983); ou no Pedido de Patente Europeia EP-O.129.688 (Shillito et al); ou por Adams et al, (1983). Estas publicações são aqui incorporadas em referência.

O meio no qual os protoplastos são cultivados pode conter substâncias adequadas para assistir os protoplastos a dividirem-se e formarem colónias. Estas substâncias incluem, por exemplo, 2,4-D, dicamba, picloram, ou outros reguladores do crescimento de plantas. Os reguladores de crescimento de plantas adequados são conhecidos na arte. A concentração de tais substâncias situa-se normalmente na gama 0,01 mg/litro a 100 mg/litro.

O ácido salicílico e seus derivados podem promover a divisão de, e/ou a formação de colónias a partir de, protoplastos Pooideae. Os derivados de ácido salicílico incluem mas não estão limitados com derivados 0-acil e O-aril. Os derivados O-acil incluem mas não estão limitados aos grupos acilo de cadeia curta, tal como os que têm de 1 a 7, de preferência de 1 a 4, e mais preferivelmente de 2 a 3 átomos de carbono. Os derivados O-arilo incluem mas não estão limitados aos que têm um ou mais anéis de 5 ou 6 membros, que podem ser condensados ou não condensados. Os anéis podem ser não substituídos ou substituídos com um ou mais grupos que incluem alquilo contendo 1 a 5 átomos de carbono, O-alquilo que contém 1 a 4 átomos de carbono, halogénio (em especial cloro e bromo), nitro; amino e amino substituido por alquilo que contém 1 a 4 átomos de carbono.

Os derivados de ácido salicílico também

-29incluem os ésteres de carboxilato. Os ésteres de carboxilato preferidos são os ésteres aril e alquílicos em que o grupo alquilo tem 1 a 4 átomos de carbono.

Os derivados de ácido salicílico, em complemento, incluem os compostos em que o anel de ácido salicílico é além disso substituido por, por exemplo, um ou mais grupos que incluem alquilo que contem 1 a 4 átomos de carbono, O-alquilo que contem 1 a 4 átomos de carbono, halogênio (em especial cloro e bromo), nitro; amino e amino substituido por alquilo que contem 1 a 4 átomos de carbono.

Os compostos preferidos que promovem a divisão de, e/ou a formação de colónias a partir de, células e protoplastos Pooideae são:

ácido O-acetoxibenzóico (aspirina, ácido acetilsalicílico) ; ácido O-hidroxibenzóico (ácido salicílico); ácido O-metoxibenzóico (ácido metilsalicílico); e ácido O-dimetil-carbamoilbenzóico / ácido 0-(CO-dimeti1)-salicílico? .

A concentração do ácido salicílico ou de um seu derivado no meio de cultura situa-se de modo adequado na gama de 0,1 mg/litro a 3000 mg/litro, de preferência na gama de 10 mg/litro a 300 mg/litro, e mais preferivelmente a cerca de 100 mg/litro.

meio no qual os protoplastos são cultivados pode conter o meio que foi préviamente condicionado para o crescimento de células adequadas tal como, por exemplo, Zea mays , Dactylis glomerata ou outras Gramideae, ou mesmo outras plantas (dicotiledíneas). É preferido o meio no qual uma suspensão embrionária de espécies gramíneas tenha tido crescimento. 0 meio preparado é o meio no qual a suspensão embrionária de Dactylis glomerata tenha tido crescimento. O meio condicionado como foi acima descrito pode ser na proporção de entre 0% e 100% (v/v), de preferência entre 5% e 50%

(v/v), com maior preferência entre 30% e 40% (v/v) do meio total.

-30Os protoplastos podem ser cultivados num meio sólido ou líquido sem subcultura durante um período de até 12 semanas, de preferência até 6 semanas, mais preferivelmente na gama de 1 a 3 semanas. Numa incorporação preferida no presente invento num meio sólido pode sercolocado num meio líquido,como foi descrito em EP-0.129.688 (Shillito et al. ) ou tratado de algurra outra maneira de modo a auxiliar a divisão de, e/ou a formação de colónias a partir de protoplastos .

Os protoplastos são cultivados à luz ou, de preferência no escuro a uma temperatura na gama entre 0°C e 50SC, de preferência entre 20SC e 32SC, mais preferivelmenA intensidade da luz situa-se tipica2 te entre 25°C e 28°c.

mente entre 0,1 yuE/m s e 200 yuE/m s, de preferência entre 30 ^íE/m^s e 90 μΕ/m^s

As eficiências de empratamento obtidas usando o meio KM-8p podem variar desde 0,5% a 10% dependendo da qualidade de preparação de protoplastos. A adição de meio de cultura em suspensão condicionado a 30% até 40% (v/v) (meio de cultura em suspensão condicionado pelo crescimento das suas células e feito tendo até 550 mOsm/kgH^O por adição de glicose) ao meio de cultura de protoplastos não resulta num aumento significativo da eficiência de empratamento mas faz acelerar o processo da divisão nas colónias derivadas de protoplastos jovens.

Numa incorporação preferida do presente invento ou protoplastos são empratados (em caixas de Petri) num meio de agarose solidificado. As primeiras divisões celulares são notadas cerca de dois dias após o empratamento dos protoplastos. As divisões subsequentes ocorrem todos os 2 a 3 dias. O processo não é síncrono, como é demonstrado pelo

facto de que as primeiras divisões poderem ainda ser observadas após 7 dias. Depois de 5 a 20 dias, de preferência depois de 10 a 14 dias, depois do empacotamento, o meio solidificado de agarose é cortado em segundos e os segmentos que contêm as colónias de células são transferidos para um meio nutriente líquido. Este procedimento é conhecido na arte como técnica de cultura de contas (bead culture technique) e é completamente descrito por Shillito et al, (1983) e na EP-0,129,688 (Shillito et al ) .

Em lugar de cortar o meio solidificado de agarose é também possível liquefazer o meio de agarose e transferir o meio liquefeito para um meio nutriente líquido. Esta modificação pode ser levada a cabo de acordo com Adams et al, (1983). Em ambos os casos, (corte ou liquefação) o componente líquido pode permancer o meio KM-8p com glicose ou sacarose com um bom crescimento de colónias observado. Contudo o componente líquido óptimo no que diz respeito à velocidade de crescimento é o meio SH-45 com 4 g/litro de hidrolisato de caseina. Dentro de cerca de 2 a 3 semanas do início das culturas de contas, podem ser observadas nas caixas novas culturas em suspensão. O exame microscópico das pranchas de agarose revela que normalmente que algumas das colónias mais frescas à superfície crescem para dentro do líquido e realizam pequenas massas de células ainda que ancoradas na agarose. As novas suspensões multiplicam-se rápidamente e após outras duas semanas são transferidas com culturas em suspensão da maneira usual ou colocadas em caixas de 3H-30 para desenvolvimento de callus. Alternativamente a agarose pode ser espalhada sobre caixas que conteham meio SH-45 solidificado de agarose, e deixaram-se as colónias a crescer.

Por isso, o presente invento também se refere a um método de produção de culturas de células (culturas de suspensões ou culturas de callus) a partir de protoplastos de plantas gramíneas de subfamilia Pooideae, a qual cultura de células é capaz de ser regenerada em plantas, incluindo

plantas férteis. Este processo compreende:

(a) a cultura de plantas regenerados lulas, e num meio de cultura adequado de protoplastos gramíneas da subfamilia Pooideae capazes de ser em plantas até eles formarem colónias de cé(b) a cultura das ditas colónias de células ou de suas partes num meio adequado para promover a formação de culturas de células, e (c) o isolamento de cultura de células resultante.

O passo (b) não é absolutamente necessário. É também possível os protoplastos permanecerem num meio do passo (a) até a cultura de células ou embriões estarem formados .

Estão também compreendidas plantas gramíneas, em especial plantas gramíneas férteis, da subfamilia Pooideae regeneradas a partir das ditas culturas de células.

Uma incorporação preferida do presente invento compreende o empratamento de protoplastos num meio solidificado de agarose, a liquefacção ou segmentação do meio solidificado de agarose, a transferência do meio liquefeito ou segmentado para um meio nutriente líquido, e a cultura até estarem formados colónias de células.

É preferido um método em que as partes das colónias de células mencionadas acima no passo (b) provém de células e/ou de massas de células libertadas para o meio nutriente líquido.

callus e as culturas de suspensões produzidos neste ou noutros passos podem ser crioconservados como se descreveu no passo A.

-33Passo D: Regeneração de plântulas a partir de callus callus derivado de protoplastos /'passo C_7, de preferência callus granular friável, é subcultivado uma ou mais vezes, de preferência cada duas semanas, num meio fresco de maneira a induzir a formação de embriões. Os meios indutores adequados incluem um meio SH com concentrações apropriadas de açúcares e de reguladores de crescimento de plantas .

Quaisquer embriões que sejam formados são removidos e colocados em caixa num meio adequado para indtEilos à maturação e germinação. Os meios adeguados incluem, por exemplo, os meios SH-30 ou OMS contendo modificações para conter as guantidades apropriadas de açúcares e de regeneradores de crescimento de plantas. As caixas são colocadas à luz / 10 ^iE/m s a 200 ^uE/m s de luz fria e branca de lâmpadas fluorescentes ou de uma mistura de luz do dia e de lâmpadas fluorescentes Gro-lux^ (Sylvania) ou qualquer outra lâmpada fluorescente adequada7. Os embriões maduros são observados cerca de 2 a 5 semanas depois de metidos em caixa. Em alguns casos nuna ou mais transferências extra para um meio fresco podem ser benéficos para o completamento da maturação dos embriões. Os embriões diferênciam-se mais para formar plântulas depois de um período de tempo adequado, tipicamente 1 semana a 6 meses mais tipicamente 1 a 3 meses.

Alternativamente, o callus derivado dos protoplastos / passo c7 , de preferência callus granular friável , é subcultivado uma oumais vezes, de preferência cada duas semanas, num meio fresco adequado de maneira a induzir a formação e maturação de embriões. Os meios adequados incluem mas não se limitam ao meio OMS com concentrações apropriadas de açúcares e sem reguladores de crescimento de plantas. As caixas são colocadas à luz / 10 ^jE/m s a 200 pE/m s de luz fria e branca de lâmpadas fluorescentes ou de uma mistura de luz do dia e de lâmpadas fluorescentes Gro-lu x© (Sylvania) ou

-34qualquer outra lâmpada fluorescente adequada7. Os embriões diferenciam-se mais para formar plântulas após um período de tempo adequado, tipicamente 1 semana a 6 meses, mais tipicamente 1 a 3 meses.

Passo E: Obtenção de plantas, de preferência plantas férteis, a partir de plântulas

As plântulas obtidas de acordo com o passo D acima descrito são transferidas para um meio adequado tal como por exemplo SH-0 ou OMS, que não contem reguladores de crescimento. Alternativamente, um regulador de crescimento que estimula o crescimento de raízes ou rebentos (gomos) pode ser adicionado. Os reguladores de crescimento adequados são conhecidos na arte. As plântulas são cultivadas no dito meio até formarem raízes. É importante remover todo o callus das plântulas, uma vez que este callus formado de novo é sabido ser inibidor do crescimento das plântulas. Para este fim as plântulas podem ser lavadas com água destilada estéril aquando a transferência. Callus que se origina subsequentemente deve ser removido a intervalos regulares, de preferência todos os 3 a 30 dias, com maior preferência cada 1 a 2 semanas. O tempo requerido para a formação de raízes é tipicamente cerca de 1 a 4 semanas, mais tipicamente cerca de 3 semanas. As plântulas com um bom sistema de raízes podem ser transformadas para o solo na estufa e gradualmente robustecido para o exterior. Neste estádio um comprimento suficiente para as raízes situa-se na gama de 1 cm a 10 cm mais tipicamente 2 cm a 5 cm, e para os rebentos (gomos) situa-se na gama de 1 cm a 10 cm, mais tipicamente 2 cm a 5 cm. Alternativamente, as plântulas podem ser subcultivadas indefenidamente in-vitro por separação dos rebentos e colocação das plântulas em meio fresco tal como SH-0 ou OMS.

Desta maneira, o método do invento de regeneração de plantas gramíneas, de preferência plantas férteis, da subfamilia Pooideae a partir de callus compreende:

(a) a cultura de callus de plantas Pooideae, callus que é derivado de ptotoplastos e é capaz de ser regenerado em plantas num meio capaz de induzir a formação de embriões até os embriões estarem formados, (b) a cultura de embriões num meio adequado para os induzir a amadurecer e germinar, e (c) a cultura das plântulas resultante até estarem suficientemente desenvolvidas para serem transferidas para o solo para formarem plantas maduras.

A floração pode ser induzida como foi descrito por Heide, (1987), ou como for apropriado para as espécies ou variedades particulares que são usadas. Os métodos para a indução da floração são conhecidos na Pooideae. As sementes produzidas por estas plantas podem ser tratadas de uma maneira apropriada para induzir a germinação, e semeadas quer em vasos quer esterelizadas e em caixas num meio Murashige e Skoog sem reguladores de crescimento (meio OMS) e solidificado com ágar ou agarose a 0,8%, ou GelRite^ ou qualquer outro agente geleificante. As sementes podem também ser semeadas num meio que contenha entre 10 ^ig/ml e 1000 ^ig/ml de higromicina B para determinar a herança do carácter de resistência da higromicina.

Nestes termos , o método do invento de regeneração de plantas gramíneas férteis da subfamilia Pooideae a partir de callus compreende (a) a cultura de callus de plantas Pooideae, callus que é derivado de protoplastos e é capaz de ser regenerado em plantas férteis num meio capaz de induzir a formação de embriões até os embriões estarem formados, (b) a cultura dos embriões num meio adequado a induzi-los a amadurecer e germinar,

(c) a cultura das plântulas resultantes até estarem suficientemente desenvolvidas para serem transferidas para o solo para formarem plantas maduras, e (d) a obtenção de sementes a seguir a polinização controlada ou aberta.

Uma incorporação adicional do presente invento é constituída por plantas gramineas, em especial plantas gramineas férteis da subfamilia Pooideae regeneradas a partir dos ditos callus.

Passo F: Tratamento de protoplastos com DNA exógeno

Os protoplastos Pooideae podem ser tratados com DNA exógeno de maneira a produzirem células que contêm todo ou parte do DNA integrado estávelmente no seu material genético. O DNA exógeno deve ser entendido neste invento como a inclusão de qualquer DNA adicionado a um protoplasto. Pode ser homólogo ou heterólogo em relação à planta que é transformada.

O DNA exógeno pode conter um promotor activo em plantas gramineas, de preferência em plantas, de preferência em plantas da subfamilia Pooideae, ou pode utilizar um promotor já presente no genoma da planta. O DNA exógeno pode conter um ou mais genes que alteram o genótipo e em especial o fenótipo das células resultantes ou das plantas que são regeneradas a partir de células transformadas. Deseja-se, contudo, que a sequência genética encorpore em código um ou mais produtos proteínicos a serem expressos, e produza um ou mais polipeptídeos ou enzimas funcionais na planta e célula resultante, respectivamente. O DNA exógeno pode ser um gene quimérico, ou uma sua porção.

Dentro do âmbito do presente ivnento o DNA exógeno deve também ser entendido de maneira a incluir sequências de DNA regulador não codificador que estão, por exem-

-37plo, envolvidas na regulação do processo de transcrições.

O tratamento de protoplastos com DNA exógeno pode ser levado a cabo por métodos tais como os descritos nas publicações seguintes /Paszkowski et al, 1984; Pedido de Patente Europeia EP-0.164.575 , (Paszkowski et al; Shilli to:et al, 1985; Potrykus et al, 1985; Loerz et al, 1985; Fromm et al, 1986; Pedido de Patente Britânica GB-2.140.822 (Mettler e Negrutin et al, 19877. Estas publicações sao incluídas em referência.

O DNA pode ser adicionado em qualquer forma, tal como, por exemplo, DNA circular ou linear nu, DNA encapsulado em lipossomas, DNA em esferoplastos, DNA em outros protoplastos de plantas, DNA complexado com sais, etc. A captação de DNA estranho pode ser estimulado por qualquer método adequado conhecido na arte incluindo os métodos descritos nas referências citadas acima.

Em primeiro lugar, os genes quiméricos contemplados neste invento são os que preparam os protoplastos de plantas transformadas, tecidos derivados de protoplastos e finalmente as plantas derivadas de protoplastos com propriedades valiosas, tais como a resistência aumentando a patogenes (e.g. a fungos fitopatogénxDS, bactérias, vírus, etc.); resistência a produtos químicos / e.g. a herbicidas (tais como triazinas, sulfonilmeias, imidazolinonas, triazolo-pirimidinas, bialafos, glifosato, etc.), insecticidas ou outros biócidas7; resistência a citotoxinas (e.g. a higromicina, canamicina, cloranfenicol , etc.); resistência a influências (e.g. ao calor, frio, vento, condições de solo desfavoráveis, humidade, seca, etc.) ambientais (edáficas ou atmosféricas) adversas; ou com formação acrescida de reservas ou armazenamento de substâncias nas folhas, sementes, tubérculos, raízes, talos, etc. As substâncias desejáveis produzidas por uma planta tran genica incluem, por exemplo, proteínas, amidos, açúcares, aminoácidos, alcaloides, aromas, cores, gorduras, etc.

A resistência as citotoxinas pode, por exemplo, ser conferida por um gene que expressa nas células da planta uma enzima que destonifica a citotoxina, por exemplo, a neomicina fosfotransferase tipo II ou aminoglicósido fosfotransferase tipo IV para a destoxificação de canamicina, higromicina e outros antibióticos aminoglicósidos, ou uma glutationa-S-transferase ou citocroma P-450 ou outra enzima catabólica conhecida para destoxificar triazina, sulfonilureias ou outros herbicidas. A resistência às citotoxinas pode também ser conferido por um gene que expressa numa planta uma forma de uma enzima tarjeta (target enzime) (local da acção da citotoxina) que é resistente à citotoxina, por exemplo uma forma da aceto-hidroxiácido-sintase que é insensível à inibição por sulfonilureias ou imidazolinonas, ou outro herbicida actuando como este passo metabólico, ou uma forma de EPSP sintase que é insensível à inibição por glifosato. Pode ser vantajoso expressar estas enzimas tarjetas alteradas numa forma que conduza ao seu transporte na célula da planta para o compartimento celular correcto, i.e. o cloroplasto nos exemplos acima mencionados.

em certos casos é vantajoso tarjetar os produtos do gene nos unitocôndrios, os vacúolos, nas vesículas endoplasmáticas, ou outras partes da célula ou mesmo nos espaços intercelulares (apoplásticos).

A resistência a certas classes de fungos pode ser conferido, por exemplo, pela introdução de um gene que expressa a quitinase nos tecidos da planta. Muitos fungos patogénicos de plantas contêm quitina como uma parte integral da estrutura hifal e dos esporos, eg. basidiomicetes (tisnas e ferrugens-bolores) e ascomiceter e fungi imperfecti (incluindo Alternaria e Bipolaris, Exerophilum turcicum, Colletotricum, Gleocercospora e Cercospora). A quitinase pode inibir o crescimento de unicélios de certos patogenes in vitro. Uma folha ou raiz de planta que expresse constitutivamente a quitinase ou em resposta a uma invasão de patogenes está protegida contra

muitos tipos de ataques de fungos. A expressão constitutiva pode ser ou pode não ser vantajosa em relação à expressão induzivel que é a resposta normal ao ataque patogénico em certas plantas, por gue a quitinase está imediatamente presente num nível alto sem o atraso requerido para a síntese de novo.

A resistência aos insectos pode, por exemplo, ser conferida por um gene que codifica um polipeptídeo que é tóxico para os insectos e/ou suas larvas, tal como a proteína cristalina do Bacillus thuringensis / Barton et al, 1987 ; Vaeck et al, 19877. Una segundo classe de proteína que conferirá resistência a insectos são os inibidores de proteases. Os inibidores de protease são constituintes comuns de estruturas de armazenamento de plantas /~Ryan, 19737. 0 inibidor de protease Bowman-Birk purificado isolado da semente de soja mostrou inibir a protease das entranhas das larvas Tenebrio / Birk et al, 19637. O gene que codifica o inibidor de tripsina de cowpea é descrito por Hilder et al, (1987).

Um gene que codifica um inibidor de protease pode ser posto sob o controlo de um promotor de plantas, de preferência um promotor constitutico tal como promotor CaMV 35S / que é descrito por Odell et al , (1985) _7 , num vector adequado. O gene, por exemplo a sequência codificante para o inibidor de protease Bowman-Birk da semente de soja, pode ser obtido usando os métodos de clonação de cDNA descritos por Hammond et al, (1984). Um método alternativo de obtenção de um gene para inibidores de protease com menos de 100 aminoácidos , tal como o inibidor de tripsina da semente 83 lima dean θ sintetizá-lo. A sequência codificadora é predita por translação retrógrada (back-translation) e as zonas de restrição (restriction sites) apropriadas para o vector desejado estão liquidas no fim de cada um. 0 gene sintético é preparado por síntese de oligonucleotídeos sobrepostos de 30 a 60 bases. Os fragmentos são cinasados, ligados (Maniatis et al , 1982) e clonados no vector apropriado. Um clone cuja inserção está na orientação correcta pode ser iden-

-40tifiçado pela sequência. O DNA plasmideo é isolado para incorporação nos protoplastos (Abel et al, 1986).

Também são incluídos no presente invento os genes codificadores para ingredientes farmacêúticamente activos, por exemplo, alcaloides, esteróides, hormonas e outras substâncias fisiológicamente activos, e flavinas, vitaminas e colorantes. Por conseguinte, os genes que sao contemplados neste invento incluem, mas não se limitam, a genes específicos de plantas, tal como o gene da zeína (Wienand et al, 1981), a genesespecíficos de mamíferos, tal como o gene da insulina, o gene da somatostatina, o gene da interleucina, os genes de t-PA (Pennica et al, 1983) etc., ou genes de origem microbiana, tal como o gene de NPTII assim como genes de origem sintética tal como o gene da insulina (Itakura et al, 1975).

Como uma coisa natural, também sequências de DNA não codificante que estão por exemplo, envolvidas no controlo do processo de transcrição, podem ser usadas para a transformação de protoplastos de planta de plantas da subfamilia Pooideae.

Vários genes de plantas são conhecidos por induzirem vários factores externos e internos que incluem hormonas de plantas, choque térmico, substâncias químicas, patogenes, carência de oxigénio e luz.

Como um exemplo de regulação de genes por uma hormona de planta, o ácido absíssico (ABA) tem demonstrado induzir os numerosos ARNm abundantes embriogénese do algodão.

Noutro exemplo, o ácido giberélico (GC3) induz as transcrições de sintase de malato em sementes de rícino e em isozimas alfa-amilase em camadas de aleuroma de cevada .

A regulação dos genes da proteína de choque térmico de semente de soja tem sido estudado em detalhe.

O tratamento de plantas durante várias horas a 40SC resulta na síntese de novo de várias também chamadas proteínas de choque térmico. Vários genes destes têm sido isolados e a sua regulação estudada em detalhe. A expressão destes genes é primariamente controlada ao nível da transcrição (Shoffl et al, citado em Willmitzer, 1988). O promotor de gene hsp70 tem sido ao^ne da neomicina fosfotransferase II (Npt II) e o gene quimérico tem mostrado ser induzido por choque térmico (spena et al , 1985).

Outra classe de genes induzíveis em plantas incluem os genes reguladores por luz, mais notávelmente o gene codificado nuclear para a pequena subunidade de ribulose 1,5-bifosfatocarboxilase (RUBISCO). Morelli et al, (1985) e Herrera-Estrella et al, (1984) demonstraram que as sequências 5'-de flanco de um gene RUBISCO de ervilha pode conferir indutibilidade à luz a um gene repórter quando ligado de uma maneira quimérica. Esta observação tem-se entendido a outros genes induzíveis por luz tal como a proteína que envolve a clorofila a/b.

Os genes da álcool desidrogenase (adh) do milho têm sido extensivamente estudados. O gene da adhl-s do milho foi isolado e uma porção do ADN de flanco 5' mostrou-se capaz de induzir a expressão de um gene repórter quimérico (e.g. acetil cloranfenicol transferase, CAT) quando o tecido transitoriamente transformado foi sujeito a condições anaeróbicas (Howard et al, 1987).

Numa incorporação preferida do presente invento os protoplastos Pooideae são transformados por meio de uma combinação de electroporação e tratamento com polietileno-glicol. Imediatamente após a purificação dos protoplastos obtidos no passo B, a electroporação é realizada como descrito por Shillito et al (1985) ou na EP-0.164.575 (Paszkowski

et al). Os protoplastos são suspensos num tampão de electroporação após a última lavagem. Os tampões de éLectroporação adequados incluem soluções aquosas de manitol que contem uma quantidade apropriada de MgCl^. Uma solução aquosa de DNA é adicionada à suspensão de protoplastos. Numa incorporação o DNA é plasmido pCIB709 linearizado por tratamento com uma endonuclease de restrição adequada. A mistura resultante é misturada com suavidade. Numa incorporação, metade do volume de uma solução a 24% (p/v) de PEG em manitol 0,5M e 30 mM de MgCl„ é adicionado. Após a mistura os protoplastos são transferidos para uma câmara de um Electroporador Dialog-⁷ /-DIARFA

-LOG G.m.b.H., Haffstasse 34, D-4000 Dusseldorf 13 aplicados a intervalos de 30 segundos 2 a 5 pulsos, de preferência 3 pulsos de cerca de 2000V/cm a 5000V/cm de voltagem inicial e de constante decaimento exponencial de 10 yjs . A amostra é em seguida colocada numa caixa de Petri (é empratada) e e'adicionado 1% (p/v) a 25% (w/p) de agarose como agente de solidificação, os protoplastos são distribuídos por todo o meio, e deixa-se assentar a agarose. A partir desta cultura de protoplastos transformados, as plantas Pooideae trangénicas, incluindo plantas Pooideae transgénicas férteis , são regeneradas como se descreveu acima nos passos C a F.

e sao

Numa incorporação preferida adicional do presente invento, os protoplastos Pooideae são transformados de acordo com o método descrito por Negrutiu et al, (1987).

neste caso os protoplastos purificados são suspensos seguindo a última lavagem em manitol 0,5M que contém entre 15 mM e 45 mM de MgCl₂ . O DNA numa solução aquosa, e em seguida é adicionado um volume igual de uma solução 36% (p/v) de PEG / Negrutin et al , 19877- A mistura resultante é misturada suavemente e incubada durante 5 a 60 minutos , de preferência durante cerca de 30 minutos, a temperaturas entre 102C e 322C, de preferência à temperatura ambiente (cerca de 252C). Durante a incubação a mistura é ocasionalmente sacudida. Após a incubação os protoplastos são lavados e metidos em caixas num meio de cultura adequado. Os meios de cultura adequados in-43-

cluem , mas não se limitam, o meio KM-8p contendo 0,3% (p/v) a 2,5% (p/v) de agarose, de preferência 0,6% (p/v) a 2% (p/v) de agarose como um agente de solidificação. Os protoplastos transformados são distribuídos por todo o meio, e deixa-se gelificar a agarose. A partir desta cultura são regeneradas plantas Poàdeae transgénicas, incluindo plantas Paideae férteis, de acordo com os acima descritos passos C a E.

Um DNA exógeno preferido no âmbito deste invento é o plasmido pCIB709 como se mostra na fig. 7, na sua forma linearizada.

Passo G: Selecção de colónias transformadas

O meio solidificado de agarose /passo F7 contendo os protoplastos transformados é incubado à luz ou de preferência às escuras durante 5 a 30 dias, de preferência 8 a 15 dias, com maior preferência durante 10 dias, a uma temperatura na gama 02C a 502C, de preferência de 202C a 322C, com maior preferência entre 252C e 282C. O meio solidificado é dividido, por exemplo em 5 fatias e seleccionado no sistema de cultura tipo conta de rosário (bead type ) de acordo com os métodos descritos por Shillito et al, (1983); ou no

Pedido de Patente Europeia EP-0.129.688 (Shillito et al); ou em Shillito et al, (1985); ou no Pedido de Patente Europeia EP-0.164.575 (Paszkowski et al): O número e o tamanho das fatias não é crítico. Numa incorporação, quatro destas fatias são postas separadamente num meio adequado, tal como, por exemplo, o meio de cultura SH-45 contendo 4g/litro de hidrolisato de caseína e 20 pg/ml a 100 ^ug/ml de higromicina B.

A quinta fatia é posta no mesmo meio mas sem higromicina B (controlo).

Após 4 a 5 semanas, as colónias de células transformadas são separadas da agarose e cultivadas num meio de cultura adequado, tal como SH-45 contendo 20 ^ig/ml a 100 ug/ml de higromicina B, que é agitado a, por exemplo, 50

rpm a 80 rpm num agitador orbital. Após outras 4 a 5 semanas todas as colónias que fazem uma nov.a cultura em suspensão são transferidas para um novo meio que contém 20 yug/ml de higromicina B. As novas suspensões vão aumentando para um número de duas subculturas na presença de 20 ^ug/ml de higromicina B e são incubadas sob as mesmas condições como acima se descreveu até o callus ser formado.

As culturas em suspensão e o callus, e as culturas derivadas dos materiais produzidos neste passo podem ser crioconservadas como se descrevem no passo A.

Passo Η: A regeneração de plantas Pooideae transformadas a partir de callus

As plantas Pooideae transformadas são regeneradas a partir do callus transgénico do passo G de acordo com o procedimento acima descrito para os passos D e E.

O método do presente invento permite que protoplastos de plantas da subfamilia Pooideae se regenerem em plantas, e com maior preferência, em plantas férteis. Esta possibilidade permite-nos pela primeira vez introduzir estavelmente ADN, exógeno no genoma dessas plantas, e alterar os seus geno e fenótipos. Para além disso os protoplastos podem ser fundidos com protoplastos da mesma ou de outras espécies, de maneira a produzir novas combinações de DNA nuclear, ou novas combinações de ADN organelo e nuclear. Além disso, os protoplastos podem ser usados como fonte de material clonal , em que pode ser levado a cada uma mutagénese e/ou selecção para um fenótipo desejado.

resistência sintéticas secticidas, sados, sais

Exemplos de a concentrações tóxicas ou naturais que incluem, herbicidas, fungicidas, , patotoxinas, inibidores fenótipos desejados incluem de substâncias químicas mas não se limitam a inbactericidas, metais pemetabólicos, e análogos

funcionais ou estruturais de metabólicos, e análogos funcionais ou estruturais de metabólicos celulares. Outros exemplos de fenótipo desejado que podem ser seleccionados incluem resistência a condições ambientais adversas tal como temperaturas baixas ou altas ou a agentes bióticos tal como patogenes .

Os seguintes exemplos e experiências ilustram em adicional o presente invento, mas não foram construídos para limitar o seu âmbito e alcance.

-46Exemplos não limitantes

Exemplo 1: Preparação de suspensões embrionárias a partir de tecido de Dactilys glomerata L. (orchardgrass)

Iniciou-se o callus embrionário a partir de secções de base das folhas mais jovens de plantas orchardgrass desenvolvidas em estufa (Dactylis glomerata L.) como descrito por Hanning et al, (1982). As folhas são esterilizadas na superfície por imersão numa solução diluída 1:10 de Clorox / uma solução de hipoclorito de sódio a 5,25% (p/v); The Clorox Company, Oakland, CA 94623, USA_7 durante cerca de 10 minutos e em seguida é assépticamente dividido em pequenos segmentos de 1 mm a 5 mm de comprimento ou de diâmetro. Estes segmentos são metidos em caixas num meio SH-30 estéril que contem agarose a 0,8% (p/v) como agente de gelificação. Apareceram callus e/ou estruturas embrionárias dentro de 2 a 6 semanas após serem colocados em caixas, em cultura a cerca de 28°C. O callus embrionário foi mantido por subcultura em meio SH-30 fresco cada 2 a 4 semanas e por cultura no escuro a 25°C.

As culturas de suspensão embrionárias são iniciadas colocando-se aproximadamente 0,5 g de peso fresco de callus embrionário em 50 ml de meio líquido descrito por Gray, et al. , (1985 ) contendo dicamba 45 e hidrolisato de caseína a 4g/litro. As culturas de suspensão são desenvolvidas a 27°C sob 16 horas de luz (40 ^uE/m^s), 8 horas de fotoperíodo escuro num misturador giratório a cerca de 130 rpm em frascos Delong selada com uma tampa metálica e parafilm Após aproximadamente quatro semanas os grupos celulares maiores deixam-se assentar durante cerca de 30 segundos e alíquotas de 10 ml do meio sobrenadante contendo aglomerações de células pequenas são removidas e transferidas para 50 ml de meio fresco. Este processo é repetido cada 3 a 4 semanas usando as culturas melhor sucedidas assim junlgadas pelo tamanho do grupo mais pequeno e melhor qualidade baseada na presença de células citoplásmicas pequenas. Depois de 5 a 8 transferências as suspensões estão essêncialmente livres de células não embrionárias e a maioria das aglomerações de células embrioná rias são muito pequenas (150 um a 2000 um).

Exemplo 2: Isolamento e purificação de protoplastos de Dactilys glomerata L.

Os protoplastos são preparados a par tir de culturas de suspensões embrionárias do Exemplo 1 filtrado assépticamente as células num filtro Nalgene^⁷de 0,2 ^im e em seguida adicionados 0,5 g de células acabadas de pesar a cada 12,5 ml de mistura de enzima de protoplastos numa caixa de Petri. A mistura de enzima é constituida por Celulase RS a 2% (p/v); CaClgxHgO 7 mM ; NaHgPO^HgO 0,7 mM; MES 3 mM (pH 5,6); glicose (550 mOs/Kg^O de pH 5,6); e é esterilizada por filtração. A mistura é passada rápidamente redemoinha do num agitador orbital a cerca de 50 rpm na obscuridade ( < 5 yuE/m s) durante cerca de 4 a 5 horas. O digerido éem seguida peneirado através de uma peneira de aço limpo (malha de tamanho 100 ^jm) e distribuída por tubos de centrifugação de 12 ml que são centrifugados a cerca de 60 g a 100 g durante cerca de 5 minutos. O sedimento que contém protoplastos é então lavado três vezes com meio KM-8p de cultura de protoplstos ajustado para 550 mOs/kgt^O com glicose. Neste ponto pode ser incluído a etapa de flutuação para uma adicional purificação dos protoplastos. Neste caso, os protoplastos lavados são encarnados na parte de cima do meio decultura KM-8p ajustado a 700 mOs/mg HgO com sacarose. Após centrifugação a 60 g até 100 g durante cerca de 10 minutos, os protoplastos congregados na interface são recolhidos usando uma pipeta fina. Por fim, os protplastos são ressuspensos em 1 ml a 2ml do meio de cultura kM-8p e purificado através de um crivo de malha limpa (tamanho de malha:20 jam) . Os protoplastos libertados são recolhidos e lavados e ressuspensos no meio KM-8p para cultura ou num meio ajustado osmóticamente adequado para a transformação de acordo com o Exemplo 6.

-48Exemplo 3; Cultura de protoplastos Dactilys glomerata L. e crescimento de callus (a) Os protoplastos purificados são empratados a uma densidade de cerca de 5x10^ protoplastos/ml num meio de cultura KM-8p contendo 1,3% (p/v) de agarose SeaPlaque® / FMC Corp., Marine Colloids Division, Rockland, Maine, USA 7 e 30% a 40% (v/v) de meio condicionado (obtido a partir de culturas de suspensões embrionárias de Dactilys glomerata L. de 3 a 4 semanas de idade filtrando o meio através de um filtro Nalgene^ de 0,2 jim estéril, tornando o meio 550 mOsm/KgF^O por adição de glicose, e esterilizando por filtração outra vez). Os pratos (ou caixas) são então colocados no escuro a uma temperatura constante de 28°C. Após 10 a 14 dias a agarose é cortada em cunhas e colocadas num cultura de contas (bead culture) como foi descrito por Shillito et al, (1983) usando 20 ml de meio de cultura de suspensão SH-45 com 3% (p/v) de sacarose por ml da cultura implatado em agarose original. Os pratos são colocados num agitador de plataforma e agitador a cer2 ca de 50 rpm com luz de 8^jE/m s. São formadas novas culturas em suspensão enquanto as colónias crescem para fora da agarose e libertam células para o meio líquido. As resultantes células cultivadas em suspensão são empratadas em meio SH-30 de ágar solidificado e empratado no escuro a 25°C até que se forme callus.

(b) Os protoplastos são cultivados como se descreveu no Exemplo 3(a) acima, exceptuando o meio de cultura que agora contem um adicional de 100 mg/litro de ácido O-acetil-salicílico.

(c) Os protoplastos são cultivados como se descreveu no Exemplo 3(a) acima, exceptuando o meio de cultura que agora contém um adicional de 30 mg/litro de ácido O-acetil-salicilico.

(d) Os protoplastos são cultivados como se descreveu nos

Exemplos 3(a) e 3(c) acima, exceptuando o meio de cultura que agora não contem meio condicionado.

Exemplo 4: Regeneração de plantas Dactilys glomerata L. a partir de callus derivado de protoplastos (a) Callus de Dactilys glomerata L. (obtido como se descreveu no Exemplo 3) derivado de protoplastos é cultivado no meio SH-30 solidificado, e subcultura cada duas semanas. Quaisquer embriões que se formem são removidos e empratados em meio de germinação (SHO) e postos à luz (45 ^uE/m s a 55 2 ^iE/m s). A germinação destes embriões ocorre em 1 a 4 semanas e as plântulas resultantes são colocadas num meio SH-O, à luz, para formarem sistemas de raízes. Elas são levadas para a estufa no sexto a décimo segundo nível de folhas, e robustecidas gradualmente.

(b) 0 callus (obtido como se descreveu no Exemplo 3) derivado de protoplastos é cultivado num meio SH-0 solidificado com 0,24% (p/v) de GelRite® à luz (45 ^íE/rn^s a 55 ^lE/m^s) e subcultivado cada duas semanas. As plântulas resultantes são colocadas numa mistura 1:1 dos meios SH-0 e OMS solidificado com uma combinação de 0,12% (p/v) de GelRite^ e de 0,4% (p/v) de ágar, àluz, para formarem sistemas de raízes. Elas são levadas para a estufa no sexto a décimo segundo nível de folhas, e rebustecidas gradualmente.

(c) São obtidas plântulas pequenas como se descreveu nas alíneas 4(a) e 4(b) acima mencionadas, e são colocadas num meio OMS solidificado com 0,8% (p/v) de ágar, à luz, para formarem sistemas de raízes. Elas são levadas para a estufas no sexto a décimo segundo nível de folha, e robustecidas gradualmente.

(d) São obtidas pequenas plântulas como âe descreveu na alínea

-50(d) São obtidas plântulas como se descreveu na alínea 4(a) acima mencionado e são colocadas numa mistura 1:1 de meios

SH-0 e OMS solidificada com uma combinação de 0,12% (p/v) fS) de GelRite^ e de 0,4% (p/v) de ágar, à luz, para formarem sistemas de raízes. Elas sao levadas para a estufa no sexto a décimo segundo nível de folhas, e robustecidas gradualmente.

Exemplo 5: Construção do plasmíde pCIB709, uma réplica de

E. coli que sustenta um gene resistente à higromicina exprimivel em plantas /~355/Hyg^r 7

A sequência codificante para o gene estrutural que põe em código a resistência à higromicina é isolada a partir de plasmídeo pLG90 (Gritz e Davies, 1983) num fragmento BamHI aproximadamente de 1150 bases de tamanho. O plasmídeo pLG90 está disponível em Linda Gritz / Applied Biotechnology, 80 Rogers St., Cambridge, Mass. 02141 7. Este fragmento BamHI é inserido no lugar BamHI do pCIB710 (Rothstein et ãL , 1987) para se construir o plasmídeo pCIB709. O plasmido pCIB710 contem as regiões reguladoras do CaMV /'vírus 35S do mosaico da couve-flor transcrito com as regiões promotoras e terminante separadas por um único lugar BamHI. 0 plasmido resultante, pCIB709, foi depositado com ATCC, número de acesso 40428 .

Antes de ser usado em transformação, o plasmido pCIB709 pode ser linearizado por tratamento com endonuclease de restrição PvuII. Este construto contém um gene (aminoglicósido fosfotransferase tipo IV) de resistência à higromicina conjuntamente com os sinais de expressões 5 ' e 3 ¹ do CaMV 35S transcrito do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) num plasmido pUC. A sequência de pCIB709 é dada na figura 7.

-51Exemplo 6: Transformação de protoplastos de Dactylis glomerata L. por meio de electroporação (a) Imediatamente após a purificação dos protoplastos, a electroporação é realizada de acordo com Shillito et al, (1985) usando o plasmido linearizado pCIB709 mostrado na figura

7. Os protoplastos são ressuspensos após a última lavagem a uma densidade de cerca de 7x10^ protoplastos/ml num tampão de electroporação (manitol 0,4M; MgC^ 6 mM). Os protoplastos são colocados em alíquotas de 0,7 ml em tubos de centrifugação de plástico de 10 ml. O ADN de plasmido (62 ul de água que contém pCIB709 restringido com PvuII e ADN / Sigma7 de timo de bezerro submetido a ultra-sons para dar concentrações finais de plasmido pCIB709 e de ADN de timo de bezerro de 10 ug/ml e de 50 ug/ml respectivamente) é adicionado aos tubos. Em seguida adiciona-se 0,38 ml de solução de polietileno-glicol (PEG) / 24% (p/v) de PEG 6000 em manitol 0,4M, MgC^ 30 mM, 0,1% (p/v) de MES (pH 5,6)_7 e a solução é gentilmente misturada. A solução de protoplastos é transferido para a câmara de um Electroporador Dialog^⁷ e 10 pulsos de voltagem inicial de 3250 V/cm e constante de decaimento exponencial de 10 ^iseg são aplicados em intervalos de 30 seg. A amostra é removida da câmara e é colocada numa caixa de Petri de 10 cm de diâmetro. São adicionados 10 ml de meio KM-8p contendo (r)

1,2% (p/v) de agarose SeaPlaque , os protoplastos são distribuídos dum modo igual através do meio, e deixa-se geleficar a agarose.

(b) O Exemplo 6(a) é repetido, exceptuando a voltagem inicial usada que é de 3500 V/cm.

(c) O Exemplo 6(a) é repetido, exceptuando ' a voltagem inicial usada que é de 4000 V/cm.

(d) O Exemplo 6(a) é repetido, exceptuando a voltagem inicial usada que é de 5000 V/cm.

-52(e) O Exemplo 6(a) é repetido, ι que é de 3000 V/cm.

(f) O Exemplo 6(a) é repetido, < que é de 2500 V/cm.

(g) Os Exemplos 6(a) a 6(f) são usado PEG de PM 4000.

(h) Os Exemplos 6(a) a 6(f) são usado PEG de PM 8000.

(i) Os Exemplos 6(a) a 6(h) são centração final de PEG se s (j) Os Exemplos 6(a) a 6(b) são do adicionalmente um choque Shillito et al, (1985) e em xceptuando a voltaqem inicial xceptuando a voltagem inicial repetidos, exceptuando que é repetidos, exceptuando que é repetidos, excepto que a contua entre 10% e 30% (p/v).

repetidos, excepto que é usatérmico como se descreveu em Potrykus et al, (1985).

Exemplo 7:

Transformação de protoplastos de Dactylis glomerata L. por tratamento com polietileno-qlicol (PEG ) (a) A transferência de genes directa mediada por PEG é realizada de acordo com Negrutiu et al, (1987). O ADN usado é o pCIB709 plasmido linearizado.

Os protoplastos são suspensos a seguir à última lavagem em manitol 0,5M contendo MgCl~ 15 mM a uma densidade de cerca de 2x10 protoplastos por ml. A suspensão de protoplastos é distribuída em alíquotas de 1 ml em tubos de centrifugação de plástico de 10 ml. E adicionado o ADN como se descreveu no Exemplo 6 acima mencionado, e em seguida é adicionado 0,5 ml de solução de PEG / 40% (p/v) de PEG 4000 em manitol 0,4M, CatNO^^ 0,lM, (pH 7,0)_7. As soluções são gentilmente misturadas e incubadas durante 30 minutos à

-53temperatura ambiente (cerca de 24°C) com agitação ocasional.

1,4 ml da solução de lavagem é então adicionada, e o conteúdo do tubo é gentilmente misturado. A solução de lavagem é constituida por manitol 87 mM, CaCl₂ 115 mM, MgCl₂ 27 mM, KC1 39 mM, Tris/HCl 7 mM e 1,7 g/litro de m-inositol, (pH 9,0). Quatro alíquotas adicionais de 1,4 ml de solução de lavagem são adicionados em intervalos de 4 minutos, com agitação após cada adição. O tubo é em seguida centrifugado a cerca de 60 g durante cerca de 10 minutos, e o sobrenadante é deitado fora.

Os protoplastos sedimentados são tomados em 10 ml de meio de cultura KM-8p e colocados numa caixa de Petri de 10 cm são adicionados 10 ml de meio KM-8p contendo 1,2% (p/v) de agarose (S\

SeaPlaque . Os protoplastos são distribuídos dum modo igual através do meio, e deixa-se geleficar a agarose.

(b) A transformação é levada a cabo como se descreveu no Exemplo 7(a) excepto o pH da solução de lavagem que é ajustada para 5,6.

(c) A transformação é levada a cabo como se descreveu no Exemplo 7(a) excepto o pH da solução de lavagem que é ajustado para 7,0.

(d) A transformação é levada a cabo como se descreveu nos Exemplos 7(a) a 7(c) excepto o PEG usado que é um PEG de PM 6000.

(e)A transformação é levada a cabo como se descreveu nos Exemplos 7(a) a 7(c) excepto o PEG usado que é um PEG de PM 2000 .

(f) A transformação é levada a cabo como se descreveu nos

Exemplos 7(a) a 7(c) excepto o PEG usado que é um PEG de PM 8000.

(g)

A transformação é levada a cabo como se descreveu nos

Exemplos 7(a) a 7(f) excepto que é usado adicionalmente um

-54choque térmico como se descreveu em Shillito et al, (1985) (h) A transformação é levada a cabo como se descreveu nos Exemplos 7(a) a 7(g) acima mencionados excepto o meio de lavagem que é constituído por NaCl 154 mM, CaClg 125 mM,

KC1 5 mM , glicose 5 mM, pH para 6,0 com KOH.

(i) A transformação é levada a cabo como se descreveu nos Exemplos 7(a) a 7(b) acima mencionados excepto o meio de lavagem que é constituído por CaClg 0,2M, 0,1% (p/v) de MES, pH para 6,0 com KOH.

(j) A transformação é levada a cabo como se descreveu nos Exemplos 7(a) a 7(g) acima mencionados excepto o meio de lavagem que é constituído por CaClg 0,2M, Tris/HCl 7 mM, pH para 9,0 com KOH.

Exemplo 8: Transformação de protoplastos de Dactylis glomerata L. por electroporação ou por tratamento com PEG (a) A transformação é levada a cabo como se descreveu nos Exemplos 6 e 7 excepto que o ADN de plasmido pCIB709 é restringido com enzima de restrição Bgll antes de ser usado para a transformação.

(b) A transformação é levada a cabo como se descreveu nos Exemplos 6 e 7 excepto que o ADN de plasmido pCIB709 é restringido com enzima de restrição HindIII antes de ser usado para a transformação.

-55Exemplo 9: Transformação de protoplastos de Dactylis glomerata L. por electroporação ou por tratamento com

PEG

A transformação é levada a cabo como se descreveu nos Exemplos 6, 7 ou 8, excepto que os protoplastos são tratados a 45°C durante cerca de 5 minutos anteriormente à distribuição dos alíquotas nos tubos para transformação ou depois da distribuição dos alíquotas, e antes da adição do PEG.

Exemplo 10: Selecção de colónias transformadas (a) Os pratos de cultura (caixas de Petri) que contêm os protoplastos são incubados durante 10 dias no escuro a cerca de 25°C e em seguida cortado em 5 fatias iguais para culturas de contas (bead culturas) (Shillito et al, 1983). 4 das fatias são colocadas, cada uma delas, em 20 ml de meio de cultura SH-45 com 4g/litro de hidrolisato de caseína e 20 jig/ml de higromicina Β. A quinta fatia é posta em 20 ml do mesmo meio mas sem higromicina B como um controlo não seleccionado. Após 4 a 5 semanas as putativas colónias de células derivadas de protoplastos transformadas que crescem em higromicina B são cortadas fora da agarose e colocadas numa caixa de Petri de 19 mm com 2 ml de meio SH-45 líquido que contém 20 ^ug/ml de higromicina Β, o qual é agitado a cerca de 50 rpm num agitador orbital. Após 4 a 5 semanas todas as colónias que crescem até se fazerem novas suspensões são transferidas para balões erlenmeyer de 125 ml e desenvolvidas de maneira semelhante à cultura de suspensão mãe, excepto que são incluídas no meio 20 ^tg/ml de higromicina B.

As novas suspensões são subcultivadas cada 1 a 3 semanas usando o meio SH-45 contendo 4g/litro de hidrolisato de caseína e 20 jng/ml de higromicina B. As célu-

las obtidas a partir destas suspensões são também empratadas em meio SH-30 solidificado que contem 20 ^íg/ml de higromicina B e incubadas a cerca de 25°C no escuro. Os calli desenvolvidos a partir das células dos pratos são subcultivadas cada duas semanas em meio fresco. As células que crescem na presença de higromicina B presumem-se ser transformantes.

(b) A selecção é levada a cabo como se descreveu no Exemplo 10(a) excepto que as colónias de células derivadas de protoplastos que crescem em higromicina B contida no meio são colocadas em lâminas de ágar, de meio SH-30 contendo 20 ^jg/ml de higromicina B e incubadas a cerca de 25°C no escuro.

Exemplo 11: Regeneração de plantas Dactylis glomerata L.

transformadas

As plantas são regeneradas a partir de callus transformado como se descreveu no Exemplo 4 para material não transformado.

Exemplo 12: Extracção de ADN de callus e de tecido de folha

O ADN é extraído de callus e de folhas de plantas regeneradas usando uma modificação do método CETAB (Roger e Bendich , 1985). Este método é descrito aqui para Dactylis glomerata L. mas pode ser usado eficazmente em tecidos de outra qualquer planta Pooideae. Outros métodos comumente usados para extracção de ADN também podem ser usados para se obter ADN a partir deste material .

e em meio SH-30 é mioda até um fino fariz com pilão.

O callus desenvolvido em meio SH-0 congelado em neve carbónica, e em seguida pó à temperatura de azoto liquido num almoO pó resultante é transferido para um tubo

de centrifugação de polipropileno de 5 ml pré-arrefecido à temperatura de azoto líquido (2 g de pó por tubo). São tomadas precauções para que o pó nunca se derreta durante o procedimento. 0 pó é seco por congelação durante a noite, e em seguida distribuído por tubos Eppendorf de 2,2 ml, 0,5 ml de pó por tubo. Adiciona-se a cada tubo 1 ml de tampão de extraeção CETAB, e eles são inventados a 60°C durante cerca de 30 a 45 minutes. Deixam-se arrefecer os tubos até à temperatura ambiente, e adiciona-se 1 ml de clorofórmio/álcool iscanílico (24:1) . Após a mistura, a solução é centrifugada durante cerca de 30 segundos a 3000 rpm num centrifugador Eppendorf, e a fase aquosa é removida para um tubo fresco. Adiciona-se 1/10 de volume de solução de CETAB a 10% (p/v), e é repetida a extraeção de clorofórmio. A fase aquosa é removida para um tubo fresco, e é adicionado um volume igual de tampão de precipitação. O ADN e o ARN precipitam à temperatura ambiente. Após um período de cerca de 30 minutos a 1 hora para permitir a precipitação, os tubos são centrifugados outra vez, e o sobrenadante é deitado fora. Os precipitados são ressuspensos em tampão TE de sal elevado (ver abaixo) a 65°C durante cerca de 30 minutos.

Tampão de extracção CETAB: 1% (p/v) de CETAB

Tris pH 8,0 (50mM) EDTA (10 mM)

NaCl (0,7 M)

0,5% (p/v) de PVP Peso Mol. 360.000 / PVP: polivinilpirrolidina7

CETAB a 10%:	10% NaCl	(p/v) de (0,7 M)	CETAB
Tampão de precipitação:	1% (p/v) de	CETAB
	Tris	pH 8,0	(50 mM)
	EDTA	(10 mM)
TE de sal elevado:	Tris	pH 8,0	(10 mM)
	EDTA	(1 mM )
	NaCl	(1 M)
Tampão TE:	Tris	pH 8,0	(10 mM)
	EDTA	(1 mM )
TE 1/10:	Tris	pH 8,0	(1 mM )
	EDTA	(0,1 mM	)

Exemplo 13: Purificação do ADN

ADN preparado como no Exemplo 12 ou qualquer outro método adequado pode ser purificado por qualquer dos numerosos métodos conhecidos. Exemplos de métodos adequados incluem mas não se limitam a: centrifugação gradiente Cscl brometo de etídio, tratamento com fenol/clorofórmio, e purificação num passo gradiente sem brometo de etídio. Tais métodos são descritos em Maniatis et al, (1982).

(a) Purificação por tratamento de fenol/clorofórmio

Os ácidos nucleicos do Exemplo 12 acima mencionado são precipitados com 2 volumes de etanol frio o (-20 C). Os tubos são centrifugados durante 2 a 3 minutos a 5000 g. O sobrenadante é removido e o precipitado lavado com etanol a 70% e etanol a 100%. Os ácidos nucleicos são parcialmente secos numa corrente de ar de um banco de fluxo estéril. O ADN é dissolvido durante a noite em 200 jul de tampão TE 1/10. A solução de ADN é transferida para um tubo de centrifugação Eppendorf e são adicionados 10 |il de uma solução a 2 mg/ml de ARNase (fervida previamente para desactivar a ADNase) e os tubos são incubados a 37°C durante 1 hora. Adicionam-se 0,25 volumes de NaCl e o ADN é precipitado por adição de 0,4 volumes de PEG a 30% (Peso Mol. 6000 a 8000) contendo NaCl 1,5M e mantendo o tubo de pé a -20°C durante cerca de 1 hora.

Os tubos são centrifugados durante cerca de 5 minutos, o sobrenadante é removido e o precipitado é lavada com etanol absoluto frio. Após breve secagem uma corrente de ar de um banco de fluxo estéril, o pelete é ressuspenso em 0,3 ml de tampão TE. A solução é extractada com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) equilibrzdo com tampão TE, centrifugada durante 30 s num Eppendorf de centrifugação, e a fase aquosa é transferida para um tubo fresco. A solução é extractada com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), centrifugada durante 30 s, e a fase aquosa removida para um tubo fresco.

A extracção de clorofórmio é repetida. É adicionado 1/10 de

-60volume acetato de sódio 3M, seguido por 2 volumes de etanol absoluto arrefecido em gelo para o ADN precipitar. O precipitado é recolhido por centrifugação, e lavado com etanol a 70% e a 100%, brevemente seco numa corrente de ar estéril, e dissolvido em tampão TE suficiente para se obter uma solução de 0,25 ^jg/ml a 1 |ig/ml para uso em análise Meridional.

(b) Purificação num passo gradiente sem brometo de etídio

Os ácidos nucleicos num passo gradiente de CsCl que consiste numa camada de fundo de CsCl 5,7M em tampão TE, e numa camada de cima de CsCl l,0M em TE.

Os ácidos nucleicos são incorporados na camada de cima. Os tubos que contém o gradiente são centrifugados durante a noite num rotor oscilante (e.g. Beckmann SW 50,1 a 45000 rpm). O ADN é recolhido da região da interface, e o ARN pode ser recuperado do fundo do tubo. O ADN é diluido com 2 volumes de água, e precipitado com 2 volumes de etanol arrefecido em gelo como no Exemplo (a) acima mencionado. Os precipitados são ressuspensos em tampão TE, precipitados de novo com etanol, e usados para análise Meridional..

Exemplo 14: Detecção de sequências de ADN estranhos no genoma de Dactylis glomerata L. transformada por análise Meridional

A análise de hibridização Meridional é essêncialmente realizada de acordo com Maniatis et al, ( 1982)

O ADN de Dactylis glomerata L. / purificado de acordo com os Exemplos 13 (a) e 13(b)_7 com BamHI enzima de restrição e são carregadas por pista 5 ug dela, e prossegue numa geleia de agarose a 1% para separar o ADN na base dos tamanhos de fragmento. A geleia é colocada em HCl 0,25M durante cerca de 20 minutos e em seguida limpa com ^0, e depois colocada em NaOH 0,4M durante 30 minutos. O ADN é transferido durante a noite para GeneSeren Plus® (nen Res. Products, NQ Cat. NEF 976, Lot.

-61NS 330GP62) de maneira normal (como descrito no folheto de instruções fornecido com o produto) usando NaOH 0,4M como tampão de transferência. Após transferência durante a noite, o filtro é removido, lavado com 2xSSC (NaCl 0,3M; citrato de Na 0,03) durante cerca de 5 minutos, e em seguida seco ao ar.

A mancha é pré-hibridizada durante 4 horas a 65°C com tampão que contém lOg/litro de Albumina de Soro Bovino (Fat Free Sigma, N° Cat. A-4503), 7% de SDS, NaEDTA 1 mM, e tampão de Fosfato de sódio 0,52M pH 7,0. Uma prova de ensaio marcado radioactivamente é preparada pelo método iniciador aleatório usando o conjunto de marcação IBI Prime Time ou qualquer outro método adequado, e separando a prova de ensaio dos nucleotídos numa coluna de giro. O ADN da prova de ensaio consiste num fragmento de pCIP709 que contém a região proitiotora 35S e a região de gene estrutural aminoglicósido fosfotransferase tipo IV. Deixa-se processar a hibridização durante a noite a 65°C. A mancha é em seguida lavada em quatro lavagens usando tampão de lavagem SW, sendo as duas últimas lavagens levadas a cabo a 65°C. A mancha é em seguida lavada durante 2 horas em 0,2xSSC contendo SDS a 1% e NaEDTA 5mM a 65°C. A mancha húmida é envolvida em filme de alimentação (Saranwarp^ou qualquer outro filme adequado, e exposto a um filme raio-X (Kodak X-Omat AR filme, Eastman Kodak, Rochester, NY 14650,

Νθ Cat. 165 1454). Na revelação, há hibridização específica clara da prova de ensaio para ADN que provem de callus e de plantas transformadas com pCIP709. O ADN de pCIP709 é claramente integrado num ADN de peso molecular elevado dos transformantes.

Tampão de hibridização SW: 1% (p/v) de Albumina de

Soro Bovino (livre de gordura )

Fosfato de sódio 0,52M pH 7,0 7% (p/v) de SDS NaEDTA 1 mM

Solução de lavagem: Fosfato de sódio 0,04M pH 7,0

NaEDTA 1 mM

1% (p/v) de SDS

NaCl 0,125 M

-62Exemplo 15: Crioconservação de culturas de callus/de Dactylis glomerata L (1) É colocado callus em crescimento activo de Dactylis glomerata L. no meio SH-0 líquido. Tipicamente , coloca-se 0,5 g a 1 g de callus em 20 ml de meio. O recipiente que contem o callus é gentilmente agitado e redemoinhado, para se romperem e dispersarem os grupos de callus. A mistura é em seguida arrefecida em gelo. A solução crioconservante é também arrefecido em gelo.

(2) Um volume igual de solução crioconservante P é adicionada durante um período de 5 minutos, e a mistura é mantida em gelo durante uma hora. Durante este tempo, são distribuídos alíquotas de 1,0 ml para frascos de crioconservação de plástico de 1,8 ml pré-arrefecidos e etiquetados (Vangard Cryos cryogenic vials, Sumitomo Bakelite Co. Ltd. Japan, N°. Cat. MS 4502) ;e mantidos em gelo. A solução crioconservante P é constituída por Glicerol 1M, L-Prolina 1M, Dimetilsulfóxido 2M (DMSO, Sigma, Cat. No. D2650, Lote NS 57F-8816)em água, pH 5,6, e é preparado de fresco antes de cada uso (a mistura glicerol/prolina/água pode ser armazenada congelada).

(3) Apos as células terem sido expostas à solução crioprotectora durante um período de cerca de 1 hora, os frascos são imersos à superfície de um banho líquido que se encontra à temperatura de 0°C. O banho pode ser constituído por etanol ou qualquer outro refrige-

-63rante adequado como se conhece na arte. O banho está equipado com um dispositivo de agitação para manter o refrigerante misturado, e é ligado a um aparelho que pode refrigerar o refrigerante a uma velocidade controlada .

(4) Uma vez os frascos no refrigerante, a temperatura é reduzida a uma velocidade de aproximadamente 0,5°C/ /minuto. Quando a temperatura atinge os -40°C, os frascos são mergulhados em azoto líquido e em seguida armazenados em azoto líquido, quer no próprio líquido quer no vapor acima dele , a uma temperatura que não exceda os -100°C.

Exemplo 16: Crioconservação de células de cultura de suspensão embrionária de Dactylis glomerata L (a) (1) Uma cultura de suspensão de Dactylis glomerata L. tomada 2 a 10 dias após a subcultura é arrefecida em gelo. A solução crioconservante é normaimente também arrefecida em gelo. 0 crioconservante consistetfe glicerol 1M, L-prolina 1M, dimetilsulfóxido (DMSO) 2M em água, pH 5,6. A solução crioprotectora ó preparada de fresco antes de cada uso ou a mistura glicerol/prolina/água pode ser armazenada congelada.

(2) 0 crioconservante é adicionado à suspensão durante um período de 5 minutos. As células são deixadas no crioconservante em gelo durante uma hora. Durante ou depois deste tempo, são distribuídos alíquotas por frascos de crioconservação e mantidos em gelo. Os frascos são em seguida tratados como acima se descreveu para o material do callus no Exemplo 15.

(b) A crioconservação é levada a cabo como se descreveu no Exemplo 16(a) excepto que o crioconservante no

passo (1) consiste de Glicerol IM, Sacarose IM e DMSO 2M em água a pH 5,6.

Exemplo 17t Recuperação das culturas em crescimento de Dactylis glomerata L Crioconservadas (a) (1) Um frasco preparado como no Exemplo 15 é removido do azoto liquido.

(2) 0 frasco é descongelado deixando-o à temperatura ambiente até todo o gelo ter fundido.

(3) Os conteúdos do frasco são espalhados num meio de cul(6) tura SH-0 solidificado com GelRite*¹⁷ ou ágar. Tipicamente, 0,5 ml de cultura descongelada é espalhada em cada caixa de Petri de 10 cm de diâmetro contendo 30 ml a 50 ml de meio. O meio sólido é vertido num plano inclinado ou numa cavidade, é esvaziado do meio àvolta da sua superfície com o fim de ajudar a drenagem do crioconservante remanescente para fora das células.

(4) O material é incubado no meio, no escuro, a 27°C. O desenvolvimento é prontamente manifesto em 1 a 4 semanas. O callus é em seguida subcultivado como se descreveu acima para o callus embrionário normal.

(b) A recuperação de culturas em crescimento de Dactylis glomerata L. crioconservadas é levado a cabo como se descreveu no Exemplo 17(a), excepto que no passo (2) o frasco é descongelado rápidamente agitando-o num banho de água a cerca de 40°C até todo o gelo ter fundido .

Exemplo 18: Crioconservação de callus de Zea mays

A crioconservação de callus de Zea Mays em desenvivi-

mento activo é levado a cabo como se descreveu para a Dactylis glomerata L. no Exemplo 15.

Exemplo 19: Crioconservação de células de culturas de suspensão embrionárias de Zea mays

A crioconservação de células de culturas de suspensões embrionárias de Zeamays é levada a cabo como se descreveu para a Dactylis glomerata L no Exemplo 16(a) e (16)b.

Exemplo 20: Recuperação de culturas em crescimento,de Zeamays crioconservadas

A recuperação de culturas ém desenvolvimento de crioconservadas é levado a cabo como se descreveu para a Dactylis glomerata L. nos Exemplos 17(a) e 17(b).

Literatura

1. Abdullah, R., et al., Bio/Technology, 4 (1986) 1087-1090;

2.	Abel, P.P.,	et	al., Science, 233	(1986)	7 38;
3.	Adams, T.L.	, et	al., Plant Cell	Reports,	2 (1983)	165-168;
4.	Ahloowalia,	B. S	. , Crop Science,	15 (1975) 449-452	>
5.	Ahloowalia,	B.S	. , Handbook of Plant Cell	Culture,	Ammirato, et al

(eds) Macmillan, NY, (1984) 91-125;

6. Barton, K.A., et al., Plant Physiol., 85 ( 1987) 1 103-1 109;

7. Birk, Y., et al., Biochim. Biophys. Acta, 67 (1963) 326-328;

8. Bright , S.W.J. and Johnes, M.G.K., Cereal Tissue and Cell Culture (1985) 204-230, Nijoff, M./Junk, W. Dr., Dordrecht;

9. Brovn, W.V., Phytomorphology, I0 (1960) 215-223;

10. Cocking, E.C., and Davey, M.R., Science, 236 ( 1987 ) 1259-1262;

11. Froim, M.E., et al., Nature, 319 (1986) 791-793;

12. Gar.borg, 0. et al., Exp. Cell Res., 50 ( 1 968) 1 51-1 58;

13. George, E-E., et al. (eds), Exgetics Ltd., Edington, Westbury, Wiltshire, England (1987);

14. Gray, D.J., et al., Plant Cell Tissue Organ Cult., 4 (1985) 123-133;

15. Gritz, L., and Davis, J., Gene, 2 5 ( 1 983) 1 79-1 88;

16. Guiseley and Renn, The Agarose Monograph, Marine Colloids Division EMC Corp. ( 1975);

17. Hammond et al., J. Biol. Chem., 259 (1984) 9833-9890;

18. Hanning, G.E., et al., Theor. Appl. Genet-, 63 ( 1982) 1 55-1 59;

19. Heide, Physiol. Plantarum, 70 ( 1 987) 523-529;

20. Herrera-Estrella L., et al., Nature, 310 (1984) 115

21. Hilder, V.A., et al., Nature, 330 (1987) 160-163;

22. Howard, et al., Planta, 170 (1987) 535

23. Itakura, K., et al., J. Am. Chem. Soc., 9J (1975) 7327;

24. Kao, K.N., et al., Planta, 126 (1975) 105-110;

25. Kasperbauer, M.J., et al., Crop Science, 1 9 ( 1 979) 457-460;

26. Krans, J.V., et al., Crop Science 22 (1982) 1193-1197;

27. Lipke, H., et al., J. Agr. Food Chem., 2_ ( 3 954) 410-41 4;

28. Lo, P.F., et al., Crop Science, 20 (1980) 363-367;

29. Loerz, H., et al., Mol. Gen. Genet., I99 (1985) 178-182;

30. Lu, Ch., et al., 2. Pflanzenphysiol., 104 (1981) 311-318;

-6731. Luehrs, R., and Loerz, H., Theor. Appl. Genet., 75 ( 1 987) 1 6-25;

32. Maniatis et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory (1982);

33. Mettler, I.J., British Patent Application GB-2,140,822;

34. Morelli, et al., Nature, 315 (1985) 200;

35.	Murashige, T.,	et	al. , Physiol.	Plant. , ( 1 962) 473-	497;
36.	Negrutiu, I.,	et al., Plant Mol.	Biology, 8 (1987)	363-373;
37.	Odell, J.T. et	al.	, Nature, 313	(1985) 810;
38.	Paszkou-ski, J.	, et	al., The EMBO	Journal, 3(1984)	2717-2722;
39.	Paszkowski, J.	, et	al. , European	Patent Application	EP 0,164,575;
40.	Pennica, P., et al	., Nature, 301	(1983) 214;

41. Potrykus, I., et al., Theor. Appl. Genet., 54 (1979) 209-214;

42. Potrykus, I., et al., Mo. Gen. Genet., 199 (1985) 183-188;

43.	Randolph,	L.F., J.	Agric. Research, 53 (1936) 881-916;
44.	Rhodes , C.	, et al.	, Biotechnology, 6 (1988) 56-60;
45.	Roger and	Bendich,	Plant Mol. Biology, 5 (1985) 69-76;
46.	Rothstein,	S . , et	al. ,	Gene, 53 (1987) 153-161.
47.	Ryan, C . ,	et al.,	Ann.	Rev. Plant Physiol., 24 (1973) 173-196;
48.	Shillito,	R.D., et	al.	, Plant cell Reports, 2 (1983) 244-247;
49.	Shillito,	R.D., et	al.	, Bio/Technology, 3 (1985) 1099-1103;
50.	Shillito,	R.D., et	al	, European Patent Application EP-0,129,688;
51 .	Shoffl F.,	et al. ,	Plant Cell Environ. , cited in Willmitzer L. ,
	Trends in	Genetics	, A,	13 (1988)
52 .	Skene , K.G	•.M. , et	al. ,	Zeitschr. PFlanzenziichtung, 90 ( 1 983) 1 30—
53.	Spena, et	al., EMBO J.	, 4 (1985) 2736
54.	Stephien,	P., et al.,	Gene, 24 (1983) 281-297;

55. Schenk, R.U. and Hildebrandt, A.C., Can. J. Bot., 50 (1972) 199-204;

56. Vaeck, Μ., et al., Nature, 328 (1987) 33-37;

57. Vasil, λ'., et al., 2. Pf lanzenphysiol. , 1 1 1 ( 1983) 233-239;

58. Wienand, U-, et al., Mol. Gen. Genet., 182 (1981) 440-444;

59. Withers, L.A., Plant Tissue Culture and its Agricultural Application;

60. Withers, L.A., and Alderson, P.G. (eds), University Press, Cambridge, England (1986) 261-276;

61. Yamada, Y., et al., Plant Cell Reports, 5 (1986) 85-88;

Claims (53)

1. lê. - Cultura de células embrionáveis de plantas gramineas da subfamilia Pooideae a partir da qual podem ser isolados protoplastos, caracterizado por os protoplastos regenerarem paredes de células, dividirem-se e formarem callus capaz de ser regenerado em plantas.
2. 2â. - Cultura de células embrionáveis de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por as referidas plantas regeneradas serem plantas férteis.
3. 3ã. - Cultura de células embrionáveis de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por as referidas plantas Pooideae serem ervas ou cereais de grão pequeno .
4. 4â. - Cultura de células embrionáveis de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por as ervas serem escolhidas de entre os géneros Poa, Festuca, Lolium, Bromus, Trisetum, Agostis, Phleum, Alpecurus e Dactilis.
5. 5â. - Cultura de células embrionáveis de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por os cereais de grão pequeno serem escolhidos de entre os géneros Avena, Triticum , Secale e Hordeum.
6. 6â. - Protoplasto ou célula de planta de plantas gramineas da subfamilia Pooideae caracterizado por ser capaz de ser regenerado em plantas.
7. 7â. - Protoplasto ou célula de planta de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por as referidas plantas regeneradas serem plantas férteis.
8. 8â. - Protoplasto ou célula de planta de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por ter in-

   -69corporado estávelmente no seu genoma DNA exógeno.
9. 9ã. - Protoplasto ou célula de planta de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por ter estávelmente incorporado no seu genoma DNA exógeno exprimível em plantas.

   lOâ. - Protoplasto ou célula de planta de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por ser derivado de culturas de células.

   llâ. - Protoplasto ou célula de planta de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ser derivado de suspensões de células embrionáveis.
10. 12â. - Protoplasto ou célula de planta de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por ser derivado de ervas ou cereais de grão pequeno.
11. 13â. - Protoplasto ou célula de planta de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por os cereais de grão pequeno serem escolhidos de entre os géneros Avena, Triticum, Secale e Hordeum.
12. 14â. - Callus derivado de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, caracterizado por ser regenerado a partir de protoplastos ou de células de planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13 e ser capaz de ser regenerado em plantas.
13. 15ã. - Callus de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por as referidas plantas regeneradas serem plantas férteis.
14. 16â. - Callus de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por as plantas Pooideae serem ervas ou cereais de grão pequeno.
15. 17i. - Cultura de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por os cereais de grão pequeno serem escolhidos de entre os géneros Avena, Triticum, Secale e Hordeum.

    185. _ Cultura de células derivadas de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, caracterizado por ser regenerada a partir de protoplastos ou de células de planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13 e ser capaz de ser regenerada em plantas.
16. 19θ. - Cultura de células de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por as referidas plantas regeneradas serem plantas férteis.
17. 20ã. - Cultura de células de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por as plantas Pooideae serem ervas ou cereais de grão pequeno.
18. 21â. - Cultura de células de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por os cereais de grão pequeno serem escolhidos de entre os géneros Avena, Triticum, Secale e Hordeum.
19. 22â. - Propágulos de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, caracterizados por serem regenerados a partir de uma cultura de células embrionárias de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
20. 23ã. - Propágulos de plantas gramíneas de subfamilia Pooideae, caracterizados por serem regenerados a partir de protoplastos óu células de plantas de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13.
21. 24θ. - Propágulos de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, caracterizado por serem regenerados a partir de um callus de acordo com qualquer uma das rei71 vindicações 14 a 17.
22. 25®. - Propágulos de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, caracterizados por serem regenerados a partir de uma cultura de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21.
23. 26^a. - Propágulos de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizados por as referidas plantas serem plantas férteis.
24. 27^a. - Propágulos de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizados por compreenderem protoplastos ou células de plantas contendo estavelmente incorporado nos seus genomas DNA exógeno.
25. 28^a. - Propágulos de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, de acordo com a reivindicação 27, caracterizados por o DNA exógeno estavelmente incorporado ser exprimivel em plantas ou células de plantas.
26. 29^a. - Propágulos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizados por consistirem de material da planta capaz de ser multiplicado sexuada ou assexuadamente, e in-vivo ou in-vitro.
27. 30^a. - Propágulos de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizados por consistirem de protoplastos, células, calli tecidos, órgãos, zigotos, embriões, pólen ou sementes obtidas de plantas Pooideae transgénicas.
28. 31^a. - Progénie caracterizada por ser a progénie das plantas de qualquer uma das reivindicações 22 a 28.
29. 32Q. - Método de produção de protoplastos de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae, protoplastos esses que são capazes de ser regenerados em plantas caracterizado por compreender:

    o isolamento de Pooideae, tecido de partes adequadas de plantas (b) a cultura deste mação de callus tecido num meio capaz de induzir a forembrionário e de embriões, (c) periodicamente a subcultura de callus embrionário e de embriões num meio fresco capaz de sustentar uma proliferação contínua, (d) o isolamento de grupos de células embrionárias após 0 a 500 transferências, e a remoção adequadas de paredes celulares com misturas de enzimas e o isolamento dos protoplastos resultantes.
30. 33ã. - Método de acordo com a reivindicação 32 caracterizado por protoplastos Pooideae serem capazes de se regenerarem em plantas férteis.
31. 34ã. - Método de acordo com a reivindicação 32 caracterizado por o tecido do passo (a) ser isolado das partes básicas de folhas interiores, jovens, embriões sexualmente imaturos, inflorescências imaturas, sementes maduras ou tecidos de sementes de plantas Pooideae.
32. 35ã. - Método de acordo com a reivindicação 34 caracterizado por o tecido do passo (a) ser isolado a partir das folhas interiores mais jovens.
33. 36ã. - Método de acordo com a reivindicação 34 caracterizado por o isolamento de grupos de células embrionárias ser levado a cabo após 0 a 100 transferências.
34. 37 ^a. - Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por o silamento de grupos de células embrionárias ser levado a cabo após 3 a 50 transferências.
35. 38^a. - Método de produção de culturas de células de uma planta gramínea da subfamilia Pooideae, cultura de células essa que é capaz de ser regenerada em plantas, caracterizado por compreender:

    (a) a cultura num meio de cultura adequado de protoplastos ou de células de plantas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, até eles formarem colónias de células, e (b) a cultura das referidas colónias de células ou de suas partes num meio adequado para promover a formação de cultura de células, e

    c) o isolamento da cultura de células resultante.
36. 39^a. - Método de produção de uma cultura de células de uma planta gramínea da subfamília Pooideae, de acordo com a reivindicação 38, cultura de células essa que é capaz de ser regenerada em plantas, caracterizado por compreender:

    (a) a cultura dum meio de cultura adequado de protoplastos ou de células de plantas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, durante um tempo suficiente para promover a formação de culturas até elas formarem colónias de células, e (b) o isolamento das culturas de células resultantes.
37. 40^a. - Método de produção de uma cultutra de células de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 ou 39, caracterizado por a referida cultura de células ser capaz de se regenerar em plantas férteis.
38. 41ê. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40 caracterizado por a cultura de células ser uma cultura èm suspensão.
39. 42â. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40 caracterizado por a cultura de células ser uma cultura de callus.
40. 43ã. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 ou 39 caracterizado por o passo (a) ser levado a cabo na presença de agarose como um agente de solidificação.
41. 44ã. - Método de acordo com a reivindicação 43 caracterizado por compreender a liquefacção do meio solidificado de agarose do passo (a) ou a sua segmentação, transferindo o meio de agarose liquefeito ou os segmentos do meio de agarose paraum meio nutriente líquido, e a cultura até que sejam formadoas colónias de células.
42. 45θ. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 ou 39 caracterizado por as partes das colónias de células no passo (b) serem células libertadas a partir de colónias de células.
43. 46â. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 ou 39 caracterizado por os protoplastos ou células conterem estávelmente integrados nos seus genomas DNA exógeno.
44. 47â. - Método de acordo com a reivindicação 46 caracterizado por o DNA exógeno integrado ser exprimivel em células de plantas.
45. 48^a. - Método de regeneração de plantas gramíneas da subfamilia Pooideae a partir de callus, caracterizado por compreender:

    (a) a cultura de callus de plantas Pooideae, de acordo com a reivindicação 14, num meio que é capaz de induzir a formação de embriões até os embriões estarem formados.

    (b) a cultura de embriões num meio adequado que os induza à maturação e à germinação, e (c) a cultura das plântulas resultantes até estarem suficientemente desenvolvidas para serem transferidas para o solo para formarem plantas maduras.
46. 49^a. - Método de regeneração de plantas gramíneas férteis da subfamilia Pooideae a partir de callus, caracterizado por compreender:

    (a) a cultura de callus de plantas Pooideae, de acordo com a reivindicação 15, num meio capaz de induzir a formação de embriões até que os embriões estejam formados, (b) a cultura de embriões num meio adequado para induzir à sua maturação e germinação, (c) a cultura das plântulas resultantes até estarem suficientemente desenvolvidas para serem transferidas para o solo para formarem plantas maduras, e (d) a obtenção de uma semente resultante de polinização controlada ou aberta.
47. 50^a. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 ou 49, caracterizado por as células de plantas que formam callus conterem DNA exógeno estavelmente integrado no seu genoma.
48. 51^a. - Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado por o DNA exógeno ser exprimívei em células de plantas.
49. 52^a. - Método de produção de gramíneas transgénicas da subfamilia Pooideae, caracterizado por compreender :

    (a) a transformação de protoplastos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 13, com DNA exógeno usando métodos de transformação conhecidos na arte, (b) a cultura de protoplastos transformados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 ou 39, e (c) a regeneração de plantas completas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 ou 49.
50. 53^a. - Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por o referido DNA exógeno compreender um ou mais genes quiméricos que proporcionam os protoplastos da planta transformada, tecidos derivados de protoplastos e finalmente plantas derivadas de protoplastos com propriedades valiosas.
51. 54^a. - Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por o referido DNA exógeno compreender sequências de DNA não codificadas exibindo funções reguladoras.
52. 55^a. - Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por um método directo de transferência de genes ser usado no passo (a) para a transformação de protoplastos.
53. 56⁸ .

    Método para a crioconservação de culturas de células embrionárias, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, incluindo culturas em suspensão e culturas de callus de plantas gramíneas, caracterizado por compreender:

    (a) a dispersão de culturas de células ou de callus em suspensão em crescimento activo num meio de cultura líquido adequado, (b) o arrefecimento desta cultura a cerca de 0°C a 5°C, (c) a mistura aproximadamente à mesma temperatura da referida cultura pré-arrefecida com uma solução aquosa crioprotectora adequada, (d) o arrefecimento da mistura resultante a uma velocidade de cerca de 0,01°C a cerca de 20°C por minuto para uma temperatura entre cerca de -20°C e cerca de -60*C, (e) o congelamento súbito da mistura pré-arrefecida ou azoto líquido ou ar líquido, e (f) o armazenamento da mistura congelada a uma temperatura inferior a -100*C.

    Lisboa, 6 de Março de 1989

    J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.