ES2555386T5 - Nuevos polipéptidos de hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, y métodos de uso - Google Patents

Nuevos polipéptidos de hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, y métodos de uso Download PDF

Info

Publication number
ES2555386T5
ES2555386T5 ES10734631.4T ES10734631T ES2555386T5 ES 2555386 T5 ES2555386 T5 ES 2555386T5 ES 10734631 T ES10734631 T ES 10734631T ES 2555386 T5 ES2555386 T5 ES 2555386T5
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polypeptide
gly
leu
val
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10734631.4T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2555386T3 (es
Inventor
Timothy Robert Hawkes
Michael Phillip Langford
Russell Colin Viner
Bernardus Theodorus Maria Vernooij
Richard Dale
Shardha Singh
Vance Kramer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Participations AG
Original Assignee
Syngenta Participations AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44115220&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2555386(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US12/692,552 external-priority patent/US8269068B2/en
Application filed by Syngenta Participations AG filed Critical Syngenta Participations AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2555386T3 publication Critical patent/ES2555386T3/es
Publication of ES2555386T5 publication Critical patent/ES2555386T5/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N41/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a sulfur atom bound to a hetero atom
    • A01N41/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a sulfur atom bound to a hetero atom containing a sulfur-to-oxygen double bond
    • A01N41/10—Sulfones; Sulfoxides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/34—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • A01N43/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom six-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/72—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms
    • A01N43/80—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms five-membered rings with one nitrogen atom and either one oxygen atom or one sulfur atom in positions 1,2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11027—4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (1.13.11.27)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Nuevos polipéptidos de hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, y métodos de uso Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos de hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) que confieren resistencia o tolerancia a herbicidas a plantas, y a las secuencia de ácidos nucleicos que los codifican. Los métodos de la invención se refieren a la producción y uso de plantas que expresan estos polipéptidos de HPPD mutantes, y que son resistentes a herbicidas de HPPD.
Antecedentes de la invención
Las hidroxifenilpiruvato dioxigenasas (HPPD) son enzimas que catalizan la reacción en la que para-hidroxifenilpiruvato (HPP) se transforma en homogentisato. Esta reacción tiene lugar en presencia de hierro enlazado a enzima (Fe2+) y oxígeno. Los herbicidas que actúan inhibiendo HPPD son bien conocidos, e incluyen isoxazoles, dicetonitrilos, tricetonas, y pirazolinatos (Hawkes “Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase (HPPD) - The Herbicide Target”. In Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 211-220). La inhibición de HPPD bloquea la biosíntesis de plastoquinona (PQ) a partir de tirosina. PQ es un cofactor esencial en la biosíntesis de pigmentos carotenoideos que son esenciales para la fotoprotección de los centros fotosintéticos. Los herbicidas que inhiben la HPPD son blanqueadores móviles en el floema que provocan que los nuevos meristemos y hojas expuestos a la luz salgan blancos. En ausencia de carotenoides, la clorofila es fotodestruida y se convierte ella misma en un agente de fotodestrucción vía la fotogeneración de oxígeno singlete.
También se conocen métodos para proporcionar plantas que sean tolerantes a los herbicidas de HPPD. Estos métodos han incluido: 1) sobreexpresar la enzima HPPD para producir cantidades de enzima HPPD en la planta que sean suficientes con relación a un herbicida dado a fin de tener suficiente enzima funcional disponible para que la planta crezca prolíficamente a pesar de la presencia del herbicida; y 2) mutar una enzima HPPD particular en una enzima que sea menos sensible a la inhibición por los herbicidas. Se han descrito métodos para mutar enzimas HPPD para la tolerancia mejorada a herbicidas de HPPD (véanse, por ejemplo, las Solicitudes PCT nos WO 99/24585 y WO 2009/144079), y algunas mutaciones particulares de las enzimas HPPD de la planta (por ejemplo, mutación de G422 en la secuencia de HPPD de Arabidopsis) son capaces supuestamente de proporcionar alguna medida de tolerancia a mesotriona y otros herbicidas tricetónicos. Sin embargo, la cinética de la enzima y los datos completos de la planta dados hasta ahora son insuficientes para concluir si los cambios mutacionales dados a conocer confieren beneficios comercialmente significativos con respecto a la enzima o enzimas de tipo salvaje correspondientes.
Además, mientras que una enzima HPPD particular puede proporcionar un nivel útil de tolerancia a ciertos herbicidas inhibidores de HPPD, la misma HPPD puede ser bastante inadecuada para proporcionar niveles comerciales de tolerancia a un herbicida diferente, más deseable, inhibidor de HPPD (véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20040058427; Publicaciones PCT nosWO 98/20144 y WO 02/46387; véase también la Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20050246800 que se refiere a la identificación y al marcaje de variedades de haba de soja como relativamente tolerantes a HPPD). Además, todavía no se han dado a conocer versiones mutadas de las HPPD procedentes de pastos de climas fríos con resistencia mejorada a herbicidas de tipo tricetona. Tales mutantes serían muy deseables, puesto que las HPPD procedentes de pastos de climas fríos son preferibles a otros tipos (véase, por ejemplo, Solicitud PCT n° WO 02/46387 y Hawkes et al. 2001 en Proc. Brit. Crop Prot. Conf. Weeds 2, 563). En consecuencia, se necesitan nuevos métodos y composiciones para conferir niveles comerciales de tolerancia a herbicidas de HPPD en las diversas cosechas y variedades de cosechas.
Breve sumario de la invención
Se proporcionan composiciones y métodos para conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas de hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD). Las composiciones incluyen secuencias nucleotídicas y de aminoácidos para polipéptidos de HPPD. En ciertas realizaciones, los polipéptidos de la invención son nuevas HPPD que derivan de plantas y que confieren resistencia o tolerancia, cuando se expresan de forma heteróloga en otras plantas, a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD. Estas HPPD comprenden secuencias de aminoácidos dispuestas en SEC ID NO: 2 y polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92% de identidad de secuencia con SEC Id NO: 2 que muestra actividad enzimática de HPPD.
Las nuevas HPPD preferidas son igualmente aquellas que, en comparación con las enzimas HPPD de la técnica anterior, muestran tolerancia superior a uno o más tipos de herbicidas de HPPD, y en las que la tolerancia se caracteriza in vitro mediante el valor numérico del parámetro (kf X kcat/ Km hpp), y en el que Koff es la constante de velocidad que gobierna la velocidad de disociación del complejo de la enzima HPPD con el herbicida, y kcat/ Km hpp es el índice de recambio catalítico dividido entre el valor de Km para el sustrato HPP (4-hidroxifenil piruvato).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
En un aspecto adicional de la presente divulgación, también se proporciona por lo tanto un método in vitro para caracterizar y seleccionar las HPPD que confieren niveles superiores de tolerancia a herbicidas de HPPD basado en la medición y comparación de valores de kcat/ Km HPP y koff, o equivalentes funcionales de estos parámetros.
En aspectos adicionales, los polipéptidos de la divulgación son HPPD mutantes catalíticamente activas que derivan de plantas, y que, con relación a la enzima similar no mutada, confieren niveles superiores de resistencia o tolerancia a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD. En particular, estos polipéptidos de HPPD mutantes comprenden una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEC ID NOs: 15-19, en las que SEC ID NOs: 15-19 tienen una o más sustituciones de aminoácidos descritas según lo siguiente:
Con respecto a la secuencia (L,I,R)(V,A)(G,A)DVL(S,T) (SEC ID NO: 15), la primera L, la I, o la R se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente E, D, G, C, N, Q, S, y A, y más particularmente E, C, A y D.
Con respecto a la secuencia G(I,V)LVD(R,K) (SEC ID NO: 16), la L se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente M, F, Y, I, A,W, y V, y más particularmente M.
Con respecto a la secuencia DH(V, I, M)VGN (SEC ID NO: 17), la primera V, la I o la M se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente L, A y I, y más particularmente L e I.
Con respecto a la secuencia GGF(E,D)F(M,L)(A,P) (SEC ID NO: 18), la A o la P se sustituye por cualquier otro aminoácido, particularmente R, K, H, N, I, L, T, S y Q, y más particularmente R, I, L, H y K.
Con respecto a la secuencia CGGFGKGN (SEC ID NO: 19), la segunda G o la K se sustituye por cualquier otro aminoácido. En ciertos aspectos, la segunda G se sustituye por una R, K, H, E, D, N, Q, A, S, T, y más particularmente R, S, T, H y K. En ciertos aspectos, la K se sustituye por una S y T, y más particularmente por una T.
En algunos aspectos, los polipéptidos son HPPD mutantes individualmente, doblemente, triplemente, cuádruplemente, quíntuplemente o séxtuplemente, que combinan más de una de las mutaciones anteriores en las diversas permutaciones (por ejemplo, 2+3, 2+4, 2+1; 3+4, 3+1; 4+1; 3+4+1, 2+3+4, 2+4+1,2+3+1; 2+3+4+1; 1+2+3+4+5 etc.).
La HPPD mutante deriva de la especie Alopecurus y deriva de uno o más de los polipéptidos de HPPD de SEC ID NO: 2.
Los polipéptidos de HPPD y polipéptidos de HPPD mutantes ejemplares según la invención corresponden a las secuencia de aminoácidos expuestas en SEC ID NO: 2 y variantes y fragmentos de las mismas. Además, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican estos polipéptidos de HPPD mutantes particulares de la invención, por ejemplo, SEC ID NO: 54. Las composiciones también incluyen casetes de expresión que comprenden un promotor enlazado de forma operable a una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de HPPD de la invención, sola o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. También se proporcionan plantas, células vegetales y semillas transformadas que comprenden un casete de expresión de la invención.
Las composiciones de la invención son útiles en métodos dirigidos a conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas, particularmente resistencia o tolerancia a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD. En realizaciones particulares, los métodos comprenden introducir en una planta al menos un casete de expresión que comprende un promotor enlazado de forma operable a una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de HPPd de la invención. Como resultado, el polipéptido de HPPD se expresa en la planta, y puesto que la HPPD se selecciona basándose en que es menos sensible a herbicidas que inhiben HPPD, esto conduce a que la planta presente resistencia o tolerancia sustancialmente mejorada a herbicidas que inhiben HPPD.
En otros aspectos, también se divulgan métodos para el ensayo, caracterización, identificación y selección de las HPPD de la actual invención.
Breve sumario de las varias vistas de los dibujos
La Figura 1 representa datos procedentes de las determinaciones de Km y Vmax del polipéptido de HPPD derivado de Avena correspondiente a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 1.
La Figura 2 representa datos procedentes de experimentos de intercambio de inhibidores a la temperatura del hielo para determinar los valores de la constante de disociación (koff) que gobiernan la disociación del complejo de estructura B (mesotriona) con el polipéptido de HPPD que corresponde a A) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 1 y B) la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 41.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La Figura 3 muestra una representación del vector binario 17900 para la transformación de haba de soja, que confiere resistencia a HPPD con un gen de HPPD de avena optimizado con un codón de dicotiledónea que codifica SEC ID NO:
49. Este vector binario también contiene marcadores seleccionables PAT dobles para la selección de glufosinato.
La Figura 4 muestra una representación del vector binario 17901 para la transformación de haba de soja que confiere resistencia a HPPD con un gen de HPPD de avena optimizado con un codón de dicotiledónea que codifica SEC ID NO:
50, y que también confiere tolerancia a glifosato (marcador seleccionable).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona composiciones y métodos dirigidos a conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas de hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD). Las composiciones incluyen secuencia de aminoácidos para polipéptidos de HPPD nativos y mutantes que tienen actividad enzimática de HPPD, y sus variantes y fragmentos. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de HPPD mutantes de la invención. Se proporcionan además métodos para conferir a las plantas resistencia o tolerancia a herbicidas, particularmente resistencia o tolerancia a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD. También se divulgan métodos para controlar de forma selectiva malas hierbas en un campo en un lugar de cosecha, y para el ensayo, caracterización, identificación y selección de las HPPD mutantes de la actual invención que proporcionan tolerancia a herbicidas.
En el contexto de la presente invención, las expresiones hidroxi fenil piruvato de dioxigenasa (HPPD), 4-hidroxi fenil piruvato de dioxigenasa (4-HPPD) y p-hidroxi fenil piruvato de dioxigenasa (p-HPPD) son sinónimas.
“Herbicidas de HPPD” son herbicidas que son blanqueadores, y cuyo sitio principal de acción es HPPD. Muchos son bien conocidos y se describen aquí en otra parte y en la bibliografía (Hawkes “Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase (HPPD) - The Herbicide Target”. En Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 211-220; Edmunds “Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) Inhibitors : Triketones”. En Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 221-242). Como se usa aquí, la expresión “herbicidas de HPPD” se refiere a herbicidas que actúan directa o indirectamente para inhibir HPPD, en la que los herbicidas son blanqueadores, y en la que la inhibición de HPPD es al menos parte del modo de acción del herbicida sobre las plantas.
Como se usa aquí, las plantas que son sustancialmente “tolerantes” a un herbicida presentan, cuando se tratan con dicho herbicida, una curva de dosis/respuesta que está desplazada a la derecha cuando se compara con la mostrada por plantas similares no tolerantes sometidas de forma similar. Tales curvas de dosis/respuesta tienen en el eje x representada gráficamente la “dosis”, y en el eje y tienen representado gráficamente el “porcentaje de exterminio o daño”, “efecto herbicida”, etc. Las plantas tolerantes necesitarán típicamente al menos dos veces tanto herbicida como las plantas similares no tolerantes, a fin de producir un efecto herbicida dado. Las plantas que son sustancialmente “resistentes” al herbicida presentan pocas lesiones, si las presentan, necróticas, líticas, cloróticas u otras lesiones, o, al menos, ninguna que impacte significativamente sobre el rendimiento, cuando se someten al herbicida a concentraciones y tasas que se emplean típicamente por la comunidad agrícola para exterminar malas hierbas en el campo.
Como se usa aquí, “plantas similares no transgénicas” son plantas que son similares o iguales a las plantas transgénicas, pero que no contienen un transgén que confiera resistencia a herbicidas.
Como se usa aquí, el término “conferir” se refiere a proporcionar una característica o rasgo, tal como tolerancia o resistencia a herbicidas, y/u otros rasgos deseables, a una planta.
Como se describe aquí en otra parte, el término “heterólogo” significa procedente de otra fuente. En el contexto de ADN, “heterólogo” se refiere a cualquier ADN “no propio” extraño, incluyendo aquél procedente de otra planta de la misma especie. Por ejemplo, en la presente solicitud, un gen de HPPD de haba de soja que se expresó de forma transgénica nuevamente en una planta de haba de soja todavía se describiría como ADN “heterólogo”.
El artículo “un” y “una” se usan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, hasta al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A título de ejemplo, “un elemento” significa uno o más elementos. A lo largo de la memoria descriptiva, la palabra “que comprende”, o variaciones tales como “comprende” o “comprender”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas señalados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.
Una variedad de términos adicionales se definen o se caracterizan de otro modo aquí.
Secuencias de HPPD
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Las composiciones de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos de HPPD nativos y mutantes, aislados o sustancialmente purificados, así como células hospedantes que comprenden los polinucleótidos de HPPD. Específicamente, la presente invención proporciona polipéptidos de HPPD que tienen actividad enzimática de HPPD, y que confieren resistencia o tolerancia en plantas a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD, y sus variantes y fragmentos. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de HPPD nativos y mutantes de la invención.
Los polipéptidos de HPPD mutantes de la presente invención tienen cambios de aminoácidos en una o más posiciones con relación a la secuencia de tipo salvaje de partida de la que derivan, y presentan tolerancia mejorada a uno o más herbicidas inhibidores de HPPD. Las enzimas HPPD que presentan tolerancia mejorada a un herbicida de HPPD lo pueden hacer en virtud de presentar, con relación a la enzima de partida no mutada similar:
a) un valor de Km más bajo para el sustrato natural, 4-hidroxifenilpiruvato;
b) un valor de kcat más elevado para convertir 4-hidroxifenilpiruvato en homogentisato;
c) un menor valor de la constante de velocidad aparente, kon, que gobierna la formación de un complejo de enzima:herbicida inhibidor de HPPD;
d) un valor incrementado de la constante de velocidad, koff, que gobierna la disociación de un complejo de enzima:herbicida inhibidor de HPPD; y/o
e) como resultado de cambios en uno o ambos de c) y d), un valor incrementado de la constante de equilibrio Ki (también denominada Kd), que gobierna la disociación del complejo de enzima:herbicida inhibidor de HPPD. Las secuencias de ADN que codifican tales HPPD mutadas mejoradas se usan en la provisión de plantas, cosechas, células vegetales y semillas de HPPD de la actual invención que ofrecen tolerancia o resistencia mejorada a uno o más herbicidas de HPPD en comparación con plantas similares que expresan igualmente la enzima de partida no mutada.
Se encuentra aquí que incrementos en el valor de kf son de valor particular a la hora de mejorar la capacidad de una HPPD para conferir resistencia a un herbicida de HPPD, mientras que, al menos en el intervalo por encima de 5000 s-1 M-1 a 25°C, los cambios en kon tienen un impacto relativamente pequeño. Así, por ejemplo, los compuestos B y C presentan valores de Kd similares con respecto a la HPPD de SEC ID NO: 1, pero valores de koff que son alrededor de un 10 veces diferentes con respecto a B y C. En consecuencia, las plantas transgénicas que expresan la HPPD de SEC ID NO: 1 presentan una resistencia superior al compuesto B que al compuesto C.
De este modo, se seleccionan HPPD preferidas como aquellas que, en comparación con otras enzimas HPPD, presentan tolerancia superior a uno o más tipos de herbicida de HPPD, y en las que la tolerancia se caracteriza in vitro mediante el valor numérico del parámetro (koff x kcat/ Km hpp), y en las que koff es la constante de velocidad que gobierna la velocidad de disociación del complejo de la enzima HPPD con el herbicida, y kcat/ Km hpp es el índice de recambio catalítico dividido entre el valor de Km para el sustrato HPP (4-hidroxifenilpiruvato).
De este modo, se divulga un método in vitro para caracterizar y seleccionar las HPPD que confieren niveles superiores de tolerancia a herbicidas de HPPD basados en la medición y comparación de los valores de kcat/ Km HPP y koff, o equivalentes funcionales de estos parámetros.
Se seleccionan mutaciones dirigidas al sitio de genes que codifican las HPPD para codificar cambios de aminoácidos seleccionados de aquellos enumerados aquí, ya sea individualmente o, preferiblemente, en combinación. Los genes que codifican tales formas mutantes de las HPPD son útiles para obtener plantas de cosechas resistentes a herbicidas que inhiben HPPD. Los genes de HPPD así modificados son especialmente adecuados para uso en plantas transgénicas a fin de conferir tolerancia o resistencia a herbicidas en las plantas de las cosechas. En una realización preferida, las HPPD derivan de plantas.
En la técnica se conocen muchas secuencias de HPPD, y se pueden usar para generar secuencias mutantes de HPPD haciendo sustituciones de aminoácidos que corresponden a las descritas aquí. Por ejemplo, una secuencia de HPPD conocida o sospechosa se puede inspeccionar para determinar la presencia de los motivos de aminoácidos SEC ID NOs: 15-19 y los cambios correspondientes descritos aquí realizados. Como alternativa, en el caso de las HPPD que no derivan de plantas, se pueden realizar cambios equivalentes a aquellos indicados aquí en base a alineamientos de secuencias y similitud con los motivos especificados aquí. Como alternativa, la secuencia a mejorar mediante mutación se puede alinear, por ejemplo, con SEC ID NO: 1 usando herramientas de alineamiento de secuencias estándar, y se pueden realizar las correspondientes sustituciones de aminoácidos descritas aquí con respecto a SEC ID NO: 1 en las posiciones correspondientes en la secuencia de referencia.
En realizaciones particulares, las composiciones de la invención comprenden un polipéptido de HPPD mutante que tiene una identidad de secuencia de al menos un 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con SEC ID NO: 2, en la que el polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD, y en las que el polipéptido contiene una o más sustituciones que corresponden a las posiciones de aminoácidos enumeradas en la columna 1 de la Tabla 1.
5
10
15
20
25
30
35
40
Tabla 1. Mutaciones de HPPD ejemplares
Posición de aminoácido mutable con relación a SEC ID NO: 1
Sustitución o adición
217
A, I, L,
326
R, K, H, N, I, L, T, S,Q
339
E, D, G, C, N, Q, S, A, L
358
M, F, Y, I, A,W, V
408
R, K, H, E, D, N, Q, A, S, T
411
_____________ST_____________
En diversas realizaciones, un aminoácido en una o más posiciones dados en la columna 1 se sustituye por cualquier otro aminoácido. En otra realización, el polipéptido comprende una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos que corresponden a la sustitución o sustituciones o supresión o supresiones de aminoácidos dados en la columna 2 de la Tabla 1. En aún otra realización, el polipéptido comprende una o más sustituciones que corresponden a una variante conservativa de los aminoácidos dados en la columna 2 de la Tabla 1.
Por ejemplo, el polipéptido puede comprender una mutación que corresponde a la posición del aminoácido 339 de SEC ID NO: 1, en la que el aminoácido se sustituye por un glutamato o una sustitución conservativa de glutamato.
Los términos “polipéptido”, “péptido”, y “proteína” se usan aquí de forma intercambiable para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los polipéptidos de la invención se pueden producir a partir de un ácido nucleico descrito aquí, o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándar. Por ejemplo, se puede producir una proteína truncada de la invención mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante de la invención en una célula hospedante apropiada, o, como alternativa, mediante una combinación de procedimientos ex vivo, tal como digestión con proteasas y purificación.
En consecuencia, la presente invención también proporciona moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos de HPPD mutantes que tienen actividad enzimática de HPPD, y que confieren resistencia o tolerancia en plantas a ciertas clases de herbicidas que inhiben HPPD, y sus variantes y fragmentos. En general, la invención incluye cualquier secuencias polinucleotídica que codifique cualquiera de los polipéptidos de HPPD mutantes descritos aquí, así como cualquier secuencias polinucleotídica que codifique polipéptidos de HPPD que tienen una o más sustituciones conservativas de aminoácidos con relación a los polipéptidos de HPPD mutantes descritos aquí. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los cinco grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: Alifático: Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I); Aromático: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); Que contienen azufre: Metionina (M), Cisteína (C); Básico: Arginina I, Lisina (K), Histidina (H); Ácido: Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E), Asparagina (N), Glutamina (Q).
En una realización, la presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con SEC ID NO: 2, en la que la secuencia de aminoácidos de HPPD deriva de una planta, en la que el polipéptido tiene actividad enzimática de HPPD, y en la que el polipéptido contiene una o más sustituciones, adiciones o supresiones como se discute más abajo.
En otra realización, la presente invención proporciona una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 54.
Como se usa aquí, “ácido nucleico” incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma mono- o bicatenaria, y, excepto que se limite de otro modo, engloba análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos) que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales por cuanto se hibridan a ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a oligonucleótidos de origen natural.
Como se usan aquí, los términos “que codifica” o “codificado”, cuando se usan en el contexto de un ácido nucleico específico, significa que el ácido nucleico comprende la información necesaria para dirigir la traducción de la secuencia nucleotídica en una proteína específica. La información mediante la cual una proteína es codificada se especifica mediante el uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) con regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias no traducidas que intervienen (por ejemplo, como en ADNc).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La invención divulga composiciones de polinucleótidos o de proteínas aislados o purificados. Un polinucleótido o proteína “aislado” o “purificado”, o una porción biológicamente activa de los mismos, está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o proteína como se encuentra en su entorno de origen natural. De este modo, un polinucleótido o proteína aislado o purificado está esencialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. De forma óptima, un polinucleótido “aislado” está libre de secuencias (óptimamente secuencias que codifican proteínas) que flanquean de forma natural el polinucleótido (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del que deriva el polinucleótido. Por ejemplo, en diversas realizaciones, el polinucleótido aislado puede contener menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencia nucleotídica que flanquea de forma natural el polinucleótido en ADN genómico de la célula de la que deriva el polinucleótido. Una proteína que está sustancialmente libre de actividades enzimáticas que interfieren, y que es capaz de ser caracterizada con respecto a sus propiedades catalíticas, cinéticas y moleculares, incluye preparaciones bastante brutas de proteína (por ejemplo producidas recombinantemente en extractos celulares) que tienen menos de alrededor de un 98%, 95% 90%, 80%, 70 %, 60% o 50% (en peso seco) de proteína contaminante, así como preparaciones purificadas adicionalmente por métodos conocidos en la técnica para que tengan 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, o 1% (en peso seco) de proteína contaminante.
Las proteínas de la invención se pueden alterar de diversas maneras, incluyendo sustituciones, supresiones, truncamiento, e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son conocidos generalmente en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes y fragmentos de secuencias de aminoácidos de las proteínas de HPPD de mutantes mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para la mutagénesis y las alteraciones polinucleotídicas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488- 492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente U.S. n° 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York), y las referencias citadas allí. En el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) se puede encontrar una guía en cuanto a sustituciones apropiadas de aminoácidos que a menudo no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés. Pueden ser óptimas las sustituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido por otro que tenga propiedades similares.
Los polinucleótidos de la invención también se pueden usar para aislar secuencias correspondientes procedentes de otros organismos, particularmente otras plantas. De esta manera, se pueden usar métodos tales como PCR, hibridación, y similares, para identificar tales secuencias basándose en su homología de secuencia con las secuencias expuestas aquí.
En un enfoque de PCR, se pueden diseñar cebadores oligonucleotídicos para uso en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier planta de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y clonar mediante PCR son generalmente conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Véanse también Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York).
En técnicas de hibridación todo o parte de un polinucleótido conocido se usa como una sonda que se hibrida de forma selectiva a otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico o fragmentos de ADNc clonados (es decir, librerías genómicas o de ADNc) procedentes de un organismo escogido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y se pueden marcar con un grupo detectable, tal como 32P, o cualquier otro marcador detectable. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación y para construcción de librerías de ADNc y genómicas son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York).
Por “que se hibrida a” o “que se hibrida específicamente a” se refiere a la unión, formación de dúplex, o hibridación de una molécula sólo a una secuencia nucleotídica particular en condiciones restrictivas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total). “Se une(n) sustancialmente” se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico diana, y abarca desemparejamientos menores que se pueden arreglar reduciendo la restricción del medio de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico diana.
“Condiciones restrictivas de hibridación” y “condiciones de de hibridación y lavado restrictivas”, en el contexto de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como hibridaciones Southern y Northern, dependen de las secuencias, y son diferentes bajo parámetros medioambientales diferentes. Las secuencias más largas se hibridan
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
específicamente a mayores temperaturas. En Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays” Elsevier, Nueva York, se encuentra una guía amplia para la hibridación de ácidos nucleicos. Generalmente, las condiciones de hibridación y de lavado muy restrictivas se seleccionan para que sean alrededor de un 5°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Típicamente, en “condiciones restrictivas” una sonda se hibridará a su subsecuencia diana, pero no a otras secuencias.
La Tm es la temperatura (en fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente emparejada. Las condiciones muy restrictivas se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42°C, llevándose a cabo la hibridación toda la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado muy restrictivas es 0,1 NaCl 5M a 72°C durante alrededor de un 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado restrictivas es un lavado con 0,2X SSC a 65°C durante 15 minutos (véase, Sambrook, más abajo, para una descripción del tampón de SSC). A menudo, un lavado muy restrictivo va precedido por un lavado menos restrictivo, para eliminar la señal de la sonda de fondo. Un ejemplo de lavado de restricción media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1X SSC a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja restricción para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6X SSC a 40°C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, alrededor de un 10 a 50 nucleótidos), las condiciones restrictivas implican típicamente concentraciones de sal menores que alrededor de un 1,0 M de ion Na, típicamente alrededor de un 0,01 a 1,0 M de concentración de ion Na (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es típicamente al menos alrededor de un 30°C. Las condiciones restrictivas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida. En general, una relación de señal a ruido de 2X (o mayor) que la observada para una sonda no relacionada, en el ensayo de hibridación particular, indica detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones restrictivas todavía son sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto se produce, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético.
Lo siguiente son ejemplos de conjuntos de condiciones de hibridación/lavado que se pueden usar para clonar secuencias nucleotídicas que son homólogos de secuencias nucleotídicas de referencia de la presente invención: una secuencia nucleotídica de referencia se hibrida preferiblemente a la secuencia nucleotídica de referencia en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C con lavado en 2X SSC, 0,1% de SDS a 50°C, de forma más deseable en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C con lavado en 1X SSC, 0,1% de SDS a 50°C, todavía de forma más deseable en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C con lavado en 0,5X SSC, 0,1% de SDS a 50°C, preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EdTa a 50°C con lavado en 0,1X SSc, 0,1% de SDS a 50°C, más preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C con lavado en 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65°C.
También se divulgan fragmentos y variantes de las secuencias nucleotídicas descritas y proteínas codificadas consiguientemente. “Fragmento” quiere decir una porción de la secuencia nucleotídica o una porción de la secuencia de aminoácidos, y por tanto proteína codificada consiguientemente. Los fragmentos de una secuencia nucleotídica pueden codificar fragmentos proteicos que retienen la actividad biológica de la proteína de HPPD mutante, y por tanto tienen actividad enzimática de HPPD. Como alternativa, los fragmentos de una secuencia nucleotídica que son útiles como sondas de hibridación o en reacciones de mutagénesis y barajado, para generar todavía más variantes de HPPD, generalmente no codifican proteínas de fragmentos que retienen actividad biológica. De este modo, los fragmentos de una secuencia nucleotídica pueden oscilar desde alrededor de un 20 nucleótidos, alrededor de un 50 nucleótidos, alrededor de un 100 nucleótidos, y hasta la secuencia nucleotídica de longitud completa que codifica los polipéptidos de la invención.
Un fragmento de una secuencia nucleotídica que codifica una porción biológicamente activa de una proteína de HPPD mutante de la invención codificará al menos 15, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 180, 200, 250, 300, 350 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido de HPPD mutante de longitud completa. Los fragmentos en una secuencia nucleotídica que son útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente activa de una proteína de HPPD.
Como se usa aquí, “secuencia de longitud completa”, en referencia a un polinucleótido específico, significa que tiene toda la secuencia de ácido nucleico de una secuencia de HPPD nativa o mutada. “Secuencia nativa” quiere decir una secuencia endógena, es decir, una secuencia no manipulada mediante ingeniería, encontrada en un genoma del organismo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
De este modo, un fragmento de una secuencia nucleotídica de la divulgación puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido de HPPD mutante, o puede ser un fragmento que se puede usar como una sonda de hibridación, etc., o cebador de PCR, usando métodos descritos más abajo. Una porción biológicamente activa de un polipéptido de HPPD mutante se puede preparar aislando una porción de una de las secuencias nucleotídicas de la invención, expresando la porción codificada de la proteína de HPPD mutante (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro), y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína de HPPD mutante. Las moléculas de ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia nucleotídica de la invención comprenden al menos 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, ó 1300 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia nucleotídica de longitud completa descrita aquí.
“Variantes” quiere decir secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende una supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos con referencia al polinucleótido, y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido de HPPD mutante. Como se usa aquí, un polinucleótido o polipéptido “de referencia” comprende una secuencia nucleotídica o secuencia de aminoácidos de HPPD mutante, respectivamente. Como se usa aquí, un polinucleótido o polipéptido “nativo” comprende una secuencia nucleotídica o secuencia de aminoácidos de origen natural, respectivamente. La persona experta en la técnica reconocerá que se pueden construir variantes de los ácidos nucleicos de la invención de manera que se mantenga el marco de lectura abierto. Para polinucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de HPPD mutantes de la invención. Las variantes alélicas de origen natural, tales como estas, se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación como se explica más abajo. Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótido derivado sintéticamente, tales como aquellos generados, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio, pero que todavía codifican una proteína de HPPd mutante. Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos un 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más con aquel polinucleótido particular según se determina mediante programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos aquí en otra parte.
Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar comparando el porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. De este modo, por ejemplo, se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido con un porcentaje de identidad de secuencia dado con los polipéptidos SEC ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 49 y 50. El porcentaje de identidad de secuencia entre cualesquiera dos polipéptidos se puede calcular usando programas de alineamiento de secuencias y los parámetros descritos aquí en otra parte.
Proteína “variante” quiere decir una proteína derivada de una proteína de referencia mediante supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína de HPPD mutante, y/o mediante sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína de HPPD mutante. Las proteínas variantes englobadas por la presente invención son biológicamente activas, esto es, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína de HPPD mutante, esto es, actividad enzimática de HPPD y/o tolerancia a herbicidas como se describe aquí. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético, o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína de HPPD mutante de la invención tendrán una identidad de secuencia de al menos un 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a lo largo de la totalidad de la secuencia de aminoácidos para la proteína de HPPD mutante, según se determina mediante programas de alineamiento de secuencias, y parámetros descritos aquí en otra parte. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de esa proteína en tan pocos como 1-15 restos de aminoácidos, tan pocos como 1-10, tales 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso un resto de aminoácido.
Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica, y se pueden lograr usando algoritmos matemáticos tales como el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineamiento local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; y el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia, se pueden utilizar implementaciones computerizadas de estos algoritmos matemáticos. Tales implementaciones incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FaStA, y TFASTA en el GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA).
Apilamiento de genes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En ciertos aspectos, los polinucleótidos de la invención que codifican polipéptidos de HPPD nativos o mutantes, o sus variantes, que retienen actividad enzimática de HPPD (por ejemplo, una secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID NO: 2) se pueden apilar con cualquier combinación de secuencias polinucleotídicas de interés, a fin de crear plantas con un rasgo deseado. Un rasgo, como se usa aquí, se refiere al fenotipo derivado de una secuencia particular o grupos de secuencias. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican un polipéptido de HPPD mutante o una variante del mismo, que retiene actividad enzimática de HPPD, se pueden apilar con cualesquiera otros polinucleótidos que codifican polipéptidos que confieren un rasgo deseable, incluyendo, pero sin limitarse a, resistencia a enfermedades, insectos, y herbicidas, tolerancia al calor y a la sequía, tiempo reducido para la madurez de la cosecha, procesamiento industrial mejorado, tal como para la conversión de almidón o biomasa en azúcares fermentables, y calidad agronómica mejorada, tal como contenido elevado de aceite y contenido proteico elevado.
En un aspecto particular de la divulgación, los polinucleótidos se pueden apilar (o, como alternativa, los casetes de expresión se pueden apilar en un único polinucleótido) para expresar más de un tipo de polipéptido de HPPD dentro de una planta. Esto es una ventaja particular cuando, por ejemplo, una HPPD es particularmente adecuada para proporcionar resistencia a una clase de herbicida de HPPD, mientras que la otra proporciona mejor tolerancia a una clase diferente de herbicida de HPPD. El apilamiento de polipéptidos de HPPD también es una ventaja cuando un polipéptido expresa resistencia inherente a herbicidas, pero es en cierto modo lábil. Esta HPPD resistente a herbicidas se puede estabilizar entonces en expresión mixta con, por ejemplo, HPPD similares pero menos lábiles a temperaturas, a través de la formación de dímeros enzimáticos mixtos.
Los polinucleótidos ejemplares que se pueden apilar con polinucleótidos de la invención que codifican un polipéptido de HPPD mutante, o una variante del mismo, que retiene actividad enzimática de HPPD incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos que confieren resistencia a plagas/patógenos, tales como virus, nemátodos, insectos u hongos, y similares. Los polinucleótidos ejemplares que se pueden apilar con polinucleótidos de la invención incluyen polinucleótidos que codifican: polipéptidos que tienen actividad plaguicida y/o insecticida, tales como otras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas en las patentes U.S. nos 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descrita en la patente U.S. n° 5.981.722), y similares; rasgos deseables para resistencia a enfermedades o a herbicidas (por ejemplo, genes de destoxificación de fumonixina (patente U.S. n° 5.792.931); genes de avirulencia y de resistencia a enfermedades (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); un gen que codifica una ariloxialcanoato dioxigenasa, que confiere resistencia a ciertas clases de herbicidas de auxina y de acetylCoA carboxilasa (por ejemplo, en las Publicaciones PCT nos WO 2008/141154, WO 2007/053482 o un gen tfdA que da resistencia a 2,4 D en la patente U.S. n° 6.153.401); un gen que codifica una dicamba monoxigenasa (Behrens et al. (2007) Science, 316, 1185) que confiere resistencia a dicamba; un gen que codifica una homogentisato solanesiltransferasa (HST), que confiere resistencia a herbicidas que inhiben HST (Publicación PCT n° WO 2010/029311); un gen que codifica una nitrilasa, que confiere resistencia a un herbicida que contiene nitrilo (por ejemplo, la bxnA bromoxinil nitrilasa); mutantes de acetolactato sintasa (ALS), que conducen a resistencia a herbicidas, tales como las mutaciones S4 y/o Hra; resistencia a glifosato (por ejemplo, gen de 5-enol-pirovil-chiquimato-3-fosfato-sintasa (EPSPS), descrito en las in Patentes U.S. nos 4.940.935 y 5.188.642; o el gen de glifosato N-acetiltransferasa (GAT), descrito en Castle et al. (2004) Science, 304:1151-1154; y en las Publicaciones de Solicitudes de Patentes U.S. nos 20070004912, 20050246798, y20050060767)); resistencia a glufosinato (por ejemplo, genes de fosfinotricin acetil transferasa PAT y BAR, descritos en las Patentes U.S. nos 5.561.236 y 5.276.268); un citocromo P450 o una variante del mismo, que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas, entre otros, a herbicidas de HPPD (Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20090011936; Patentes U.S. nos 6.380.465; 6.121.512; 5.349.127; 6.649.814; y 6.300.544; y Publicación PCT n° WO 2007/000077); y rasgos deseables para el procesamiento o procesar productos tales como aceite elevado (por ejemplo, patente U.S. n° 6.232.529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasa (patente U.S. n° 5.952.544; Publicación PCT n° WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sintasas (SS), enzimas de ramificación de almidones (SBE), y enzimas de desramificación de almidones (SDBE)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, patente U.S. n° 5.602.321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa, y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) que facilita la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA)).
De este modo, los polinucleótidos que codifican un polipéptido de HPPD nativo o mutante, o variante del mismo, que retiene actividad enzimática de HPPd, se pueden apilar con uno o más polinucleótidos que codifican polipéptidos que confieren resistencia o tolerancia a un herbicida. En un aspecto, el rasgo deseable es resistencia o tolerancia a un inhibidor de HPPD. En otro aspecto, el rasgo deseable es resistencia o tolerancia a glifosato. En otro aspecto, el rasgo deseable es resistencia o tolerancia a glufosinato. En aspectos adicionales, el rasgo deseable es resistencia o tolerancia a un herbicida inhibidor de HST, un herbicida de auxina o un herbicida de PSII.
Estas combinaciones apiladas se pueden crear por cualquier método, incluyendo, pero sin limitarse a, reproducción cruzada de plantas mediante cualquier metodología convencional o TopCross, o transformación genética. Si las
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
secuencias se apilan transformando genéticamente las plantas, las secuencias polinucleotídicas de interés se pueden combinar en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más rasgos deseados se puede usar como la diana para introducir rasgos adicionales mediante transformación subsiguiente. Los rasgos se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés proporcionados por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se introdujeran dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación (trans) separados, o pueden estar contenidas en el mismo casete de transformación (cis). La expresión de las secuencias se puede llevar a cabo por el mismo promotor, o por promotores diferentes. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un casete de transformación que suprimirá la expresión del polipéptido de interés. Este se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión, para generar la combinación deseada de rasgos en la planta. Se reconoce además que se pueden apilar secuencias polinucleotídicas en una localización genómica deseada usando un sistema de recombinación específica del sitio. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT nos WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855, y WO 99/25853.
Casetes de expresión vegetales
Las composiciones de la invención pueden contener adicionalmente secuencias de ácidos nucleicos para la transformación y expresión en una planta de interés. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden estar presentes en constructos de ADN o casetes de expresión. “Casete de expresión”, como se usa aquí, significa una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia nucleotídica particular en una célula hospedante apropiada, que comprende un promotor enlazado operablemente a la secuencia nucleotídica de interés (es decir, un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que retiene actividad enzimática de HPPD, solo o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables) que está operablemente enlazada a señales de terminación. También comprende típicamente secuencias requeridas para la traducción apropiada de la secuencia nucleotídica. La región codificante codifica habitualmente una proteína de interés, pero también codifica un ARN funcional de interés, por ejemplo ARN antisentido o un ARN no traducido, en la dirección del sentido o antisentido. El casete de expresión que comprende la secuencia nucleotídica de interés puede ser quimérico, queriendo decir que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión puede ser también uno que sea de origen natural, pero se ha obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Típicamente, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al hospedante, es decir, la secuencia de aDn particular del casete de expresión no se encuentra de forma natural en la célula hospedante, y se debe de haber introducido en la célula hospedante o en un ancestro de la célula hospedante mediante un suceso de transformación. La expresión de la secuencia nucleotídica en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, o de un promotor inducible, que inicia la transcripción sólo cuando la célula hospedante se expone a cierto estímulo externo particular. Adicionalmente, el promotor puede ser también específico de un tejido u órgano o etapa de desarrollo particular.
La presente invención engloba la transformación de plantas con casetes de expresión capaces de expresar un polinucleótido de interés, es decir, un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que retiene actividad enzimática de HPPD, solo o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. El casete de expresión incluirá en la dirección 5'- 3' de la transcripción una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor) y un marco de lectura abierto polinucleotídico. El casete de expresión puede comprender opcionalmente una región de terminación transcripcional y traduccional (es decir, región de terminación) funcional en plantas. En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende un gen marcador seleccionable, para permitir la selección de transformantes estables. Los constructos de expresión de la invención pueden comprender también una secuencia líder, y/o una secuencia que permite la expresión inducible del polinucleótido de interés. Véase Guo et al. (2003) Plant J. 34:383-92 y Chen et al. (2003) Plant J. 36:731-40, para ejemplos de secuencias que permiten la expresión inducible.
Las secuencias reguladoras del constructo de expresión están enlazadas operablemente al polinucleótido de interés. Por “enlazadas operablemente” se quiere decir un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en el que la segunda secuencia inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. Generalmente, operablemente enlazadas significa que las secuencias nucleotídicas que se enlazan son contiguas.
En la práctica de la invención se puede usar cualquier promotor capaz de dirigir la expresión en la planta de interés. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo al hospedante vegetal. Los términos “heterólogo” y “exógeno”, cuando se usan aquí, se refieren a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo una secuencia de ADN o ARN) o un gen, se refieren a una secuencia que se origina de una fuente extraña a la célula hospedante particular, o, si procede de la misma fuente, está modificada de su forma original. De este modo, un gen heterólogo en una célula hospedante incluye un gen que es endógeno a la célula hospedante particular, pero que se ha modificado, por ejemplo, mediante el uso de barajado de ADN. Los términos también incluyen múltiples copias de origen no natural de una secuencia de ADN de origen natural. De este modo, los términos se refieren a un fragmento de ADN que es extraño o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedante en la que el elemento no se encuentra normalmente. Los segmentos de ADN exógenos se expresan para producir polipéptidos exógenos.
Una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) “homóloga” es una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) asociada de forma natural con una célula hospedante en la que se introduce.
La elección de los promotores a incluir depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, eficiencia, selectibilidad, inducibilidad, nivel de expresión deseado, y expresión preferencial por células o tejidos. Es una materia normal para un experto en la técnica modular la expresión de una secuencia seleccionando y colocando apropiadamente promotores y otras regiones reguladoras con relación a esa secuencia. Los promotores que se usan para la expresión del transgén o transgenes pueden ser un promotor vegetal fuerte, un promotor vírico, o promotores quiméricos compuestos de elementos tales como: la caja TATA de cualquier gen (o cajas TATA sintéticas, basadas en el análisis del gen de la planta), opcionalmente fusionado a la región 5' a la caja TATA de promotores vegetales (que dirigen la expresión génica en tejidos y temporalmente apropiada), opcionalmente fusionado a uno o más potenciadores (tales como el potenciador 35S, el potenciador FMV, el potenciador CMP, el potenciador de la SUBUNIDAD PEQUEÑA DE RUBISCO, el potenciador de PLASTOCYANINA).
Los promotores constitutivos ejemplares incluyen, por ejemplo, el promotor central del promotor Rsyn7, y otros promotores constitutivos descritos en el documento WO 99/43838 y en la patente U.S. n° 6.072.050; el promotor CaMV 35S central (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632; y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581 -588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); el promotor de ALS (patente U.S. n° 5.659.026), y similares. Otros promotores constitutivos se incluyen en, por ejemplo, las Patentes U.S. nos 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611.
Los promotores vegetales o quiméricos apropiados son útiles para aplicaciones tales como la expresión de transgenes en ciertos tejidos, mientras que minimizan la expresión en otros tejidos, tales como semillas, o tejidos reproductivos. Los promotores de tipo celular o preferencialmente tisulares ejemplares conducen la expresión preferentemente en el tejido diana, pero también pueden igualmente conducir a cierta expresión en otros tipos celulares o tejidos. Los métodos para identificar y caracterizar regiones promotoras en ADN genómico vegetal incluyen, por ejemplo, los descritos en las siguientes referencias: Jordano, et al., Plant Cell, 1:855-866 (1989); Bustos, et al., Plant Cell, 1:839-854 (1989); Green, et al., EMBO J. 7, 4035-4044 (1988); Meier, et al, Plant Cell, 3, 309-316 (1991); y Zhang, et al., Plant Physiology 110: 1069-1079 (1996).
En otros aspectos de la presente divulgación, se pueden desear promotores inducibles. Los promotores inducibles llevan a cabo la transcripción en respuesta a estímulos externos, tales como agentes químicos, o estímulos medioambientales. Por ejemplo, los promotores inducibles pueden conferir transcripción en respuesta hormonas tales como ácido giberélico o etileno, o en respuesta a la luz o a la sequía.
Existe una variedad de terminadores transcripcionales para uso en casetes de expresión. Son responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgén, y la poliadenilación de ARNm correcta. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés operablemente enlazada, puede ser nativa con el hospedante vegetal, o puede derivar de otra fuente (es decir extraña o heteróloga al promotor, a la secuencia de ADN de interés, al hospedante vegetal, o a cualquier combinación de los mismos). Los terminadores transcripcionales apropiados son aquellos que se sabe que funcionan en plantas, e incluyen el terminador CAMV 35S, el terminador tml, el terminador de nopalina sintasa, y el terminador rbcs E9 del guisante. Estos se pueden usar tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Además, se puede usar un terminador de la transcripción nativo del gen.
Generalmente, el casete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados.
Se han encontrado numerosas secuencias para potenciar la expresión génica a partir de la unidad transcripcional, y estas secuencias se pueden usar conjuntamente con los genes de esta invención para incrementar su expresión en plantas transgénicas.
Se ha demostrado que diversas secuencias intrónicas potencian la expresión, particularmente en células monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha encontrado que los intrones del gen Adhl del maíz potencian significativamente la expresión del gen de tipo salvaje bajo su promotor cognato cuando se introducen en células de maíz. Se encontró que el intrón 1 es particularmente efectivo y que potenció la expresión en constructos de fusión con el gen de cloranfenicol acetiltransferasa (Callis et al. Genes Develop. 1:1183-1200 (1987)). En el mismo sistema experimental, el intrón del gen
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
bronce 1 del maíz tiene un efecto similar potenciando la expresión. Las secuencias intrónicas se han incorporado de forma habitual en vectores de transformación de plantas, típicamente en el líder no traducido.
También se sabe que un número de secuencias líder no traducidas, derivadas de virus, potencian la expresión, y estas son particularmente efectivas en células dicotiledóneas. Específicamente, se ha demostrado que las secuencias líder del virus del mosaico del tabaco (TMV, la “secuencia W”), el virus del moteado clorótico del maíz (MCMV), y el virus del mosaico de la alfalfa (AMV), son efectivas potenciando la expresión (por ejemplo, Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15: 86938711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)). Otras secuencias líder conocidas en la técnica incluyen, pero no se limitan a: líderes de picomavirus, por ejemplo líder de EMCV (región no codificante de 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., y Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130 (1989)); los líderes de potivirus, por ejemplo el líder del virus del jaspeado del tabaco (TEV) (Allison et al. 1986); el líder del virus del mosaico del enanismo maíz (MDMV); Virology 154:9-20); el líder de la proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak, D. G., y Samow, P., Nature 353: 90-94 (1991); el líder no traducido procedente del ARNm de proteína de revestimiento del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling, S. A., y Gehrke, L., Nature 325:622- 625 (1987); el líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie, D. R. et al., Molecular Biology of RNA, 237-256 (1989); y el líder del virus moteado clorótico del maíz (McmV) (Lommel, S. A. et al., Virology 81:382-385 (1991). Véase también, Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968 (1987).
En la presente invención también se divulgan constructos de ácidos nucleicos que comprenden uno o más de los casetes de expresión descritos anteriormente. El constructo puede ser un vector, tal como un vector de transformación vegetal. En un aspecto, el vector es un vector de transformación vegetal que comprende un polinucleótido que comprende la secuencia expuesta en SEC ID NO: 51 o SEC ID NO: 52.
Plantas
Como se usa aquí, la expresión “parte vegetal” o “tejido vegetal” incluye células vegetales, protoplastos vegetales, cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales se pueden generar plantas, callos vegetales, racimos vegetales, y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, fruta, pepitas, espigas, mazorcas, cáscaras, tallos, raíces, puntas de raíces, anteras, y similares. Las expresiones mencionadas anteriormente incluyen productos vegetales, tales como grano, frutos, y nueces.
Las plantas útiles en la presente invención incluyen plantas que son transgénicas para al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que retiene actividad enzimática de HPPD, solo o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. El tipo de planta seleccionada depende de una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, el uso aguas abajo del material vegetal cosechado, la susceptibilidad de la especie vegetal a la transformación, y las condiciones en las que se harán crecer, se cosecharán, y/o se procesarán las plantas. Un experto reconocerá además que factores adicionales para seleccionar variedades vegetales apropiadas para uso en la presente invención incluyen elevado potencial de rendimiento, buena fortaleza del tallo, resistencia a enfermedades específicas, tolerancia a la sequía, secado rápido, y suficiente calidad de grano para permitir el almacenamiento y el envío al mercado con pérdida mínima.
Las plantas según la presente invención incluyen cualquier planta que se cultive con el fin de producir material vegetal que es buscado por el hombre o animal para el consumo oral, o para la utilización en un proceso industrial, farmacéutico, o comercial. La invención se puede aplicar a cualquiera de una variedad de plantas, incluyendo, pero sin limitarse a, maíz, trigo, arroz, cebada, haba de soja, algodón, sorgo, habas en general, colza/cánola, alfalfa, lino, girasol, alazor, mijo, centeno, caña de azúcar, remolacha azucarera, cacao, té, Brassica, algodón, café, batata, lino, cacahuete, clavo; vegetales tales como lechuga, tomate, cucurbitáceas, casabe, patata, zanahoria, rábano, guisante, lentejas, repollo, coliflor, brócoli, coles de Bruselas, pimientos, y piña; frutas de árboles tales como limón, manzanas, peras, melocotones, albaricoques, nueces, aguacate, plátano, y coco, y flores tales como orquídeas, claveles y rosas. Otras plantas útiles en la práctica de la invención incluyen pastos perennes, tales como pasto varilla, pastos de las praderas, pasto de la India, pasto de tallo azul gigante, y similares. Se reconoce que se pueden usar mezclas de plantas.
Además, el término “cosechas” se ha de entender también que incluye cosechas que se han hecho tolerantes a herbicidas o clases de herbicidas (tales como, por ejemplo, inhibidores de ALS, por ejemplo primisulfurón, prosulfurón y trifloxisulfurón, inhibidores de EPSPS (5-enol-pirovil-chiquimato-3-fosfato-sintasa), inhibidores de gS (glutamina sintetasa)) como resultado de métodos convencionales de reproducción o manipulación genética mediante ingeniería. Los ejemplos de cosechas que se han hecho tolerantes a herbicidas o clases de herbicidas mediante métodos de manipulación genética mediante ingeniería incluyen variedades de cosechas resistentes a glifosato y a glufosinato, comercialmente disponibles con los nombres comerciales RoundupReady® y LibertyLink®. El método según la presente invención es especialmente adecuado para la protección de cosechas de haba de soja que también se han hecho tolerantes a glifosato y/o glufosinato, y en las que se usan herbicidas de HPPD en un programa de control de malas hierbas junto con otros de tales herbicidas (glufosinato y/o glifosato) para el control de malas hierbas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se contempla además que los constructos divulgados se pueden introducir en variedades vegetales que tienen propiedades mejoradas adecuadas u óptimas para un uso aguas abajo particular. Por ejemplo, la variabilidad genética de origen natural da como resultado plantas con resistencia o tolerancia a inhibidores de HPPD u otros herbicidas, y tales plantas son también útiles en los métodos divulgados. El método según la presente divulgación se puede optimizar además cruzando los transgenes que proporcionan un nivel de tolerancia con variedades de cultivo de haba de soja que muestran un nivel mejorado de tolerancia a inhibidores de HPPD que se encuentra en un pequeño porcentaje de líneas de haba de soja.
Transformación vegetal
Una vez que se ha clonado en un sistema de expresión un polinucleótido de HPPD mutante resistente o tolerante a herbicidas, solo o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables, se transforma en una célula vegetal. Los casetes de expresión de la invención se pueden introducir en la célula vegetal de muchas maneras reconocidas en la técnica. El término “introducir”, en el contexto de un polinucleótido, por ejemplo un constructo nucleotídico de interés, quiere decir presentar a la planta el polinucleótido de manera que el polinucleótido gane acceso al interior de una célula de la planta. Cuando se va a introducir más de un polinucleótido, estos polinucleótidos se pueden ensamblar como parte de un único constructo nucleotídico, o como constructos nucleotídicos separados, y se pueden localizar en los mismos vectores de transformación o en diferentes vectores de transformación. En consecuencia, estos polinucleótidos se pueden introducir en la célula hospedante de interés en un suceso de transformación individual, en sucesos de transformación separados, o, por ejemplo, en plantas, como parte de un protocolo de reproducción. Los métodos de la invención no dependen del método particular para introducir uno o más polinucleótidos en una planta, sólo que el polinucleótido o polinucleótidos ganen acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación transitoria, métodos de transformación estable, y métodos mediados por virus.
“Transformación transitoria”, en el contexto de un polinucleótido, quiere decir que se introduce un polinucleótido en la planta y no se integra en el genoma de la planta.
Por “introducir de forma estable” o “introducido de forma estable”, en el contexto de un polinucleótido introducido en una planta, se quiere decir que el polinucleótido introducido se incorpora de forma estable en el genoma de la planta, y de este modo la planta se transforma de forma estable con el polinucleótido.
“Transformación estable” o “transformado de forma estable” quiere decir que un polinucleótido, por ejemplo un constructo nucleotídico descrito aquí, introducido en una planta, se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma, más particularmente por la progenie de múltiples generaciones sucesivas.
Aquellos de pericia normal en las técnicas de transformación vegetal conocen numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación vegetal, y se pueden usar los genes pertinentes a esta invención conjuntamente con cualquiera de tales vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y de la especie diana para la transformación. Para ciertas especies diana, se pueden preferir diferentes marcadores de selección de antibióticos o de herbicidas. Los marcadores de selección usados habitualmente en transformación incluyen el gen nptll, que confiere resistencia a canamicina y antibióticos relacionados (Messing y Vierra Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), los genes pat y bar, que confieren resistencia al herbicida glufosinato (también denominado fosfinotricina; véanse White et al., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990) y las patentes U.S. nos 5.561.236 y 5.276.268), el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger y Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), y el gen de dhfr, que confiere resistencia a metatrexato (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)), el gen de EPSPS, que confiere resistencia a glifosato (patentes U.S. nos 4.940.935 y 5.188.642), el gen de glifosato N-acetiltransferasa (GAT), que también confiere resistencia a glifosato (Castle et al. (2004) Science, 304:1151-1154; Pub. Sol. de patentes U.S. nos 20070004912, 20050246798, y 20050060767); y el gen de manosa-6-fosfato isomerasa, que proporciona la capacidad para metabolizar manosa (patentes U.S. nos 5.767.378 y 5.994.629). Como alternativa, y en una realización preferida, el gen de HPPD de la actual invención se usa él mismo, como el marcador seleccionable, en combinación con el uso de un herbicida de HPPD como agente de selección.
Los métodos para la regeneración de plantas también son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se han utilizado vectores plasmídicos Ti para el suministro de ADN extraño, así como la captación directa de ADN, liposomas, electroporación, microinyección, y microproyectiles. Además, se pueden utilizar bacterias del género Agrobacterium para transformar células vegetales. A continuación se dan descripciones de técnicas representativas para transformar plantas tanto dicotiledóneas como monocotiledóneas, así como una técnica de transformación de plástidos representativa.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Muchos vectores están disponibles para la transformación usando Agrobacterium tumefaciens. Estos poseen típicamente al menos una secuencia frontera de T-DNA, e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Para la construcción de vectores útiles en la transformación con Agrobacterium, véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 2006/0260011.
La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens soslaya la necesidad de secuencias de T-DNA en el vector de transformación escogido, y en consecuencia se pueden utilizar vectores que carecen de estas secuencias, además de vectores tales como aquellos descritos anteriormente que contienen las secuencias de T-DNA. Las técnicas de transformación que no se basan en Agrobacterium incluyen la transformación vía bombardeo con partículas, captación de protoplastos (por ejemplo, PEG y electroporación) y microinyección. La elección del vector depende enormemente de la selección preferida para la especie que se transforma. Para la construcción de tales vectores, véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20060260011.
Para la expresión de una secuencia nucleotídica de la presente invención en plástidos vegetales, se usa el vector de transformación de plástidos pPH143 (véase la Publicación PCT n° WO 97/32011, Ejemplo 36). La secuencia nucleotídica se inserta en pPH143, sustituyendo de ese modo la secuencia codificante de PROTOX. Este vector se usa entonces para la transformación plastídica y la selección de transformantes para resistencia a espectinomicina. Como alternativa, la secuencia nucleotídica se inserta en pPH143, de forma que sustituye al gen aadH. En este caso, los transformantes se seleccionan para resistencia a inhibidores de PROTOX.
Las técnicas de transformación para dicotiledóneas son bien conocidas en la técnica, e incluyen técnicas a base de Agrobacterium y técnicas que no requieren Agrobacterium. Las técnicas sin Agrobacterium implican la captación de material genético exógeno directamente por los protoplastos o células. Esto se puede lograr mediante captación mediada por PEG o por electroporación, suministro mediado por bombardeo con partículas, o microinyección. Los ejemplos de estas técnicas se describen por Paszkowski et al. EMBO J. 3:2717-2722 (1984); Potrykus et al. Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985); Reich et al. Biotechnology 4:1001-1004 (1986); y Klein et al. Nature 327:70-73 (1987). En cada caso, las células transformadas se regeneran en plantas completas usando técnicas estándar conocidas en la técnica.
La transformación mediada por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de dicotiledóneas, debido a su elevada eficiencia de transformación ya su amplia utilidad con muchas especies diferentes. La transformación mediada por Agrobacterium implica típicamente la transferencia del vector binario que posee el ADN extraño de interés (por ejemplo, pCIB200 o pCIB2001) a una cepa de Agrobacterium apropiada, que puede depender del complemento de genes vir portados por la cepa hospedante de Agrobacterium en un plásmido Ti corresidente, o cromosómicamente (por ejemplo, cepa CIB542 para pCIB200 y pCIB2001 (Uknes et al. Plant Cell 5:159-169 (1993)). La transferencia del vector binario recombinante a Agrobacterium se logra mediante un procedimiento de emparejamiento triparental usando E. coli que posee el vector binario recombinante, una cepa de E. coli auxiliar que posee un plásmido tal como pRK2013 y que es capaz de movilizar el vector binario recombinante a la cepa diana de Agrobacterium. Como alternativa, el vector binario recombinante se puede transferir a Agrobacterium mediante transformación con ADN (Hofgen y Willmitzer Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)).
La transformación de la especie vegetal diana mediante Agrobacterium recombinante implica habitualmente el cocultivo de la Agrobacterium con explantes procedentes de la planta, y siguiendo protocolos bien conocidos en la técnica. El tejido transformado se regenera en medio seleccionable que posee el marcador de resistencia a antibióticos o a herbicidas presente entre las fronteras de T-DNA del plásmido binario.
Otro enfoque para transformar células vegetales con un gen implica propulsar partículas inertes o biológicamente activas en los tejidos y células vegetales. Esta técnica se describe en las patentes U.S. nos 4.945.050, 5.036.006, y 5.100.792, todas de Sanford et al. Generalmente, este procedimiento implica impulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células en condiciones efectivas para penetrar la superficie exterior de la célula y producir la incorporación en el interior de la misma. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector se puede introducir en la célula revistiendo las partículas con el vector que contiene el gen deseado. Como alternativa, la célula diana puede estar rodeada por el vector, de manera que el vector es portado en la célula por la estela de la partícula. Las partículas biológicamente activas (por ejemplo, células de levadura secas, bacteria seca o un bacteriófago, conteniendo cada uno ADN que se busca introducir) también pueden ser propulsadas en un tejido de célula vegetales.
La transformación de la mayoría de las especies de monocotiledóneas se ha convertido ahora también en algo normal. Las técnicas preferidas incluyen la transferencia génica directa en protoplastos usando técnicas mediante PEG o electroporación, y bombardeo con partículas en el tejido del callo. Las transformaciones se pueden llevar a cabo con una única especie de ADN, o con múltiples especies de ADN (es decir, cotransformación), y estas dos técnicas son adecuadas para uso con esta invención. La cotransformación puede tener la ventaja de evitar la construcción completa del vector, y de generar plantas transgénicas con loci sin enlazar para el gen de interés y el marcador seleccionable,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
permitiendo la eliminación del marcador seleccionable en generaciones subsiguientes, considerándose esto deseable. Sin embargo, una desventaja del uso de la cotransformación es la frecuencia menor de 100% con la que la especie de ADN separada se integra en el genoma (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)).
Las patentes europeas EP 0292435, EP 0392225, y la Publicación PCT n° WO 93/07278, describen técnicas para la preparación de callo y protoplastos a partir de una línea consanguínea de élite de maíz, la transformación de los protoplastos usando PEG o electroporación, y la regeneración de plantas de maíz a partir de protoplastos transformados. Gordon-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603-618 (1990)) y Fromm et al. (Biotechnology 8: 833-839 (1990)) han publido técnicas para la transformación de la estirpe del maíz derivada de A188 usando bombardeo con partículas. Además, el documento la Publicación PCT n° WO 93/07278 y Koziel et al. (Biotechnology 11:194-200 (1993)) describen técnicas para la transformación de estirpes consanguíneas de élite de maíz mediante bombardeo con partículas. Esta técnica utiliza embriones inmaduros de maíz de una longitud de 1,5-2,5 mm, cortados de una mazorca de maíz 14-15 días después de la polinización, y un dispositivo PDS-1000He Biolistics para el bombardeo.
La transformación de arroz también se puede llevar a cabo mediante técnicas de transferencia génica directa utilizando protoplastos o bombardeo con partículas. Las transformaciones mediadas por protoplastos se han descrito para los tipos Japónica e Índica (Zhang et al. Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338:274-277 (1989); y Datta et al. Biotechnology 8:736-740 (1990)). Ambos tipos también son transformables de forma habitual usando bombardeo con partículas (Christou et al. Biotechnology 9:957-962 (1991)). Además, la Publicación PCT n° WO 93/21335 describe técnicas para la transformación de arroz vía electroporación.
La patente europea EP 0332581 describe técnicas para la generación, transformación, y regeneración de protoplastos de Pooideae. Estas técnicas permiten la transformación de Dactylis y trigo. Además, la transformación del trigo se ha descrito por Vasil et al. (Biotechnology 10:667-674 (1992)) usando bombardeo con partículas en células de callo regenerable a largo plazo tipo C, y también por Vasil et al. (Biotechnology 11:1553-1558 (1993)) y Weeks et al. (Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993)) usando bombardeo con partículas de embriones inmaduros y callo derivado de embriones inmaduros. Sin embargo, una técnica preferida para la transformación de trigo implica la transformación de trigo mediante bombardeo con partículas de embriones inmaduros, e incluye una etapa con alto contenido de sacarosa o una etapa con alto contenido de maltosa antes del suministro génico. Antes del bombardeo, se colocan en placas cualquier número de embriones (0,75-1 mm de longitud) en medio MS con 3% de sacarosa (Murashiga y Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)) y 3 mg/l de 2,4-D para la inducción de embriones somáticos, que se deja transcurrir en la oscuridad. En el día escogido del bombardeo, los embriones se retiran del medio de inducción y se colocan en el osmótico (es decir, medio de inducción con sacarosa o maltosa añadida a la concentración deseada, típicamente 15%). Los embriones se dejan plasmolizar durante 2-3 horas y después son bombardeados. Veinte embriones por placa diana son típicos, aunque no críticos. Un plásmido que posee el gen apropiado (tal como pCIB3064 o pSOG35) se hace precipitar sobre partículas de oro de tamaño micrométrico usando procedimientos estándar. Cada placa de embriones es disparada con el dispositivo de helio DuPont BIOLISTICS® usando una presión de estallido de alrededor de un 1000 psi usando un tamiz de malla 80 estándar. Tras el bombardeo, los embriones se colocan nuevamente en la oscuridad para que se recuperen durante alrededor de un 24 horas (todavía en osmótico). Después de 24 h, los embriones se retiran del osmótico y se colocan nuevamente en medio de inducción, en el que permanecen durante alrededor de un un mes antes de la regeneración. Aproximadamente un mes después, los explantes embriónicos con callo embriogénico en desarrollo se transfieren a medio de regeneración (MS+1 mg/l NAA, 5 mg/l GA), que contiene además el agente de selección apropiado (10 mg/l basta en el caso de pCIB3064, y 2 mg/l de metotrexato en el caso de pSOG35). Después de aproximadamente un mes, los retoños desarrollados se transfieren a recipientes estériles más grandes conocidos como “GA7”, que contienen MS de fuerza media, 2% de sacarosa, y la misma concentración de agente de selección.
También se ha descrito la transformación de monocotiledóneas usando Agrobacterium. Véanse, la publicación PCT n° WO 94/00977 y la patente U.S. n° 5.591.616, y Negrotto et al. Plant Cell Reports 19:798-803 (2000). Por ejemplo, se puede usar arroz (Oryza sativa) para generar plantas transgénicas. Se pueden usar diversas variedades de cultivo del arroz (Hiei et al., 1994, Plant Journal 6:271-282; Dong et al., 1996, Molecular Breeding 2:267-276; y Hiei et al., 1997, Plant Molecular Biology 35:205-218). También, los diversos constituyentes de los medios descritos más abajo se pueden variar en cantidad o se pueden sustituir. Las respuestas embriogénicas se inician y/o los cultivos se establecen a partir de embriones maduros cultivando en medio MS-CIM (sales basales de MS, 4,3 g/l; vitaminas B5 (200X), 5 ml/l; sacarosa, 30 g/l; prolina, 500 mg/l; glutamina, 500 mg/l; hidrolizado de caseína, 300 mg/l; 2,4-D (1 mg/ml), 2 ml/l; ajustar pH hasta 5,8 con KOH 1 N; Phytagel, 3 g/l). Tanto los embriones maduros en las etapas iniciales de respuesta del cultivo o las estirpes del cultivo establecidas se inoculan y cocultivan con la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium) que contiene la construcción vectorial deseada. Agrobacterium se cultiva a partir de lotes de glicerol sobre medio YPC sólido (100 mg/l de espectinomicina y cualquier otro antibiótico apropiado) durante alrededor de un 2 días a 28°C. Agrobacterium se resuspende en medio MS-CIM líquido. El cultivo de Agrobacterium se diluye hasta una OD600 de 0,2-0,3, y se añade acetosiringona hasta una concentración final de 200 ^M. La acetosiringona se añade antes de mezclar la disolución con los cultivos de arroz para inducir al Agrobacterium para la transferencia de ADN a las
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
células vegetales. Para la inoculación, los cultivos vegetales se sumergen en la suspensión bacteriana. La suspensión bacteriana líquida se retira y los cultivos inoculados se colocan en medio de cocultivo y se incuban a 22°C durante dos días. Los cultivos se transfieren entonces a medio MS-CIM con ticarcilina (400 mg/l) para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Para los constructos que utilizan el gen marcador seleccionable de PMI (Reed et al. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37:127-132), los cultivos se transfieren a medio de selección que contiene manosa como fuente de hidratos de carbono (MS con 2% de manosa, 300 mg/l de ticarcilina) después de 7 días, y se cultivan durante 3-4 semanas en la oscuridad. Las colonias resistentes se transfieren entonces para la regeneración en medio de inducción (MS sin 2,4-D, 0,5 mg/litro de IAA, 1 mg/l de zeatina, 200 mg/l de timentina, 2% de manosa y 3% de sorbitol) y se hacen crecer en la oscuridad durante 14 días. Las colonias que proliferan se transfieren entonces a otra ronda de medio de inducción de regeneración y se mueven a la habitación de crecimiento iluminada. Los brotes regenerados se transfieren a recipientes GA7 con medio GA7-1 (MS sin hormonas y con 2% de sorbitol) durante 2 semanas, y después se mueven al invernadero donde son suficientemente grandes y tienen raíces adecuadas. Las plantas se transplantan al suelo en el invernadero (generación T0), se hacen crecer hasta la madurez, y la semilla T1 se cosecha.
Las plantas obtenidas vía transformación con una secuencia de ácido nucleico de interés en la presente invención pueden ser cualquiera de una amplia variedad de especies vegetales, incluyendo aquellas monocotiledóneas y dicotiledóneas; sin embargo, las plantas usadas en el método de la invención se seleccionan preferiblemente de la lista de cosechas diana agronómicamente importantes expuestas aquí en otra parte. La expresión de un gen de la presente invención, en combinación con otras característica importantes para la producción y calidad, se pueden incorporar en estirpes vegetales a través de reproducción. Los enfoques y técnicas de reproducción son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Welsh, Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley and Sons, NY (1981); Crop Breeding, Wood D.R. (Ed.) American Society of Agronomy Madison, Wis. (1983); Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Segunda Edición, Clarendon Press, Oxford (1987); Singh, D. P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986); y Wricke y Weber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding, Walter de Gruyter and Co., Berlín (1986).
Para la transformación de plástidos, se hacen germinar semillas de Nicotiana tabacum c.v. “Xanthiene”, siete por placa, en una disposición circular de 1” en un medio de agar T, y 12-14 días después de sembrar se bombardean con partículas de volframio de 1 |jm (M10, Biorad, Hercules, Calif.) revestidas con ADN procedente de los plásmidos pPH143 y pPH145, esencialmente como se describe (Svab, Z. y Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917). Las plántulas bombardeadas se incuban en medio T durante dos días, después de lo cual se cortan las hojas y se colocan con el lado abaxial hacia arriba en luz brillante (350-500 jmoles de fotones/m2/s) en placas de medio RMOP (Svab, Z., Hajdukiewicz, P. y Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530) que contiene 500 jg/ml de dihidrocloruro de espectinomicina (Sigma, St. Louis, MO). Los brotes resistentes que aparecen por debajo de las hojas cloróticas, tres a ocho semanas después del bombardeo, se subclonan en el mismo medio selectivo, se deja que se forme callo, y los brotes secundarios se aíslan y se subclonan. La segregación completa de copias genómicas de plástidos transformados (homoplasmicidad) en subclones independientes se evalúa mediante técnicas estándar de transferencia Southern (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Se separa ADN celular total digerido con BamHI/EcoRI (Mettler, I. J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5, 346349) en geles de agarosa con 1% de Tris-borato (TBE), se transfiere a membranas de nailon (Amersham), y se sonda con secuencias de ADN cebadas al azar marcadas con 32P que corresponden a un fragmento de ADN de BamHI/HindlII de 0,7 kb procedente de pC8 que contiene una porción de la secuencia que selecciona plástidos rps7/12. Los brotes homoplásmicos se enraízan asépticamente en medio MS/IBA que contiene espectinomicina (McBride, K. E. et al. (1994) PnAs 91,7301-7305), y se transfieren al invernadero.
Las propiedades genéticas manipuladas mediante ingeniería en las semillas y plantas transgénicas descritas anteriormente se perpetúan mediante reproducción sexual o crecimiento vegetativo, y de este modo se pueden mantener y propagar en las plantas de la progenie. Generalmente, el mantenimiento y la propagación hacen uso de métodos agrícolas conocidos, desarrollados para satisfacer fines específicos tales como el arado, la siembra o el cosechado.
El uso de las propiedades genéticas ventajosas de las plantas y semillas transgénicas según la invención se puede hacer adicionalmente en la reproducción vegetal. Dependiendo de las propiedades deseadas, se toman diferentes medidas de reproducción. Las técnicas pertinentes son bien conocidas en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, hibridación, reproducción endogámica, reproducción por retrocruzamiento, reproducción de múltiples líneas, mezcla de variedades, hibridación interespecífica, técnicas aneuploides, etc. De este modo, las semillas y plantas transgénicas según la invención se pueden usar para la reproducción de líneas vegetales mejoradas que, por ejemplo, incrementan la efectividad de métodos convencionales, tales como el tratamiento con herbicidas o plaguicidas, o permiten dispensarlos con dichos métodos debido a sus propiedades genéticas modificadas.
Muchos métodos adecuados para la transformación que usan marcadores de selección adecuados, tales como canamicina, vectores binarios tales como procedentes de Agrobacterium, y regeneración de plantas, como, por ejemplo, procedentes de discos de hojas de tabaco, son bien conocidos en la técnica. Opcionalmente, igualmente una población
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
de control vegetal se transforma con un polinucleótido que expresa la HPPD de control. Como alternativa, una planta dicotiledónea no transformada, tal como Arabidopsis o tabaco, se puede usar como un control, puesto que, en este caso, expresa su propia HPPD endógena.
Resistencia a herbicidas
La presente invención proporciona plantas, células vegetales, tejidos y semillas transgénicas que se han transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica una HPPD mutante o variante de la misma que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas, sola o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables.
En un aspecto, las plantas transgénicas de la invención presentan resistencia o tolerancia a la aplicación de herbicida en una cantidad desde alrededor de un 5 hasta alrededor de un 2,000 gramos por hectárea (g/ha), incluyendo, por ejemplo, alrededor de un 5 g/ha, alrededor de un 10 g/ha, alrededor de un 15 g/ha, alrededor de un 20 g/ha, alrededor de un 25 g/ha, alrededor de un 30 g/ha, alrededor de un 35 g/ha, alrededor de un 40 g/ha, alrededor de un 45 g/ha, alrededor de un 50 g/ha, alrededor de un 55 g/ha, alrededor de un 60 g/ha, alrededor de un 65 g/ha, alrededor de un 70 g/ha, alrededor de un 75 g/ha, alrededor de un 80 g/ha, alrededor de un 85 g/ha, alrededor de un 90 g/ha, alrededor de un 95 g/ha, alrededor de un 100 g/ha, alrededor de un 110 g/ha, alrededor de un 120 g/ha, alrededor de un 130 g/ha, alrededor de un 140 g/ha, alrededor de un 150 g/ha, alrededor de un 160 g/ha, alrededor de un 170 g/ha, alrededor de un 180 g/ha, alrededor de un 190 g/ha, alrededor de un 200 g/ha, alrededor de un 210 g/ha, alrededor de un 220 g/ha, alrededor de un 230 g/ha, alrededor de un 240 g/ha, alrededor de un 250 g/ha, alrededor de un 260 g/ha, alrededor de un 270 g/ha, alrededor de un 280 g/ha, alrededor de un 290 g/ha, alrededor de un 300 g/ha, alrededor de un 310 g/ha, alrededor de un 320 g/ha, alrededor de un 330 g/ha, alrededor de un 340 g/ha, alrededor de un 350 g/ha, alrededor de un 360 g/ha, alrededor de un 370 g/ha, alrededor de un 380 g/ha, alrededor de un 390 g/ha, alrededor de un 400 g/ha, alrededor de un 410 g/ha, alrededor de un 420 g/ha, alrededor de un 430 g/ha, alrededor de un 440 g/ha, alrededor de un 450 g/ha, alrededor de un 460 g/ha, alrededor de un 470 g/ha, alrededor de un 480 g/ha, alrededor de un 490 g/ha, alrededor de un 500 g/ha, alrededor de un 510 g/ha, alrededor de un 520 g/ha, alrededor de un 530 g/ha, alrededor de un 540 g/ha, alrededor de un 550 g/ha, alrededor de un 560 g/ha, alrededor de un 570 g/ha, alrededor de un 580 g/ha, alrededor de un 590 g/ha, alrededor de un 600 g/ha, alrededor de un 610 g/ha, alrededor de un 620 g/ha, alrededor de un 630 g/ha, alrededor de un 640 g/ha, alrededor de un 650 g/ha, alrededor de un 660 g/ha, alrededor de un 670 g/ha, alrededor de un 680 g/ha, alrededor de un 690 g/ha, alrededor de un 700 g/ha, alrededor de un 710 g/ha, alrededor de un 720 g/ha, alrededor de un 730 g/ha, alrededor de un 740 g/ha, alrededor de un 750 g/ha, alrededor de un 760 g/ha, alrededor de un 770 g/ha, alrededor de un 780 g/ha, alrededor de un 790 g/ha, alrededor de un 800 g/ha, alrededor de un 810 g/ha, alrededor de un 820 g/ha, alrededor de un 830 g/ha, alrededor de un 840 g/ha, alrededor de un 850 g/ha, alrededor de un 860 g/ha, alrededor de un 870 g/ha, alrededor de un 880 g/ha, alrededor de un 890 g/ha, alrededor de un 900 g/ha, alrededor de un 910 g/ha, alrededor de un 920 g/ha, alrededor de un 930 g/ha, alrededor de un 940 g/ha, alrededor de un 950 g/ha, alrededor de un 960 g/ha, alrededor de un 970 g/ha, alrededor de un 980 g/ha, alrededor de un 990 g/ha, alrededor de un 1.000, g/ha, alrededor de un 1.010 g/ha, alrededor de un 1.020 g/ha, alrededor de un 1.030 g/ha,
alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de
1.040 g/ha, 1.080 g/ha, 1.120 g/ha, 1.160 g/ha, 1.200 g/ha, 1.240 g/ha, 1.280 g/ha, 1.320 g/ha,
alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de
1.050 g/ha, 1.090 g/ha, 1.130 g/ha, 1.170 g/ha, 1.210 g/ha, 1.250 g/ha, 1.290 g/ha, 1.330 g/ha,
alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de alrededor de
1.060 g/ha, 1.100 g/ha, 1.140 g/ha, 1.180 g/ha, 1.220 g/ha, 1.260 g/ha, 1.300 g/ha, 1.340 g/ha,
alrededor de un alrededor de un alrededor de un alrededor de un alrededor de un alrededor de un alrededor de un alrededor de un
1.070 g/ha, 1.110 g/ha, 1.150 g/ha, 1.190 g/ha, 1.230 g/ha, 1.270 g/ha, 1.310 g/ha, 1.350 g/ha,
alrededor de un 360 g/ha, alrededor de un 1.370 g/ha, alrededor de un 1.380 g/ha, alrededor de un 1.390 g/ha, alrededor de un 1.400 g/ha, alrededor de un 1.410 g/ha, alrededor de un 1.420 g/ha, alrededor de un 1.430 g/ha, alrededor de un 1.440 g/ha, alrededor de un 1.450 g/ha, alrededor de un 1.460 g/ha, alrededor de un 1.470 g/ha, alrededor de un 1.480 g/ha, alrededor de un 1.490 g/ha, alrededor de un 1.500 g/ha, alrededor de un 1.510 g/ha, alrededor de un 1.520 g/ha, alrededor de un 1.530 g/ha, alrededor de un 1.540 g/ha, alrededor de un 1.550 g/ha, alrededor de un 1.560 g/ha,
alrededor de un 1.570 g/ha, alrededor de un 1.580 g/ha, alrededor de un 1.590 g/ha, alrededor de un 1.600 g/ha,
alrededor de un 1.610 g/ha, alrededor de un 1.620 g/ha, alrededor de un 1.630 g/ha, alrededor de un 1.640 g/ha,
alrededor de un 1.650 g/ha, alrededor de un 1.660 g/ha, alrededor de un 1.670 g/ha, alrededor de un 1.680 g/ha,
alrededor de un 1.690 g/ha, alrededor de un 1.700 g/ha, alrededor de un 1.710 g/ha, alrededor de un 1.720 g/ha,
alrededor de un 1.730 g/ha, alrededor de un 1.740 g/ha, alrededor de un 1.750 g/ha, alrededor de un 1.760 g/ha,
alrededor de un 1.770 g/ha, alrededor de un 1.780 g/ha, alrededor de un 1.790 g/ha, alrededor de un 1.800 g/ha,
alrededor de un 1.810 g/ha, alrededor de un 1.820 g/ha, alrededor de un 1.830 g/ha, alrededor de un 1.840 g/ha,
alrededor de un 1.850 g/ha, alrededor de un 1.860 g/ha, alrededor de un 1.870 g/ha, alrededor de un 1.880 g/ha,
alrededor de un 1.890 g/ha, alrededor de un 1.900 g/ha, alrededor de un 1.910 g/ha, alrededor de un 1.920 g/ha,
alrededor de un 1.930 g/ha, alrededor de un 1.940 g/ha, alrededor de un 1.950 g/ha, alrededor de un 1.960 g/ha,
alrededor de un 1.970 g/ha, alrededor de un 1.980 g/ha, alrededor de un 1.990 g/ha, o alrededor de un 2.000.
18
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los niveles medios y de distribución de tolerancia o resistencia a herbicidas de un intervalo de sucesos de transformación vegetal primario se evalúan de la manera normal basándose en el daño a la planta, síntomas de clorosis meristemática, etc., en un intervalo de diferentes concentraciones de herbicidas. Estos datos se pueden expresar en términos de, por ejemplo, valores GR50, derivados de curvas de dosis/respuesta que representan gráficamente las “dosis” en el eje x, y representan gráficamente en el eje y el “porcentaje de exterminio”, “efecto herbicida”, “números de plantas verdes que emergen”, etc., en las que valores incrementados de GR50 corresponden a niveles incrementados de tolerancia inherente a inhibidores (por ejemplo, valor incrementado de koff/KmHPP) y/o el nivel de expresión de polipéptido de HPPD expresado.
Los métodos de la presente divulgación son especialmente útiles para proteger cosechas de la lesión herbicida de herbicidas inhibidores de HPPD. Por ejemplo, el herbicida inhibidor de HPPD se selecciona adecuadamente del grupo que consiste en biciclopirona (CAS RN 352010-68-5), benzobiciclón (CAS RN 156963-66-5), benzofenap (CAS Rn 82692-44-2), cetospiradox (CAS RN 192708-91-1) o su ácido libre (CAS RN 187270-87-7), isoxaclortol (CAS RN 141112-06-3), isoxaflutol (CAS RN 141112-29-0), mesotriona (CAS RN 104206-82-8), pirasulfotol (CAS RN 365400-119), pirazolinato (CAS RN 58011-68-0), pirazoxifeno (CAS RN 71561-11-0), sulcotriona (Cas RN 99105-77-8), tefuriltriona (CAs RN 473278-76-1), tembotriona (Cas RN 335104-84-2) y topramezona (CAS RN 210631-68-8); incluyendo, cuando sea aplicable, sus sales agronómicamente aceptables.
Métodos de uso
También se divulga un método para controlar selectivamente malas hierbas en un locus, que comprende plantas de cosechas y malas hierbas, en el que las plantas se obtienen por cualquiera de los métodos de la actual divulgación descritos anteriormente, en el que el método comprende la aplicación al locus de una cantidad controladora de malas hierbas de uno o más herbicidas. En estos métodos de invención se puede usar cualquiera de las plantas transgénicas descritas aquí. El término “locus” puede incluir suelo, semillas, y plántulas, así como una vegetación establecida. Los herbicidas se pueden aplicar adecuadamente preemergencia o posemergencia de la cosecha o malas hierbas.
La expresión “cantidad controladora de malas hierbas” quiere incluir funcionalmente una cantidad de herbicida que es capaz de afectar al crecimiento o desarrollo de una mala hierba. De este modo, la cantidad puede ser suficientemente pequeña para simplemente retrasar o suprimir el crecimiento o desarrollo de una mala hierba dada, o la cantidad puede ser suficientemente grande para destruir irreversiblemente una mala hierba dada.
De este modo, la presente invención divulga un método para controlar malas hierbas en un locus, que comprende aplicar al locus una cantidad controladora de malas hierbas de uno o más herbicidas, en el que el locus comprende una planta transgénica que se ha transformado con una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que confiere resistencia o tolerancia a herbicidas de HPPD, sola o en combinación con una o más moléculas de ácidos nucleicos adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables. En un aspecto, el rasgo deseable es resistencia o tolerancia a un herbicida, incluyendo, por ejemplo, herbicidas seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de HPPD, glifosato y glufosinato. En otro aspecto, el locus comprende una planta transgénica que se ha transformado con cualquier combinación de moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, incluyendo una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de HPPD mutante o variante del mismo que confiere resistencia o tolerancia a un herbicida, en combinación con al menos una, al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro moléculas de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos que confieren rasgos deseables.
En un aspecto, la presente invención divulga plantas transgénicas y métodos útiles para el control de especies vegetales indeseadas en campos de cosechas, en los que las plantas de cosechas se hacen resistentes a la química de HPPD mediante transformación para expresar genes que codifican polipéptidos de HPPD mutantes, y en los que se aplica un herbicida de HPPD como una aplicación desde la parte superior en cantidades capaces de exterminar o alterar el crecimiento de especies vegetales indeseadas (especies de malas hierbas, o, por ejemplo, plantas de cosechas sobrantes o “maleza” o “espontánea” en un campo de plantas de cosecha deseables). La aplicación puede ser pre- o post-emergencia de las plantas de la cosecha o de la especie indeseada, y se puede combinar con la aplicación de otros herbicidas a los que la cosecha es tolerante de forma natural, o a los que es resistente vía la expresión de uno o más transgenes distintos de resistencia a herbicidas. Véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud Patente U.S. n° 2004/0058427 y la Publicación PCT n° WO 98/20144.
En otro aspecto, la invención también se refiere a un método para proteger plantas de cosecha de la lesión herbicida. En el cultivo de plantas de cosecha, especialmente a escala comercial, la rotación correcta de la cosecha es crucialmente importante para la estabilidad del rendimiento (el logro de rendimientos elevados de buena calidad a lo largo de un período prolongado) y para el éxito económico de un negocio agronómico. Por ejemplo, a lo largo de grandes áreas de las principales regiones de los Estados Unidos donde se hace crecer el maíz (el “cinturón de maíz central”), se hace crecer soja como la cosecha subsiguiente al maíz, en alrededor de unl 75% de los casos. El control selectivo de las malas hierbas en cosechas de maíz está siendo llevado a cabo cada vez más usando herbicidas inhibidores de HPPD.
5
10
15
20
25
30
35
40
Aunque esa clase de herbicidas tiene excelente idoneidad para ese fin, puede dar como resultado daño fitotóxico agronómicamente inaceptable a las plantas de la cosecha en las cosechas subsiguientes (daño “residual”). Por ejemplo, ciertas variedades de soja son sensibles a restos incluso muy pequeños de tales herbicidas inhibidores de HPPD. En consecuencia, las plantas resistentes o tolerantes a herbicidas de la divulgación también son útiles para plantarlas en un locus de cualquier remanente a corto plazo de herbicida procedente de una aplicación previa (por ejemplo, plantando una planta transgénica de la invención en el año siguiente a la aplicación de un herbicida, para reducir el riesgo de daño procedente de restos de suelo del herbicida).
Ejemplos
La invención se describe ahora con referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan con el fin ilustrativo solamente y la invención no está limitada a estos Ejemplos, sino más bien engloba todas las variaciones que son evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas aquí.
Ejemplo 1
Clonación, expresión y ensayo de SEC ID NO: 1 de HPPD derivada de Avena, y determinación de los valores de kcat, KmHPP y koff frente a diversos herbicidas de HPPD
Se sintetizó una secuencia de ADN, optimizada en los codones para la expresión en E. coli, mediante GeneArt (Regensburg, Alemania) para codificar una HPPD derivada de Avena sativa (SEC ID NO: 1), se clonó en pET24a y se expresó en E. coli BL21(DE3) con selección de 50 pg/ml de canamicina como se describe en la Publicación PCT n° WO 02/46387. Los cultivos nocturnos que se hicieron crecer a 30°C se usaron para inocular 3 x 1 litro de LB en matraces de agitación, a una relación 1:100. Los cultivos se hicieron crecer a 37°C, 220 rpm, hasta que se alcanzó una A1cm600nm de 0,6-0,8. La temperatura se redujo hasta 15°C, y se indujo con 0,1 mM de IPTG. Los cultivos se hicieron crecer toda la noche, y las células se cosecharon después de centrifugar durante 15 minutos a 10.000 g. Las células se almacenaron a -20°C hasta la extracción. Un pelete celular procedente de 3 litros de cultivo en matraz de agitación (~12 g) se descongeló en tampón de extracción (50 mM de Tris, 10 de mM ascorbato de sodio, 2 mM de DTT, 2 mM de AEBSF, 10 pM de inhibidor de tripsina, 1 mM de EDTA, pH 7,66) a una relación de 1 ml de tampón:1 g de pasta celular.
El extracto se hizo pasar a través del destructor celular a 30.000 psi, y se centrifugó a 50.000 g durante 25 minutos a 4°C. El extracto se puede intercambiar opcionalmente de tampón en Sephadex® G25. Los sobrenadantes se colocaron en perlas en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80°C. Los niveles de expresión de HPPD se estimaron mediante análisis de transferencia Western, usando como patrón Avena purificada (1-10 ng). Los extractos se diluyeron 1:6000, y se cargaron 1-10 pl sobre 12% de SDS PAGE. Además, la expresión se cuantificó comparando SDS PAGE inducido y no inducido con tinción de Coomassie® (Imperial Chemicals Industries, Ltd., Londres UK). Los geles se transfirieron sobre membranas de PVDF, y se llevaron a cabo transferencias Western usando suero anti-HPPD de trigo de conejo (1:6600) como anticuerpo primario, y anticuerpos enlazados a FITC anti-conejo de cabra (1:600) como anticuerpo secundario. La detección de las bandas se llevó a cabo haciendo un barrido en un Fluorimager™ 595 (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y la cuantificación de los picos se llevó a cabo usando ImageQuant™ (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK). El ADN plasmídico se volvió a aislar de todas las cepas transformadas, y se confirmó la secuencia de ADN a lo largo de la región codificante.
A partir de las transferencias Western, se estimó que el nivel de expresión del polipéptido de SEC ID NO: 1 expresado en el extracto de E. coli era alrededor de un 10-14 mg/ml de una concentración total de proteína soluble de 33,5 mg/ml.
La concentración de HPPD activa en el extracto también se estimó de forma más exacta mediante titulación de sitios activos. Por ejemplo, se añadió un intervalo de volúmenes de extracto (típicamente 0-20 pl) a 50 mM de tampón de BisTrisPropano, a pH 7,0 y a 25°C, que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 pg/ml de catalasa bovina y 3 nmoles de compuesto A marcado con 14C (1,81 GBq/mmol), en un volumen de ensayo final total de 425 pl.
Compuesto A
O
imagen1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La reacción de unión de proteína radiomarcada se extinguió después de 3 minutos mediante adición de 100 |l de 1 mM de Estructura A “fría”. La proteína se intercambió en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 0,1M de KCl mediante cromatografía rápida en una columna NAP5 G25 Sephadex® (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y 14C unido a las fracciones proteicas se midió en un líquido de centelleo Optiphase usando un contador de centelleo Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer, Wellesley, MA). La concentración de sitio de unión de HPPD en el extracto se calculó a partir de la titulación como se describe en la publicación PCT n° WO 02/46387, y se estimó como 94,9, 78,3, y 82,3 (media 85,2) |M en un extracto, y 47,2 |jM en otro ejemplo.
Los valores de KmHPP y kcat de la HPPD expresada se estimaron basándose en los ensayos llevados a cabo a 25°C en disolución de 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 ig/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO), y un intervalo de concentraciones (típicamente 0,5x-10x Km) de 4- hidroxifenilpiruvato. Típicamente, los ensayos en un volumen final de 110 |l se iniciaron con la adición de enzima, y se detuvieron de forma exacta después de 20, o preferiblemente 10 ó 15 segundos, con adición mezclada en remolinos de 20 |l de ácido perclórico al 25%. La disolución de ensayo se transfirió a viales de Chromacol 03-CVG HPLC, se cerraron herméticamente, y la cantidad de homogentisato formada en una alícuota de 40 |l se determinó mediante inyección en una columna de HPLC Aqua C18 5| 75 x 4,6 mm HPLC de fase inversa que corre con 5,5% de acetonitrilo 0,1% de TFA (Tampón A) a 1,5 ml/min. La columna se eluyó a 1,5 ml/minuto usando un lavado de 2 minutos en tampón A, seguido de un lavado de 2 minutos en una mezcla 30/70 de tampón A y 100% de acetonitrilo, y un lavado adicional de 3,5 minutos en tampón A. La elución de homogentisato se monitorizó mediante UV a 292 nm, y la cantidad formada en cada reacción se cuantificó comparando con una curva de calibración patrón.
Los valores de Km y Vmax se determinaron (por ejemplo Figura 1) usando un ajuste de mínimos cuadrados no lineal usando el software Grafit 4™ (Erithacus Software, Middlesex, UK). Los valores de Kcat se determinaron dividiendo la velocidad máxima, Vmax, expresada en nmoles/s, entre el número de nmoles de enzima HPPD (basado en la concentración determinada mediante titulación de sitios activos).
A partir de un conjunto de experimentos separados similares a aquellos que produjeron los datos mostrados en la Figura 1, en un extracto de SEC ID NO: 1 de HPPD se estimó el valor de Km como 6,17, 4,51,6,09, 6,13, 4,37, 4,62, 5,41, 5,13 y 6 |M (Km media = 5,38 |M). Los valores de kcat correspondientes fueron 4,92, 6,25, 7,08, 6,26, 5,5, 6,77, 6,89, 7,12 y 7,39 s-1 (kcat media = 6,46 s-1). Obsérvese que para este cálculo, y de forma estándar aquí, Mr se tomó como ~94 kD, y se supuso un sitio activo por dímero (es decir, la mitad de actividad de los sitios así como la unión del inhibidor; véanse Garcia et al. (2000) Biochemistry, 39:7501-7507; Hawkes “Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase (HPPD) - The Herbicide Target”. En Modern Crop Protection Compounds. Eds. Kramer y Schirmer. Weinheim, Alemania: Wiley-VCH, 2007. Cap. 4.2, p. 211-220). Para la suposición alternativa de un sitio activo por monómero, entonces los valores calculados de kcat deberían simplemente dividirse a la mitad correspondiente y sistemáticamente.
Las velocidades de asociación (gobernadas por una constante de velocidad de asociación, kon) para la formación de los complejos de enzima:inhibidor, EI y velocidades de disociación (gobernadas por una constante de velocidad de disociación, koff) se determinaron por métodos conocidos en la técnica y esencialmente como se describe en Hawkes et al. (2001) Proc. Bright. Crop. Prot. Conf. Weeds, 2:563-568 y en la publicación PCT n° WO 02/46387).
Por ejemplo, las velocidades de asociación se midieron, a tiempo cero, añadiendo ~60 pmoles de HPPD a 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 y a 25°C que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 ig/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO) y un exceso (-300 pmoles) de 14C-inhibidor en un volumen de ensayo total de 425 |l, y, a diversos puntos de tiempo (0-180 s), extinguiendo la reacción de unión del radiomarcador mediante adición y mezclamiento rápido de 100 |l de estructura A “fría” 1 mM. Las muestras de proteína extinguidas a diferentes tiempos se intercambiaron entonces en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 0,1 M de KCl mediante cromatografía rápida a través de una columna NAP5 G25 Sephadex® (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y la cantidad de 14C unido a las fracciones proteicas se cuantificó en un líquido de centelleo Optiphase usando un contador de centelleo Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Los datos se ajustaron según el esquema más abajo, a fin de derivar el valor de la constante de velocidad aparente de segundo orden, k2, que gobierna la velocidad de asociación de la enzima y el inhibidor radiomarcado. Se usó un intervalo de concentraciones de enzima y de inhibidor. Opcionalmente, la constante de velocidad se puede obtener a partir de experimentos similares en los que la enzima (a -0,05-0,2 |M de sitios de unión) y, en este caso, inhibidor sin marcar (a -0,5 a 2 |M) se hacen reaccionar durante un intervalo de tiempos cortos (0-60 s) en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 y a 25°C que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 ig/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO), y entonces se extinguió mediante dilución rápida en disolución de ensayo que contiene 100-200 |M de HPP para el ensayo inmediato mediante cuantificación por HPLC/UV de la formación de homogentisato después de 30-40 s (es decir, un tiempo suficientemente corto de manera que la disociación y asociación del inhibidor no se produce significativamente en la escala de tiempo del ensayo) como se describe anteriormente. Otros métodos ejemplares se describen en la publicación PCT n° WO 02/46387.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Las velocidades de disociación (k1 en el esquema más abajo) se obtuvieron a partir de estudios de velocidad de intercambio, en los que el inhibidor de ensayo, I, o su pareja de intercambio, J, se radiomarcaron, y los datos se ajustaron según el esquema más abajo. Como se señala en Hawkes et al. (2001) Proc. Bright. Crop. Prot. Conf. Weeds, 2:563-568, las preparaciones de HPPD parecen típicamente comprender, al menos con respecto a la disociación de ciertos inhibidores, 5-40% de una fracción que se intercambia más rápidamente (unión más débil) de sitios de unión al inhibidor. Una pequeña cantidad de este efecto es debida a la unión no específica, que se puede restar fácilmente o se puede tener en cuenta. Para la mayoría de los inhibidores, el efecto es pequeño; con respecto a estructuras como el compuesto A, tal efecto es probablemente debido a la proquiralidad. Cuando las fracciones que se intercambian de manera rápida y lenta se distinguen en absoluto por los inhibidores, aquí las velocidades de disociación medidas se refieren siempre sólo a la fracción principal que se intercambia de manera más lenta, que representa el 60-95% de la masa de los sitios de unión al inhibidor de HPPD presentes en los extractos ensayados.
K2
E + I ^ ^ EI
K1
K3
E + J ^ - EJ
K4
Las velocidades de disociación se determinaron preincubando, por ejemplo, -200 pmoles de sitios de unión a HPPD (determinados como se describe anteriormente mediante titulación de los sitios activos en una reacción de 3 min. con la estructura A) en 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 y a 25°C que contiene 25 mM de ascorbato de Na, 4 l^g/ml de catalasa bovina (Sigma, St. Louis, MO) que contiene -1,0 nmoles de 14C inhibidor a 25°C en un volumen de ensayo total de 1,3 ml. Después de 30 minutos, se inició la reacción de intercambio con adición de 100 de 1 mM de estructura A “fría” con mezclamiento a conciencia, e, inmediatamente, se extrajeron 150 y se cargaron en una columna NAP5, la proteína se intercambió en 50 mM de tampón de 50 mM de tampón de BisTrisPropano a pH 7,0 que contiene 0,1 M de KCl mediante cromatografía rápida (< 2 min.) a través de una columna NAP5 G25 Sephadex® (GE Healthcare Ltd, Buckinghamshire UK), y la cantidad de 14C unido a proteína se midió mediante líquido de centelleo Optiphase usando un contador de centelleo Tri-Carb® 2900TR (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Se retiraron alícuotas adicionales y se midieron de la misma manera a diversos tiempos durante minutos u horas según se requiere, a fin de determinar la cinética de intercambio.
En una variante del método útil para distinguir mejor entre velocidades de disociación que fueron relativamente rápidas (por ejemplo, en las que t ^ <15 min. a 25°C), la temperatura del experimento se redujo desde 25°C hasta la temperatura del hielo. En este caso, las velocidades de disociación se determinaron preincubando -200 pmoles de HPPD en tampón de reacción (50 mM de BTP pH 7, 25 mM de ascorbato de Na, 4 ^g/ml de catalasa bovina, y 10% de glicerol) que contiene -1,0 nmoles de 14C inhibidor a 25°C en un volumen de ensayo total de 1,3 ml. Después de 30 minutos, la vasija de reacción se transfirió a hielo. Después de otros 10 minutos a temperatura del hielo, se inició la reacción de intercambio mediante adición de 100 de 1 mM de Estructura A, con mezclamiento a conciencia, y se extrajeron 150 p.l, se cargaron y se intercambiaron rápidamente a través de una columna NAP5 en una habitación fría a -5-8°C, a fin de cuantificar la cantidad de radiomarcador que queda unido a la proteína a diversos tiempos desde el comienzo de intercambio a la temperatura del hielo.
Las velocidades de disociación (k1) de los inhibidores de HPPD que no se pueden radiomarcar fácilmente o que presentan otros problemas de medición (por ejemplo niveles elevados de unión no específica a proteína de fondo, que se puede medir como unión del radiomarcador que persiste en presencia de concentraciones elevadas de inhibidor “frío”) se pueden medir directamente. En este caso, primero se forma el complejo enzimático (-0,1-0,2 ^M) con el inhibidor sin marcar, y después se obtuvo la cinética de intercambio ahuyentándolo con una concentración elevada de estructura A marcada con 14C (o D radiomarcado) y monitorizando la velocidad a la cual el marcador se une a la proteína. La estructura A es un inhibidor particularmente potente con cinética conocida. En un exceso de 20 veces o más, la Estructura A ocupara, en el equilibrio, >90% de los sitios de unión en la competición de intercambio con los otros inhibidores ensayados aquí, y de hecho con la mayoría de los otros inhibidores (los expertos en la técnica diseñarán por supuesto las concentraciones del experimento/relativas y ajustarán los datos en consecuencia). Los métodos ejemplares también se describen en la Publicación PCT n° WO 02/46387.
Los datos de velocidades de asociación y de disociación ejemplares (y los valores de ki derivados) se obtuvieron para la SEC ID NO: 1 de HPPD derivada de Avena para los siguientes compuestos como se indica.
Compuesto A (14C a 1,81 GBq/mmol)
O
imagen2
Velocidad de disociación k1 = 1,67 E - 05 s-1 según se determina a 25°C usando el método radioquímico directo. Velocidad de disociación k2 = 8,50 E + 04 M-1 s-1 según se determina a 25°C usando el método radioquímico directo. Kd= 1,96E-10 M.
5 Relación Kd/ Km = 0,000036
De este modo, se estimó que kf es = 1,67 E - 05 s-1 Compuesto B (14C a 1,425GBq/mmol)
O O ^N+^
imagen3
Velocidad de disociación k1 (media) = 8,1 E-04 s-1 a 25°C (los experimentos individuales produjeron k1 = 8,00 E - 04, 10 8,88 E - 04, 7,50 E - 04 y 8,00E -04 s-1, según se determina mediante el método radioquímico directo).
Medida a temperatura de hielo k1 = 1,58 E- 05 s-1 (los experimentos individuales iniciales produjeron 1,16 E - 05 s-1, 1,0 E - 05 s-1, 1,2 E - 05 s-1,1,5 E - 05 s-1. Más tarde, experimentos más amplios haciendo una mejor asignación para valores de unión no específica aparecieron consistentemente próximos y de media a alrededor de un 1,58 E - 05 s-1 (1,58 E - 05 s-1, 1,5 -05 s-1, 1,67 -05 s-1, 1,5 -05 s-1, 1,58 -05 s-1, 1,58 -05 s-1, 1,5 -05 s-1).
15 La velocidad de asociación k2 (media) 6,7 E + 04 s-1 M-1 a 25°C (los experimentos individuales produjeron k2 = 6,35 E + 04, 7,50 E + 04, 6,2 E + 04 según se determina mediante el método radioquímico directo). Para mesotriona, que tiene una velocidad de disociación relativamente rápida, los estimados para la velocidad de asociación basándose en el método a base de actividad fueron más variables, oscilando desde 4,2 E + 04 s-1 M-1, 4,9 E + 04 s-1 M-1 hasta 7,5 E + 04 s-1 M-1 a 25°C.
20 Kd se estimó así a partir del dato radioquímico como 1,16 E -08 M-1, que corresponde a una relación Kd/ Km de 0,00217. De este modo, se estimó que kofffue 8,1 E - 04 s-1 a 25°C y 1,58 E -05 s-1 a 0°C.
Compuesto C (14C a 0,774 GBq/mmol)
5
10
15
20
imagen4
Velocidad de disociación k1 (media) = 5,3 E - 05 s-1 a25°C (experimentos iniciales dieron k1 = 7,80 E - 05 s"1, 9,17 E - 05 s-1, 4,5 E - 05 s-1, 6 E - 05 s-1, 7 E - 05 s-1 y 7,80 E - 05 s-1; sin embargo, un conjunto subsiguiente de experimentos, que hacen una asignación más exacta para los efectos de unión no específica hacen probable que los primeros valores elevados fueron atípicos). Basándose en valores tardíos más consistentes la velocidad de disociación k1 (media) = 5,3 E - 05 s-1 se basó en los valores experimentales individuales de 6,5 - 05 s, 5,0 -05 s-1, 5,67 - 05 s-1, 4,67 - 05 s-1, 5,17 - 05 s-1, 4,67 - 05 s-1, 4,67 - 05 s-1, y 6,0-05 s-1.
La velocidad de asociación k2, que se estimó que era 7,50 E + 03 s-1 M-1 a 25°C usando el método radioquímico directo, está muy de acuerdo con los estimados a partir del método a base de actividad enzimática de 7,50 E + 03 s-1 M-1, 7,80 E + 03 s-1 M-1, 7,60 E + 03 s-1 M-1, 7,20 E + 03 s-1 M-1 y 1,0 E + 04 s-1 M-1 a 25°C.
Basándose en el método radioquímico, el estimado de Kd = 7,1 E - 09 M.
Por lo tanto, el estimado de la relación Kd/ Km = 0,0013.
De este modo, koff se estimó que era 5,3 E - 05 s-1.
Compuesto D (14C a 1,036GBq/mmol)
imagen5
Velocidad de disociación k1 = 3,96 E -05 s-1 a 25°C según se determina usando el método radioquímico directo
(mediciones individuales de 4,17 E - 05 s-1 y 3,75 E - 05 s-1). La velocidad de disociación según se determina en una
serie de experimentos indirectos de velocidad de disociación fue 4,25 - 05 s-1, 4,66 - 05 s-1, 4,5 - 05 s-1, 4,83 - 05 s-1, 3,83 -1 -1 -1 -1 -1
-05 s , 4,5 - 05 s , 4,5 - 05 s , 4,33 - 05 s , 5,0 - 05 s ., El valor medio para la velocidad de disociación se toma como 4,39 E - 05 s-1 a partir de todos los datos.
Velocidad de asociación k2 = 3,20 E + 04 M-1 s-1 a 25°C según se determina mediante el método radioquímico directo. Esto está bastante de acuerdo con los estimados procedentes del método a base de actividad para una velocidad de disociación de 3,20 E + 04 M-1 s-1 y 5,7 E + 04 M-1 s-1.
Basado en los métodos radioquímicos, el estimado de Kd = 1,36 E - 9 M.
El estimado de la relación Kd/Km = 0,00025.
De este modo, se estimó que koff fue 4,39 E - 05 s-1.
Compuesto E
5
10
15
20
25
30
imagen6
Velocidad de disociación k1 = 4,17 E - 05 s-1 a 25°C según se determina inicialmente mediante el método radioquímico indirecto basado en mediciones individuales de 5,50 E - 05 s-1 y 2,85 E - 05 s-1). A partir de una serie de medidas adicionales, parece que el valor inicial más elevado es un valor atípico, con valores obtenidos de 3,67 E - 05 s-1, 3,17 E - 05 s-1, 2,67 E - 05 s-1, 3,17 E - 05 s-1, 2,67 E - 05 s-1, 3,33 E - 05 s-1, 3,08 E - 05 s-1, 2,02 E - 05 s-1, 3,00 E - 05 s-1, y un nuevo valor de koff medio estimado como 2,96 E - 05 s-1.
Velocidad de asociación k2 = 1,30 E + 05 M-1 s-1 a 25°C según se determina mediante el método no radioquímico directo.
El estimado de Kd = 2,28 E - 10M El estimado de la relación Kd/ Km = 0,000042 De este modo, koff se estimó que era 2,96 E -05 s-1. Compuesto F
n
imagen7
El valor medio de koff se estimó que era 6,72 E - 05 s-1 a partir de una serie de medidas indirectas de la velocidad de disociación (7,08 E - 05 s-1, 6,00 E - 05 s-1, 7,00 E - 05 s-1 y 6,83 E - 05 s-1).
Ejemplo 2
Clonación, expresión y ensayo de las SEC ID NOs: 1-14 de las HPPD procedentes de diversas plantas, y determinación de los valores de kcat, KmHPP y koff frente a diversos herbicidas de HPPD
Secuencias de ADN, optimizadas para el uso de codones de E. coli, y que codifican polipéptidos de HPPD que corresponden a las SEC ID NOs: 1-14, derivadas de diversas plantas, se sintetizaron mediante GeneArt (Regensburg, Alemania), se clonaron en pET24a, y se expresaron en E. coli BL21(DE3) con selección con 50 ^g/ml de canamicina como se describe en la Pub. Sol. PCT n° WO 02/46387. Las células se hicieron crecer, se prepararon extractos proteicos, y se llevaron a cabo medidas de los títulos de sitios activos de HPPD y cinéticas (de los valores de kcat, KmHPP y koff frente a diversos herbicidas diferentes), como se describe en el Ejemplo 1.
La HPPD que corresponde a SEC ID NO: 1 se incluyó como un control interno en los experimentos. Los valores medios absolutos de los diversos parámetros cinéticos para SEC ID NO: 1 se enumeran anteriormente con detalle en el Ejemplo 1. Los datos en la Tabla 2 a continuación proporcionan datos a partir de estas medidas para las SEC ID NOs: 2-14 expresados como una relación frente al valor de control correspondiente para SEC ID NO: 1. De este modo, todos los valores de los parámetros para SEC ID NO: 1 se dan como 1,0, y todos los valores en la tabla son comparativos con aquellos para SEC ID NO: 1.
Tabla 2. Parámetros cinéticos de las HPPD de SEC ID NOs: 2-14
Ó z g o LU OT
Ó z s O £ o 8 LU iO O E Z * O Q. — £ O E LU iO Ó e e n "§ "§ O ÍS ÍS C/5 CQ § 3= ^ O m o g LU iO 0 o 3= ^ O «3 o 1 LU iO Q O 3= ^ o ° o 1 LU iO LU § 3= ^ O [u o g LU iO Ó LL z ¡t ^ 9 4e ° g LU iO
1
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
2
2,0
3
1,1 1,1 0,9 2,1 1,3 1,3 1,5 1,6
1,3 1,2 1,1 2,2 1,1 1,2 1,5
4
1,3 1,6 0,8 0,5 0,6 1,6
1,3 1,6 0,8
5
1,5 1,4 1,1 0,5 0,7 1,5
1,7 1,8 0,9
6
1,0 1,1 0,9 1,0 1,8 1,0
7
1,1 0,9 1,2 1,1 2,1 1,7 1,3
0,9 0,8 1,1 1,3 1,7 1,7
8
1,1 0,8 1,3 1,3 1,4 1,1
1,2 0,8 1,4
9
1,2 1,1 1,1 0,1 0,2 0,5
10
1,4 <0,05 0,2 0,1
11
<0,1 0,3 0,3 0,3
12
0,1 0,1 0,2 0,2
13
0,7 0,7 1,0 <0,05 0,2
14
0,8 6,0 0,2 <0,05 4,0
“koff B”, “koff C”, etc. se refieren a velocidades de disociación medidas mediante intercambio de radiomarcador con los herbicidas B-F inhibidores de HPPD descritos en el Ejemplo 1.
Es manifiesto a partir de los datos en la Tabla 2 que, con relación a SEC ID NO: 1, algunas HPPD son más y otras son menos inherentemente resistentes a los diversos herbicidas B-F, y por lo tanto más o menos adecuadas para conferir 5 resistencia en plantas transgénicas. Además, algunas muestran valores más grandes o más pequeños de kcat/ Km a la HPPD de SEC ID NO: 1. Para cada herbicida, el parámetro comparativo relevante que determina la idoneidad o de otro modo de la secuencia de HPPD dada es el múltiplo del valor de kcat/ Km (con relación a aquél para SEC ID NO: 1) y la velocidad koff correspondiente para el herbicida (con relación a aquella para SEC ID NO: 1).
De este modo, por ejemplo, la HPPD de SEC ID NO: 3 derivada de Alopecurus da un valor para este múltiplo de ~2,3 10 para mesotriona (B), queriendo decir que es efectivamente alrededor de un 2,3 veces más resistente a mesotriona que lo que lo es SEC ID NO: 1, y, todo lo demás siendo igual, conferirá un nivel mayor (probablemente alrededor de un 2 veces) de tolerancia a mesotriona cuando se exprese igualmente en plantas transgénicas.
De forma similar, la misma secuencia también proporciona una tolerancia mejorada (si bien hasta un menor grado) con respecto a SEC ID NO: 1 a los otros herbicidas ensayados (topramezona, tembotriona y el dicetonitrilo derivado de
26
5
10
15
20
25
30
35
40
45
isoxaflutol, etc.). Igualmente se puede observar que las HPPD de SEC ID NOs: 6, 7 y 8 también confieren ventajas. Por otro lado, del intervalo de otras HPPD ensayadas, algunas parecen significativamente menos efectivas que la HPPD de SEC ID NO: 1 para proporcionar tolerancia a cualquier herbicida. De este modo, por ejemplo, parece que las HPPD de Erichola, Arabidopsis y Bidens son de actividad catalítica similar a la HPPD de sEc ID NO: 1, pero son >20 veces más sensibles a mesotriona, mientras que la enzima de Pseudomonas es tanto menos catalíticamente eficiente (kcat/ Km ~0,2 de aquél para SEC ID NO: 1) como menos sensible a mesotriona. De este modo, un número de las nuevas secuencias de HPPD descritas aquí (por ejemplo, SEC ID NOs: 2-8) ofrecen mejoras significativas con respecto a la técnica anterior con relación a proporcionar mejores opciones para proporcionar tolerancia a herbicidas de HPPD, y especialmente con respecto a las clases químicas ejemplificadas.
Ejemplo 3
Clonación, expresión y ensayo de variantes mutantes de las HPPD, y determinación de los valores de kcat, KmHPP y koff frente a diversos herbicidas de HPPD
Las secuencias de ADN optimizadas para el uso de codones de E. coli, y que codifican polipéptidos de HPPD que corresponden a las SEC ID NOs: 20-47, que codifican polipéptidos de HPPD derivados Avena sativa, Alopecurus mysoides y Poa annua, se sintetizaron mediante GeneArt (Regensburg, Alemania), se clonaron en pET24a, y se expresaron en E. coli BL21(DE3) con selección con 50 ^g/ml de canamicina, como se describe en la Publicación PCT n° WO 02/46387. Las células se hicieron crecer, se prepararon extractos proteicos, y se llevaron a cabo mediciones de los títulos de sitios activos de HPPD y cinéticas de los valores de kcat, KmHPP y koff, como se describe en el Ejemplo 1.
En el presente ejemplo, se usaron las siguientes secuencias de HPPD derivadas de SEC ID NO: 1.
La SEC ID NO: 20 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de M por L en la posición 358.
La SEC ID NO: 21 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de I por la V en la posición 217.
La SEC ID NO: 22 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de L por la V en la posición 217.
La SEC ID NO: 23 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de R por la A en la posición 326.
La SEC ID NO: 24 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de K por la A en la posición 326.
La SEC ID NO: 25 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de I por la A en la posición 326.
La SEC ID NO: 26 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de E por la I en la posición 339.
La SEC ID NO: 27 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de D por la I en la posición 339.
La SEC ID NO: 28 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de C por la I en la posición 339.
La SEC ID NO: 29 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de R por la G en la posición 408.
La SEC ID NO: 30 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de M por L en la posición 358 y mediante la sustitución de R por la A en la posición 326.
La SEC ID NO: 31 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de M por L en la posición 358, mediante la sustitución de R por la A en la posición 326, y mediante la sustitución de I por la V en la posición 217.
La SEC ID NO: 32 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de M por L en la posición 358 y mediante la sustitución de I por la V en la posición 217.
5
10
15
20
25
30
35
40
La SEC ID NO: 33 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de R por la A en la posición 326 y mediante la sustitución de I por la V en la posición 217.
La SEC ID NO: 34 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de M por L en la posición 358, mediante la sustitución de K por la A en la posición 326, y mediante la sustitución de I por la V en la posición 217.
La SEC ID NO: 35 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de M por L en la posición 358, mediante la sustitución de R por la A en la posición 326, y mediante la sustitución de L por la V en la posición 217.
La SEC ID NO: 36 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de M por L en la posición 358, mediante la sustitución de R por la A en la posición 326, mediante la sustitución de I por la V en la posición 217, y mediante la sustitución de E por la I en la posición 339.
La SEC ID NO: 37 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de M por L en la posición 358, mediante la sustitución de R por la A en la posición 326, mediante la sustitución de L por la V en la posición 217, y mediante la sustitución de E por la I en la posición 339.
La SEC ID NO: 42 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de H por la G en la posición 412.
La SEC ID NO: 43 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de C por la G en la posición 412.
La SEC ID NO: 44 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de A por la Q en la posición 297.
La SEC ID NO: 45 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de N por la Q en la posición 283.
La SEC ID NO: 46 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de G por la Q en la posición 297.
La SEC ID NO: 47 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 1 mediante la sustitución de A por L en la posición
358.
En el presente ejemplo, se usaron las siguientes secuencias de HPPD derivadas de SEC ID NO: 3:
La SEC ID NO: 40 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 3 mediante la sustitución de M por L en la posición 359 y mediante la sustitución de R por la A en la posición 327.
La SEC ID NO: 41 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 3 mediante la sustitución de M por L en la posición
359, mediante la sustitución de R por la A en la posición 327, y mediante la sustitución de I por la V en la posición 218.
En el presente ejemplo, se usaron las siguientes secuencias de HPPD derivadas de SEC ID NO: 7:
La SEC ID NO: 38 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 7 mediante la sustitución de M por L en la posición 353 y mediante la sustitución de R por la A en la posición 321.
La SEC ID NO: 39 de HPPD se cambió con relación a SEC ID NO: 7 mediante la sustitución de M por L en la posición 353, mediante la sustitución de R por la A en la posición 321, y mediante la sustitución de I por la primera V en la posición 213.
La HPPD correspondiente a SEC ID NO: 1 se incluyó como control interno en los experimentos. Los valores medios absolutos de los diversos parámetros cinéticos para la HPPD de SEC ID NO: 1 se enumeran anteriormente con detalle en el Ejemplo 1. Los datos en las Tablas 3-5 a continuación proporcionan datos procedentes de estas medidas para las SEC ID NOs: 20-47 y 50, expresados como una relación frente al valor de control correspondiente para SEC ID NO: 1. De este modo, todos los valores de los parámetros para SEC ID NO: 1 se les da un valor de 1.0.
Tabla 3. Parámetros cinéticos de las HPPD de SEC ID NOs: 20-29
co o - SEC ID NO:
O b>
o b) o Kcat/Kcat SEC ID NO: 1
o en
o b) o KmHPp/Km SEC ID NO: 1
o (Kcat/Km)/ ( Kcat/Km ) SEC ID NO: 1
co co
co 4^ o KoffB/KoffB SEC ID NO: 1
o KoffC/KoffC SEC ID NO: 1
NO Vi
NO CO o Koff D/Koff D SEC ID NO: 1
b>
b) o K0ff E/Koff E SEC ID NO: 1
co
co 7o o KoffF/KoffF SEC ID NO: 1
Q)
C7
Q)
4^
TI
Q)
Q)>
3
0
O
0 (fi
Cl
0
qT
(fi
1 TI TI D
~o
0
Q)
O)
m
o
O
(/>
CO
0
1
CO
O)
29 NO 00 27 26 25 24 23 22 NO 20 - SEC ID NO:
Kcat/Kcat
O
O
o O o O O o O -i. -i. o O o -i. o o -i.
■^1 co O) O) co ■^1 co co en “vj 00 co 00 ■^1 o SEC ID NO: 1
KmHPp/Km
o
o
o o o o o o o o o o o
co
b> Vi "co b> "en b) o b> o Vj co "co 4^ "co "co "o SEC ID NO: 1
(Kcat/Km)/
o
o
o o NO o o o (Kcat/Km)
4^
NO —1 co o NO NO 00 NO oo —1 o o co 00 co o
SEC ID NO: 1
KoffB/KoffB
00 —i. —i. —i. —i. —i. NO —i. —i. —i. NO —i.
NO en O) 4^ o en en co o o SEC ID NO: 1
Kof,C/Kof,C
—i. o —i. —i. —i. —i.
o co o o SEC ID NO: 1
Kof, D/Kof, D
—i. —i. —i. —i. —i. —i. —i. —i. NO —i.
O 4^ en 4^ 4^ NO o co co o SEC ID NO: 1
Kotf E/Kof, E
_i.
CO OO en O) co NO CO NO o o NO o SEC ID NO: 1
KoffF/KoffF
-i. -i. -i. -i. -i. NO -i.
en CO CO o o SEC ID NO: 1
4^
4^ o eo CD eo 00 eo “v] - SEC ID NO:
O ~co
o 00 o b) o (O o 00 o b) o bi o Vj o Vj o Kcat/Kcat SEC ID NO: 1
o Vi
o b) o en O 00 o Vj 0 01 o 00 o 4^ 0 01 o KmHPp/Km SEC ID NO: 1
NO
eo o O NO NO o Vj b) eo o (Kcat/Km)/ (Kcat/Km) SEC ID NO: 1
NO en
00 4^ CT> 4^ eo ~co 00 b) o KoffB/KoffB SEC ID NO: 1
o KoffC/KoffC SEC ID NO: 1
oo b>
JO 4^ eo eo eo 4^ o Koff D/Koff D SEC ID NO: 1
en eo
NO OI 4^ 00 NO 00 eo Vj o K0ff E/Koff E SEC ID NO: 1
o KoffF/KoffF SEC ID NO: 1
Tabla 5. Parámetros cinéticos de las HPPDs de SEC ID NOs: 37-47 y 50
36 35 34 33 32 eo
O
O
o O o O o O o o o o o o o
■■vj
■vj ■vj 00 ■vj ■vj O) eoo eo O 00 O) O) 00 00 00
o
O o o O o o o
o
o
o
o
o
o
en
■vj 00 NO eo 00 ■vj en eo ■vj en en ■vj ■vj 00
o O o o o o o o
CO
O eo ■vj 00 eo ■vj 00 eo 00 NO o
00 CT> en NO eo eo en en eo eo
en eo o en NO eo eo O) en
o
eo o eo
eo eo eo NO NO NO eo NO eo
O) o NO 4^ eo O) NO 00
en NO NO NO NO NO
en eo en oo eo NO eo
NO eo
eo ■vj 00
5
10
15
20
25
30
35
0,9 1,0 1,0
42
2,0 8,1 0,2 1,4 0,7 0,6 1,0 1,9
1,1 4,6 0,2
43
0,7 10,5 <0,1 2,0 1,4 1,0 2,7 0,7
0,5 8,5 <0,1
44
0,4 22 <0,1 1,6 0,6
45
<0,05 >2 <<0,1 2,0
46
0,1 49 <<0,1 2,7 1,8
47
0,2 2 0,1 1,0 1,7
50
1,1 2 1,1 15,3 3,2 4,7
3,4 3,7 4,1
Es manifiesto a partir de los datos dados a conocer en las Tablas 3-5 que, con relación a SEC ID NO: 1, algunas HPPD mutantes son más y otras son menos inherentemente resistentes a los diversos herbicidas B-F, y por lo tanto más o menos adecuadas para conferir resistencia en plantas transgénicas. Nuevamente, para cada herbicida, el parámetro comparativo relevante que determina la idoneidad u otro modo de la secuencia de HPPD dada es el múltiplo del valor de kcat/Km (con relación a aquél para SEC ID NO: 1) y la velocidad kotr correspondiente para el herbicida (con relación a aquella para SEC ID NO: 1). De este modo, aquellas secuencias, por ejemplo SEC ID NOs: 20-29, que tienen cambios de aminoácidos individuales con relación a SeC ID NO: 1 en las posiciones L358, V217, I339 y A326 de SEC ID NO: 1 no muestran sólo incrementos significativos en la velocidad de disociación (kotr) a uno o más de los herbicidas de ensayo (B-F), sino también siguen siendo catalíticamente eficientes (es decir kcat/Km sigue siendo aproximadamente el mismo, o está mejorado, con relación a aquél para SEC ID NO: 1). De este modo, por ejemplo, la HpPD de SEC ID NO: 26, que tiene una sustitución de aminoácido I339E con relación a SEC ID NO: 1 muestra una mejora significativa (~1,5 veces) en la tolerancia inherente a herbicidas B, D, E y F con relación a SEC ID NO: 1. De forma similar, las otras diversas sustituciones de aminoácidos individuales (L358M, V217I, V217L, G408R, I339D, I339C, A326R, A326I y A326K de SEC ID NOs: 20-29) también proporcionan mejoras en la tolerancia inherente a uno o más de los herbicidas.
SEC ID NO: 29, con un cambio G408R con relación a SEC ID NO: 1, muestra sólo alrededor de un un cuarto a un tercio de la actividad catalítica de la HPPD de SEC ID NO: 1. Sin embargo, esta deficiencia en la actividad catalítica está más que reconciliada por el incremento de 8X o más en el valor de koff que gobierna la velocidad de disociación de los compuestos B y E a partir de la enzima. Pruebas adicionales demuestran que la mutación de G408 confiere propiedades ventajosas en la enzima mutante. Por ejemplo, una sustitución G408A tiene actividad catalítica similar a la HPPD de SEC ID NO: 1 (kcat/Km), y muestra, en comparación con SEC ID NO: 1, un incremento de 1,45 veces en la velocidad de disociación (koff) del complejo de enzima:inhibidor con mesotriona. La HPPD mutante de G408A también muestra, con relación a SEC ID NO: 1, un incremento mayor que 1,5X en el valor de koff con respecto al inhibidor D, y un incremento mayor que 3,5X en el valor de Koff con respecto al inhibidor E. Como tal, los niveles comerciales de tolerancia a los herbicidas de HPPD, y particularmente a las clases estructurales ejemplificadas aquí, se logra más fácilmente a través de las mejoras adicionales conferidas por esas mutaciones descritas.
A fin de proporcionar cualquier grado de tolerancia útil, una mutación debe proporcionar una disminución en la unión al herbicida (medida aquí como un incremento en la velocidad de disociación del herbicida desde la enzima) que, en magnitud numérica supere con creces cualquier déficit catalítico (medido aquí como kcat/Km). Incluso son más valiosas aquellas mutaciones que se pueden combinar juntas entre sí y se pueden incorporar en una variedad de secuencias de HPPD (por ejemplo, las HPPD expuestas en la Tabla 2) para que trabajen en combinación y proporcionen niveles aditivos, o más preferiblemente sinérgicos, de tolerancia a herbicidas con relación a las HPPD nativas.
De este modo, por ejemplo, la HPPD variante de SEC ID NO: 30 derivada de Avena, que combina la sustitución A326R de SEC ID NO: 23 con la sustitución L358M de SEC ID NO: 20, proporciona un nivel de resistencia a herbicida de HPPD que supera a aquél de las dos mutaciones individuales, y, de hecho, proporciona un incremento casi multiplicativo. Así, por ejemplo, la HPPD de SEC ID NO: 30 es alrededor de un 3,5 veces más resistente a mesotriona que lo que lo es la SEC ID NO: 1, y de este modo, todo lo demás siendo igual, conferirá un nivel mayor (probablemente alrededor de un 3 o más veces) de tolerancia a mesotriona cuando se expresa igualmente en plantas transgénicas. La misma secuencia de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
HPPD (es decir, SEC ID NO: 30) también proporciona tolerancia mejorada con respecto a SEC ID NO: 1 en lo que respecta a los otros herbicidas ensayados, y, notablemente, por ejemplo, es alrededor de un 3 veces más tolerante a topramezona y a isoxaflutol (dicetonitrilo) que lo que lo es SEC ID NO: 1. La HPPD de SEC ID NO: 31, que combina la sustitución V217I de SEC ID NO: 21 con la sustitución L358M de SEC ID NO: 20 y la sustitución A326R de SEC ID NO: 23 muestra correspondientemente incluso una mejora aún mayor (~5,8 veces) en la resistencia a mesotriona y a otros herbicidas con relación a la HPPD de SEC ID NO: 1. De forma similar, la HPPD de SEC ID NO: 36, que añade todavía más el cambio I339E de SEC ID NO: 26 a aquellos de SEC ID NO: 31 es incluso más tolerante a mesotriona (~9,8 veces) que lo que lo es la HPPD de SEC ID NO: 1. Esto demuestra que los cambios en todas estas posiciones de aminoácidos se pueden combinar para proporcionar niveles mejorados de tolerancia inherente a herbicidas enzimáticos.
Además, los mismos cambios mutacionales también funcionan y beneficiosamente alteran las características de las HPPD distintas de la SEC ID NO: 1 de Avena. De este modo, por ejemplo, SEC ID NO: 40 combina los cambios de aminoácidos equivalentes como en SEC ID NO: 30, pero en este caso en la HPPD de Alopecurus de SEC ID NO: 3. Los beneficios de los dos cambios mutacionales y de la enzima HPPD de Alopecurus con respecto a Avena funcionan aproximadamente de forma multiplicativa de manera que, teniendo en cuenta los valores de kcat/Km y de koff, la HPPD de SEC ID NO: 40 muestra una mejora de más de 10 veces en la tolerancia inherente a mesotriona con relación a SEC ID NO: 1. De forma similar, SEC ID NO: 39 combina los cambios de aminoácidos equivalentes como en SEC ID NO: 31, pero en este caso en la HPPD de Poa de SEC ID NO: 7. En consecuencia, SEC ID NO: 39 muestra una tolerancia significativamente mejor al compuesto D (~4,7 mejor que la HPPD de SEC ID NO: 1), que lo que lo hace la HPPD de SEC ID NO: 31 (~3,2 mejor que la HPPD de SEC ID NO: 1). SEC ID NO: 41 también combina los cambios de aminoácidos equivalentes como en SEC ID NO: 31, pero en este caso en la HPPD de Alopecurus de SEC ID NO: 3. La HPPD de SEC ID NO: 41 muestra un nivel elevado de tolerancia inherente tanto al compuesto E (~5,8 veces mayor que la HPPD de SEC ID NO: 1) como también a mesotriona (~13,8 veces mayor que la HPPD de SEC ID NO: 1).
Ejemplo 4
Preparación y evaluación de tolerancia herbicida conferida por enzimas HPPD heterólogas expresadas en tabaco
En el presente ejemplo, las HPPD nativas y mutantes son, por ejemplo, SEC ID NOs: 1-14 y 20-47. Las secuencias de ADN que codifican a éstas (optimizadas para tabaco, u, opcionalmente, optimizadas en codones según una cosecha diana tal como haba de soja) se preparan sintéticamente y se obtienen comercialmente a partir de GeneArt (Regensburg, Alemania). Cada secuencia se diseña para tener sitios 5' Nde1 y 3’BamH1 para facilitar la clonación directa, y después se clona en un vector binario adecuado para la transformación vegetal a base de Agrobacterium.
En una realización particular, los genes optimizados para el tabaco que codifican las fusiones N-terminales del péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de petunia (SEC ID NO: 48) a HPPD SEC ID NOs: 13 y 14, y la HPPD de trigo (SEC ID NO: 5 en la publicación PCT n° WO 02/46387; UNIPROT:A7WK82) se clonan en constructos de expresión y se transforman en tabaco. La secuencia nucleotídica codificante de CTP/HPPD se edita mediante PCR (o se sintetiza inicialmente) para incluir un sitio 5' Xhol, un potenciador TMV omega (SEC ID NO: 86) y un sitio de 3' KpnI (y para eliminar cualquiera de tales sitios internos).
El casete de expresión, que comprende el líder TMV omega 5', CTP y el gen de 4-HPPD, se corta usando XhoI/Kpnl y se clona en pBIN 19 digerido de forma similar (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) detrás de un promotor 35S mejorado doble (SEC ID NO: 87) y delante de un terminador de la transcripción NOS 3' (SEC ID NO: 88), y después se transforma en células competentes de E. coli TOP 10. El ADN recuperado de la E. coli se usa para transformar Agrobacterium tumefaciens LBA4404, y las bacterias transformadas se seleccionan en medio que contiene rifampicina y canamicina. El tejido de tabaco se somete a transformación mediada por Agrobacterium, usando métodos conocidos en la técnica o como se describe aquí. Por ejemplo, una placa maestra de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector binario que expresa HPPD se usa para inocular 10 ml de LB (caldo L) que contiene 100 mg/l de rifampicina más 50 mg/l de canamicina, usando una única colonia bacteriana. Esto se incuba toda la noche a 28°C, agitando a 200 rpm. Este cultivo nocturno completo se usa para inocular un volumen de 50 ml de LB que contiene el mismo antibiótico. Nuevamente, esto se cultiva toda la noche a 28°C, agitando a 200 rpm. Las células de Agrobacterium se peletizan centrifugando a 3000 rpm durante 15 minutos, y después se resuspenden en medio MS (Murashige y Skoog) que contiene 30 g/l de sacarosa, pH 5,9 hasta una OD (600 nM) = 0,6. Esta suspensión se dispensa en alícuotas de 25 ml en cápsulas de Petri.
Cultivos de brotes de tabaco micropropagados de forma clonal se usaron para escindir hojas jóvenes (todavía no expandidas completamente). La nervadura central y los márgenes externos de las hojas se eliminan y se desechan, y la lámina que queda se corta en cuadrados de 1 cm. Estos se transfieren a la suspensión de Agrobacterium durante 20 minutos. Los explantes se retiran entonces, se embadurnan en papel de filtro estéril para eliminar la suspensión en exceso, después se transfieren a medio NBM sólido (medio MS que contiene 30 g/l de sacarosa, 1 mg/l de BAP (bencilaminopurina) y 0,1 mg/l de NAA (ácido naftalenoacético) a pH 5,9, y solidificado con 8 g/l de plantagar), con la superficie abaxial de cada explante en contacto con el medio. Se transfirieron aproximadamente 7 explantes por placa,
5
10
15
20
25
30
35
40
que entonces se cierran herméticamente y se mantienen en una incubadora alumbrada a 25°C durante un fotoperíodo de 16 horas durante 3 días.
Los explantes se transfieren entonces sobre medio NMB que contiene 100 mg/l de canamicina más antibiótico, para evitar el crecimiento adicional de Agrobacterium (200 mg/l de timentina con 250 mg/l de carbenicilina). Entonces se llevó a cabo el subcultivo adicional sobre este mismo medio cada 2 semanas.
A medida que los brotes comienzan a regenerarse a partir de las explantas de hojas que forman callos, se retiran a medio de alargamiento de brotes (medio MS, 30 g/l de sacarosa, 8 g/l de plantagar, 100 mg/l de canamicina, 200 mg/l de timentina, 250 mg/l de carbenicilina, pH 5,9). Las plantas transgénicas estables enraízan fácilmente en 2 semanas. Para proporcionar múltiples plantas por suceso para permitir finalmente ensayar más de un herbicida por planta transgénica, todos los brotes que enraízan se micropropagan para generar 3 o más clones enraizados.
Las plantas transgénicas putativas que están enraizando y que muestran un crecimiento vigoroso del brote en el medio que incorpora canamicina se analizan mediante PCR usando cebadores que amplificaron un fragmento de 500 pb en el transgén de HPPD. La evaluación de este mismo cebador montado en tabaco sin transformar mostró de forma concluyente que estos cebadores no amplificarían secuencias del gen de HPPD de tabaco nativo.
Los brotes transformados se dividen en 2 ó 3 clones y se regeneran a partir de callo resistente a canamicina. Los brotes se enraízan en agar MS que contiene canamicina. Las explantas enraizadas que sobreviven se vuelven a enraizar para proporcionar aproximadamente 40-50 eventos resistentes a canamicina y positivos a PCR a partir de cada evento.
Una vez enraizadas, las plántulas se transfieren desde agar y se ponen en macetas en 50% de turba, 50% de John Innes Soil n° 3 con un fertilizante de liberación lenta en macetas redondas de 3 pulgadas, y se dejan regadas regularmente para establecerse durante 8-12 días en el invernadero. Las condiciones del invernadero se ajustaron a alrededor de un 24-27°C día, 18-21°C noche, y aproximadamente un fotoperíodo de 14 horas. La humedad se ajustó a -65%, y los niveles de luz fueron hasta 2000 ^moles/m2 al nivel del banco.
De este modo se produjeron tres poblaciones transgénicas, cada una de alrededor de un cuarenta plantas de tabaco y que comprenden, como alternativa, un gen de HPPD que codifica la HPPD de trigo HPPD (A7WK82), HPPD SEC ID NO: 12 o HPPD SEC ID NO: 13. Entonces se seleccionó un subconjunto de alrededor de un 30 plantas basándose en el tamaño similar de cada población, para el ensayo de pulverización. Todas las plantas se pulverizaron entonces con 600 g/ha de mesotriol. Se mezcló Callisto® en agua con 0,2-0,25% de tensioactivo X-77®, y se pulverizó desde un brazo de grúa en un pulverizador de carril adecuado que se mueve a 2 mph, con una boquilla a alrededor de un 2 pulgadas desde las partes superiores de la planta. El volumen de pulverización fue 200 l/ha. Las plantas se evaluaron para determinar el daño, y se puntuaron a 14 días después del tratamiento (DAT). Los resultados se representan en la Tabla 6.
Las cajas negras en la Tabla 6 indican que las plantas en ese evento particular fueron verdes, mientras que las cajas grises indican que las plantas estaban parcialmente cloróticas. Las cajas blancas restantes indican que las plantas estaban completamente cloróticas. A partir de los datos representados en la Tabla 6, está claro que, de las HPPD expresadas de forma similar, sólo la HPPD de trigo (A7WK82) había conferido un nivel útil de tolerancia a mesotriona (es decir, normalmente robusta a al menos 2-4X de una tasa de aplicación de campo normal). Por el contrario, las HPPD de SEC ID NO: 13 (procedente de Arabidopsis) y SEC ID NO: 14 (procedente de Pseudomonas fluorescens) no proporcionaron tolerancia efectiva a la tasa pulverizada. Cinco de 33 eventos de HPPD de trigo mostraron < o igual a 10% de daño (cero a ligera atrofia). Esta diferencia en la tolerancia a mesotriona según la cual HPPD se expresa es completamente consistente tanto con los datos in vitro representados en la Tabla 2 (que indican que ni las HPPD de Arabidopsis ni las de Pseudomonas tienen mucha tolerancia inherente a mesotriona) como también con los datos publicados que describen la superioridad significativa relativa de la HPPD del trigo (tanto in vitro como in planta) a cualquiera de estos (Hawkes et al (2001) en Proc. Brit Crop Prot. Conf.(Weeds), p 563. British Crop Protection Council y Publicación PCT n° WO 02/46387).
Tabla 6
Arabidopsis
Trigo Pseudomonas
Evento
Puntuación Evento Puntuación Evento Puntuación
987
90 1605 90 1897 85
1988
90 1607 0 1898 80
1990
80 1608 15 1899 80
1993
85 1609 30 1905 85
1995
85 1610 80 1908 85
1996
90 1612 75 1909 90
1997
85 1613 80 1918 85
1999
90 1616 50 1920 100
2009
85 1617 65 1927 85
2011
90 1618 70 1928 90
2012
90 1620 0 1929 85
2013
95 1622 20 1930 85
2015
90 1623 30 1931 85
2016
90 1626 75 1934 85
2021
90 1636 85 1936 80
2022
90 1701 70 1937 80
2029
90 1704 75 1938 75
2031
85 1705 75 1939 90
2033
85 1706 10 1940 85
2035
85 1708 15 1943 85
2036
90 1709 90 1944 80
2038
85 1710 5 1945 80
2039
90 1711 85 1951 90
2040
90 1713 70 1952 90
2044
90 1717 75 1953 90
2049
85 1718 80 1954 95
2051
90 1719 5 1955 95
2052
85 1720 70 1956 95
2053
90 1721 15 1957 95
2059
0 1722 90 1958 95
2061
90 1723 15 1965 85
2062
90 1727 35 1966 95
1728 40
La Tabla 7 representa una evaluación del daño 14 DAT con 600 g/ha de isoxaflutol de plantas clónales de los mismos eventos como se representan en la Tabla 6, a partir de un experimento llevado a cabo en paralelo al mismo tiempo.
Tabla 7
Arabidopsis
Trigo Pseudomonas
Evento
Puntuación Evento Puntuación Evento Puntuación
987
65 1605 85 1897 70
1988
75 1607 60 1898 50
1990
80 1608 15 1899 50
1993
10 1609 70 1905 65
1995
80 1610 80 1908 90
1996
65 1612 85 1909 95
1997
70 1613 30 1918 70
1999
85 1616 70 1920
2009
70 1617 80 1927 70
2011
70 1618 10 1928 75
2012
70 1620 65 1929 60
2013
90 1622 80 1930 75
2015
80 1623 65 1931 60
2016
70 1626 90 1934 70
2021
70 1636 35 1936 60
2022
65 1701 65 1937 65
2029
70 1704 90 1938 30
2031
80 1705 65 1939 80
2033
70 1706 25 1940 70
2035
80 1708 25 1943 75
2036
80 1709 90 1944 75
2038
80 1710 40 1945 50
2039
1711 95 1951 68
2040
85 1713 65 1952 75
2044
90 1717 85 1953 68
2049
75 1718 75 1954 68
2051
75 1719 25 1955 55
2052
68 1720 80 1956 55
2053
68 1721 65 1957 70
2059
70 1722 95 1958 68
2061
75 1723 15 1965 80
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2062
90 1727 50 1966 75
1728 68
Todas las plantas pulverizadas con isoxaflutol fueron dañadas, mostrando sólo 3/33 eventos que expresan HPPD de trigo menos de 20% de daño. Nuevamente, ninguna de las plantas que expresan HPPD de Arabidopsis parece apreciablemente resistente, mientras que la HPPD de Pseudomonas sí confiere cierto grado de resistencia, mostrando 4/32 plantas un 50% de daño o menos. Nuevamente, esto es ampliamente consistente con los datos genéticos in vitro (Tabla 2 y Publicación PCT n° WO 02/46387), que muestran que, aunque exhibe un valor elevado de Km para HPP, y por lo tanto muestra un valor relativamente pobre de kcat/ Km, la HPPD de Pseudomonas exhibe un valor relativamente elevado de koff para el dicetonitrilo de isoxaflutol (es decir, Compuesto D).
Los datos anteriores establecen ampliamente el poder predictivo de determinar la cinética enzimática i vitro, como se determina mediante el valor relativo de (kcat/ Km) x koff, para anticipar cuánta tolerancia conferirá una HPPD dada a un herbicida de HPPD dado cuando se expresa en una planta de cosecha.
En ejemplos adicionales, genes optimizados para tabaco que codifican HPPD SEC ID NOs. 1 a 14 y HPPD SEC NOs: 20-47 se clonan (esta vez sin ningún CTP) en constructos de expresión, como se describe más abajo, y se transforman en tabaco. La secuencia nucleotídica codificante de HPPD se edita mediante PCR (o se sintetiza inicialmente) para incluir el sitio 5' Xhol, un potenciador TMV omega, y un sitio 3' Kpnl (y para eliminar cualquiera de tales sitios internos). El casete de expresión, que comprende el líder de TMV omega y el gen de 4-HPPD se escinde usando Xhol/Kpnl y se clona en pBIN 19 digerido de forma similar (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) detrás de un promotor 35S doble y delante de un terminador transcripcional del gen Nos, y después se transforma en células competentes de E. coli TOP 10. Nuevamente, se generan poblaciones transgénicas de plantas de tabaco, y se evalúan en el invernadero como se describe anteriormente.
Ejemplo 5
Construcción de vectores de transformación de haba de soja
Se construyeron vectores binarios para transformación de dicotiledóneas (haba de soja) con un promotor, tal como un promotor sintético que contiene los potenciadores transcripcionales CaMV 35S y FMV que dirigen la expresión de la secuencia codificante de HPPD, tales como SEC ID NOs: 1-8 y 20-41, seguido de un terminador de 3' del gen Nos. El gen de HPPD se optimizó en los codones para la expresión de haba de soja basándose en la secuencia de aminoácidos predicha de la región codificante del gen de HPPD. En el caso de que no se use como marcador seleccionable la propia HPPD, se construyen vectores de transformación binarios de Agrobacterium que contienen un casete de expresión de HPPD añadiendo un gen marcador seleccionable de la transformación. Por ejemplo, el vector de transformación binario 17900 (SEC ID NO: 51) contiene un casete de expresión que codifica una variante de HPPD (SEC ID NO: 49) enlazado con dos casetes del gen PAT (uno con el promotor 35S y uno con el promotor COMPUESTO, y en los que ambos genes PAT van seguidos por el terminador nos) para la selección a base de glufosinato durante el proceso de transformación. Otro vector de transformación binario (17901; SEC ID NO: 52) contiene un casete de expresión que codifica la variante de HPPD (SEC ID NO: 50) y también un casete de marcador seleccionable de EPSPS. El vector 17901 se transforma en haba de soja, y se obtienen plantas transgénicas usando selección con glifosato usando transformación, mediada por Agrobacterium, de dianas de semillas inmaduras. Las secuencias de ADN que codifican los genes de HPPD se optimizan en los codones para la expresión en plantas dicotiledóneas.
Los vectores binarios ejemplares descritos anteriormente se construyen usando una combinación de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como PCR de solapamiento, síntesis de ADN, subclonación y ligación de fragmentos de restricción. Sus estructuras únicas se obtienen explícitamente en las Figuras 3 (vector 17900) y Figura 4 (vector 17901) y en los listados de secuencias SEC ID NOs: 51 y 52. A continuación se proporciona información adicional con respecto a los vectores.
Las abreviaturas usadas en la Figura 3 (vector 17900) se definen según lo siguiente: cAvHPPD-04
Principio: 1024 Final: 2343
Gen de HPPD de avena optimizado en los codones para haba de soja que codifica SEC ID NO: 49 cPAT-03-01
5
10
15
20
25
30
35
S. viridochromogenes sintético Hoescht AO2774 PAT, codones vegetales; idéntico a la proteína Q57146 de fosfinotricin acetil transferasa
cPAT-03-02
Principio: 5062 Final: 5613
Proteína fosfinotricin acetil transferasa de S. viridochromogenes PAT Q57146, ADN de cPAT-03-01, con sitios BamHI, Bgl2 mutados
cSpec-03
Principio: 6346 Final: 7134
También denominado aadA; gen que codifica la enzima aminoglucósido 3' adeniltransferasa, que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina para mantenimiento del vector en E. coli y Agrobacterium.
cVirG-01
Principio: 7434 Final: 8159
virG (putativo) procedente de pAD1289 con codón de Principio TTG. virGN54D procede de pAD1289 descrito en Hansen et al. 1994, PNAS 91:7603-7607
cRepA-01
Principio: 8189 Final: 9262 Proteína de replicación RepA, pVS1 eNOS-01
Principio: 168 Final: 259
Secuencia potenciadora de NOS putativa procedente de 15235 como se encuentra en la frontera derecha de ciertos vectores binarios.
eFMV-03
Principio: 396 Final: 589
Región potenciadora del virus del mosaico de la escrofularia (FMV) e35S-05
Principio: 596 Final: 888
Cambios de pb de C a T y C a A en la región del potenciador CMV 35S eTMV-02
Principio: 953 Final: 1020
Secuencia líder de TMV Omega 5'UTR que se piensa que potencia la expresión. EMBL: TOTMV6 eFMV-03
Principio: 4054 Final: 4247
Región potenciadora procedente del virus del mosaico de la escrofularia (FMV) e35S-05
Principio: 4254 Final: 4546
Cambios de pb de C a T y C a A en la región del potenciador CMV 35S
5
10
15
20
25
30
35
eNOS-01
Principio: 4557 Final: 4648
Secuencia del potenciador NOS putativa procedente de 15235 como se encuentra en la frontera derecha de ciertos vectores binarios
bNRB-05
Principio: 4 Final: 259 (complementario)
Región de frontera derecha/ T-DNA de NOS; puede influir en los promotores. EMBL Nos: J01826, V00087, AF485783. bNRB-01-01
Principio: 101 Final: 125 (complementario)
Repetición de frontera derecha de T-DNA del plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens bNLB-03
Principio: 5937 Final: 6066 (complementario)
Región de frontera izquierda de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens Principio: 5972 Final: 5996 (complementario)
Región de repetición de frontera izquierda de 25 pb de T-DNA del plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens prCMP-04
Principio: 4655 Final: 5051
Promotor y líder del virus del rizado de la hoja amarilla de galán de noche. Número de Acceso a Genbank®: AF364175. Véase también la Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20040086447. prCMP-01 con un truncamiento de un par de bases en el extremo 5', y un truncamiento de 2 pares de bases en el extremo 3'
pr35S-04-01
Principio: 2664 Final: 3184
Promotor 35S procedente de CMV. EMBL: CAMVG2 oVS1-02
Principio: 9305 Final: 9709
Origen de replicación y región de partición de plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh et al. 1984, Plasmid 11: 206-220); similar al Número de Acceso GenBank® U10487; sirve como origen de replicación en el hospedante de Agrobacterium tumefaciens
oCOLE-06
Principio: 10387 Final: 11193 (complementario)
El origen de replicación de ColE1 funcional en E. coli derivó de pUC19 tNOS-05-01
Principio: 2360 Final: 2612
Terminador sintético de nopalina sintetasa
tNOS-05-01
5
10
15
20
25
30
35
Terminador sintético de nopalina sintetasa tNOS-05-01
Principio: 5642 Final: 5894 Terminador sintético de nopalina sintetasa
Las abreviaturas usadas en la Figura 4 (vector 17901) se definen como lo siguiente:
cAmHPPD-01
Principio: 1024 Final: 2346
Gen de HPPD de Alopecurus mycosuroides optimizado en los codones para tabaco, que codifica SEC ID NO: 50
cGmEPSPS-01
Principio: 3675 Final: 5252
Versión optimizada en los codones para haba de soja de ADNc de EPSPS de haba de soja mutante doble cSpec-03
Principio: 6346 Final: 7134
También denominado aadA; gen que codifica la enzima aminoglucósido 3' adeniltransferasa, que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina para mantenimiento del vector in E. coliy Agrobacterium.
cVirG-01
Principio: 7434 Final: 8159
virG (putativo) procedente de pAD1289 con codón de Principio TTG. virGN54D procedió de pAD1289 descrito en Hansen et al. 1994, PNAS 91:7603-7607
cRepA-01
Principio: 8189 Final: 9262
Proteína de replicación de RepA, pVS1
eNOS-01
Principio: 168 Final: 259
Secuencia del potenciador NOS putativa procedente de 15235 como se encuentra en la frontera derecha de ciertos vectores binarios.
eFMV-03
Principio: 396 Final: 589
Región potenciadora del virus del mosaico de la escrofularia (FMV) e35S-05
Principio: 596 Final: 888
Cambios de pb de C a T y C a A en la región del potenciador CMV 35S eTMV-02
Principio: 953 Final: 1020
Secuencia líder de TMV Omega 5'UTR que se piensa que potencia la expresión. EMBL: TOTMV6
5
10
15
20
25
30
35
eFMV-03
Principio: 4054 Final: 4247
Región potenciadora del virus del mosaico de escrofularia (FMV) e35S-05
Principio: 4254 Final: 4546
Cambios de pb de C a T y C a A en la región del potenciador CMV 35S eNOS-01
Principio: 4557 Final: 4648
Secuencia del potenciador NOS putativa procedente de 15235 como se encuentra en la frontera derecha de ciertos vectores binarios.
bNRB-05
Principio: 4 Final: 259 (complementario)
Región de frontera derecha/T-DNA de NOS; puede influir en los promotores. EMBL Nos: J01826, V00087, AF485783. bNRB-01-01
Principio: 101 Final: 125 (complementario)
Repetición de frontera derecha de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens bNLB-03
Principio: 5937 Final: 6066 (complementario)
Región de frontera izquierda de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens Principio: 5972 Final: 5996 (complementario)
Región de repetición de frontera izquierda de 25 pb de T-DNA de plásmido ti de nopalina de Agrobacterium tumefaciens prCMP-04
Principio: 4655 Final: 5051
Promotor y líder del virus del rizado de la hoja amarilla de galán de noche. Número de Acceso Genbank® AF364175. Véase también la Publicación de Solicitud U.S. n° 20040086447. prCMP-01 con truncamiento de 1 par de bases en el extremo 5' y truncamiento de 2 pares de bases en el extremo 3'.
oVS1-02
Principio: 9305 Final: 9709
Origen de la replicación y región de partición procedente del plásmido pVS1 de Pseudomonas (Itoh et al. 1984, Plasmid 11: 206-220); similar al Número de Acceso GenBank® U10487; sirve como origen de replicación en el hospedante de Agrobacterium tumefaciens.
oCOLE-06
Principio: 10387 Final: 11193 (complementario)
El origen de replicación de ColE1 funcional en E. coli derivó de pUC19 tNOS-05-01
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Terminador sintético de nopalina sintetasa tNOS-05-01
Principio: 3794 Final: 4046 Terminador sintético de nopalina sintetasa Ejemplo 6
Transformación de haba de soja y selección de plantas resistentes a herbicidas
El material vegetal de haba de soja se puede transformar de forma adecuada y se pueden regenerar plantas fértiles mediante muchos métodos que son bien conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, las plantas transgénicas de haba de soja fértiles morfológicamente normales se pueden obtener mediante: 1) la producción de tejido embriogénico somático procedente de, por ejemplo, cotiledón inmaduro, hipocotilo u otro tejido adecuado; 2) transformación mediante bombardeo con partículas o infección con Agrobacterium; y 3) regeneración de plantas. En un ejemplo, como se describe en la patente U.S. n° 5.204.944, se corta tejido de cotiledón procedente de embriones inmaduros de haba de soja, preferiblemente al que se le ha eliminado el eje embriónico, y se cultiva en medio que contiene hormonas, para formar material vegetal embriogénico somático. Este material se transforma usando, por ejemplo, métodos de ADN directos, bombardeo con microproyectiles revestidos con ADN o infección con Agrobacterium, se cultiva en un medio de selección adecuado y se regenera, opcionalmente también en presencia continua de agente de selección, en plantas de haba de soja transgénicas fértiles. Los agentes de selección pueden ser antibióticos tales como canamicina, higromicina, o herbicidas tales como fosfinotricina o glifosato, o, como alternativa, la selección se puede basar en la expresión de un gen marcador visualizable, tal como GUS. Como alternativa, los tejidos diana para la transformación comprenden tejido meristemático en vez de embriogénico somaclonal, u, opcionalmente, es tejido de flores o formador de flores. Otros ejemplos de transformaciones de haba de soja se pueden encontrar, por ejemplo, mediante el método de suministro de aDn físico, tal como bombardeo con partículas (Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182; McCabe et al. (1988) Bio/technology 6:923-926), triquitas (Khalafalla et al. (2O06) African J. of Biotechnology 5:1594-1599), inyección de haces de aerosol (patente U.S. n° 7.001.754), o mediante métodos de suministro mediados por Agrobacterium (Hinchee et al. (1988) Bio/Technology 6:915-922; patente U.S. n° 7.002.058; Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20040034889; Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20080229447; Paz et al. (2006) Plant Cell Report 25:206-213). El gen de HPPD también se puede suministrar en un orgánulo tal como un plástido, para conferir resistencia incrementada a herbicidas (véase la Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20070039075).
Las plantas transgénicas de haba de soja se pueden generar con los vectores binarios descritos hasta ahora que contienen variantes del gen de HPPD con diferentes métodos de transformación. Opcionalmente, el gen de HPPD puede proporcionar el medio de selección e identificación de tejido transgénico. Por ejemplo, se usó un vector para transformar dianas de semillas inmaduras como se describe (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20080229447) para generar plantas de haba de soja de HPPD transgénicas directamente usando inhibidor de HPPD, tal como mesotriona, como agente de selección. Opcionalmente, los genes de HPPD se pueden presentar en el polinucleótido junto con otras secuencias que proporcionan medios adicionales de selección/identificación de tejido transformado, incluyendo, por ejemplo, los genes conocidos que proporcionan resistencia a canamicina, higromicina, fosfinotricina, butafenacilo, o glifosato. Por ejemplo, vectores binarios diferentes que contienen los genes marcadores seleccionables PAT o EPSPS como se describe en el Ejemplo 4 se transformaron en una diana de semilla de haba de soja inmadura para generar plantas tolerantes a herbicidas de HPPD usando transformación mediada por Agrobacterium y selección con glufosinato o glifosato (véase, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20080229447).
Como alternativa, las secuencias marcadoras seleccionables pueden estar presentes en polinucleótidos separados, y se usa un proceso de, por ejemplo, cotransformación y coselección. Como alternativa, en lugar de un gen marcador seleccionable, se puede usar un gen marcador puntuable, tal como GUS, para identificar un tejido transformado.
Se puede usar un método a base de Agrobacterium para la transformación de haba de soja para generar plantas transgénicas usando glufosinato, glifosato o inhibidor de HPPD mesotriona como agente de selección, usando semillas de haba de soja inmaduras como se describe (Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 20080229447).
Ejemplo 7
Crecimiento de plantas transgénicas T0 de haba de soja, análisis y evaluación de la tolerancia a herbicidas
Se llevaron plantas T0 procedentes de cultivo de tejido al invernadero, en el que se transplantaron en suelo saturado con agua (mezcla para cepellones y plántulas Redi-Earth®, Sun Gro Horticultura, Bellevue, WA) mezclado con 1% de
Marathón® granular (Olympic Horticultural Products, Co., Mainland, PA) a 5-10 g/gal de mezcla Redi-Earth® en macetas cuadradas de 2”. Las plantas se cubrieron con cúpulas para la humedad y se colocaron en una cámara Conviron (Pembina, ND) con las siguientes condiciones medioambientales: 24°C día; 18°C noche; fotoperíodo de 16 h de luz-8 h de oscuridad; y humedad relativa de 80%.
5 Después de que las plantas se establecen en el suelo y aparecen nuevos crecimientos (~1-2 semanas), se toman muestras de las plantas y se ensayan para determinar la presencia del transgén deseado mediante análisis Taqman™ usando sondas apropiadas para los genes de HPPD, o promotores (por ejemplo prCMP y prUBq3). Todas las plantas positivas y varias plantas negativas se transplantaron en macetas cuadradas de 4” que contienen suelo MetroMix® 380 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA). Se incorpora un fertilizante de liberación lenta Sierra 17-6-12 en el suelo, a la tasa 10 recomendada. Las plantas negativas sirven como controles para el experimento de pulverización. Las plantas se vuelven a colocar entonces en un invernadero estándar para aclimatizarlas (~1 semana). Las condiciones medioambientales son típicamente: 27°C día; 21°C noche; fotoperíodo de 16 h (con luz ambiental); humedad ambiental. Después de aclimatarse (~1 semana), las plantas están listas para ser pulverizadas con los herbicidas deseados. Se hacen crecer plantas transgénicas de haba de soja tolerantes a herbicidas hasta madurez, para la producción de semillas. Las 15 semillas transgénicas y las plantas de la progenie se usan para evaluar posteriormente su comportamiento de tolerancia a herbicidas y sus características moleculares.
De este modo, las plantas de haba de soja T1 del vector 17900 (Figura 3) y del vector 17901 (Figura 4), que expresan, como alternativa, SEC ID NO: 49 y SEC ID NO: 50 procedentes de casetes de expresión idénticos, se hacen crecer y se ensayan para determinar la tolerancia a un intervalo de herbicidas de HPPD, en comparación con plantas similares, que 20 expresan similarmente SEC ID NO: 1 de HPPD.
Todas las patentes, solicitudes y publicaciones de patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Syngenta Participations AG Hawkes, Timothy R Langford, Michael P Viner, Russell C Vernooij, Bernard TM Dale, Richard Singh, Shradha Kramer, Vance
<120> Nuevos Polipéptidos De Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa Y Métodos De Uso
<130> S305 1021PCT 63367.0139.1
<150> 61/224.661
<151> 2009-07-10
<150> 12/692.552
<151> 2010-01-22
<150> 61/146.513
<151> 2009-01-22
<160> 88
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1

<211> 439
<212> PRT
<213> Avena sativa

<400> 1

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser 435

<210> 2 <211> 441
<212> PRT
<213> Alopecurus mycosuroides

<400> 2

Met Pro Pro Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Arg Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ala Phe His His Val Glu Phe 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ser 65 70 75 80

His Ala Ser His Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Asp Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr 100 105 110

Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Thr Glu Ala Ala Arg Thr Phe Ser Ser 115 120 125
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ala Glu Ala Phe His Thr Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe 145 150 155 160

Ala Pro Ala Asp Leu Gly Ser Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu 165 170 175

Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser His Pro Asp Gly Asp Asp 180 185 190

Val Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Gly Val Ser Arg Pro Gly Ala Met 195 200 205

Asp Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu 210 215 220

Met Ala Pro Val Ala Ala Tyr Met Lys Gly Phe Thr Gly Phe His Glu 225 230 235 240

Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Ala Glu Ser Gly Leu 245 250 255

Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu 260 265 270

Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr 275 280 285

Leu Asp Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser 290 295 300

Ser Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Ser Ala Met 305 310 315 320

Gly Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly 325 330 335

Val Arg Arg Leu Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu 340 345 350

Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu 355 360 365
Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Arg Pro Thr Phe Phe
46
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
370
375
380

Leu Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Ile Gly 385 390 395 400

Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe 405 410 415

Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala 420 425 430

Lys Gln Ser Ala Val Ala Gln Gln Ser 435 440

<210> 3

<211> 440
<212> PRT
<213> Alopecurus mycosuroides

<400> 3

Met Pro Pro Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Arg Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ala Phe His His Val Glu Phe 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ser 65 70 75 80

His Ala Ser His Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Asp Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr 100 105 110

Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Thr Glu Ala Ala Arg Thr Phe Ser Ser 115 120 125

Ala His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Ala Ile Arg Val Ala Asp Ala 130 135 140
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ala Glu Ala Phe His Thr Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe 145 150 155 160

Ala Pro Ala Asp Leu Gly Ser Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu 165 170 175

Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser His Pro Asp Gly Asp Asp 180 185 190

Val Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Gly Val Ser Arg Pro Gly Ala Met 195 200 205

Asp Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu 210 215 220

Met Ala Pro Val Ala Ala Tyr Met Lys Gly Phe Thr Gly Phe His Glu 225 230 235 240

Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Ala Glu Ser Gly Leu 245 250 255

Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu 260 265 270

Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr 275 280 285

Leu Asp Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser 290 295 300

Ser Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Ser Ala Met 305 310 315 320

Gly Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly 325 330 335

Val Arg Arg Leu Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu 340 345 350

Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu 355 360 365

Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu 370 375 380

Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Ile Gly Gln 385 390 395 400
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys 420 425 430

Gln Ser Ala Val Ala Gln Gln Ser 435 440
<210>
4
<211>
440
<212>
PRT
<213>
Sorghum halepense
<400>
4

Met Pro Pro Thr Pro Thr Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Val Ala 1 5 10 15

Ala Ala Ser Ala Glu Gln Ala Ala Phe Arg Leu Val Gly His Arg Asn 20 25 30

Phe Val Arg Val Asn Pro Arg Ser Asp Arg Phe His Thr Leu Ala Phe 35 40 45

His His Val Glu Leu Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg 50 55 60

Phe Ser Phe Gly Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser 65 70 75 80

Thr Gly Asn Thr Ala His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu 85 90 95

Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Ala His Gly Ala Asp Ala Ala Thr 100 105 110

Ala Ser Leu Pro Ser Phe Ser Ala Ala Glu Ala Arg Arg Phe Ala Ala 115 120 125

Asp His Gly Leu Ala Val Arg Ala Val Ala Leu Arg Val Ala Asp Ala 130 135 140

Glu Asp Ala Phe Arg Ala Ser Val Ala Ala Gly Ala Arg Pro Ala Phe 145 150 155 160
Glu Pro Val Glu Leu Gly Leu Gly Phe Arg Leu Ala Glu Val Glu Leu
49
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
165 170 175
Tyr Gly Asp Val
Val Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Pro Asp Asp Ala Asp
180
185 190

Ala Ser Phe Leu Pro Gly Phe Val Gly Val Ser Ser Pro Gly Ala Ala 195 200 205

Asp Tyr Gly Leu Arg Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu 210 215 220

Leu Ala Pro Ala Ala Ala Tyr Phe Ala Gly Phe Thr Gly Phe His Glu 225 230 235 240

Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu 245 250 255

Asn Ser Met Val Leu Ala Asn Asn Ala Glu Asn Val Leu Leu Pro Leu 260 265 270

Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Phe 275 280 285

Leu Asp His His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Met Ala Leu Ala Ser 290 295 300

Asp Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Gln Ala Cys Ser Ala Met 305 310 315 320

Gly Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Ala Pro Glu Tyr Tyr Asp Gly 325 330 335

Val Arg Arg Arg Ala Gly Asp Val Leu Thr Glu Ala Gln Ile Lys Glu 340 345 350

Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu 355 360 365

Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu 370 375 380

Glu Ile Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Lys Gly Gln 385 390 395 400

Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser 405 410 415
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Gln Leu Phe Lys Ser 420

Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys 425 430
Gln Ala Ala Ala Ala 435
Gln Gly Pro 440
<210>
5
<211>
453
<212>
PRT
<213>
Sorghum halepense
<400>
5

Met Pro Pro Thr Pro Thr Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Val Ala 1 5 10 15

Ala Ala Ser Ala Glu Gln Ala Ala Phe Arg Leu Val Gly His Arg Asn 20 25 30

Phe Val Arg Val Asn Pro Arg Ser Asp Arg Phe His Thr Leu Ala Phe 35 40 45

His His Val Glu Leu Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg 50 55 60

Phe Ser Phe Gly Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser 65 70 75 80

Thr Gly Asn Thr Ala His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu 85 90 95

Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Ala His Gly Ala Asp Ala Ala Thr 100 105 110

Ala Ser Leu Pro Ser Phe Ser Ala Ala Glu Ala Arg Arg Phe Ala Ala 115 120 125

Asp His Gly Leu Ala Val Arg Ala Val Ala Leu Arg Val Ala Asp Ala 130 135 140

Glu Asp Ala Phe Arg Ala Ser Val Ala Ala Gly Ala Arg Pro Ala Phe 145 150 155 160

Glu Pro Val Glu Leu Gly Leu Gly Phe Arg Leu Ala Glu Val Glu Leu 165 170 175

Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Pro Thr Thr Arg Thr 180 185 190
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Arg Pro Ser Cys Arg Gly Ser Trp Ala Asp Asp Ala Asp Ala Ser Phe 195 200 205

Leu Pro Gly Phe Val Gly Val Thr Ser Pro Gly Ala Ala Asp Tyr Gly 210 215 220

Leu Lys Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro 225 230 235 240

Ala Ala Ala Tyr Phe Ala Gly Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu 245 250 255

Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn Ser Met 260 265 270
Val Leu Ala Asn Asn Ala Glu Asn Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro
275
280
285

Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Phe Leu Asp His 290 295 300

His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Met Ala Leu Ala Ser Asp Asp Val 305 310 315 320

Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Gln Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe 325 330 335

Glu Phe Met Ala Pro Pro Ala Pro Glu Tyr Tyr Asp Gly Val Arg Arg 340 345 350

Arg Ala Gly Asp Val Leu Thr Glu Ala Gln Ile Lys Glu Cys Gln Glu 355 360 365

Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile 370 375 380

Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu Ile Ile 385 390 395 400

Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Lys Gly Gln Glu Tyr Gln 405 410 415

Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Gln Leu Phe 420 425 430
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ala Ala 435 440 445
Ala Ala Gln Gly Pro 450
<210>
6
<211>
436
<212>
PRT
<213>
Poa annua
<400>
6

Met Pro Pro Thr Thr Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Thr Val Thr Pro 1 5 10 15

Glu His Ala Ala Arg Arg Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn Pro Arg 20 25 30

Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Phe Trp Cys 35 40 45

Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu Gly Ala 50 55 60

Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala His Ala 65 70 75 80

Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro 85 90 95

Tyr Ala Pro Gln Pro Gln Asp Ala Asp Thr Ala Ser Ile Pro Ser Phe 100 105 110

Ser Ala Asp Ala Ala Arg Ala Phe Ser Ala Ala His Gly Leu Ala Val 115 120 125

Arg Ser Val Ala Val Arg Val Ala Asp Ala Ala Asp Ala Phe Arg Ala 130 135 140

Ser Ile Ala Ala Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala Pro Ala Asp Leu Gly 145 150 155 160

Arg Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu 165 170 175

Arg Phe Val Ser His Pro Asp Ala Asp Asp Ala Pro Pro Phe Leu Pro 180 185 190
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gly Phe Glu Ala Val Ser Arg Arg Pro Gly Ala Val Asp Tyr Gly Leu 195 200 205

Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met Gly Pro Val 210 215 220

Ile Asp Tyr Ile Lys Gly Phe Met Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe 225 230 235 240

Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val 245 250 255

Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val 260 265 270

His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu Glu Tyr His 275 280 285

Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Ser Asp Val Leu 290 295 300

Arg Thr Leu Arg Glu Met Gln Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu 305 310 315 320

Phe Met Ala Pro Pro Gln Pro Lys Tyr Tyr Glu Gly Val Arg Arg Ile 325 330 335

Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu Cys Gln Glu Leu 340 345 350

Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe 355 360 365

Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu Met Ile Gln 370 375 380

Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Arg Gly Gln Glu Tyr Gln Lys 385 390 395 400

Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys 405 410 415

Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ser Ala Val 420 425 430
Ala Gln Gln Ser
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
435
<210>
7
<211>
434
<212>
PRT
<213>
Poa annua
<400>
7

Met Pro Pro Thr Thr Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Thr Val Thr Pro 1 5 10 15

Glu His Ala Ala Arg Arg Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn Pro Arg 20 25 30

Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Phe Trp Cys 35 40 45

Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu Gly Ala 50 55 60

Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala His Ala 65 70 75 80

Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro 85 90 95

Tyr Ala Pro Gln Pro Gln Asp Ala Asp Thr Ala Ser Ile Pro Ser Phe 100 105 110

Ser Ala Asp Ala Ala Arg Ala Phe Ser Ala Ala His Gly Leu Ala Val 115 120 125

Arg Ser Val Ala Val Arg Val Ala Asp Ala Ala Asp Ala Phe Arg Ala 130 135 140

Ser Ile Ala Ala Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala Pro Ala Asp Leu Gly 145 150 155 160

Arg Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu 165 170 175

Arg Phe Val Ser His Pro Asp Ala Asp Asp Ala Pro Phe Leu Pro Gly 180 185 190

Phe Glu Ala Val Ser Arg Pro Gly Ala Val Asp Tyr Gly Leu Thr Arg 195 200 205
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met Gly Pro Val Ile Asp 210 215 220

Tyr Ile Lys Gly Phe Met Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe Thr Ala 225 230 235 240

Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val Leu Ala 245 250 255

Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val His Gly 260 265 270

Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu Glu Tyr His Gly Gly 275 280 285

Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr 290 295 300

Leu Arg Glu Met Gln Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu Phe Met 305 310 315 320

Ala Pro Pro Gln Pro Lys Tyr Tyr Glu Gly Val Arg Arg Ile Ala Gly 325 330 335

Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu Cys Gln Glu Leu Gly Val 340 345 350

Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe Thr Lys 355 360 365

Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu Met Ile Gln Arg Ile 370 375 380

Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Arg Gly Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Gly 385 390 395 400

Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile 405 410 415

Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ser Ala Val Ala Gln 420 425 430
Gln Ser

<210> 8 <211> 440
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<212> PRT

<213> Lolium multiflorum <400> 8

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr 100 105 110

Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala 115 120 125

Ala His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala 130 135 140

Ala Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe 145 150 155 160

Ala Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu 165 170 175

Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp 180 185 190

Leu Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val 195 200 205

Asp Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu 210 215 220
Met Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
225
230
235
240

Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu 245 250 255

Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Asn Val Leu Leu Pro Leu 260 265 270

Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr 275 280 285

Leu Asp Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser 290 295 300

Thr Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met 305 310 315 320

Gly Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly 325 330 335

Val Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu 340 345 350

Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu 355 360 365

Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu 370 375 380

Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln 385 390 395 400

Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser 405 410 415

Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Thr Leu Glu Ala Lys 420 425 430

Gln Ser Val Val Ala Gln Lys Ser 435 440
<210>
9
<211>
444
<212>
PRT
<213>
Erichola villosa
<400>
9
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Met Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15

Ala Pro Pro Ala Ala Ala Glu Gln Ala Ala Phe Arg Leu Val Gly His 20 25 30

Arg Ser Phe Val Arg Val Asn Pro Arg Ser Asp Arg Phe His Thr Leu 35 40 45

Ala Phe His His Val Glu Leu Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala 50 55 60

Gly Arg Phe Ser Phe Gly Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp 65 70 75 80

Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala His Thr Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly 85 90 95

Ser Leu Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Ala Glu His Ala Gly Ala 100 105 110

Asp Ala Ala Thr Ala Ser Leu Pro Ser Phe Ser Ala Pro Thr Ala Arg 115 120 125

Arg Phe Ala Ala Asp His Gly Leu Ala Val Arg Ala Ile Ala Leu Arg 130 135 140

Val Ala Asp Ala Glu Asp Ala Phe Arg Ala Ser Val Ala Ala Gly Ala 145 150 155 160

Arg Pro Ala Phe Glu Pro Ala Glu Leu Gly Leu Gly Phe Arg Leu Ala 165 170 175

Glu Val Glu Leu Tyr Gly Glu Val Val Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Pro 180 185 190

Asp Ala Ala Gly Ser Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Glu Val Arg Asn 195 200 205

Pro Arg Ala Val Asp Tyr Gly Leu Lys Arg Phe Asp His Ile Val Gly 210 215 220

Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Val Ala Ala Tyr Val Ala Gly Phe Thr 225 230 235 240
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Leu Ile Pro Leu Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln 275 280 285

Ile Gln Thr Phe Leu Glu His His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile 290 295 300

Ala Leu Ala Ser Asp Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Gln Ala 305 310 315 320

Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Pro Pro Asp 325 330 335

Tyr Tyr Asp Gly Val Arg Arg Arg Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala 340 345 350

Gln Ile Lys Glu Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp 355 360 365

Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro 370 375 380

Thr Phe Phe Leu Glu Ile Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp 385 390 395 400

Glu Gln Gly Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys 405 410 415

Gly Asn Phe Ser Gln Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser 420 425 430
Leu Glu Val Lys Gln Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
10
<211>
453
<212>
PRT
<213>
Bidens subalternans
<400>
10

Met Gly Thr Glu Ala Asn Thr Thr Phe Thr Gly Glu Gln Gln Ser Thr 1 5 10 15
Gln Ala Phe Lys Leu Val Gly Phe Arg Asn Phe Ile Arg Thr Asn Pro
60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
20
25
30

Cys Ser Asp Ala Thr Asn Thr Ser Arg Arg Phe Ser Trp Gly Leu Gly 50 55 60

Met Pro Ile Leu Leu Lys Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Thr Val His 65 70 75 80

Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ser Gly His Leu Asn Phe Leu Phe Thr Ala 85 90 95

Pro Tyr Ser Pro Ser Ile Thr Thr Thr Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser His Thr Val Cys Arg Asp Phe Thr Gly Lys 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ala Ile Ala Val Glu Val Glu Asp Ala Glu 130 135 140

Thr Ala Phe Ala Val Ser Val Ala Asn Gly Ala Lys Pro Ser Cys Thr 145 150 155 160

Pro Val Thr Ile Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gln Asn Asp Val 165 170 175

Val Val Val Leu Ser Glu Val Lys Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg 180 185 190

Tyr Val Ser Tyr Lys Asn Pro Asn Leu Glu Thr Asn Leu Lys Phe Leu 195 200 205

Pro Gly Phe Glu Pro Val Glu Ala Thr Ser Ser Phe Pro Asp Leu Asp 210 215 220

Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Asp His Ala Val Gly Asn Val Pro Glu Leu 225 230 235 240

Ala Pro Ala Val Glu Tyr Val Lys Ser Phe Thr Gly Phe His Glu Phe 245 250 255
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ser Val Val Leu Ala Cys Asn Ser Glu Glu Val Leu Leu Pro Met Asn 275 280 285

Glu Pro Val Tyr Gly Thr Lys Arg Lys Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 290 295 300

Glu His Asn Glu Gly Ala Gly Val Gln His Leu Ala Leu Ala Ser Glu 305 310 315 320

Asp Ile Phe Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Lys Arg Ser Gly Val Gly 325 330 335

Gly Phe Glu Phe Met Pro Ser Pro Pro Pro Thr Tyr Tyr Arg Asn Leu 340 345 350

Lys Asn Arg Ala Gly Asp Val Leu Ser Asp Glu Gln Ile Lys Glu Cys 355 360 365

Glu Glu Leu Gly Ile Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Thr Leu Leu 370 375 380

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Ile Phe Ile Glu 385 390 395 400

Ile Ile Gln Arg Val Gly Cys Met Val Lys Asp Asp Glu Gly Asn Val 405 410 415

Gln Gln Lys Ala Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 420 425 430

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Glu Ala Arg Val 435 440 445
Ala Thr Ala Thr Ala 450
<210>
11
<211>
456
<212>
PRT
<213>
Bidens pilosa
<400>
11

Met Gly Thr Glu Ala Asn Thr Thr Phe Thr Gly Glu Gln Gln Gln Gln 1 5 10 15

Gln Ser Thr Gln Pro Phe Lys Leu Val Gly Phe Lys Asn Phe Ile Arg 20 25 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Glu Phe Trp Cys Ser Asp Ala Thr Asn Thr Ser Arg Arg Phe Ser Trp 50 55 60

Gly Leu Gly Met Pro Ile Val Leu Lys Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn 65 70 75 80

Ser Val His Ala Ser Tyr Leu Leu Arg Ser Gly Ser Leu Asn Phe Leu 85 90 95

Phe Thr Ala Pro Tyr Ser Pro Ser Ile Thr Thr Thr Gly Ser Thr Ser 100 105 110

Ser Ser Ile Pro Ser Phe Ser His Thr Val Cys Arg Asp Phe Thr Gly 115 120 125

Lys His Gly Leu Ala Val Arg Ala Ile Ala Val Glu Val Glu Asp Ala 130 135 140

Glu Thr Ala Phe Ala Val Ser Val Ala Asn Gly Ala Lys Pro Ser Cys 145 150 155 160

Ala Pro Val Thr Ile Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asp Asn Gln Asn Asp 165 170 175

Val Val Val Leu Ser Glu Val Lys Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg 180 185 190

Tyr Val Ser Tyr Lys Asn Pro Asn Leu Glu Thr Asn Leu Asn Asn Leu 195 200 205

Lys Ile Leu Pro Gly Phe Glu Pro Val Glu Thr Thr Ser Ser Phe Pro 210 215 220

Asp Leu Asp Tyr Gly Ile Arg Arg Leu Asp His Ala Val Gly Asn Val 225 230 235 240

Pro Glu Leu Ala Lys Ala Val Asp Tyr Val Lys Ser Phe Thr Gly Phe 245 250 255
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Gly Leu
Asn Ser Val Val Leu Ala Cys Asn Ser Glu Glu Val Leu
275 280 285
Pro Met
Asn Glu Pro Val Tyr Gly Thr Lys Arg Lys Ser Gln Ile
290
295 300
Thr Tyr
Leu Glu His Asn Glu Gly Ala Gly Val Gln His Leu Ala
305
310 315
Ala Ser
Glu Asp Ile Phe Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Lys Arg
325 330 335
Gly Val
Gly Gly Phe Glu Phe Met Pro Ser Pro Pro Pro Thr Tyr
340 345 350
Arg Asn
Leu Lys Asn Arg Ala Gly Asp Val Leu Ser Asp Glu Gln
355 360 365
Lys Glu
Cys Glu Glu Leu Gly Ile Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln
370
375 380
Thr Leu
Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr
385
390 395
Phe Ile
Glu Ile Ile Gln Arg Val Gly Cys Met Met Lys Asp Asp
405 410 415
Gly Lys
Val Gln Gln Lys Ala Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly
420 425 430
Phe Ser
Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Glu Tyr Glu Lys Thr Leu
435 440 445
Ala Arg
Ala Thr Thr Ala Thr Ala
450
455
<210>
12
<211>
436
<212>
PRT
<213>
Brachypodium arbuscula
<400>
12
Met Pro
Pro Pro Ala Thr Thr Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Val
1
5 10 15
Pro Glu
His Ala Arg Pro Pro Arg Arg Val Ala Arg Val Asn Pro
20 25 30
400
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu Gly Ala 50 55 60

Pro Pro Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala His Ala 65 70 75 80

Ser Ile Leu Leu Arg Ser Gly Ser Leu Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro 85 90 95

Tyr Ala Pro Ser Pro Ala Ser Asp Ser Ala Ala Ser Ile Pro Ser Phe 100 105 110

Ser Ala Ser Ala Ala Arg Gln Phe Thr Ala Asp His Gly Gly Leu Ala 115 120 125

Val Arg Ala Val Ala Leu Arg Val Ser Ser Ala Ser Asp Ala Phe His 130 135 140

Ala Ser Val Ser Ala Gly Ala Arg Pro Ser Phe Pro Pro Ala Asp Leu 145 150 155 160

Gly Gln Gly Phe Ala Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val 165 170 175

Leu Arg Phe Ile Ser His Pro Asp Glu Asn Thr Glu Ile Pro Phe Leu 180 185 190

Pro Gly Phe Glu Ser Val Ser Asn Pro Gly Ala Ser Thr Tyr Gly Leu 195 200 205

Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Ser Leu Ala Pro Val 210 215 220

Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe 225 230 235 240

Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Ala Asp Ser Gly Leu Asn Ser Val Val 245 250 255

Leu Ala Asn Asn Ser Glu Arg Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val 260 265 270
His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu Asp His His
65
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asp Asp Val Leu 290 295 300

Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu 305 310 315 320

Phe Leu Ala Pro Pro Pro Pro Asn Tyr Tyr Asp Gly Val Arg Arg Arg 325 330 335

Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu Cys Gln Glu Leu 340 345 350

Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe 355 360 365

Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Leu Phe Leu Glu Met Ile Gln 370 375 380

Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Ile Gly Gln Glu Gln Gln Lys 385 390 395 400

Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Arg 405 410 415

Ser Ile Glu Glu Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ser Ala Val 420 425 430
Val Gln Glu Ser 435

<210> 13

<211> 445
<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana <400> 13

Met Gly His Gln Asn Ala Ala Val Ser Glu Asn Gln Asn His Asp Asp 1 5 10 15

Gly Ala Ala Ser Ser Pro Gly Phe Lys Leu Val Gly Phe Ser Lys Phe 20 25 30

Val Arg Lys Asn Pro Lys Ser Asp Lys Phe Lys Val Lys Arg Phe His 35 40 45
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

His Ile Glu Phe Trp Cys Gly Asp Ala Thr Asn Val Ala Arg Arg Phe 50 55 60

Ser Trp Gly Leu Gly Met Arg Phe Ser Ala Lys Ser Asp Leu Ser Thr 65 70 75 80

Gly Asn Met Val His Ala Ser Tyr Leu Leu Thr Ser Gly Asp Leu Arg 85 90 95

Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Ser Pro Ser Leu Ser Ala Gly Glu Ile 100 105 110

Lys Pro Thr Thr Thr Ala Ser Ile Pro Ser Phe Asp His Gly Ser Cys 115 120 125

Arg Ser Phe Phe Ser Ser His Gly Leu Gly Val Arg Ala Val Ala Ile 130 135 140

Glu Val Glu Asp Ala Glu Ser Ala Phe Ser Ile Ser Val Ala Asn Gly 145 150 155 160

Ala Ile Pro Ser Ser Pro Pro Ile Val Leu Asn Glu Ala Val Thr Ile 165 170 175

Ala Glu Val Lys Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Tyr Val Ser Tyr 180 185 190

Lys Ala Glu Asp Thr Glu Lys Ser Glu Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg 195 200 205

Val Glu Asp Ala Ser Ser Phe Pro Leu Asp Tyr Gly Ile Arg Arg Leu 210 215 220

Asp His Ala Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Gly Pro Ala Leu Thr Tyr 225 230 235 240

Val Ala Gly Phe Thr Gly Phe His Gln Phe Ala Glu Phe Thr Ala Asp 245 250 255

Asp Val Gly Thr Ala Glu Ser Gly Leu Asn Ser Ala Val Leu Ala Ser 260 265 270

Asn Asp Glu Met Val Leu Leu Pro Ile Asn Glu Pro Val His Gly Thr 275 280 285

Lys Arg Lys Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu Glu His Asn Glu Gly Ala 290 295 300
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gly Leu Gln His Leu Ala Leu Met Ser Glu Asp Ile Phe Arg Thr Leu 305 310 315 320

Arg Glu Met Arg Lys Arg Ser Ser Ile Gly Gly Phe Asp Phe Met Pro 325 330 335

Ser Pro Pro Pro Thr Tyr Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Arg Val Gly Asp 340 345 350

Val Leu Ser Asp Asp Gln Ile Lys Glu Cys Glu Glu Leu Gly Ile Leu 355 360 365

Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Thr Leu Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro 370 375 380

Leu Gly Asp Arg Pro Thr Ile Phe Ile Glu Ile Ile Gln Arg Val Gly 385 390 395 400

Cys Met Met Lys Asp Glu Glu Gly Lys Ala Tyr Gln Ser Gly Gly Cys 405 410 415

Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu 420 425 430

Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Glu Ala Lys Gln Leu Val Gly 435 440 445
<210>
14
<211>
358
<212>
PRT
<213>
Pseudomonas aeruginosa
<400>
14

Met Ala Asp Gln Tyr Glu Asn Pro Met Gly Leu Met Gly Phe Glu Phe 1 5 10 15

Ile Glu Phe Ala Ser Pro Thr Pro Gly Thr Leu Glu Pro Ile Phe Glu 20 25 30

Ile Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg Ser Lys Asn Val His 35 40 45

Leu Tyr Arg Gln Gly Glu Ile Asn Leu Ile Leu Asn Asn Gln Pro Asp 50 55 60
Ser Leu Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gln Gln Ala Tyr Asn Arg Ala Leu 85 90 95

Glu Leu Gly Ala Gln Pro Ile His Ile Glu Thr Gly Pro Met Glu Leu 100 105 110

Asn Leu Pro Ala Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu Ile 115 120 125

Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser Ile Tyr Asp Ile Asp Phe Val Tyr 130 135 140

Leu Glu Gly Val Asp Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val Ile 145 150 155 160

Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Ala Tyr Trp Ala 165 170 175

Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp 180 185 190

Ile Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro 195 200 205

Asp Gly Met Ile Arg Ile Pro Leu Asn Glu Glu Ser Ser Lys Gly Ala 210 215 220

Gly Gln Ile Glu Glu Phe Leu Met Gln Phe Asn Gly Glu Gly Ile Gln 225 230 235 240

His Val Ala Phe Leu Thr Glu Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala Leu 245 250 255

Lys Lys Ile Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr 260 265 270

Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asn His Gly Glu Pro Val Asp Gln 275 280 285

Leu Gln Ala Arg Gly Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ile Glu Gly Asp 290 295 300

Lys Arg Leu Leu Leu Gln Ile Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val 305 310 315 320
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Phe
Phe
Glu Phe Ile 325 Gln Arg Lys Gly Asp 330 Asp Gly Phe Gly Glu 335 Gly
Asn
Phe Lys Ala 340 Leu Phe Glu Ser Ile Glu 345 Arg Asp Gln Val 350 Arg Arg
Gly Val Leu Thr Thr Asp 355
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <2 2 0>
<223> Motivo de secuencia de HPPD derivada de Avena sativa
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (1)..(1)
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de L, I o R
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (2)..(2)
<223> Xaa = V o A
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (3)..(3)
<223> Xaa = G o A
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (7)..(7)
<223> Xaa = S o T
<400> 15
Xaa Xaa Xaa Asp Val Leu Xaa 1 5
<210> 16 <211> 6 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <2 2 0>
<223> Motivo de secuencia de HPPD derivada de Avena sativa
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (2)..(2) <223> Xaa = I o V
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (3)..(3)
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de L <2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (6)..(6)
<223> Xaa = R o K

<400> 16

Gly Xaa Xaa Val Asp Xaa 1 5

<210> 17
<211> 6 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <2 2 0>
<223> Motivo de secuencia de HPPD derivada de Avena sativa
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (3)..(3)

<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de V, I o M <400> 17

Asp His Xaa Val Gly Asn 1 5

<210> 18 <211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <2 2 0>
<223> Motivo de secuencia de HPPD derivada de Avena sativa
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (4)..(4)
<223> Xaa = E o D
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (6)..(6)
<223> Xaa = M o L
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (7)..(7)
<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de A o P <400> 18
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Gly Gly Phe Xaa Phe Xaa Xaa 1 5
<210> 19
<211> 8 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <2 2 0>
<223> Motivo de secuencia de HPPD derivada de Avena sativa
<2 2 0>
<221> VARIANTE <222> (6)..(6)

<223> Xaa = cualquier aminoácido distinto de K <400> 19
Cys Gly Gly Phe Gly Xaa Gly Asn
1
5
<210>
20
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
20

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365
Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu
73
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
21
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
21

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
22
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
22

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160
Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Leu Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
23
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
23

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
435
<210>
24
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
24

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Lys Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser 435

<210> 25
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
25

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ile Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
26
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
26
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240
Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn
84
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Glu Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
27
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
27

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Asp Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser 435
<210> 28

<211> 439
<212> PRT
<213> Avena sativa

<400> 28
Met
Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val
1
5 10 15
Thr
Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn
20 25 30
Pro
Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Cys Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
29
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
29

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Arg Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
30
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
30

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320
Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val
92
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
31
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
31

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
32
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
32

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110
Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
33
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
33

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
34
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
34

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Lys Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400
Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu
100
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
35
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
35

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Leu Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
435
<210>
36
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
36

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190
Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Glu Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser 435
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210>
37
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
37

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Glu Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser 435

<210> 38

<211> 434
<212> PRT <213> Poa annua
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

<400> 38

Glu His Ala Ala Arg Arg Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn Pro Arg 20 25 30

Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Phe Trp Cys 35 40 45

Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu Gly Ala 50 55 60

Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala His Ala 65 70 75 80

Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro 85 90 95

Tyr Ala Pro Gln Pro Gln Asp Ala Asp Thr Ala Ser Ile Pro Ser Phe 100 105 110

Ser Ala Asp Ala Ala Arg Ala Phe Ser Ala Ala His Gly Leu Ala Val 115 120 125

Arg Ser Val Ala Val Arg Val Ala Asp Ala Ala Asp Ala Phe Arg Ala 130 135 140

Ser Ile Ala Ala Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala Pro Ala Asp Leu Gly 145 150 155 160

Arg Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu 165 170 175

Arg Phe Val Ser His Pro Asp Ala Asp Asp Ala Pro Phe Leu Pro Gly 180 185 190

Phe Glu Ala Val Ser Arg Pro Gly Ala Val Asp Tyr Gly Leu Thr Arg 195 200 205

Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met Gly Pro Val Ile Asp 210 215 220
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val His Gly 260 265 270

Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu Glu Tyr His Gly Gly 275 280 285

Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr 290 295 300

Leu Arg Glu Met Gln Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu Phe Met 305 310 315 320

Arg Pro Pro Gln Pro Lys Tyr Tyr Glu Gly Val Arg Arg Ile Ala Gly 325 330 335

Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu Cys Gln Glu Leu Gly Val 340 345 350

Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe Thr Lys 355 360 365

Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu Met Ile Gln Arg Ile 370 375 380

Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Arg Gly Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Gly 385 390 395 400

Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile 405 410 415

Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ser Ala Val Ala Gln 420 425 430
Gln Ser
<210>
39
<211>
434
<212>
PRT
<213>
Poa annua
<400>
39
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Phe Trp Cys 35 40 45

Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu Gly Ala 50 55 60

Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala His Ala 65 70 75 80

Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro 85 90 95

Tyr Ala Pro Gln Pro Gln Asp Ala Asp Thr Ala Ser Ile Pro Ser Phe 100 105 110

Ser Ala Asp Ala Ala Arg Ala Phe Ser Ala Ala His Gly Leu Ala Val 115 120 125

Arg Ser Val Ala Val Arg Val Ala Asp Ala Ala Asp Ala Phe Arg Ala 130 135 140

Ser Ile Ala Ala Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala Pro Ala Asp Leu Gly 145 150 155 160

Arg Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu 165 170 175

Arg Phe Val Ser His Pro Asp Ala Asp Asp Ala Pro Phe Leu Pro Gly 180 185 190

Phe Glu Ala Val Ser Arg Pro Gly Ala Val Asp Tyr Gly Leu Thr Arg 195 200 205

Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu Met Gly Pro Val Ile Asp 210 215 220

Tyr Ile Lys Gly Phe Met Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe Thr Ala 225 230 235 240
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val His Gly 260 265 270

Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu Glu Tyr His Gly Gly 275 280 285

Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr 290 295 300

Leu Arg Glu Met Gln Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu Phe Met 305 310 315 320

Arg Pro Pro Gln Pro Lys Tyr Tyr Glu Gly Val Arg Arg Ile Ala Gly 325 330 335

Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu Cys Gln Glu Leu Gly Val 340 345 350

Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe Thr Lys 355 360 365

Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu Met Ile Gln Arg Ile 370 375 380

Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Arg Gly Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Gly 385 390 395 400

Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile 405 410 415

Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ser Ala Val Ala Gln 420 425 430
Gln Ser

<210> 40

<211> 440
<212> PRT
<213> Alopecurus mycosuroides

<400> 40

Met Pro Pro Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ser 65 70 75 80

His Ala Ser His Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Asp Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr 100 105 110

Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Thr Glu Ala Ala Arg Thr Phe Ser Ser 115 120 125

Ala His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Ala Ile Arg Val Ala Asp Ala 130 135 140

Ala Glu Ala Phe His Thr Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe 145 150 155 160

Ala Pro Ala Asp Leu Gly Ser Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu 165 170 175

Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser His Pro Asp Gly Asp Asp 180 185 190

Val Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Gly Val Ser Arg Pro Gly Ala Met 195 200 205

Asp Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu 210 215 220

Met Ala Pro Val Ala Ala Tyr Met Lys Gly Phe Thr Gly Phe His Glu 225 230 235 240

Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Ala Glu Ser Gly Leu 245 250 255

Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu 260 265 270
Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr
111
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Leu Asp Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser 290 295 300

Ser Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Ser Ala Met 305 310 315 320

Gly Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly 325 330 335

Val Arg Arg Leu Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu 340 345 350

Cys Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu 355 360 365

Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu 370 375 380

Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Ile Gly Gln 385 390 395 400

Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser 405 410 415

Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys 420 425 430

Gln Ser Ala Val Ala Gln Gln Ser 435 440

<210> 41

<211> 440
<212> PRT
<213> Alopecurus mycosuroides

<400> 41

Met Pro Pro Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Arg Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ala Phe His His Val Glu Phe 35 40 45
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ser 65 70 75 80

His Ala Ser His Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Asp Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr 100 105 110

Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Thr Glu Ala Ala Arg Thr Phe Ser Ser 115 120 125

Ala His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Ala Ile Arg Val Ala Asp Ala 130 135 140

Ala Glu Ala Phe His Thr Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe 145 150 155 160

Ala Pro Ala Asp Leu Gly Ser Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu 165 170 175

Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser His Pro Asp Gly Asp Asp 180 185 190

Val Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Gly Val Ser Arg Pro Gly Ala Met 195 200 205

Asp Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu 210 215 220

Met Ala Pro Val Ala Ala Tyr Met Lys Gly Phe Thr Gly Phe His Glu 225 230 235 240

Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Ala Glu Ser Gly Leu 245 250 255

Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu 260 265 270

Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr 275 280 285
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gly Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly 325 330 335

Val Arg Arg Leu Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu 340 345 350

Cys Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu 355 360 365

Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu 370 375 380

Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Ile Gly Gln 385 390 395 400

Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser 405 410 415

Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys 420 425 430
Gln Ser Ala Val Ala Gln Gln Ser
435
<210>
42
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
42
Met
Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val
1
5 10 15
Thr
Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn
20 25 30
Pro
Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu
35 40 45
Trp
Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu
50 55 60
Gly Ala
Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys His Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
43
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
43

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Cys Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
44
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
44

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Ala His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350
Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu
119
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
45
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
45

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Asn Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu 405 410 415

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
46
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
46

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140
Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp Leu 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gly His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 420 425 430
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
47
<211>
439
<212>
PRT
<213>
Avena sativa
<400>
47

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60

Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala 65 70 75 80

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala 100 105 110

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asn 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Ile Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Glu Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350

Gln Glu Leu Gly Val Ala Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu 355 360 365

Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu 370 375 380

Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln Glu 385 390 395 400
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr 420
Ser Val Val Ala Gln Lys Ser
435
<210>
48
<211>
72
<212>
PRT
<213>
Petunia x hybrida
<400>
48
Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys Gln 425 430

Met Ala Gln Ile Asn Asn Met Ala Gln Gly Ile Gln Thr Leu Asn Pro 1 5 10 15

Asn Ser Asn Phe His Lys Pro Gln Val Pro Lys Ser Ser Ser Phe Leu 20 25 30

Val Phe Gly Ser Lys Lys Leu Lys Asn Ser Ala Asn Ser Met Leu Val 35 40 45

Leu Lys Lys Asp Ser Ile Phe Met Gln Lys Phe Cys Ser Phe Arg Ile 50 55 60

Ser Ala Ser Val Ala Thr Ala Cys 65 70

<210> 49

<211> 440
<212> PRT
<213> Avena sativa

<400> 49

Met Pro Pro Thr Pro Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val 1 5 10 15

Thr Pro Glu His Ala Ala Arg Ser Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn 20 25 30

Pro Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ser Phe His His Val Glu Leu 35 40 45

Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu 50 55 60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr 85 90 95

Ala Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr 100 105 110

Ala Ser Ile Pro Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Thr Phe Ala Ala 115 120 125

Ala His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Gly Val Arg Val Ala Asp Ala 130 135 140

Ala Glu Ala Phe Arg Val Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe 145 150 155 160

Ala Pro Ala Asp Leu Gly His Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu 165 170 175

Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser Tyr Pro Asp Glu Thr Asp 180 185 190

Leu Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Arg Val Ser Ser Pro Gly Ala Val 195 200 205

Asp Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Ile Val Gly Asn Val Pro Glu 210 215 220

Met Ala Pro Val Ile Asp Tyr Met Lys Gly Phe Leu Gly Phe His Glu 225 230 235 240

Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu 245 250 255

Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu 260 265 270

Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr 275 280 285

Leu Glu Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser 290 295 300

Asn Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Thr Pro Met 305 310 315 320
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Cys Gln Glu Leu Gly Val Met Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu 355 360 365

Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu 370 375 380

Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Val Gly Gln 385 390 395 400

Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser 405 410 415

Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Val Lys 420 425 430

Gln Ser Val Val Ala Gln Lys Ser 435 440

<210> 50

<211> 439
<212> PRT
<213> Alopecurus mycosuroides

<400> 50

Pro Pro Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr 1 5 10 15

Pro Glu His Ala Ala Arg Arg Phe Pro Arg Val Val Arg Val Asn Pro 20 25 30

Arg Ser Asp Arg Phe Pro Val Leu Ala Phe His His Val Glu Phe Trp 35 40 45

Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ser Phe Ala Leu Gly 50 55 60

Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ser His 65 70 75 80

Ala Ser His Leu Leu Arg Ser Gly Ala Leu Ala Phe Leu Phe Thr Ala 85 90 95
Pro Tyr Ala Pro Pro Pro Gln Asp Ala Ala Asp Ala Ala Ala Thr Ala
128
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60

Ser Ile Pro Ser Phe Ser Thr Glu Ala Ala Arg Thr Phe Ser Ser Ala 115 120 125

His Gly Leu Ala Val Arg Ser Val Ala Ile Arg Val Ala Asp Ala Ala 130 135 140

Glu Ala Phe His Thr Ser Val Ala Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala 145 150 155 160

Pro Ala Asp Leu Gly Ser Gly Phe Gly Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr 165 170 175

Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser His Pro Asp Gly Asp Asp Val 180 185 190

Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Gly Val Ser Arg Pro Gly Ala Met Asp 195 200 205

Tyr Gly Leu Thr Arg Phe Asp His Leu Val Gly Asn Val Pro Glu Met 210 215 220

Ala Pro Val Ala Ala Tyr Met Lys Gly Phe Thr Gly Phe His Glu Phe 225 230 235 240

Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Ala Glu Ser Gly Leu Asn 245 250 255

Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ser Glu Ala Val Leu Leu Pro Leu Asn 260 265 270

Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu 275 280 285

Asp Tyr His Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Ser 290 295 300

Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly 305 310 315 320

Gly Phe Glu Phe Met Arg Pro Pro Gln Ala Lys Tyr Tyr Glu Gly Val 325 330 335

Arg Arg Glu Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu Cys 340 345 350
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Gln Glu Leu Gly Val 355
Gln Ile Phe Thr Lys 370
Met Ile Gln Arg Ile 385
Tyr Gln Lys Gly Gly 405
Met Val Asp Arg Asp Asp 360
Pro Val Gly Asp Arg Pro 375
Gly Cys Met Glu Lys Asp 390 395
Cys Gly Gly Phe Gly Lys 410
Gln Gly Val Leu Leu 365
Thr Phe Phe Leu Glu
380
Glu Ile Gly Gln Glu 400
Gly Asn Phe Ser Glu 415
Leu Phe Lys Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln 420 425 430
Ser Ala Val Ala Gln Gln Ser 435
<210> 51
<211> 11208 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <2 2 0>
<223> Casete de Expresión <400> 51
attcctgtgg
ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg
attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac
tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag
tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga
accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc 300
gcgtacgtag
cactagtgaa ttccggaccc aagcttgcat gcctgcagga attggccgca 360
gcggccattt
aaatcaattg ggcgcgtgcg gccgcagctg cttgtgggga ccagacaaaa 420
aaggaatggt
gcagaattgt taggcgcacc taccaaaagc atctttgcct ttattgcaaa 480
gataaagcag
attcctctag tacaagtggg gaacaaaata acgtggaaaa gagctgtcct 540
gacagcccac
tcactaatgc gtatgacgaa cgcagtgacg accacaaaac tcgagacttt 600
tcaacaaagg
gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt 660
tattgtgaag
atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg 720
aaaggctatc
gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac 780
gaggagcatc
gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg 840
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
tgatatctcc
actgacgtaa gggatgacga acaatcccac tatccttctg caggtcgact 900
ctagaggatc
ctataaatag gaagttcatt tcatttggag aggaaacctc gagtattttt 960
acaacaatta
ccaacaacaa caaacaacaa acaacattac aattactatt tacaattaca 1020
catatgccac
caactactgc tactgctaca ggtgctgctg ctgcagctgt tactccagaa 1080
catgctgcta
gaaggttccc aagagttgtt agagttaacc caaggtctga taggttccca 1140
gttcttgctt
tccatcatgt tgagttttgg tgtgctgatg ctgcttctgc tgctggaaga 1200
ttttcttttg
ctcttggtgc tccacttgct gctagatctg atttgtctac tggaaactct 1260
tctcacgctt
ctcacctttt gagatctggt gctcttgctt tccttttcac tgctccttat 1320
gctccaccac
cacaagatgc tgcagatgca gcagctactg cttctattcc atctttttca 1380
actgaggctg
ctaggacttt ctcttctgct catggattgg ctgttagatc tgtggctatt 1440
agagttgcag
atgctgcaga ggctttccat acttctgttg ctggtggtgc tagaccagct 1500
tttgctccag
ctgatcttgg atctggattt ggacttgctg aggttgagct ttacggtgat 1560
gttgttctta
gattcgtgtc tcacccagat ggtgatgatg ttccatttct tccaggattc 1620
gagggtgtta
gtagaccagg tgctatggat tatggactca ctaggttcga tcaccttgtg 1680
ggaaatgttc
cagaaatggc tccagttgct gcttacatga agggattcac tggatttcat 1740
gagttcgctg
agttcactgc tgaggatgtt ggaactgctg agtctggact taactctgtt 1800
gtgcttgcta
acaactctga ggctgttctt ttgccactta atgagccagt tcacggcact 1860
aagagaagat
ctcagattca gacttacctc gattaccatg gtggaccagg tgttcaacat 1920
attgctcttg
cttcatctga tgtgcttagg actcttagag agatgagagc tagatctgct 1980
atgggaggat
ttgagtttat gagaccacca caagctaagt attacgaagg tgttagaagg 2040
gaggctggtg
atgttctttc tgaggctcaa atcaaagagt gccaagagct tggagttatg 2100
gtggatagag
atgatcaggg tgtgcttctc cagattttca ctaagccagt tggagatagg 2160
ccaacattct
tcttggagat gattcagagg atcggctgca tggaaaagga tgagattgga 2220
caagagtacc
aaaagggcgg atgtggtgga tttggaaagg gaaatttctc cgagcttttc 2280
aagtccatcg
aggattacga gaagtctctt gaggctaagc aatctgctgt tgctcaacag 2340
tcttgagagc
tcttcatatg acgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt 2400
gaatcctgtt
gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 2460
tgtaataatt
aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 2520
cccgcaatta
tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 2580
attatcgcgc
gcggtgtcat ctatgttact agatcgcgga ccgaagcttg catgcctgca 2640
ggtcgactct
agaggatctg ggacccagtc aaagattcaa atagaggacc taacagaact 2700
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
cgccgtaaag
actggcgaac agttcataca gagtctctta cgactcaatg acaagaagaa 2760
aatcttcgtc
aacatggtgg agcacgacac gcttgtctac tccaaaaata tcaaagatac 2820
agtctcagaa
gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct 2880
cctcggattc
cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg 2940
tggctcctac
aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc 3000
cgacagtggt
cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt 3060
tccaaccacg
tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 3120
cgcacaatcc
cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt 3180
ggagaggaca
cgctgaaatc actagtccac catgtctccg gagaggagac cagttgagat 3240
taggccagct
acagcagctg atatggccgc ggtttgtgat atcgttaacc attacattga 3300
gacgtctaca
gtgaacttta ggacagagcc acaaacacca caagagtgga ttgatgatct 3360
agagaggttg
caagatagat acccttggtt ggttgctgag gttgagggtg ttgtggctgg 3420
tattgcttac
gctgggccct ggaaggctag gaacgcttac gattggacag ttgagagtac 3480
tgtttacgtg
tcacataggc atcaaaggtt gggcctagga tccacattgt acacacattt 3540
gcttaagtct
atggaggcgc aaggttttaa gtctgtggtt gctgttatag gccttccaaa 3600
cgatccatct
gttaggttgc atgaggcttt gggatacaca gcccggggta cattgcgcgc 3660
agctggatac
aagcatggtg gatggcatga tgttggtttt tggcaaaggg attttgagtt 3720
gccagctcct
ccaaggccag ttaggccagt tacccagatc tgaactagtg atatcggcgc 3780
catgggtcga
cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc 3840
tgttgccggt
cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat 3900
aattaacatg
taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca 3960
attatacatt
taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc 4020
gcgcgcggtg
tcatctatgt tactagatcc ggacccagct gcttgtgggg accagacaaa 4080
aaaggaatgg
tgcagaattg ttaggcgcac ctaccaaaag catctttgcc tttattgcaa 4140
agataaagca
gattcctcta gtacaagtgg ggaacaaaat aacgtggaaa agagctgtcc 4200
tgacagccca
ctcactaatg cgtatgacga acgcagtgac gaccacaaaa ctcgagactt 4260
ttcaacaaag
ggtaatatcc ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact 4320
ttattgtgaa
gatagtggaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag 4380
gaaaggctat
cgttgaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca 4440
cgaggagcat
cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat 4500
gtgatatctc
cactgacgta agggatgacg aacaatccca ctatccttct gccggaccct 4560
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
catgagcgga
gaattaaggg agtcacgtta tgacccccgc cgatgacgcg ggacaagccg 4620
ttttacgttt
ggaactgaca gaaccgcaac gaagctttgg cagacaaagt ggcagacata 4680
ctgtcccaca
aatgaagatg gaatctgtaa aagaaaacgc gtgaaataat gcgtctgaca 4740
aaggttaggt
cggctgcctt taatcaatac caaagtggtc cctaccacga tggaaaaact 4800
gtgcagtcgg
tttggctttt tctgacgaac aaataagatt cgtggccgac aggtgggggt 4860
ccaccatgtg
aaggcatctt cagactccaa taatggagca atgacgtaag ggcttacgaa 4920
ataagtaagg
gtagtttggg aaatgtccac tcacccgtca gtctataaat acttagcccc 4980
tccctcattg
ttaagggagc aaaatctcag agagatagtc ctagagagag aaagagagca 5040
agtagcctag
aagtggatcc caccatgtct ccggagagga gaccagttga gattaggcca 5100
gctacagcag
ctgatatggc cgcggtttgt gatatcgtta accattacat tgagacgtct 5160
acagtgaact
ttaggacaga gccacaaaca ccacaagagt ggattgatga tctagagagg 5220
ttgcaagata
gatacccttg gttggttgct gaggttgagg gtgttgtggc tggtattgct 5280
tacgctgggc
cctggaaggc taggaacgct tacgattgga cagttgagag tactgtttac 5340
gtgtcacata
ggcatcaaag gttgggccta ggatctacat tgtacacaca tttgcttaag 5400
tctatggagg
cgcaaggttt taagtctgtg gttgctgtta taggccttcc aaacgatcca 5460
tctgttaggt
tgcatgaggc tttgggatac acagcccggg gtacattgcg cgcagctgga 5520
tacaagcatg
gtggatggca tgatgttggt ttttggcaaa gggattttga gttgccagct 5580
cctccaaggc
cagttaggcc agttacccag atatgagtcg agctctagat ccccgaattt 5640
ccccgatcgt
tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 5700
tgcgatgatt
atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 5760
atgcatgacg
ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 5820
atacgcgata
gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 5880
atctatgtta
ctagatcggg aattgggtac catgcccggg cggccagcat ggccgtatcc 5940
gcaatgtgtt
attaagttgt ctaagcgtca atttgtttac accacaatat atcctgccac 6000
cagccagcca
acagctcccc gaccggcagc tcggcacaaa atcaccactc gatacaggca 6060
gcccatcaga
attaattctc atgtttgaca gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg 6120
cttctggcgt
caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg 6180
cataattcgt
gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc 6240
ataacggttc
tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat 6300
aatgtgtgga
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gagggaagcg 6360
ttgatcgccg
aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc 6420
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gaaccgacgt
tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca 6480
cacagtgata
ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga 6540
gctttgatca
acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc 6600
gctgtagaag
tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag 6660
cgcgaactgc
aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca 6720
gccacgatcg
acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc 6780
ttggtaggtc
cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag 6840
gcgctaaatg
aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga 6900
aatgtagtgc
ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg 6960
aaggatgtcg
ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata 7020
cttgaagcta
ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 7080
ttggaagaat
ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aagtagtcgg caaataaagc 7140
tctagtggat
ctccgtaccc ggggatctgg ctcgcggcgg acgcacgacg ccggggcgag 7200
accataggcg
atctcctaaa tcaatagtag ctgtaacctc gaagcgtttc acttgtaaca 7260
acgattgaga
atttttgtca taaaattgaa atacttggtt cgcatttttg tcatccgcgg 7320
tcagccgcaa
ttctgacgaa ctgcccattt agctggagat gattgtacat ccttcacgtg 7380
aaaatttctc
aagcgctgtg aacaagggtt cagattttag attgaaaggt gagccgttga 7440
aacacgttct
tcttgtcgat gacgacgtcg ctatgcggca tcttattatt gaatacctta 7500
cgatccacgc
cttcaaagtg accgcggtag ccgacagcac ccagttcaca agagtactct 7560
cttccgcgac
ggtcgatgtc gtggttgttg atctagattt aggtcgtgaa gatgggctcg 7620
agatcgttcg
taatctggcg gcaaagtctg atattccaat cataattatc agtggcgacc 7680
gccttgagga
gacggataaa gttgttgcac tcgagctagg agcaagtgat tttatcgcta 7740
agccgttcag
tatcagagag tttctagcac gcattcgggt tgccttgcgc gtgcgcccca 7800
acgttgtccg
ctccaaagac cgacggtctt tttgttttac tgactggaca cttaatctca 7860
ggcaacgtcg
cttgatgtcc gaagctggcg gtgaggtgaa acttacggca ggtgagttca 7920
atcttctcct
cgcgttttta gagaaacccc gcgacgttct atcgcgcgag caacttctca 7980
ttgccagtcg
agtacgcgac gaggaggttt atgacaggag tatagatgtt ctcattttga 8040
ggctgcgccg
caaacttgag gcagatccgt caagccctca actgataaaa acagcaagag 8100
gtgccggtta
tttctttgac gcggacgtgc aggtttcgca cggggggacg atggcagcct 8160
gagccaattc
ccagatcccc gaggaatcgg cgtgagcggt cgcaaaccat ccggcccggt 8220
acaaatcggc
gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc 8280
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ccagcggcaa
cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga 8340
tcgaatccgc
aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc 8400
gcccaagggc
gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg 8460
cgatagtcgc
agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc 8520
tggcgaggtg
atccgctacg agcttccaga cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc 8580
cggcatggcc
agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga 8640
atccatgaac
cgataccggg aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca 8700
cgttgcggac
gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct 8760
ggtagaaacc
tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc 8820
caagaacggc
cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat 8880
cgtaaagagc
gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc gagctagctg attggatgta 8940
ccgcgagatc
acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt 9000
gatcgatccc
ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc 9060
agaagccaga
tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa 9120
gaagttctgt
ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt 9180
gaaggaggag
gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga 9240
gggcgaagca
tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc 9300
aggggaaaaa
ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa 9360
gccgtacatt
gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 9420
gtcacacatg
taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc 9480
tttaaaactt
attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg 9540
cacagccgaa
gagctgcaaa aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc 9600
cgcttcgcgt
cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg 9660
caatctacca
gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc gctgaggtct 9720
gcctcgtgaa
gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca 9780
gaaagtgagg
gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt 9840
gaacttttgc
tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt 9900
caactcagca
aaagttcgat ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg 9960
ctctgccagt
gttacaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa 10020
tgaaactgca
atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc 10080
tgtaatgaag
gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg 10140
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
tctgcgattc
cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata 10200
aggttatcaa
gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc 10260
tctgcattaa
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 10320
cgcttcctcg
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 10380
tcactcaaag
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 10440
gtgagcaaaa
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 10500
ccataggctc
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 10560
aaacccgaca
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 10620
tcctgttccg
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 10680
ggcgctttct
catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 10740
gctgggctgt
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 10800
tcgtcttgag
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 10860
caggattagc
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 10920
ctacggctac
actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 10980
cggaaaaaga
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 11040
ttttgtttgc
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 11100
cttttctacg
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 11160
gagattatca
aaaaggatct tcacctagat ccttttgatc cggaatta 11208
<210> 52
<211> 11208 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <2 2 0>
<223> Casete de expresión <400> 52
attcctgtgg
ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg
attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac
tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag
tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga
accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc 300
gcgtacgtag
cactagtgaa ttccggaccc aagcttgcat gcctgcagga attggccgca 360
gcggccattt
aaatcaattg ggcgcgtgcg gccgcagctg cttgtgggga ccagacaaaa 420
aaggaatggt
gcagaattgt taggcgcacc taccaaaagc atctttgcct ttattgcaaa 480
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gataaagcag
attcctctag tacaagtggg gaacaaaata acgtggaaaa gagctgtcct 540
gacagcccac
tcactaatgc gtatgacgaa cgcagtgacg accacaaaac tcgagacttt 600
tcaacaaagg
gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt 660
tattgtgaag
atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg 720
aaaggctatc
gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac 780
gaggagcatc
gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg 840
tgatatctcc
actgacgtaa gggatgacga acaatcccac tatccttctg caggtcgact 900
ctagaggatc
ctataaatag gaagttcatt tcatttggag aggaaacctc gagtattttt 960
acaacaatta
ccaacaacaa caaacaacaa acaacattac aattactatt tacaattaca 1020
catatgccac
caactactgc tactgctaca ggtgctgctg ctgcagctgt tactccagaa 1080
catgctgcta
gaaggttccc aagagttgtt agagttaacc caaggtctga taggttccca 1140
gttcttgctt
tccatcatgt tgagttttgg tgtgctgatg ctgcttctgc tgctggaaga 1200
ttttcttttg
ctcttggtgc tccacttgct gctagatctg atttgtctac tggaaactct 1260
tctcacgctt
ctcacctttt gagatctggt gctcttgctt tccttttcac tgctccttat 1320
gctccaccac
cacaagatgc tgcagatgca gcagctactg cttctattcc atctttttca 1380
actgaggctg
ctaggacttt ctcttctgct catggattgg ctgttagatc tgtggctatt 1440
agagttgcag
atgctgcaga ggctttccat acttctgttg ctggtggtgc tagaccagct 1500
tttgctccag
ctgatcttgg atctggattt ggacttgctg aggttgagct ttacggtgat 1560
gttgttctta
gattcgtgtc tcacccagat ggtgatgatg ttccatttct tccaggattc 1620
gagggtgtta
gtagaccagg tgctatggat tatggactca ctaggttcga tcaccttgtg 1680
ggaaatgttc
cagaaatggc tccagttgct gcttacatga agggattcac tggatttcat 1740
gagttcgctg
agttcactgc tgaggatgtt ggaactgctg agtctggact taactctgtt 1800
gtgcttgcta
acaactctga ggctgttctt ttgccactta atgagccagt tcacggcact 1860
aagagaagat
ctcagattca gacttacctc gattaccatg gtggaccagg tgttcaacat 1920
attgctcttg
cttcatctga tgtgcttagg actcttagag agatgagagc tagatctgct 1980
atgggaggat
ttgagtttat gagaccacca caagctaagt attacgaagg tgttagaagg 2040
gaggctggtg
atgttctttc tgaggctcaa atcaaagagt gccaagagct tggagttatg 2100
gtggatagag
atgatcaggg tgtgcttctc cagattttca ctaagccagt tggagatagg 2160
ccaacattct
tcttggagat gattcagagg atcggctgca tggaaaagga tgagattgga 2220
caagagtacc
aaaagggcgg atgtggtgga tttggaaagg gaaatttctc cgagcttttc 2280
aagtccatcg
aggattacga gaagtctctt gaggctaagc aatctgctgt tgctcaacag 2340
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
tcttgagagc
tcttcatatg acgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt 2400
gaatcctgtt
gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 2460
tgtaataatt
aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 2520
cccgcaatta
tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 2580
attatcgcgc
gcggtgtcat ctatgttact agatcgcgga ccgaagcttg catgcctgca 2640
ggtcgactct
agaggatctg ggacccagtc aaagattcaa atagaggacc taacagaact 2700
cgccgtaaag
actggcgaac agttcataca gagtctctta cgactcaatg acaagaagaa 2760
aatcttcgtc
aacatggtgg agcacgacac gcttgtctac tccaaaaata tcaaagatac 2820
agtctcagaa
gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct 2880
cctcggattc
cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg 2940
tggctcctac
aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc 3000
cgacagtggt
cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt 3060
tccaaccacg
tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 3120
cgcacaatcc
cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt 3180
ggagaggaca
cgctgaaatc actagtccac catgtctccg gagaggagac cagttgagat 3240
taggccagct
acagcagctg atatggccgc ggtttgtgat atcgttaacc attacattga 3300
gacgtctaca
gtgaacttta ggacagagcc acaaacacca caagagtgga ttgatgatct 3360
agagaggttg
caagatagat acccttggtt ggttgctgag gttgagggtg ttgtggctgg 3420
tattgcttac
gctgggccct ggaaggctag gaacgcttac gattggacag ttgagagtac 3480
tgtttacgtg
tcacataggc atcaaaggtt gggcctagga tccacattgt acacacattt 3540
gcttaagtct
atggaggcgc aaggttttaa gtctgtggtt gctgttatag gccttccaaa 3600
cgatccatct
gttaggttgc atgaggcttt gggatacaca gcccggggta cattgcgcgc 3660
agctggatac
aagcatggtg gatggcatga tgttggtttt tggcaaaggg attttgagtt 3720
gccagctcct
ccaaggccag ttaggccagt tacccagatc tgaactagtg atatcggcgc 3780
catgggtcga
cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc 3840
tgttgccggt
cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat 3900
aattaacatg
taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca 3960
attatacatt
taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc 4020
gcgcgcggtg
tcatctatgt tactagatcc ggacccagct gcttgtgggg accagacaaa 4080
aaaggaatgg
tgcagaattg ttaggcgcac ctaccaaaag catctttgcc tttattgcaa 4140
agataaagca
gattcctcta gtacaagtgg ggaacaaaat aacgtggaaa agagctgtcc 4200
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
tgacagccca
ctcactaatg cgtatgacga acgcagtgac gaccacaaaa ctcgagactt 4260
ttcaacaaag
ggtaatatcc ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact 4320
ttattgtgaa
gatagtggaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag 4380
gaaaggctat
cgttgaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca 4440
cgaggagcat
cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat 4500
gtgatatctc
cactgacgta agggatgacg aacaatccca ctatccttct gccggaccct 4560
catgagcgga
gaattaaggg agtcacgtta tgacccccgc cgatgacgcg ggacaagccg 4620
ttttacgttt
ggaactgaca gaaccgcaac gaagctttgg cagacaaagt ggcagacata 4680
ctgtcccaca
aatgaagatg gaatctgtaa aagaaaacgc gtgaaataat gcgtctgaca 4740
aaggttaggt
cggctgcctt taatcaatac caaagtggtc cctaccacga tggaaaaact 4800
gtgcagtcgg
tttggctttt tctgacgaac aaataagatt cgtggccgac aggtgggggt 4860
ccaccatgtg
aaggcatctt cagactccaa taatggagca atgacgtaag ggcttacgaa 4920
ataagtaagg
gtagtttggg aaatgtccac tcacccgtca gtctataaat acttagcccc 4980
tccctcattg
ttaagggagc aaaatctcag agagatagtc ctagagagag aaagagagca 5040
agtagcctag
aagtggatcc caccatgtct ccggagagga gaccagttga gattaggcca 5100
gctacagcag
ctgatatggc cgcggtttgt gatatcgtta accattacat tgagacgtct 5160
acagtgaact
ttaggacaga gccacaaaca ccacaagagt ggattgatga tctagagagg 5220
ttgcaagata
gatacccttg gttggttgct gaggttgagg gtgttgtggc tggtattgct 5280
tacgctgggc
cctggaaggc taggaacgct tacgattgga cagttgagag tactgtttac 5340
gtgtcacata
ggcatcaaag gttgggccta ggatctacat tgtacacaca tttgcttaag 5400
tctatggagg
cgcaaggttt taagtctgtg gttgctgtta taggccttcc aaacgatcca 5460
tctgttaggt
tgcatgaggc tttgggatac acagcccggg gtacattgcg cgcagctgga 5520
tacaagcatg
gtggatggca tgatgttggt ttttggcaaa gggattttga gttgccagct 5580
cctccaaggc
cagttaggcc agttacccag atatgagtcg agctctagat ccccgaattt 5640
ccccgatcgt
tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 5700
tgcgatgatt
atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 5760
atgcatgacg
ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 5820
atacgcgata
gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 5880
atctatgtta
ctagatcggg aattgggtac catgcccggg cggccagcat ggccgtatcc 5940
gcaatgtgtt
attaagttgt ctaagcgtca atttgtttac accacaatat atcctgccac 6000
cagccagcca
acagctcccc gaccggcagc tcggcacaaa atcaccactc gatacaggca 6060
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gcccatcaga
attaattctc atgtttgaca gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg 6120
cttctggcgt
caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg 6180
cataattcgt
gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc 6240
ataacggttc
tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat 6300
aatgtgtgga
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gagggaagcg 6360
ttgatcgccg
aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc 6420
gaaccgacgt
tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca 6480
cacagtgata
ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga 6540
gctttgatca
acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc 6600
gctgtagaag
tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag 6660
cgcgaactgc
aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca 6720
gccacgatcg
acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc 6780
ttggtaggtc
cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag 6840
gcgctaaatg
aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga 6900
aatgtagtgc
ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg 6960
aaggatgtcg
ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata 7020
cttgaagcta
ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 7080
ttggaagaat
ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aagtagtcgg caaataaagc 7140
tctagtggat
ctccgtaccc ggggatctgg ctcgcggcgg acgcacgacg ccggggcgag 7200
accataggcg
atctcctaaa tcaatagtag ctgtaacctc gaagcgtttc acttgtaaca 7260
acgattgaga
atttttgtca taaaattgaa atacttggtt cgcatttttg tcatccgcgg 7320
tcagccgcaa
ttctgacgaa ctgcccattt agctggagat gattgtacat ccttcacgtg 7380
aaaatttctc
aagcgctgtg aacaagggtt cagattttag attgaaaggt gagccgttga 7440
aacacgttct
tcttgtcgat gacgacgtcg ctatgcggca tcttattatt gaatacctta 7500
cgatccacgc
cttcaaagtg accgcggtag ccgacagcac ccagttcaca agagtactct 7560
cttccgcgac
ggtcgatgtc gtggttgttg atctagattt aggtcgtgaa gatgggctcg 7620
agatcgttcg
taatctggcg gcaaagtctg atattccaat cataattatc agtggcgacc 7680
gccttgagga
gacggataaa gttgttgcac tcgagctagg agcaagtgat tttatcgcta 7740
agccgttcag
tatcagagag tttctagcac gcattcgggt tgccttgcgc gtgcgcccca 7800
acgttgtccg
ctccaaagac cgacggtctt tttgttttac tgactggaca cttaatctca 7860
ggcaacgtcg
cttgatgtcc gaagctggcg gtgaggtgaa acttacggca ggtgagttca 7920
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
atcttctcct
cgcgttttta gagaaacccc gcgacgttct atcgcgcgag caacttctca 7980
ttgccagtcg
agtacgcgac gaggaggttt atgacaggag tatagatgtt ctcattttga 8040
ggctgcgccg
caaacttgag gcagatccgt caagccctca actgataaaa acagcaagag 8100
gtgccggtta
tttctttgac gcggacgtgc aggtttcgca cggggggacg atggcagcct 8160
gagccaattc
ccagatcccc gaggaatcgg cgtgagcggt cgcaaaccat ccggcccggt 8220
acaaatcggc
gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc 8280
ccagcggcaa
cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga 8340
tcgaatccgc
aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc 8400
gcccaagggc
gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg 8460
cgatagtcgc
agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc 8520
tggcgaggtg
atccgctacg agcttccaga cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc 8580
cggcatggcc
agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga 8640
atccatgaac
cgataccggg aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca 8700
cgttgcggac
gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct 8760
ggtagaaacc
tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc 8820
caagaacggc
cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat 8880
cgtaaagagc
gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc gagctagctg attggatgta 8940
ccgcgagatc
acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt 9000
gatcgatccc
ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc 9060
agaagccaga
tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa 9120
gaagttctgt
ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt 9180
gaaggaggag
gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga 9240
gggcgaagca
tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc 9300
aggggaaaaa
ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa 9360
gccgtacatt
gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 9420
gtcacacatg
taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc 9480
tttaaaactt
attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg 9540
cacagccgaa
gagctgcaaa aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc 9600
cgcttcgcgt
cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg 9660
caatctacca
gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc gctgaggtct 9720
gcctcgtgaa
gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca 9780
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gaaagtgagg
gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt 9840
gaacttttgc
tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt 9900
caactcagca
aaagttcgat ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg 9960
ctctgccagt
gttacaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa 10020
tgaaactgca
atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc 10080
tgtaatgaag
gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg 10140
tctgcgattc
cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata 10200
aggttatcaa
gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc 10260
tctgcattaa
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 10320
cgcttcctcg
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 10380
tcactcaaag
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 10440
gtgagcaaaa
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 10500
ccataggctc
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 10560
aaacccgaca
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 10620
tcctgttccg
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 10680
ggcgctttct
catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 10740
gctgggctgt
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 10800
tcgtcttgag
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 10860
caggattagc
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 10920
ctacggctac
actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 10980
cggaaaaaga
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 11040
ttttgtttgc
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 11100
cttttctacg
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 11160
gagattatca
aaaaggatct tcacctagat ccttttgatc cggaatta 11208
<210> 53
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 53
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatggctcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 54
<211> 1326
<212> ADN
<213> Alopecurus mycosuroides
<400> 54
atgcctccga
ccaccgcaac cgcaaccggt gctgcagcag cagccgttac accggaacat 60
gcagcacgtc
gttttccgcg tgttgttcgt gttaatccgc gtagcgatcg ttttccggtt 120
ctggcatttc
atcatgttga attttggtgt gccgatgcag caagcgcagc aggtcgtttt 180
agctttgcac
tgggtgcacc gctggcagca cgtagcgatc tgagcaccgg taatagcagc 240
catgcaagcc
atctgctgcg tagtggtgca ctggcatttc tgtttaccgc accgtatgca 300
ccgcctccgc
aggatgcagc agatgcagcc gctaccgcca gcattccgag ctttagcacc 360
gaagcagcac
gtacctttag cagcgcacat ggtctggcag ttcgtagcgt tgcaattcgt 420
gttgcagatg
ccgcagaagc atttcatacc agcgttgcgg gtggtgcacg tccggcattt 480
gcaccggcag
atctgggtag cggttttggt ctggccgaag ttgaactgta tggtgatgtt 540
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gttctgcgtt
ttgttagtca tccggatggt gatgatgttc cgtttctgcc gggttttgaa 600
ggtgttagcc
gtccgggtgc aatggattat ggtctgaccc gttttgatca tgttgttggt 660
aatgttccgg
aaatggcacc ggttgcagca tatatgaaag gttttaccgg ctttcatgaa 720
tttgccgaat
ttaccgcaga agatgttggc accgcagaaa gcggtctgaa tagcgttgtt 780
ctggcaaata
atagcgaagc agttctgctg ccgctgaatg aaccggtgca tggcaccaaa 840
cgtcgtagcc
agattcagac ctatctggat tatcatggtg gtccgggtgt tcagcatatt 900
gcactggcaa
gcagtgatgt tctgcgtacc ctgcgtgaaa tgcgtgcacg tagcgcaatg 960
ggtggttttg
aatttatggc accgccgcag gcaaaatatt atgaaggtgt tcgtcgtctg 1020
gctggtgatg
ttctgagcga agcacagatt aaagaatgtc aggaactggg cgttctggtt 1080
gatcgtgatg
atcagggtgt tctgctgcag atttttacca aaccggttgg tgatcgtcgt 1140
ccgacctttt
ttctggaaat gattcagcgt attggctgca tggaaaaaga tgaaattggc 1200
caggaatatc
agaaaggcgg ctgtggtggt tttggtaaag gtaattttag cgaactgttt 1260
aaaagcattg
aagattatga aaaaagcctg gaagccaaac agagcgcagt tgcacagcag 1320
agctaa
1326
<210> 55 <211> 1323 <212> ADN <213> Alopecurus mycosuroides
<400> 55 atgccaccaa
ctactgctac tgctacaggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagaa
ggttcccaag agttgttaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
cttgctttcc
atcatgttga gttttggtgt gctgatgctg cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct agatctgatt tgtctactgg aaactcttct 240
cacgcttctc
accttttgag atctggtgct cttgctttcc ttttcactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagatgctgc agatgcagca gctactgctt ctattccatc tttttcaact 360
gaggctgcta
ggactttctc ttctgctcat ggattggctg ttagatctgt ggctattaga 420
gttgcagatg
ctgcagaggc tttccatact tctgttgctg gtggtgctag accagctttt 480
gctccagctg
atcttggatc tggatttgga cttgctgagg ttgagcttta cggtgatgtt 540
gttcttagat
tcgtgtctca cccagatggt gatgatgttc catttcttcc aggattcgag 600
ggtgttagta
gaccaggtgc tatggattat ggactcacta ggttcgatca cgttgtggga 660
aatgttccag
aaatggctcc agttgctgct tacatgaagg gattcactgg atttcatgag 720
ttcgctgagt
tcactgctga ggatgttgga actgctgagt ctggacttaa ctctgttgtg 780
cttgctaaca
actctgaggc tgttcttttg ccacttaatg agccagttca 144 cggcactaag 840
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
agaagatctc
agattcagac ttacctcgat taccatggtg gaccaggtgt tcaacatatt 900
gctcttgctt
catctgatgt gcttaggact cttagagaga tgagagctag atctgctatg 960
ggaggatttg
agtttatggc tccaccacaa gctaagtatt acgaaggtgt tagaaggctt 1020
gctggtgatg
ttctttctga ggctcaaatc aaagagtgcc aagagcttgg agttcttgtg 1080
gatagagatg
atcagggtgt gcttctccag attttcacta agccagttgg agataggcca 1140
acattcttct
tggagatgat tcagaggatc ggctgcatgg aaaaggatga gattggacaa 1200
gagtaccaaa
agggcggatg tggtggattt ggaaagggaa atttctccga gcttttcaag 1260
tccatcgagg
attacgagaa gtctcttgag gctaagcaat ctgctgttgc tcaacagtct 1320
tga
1323
<210> 56 <211> 1323 <212> ADN <213> Sorghum halepense
<400> 56 atgcctccga
ccccgaccac cgcagcagca acaggtgccg cagttgcagc agcaagcgca 60
gaacaggcag
catttcgtct ggttggtcat cgtaattttg ttcgtgttaa tccgcgtagc 120
gatcgttttc
ataccctggc atttcatcat gttgaactgt ggtgtgccga tgcagccagc 180
gcagcaggtc
gttttagctt tggtctgggt gcaccgctgg cagcacgtag cgatctgagc 240
accggtaata
ccgcacatgc aagcctgctg ctgcgttcag gtgcactggc atttctgttt 300
accgcaccgt
atgcccatgg tgctgatgca gcaaccgcaa gcctgccgag ctttagcgca 360
gcagaagcac
gtcgttttgc agcagatcat ggtctggcag ttcgtgccgt tgcactgcgt 420
gttgcagatg
ccgaagatgc atttcgtgca agcgttgcag ccggtgcacg tccggcattt 480
gaaccggttg
aactgggtct gggttttcgt ctggccgaag ttgaactgta tggtgatgtt 540
gttctgcgtt
atgttagcta tccggatgat gcagatgcaa gctttctgcc gggttttgtt 600
ggtgttagca
gtccgggtgc ggcagattat ggcctgcgtc gttttgatca tattgtgggt 660
aatgttccgg
aactggcacc ggcagcggca tattttgcag gttttaccgg ctttcatgaa 720
tttgcagaat
ttaccgcaga agatgttggc accaccgaaa gcggtctgaa tagcatggtt 780
ctggcaaata
atgccgaaaa tgttctgctg ccgctgaatg aaccggtgca tggcaccaaa 840
cgtcgtagcc
agattcagac ctttctggat catcatggtg gtccgggtgt tcagcacatg 900
gcactggcaa
gtgatgatgt gctgcgtacc ctgcgtgaaa tgcaggcatg tagtgcaatg 960
ggtggttttg
aatttatggc accgccggca ccggaatatt atgatggtgt tcgtcgtcgt 1020
gccggtgatg
ttctgaccga agcacagatt aaagaatgtc aggaactggg cgttctggtt 1080
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gatcgtgatg
atcagggtgt tctgctgcag atttttacca aaccggttgg tgatcgcccg 1140
accttttttc
tggaaattat tcagcgtatt ggttgcatgg aaaaagatga aaaaggccag 1200
gaatatcaga
aaggcggttg tggtggtttt ggtaaaggta attttagcca gctgtttaaa 1260
agcattgaag
attatgaaaa aagcctggaa gcaaaacagg cagctgcagc acagggtccg 1320
taa
1323
<210> 57 <211> 1323 <212> ADN <213> Sorghum halepense
<400> 57 atgcctccga
ccccgaccac cgcagcagca acaggtgccg cagttgcagc agcaagcgca 60
gaacaggcag
catttcgtct ggttggtcat cgtaattttg ttcgtgttaa tccgcgtagc 120
gatcgttttc
ataccctggc atttcatcat gttgaactgt ggtgtgccga tgcagccagc 180
gcagcaggtc
gttttagctt tggtctgggt gcaccgctgg cagcacgtag cgatctgagc 240
accggtaata
ccgcacatgc aagcctgctg ctgcgttcag gtgcactggc atttctgttt 300
accgcaccgt
atgcccatgg tgctgatgca gcaaccgcaa gcctgccgag ctttagcgca 360
gcagaagcac
gtcgttttgc agcagatcat ggtctggcag ttcgtgccgt tgcactgcgt 420
gttgcagatg
ccgaagatgc atttcgtgca agcgttgcag ccggtgcacg tccggcattt 480
gaaccggttg
aactgggtct gggttttcgt ctggccgaag ttgaactgta tggtgatgtt 540
gttctgcgtt
atgttagcta tccggatgat gcagatgcaa gctttctgcc gggttttgtt 600
ggtgttacca
gtccgggtgc ggcagattat ggcctgaaac gttttgatca tattgtgggt 660
aatgttccgg
aactggcacc ggcagcggca tattttgcag gttttaccgg ctttcatgaa 720
tttgcagaat
ttaccgcaga agatgttggc accaccgaaa gcggtctgaa tagcatggtt 780
ctggcaaata
atgccgaaaa tgttctgctg ccgctgaatg aaccggtgca tggcaccaaa 840
cgtcgtagcc
agattcagac ctttctggat catcatggtg gtccgggtgt tcagcacatg 900
gcactggcaa
gtgatgatgt gctgcgtacc ctgcgtgaaa tgcaggcacg tagtgcaatg 960
ggtggttttg
aatttatggc accgccggca ccggaatatt atgatggtgt tcgtcgtcgt 1020
gccggtgatg
ttctgaccga agcacagatt aaagaatgtc aggaactggg cgttctggtt 1080
gatcgtgatg
atcagggtgt tctgctgcag atttttacca aaccggttgg tgatcgcccg 1140
accttttttc
tggaaattat tcagcgtatt ggttgcatgg aaaaagatga aaaaggccag 1200
gaatatcaga
aaggcggttg tggtggtttt ggtaaaggta attttagcca gctgtttaaa 1260
agcattgaag
attatgaaaa aagcctggaa gcaaaacagg cagctgcagc acagggtccg 1320
taa
1323
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210> 58
<211> 1311
<212> ADN <213> Poa annua
<400> 58 atgcctccga
ccaccgcaac cgccaccgca gcagcaaccg ttacaccgga acatgcagca 60
cgtcgttttc
cgcgtgttgt tcgtgttaat ccgcgtagcg atcgttttcc ggttctgagc 120
tttcatcatg
ttgaattttg gtgtgccgat gcagcaagcg cagcaggtcg ttttagcttt 180
gcactgggtg
caccgctggc agcacgtagc gatctgagca ccggtaatag cgcacatgca 240
agcctgctgc
tgcgttcagg tgcactggca tttctgttta ccgcaccgta tgcaccgcag 300
ccgcaggatg
cagataccgc aagcattccg agctttagcg cagatgcagc acgtgcattt 360
agcgcagcac
atggtctggc agttcgtagc gttgcagttc gtgttgcaga tgccgcagat 420
gcatttcgtg
caagcattgc agccggtgca cgtccggcat ttgcaccggc agatctgggt 480
cgtggttttg
gtctggccga agttgaactg tatggtgatg ttgttctgcg ttttgttagc 540
catccggatg
cagatgatgc accgccgttt ctgccgggtt ttgaagcagt tagccgtcgt 600
ccgggtgccg
ttgattatgg tctgacccgt tttgatcatg ttgttggtaa tgttccggaa 660
atgggtccgg
tgattgatta tattaaaggc tttatgggct ttcatgaatt tgccgaattt 720
accgcagaag
atgttggcac caccgaaagc ggtctgaata gcgttgttct ggcaaataat 780
agcgaagcag
ttctgctgcc gctgaatgaa ccggtgcatg gcaccaaacg tcgtagccag 840
attcagacct
atctggaata tcatggtggt ccgggtgttc agcatattgc actggcaagc 900
agtgatgttc
tgcgtaccct gcgtgaaatg caggcacgtt cagcaatggg tggttttgaa 960
tttatggcac
cgccgcagcc gaaatattat gaaggtgttc gtcgtattgc cggtgatgtt 1020
ctgagcgaag
cacagattaa agaatgtcag gaactgggcg ttctggttga tcgtgatgat 1080
cagggtgttc
tgctgcagat ttttaccaaa ccggttggtg atcgtccgac cttttttctg 1140
gaaatgattc
agcgtattgg ctgcatggaa aaagatgaac gtggtcagga atatcagaaa 1200
ggcggttgtg
gcggttttgg taaaggtaat tttagcgaac tgtttaaaag cattgaagat 1260
tatgaaaaaa
gcctggaagc caaacagagc gcagttgcac agcagagcta a 1311
<210> 59 <211> 1305 <212> ADN <213> Poa annua
<400> 59 atgccaccaa
ctactgctac tgctacagct gctgctactg ttactccaga acatgctgct 60
agaaggttcc
caagagttgt tagagttaac ccaaggtctg ataggttccc 147 agttctttct 120
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ttccaccacg
ttgaattttg gtgtgctgat gctgcttctg ctgctggaag attttctttt 180
gctcttggtg
ctccacttgc tgctagatct gatttgtcta ctggaaattc tgctcacgct 240
tctttgcttt
tgaggtctgg tgctcttgct ttccttttta ctgctcctta tgctccacaa 300
ccacaggatg
ctgatactgc atcaattcca tctttctcag ctgatgctgc aagggctttt 360
tctgctgctc
atggattggc tgttagatct gttgctgtta gagttgctga tgcagctgat 420
gctttcagag
cttctattgc tgcaggtgct agaccagctt ttgctccagc tgatcttgga 480
agaggatttg
gacttgctga ggttgagctt tacggtgatg ttgttcttag attcgtgtct 540
cacccagatg
ctgatgatgc tccatttctt ccaggatttg aggctgtttc tagaccaggt 600
gctgttgatt
atggactcac taggttcgat cacgttgtgg gaaatgttcc agaaatggga 660
ccagtgatcg
attacatcaa gggattcatg ggattccatg agttcgctga gtttactgct 720
gaggatgttg
gaactactga gtctggactt aactctgttg tgcttgctaa caactctgag 780
gctgttcttt
tgccacttaa tgagccagtt cacggcacta agagaagatc tcagattcag 840
acttaccttg
agtaccatgg tggaccaggt gttcaacata ttgctcttgc ttcatctgat 900
gtgcttagga
ctcttagaga gatgcaagct agatctgcta tgggaggatt tgagtttatg 960
gctccaccac
aacctaagta ttacgagggt gttagaagga ttgctggtga tgttctttcc 1020
gaggctcaaa
tcaaagagtg tcaagagctt ggagtgcttg tggatagaga tgatcagggt 1080
gtgcttctcc
agattttcac taagccagtt ggagataggc caacattctt cttggagatg 1140
attcagagga
tcggctgcat ggaaaaggat gagagaggtc aagagtatca aaagggcgga 1200
tgtggtggat
ttggaaaggg aaatttctcc gagcttttca agtccatcga ggattacgag 1260
aagtctcttg
aggctaagca atctgctgtt gctcaacagt cttga 1305
<210> 60 <211> 1323
<212> ADN
<213> Lolium multiflorum <400> 60
atgcctccga
caccggcaac cgcaaccggt gctgcagcag cagcagttac accggaacat 60
gcagcacgta
gctttccgcg tgttgttcgt gttaatccgc gtagcgatcg ttttccggtt 120
ctgagctttc
atcatgttga actgtggtgt gccgatgcag caagcgcagc aggtcgtttt 180
agctttgcac
tgggtgctcc gctggcagcc cgtagcgatc tgagcaccgg taatagcgca 240
catgcaagcc
tgctgctgcg tagcggtgca ctggcatttc tgtttaccgc accgtatgca 300
ccgcctccgc
aggaagcagc aaccgcagct gcaaccgcaa gcattccgag ctttagcgca 360
gatgcagccc
gtacctttgc agcagcacat ggtctggcag ttcgtagcgt tggtgttcgt 420
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gttgccgatg
cagcggaagc atttcgtgtt agcgttgccg gtggtgcacg tccggcattt 480
gcaccggcag
atctgggtca tggttttggt ctggccgaag ttgaactgta tggtgatgtt 540
gttctgcgtt
ttgttagcta tccggatgaa accgatctgc cgtttctgcc gggttttgaa 600
cgtgttagca
gtccgggtgc cgttgattat ggtctgaccc gttttgatca tgttgttggt 660
aatgttccgg
aaatggcacc ggttattgat tatatgaaag gctttctggg ctttcatgaa 720
tttgcagaat
ttaccgcaga agatgttggc accaccgaaa gcggtctgaa tagcgttgtt 780
ctggcaaata
atagcgaaaa tgttctgctg ccgctgaatg aaccggtgca tggcaccaaa 840
cgtcgtagcc
agattcagac ctatctggat tatcatggtg gtccgggtgt tcagcatatt 900
gcactggcaa
gcaccgatgt tctgcgtacc ctgcgtgaaa tgcgtgcacg taccccgatg 960
ggtggttttg
aatttatggc accgccgcag gcaaaatatt atgaaggtgt tcgtcgtatt 1020
gccggtgatg
ttctgagcga agaacaaatt aaagaatgtc aggaactggg cgttctggtt 1080
gatcgtgatg
atcagggtgt tctgctgcag atttttacca aaccggttgg tgatcgtccg 1140
accttttttc
tggaaatgat tcagcgtatt ggctgcatgg aaaaagatga agttggtcag 1200
gaatatcaga
aaggcggttg tggtggtttt ggtaaaggta attttagcga actgtttaaa 1260
agcattgaag
attatgaaaa aaccctggaa gccaaacaga gcgttgttgc acagaaaagc 1320
taa
1323
<210> 61 <211> 1320 <212> ADN <213> Avena sativa
<400> 61 atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt 149 ccatgagttc 720
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatggctcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tatggtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 62
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 62
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacat tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatggctcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ggtgatgttc tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080 agagatgatc agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140 ttcttcttgg agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200 taccaaaagg gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260 atcgaggatt acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 63
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 63
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacct tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatggctcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210> 64
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 64 atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgagacc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 65 <211> 1320 <212> ADN <213> Avena sativa
<400> 65 atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc 152 tggaagattt 180
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgaagcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 66
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 66
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgattcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 67
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 67
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatggctcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aagggaggct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 68
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 68
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatggctcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aagggatgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320

<210> 69

<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 69
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatggctcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggtgcgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320

<210> 70

<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<400> 70 atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatggctcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tagatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 71 <211> 1320 <212> ADN <213> Avena sativa
<400> 71 atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc 157 tccttatgct 300
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacgt tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgagacc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tatggtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 72
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 72
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacat tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgagacc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tatggtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 73
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 73
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacat tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ggatttgagt
ttatggctcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tatggtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 74
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 74
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacat tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgagacc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tctcgtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 75 <211> 1320 <212> ADN <213> Avena sativa
<400> 75 atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacat tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgaagcc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tatggtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 76 <211> 1320 <212> ADN <213> Avena sativa
<400> 76 atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacct tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgagacc accacaagct aagtattacg agggtgttag aaggattgct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tatggtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 77
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 77
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacat tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgagacc accacaagct aagtattacg agggtgttag aagggaggct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tatggtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 78
<211> 1320
<212> ADN
<213> Avena sativa
<400> 78
atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgct actgcttcta ttccatcttt ttcagctgat 360
gctgcaagga
cttttgctgc tgctcatgga cttgctgtta gatctgttgg agttagagtt 420
gctgatgcag
ctgaggcttt cagagtttct gttgctggtg gtgctagacc agcttttgct 480
ccagctgatc
ttggacatgg atttggactt gctgaggttg agctttacgg tgatgttgtt 540
cttcgtttcg
tgtcttaccc agatgagact gatcttccat tccttccagg atttgagagg 600
gtttcatctc
caggtgctgt tgattatgga ctcactaggt tcgatcacct tgtgggaaat 660
gttccagaaa
tggctccagt gatcgattac atgaagggat tccttggatt ccatgagttc 720
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gctgagttta
ctgctgagga tgttggaact actgagtctg gacttaactc tgttgtgctt 780
gctaacaact
ctgaggctgt tcttttgcca cttaatgagc cagttcacgg cactaagaga 840
agatctcaga
ttcagactta ccttgagtac catggtggac caggtgttca acatattgct 900
cttgcttcta
acgatgtgct taggactctt agagagatga gagctagaac tccaatggga 960
ggatttgagt
ttatgagacc accacaagct aagtattacg agggtgttag aagggaggct 1020
ggtgatgttc
tttccgagga acagatcaaa gagtgtcaag agcttggagt tatggtggat 1080
agagatgatc
agggtgtgct tctccagatt ttcactaagc cagttggaga taggccaaca 1140
ttcttcttgg
agatgattca gaggatcggc tgcatggaaa aggatgaagt tggacaagag 1200
taccaaaagg
gcggatgtgg tggatttgga aagggaaatt tctccgagct tttcaagtcc 1260
atcgaggatt
acgagaagtc tcttgaggtt aagcagtctg ttgtggctca gaagtcttga 1320
<210> 79
<211> 1305
<212> ADN <213> Poa annua
<400> 79
atgccaccaa
ctactgctac tgctacagct gctgctactg ttactccaga acatgctgct 60
agaaggttcc
caagagttgt tagagttaac ccaaggtctg ataggttccc agttctttct 120
ttccaccacg
ttgaattttg gtgtgctgat gctgcttctg ctgctggaag attttctttt 180
gctcttggtg
ctccacttgc tgctagatct gatttgtcta ctggaaattc tgctcacgct 240
tctttgcttt
tgaggtctgg tgctcttgct ttccttttta ctgctcctta tgctccacaa 300
ccacaggatg
ctgatactgc atcaattcca tctttctcag ctgatgctgc aagggctttt 360
tctgctgctc
atggattggc tgttagatct gttgctgtta gagttgctga tgcagctgat 420
gctttcagag
cttctattgc tgcaggtgct agaccagctt ttgctccagc tgatcttgga 480
agaggatttg
gacttgctga ggttgagctt tacggtgatg ttgttcttag attcgtgtct 540
cacccagatg
ctgatgatgc tccatttctt ccaggatttg aggctgtttc tagaccaggt 600
gctgttgatt
atggactcac taggttcgat cacgttgtgg gaaatgttcc agaaatggga 660
ccagtgatcg
attacatcaa gggattcatg ggattccatg agttcgctga gtttactgct 720
gaggatgttg
gaactactga gtctggactt aactctgttg tgcttgctaa caactctgag 780
gctgttcttt
tgccacttaa tgagccagtt cacggcacta agagaagatc tcagattcag 840
acttaccttg
agtaccatgg tggaccaggt gttcaacata ttgctcttgc ttcatctgat 900
gtgcttagga
ctcttagaga gatgcaagct agatctgcta tgggaggatt tgagtttatg 960
aggccaccac
aacctaagta ttacgagggt gttagaagga ttgctggtga tgttctttcc 1020
gaggctcaaa
tcaaagagtg tcaagagctt ggagtgatgg tggatagaga tgatcagggt 1080
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gtgcttctcc
agattttcac taagccagtt ggagataggc caacattctt cttggagatg 1140
attcagagga
tcggctgcat ggaaaaggat gagagaggtc aagagtatca aaagggcgga 1200
tgtggtggat
ttggaaaggg aaatttctcc gagcttttca agtccatcga ggattacgag 1260
aagtctcttg
aggctaagca atctgctgtt gctcaacagt cttga 1305
<210> 80 <211> 1305
<212> ADN <213> Poa annua
<400> 80
atgccaccaa
ctactgctac tgctacagct gctgctactg ttactccaga acatgctgct 60
agaaggttcc
caagagttgt tagagttaac ccaaggtctg ataggttccc agttctttct 120
ttccaccacg
ttgaattttg gtgtgctgat gctgcttctg ctgctggaag attttctttt 180
gctcttggtg
ctccacttgc tgctagatct gatttgtcta ctggaaattc tgctcacgct 240
tctttgcttt
tgaggtctgg tgctcttgct ttccttttta ctgctcctta tgctccacaa 300
ccacaggatg
ctgatactgc atcaattcca tctttctcag ctgatgctgc aagggctttt 360
tctgctgctc
atggattggc tgttagatct gttgctgtta gagttgctga tgcagctgat 420
gctttcagag
cttctattgc tgcaggtgct agaccagctt ttgctccagc tgatcttgga 480
agaggatttg
gacttgctga ggttgagctt tacggtgatg ttgttcttag attcgtgtct 540
cacccagatg
ctgatgatgc tccatttctt ccaggatttg aggctgtttc tagaccaggt 600
gctgttgatt
atggactcac taggttcgat cacattgtgg gaaatgttcc agaaatggga 660
ccagtgatcg
attacatcaa gggattcatg ggattccatg agttcgctga gtttactgct 720
gaggatgttg
gaactactga gtctggactt aactctgttg tgcttgctaa caactctgag 780
gctgttcttt
tgccacttaa tgagccagtt cacggcacta agagaagatc tcagattcag 840
acttaccttg
agtaccatgg tggaccaggt gttcaacata ttgctcttgc ttcatctgat 900
gtgcttagga
ctcttagaga gatgcaagct agatctgcta tgggaggatt tgagtttatg 960
aggccaccac
aacctaagta ttacgagggt gttagaagga ttgctggtga tgttctttcc 1020
gaggctcaaa
tcaaagagtg tcaagagctt ggagtgatgg tggatagaga tgatcagggt 1080
gtgcttctcc
agattttcac taagccagtt ggagataggc caacattctt cttggagatg 1140
attcagagga
tcggctgcat ggaaaaggat gagagaggtc aagagtatca aaagggcgga 1200
tgtggtggat
ttggaaaggg aaatttctcc gagcttttca agtccatcga ggattacgag 1260
aagtctcttg
aggctaagca atctgctgtt gctcaacagt cttga 1305
<210> 81
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<211> 1323
<212> ADN
<213> Alopecurus mycosuroides
<400> 81 atgccaccaa
ctactgctac tgctacaggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagaa
ggttcccaag agttgttaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
cttgctttcc
atcatgttga gttttggtgt gctgatgctg cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct agatctgatt tgtctactgg aaactcttct 240
cacgcttctc
accttttgag atctggtgct cttgctttcc ttttcactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagatgctgc agatgcagca gctactgctt ctattccatc tttttcaact 360
gaggctgcta
ggactttctc ttctgctcat ggattggctg ttagatctgt ggctattaga 420
gttgcagatg
ctgcagaggc tttccatact tctgttgctg gtggtgctag accagctttt 480
gctccagctg
atcttggatc tggatttgga cttgctgagg ttgagcttta cggtgatgtt 540
gttcttagat
tcgtgtctca cccagatggt gatgatgttc catttcttcc aggattcgag 600
ggtgttagta
gaccaggtgc tatggattat ggactcacta ggttcgatca cgttgtggga 660
aatgttccag
aaatggctcc agttgctgct tacatgaagg gattcactgg atttcatgag 720
ttcgctgagt
tcactgctga ggatgttgga actgctgagt ctggacttaa ctctgttgtg 780
cttgctaaca
actctgaggc tgttcttttg ccacttaatg agccagttca cggcactaag 840
agaagatctc
agattcagac ttacctcgat taccatggtg gaccaggtgt tcaacatatt 900
gctcttgctt
catctgatgt gcttaggact cttagagaga tgagagctag atctgctatg 960
ggaggatttg
agtttatgag accaccacaa gctaagtatt acgaaggtgt tagaaggctt 1020
gctggtgatg
ttctttctga ggctcaaatc aaagagtgcc aagagcttgg agttatggtg 1080
gatagagatg
atcagggtgt gcttctccag attttcacta agccagttgg agataggcca 1140
acattcttct
tggagatgat tcagaggatc ggctgcatgg aaaaggatga gattggacaa 1200
gagtaccaaa
agggcggatg tggtggattt ggaaagggaa atttctccga gcttttcaag 1260
tccatcgagg
attacgagaa gtctcttgag gctaagcaat ctgctgttgc tcaacagtct 1320
tga
1323
<210> 82 <211> 1323 <212> ADN <213> Alopecurus mycosuroides
<400> 82 atgccaccaa
ctactgctac tgctacaggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagaa
ggttcccaag agttgttaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
cttgctttcc
atcatgttga gttttggtgt gctgatgctg cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct agatctgatt tgtctactgg aaactcttct 240
cacgcttctc
accttttgag atctggtgct cttgctttcc ttttcactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagatgctgc agatgcagca gctactgctt ctattccatc tttttcaact 360
gaggctgcta
ggactttctc ttctgctcat ggattggctg ttagatctgt ggctattaga 420
gttgcagatg
ctgcagaggc tttccatact tctgttgctg gtggtgctag accagctttt 480
gctccagctg
atcttggatc tggatttgga cttgctgagg ttgagcttta cggtgatgtt 540
gttcttagat
tcgtgtctca cccagatggt gatgatgttc catttcttcc aggattcgag 600
ggtgttagta
gaccaggtgc tatggattat ggactcacta ggttcgatca cattgtggga 660
aatgttccag
aaatggctcc agttgctgct tacatgaagg gattcactgg atttcatgag 720
ttcgctgagt
tcactgctga ggatgttgga actgctgagt ctggacttaa ctctgttgtg 780
cttgctaaca
actctgaggc tgttcttttg ccacttaatg agccagttca cggcactaag 840
agaagatctc
agattcagac ttacctcgat taccatggtg gaccaggtgt tcaacatatt 900
gctcttgctt
catctgatgt gcttaggact cttagagaga tgagagctag atctgctatg 960
ggaggatttg
agtttatgag accaccacaa gctaagtatt acgaaggtgt tagaaggctt 1020
gctggtgatg
ttctttctga ggctcaaatc aaagagtgcc aagagcttgg agttatggtg 1080
gatagagatg
atcagggtgt gcttctccag attttcacta agccagttgg agataggcca 1140
acattcttct
tggagatgat tcagaggatc ggctgcatgg aaaaggatga gattggacaa 1200
gagtaccaaa
agggcggatg tggtggattt ggaaagggaa atttctccga gcttttcaag 1260
tccatcgagg tga
attacgagaa gtctcttgag gctaagcaat ctgctgttgc tcaacagtct 1320 1323
<210> 83
<211> 217
<212> ADN
<213> Petunia x hybrida <400> 83
atggcacaaa
ttaacaacat ggcacaaggg atacaaaccc ttaatcccaa ttccaatttc 60
cataaacccc
aagttcctaa atcttcaagt tttcttgttt ttggatctaa aaaactgaaa 120
aattcagcaa
attctatgtt ggttttgaaa aaagattcaa tttttatgca aaagttttgt 180
tcctttagga
tttcagcatc agtggctaca gcctgcc 217
<210> 84
<211> 1323
<212> ADN
<213> Avena sativa
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<400> 84 atgccaccaa
ctccagctac tgctactggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagat
cttttccaag ggttgtgaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
ctttctttcc
accacgttga actttggtgt gctgatgcag cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct aggtctgatt tgtctactgg aaattctgct 240
cacgcttctt
tgcttttgag gtctggtgct cttgctttcc tttttactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagaagctgc tacagctgca gctactgctt ctattccatc tttttcagct 360
gatgctgcaa
ggacttttgc tgctgctcat ggacttgctg ttagatctgt tggagttaga 420
gttgctgatg
cagctgaggc tttcagagtt tctgttgctg gtggtgctag accagctttt 480
gctccagctg
atcttggaca tggatttgga cttgctgagg ttgagcttta cggtgatgtt 540
gttcttcgtt
tcgtgtctta cccagatgag actgatcttc cattccttcc aggatttgag 600
agggtttcat
ctccaggtgc tgttgattat ggactcacta ggttcgatca cattgtggga 660
aatgttccag
aaatggctcc agtgatcgat tacatgaagg gattccttgg attccatgag 720
ttcgctgagt
ttactgctga ggatgttgga actactgagt ctggacttaa ctctgttgtg 780
cttgctaaca
actctgaggc tgttcttttg ccacttaatg agccagttca cggcactaag 840
agaagatctc
agattcagac ttaccttgag taccatggtg gaccaggtgt tcaacatatt 900
gctcttgctt
ctaacgatgt gcttaggact cttagagaga tgagagctag aactccaatg 960
ggaggatttg
agtttatgag accaccacaa gctaagtatt acgagggtgt tagaaggatt 1020
gctggtgatg
ttctttccga ggaacagatc aaagagtgtc aagagcttgg agttatggtg 1080
gatagagatg
atcagggtgt gcttctccag attttcacta agccagttgg agataggcca 1140
acattcttct
tggagatgat tcagaggatc ggctgcatgg aaaaggatga agttggacaa 1200
gagtaccaaa
agggcggatg tggtggattt ggaaagggaa atttctccga gcttttcaag 1260
tccatcgagg
attacgagaa gtctcttgag gttaagcagt ctgttgtggc tcagaagtct 1320
tga
1323
<210> 85 <211> 1323 <212> ADN <213> Alopecurus mycosuroides
<400> 85 atgccaccaa
ctactgctac tgctacaggt gctgctgctg cagctgttac tccagaacat 60
gctgctagaa
ggttcccaag agttgttaga gttaacccaa ggtctgatag gttcccagtt 120
cttgctttcc
atcatgttga gttttggtgt gctgatgctg cttctgctgc tggaagattt 180
tcttttgctc
ttggtgctcc acttgctgct agatctgatt tgtctactgg 168 aaactcttct 240
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
cacgcttctc
accttttgag atctggtgct cttgctttcc ttttcactgc tccttatgct 300
ccaccaccac
aagatgctgc agatgcagca gctactgctt ctattccatc tttttcaact 360
gaggctgcta
ggactttctc ttctgctcat ggattggctg ttagatctgt ggctattaga 420
gttgcagatg
ctgcagaggc tttccatact tctgttgctg gtggtgctag accagctttt 480
gctccagctg
atcttggatc tggatttgga cttgctgagg ttgagcttta cggtgatgtt 540
gttcttagat
tcgtgtctca cccagatggt gatgatgttc catttcttcc aggattcgag 600
ggtgttagta
gaccaggtgc tatggattat ggactcacta ggttcgatca ccttgtggga 660
aatgttccag
aaatggctcc agttgctgct tacatgaagg gattcactgg atttcatgag 720
ttcgctgagt
tcactgctga ggatgttgga actgctgagt ctggacttaa ctctgttgtg 780
cttgctaaca
actctgaggc tgttcttttg ccacttaatg agccagttca cggcactaag 840
agaagatctc
agattcagac ttacctcgat taccatggtg gaccaggtgt tcaacatatt 900
gctcttgctt
catctgatgt gcttaggact cttagagaga tgagagctag atctgctatg 960
ggaggatttg
agtttatgag accaccacaa gctaagtatt acgaaggtgt tagaagggag 1020
gctggtgatg
ttctttctga ggctcaaatc aaagagtgcc aagagcttgg agttatggtg 1080
gatagagatg
atcagggtgt gcttctccag attttcacta agccagttgg agataggcca 1140
acattcttct
tggagatgat tcagaggatc ggctgcatgg aaaaggatga gattggacaa 1200
gagtaccaaa
agggcggatg tggtggattt ggaaagggaa atttctccga gcttttcaag 1260
tccatcgagg
attacgagaa gtctcttgag gctaagcaat ctgctgttgc tcaacagtct 1320
tga
1323
<210> 86 <211> 70 <212> ADN <213> Virus del mosaico del tabaco
<400> 86 tatttttaca
acaattacca acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac 60
aattacacat
70
<210> 87 <211> 744 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<2 2 0> <223> Secuencia de ADN del promotor 35S doble
<400> 87 aacatggtgg
agcacgacac acttgtctac tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa 60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
gaccaaaggg
caattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct cctcggattc 120
cattgcccag
ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac 180
aaatgccatc
attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt 240
cccaaagatg
gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg 300
tcttcaaagc
aagtggattg atgtgataac atggtggagc acgacacact tgtctactcc 360
aaaaatatca
aagatacagt ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg 420
gtaatatccg
gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag 480
atagtggaaa
aggaaggtgg ctcttacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc 540
gttgaagatg
cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc 600
gtggaaaaag
aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc 660
actgacgtaa
gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa 720
ggaagttcat
ttcatttgga gagg 744
<210> 88 <211> 255 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<2 2 0> <223> Secuencia de ADN del terminador Nos
<400> 88 cgatcgttca
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 60
gatgattatc
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg 120
catgacgtta
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 180
cgcgatagaa
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc 240
tatgttacta gatcg 255

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    1. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
    a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;
    b) un polipéptido que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) y comprende la secuencia (L,I,R)(V,A)(G,A)DVL(S,T), en el que la primera L, la I, o la R se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    c) un polipéptido que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia G(I,V)LVD(r,K), en el que L se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    d) un polipéptido que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia DH(V, I, M)vGn, en el que la primera V, la I o la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    e) un polipéptido que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia GGF(E,D)F(M,l)(A,P), en el que la A o P se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    f) un polipéptido que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia CGGFGKGn, en el que la segunda G o la K se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    g) un polipéptido que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia (L,I,R)(V,A)(G,A)DVL(S,T), en el que la primera L, la I o la R se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    h) un polipéptido que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia G(I,V)LVD(r,K), en el que L se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    i) un polipéptido que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia DH(V, I, M)VGN, en el que la primera V, la I o la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    j) un polipéptido que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia GGF(E,D)F(M,L)(A,P), en el que la A o P se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    k) un polipéptido que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia CGGFGKGn, en el que la segunda G o la K se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    l) un polipéptido que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia (L,I,R)(V,A)(G,A)DVL(S,T), en el que la primera L, la I, o la R se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    m) un polipéptido que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia G(I,V)LVD(r,K), en el que L se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    n) un polipéptido que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia DH(V, I, M)vGn, en el que la primera V, la I o la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    o) un polipéptido que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia GGF(E,D)F(M,l)(A,P), en el que la A o P se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    p) un polipéptido que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia CGGFGKGn, en el que la segunda G o la K se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    q) un polipéptido que tiene al menos un 96% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia (L,I,R)(V,A)(G,A)DVL(S,T), en el que la primera L, la I, o la R se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    r) un polipéptido que tiene al menos un 96% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia G(I,V)LVD(r,K), en el que L se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    s) un polipéptido que tiene al menos un 96% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia DH(V, I, M)vGn, en el que la primera V, la I o la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    t) un polipéptido que tiene al menos un 96% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia GGF(E,D)F(M,L)(A,P), en el que la A o la P se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    u) un polipéptido que tiene al menos un 96% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia CGGFGKGn, en el que la segunda G o la K se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    v) un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia (L,I,R)(V,A)(G,A)DVL(S,T), en el que la primera L, la I, o la R se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    w) un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia G(I,V)LVD(R,K), en el que la L se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    x) un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia DH(V, I, M)VGN, en el que la primera V, la I o la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    y) un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia GGF(E,D)F(M,L)(A,P), en el que la A o la P se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    z) un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia CGGFGKGn, en el que la segunda G o la K se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    aa) un polipéptido que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia (L,I,R)(V,A)(G,A)DVL(S,T), en el que la primera L, la I, o la R se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    bb) un polipéptido que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia G(I,V)LVD(r,K), en el que L se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    cc) un polipéptido que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia DH(V, I, M)vGn, en el que la primera V, la I o la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    dd) un polipéptido que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia GGF(E,D)F(M,L)(A,P), en el que la A o la P se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    ee) un polipéptido que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia CGGFGKGn, en el que la segunda G o la K se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    ff) un polipéptido que tiene al menos un 93% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia (L,I,R)(V,A)(G,A)DVL(S,T), en el que la primera L, la I, o la R se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    gg) un polipéptido que tiene al menos un 93% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia G(I,V)LVD(r,K), en el que L se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    hh) un polipéptido que tiene al menos un 93% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia DH(V, I, M)vGn, en el que la primera V, la I o la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    ii) un polipéptido que tiene al menos un 93% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia GGF(E,D)F(M,L)(A,P), en el que la A o la P se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    jj) un polipéptido que tiene al menos un 93% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia CGGFGKGn, en el que la segunda G o la K se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    kk) un polipéptido que tiene al menos un 92% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia (L,I,R)(V,A)(G,A)DVL(S,T), en el que la primera L, la I, o la R se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    ll) un polipéptido que tiene al menos un 92% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia G(I,V)LVD(r,K), en el que L se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    mm) un polipéptido que tiene al menos un 92% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia DH(V, I, M)vGn, en el que la primera V, la I o la M se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    nn) un polipéptido que tiene al menos un 92% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia GGF(E,D)F(M,L)(A,P), en el que la A o la P se sustituye por cualquier otro aminoácido;
    oo) un polipéptido que tiene al menos un 92% de identidad de secuencia con el polipéptido de a), en el que dicho polipéptido posee actividad enzimática de HPPD y comprende la secuencia CGGFGKGn, en el que la segunda G o la K se sustituye por cualquier otro aminoácido;
  2. 2. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende además una o más sustituciones o supresiones de aminoácidos que corresponden a las sustituciones y supresiones de aminoácidos enumeradas en la Tabla 1.
  3. 3. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido aislado de la reivindicación 1.
  4. 4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 3, seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NOs: 54.
  5. 5. Un polinucleótido aislado que se hibrida en condiciones restrictivas al polinucleótido aislado de la reivindicación 3, en el que las condiciones restrictivas se seleccionan del grupo que consiste en:
    a) 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50 °C con lavado en 2X SSC, 0,1% de SDS a 50 °C;
    b) 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50 °C con lavado en 1X SSC, 0,1% de SDS a 50 °C;
    c) 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50 °C con lavado en 0,5X SSC;
    d) 0,1% de SDS a 50 °C, preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50 °C con lavado en 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 50 °C; y
    e) 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50 °C con lavado en 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65 °C.
  6. 6. Un casete de expresión que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 3, enlazado operablemente a un promotor que dirige la expresión en una planta o célula vegetal.
  7. 7. Un método para conferir resistencia o tolerancia a un inhibidor de hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) en una planta, comprendiendo el método introducir el casete de expresión de la reivindicación 6 en una planta.
    5 8. Una célula vegetal transformada que comprende el casete de expresión de la reivindicación 6.
  8. 9. Una planta, parte de una planta, o semilla que comprende la célula vegetal de la reivindicación 8.
ES10734631.4T 2009-07-10 2010-07-16 Nuevos polipéptidos de hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, y métodos de uso Active ES2555386T5 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22466109P 2009-07-10 2009-07-10
US224661P 2009-07-10
US12/692,552 US8269068B2 (en) 2009-01-22 2010-01-22 Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
US692552 2010-01-22
PCT/US2010/042357 WO2011068567A1 (en) 2009-07-10 2010-07-16 Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2555386T3 ES2555386T3 (es) 2015-12-30
ES2555386T5 true ES2555386T5 (es) 2018-12-28

Family

ID=44115220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10734631.4T Active ES2555386T5 (es) 2009-07-10 2010-07-16 Nuevos polipéptidos de hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, y métodos de uso

Country Status (8)

Country Link
US (2) US9347046B2 (es)
EP (1) EP2451946B2 (es)
CN (1) CN102725402B (es)
AU (1) AU2010326672A1 (es)
CA (1) CA2749383A1 (es)
CL (2) CL2011001763A1 (es)
ES (1) ES2555386T5 (es)
WO (1) WO2011068567A1 (es)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9347046B2 (en) 2009-01-22 2016-05-24 Syngenta Participations Ag Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
EP2521439A4 (en) * 2010-01-05 2013-05-15 Syngenta Participations Ag SYNTHETIC CONSTITUENT PLANT PROMOTERS AND METHODS OF USING SAME
US9187762B2 (en) 2010-08-13 2015-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) activity
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
AR087874A1 (es) 2011-09-16 2014-04-23 Bayer Ip Gmbh Uso de acilsulfonamidas para mejorar el rendimiento de las plantas
US20140302991A1 (en) 2011-09-16 2014-10-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of phenylpyrazolin-3-carboxylates for improving plant yield
CN107897194A (zh) 2011-09-16 2018-04-13 拜耳知识产权有限责任公司 5‑苯基‑或5‑苄基‑2‑异噁唑啉‑3‑甲酸酯用于改善植物产量的用途
JP2014534816A (ja) * 2011-11-02 2014-12-25 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 除草剤耐性の増大した植物
US9499831B2 (en) 2012-01-17 2016-11-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transcription factors, promoters and uses thereof
CN104703998B (zh) 2012-03-13 2020-08-21 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
WO2013138309A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
BR112014031260A2 (pt) 2012-06-15 2019-08-20 Du Pont métodos e composições que envolvem variantes de als com preferência de substrato nativo
KR20150070148A (ko) 2012-09-14 2015-06-24 바이엘 크롭사이언스 엘피 Hppd 변이체들 및 사용 방법들
CN110172466A (zh) 2013-03-07 2019-08-27 巴斯夫农业解决方案种子美国有限责任公司 毒素基因及其使用方法
CA2903693A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize stress related transcription factor 18 and uses thereof
US20140283216A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods of use of acc oxidase polynucleotides and polypeptides
EA201592007A1 (ru) * 2013-04-30 2016-04-29 Басф Се Растения, обладающие повышенной толерантностью к воздействию гербицидов
BR112015025010A2 (pt) * 2013-04-30 2017-10-10 Basf Se métodos para controlar a vegetação, para a identificação de um herbicida benzamida e de identificação de uma sequência de nucleotídeos, ácido nucleico isolado, célula, planta e método de identificação ou seleção de uma célula
WO2015022634A2 (en) * 2013-08-12 2015-02-19 Basf Se Herbicide-resistant hydroxyphenylpyruvate dioxygenases
CA2942171C (en) 2014-03-11 2023-05-09 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
CN107075488A (zh) 2014-03-11 2017-08-18 拜耳作物科学股份公司 Hppd变体及使用方法
AR103649A1 (es) * 2015-02-11 2017-05-24 Basf Se Hidroxifenilpiruvato dioxigenasas resistentes a herbicidas
EA201792106A1 (ru) * 2015-03-23 2018-03-30 Зингента Партисипейшнс Аг Конструкция нуклеиновой кислоты для обеспечения толерантности к гербицидам у растений
WO2017042259A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Hppd variants and methods of use
BR102016008417B1 (pt) * 2016-04-15 2023-02-28 Universidade Federal Do Rio Grande Do Sul Processo de controle seletivo de populações de artrópodes hematófagos usando inibidores das enzimas do metabolismo da tirosina
AU2017365169B2 (en) 2016-11-23 2022-07-21 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Axmi669 and Axmi991 toxin genes and methods for their use
WO2018119336A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Athenix Corp. Use of cry14 for the control of nematode pests
WO2018136611A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 Bayer Cropscience Lp Use of bp005 for the control of plant pathogens
CN110431234B (zh) 2017-01-18 2024-04-16 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 Bp005毒素基因及其使用方法
BR112019018056A2 (pt) * 2017-03-07 2020-08-11 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, métodos para conferir tolerância e para controlar ervas daninhas, produto de utilidade e uso da sequência de nucleotídeos
WO2019083810A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Basf Se IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS
BR112020008096A2 (pt) 2017-10-24 2020-11-03 Basf Se método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
GB201810047D0 (en) 2018-06-19 2018-08-01 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2020221312A1 (zh) * 2019-04-30 2020-11-05 山东舜丰生物科技有限公司 抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用
GB201910641D0 (en) 2019-07-25 2019-09-11 Syngenta Crop Protection Ag Improvments in or relating to organic compounds
BR112022004033A2 (pt) * 2019-09-05 2022-06-14 Plantarc Bio Ltd Composições e métodos para controlar o crescimento vegetal.
WO2021051265A1 (zh) * 2019-09-17 2021-03-25 北京大北农生物技术有限公司 突变的羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽、其编码基因及用途
AR120445A1 (es) 2019-11-15 2022-02-16 Syngenta Crop Protection Ag N-tetrazolil o n-1,3,4-oxadiazolil benzamidas como herbicidas
CN113249346B (zh) * 2020-02-07 2022-06-28 山东舜丰生物科技有限公司 抗除草剂多肽、核酸及其应用
EP4136080B1 (en) 2020-04-17 2024-04-24 Syngenta Crop Protection AG Herbicidal compounds
EP4250927A1 (en) * 2020-11-30 2023-10-04 Syngenta Crop Protection AG Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use thereof
AR124335A1 (es) 2020-12-18 2023-03-15 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos herbicidas
CN117222627A (zh) 2021-05-07 2023-12-12 先正达农作物保护股份公司 除草化合物
EP4337651A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 Syngenta Crop Protection AG Substituted benzamides as herbicides
GB202106945D0 (en) 2021-05-14 2021-06-30 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
WO2023280701A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
AU2022309104A1 (en) 2021-07-09 2023-12-07 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
AU2022306931A1 (en) 2021-07-09 2023-12-07 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
WO2023280697A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compositions
GB202115018D0 (en) 2021-10-20 2021-12-01 Syngenta Crop Protection Ag Improvements in or relating to organic compounds
CN114585731A (zh) * 2021-12-15 2022-06-03 北京大北农生物技术有限公司 突变的羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽、其编码基因及用途
WO2024017762A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
DK175922B1 (da) 1985-08-07 2005-07-04 Monsanto Technology Llc Glyphosat-resistente planter
DE3765449D1 (de) 1986-03-11 1990-11-15 Plant Genetic Systems Nv Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen.
US5024944A (en) 1986-08-04 1991-06-18 Lubrizol Genetics, Inc. Transformation, somatic embryogenesis and whole plant regeneration method for Glycine species
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
DE3629890A1 (de) 1986-08-29 1988-03-10 Schering Ag Mikroorganismen und plasmide fuer die 2,4-dichlorphenoxyessigsaeure (2,4-d)-monooxigenase - bildung und verfahren zur herstellung dieser plasmide und staemme
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
DE3856241T2 (de) 1987-05-20 1999-03-25 Novartis Ag Verfahren zur Herstellug von transgene Zea mays-Pflanzen, die aus Protoplasten oder aus von Protopflasten erhaltenen Zellen regeneriert wurden
ES2097746T3 (es) 1988-03-08 1997-04-16 Ciba Geigy Ag Regeneracion de plantas gramineas de la subfamilia pooideae partiendo de protoplastos.
DK0392225T3 (da) 1989-03-24 2003-09-22 Syngenta Participations Ag Sygdomsresistente transgene planter
US4940935A (en) 1989-08-28 1990-07-10 Ried Ashman Manufacturing Automatic SMD tester
US5212296A (en) 1989-09-11 1993-05-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Expression of herbicide metabolizing cytochromes
ES2187497T3 (es) 1990-04-12 2003-06-16 Syngenta Participations Ag Promotores preferentemente en tejidos.
WO1991016433A1 (en) 1990-04-26 1991-10-31 Plant Genetic Systems N.V. New bacillus thuringiensis strains and their genes encoding insecticidal toxins
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
ES2124738T3 (es) 1991-08-02 1999-02-16 Mycogen Corp Nuevo microorganismo e insecticida.
DE69230290T2 (de) 1991-08-27 2000-07-20 Novartis Ag Proteine mit insektiziden eigenschaften gegen homopteran insekten und ihre verwendung im pflanzenschutz
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
CA2124673C (en) 1991-12-04 2008-08-05 John Browse Fatty acid desaturase genes from plants
WO1993021335A2 (en) 1992-04-15 1993-10-28 Plant Genetic Systems, N.V. Transformation of monocot cells
US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
CA2149223C (en) 1992-11-17 2007-04-24 Jonathan Edward Lightner Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
EP0625006A4 (en) 1992-11-20 1996-04-24 Agracetus Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic.
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5981722A (en) 1995-11-20 1999-11-09 Board Of Regents For The University Of Oklahoma Trypsin inhibitors with insecticidal properties obtained from PENTACLETHRA MACROLOBA
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
WO1997032011A1 (en) 1996-02-28 1997-09-04 Novartis Ag Dna molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
EP0914447A1 (en) 1996-06-27 1999-05-12 E.I. Du Pont De Nemours And Company PLANT GENE FOR $i(P)-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE
CA2262002A1 (en) 1996-07-25 1998-02-05 American Cyanamid Company Hppd gene and inhibitors
US20030041357A1 (en) * 1996-11-07 2003-02-27 Zeneca Limited Herbicide resistant plants
WO1998020144A2 (en) 1996-11-07 1998-05-14 Zeneca Limited Herbicide resistant plants
US6232529B1 (en) 1996-11-20 2001-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels
CN1249779A (zh) 1997-03-07 2000-04-05 诺瓦提斯公司 细胞色素p450单加氧酶
BR9808825A (pt) 1997-03-07 2000-07-04 Novartis Ag Monooxigenases do citocromo p450
DE19730066A1 (de) 1997-07-14 1999-01-21 Basf Ag DNA-Sequenz codierend für eine Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase und deren Überproduktion in Pflanzen
JP2001516575A (ja) 1997-09-12 2001-10-02 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼイション 植物における遺伝子発現の調節
US6121512A (en) 1997-10-10 2000-09-19 North Carolina State University Cytochrome P-450 constructs and method of producing herbicide-resistant transgenic plants
US6245968B1 (en) * 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
FR2770854B1 (fr) 1997-11-07 2001-11-30 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un tel gene, tolerantes aux herbicides
NZ504511A (en) 1997-11-18 2002-12-20 Pioneer Hi Bred Int Recombinant proteins comprising fused first and second distinct site specific recombinase and use in methods for the integration of foreign DNA into eukaryotic genomes
PT1034262E (pt) 1997-11-18 2005-10-31 Pioneer Hi Bred Int Composicoes e metodos para a modificacao genetica de plantas
DE69841438D1 (de) 1997-11-18 2010-02-25 Pioneer Hi Bred Int Mobilisierung eines viralen genoms aus t-dna durch ortsspezifische rekombinationssysteme
AU1526199A (en) 1997-11-18 1999-06-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
ES2273127T3 (es) 1998-02-26 2007-05-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promotor alfa-tubulin 3-18 del maiz.
US6380465B1 (en) 1998-07-12 2002-04-30 University Of Kentucky Research Foundation Cytochrome P450 enzymes and related compounds and methods
WO2000009727A2 (en) 1998-08-12 2000-02-24 Maxygen, Inc. Dna shuffling to produce herbicide selective crops
AU2037700A (en) 1998-12-03 2000-06-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant vitamin e biosynthetic enzymes
US7071381B1 (en) 1998-12-03 2006-07-04 E. I. Du Pont De Nemours & Company Plant vitamin e biosynthetic enzymes
AU2848800A (en) 1999-01-14 2000-08-01 Monsanto Technology Llc Soybean transformation method
EP1887081A2 (en) 1999-02-25 2008-02-13 Ceres Incorporated DNA Sequences
US20090087878A9 (en) 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
US20100293669A2 (en) 1999-05-06 2010-11-18 Jingdong Liu Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US20070011783A1 (en) 1999-05-06 2007-01-11 Jingdong Liu Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US20040031072A1 (en) 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
AU1803601A (en) 1999-11-29 2001-06-04 Midwest Oilseeds, Inc. Methods and compositions for the introduction of molecules into cells
IL151886A (en) * 2000-03-27 2010-11-30 Syngenta Participations Ag Promoters of a virus that causes curling of a yellow leaf of a cyst
US20110131679A2 (en) 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US20040181830A1 (en) 2001-05-07 2004-09-16 Kovalic David K. Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
US6768044B1 (en) 2000-05-10 2004-07-27 Bayer Cropscience Sa Chimeric hydroxyl-phenyl pyruvate dioxygenase, DNA sequence and method for obtaining plants containing such a gene, with herbicide tolerance
DE10046462A1 (de) 2000-09-19 2002-05-29 Sungene Gmbh & Co Kgaa Verbesserte Verfahren zur Vitamin E Biosynthese
US7169970B2 (en) * 2000-09-29 2007-01-30 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
EP2287292B1 (en) 2000-12-07 2015-04-08 Syngenta Limited Plant derived hydroxy phenyl pyruvate dioxygneases (hppd) resistant against triketone herbicides and transgenic plants containing these dioxygenases
US20040034889A1 (en) * 2002-06-22 2004-02-19 Syngenta Participations Ag Method of transforming soybean
JP2004149392A (ja) 2002-11-01 2004-05-27 Nippon Sanso Corp 一酸化炭素の精製方法
FR2848064B1 (fr) 2002-12-06 2006-01-13 Bayer Cropscience Sa Plantes legumineuses transplastomiques fertiles
US7297541B2 (en) 2004-01-26 2007-11-20 Monsanto Technology Llc Genes encoding 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) enzymes for plant metabolic engineering
BRPI0508518A (pt) * 2004-03-08 2007-08-14 Syngenta Participations Ag proteìna e promotor de semente de milho rica em glutamina
US20060260011A1 (en) 2005-03-28 2006-11-16 Syngenta Participations Ag Methods and genetic constructs for modification of lignin composition of corn cobs
US7405074B2 (en) 2004-04-29 2008-07-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate-N-acetyltransferase (GAT) genes
US8216975B2 (en) 2004-04-29 2012-07-10 Syngenta Crop Protection Inc Method of labelling soya varieties
EP1900817B1 (en) 2005-06-28 2012-12-05 Zhejiang University A bentazon and sulfonylurea herbicide-resistant gene cyp81a6 of rice
NZ567807A (en) 2005-10-28 2011-09-30 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide (2,4-D and pyridyloxyacetate) resistance genes with aryloxyalkanoage dioxygenase activity
US20080229447A1 (en) 2007-03-12 2008-09-18 Syngenta Participations Ag Transformation of immature soybean seeds through organogenesis
WO2008141154A2 (en) 2007-05-09 2008-11-20 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
EP2164320A4 (en) * 2007-05-30 2010-08-11 Syngenta Participations Ag CYCTOCHROM P450 GENES TRANSFERRING HERBICIDE RESISTANCE
CA2724670C (en) 2008-04-14 2017-01-31 Bayer Bioscience N.V. New mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, dna sequence and isolation of plants which are tolerant to hppd inhibitor herbicides
GB0816880D0 (en) 2008-09-15 2008-10-22 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
CN101586108B (zh) * 2008-11-27 2011-04-06 上海交通大学 生菜hppd蛋白编码序列
US9347046B2 (en) 2009-01-22 2016-05-24 Syngenta Participations Ag Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
EP2389442A4 (en) * 2009-01-22 2012-07-04 Syngenta Participations Ag MUTANT HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE
US20130053243A1 (en) 2010-05-04 2013-02-28 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides

Also Published As

Publication number Publication date
EP2451946A1 (en) 2012-05-16
CL2013002839A1 (es) 2014-05-30
CN102725402A (zh) 2012-10-10
CL2011001763A1 (es) 2012-06-01
CN102725402B (zh) 2016-02-03
WO2011068567A1 (en) 2011-06-09
EP2451946B1 (en) 2015-10-14
US20110023180A1 (en) 2011-01-27
US10053675B2 (en) 2018-08-21
AU2010326672A1 (en) 2011-08-04
US20160222360A1 (en) 2016-08-04
CA2749383A1 (en) 2011-06-09
ES2555386T3 (es) 2015-12-30
EP2451946B2 (en) 2018-08-29
US9347046B2 (en) 2016-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2555386T5 (es) Nuevos polipéptidos de hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, y métodos de uso
ES2727575T3 (es) Polipéptidos de Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa mutantes, y Métodos de uso
ES2262514T3 (es) Plantas resistentes a herbicidas.
ES2406809T5 (es) Nuevos genes de resistencia a los herbicidas
JP2003528571A6 (ja) 除草剤抵抗性植物
PT1029059E (pt) Hidróxi-fenil piruvato dioxigenase mutada, sequência de adn e obtenção de plantas contendo este gene tolerante aos herbicidas
SK161597A3 (en) Dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides
RU2628504C2 (ru) Способы повышения урожайности резистентных к 2,4-d сельскохозяйственных культур
US9175305B2 (en) Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CN111334484B (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
CA3199040A1 (en) Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use thereof