PT98071B - Processo para a preparacao de plantas de milho transgenicas ferteis com gene estranho - Google Patents

Processo para a preparacao de plantas de milho transgenicas ferteis com gene estranho Download PDF

Info

Publication number
PT98071B
PT98071B PT98071A PT9807191A PT98071B PT 98071 B PT98071 B PT 98071B PT 98071 A PT98071 A PT 98071A PT 9807191 A PT9807191 A PT 9807191A PT 98071 B PT98071 B PT 98071B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
protoplasts
plants
gene
dna
protoblasts
Prior art date
Application number
PT98071A
Other languages
English (en)
Other versions
PT98071A (pt
Inventor
Denes Dudits
Gunter Donn
Sandor Morocz
Janos Nemeth
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8204128&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT98071(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of PT98071A publication Critical patent/PT98071A/pt
Publication of PT98071B publication Critical patent/PT98071B/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE PLANTAS DE MILHO
TRANSGENICAS FÉRTEIS COM GENE ESTRANHO
A requerente supõe que a regeneração de protoplastos em sementes férteis está dependente de um variado número de factores, como por exemplo: o tipo genético, o estado fisiológico das células doadoras e as consições de cultivo.
No pedido de patente de invenção europeia 90 111 945.3 [ título: Improved Zea Mays (L.) genotypes with capability of long term, Highly Efficient Plant Regeneration: apresentado simultaneamente £ na HOE 90/F 184, está descrito um novo tipo genético de milho a partir do qual se podem produzir protoplastos reproduzíveis em curto espaço de tempo que podem regenerar férteis sem anomalias.
Os novos tipos genéticos de milho diferenciam-se dos tipos genéticos regeneráveis descritos antes, pelo que, partindo de embriões imaturos do meio alimentar isento de hormonas onde se desenvolvem germens a nível dos rebentos, se revela uma auxina-autotrófica embriogénica no caule. Este caule é susceptível de ser subcultivado por um longo período de tempo (superior a 12 meses) em meios isentos de hormonas, tomando em consideração as suas propriedades de embriogénese. Nestas condições de cultura, revelam-se embriões totalmente desenvolvidos que, duma maneira geral, se diferenciam espontaneamente. Além disso, aparecem embriões adventícios em grande número, principalmente num meio de contéudo de sacarose elevado (6-9
-2% em média). Através da substituição dos meios alimentícios (redução do conteúdo de sacarose para 2-3 % e adição de 1-3 mg/1 de ácido-2,4 Dicloro-fenoxi-acético (2,4-D, isto é Dicamba), consegue-se produzir caules macios e granulosos constituídos por um agregado de células embriogénicas que nos levam a crer serem caules do tipo II. Estes caules do tipo II podem, em meios líquidos tais como uma cultura de células em suspensão, ser subcultivados e proporcionam o isolamento para os protoplastos totipotentes. Os protoplastos podem, por exemplo, ser utilizados para a transformação genética e podem, nas condições descritas na presente invenção, ser utilizados para a regeneração das sementas férteis de milho híbrido.
Sumário da invenção:
A presente invenção refere-se a:
- Uma linha celular de milhos híbridos produzidos a partir de protoplastos, extraídos de um tipo genético de milho auxino-autotrófico, e ainda, a partir dessa mesma linha celular, a sementes e partículas de sementas híbridas regeneradas para os milhos da descendência.
- Um processo de produção de uma linha celular de milhos híbridos que se caracteriza por:
- se produzir enzimáticamente protoplastos a partir de uma suspensão celular de tipos genéticos de miI ho.
- os protoplastos serem incubados com ADN.
- os protoplastos com ADN das linhas celulares de milhos híbridos serem seleccionados e regenerados.
-3/
Conforme descrito no pedido de patente de invenção europeia 90 111 945.3, a linha celular de milho altamente embriogénica DSM 6009 foi apresentada, através dos formulários legais vigentes, à Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh em 1.6. 1990 sob a alçada do Budapester Vertrags. Como foi descrito no respectivo pedido de patente, a linha celular era extraída do embrião da semente de milho, conseguido através do cruzamento dos tipos genéticos H 229 e 0K 281.
Para a produção das sementes de milho híbrido, como relata a invenção, são produzidos protoplastos a partir de culturas em suspensão das linhas celulares que serão depois incubadas com o ADN incorporado.
A produção de protoplastos a partir da DSM 6009 é conseguida com a ajuda dos enzimas desdobrados, como por exemplo: celulase e pectinase, onde os enzimas também podem ser utilizados em misturas. A concentração dos enzimas pode variar entre 0,05% e 4% (proporção entre peso e volume da solução enzimática). A composição óptima da solução aquosa osmótica, assim como a concentração enzimática, têm de ser encontradas, para os vários tipos de tecidos, através de experiências simples.
Para a estabilização dos protoplastos, a solução aquosa osmótica deve conter substâncias activas tais como manitol, sorbitol, glicose, sacarose, fructose, KNO^ ou outros sais típicos dos meios alimentares das sementes. A osmolaridade da solução enzimática varia entre 500 e 750 mOsm, preferencialmente entre 600 e 700 mOsm. 0 pH pode variar entre 4,5 e 6,0.
Preferencialmente a solução enzimática será ajustada para um valor de pH entre 5,5 e 6 e estabilizada com um tampão de fosfato entre 1mM e 5mM e ácido morfolino-etano-sulfónico (MES) entre 1mM e 10 mM.
Dependendo da concentração dos enzimas desdobrados, assim serão libertados os protoplastos num período de tempo compreendido entre 3 e 20 horas. A agitação cuidadosa, durante a incubação dos enzimas, é um factor primordial. A agitação num agitador rotativo a 10-50 rpm proporcionou óptimos resultados.
Qualquer ADN pode ser injectado na célula. De preferência trabalhar-se-á com genes marcadores selectivos, como por exemplo; os genes para fosfino-tricinacetil-transferase, acetil-coA-carboxi1 ase, glutationa-S-transferase, higromicina-fosfotransferase, acetolactato-sintetase, 5-enolpiruvi1-shikimat-fosfato-sintetase (EPSP-sintetase), glutamina-sintetase ou transamínase. Naturalmente que poderão ser injectados genes cuja expressão não possa ser seleccionada através do crescimento das sementes. Genes desta espécie podem, por exemplo, codificar para á-endotoxina do Bacillus Thuringiensis ou para vírus resistentes, por exemplo: gene para o Vírus coat Proteína. Também pode ser utilizado o gene ou genes da Chitinase que melhoram o potencial de fotossintese das plantas, por exemplo: o gene para fosfoenol-piruvato-carboxi1 ase ou asparagina-sintetase bacteriana (Nakamura, M.M. et al. Nucleic Acids Research 9, 4669 (1981) ). De preferência, trabalhar-se-á com o gene da fosfinotricinaceti1-transferase de Streptomyces viridochromogenes (Wohlleben, W. et. al., Gene 80, 25-57 (1988) que pode modificar a expressão nas sementes ou plantas. Graças
-5/ à incorporação destes genes, as sementes do milho e da sua descendência serão mais resistentes contra a fosfinotricina (Glufosinato) e contra a fosfinotricinalani1alanina (Bialafos).
Depois da síntese, por exemplo, por isolamento, o gene pode ser multiplicado através de métodos convencionais, tais como transformação de E. coli ou através de reacção em cadeia com polimerase. 0 gene funcional isolado pode então, directamente ou através de um vector de clonagem escolhido, de preferência pBR 322, pUC 18 ou pDH 51 (Pietrzak, M. et al. Nucl.
Acid Res. 5858 (1986) e com ou sem um promotor efectivo nas plantas, ser misturado com os protoplastos. Como promotor dã-se preferência à utilização do promotor 35S. 0 ADN pode ser agrupado sob a forma de um complexo com histona, conforme exemplificado no pedido de patente de invenção alemã 40 05 152.8.
No que diz respeito à incubação dos protoplastos, preparar-se-á uma suspensão de ADN numa solução aquosa que poderá conter sais alimentícios e far-se-á então a mistura com os protoplastos que se encontram numa massa de transformação por osmose.
Essa massa de transformação por osmose é composta por uma solução aquosa de sais, preferencialmente de catiões bivalentes, como MgClg ou CaClg, as suas misturas ou ainda açúcares tais como sacarose, glicose ou fructose, ou álcoois de açúcares como por exemplo o manitol ou o sorbitol. Esses sais encontram-se numa quantidade compreendida entre 30 e 300 mval, os açúcares ou os álcoois de açúcares numa concentração compreendida entre 50 e 500 mmol, na massa de transformação.
Depois de se adicionar a solução de ADN aos protoplastos, adicionar-se-á à referida mistura, polietilenoglicol, de preferência PEG 1500 a 8000, para que a concentração final na mistura seja de cerca de 10 a 25% em peso, de preferência de 6 a 10% em peso. Pode então fazer-se a incubação para valores de pH de 6,0 a 8,0, de preferência entre 6,5 e 7, a uma temperatura compreendida entre 15° e 40°C, de preferência entre 20° e 25°C, por um período de tempo variável entre 5 minutos e 1 hora, de preferência entre 20 e 30 minutos. Depois de terminado o período de incubação, as células serão preferêncialmente introduzidas num meio de crescimento contendo sais orgânicos tais como, por exemplo, os sais de amónio, de potássio, de cálcio, e de magnésio, como os nitratos, fosfatos, sulfatos, di-hidrogeno-fosfatos, citratos, vitaminas, aminoácidos, uma auxina sintética, por exemplo, 2,4-D ou Dicamba assim como açúcar, de preferência uma mistura de frutose, glicose e sacarose, depois do PEG ter sido retirado através de uma ou de várias lavagens.
Decorridos 10 a 25 dias, as células sobreviventes e em parte ainda activas serão cultivadas num meio selectivo. Esse meio selectivo deverá ser, para a estabilização osmótica dos protoplastos, constituído de preferência por 6 a 10% de açúcar, principalmente sacarose. Quando mais antiga for a cultura dos protoplastos, menor será a quantidade de açúcar necessária. Como exemplo, para uma cultura de protoplastos com 15 a 20 dias, está indicada uma média de cerca de 9% de açúcar. 0 meio de selecção é essencialmente conforme descrito antes para o meio de crescimento e contém um meio selectivo como a fosfinotricina.
A selecção far-se-à por exemplo, conforme descrito na patente de invenção europeia Ns0 290 987.
No meio alimentar descrito antes, o gene de expressão (Zel1c1uster) desenvolve-se a partir dos protoplastos que se vão transformando e vão crescendo como caules macroscópicos. Decorridos 14 a 28 dias depois do inicio da selecção, os caules serão mudados para um meio de selecção recente e sem hormonas para permitir a maturação embrionária. Os embriões híbridos desenvolvidos podem, por cultura posterior, com ou sem meio selectivo, diferenciar-se em folhas e raízes.
Logo que no laboratório as plantas atinjam 4 a 8 cm de altura, serão plantadas no solo e numa estufa para crescimento.
Os milhos híbridos férteis podem reprõduzir-se por polinização própria ou alheia ou através de cruzamento com linhas de cultura de elite.
A presente invenção versa também sobre um processo de protecção de plantas monocotíledóneas, através de eliminação selectiva de ervas daninhas com fosfinotricina ou fosfinotricina1ani1alanina, através de conjuntos de plantas que são obtidas por tratamento efectuado de acordo com o descrito na invenção e que conterão o gene da fosfinotricinacetiItransferase e também de outras plantas da descendência.
Nos exemplos seguintes serão descritos os vários passos da presente invenção.
EXEMPLOS
Meio de isolamento dos protoplastos (100 ml)
Celulase Onozuka R S (Meiji Seika, Japão) 800 mg
Pectoliase Y 23 40 mg
KNOg 200 mg
kh2po4 136 mg
k2hpo4 47 mg
CaCl2*2H20 147 mg
MgS04-7H20 250 mg
Albumina do soro de bovino (ASB) 20 mg
Glicose 4000 mg
Frutose 4000 mg
Sacarose 1000 mg
PH 5,8
Osmolaridade 660 mOsm
Solução de lavagem dos protoplastos 1: conforme descrito antes, mas sem celulase, pectoliase e ASB.
Massa de Transformação
a) Glicose 0,5 M
MES 0,1 %
MgCl2-6H20 25 mM pH 5,8 osmolaridade 600 mOsm
b) PEG 6000-Solução Glicose MgCl2-6H20 Hepes PH
0,5 M
100 mM mM
6,5
A massa b), imediatamente antes da utilização, ser-lhe-à adicionado PEG 6000 (40 peso/% PEG). A solução PEG será filtrada através de um filtro esterilizado de 0,45 micra.
Solução W 5
C a C12 125 mM
NaCl 150 mM
KC1 5 mM
G1icose 50 mM
Meio de cultura dos protoplastos
KNOg 3000
(nh4)2so 4 500
MgS04-7H 2° 350
KH2P04 400
CaCl2·2H 2° 300
Fe-EDTA e elementos raros como os
(Physiol. Plant, 15, 473 (1962)).
m-Inosit 100
Cloridrato de tiamina 1,0
Amida do ácido nicotínico 0,5
Cloridrato de piridoxina 0,5
G1i cina
2,0
750
Acido glicorónico 750
Acido galactorónico 750
Galactose 500
Maltose 500
Glicose 36.000
Frutose 36.000
Sacarose 30.000
Asparagina 500
Glutamina 100
Prolina 300
Hidrolisato de caseína 500
Acido 2,4-diclorofenoxiacêtico (2,4-D) 0,5 pH 5,8
Osmolaridade 600 mOsm
1. Produção de protoplastos da linha celular DSM 6009
Isolamento dos protoplastos
Decorridos 2 a 4 dias, de preferência 3 dias depois da última mudança de meio da cultura de suspensão, o meio líquido é aspirado e as células restantes serão lavadas com 50 ml da solução 1 de lavagem dos protoplastos e depois aspira-se outra vez o líquido atê ficarem secas. Por cada 2 g de massa celular colhida, adiciona-se 10 ml do meio isolante dos protoplastos. A nova suspensão celular e os agregados celulares serão incubados à temperatura de 27° ± 2° c, ao abrigo da luz e sob agitação suave (30 a 40 rpm) durante 4 a 6 horas.
Purificação dos protoplastos
Assim que a concentração dos protoplastos atinge no mínimo 1 milhão/ml (observação microscópica), a suspensão é filtrada através de um filtro com rede de nylon com malha de 200 a 45 micra e com uma vareta de aço inoxidável. A combinação de um filtro com malha de 100 micra e outro com malha de 60 micra possibilita também a separação do agregado celular. 0 filtrado dos protoplastos deve ser inspeccionado ao microscópio. Normalmente contém cerca de 98-99% de protoplastos. 0 resto são células mal digeridas. As preparações de protoplastos com este grau de pureza são utilizadas em experiências de tranformações sem necessidade de centrifugação variável. Os protoplastos são sedimentados através de centrifugação a 1000 rpm (100 x g, 3 min). 0 excesso ê rejeitado e com os protoplastos prepara-se nova suspensão na solução de lavagem 1. A centrifugação é repetida e com os protoplastos prepara-se depois nova suspensão na solução da massa de transformação.
2. Clonagem dos genes da fosfinotricinaceti1-transferase
Para a transformação ê utilizado o gene da fosfinotricin-aceti1-transferase de síntese sob o controlo do promotor 35 S- Transcrição do vírus do mosaico do caule da flor, (comparar com as sequências da estrutura genética da fosfinotricinaceti1 -transferase na secção Sal I-clonagem do pDH51) por exemplo o gene sintético descrito no pedido de patente de invenção europeia 0 275 957. 0 gene quimérico do qual fazem parte o gene estrutural 35 S-Promotor e 35 S-Terminador está integrado no sítio EcoRI dos poli-1igantes pUC18. Na maioria das experiências é ferase do com utilizado o plasmídeo completo pUC18-35S-aceti1trans-12-
Em experiências simples utiliza-se o plasmídeo cindiEcoRI e a mistura de plasmídeo pUC18 linearizado e de
1,3 Kb-35S-acetiltransferase de 1,3Kb para a transformação.
Sequência do gene fosfinotricinacetiltransferase:
13EcoRI
GAATTCCCATGGAGTCAAAGAATCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCA
CTTAAGGGTACCTCAGTTTCTTAGTTTATCTCCTGGATTGTCTTGAGCGGCATTTCTGACCGCTTGTCAAGT
24 36 48 60 72
TACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACGCTTGTCT
ATCTCTCAGAGAATGCTGAGTTACTGTTCTTGTTTTAGAAGCAGTTGTACCACCTCGTGCTGTGCGAACAGA
96 108 120 132 144
ACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATAT
TGAGGTTTTTATAGTTTCTATGTCAGAGTCTTCTGGTTTCCCGTTAACTCTGAAAAGTTGTTTCCCATTATA
156 168 180 192 204 216
CCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTG
GCCTTTGGAGGAGCCTAAGGTAACGGGTCGATAGACAGTGAAATAACACTTCTATCACCTTTTCCTTCCAC 228 240 252 264 276 288
GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCA
CGAGGATGTTTACGGTAGTAACGCTATTTCCTTTCCGGTAGCAACTTCTACGGAGACGGCTGTCACCAGGGT
300 312 324 336 '348 360
AAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGG
TTCTACCTGGGGGTGGGTGCTCCTCGTAGCACCTTTTTCTTCTGCAAGGTTGGTGCAGAAGTTTCGTTCACC
372 384 398 408 420 432
ATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTA
TAACTACACTATAGAGGTGACTGCATTCCCTACTGCGTGTTAGGGTGATAGGAAGCGTTCTGCCAACCACAT
444 456 468 480 4 92 504
TATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACAGGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC
ATATTCCTTCAAGTAAAGTAAACCTCTCCTGTCCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACG
516 528 540 552 564 576
CGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAG
GCGACTTTAGTGGTCAGAGAGAGATGTTTAGATAGAGAGAGATATTATTACACACTCATCAAGGGTCTATTC
588 600 612 624 636 648
GGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTT
CCTTAATCCCAAGAATATCCCAAAGCGAGTACACAACTCGTATATTCTTTGGGAATCATACATAASCATAAA
660 672 684 696 708 720
EcoRI
GTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTGGGTACCGAGCTCGAATTCAA
CATTTTATGAAGATAGTTATTTTAAAGATTAAGGATTTTGGTTTTAGGTCACCCATGGCTCGAGCTTAAGTT
732 744 758 768 780 792
Vai Asp Met Ser Pro Glu Arg Arg Pro Vai Glu Ile Arg Pro Ala Thr
Sall
GTC GAC ATG TCT CCG GAG AGG AGA CCA GTT GAG ATT AGG CCA GCT ACA CAG CTG TAC AGA GGC CTC TCC TCT GGT CAA CTC TAA TCC GGT CGA TGT
24 38 48
Ala Asp Met Ala Ala Vai Cys ASP Ile Vai Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser
GCT GAT ATG GCC GCG GTT TCT GAT ATC GTT AAC GAT TAC ATT GAG ACC TCT
CGA CTA TAC CGG CGC CAA ACA CTA TAG CAA TTG GTA ATG TAA CTC TGC AGA
63 75 87 99
Thr Vai Asn Phe Arg Thr Glu Pro Gin Thr Pro Gin Glu Trp Ile Asp Asp
ACA GTG AAC TTT AGG ACA GAG CCA CAA ACA CCA CAA GAG TGG ATT GAT GAT
TGT CAC TTG AAA TCC TGT CTC GGT GTT TGT GGT GTT CTC ACC TAA CTA CTA
114 126 138 150
Leu Glu Arg Leu Gin Asp Arg Tyr Pro Trp Leu Vai Ala Glu Vai Glu Gly
CTA GAG AGG TTG CAA GAT AGA TAC CCT TGG TTG GTT GCT GAG GTT GAG GGT
GAT CTC TCC AAC GTT CTA TCT ATG GGA ACC AAC CAA CGA CTC CAA CTC CCA
165 177 189 201
Vai Vai Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg Asn Ala Tyr
GTT GTG GCT GGT ATT GCT TAC GCT GGG CCC TGG AAG GCT AGG AAC GCT TAC
CAA CAC CGA CCA TAA CGA ATG CGA CCC GGG ACC TTC CGA TCC TTG CGA ATG
216 228 240 252
Asp Trp Thr Vai Glu Ser Thr Vai Tyr Vai Ser His Arg His Gin Arg Leu
GAT TGG ACA GTT GAG AGT ACT GTT TAC GTG TCA CAT AGG CAT CAA AGG TTG
CTA ACC TGT CAA CTC TCA TGA CAA ATG CAC AGT CTA TCC GTA GTT TCC AAC
267 279 291 303
Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys Ser Met Glu Ala Gin
GGC CTA GGA TCC ACA TTG TAC ACA CAT TTG CTT AAG TCT ATG GAG GCG CAA
CCG GAT CCT AGG TGT AAC ATG TGT GTA AAC GAA TTC AGA TAC CTC CGC GTT
318 330 342 354
Gly Phe Lys Ser Vai Vai Ala Vai Ile Gly Leu Pro Asn Asp Pro Ser Vai
GGT TTT AAG TCT GTG GTT GCT GTT ATA GGC CTT CCA AAC GAT CCA TCT GTT
CCA AAA TTC AGA CAC CAA CGA CAA TAT CCG GAA GGT TTG CTA GGT AGA CAA
369 381 393 405
Arg Leu His Glu Ala Leu Gly Tyr Thr Ala Arg Gly ' Thr Leu Arg Ala Ala
AGG TTG CAT GAG GCT TTG GGA TAC ACA GCC CGG GGT , ACA TTG CGC GCA GCT
TCC AAC GTA CTC CGA AAC CCT ATG TGT CGG GCC CCA TGT AAC GCG CGT CGA
420 432 444 456
Gly Tyr Lys His Gly Gly Trp His Asp Vai Gly Phe Trp Gin Arg Asp Phe
GGA TAC AAG CAT GGT GGA TGG CAI ' GAT GTT GGT TTT TGG CAA AGG GAT TTT
CCT ATG TTC GTA CCA CCT ACC GTA CTA CAA CCA AAA ACC : GTT TCC CTA l AAA
471 483 495 507
Glu Leu Pro Ala Pro Pro Arg Pro Vai Arg Pro Vai Thr Gin Ilo/96#Val C = 1 T
GAG TTG CCA GCT CCT CCA AGG CCA GTT AGG CCA GTT ACC CAG ATC TGA GTC
CTC AAC GGT CGA GGA GGT TCC GGT CAA TCC GGT CAA TGG GTC TAG ACT CAG
522 534 546 558
Asp
GAC
CTG
3. Transformação dos protoplastos
A nova suspensão de protoplastos na massa de transformação ê colocada em tubos Polyallomer de 50 ml, em porções de £
ml tituladas a 0,5-1x10 protoplastos/ml. 0 ADN utilizados na transformação ê dissolvido no tampão Tris-EDTA (TE). Por cada ml de suspensão de protoplastos adiciona-se 20 yjg de ADN plasmídico. Depois de adicionado o ADN, a suspensão dos protoplastos é cuidadosamente agitada para homogeneizar a solução de ADN. Imediatamente depois adiciona-se gota a gota 5 ml de solução PEG.
A solução PEG é homogeneamente preparada através da viragem cuidadosa dos tubos. Depois são novamente adicionados 5 ml de solução PEG e repete-se a viragem de homogeneização. Os protoplastos ficam durante 20 minutos na solução de PEG a uma temperatura de 25°C ± 2°C. Depois os protoplastos são centrifugados durante 3 minutos (100 x g a 1000 rpm) e sedimentados. 0 restante ê rejeitado. Os protoplastos são lavados em 20 ml de solução Wg, agitando-se cuidadosamente e depois novamente centrifugados. Depois prepara-se nova suspensão em 20 ml do meio de cultura, de protoplastos, centrifuga-se novamente e prepara-se nova suspensão na solução do meio de cultura. Proceder-se-à ã colocação em cadinhos (60 mm diâmetro, 15 mm altura) em porções de 3 ml, fazendo-se a titulação a 6-8x10^ de protoplastos/ml assim cultivados . Os cadinhos são vedados com uma película de parafina e são mantidos ao abrigo da luz a uma temperatura de 25°C + 2°C.
-164. Cultura de protoplastos
Durante as primeiras 2 a 3 semanas depois do isolamento e da transformação dos protoplastos, estes serão cultivados sem adição de meio de cultura recente. Assim que se revelem agregados celulares das células regeneradas com mais de 20-50 células, ê-lhes adicionado 1 ml de meio de cultura recente de protoplastos com um conteúdo de sacarose osmótica correspondente a 90 g/1.
5. Selecção das células de milho transformadas e regeneração das sementes
Decorridos 3 a 10 dias depois da adição do meio de cultura recente, os agregados celulares resultantes dos protoplastos podem ser colocados em placas de gelose com L-fosfinotricina na proporção de 100 ml/1. 0 meio N6 com as vitaminas do meio de cultura dos protoplastos, sacarose na proporção de 90 g/1 e 2,4-D na proporção de 1,0 mg/1 são também indicados como um meio análogo contendo, por exemplo, os macro e micro-sais alimentares dos meios MS (Murashige + SKoog 1962).
Os caules obtidos a partir dos protoplastos estáveis transformados podem desenvolver-se e crescer sem problemas nos meios selectivos. Depois de 3-5 semanas, de preferência 4 semanas, os caules híbridos podem ser transferidos para um meio selectivo recente que deve conter L-fosfinotricina na proporção de 100 mg/1, mas que não pode conter qualquer Auxina. decorridas 3-5 semanas, cerca de 50% dos caules de milho híbrido vão ser diferenciados; os que integraram o gene da L-fosfinotricinaceti1-transferase e os da L-fosfinotricina da primeira sementeira.
6. Cultura de sementes regeneradas tecido do milho transformado pelo gene embrionário será cultivado em meio N6 isento de hormonas, (Chu C.C. et al.,
Sei.Sin., 1 6 1975;p.659 ), comparativamente com L-fosfinotri-4 cina 5x10 Nesse meio surgem embriões de milho de forte expressão do gene da fosfinotricinacetil-transferase (gene-PAT). Embriões não transformados ou alguns com muito fraca actividade PAT, morrem. Assim que as folhas das plantas cultivadas no laboratório atingem um comprimento de 4-6 mm, podem ser transferidas para o solo. Depois da lavagem das raízes para eliminação dos restos de gelose, as plantas são plantadas no solo com uma mistura de marga, areia, vermiculite e terra simples na proporção de 3:1:1:1 com uma humidade relativa do ar de cerca de 90-100% durante os primeiros 3 dias para se adaptarem à cultura no solo. A cultura efectua-se numa estufa durante 14 horas de período de luz a cerca de 25000 lux, ao nível da planta, a uma temperatura variável entre 23° ± 17°C + 1°C, dia e noite.
As plantas que se adaptem serão cultivadas com uma humidade relativa do ar de cerca de 65 t 5%.
7. Expressão marcadora dos genes da fosfinotricinacetiltransferase
a) Decorridas 3-4 semanas depois da transferência para o solo, ensaiou-se com fosfinotricina plantas híbridas regeneradas e caules regenerados de controlo que não foram tratados com ADN, /6) nas fórmulas habituais (Basta ^). Utilizou-se uma porção de fosfinotricina adequada para 2,0 Kg de produto por hectare.
Diluiu-se o herbicida com água fazendo-se a aplicação na proporção de 50 ml/m2 (=500 1/ha). A partir desta utilização da fosfinotricina, as plantas sem actividade PAT, decorridos 7 a 10 dias, dependendo do grau de expressão dos genes, não são danificados pelo produto ou, no caso de baixa actividade PAT, são visíveis manchas locais nas folhas que não influem no crescimento das plantas.
b) Congela-se uma amostra de cerca de 100 mg de caules de milho e folhas utilizando anidrido carbónico num vaso de reacção de 1,5 ml e faz-se a sua homogeneização com uma vareta de aço inoxidável adaptada ao vaso de reacção. Adiciona-se 100 ^il de solução tampão TRIS-EDTA (Tris 50mM/ EDTA 2mM; pH 7,5). Centrifuga-se a solução homogeneizada durante 1 minuto numa centrifugadora Eppendorf a 12000 rpm. Retirou-se o sobrenadante límpido e os resíduos rejeitados. Determina-se o conteúdo proteico do extracto através de um ensaio Bio-Rad. Para o ensaio PAT recolheram-se aliquotas do extracto que continham cerca de 20 yjg de proteínas. Adiciona-se acetil-Co-A e 14C-L-fosfinotricina. A concentração final na mistura de incubação é cerca de 1 mM para o acetil-Co-A e 0,1 mM para a 14C-L-fosfinotricina. As amostras são misturadas rapidamente e incubadas a 37°C durante 1 hora. Depois interrompe-se a reacção enzimática através da adição de 0,5 vol. de ácido tricloroacético a 12%, mistura-se bem e coloca-se em gelo durante 10 minutos. Depois faz-se a centrifugação durante 10 min a 12000 rpm e utiliza-se o sobrenadante para DC. Colocam-se 6 ^il da mistura de incubação sobre uma placa fina (Celulose F254, Fa. Merck) assim como as substâncias de referência 14C-fosfinotricina e
14C-acetilfosfinotricina. Como fluido para a cromatografia utiliza-se n-propanol/NH3 a 25% (3:2) ou pi ridina/n-butanol/ ácido acético glacial/água (3:5:1:4).
A placa fina e seca é embalada em folha de plástico e exposta a uma película de Rontgen (raios X). Na revelação da película de raios X reconhece-se a actividade PAT (só no tecido híbrido) na banda da acetilfosfinotricina. A fosfinotricina e a acetilfosfinotricina são facilmente separáveis com os fluidos utilizados e na placa fina cromatografica.
8. Transmissão da hereditariedade dos genes nas plantas regenerativas da descendência pólen dos transformantes, que depois de tolerar a aplicação de uma dose de glufosinato de 2 Kg ia/ha sem problemas e que revela uma actividade PAT num teste PAT-enzimático, será utilizado para polinizar estigmas de diversas linhas de cultura, por exemplo, B73, LH119, LH82, LH51, por comparação com Mo17. Como nos pólens só genes de núcleo codificado podem ser transmitidos, pode assim ser testado se o gene hereditário foi integrado no núcleo. Só então pode ser esperada a hereditariedade de um gene de expressão nos genes da descendência, como sucede nas leis de hereditariedade de Mendel.
a) Ensaio de embriões imaturos
Decorridos 12 a 16 dias após a polinização, procede-se à preparação de embriões imaturos das cariopses em condições estéreis. Os embriões isolados são cultivados num meio MS isento de hormonas, por exemplo, meio de agar Νθ, contendo 9% de sacarose e sal de L-fosflnotricina-NH4 na prOporçao de 100 mg/1
(glufosinato-amónia). Os embriões são cultivados de maneira que o escutelo esteja no agar. Durante 12 horas por dia estarão sujeitos a uma luminosidade de 2000-5000 lux, à temperatura de 75°C t 2°C. Os embriões sem genes de expressão PAT morrem ao fim de 14 dias, sem germinar. 0 quadro 1 mostra o comportamento dos híbridos da primeira geração (híbrido-tp de três transformantes diferentes.
- QUADRO 1 Comportamento de embriões imaturos de cruzamentos de plantas-mãe híbridas com linhas de cultura não híbridas.
iEmbriões I Embriões i Embriões
Dador de póleniisolados | a morrer 1 a desenvolver
Transformante 2 l 20 1 9 1 11
Transformante 5 i 20 1 12 1 8
Transformante 9 1 100 I 47 , 53
Os embriões que se desenvolveram, por comparação com os que germinaram com L-fosfinotricina com a concentração de δχΙΟ”4 M, revelaram raízes normais e folhas verdes neste meio.
As plantas podem, por analogia com os embriões somáticos desenvolvidos no 1 aboratório,ser reproduzidas e desenvolvidas no solo.Estas plantas transmitem o gene-PAT à geração-tg, quando os pólens de plantas-t^ polinizarem plantas-mãe de estigmas não híbridos.
b) Ensaio das sementes
Procedeu-se à secagem de sementes escolhidas dos cruzamentos atrás descritos (conteúdo de água<15%) e à sua exposição
-21a 20000 lux durante 12 horas e a uma temperatura de 22°C de dia e de 16°C de noite. Assim que atingem o estádio de desenvolvimento de 2 a 3 folhas são aspergidas com uma solução a 1% do produto Basta ® de forma análoga à das plantas regenerativas (ver exemplo 6)
- QUADRO 2 Obtêm-se os seguintes resultados:
Sementes depois da aplicação de 2 Kg de glufosinato/ha
Dador de pólen ιSementes ensaiadas I I incólumes i morrendo
Transformante 9 I . 29 1 1 15 1 14 i
Transformante 13 I 20 1 11 9
Transformante 14 ι 39 I 1 1 17 22
A relação da separação está de acordo com alguns transformantes que só têm um gene-PAT.
Em 12. 6. 1990 foram entregues sementes do transformante Nr. 14 nas condições do tratado de Budapester exaradas na acta NCIMB 40291 na National Collections of Industrial and Marine Bactéria Ltd. (NCIMB), Aberdeen, RU .

Claims (4)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. - '-Processo para a produção de uma célula de milho transgénica, caracterizado por:
    - se produz.ir enzimaticamente protoblastos a partir de uma suspensão celular de um genotipo de milho auxina-autotróf ico;
    - os protoblastos serem incubados com ADN;
    - a linha de células de milho transgénicas ser seleccionada e regenerada a partir dos protoblastos que contêm ADN; e
    - se regenerarem plantas ou partes de plantas a partir da linha de células de milho.
  2. 2. - Processo segundo a reivindicação 1, caracterizado por se utilizarem protoblastos do genotipo DSM 6009.
  3. 3. - Processo segundo uma ou outra das reivindicações 1 e 2, caracterizado por os protoblastos
    - serem incubados com ADN· que codifica para fosfinotricinacetiltransferase;
    - a linha, de células transgénicas de milho ser seleccionada e regenerada a partir dos protoblastos que contêm o
    ADN; e
    - se regenerarem plantas ou partes de plantas a partir da linha de células de milho.
  4. 4, - Processo de protecção de plantas de milho através da destruição selectiva.de ervas daninhas com fosfinotricina ou fosfinotricinalanilalanina em superfícies de cultivo, caracterizado por as superfícies de cultivo serem plantadas com plantas obtidas pelo processo segundo as reivindica.ções 1 e 3, assim como com os respectivos rebentos.
PT98071A 1990-06-23 1991-06-21 Processo para a preparacao de plantas de milho transgenicas ferteis com gene estranho PT98071B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP90111946 1990-06-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT98071A PT98071A (pt) 1992-06-30
PT98071B true PT98071B (pt) 2003-06-30

Family

ID=8204128

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT98071A PT98071B (pt) 1990-06-23 1991-06-21 Processo para a preparacao de plantas de milho transgenicas ferteis com gene estranho

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0469273B1 (pt)
JP (1) JP3878678B2 (pt)
AT (1) ATE256192T1 (pt)
DE (1) DE59109256D1 (pt)
DK (1) DK0469273T3 (pt)
ES (1) ES2213740T3 (pt)
HU (1) HU218822B (pt)
IE (1) IE912164A1 (pt)
PT (1) PT98071B (pt)
TR (1) TR26581A (pt)
ZA (1) ZA914787B (pt)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5350689A (en) * 1987-05-20 1994-09-27 Ciba-Geigy Corporation Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5484956A (en) * 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
US6114608A (en) * 1997-03-14 2000-09-05 Novartis Ag Nucleic acid construct comprising bacillus thuringiensis cry1Ab gene
US6573438B1 (en) 1997-03-14 2003-06-03 Syngenta Participations Ag Inbred Maize line 2044BT
US6040497A (en) * 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
AU6882298A (en) 1997-04-03 1998-10-22 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
PT2025756E (pt) 2003-11-18 2011-09-28 Bayer Bioscience Nv Inserção direccionada de adn em plantas
EP3339441A1 (en) 2005-10-13 2018-06-27 Monsanto Technology LLC Methods for producing hybrid seed
US8912392B2 (en) 2007-06-29 2014-12-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for altering the genome of a monocot plant cell
PE20141518A1 (es) 2011-07-01 2014-11-17 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la regulacion selectiva de la expresion de proteinas

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3715958A1 (de) * 1987-05-13 1988-11-24 Hoechst Ag Herbizidresistente kulturpflanzen, verfahren zu deren selektion und deren regeneration
EP0846771A1 (en) * 1987-05-20 1998-06-10 Novartis AG Zea mays plants and transgenic zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
ES2150410T3 (es) * 1988-06-20 2000-12-01 Novartis Ag Procedimiento para el combate de parasitos de plantas.

Also Published As

Publication number Publication date
DE59109256D1 (de) 2004-01-22
ZA914787B (en) 1992-03-25
HU912083D0 (en) 1991-12-30
EP0469273B1 (de) 2003-12-10
ATE256192T1 (de) 2003-12-15
EP0469273A1 (de) 1992-02-05
TR26581A (tr) 1995-03-15
IE912164A1 (en) 1992-01-01
JP3878678B2 (ja) 2007-02-07
PT98071A (pt) 1992-06-30
ES2213740T3 (es) 2004-09-01
DK0469273T3 (da) 2004-04-13
HUT58807A (en) 1992-03-30
HU218822B (hu) 2000-12-28
JPH04271733A (ja) 1992-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT98071B (pt) Processo para a preparacao de plantas de milho transgenicas ferteis com gene estranho
Chupeau et al. Transgenic plants of lettuce (Lactuca sativa) obtained through electroporation of protoplasts
ES2260886T3 (es) Procedimiento para transformar plantas monocotiledoneas.
US5550318A (en) Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5272072A (en) Method for preparing transformed plant
Casas et al. Transgenic sorghum plants obtained after microprojectile bombardment of immature inflorescences
PT89914B (pt) Regeneracao de plantas gramineas da subfamilia pooideae a partir de protoplastos
BRPI0007815B1 (pt) processo de transformação da soja
BR112017015988B1 (pt) Métodos para a modificação sítio dirigida para um fragmento alvo de um gene alvo em uma planta inteira e para a obtenção de uma planta mutante livre de transgene
JPH07505531A (ja) 単子葉植物細胞の形質転換法
US5792927A (en) Genetically transformed rose plants and methods for their production
Costantino et al. Bacterial plant oncogenes: the rol genes' saga
US20020083495A1 (en) Enhanced selection of genetically modified pine embryogenic tissue
Barcelo et al. Transformation of cereals by microprojectile bombardment of immature inflorescence and scutellum tissues
BR122017020958B1 (pt) Métodos para melhorar a eficiência da regeneração de planta de algodão
PL158090B1 (pl) Sposób przenoszenia genów u roslin PL
JP2000510325A (ja) 植物性材料の繁殖および／または選択方法
RU2024613C1 (ru) Способ получения трансгенных растений gossypium, устойчивых к насекомым
JP3174048B2 (ja) ＣｕｃｕｍｉｓＭｅｌｏ（マスクメロン）種に属する遺伝子導入植物
BRPI0202855B1 (pt) método de transformação de células de planta de palma oleaginosa com material genético, e método de produção de planta de palma oleaginosa geneticamente modificada
Atkins et al. Genetic transformation and regeneration of legumes
ES2384876T3 (es) Procedimiento de transformación y regeneración altamente eficiente de células vegetales en suspensión
EP0438475A1 (en) Transformation of cucumber by agrobacterium tumefaciens and the regeneration of transformed cucumber plants
US20010007157A1 (en) Genetically transformed rose plants and methods for their production
Al-Khayri Genetic transformation in Spinacia oleracea L.(spinach)

Legal Events

Date Code Title Description
BB1A Laying open of patent application

Effective date: 19920323

FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 20030513

MM3A Annulment or lapse

Effective date: 20041115

NF3A Restitutio in integrum

Free format text: RESTITUTIO IN INTEGRUM

Effective date: 20050504

PC4A Transfer of assignment

Owner name: BAYER CROPSCIENCE AG, DE

Effective date: 20080403

Owner name: HOECHST SCHERING AGREVO GMBH, DE

Effective date: 20080403

PD4A Change of proprietorship

Owner name: AVENTIS CROPSCIENCE GMBH, DE

Effective date: 20080403

Owner name: BAYER CROPSCIENCE GMBH, DE

Effective date: 20080403