CN102725402A - 新颖的羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了新颖的羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)多肽、变体及其片段，连同编码能够向植物赋予商业水平的赋予HPPD除草剂抗性或耐受性的多肽、变体及其片段的多核苷酸。提供了包括对于HPPD多肽的氨基酸序列、以及它们的变体和片段，连同编码它们的多核苷酸。还提供了用于生产和使用表达这些新颖的HPPD多肽的HPPD除草剂抗性植物的方法、用于在作物场所的大田中选择性地控制杂草的方法、以及用于测定、表征、鉴定和选择这些新颖的HPPD的方法。

Description

新颖的羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法

相关申请的交叉引用 

在此要求对于2010年1月22日提交的美国专利申请号12/692,552、2009年7月10号提交的美国临时申请号61/224,661、以及对于2009年1月22号提交的美国临时申请号61/146,513的优先权，将它们每一个通过引用以其全文结合在此。 

发明的技术领域 

本发明涉及向植物赋予除草剂抗性或耐受性的新颖的羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)多肽以及编码它们的核酸序列。本发明的方法涉及表达这些突变体HPPD多肽并且对于HPPD除草剂具有抗性的植物的产生和用途。 

发明背景 

羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)是催化对羟基苯丙酮酸(HPP)被转化成尿黑酸盐的反应的酶。这个反应在酶结合的铁(Fe²⁺)和氧的存在下发生。通过抑制HPPD而起作用的除草剂是熟知的，并且包括异噁唑类、二酮腈类、三酮类、以及吡唑啉盐类(pyrazolinate)(Hawkes “Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase(HPPD)-The Herbicide Target.”In Modern Crop Protection Compounds.Eds. and Schirmer.Weinheim，Germany：Wiley-VCH，2007.Ch.4.2，pp.211-220)。HPPD的抑制作用阻断了从酪氨酸生物合成质体醌(PQ)。PQ在类胡萝卜素色素的生物合成中是一种必需的辅因子，这些类胡萝卜素色素对于光合中心的光防护是必需的。抑制HPPD的除草剂是韧皮部可移动的漂白剂，它们引起暴露于光的新的分生组织和叶子显现出白色。在缺乏类胡萝卜素下，叶绿素是光破坏性的并且通过单线态氧的光生作用而自身变成一种光化裂解剂。 

用于提供耐受HPPD除草剂的植物的方法同样是已知的。这些方法包括：1)将HPPD酶过量表达从而在植物中产生大量的HPPD酶，这些HPPD 酶与一种给定的除草剂是充分有关的从而具有足够的可供使用的用于植物茁壮成长的功能性酶(尽管存在该除草剂)；并且2)将一种特定的HPPD酶突变成一种对于通过除草剂的抑制是较不敏感的酶。已经描述了为了改进HPPD除草剂耐受性的用于突变HPPD酶的方法(参见，例如，PCT申请号WO 99/24585和WO 2009/144079)，并且植物HPPD酶的一些特定的突变(例如，拟南芥属HPPD序列中的G422的突变)据称能够提供对于甲基磺草酮和其他三酮除草剂的一定量度的耐受性。然而，迄今所报道的酶动力学的和完整的植物数据不足以推定所报道的突变是否向相应的野生型酶赋予了商业上重要的益处。 

此外，虽然一种特定的突变体HPPD酶可以提供一个有用水平的对于一些HPPD抑制剂除草剂的耐受性，相同的HPPD可能相当不足以提供商业水平的对于一种不同的、更希望的HPPD抑制剂除草剂的耐受性(参见，例如，美国专利申请公开号20040058427；PCT公开号WO 98/20144和WO 02/46387；还参见美国专利申请公开号20050246800，它涉及作为相对耐受HPPD的大豆品种的鉴定和标记)。而且，还有待报道来自具有改进的对三酮类型除草剂的抗性的冷气候禾本科植物(cool-climate grass)的HPPD的突变形式。此类突变体将是非常令人希望的，这是由于来自冷气候禾本科植物的HPPD优于其他类型(参见，例如，PCT申请号WO 02/46387和Hawkes et al.2001 in Proc.Brit.Crop Prot.Conf.Weeds 2，563)。因此，需要用于向不同的作物和作物品种赋予商业水平的HPPD除草剂耐受性的新的方法和组合物。 

发明概述 

在此提供了用于向植物赋予羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)除草剂抗性或耐受性的组合物和方法。这些组合物包括对于HPPD多肽的核苷酸和氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的这些多肽是新颖的HPPD，这些新颖HPPD来自于植物并且当在其他植物中异源表达时赋予对于某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性。在具体的实施方案中，这些HPPD多肽包括在SEQ ID NOs：2-12中列出的、特别是在SEQ ID NOs：2-8中列出的氨基酸序列，以及具有与展示出HPPD酶活性的SEQ ID NOs：2-12至少大 约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％的序列同一性的多肽。 

优选的新颖的HPPD同样是与现有技术的HPPD酶相比展示出对于一种或多种类型的HPPD除草剂的优越的耐受性并且其中耐受性是在体外由参数(k_off X k_cat/K_m HPP)的数值来表征的那些，其中k_off是决定HPPD酶与除草剂的复合体的解离速率的速率常数并且k_cat/K_m HPP是催化转化数除以对于底物HPP(4-羟苯基丙酮酸)的K_m值。 

在本发明的一个另外的实施方案中，因此还提供了一种用于表征和选择赋予优越水平的对于HPPD除草剂的耐受性的HPPD的体外方法，这种方法是基于测量并且比较k_cat/K_m HPP和k_off值或这些参数的功能性等同物。 

在另外的实施方案中，本发明的这些多肽是从植物得到的催化上具有活性的突变体HPPD，并且这些多肽相对于相似的未突变酶赋予了优越水平的对某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性。在具体的实施方案中，这些突变体HPPD多肽包括选自SEQ ID NOs：15-19的一种或多种氨基酸序列，其中SEQ ID NOs：15-19具有如以下所述的一个或多个氨基酸置换： 

关于序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)(SEQ ID NO：15)，第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸、特别是被E、D、G、C、N、Q、S、以及A并且更特别是被E、C、A以及D替换。 

关于序列G(I，V)LVD(R，K)(SEQ ID NO：16)，其中L被任何其它的氨基酸、特别是被M、F、Y、I、A、W、以及V并且更特别是被M所代替。 

关于序列DH(V，I，M)VGN(SEQ ID NO：17)，第一个V、I或M被任何其它的氨基酸、特别是被L、A以及I并且更特别是被L和I所代替。 

关于序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)(SEQ ID NO：18)，A或P被任何其它的氨基酸、特别是被R、K、H、N、I、L、T、S以及Q、并且更特别是被R、I、L、H以及K代替。 

关于序列CGGFGKGN(SEQ ID NO：19)，第二个G或K被任何其它的氨基酸所代替。在某些实施方案中，第二个G被R、K、H、E、D、N、Q、A、S、T并且更具体地被R、S、T、H以及K所代替。在其它的实施方案中，K被S和T、并且更具体地被T所代替。 

在一些实施方案中，这些多肽是单个的、双重的、三重的、四重的、五重的或六重的突变体HPPD，它们以不同的排列组合了多于一个以上的突变 体(例如，2+3、2+4、2+1；3+4、3+1；4+1；3+4+1、2+3+4、2+4+1、2+3+1；2+3+4+1；1+2+3+4+5等)。 

在另外的实施方案中，该突变体HPPD是来自一种单子叶植物并且特别是来自一种冷气候禾本科植物种类如小麦、大麦、燕麦或黑麦。在具体的实施方案中，该突变体HPPD是来自黑麦草属(Lolium)、燕麦属(Avena)、早熟禾属(Poa)、看麦娘属(Alopecurus)或高粱属种类(Sorghum)，并且更具体地，是来自SEQ ID NOs：1-8的HPPD多肽中的一种或多种。 

根据本发明的示例性HPPD多肽和突变体HPPD多肽相应于在SEQ ID NOs：2-8、20-41、49以及50中所列出的氨基酸序列，及其变体和片段。进一步提供了包括编码本发明的这些特定的突变体HPPD多肽的多核苷酸序列的核酸分子，例如SEQ ID NOs：53-82、84以及85。组合物还包括表达盒，该表达盒包括可操作地连接到编码本发明的HPPD多肽的一个核苷酸序列上的启动子，该表达盒是单独的或与一种或多种另外的编码赋予所希望的性状的多肽的核酸分子进行组合。进一步提供了包括本发明的一种表达盒的转化的植物、植物细胞、以及种子。 

在针对向植物赋予除草剂抗性或耐受性、特别是对某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性的方法中，本发明的这些组合物是有用的。在具体的实施方案中，这些方法包括向植物中引入至少一种表达盒，该表达盒包括可操作地连接到编码本发明的HPPD多肽的核苷酸序列上的启动子。其结果是，该HPPD多肽被表达于该植物中，并且由于该HPPD是基于这个基础选择的，即对于抑制HPPD的除草剂是较不敏感的，这导致了该植物展示出对于抑制HPPD的除草剂的基本上基本上改进的抗性或耐受性。 

本发明的方法还包括选择性地控制在一个作物场所的大田中的杂草。在一个实施方案中，此类方法涉及在一个作物场所的大田中过多的苗前或苗后施用杂草控制量的HPPD除草剂，该作物场所含有表达本发明的HPPD多肽的植物。在其他实施方案中，还提供了用于测定、表征、鉴定、以及选择本发明的突变体HPPD的方法。 

附图的若干视图的简要概述 

图1描述了来自燕麦属的HPPD多肽(对应于在SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列)的K_m和V_max测定的数据。 

图2描述了在冰温下来自抑制剂交换实验的数据以确定解离速率(k_off)值，该解离速率(k_off)值决定了结构B(甲基磺草酮)与HPPD多肽的复合体的解离，该HPPD多肽相应于A)SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列以及B)SEQ ID NO：41中列出的氨基酸序列。 

图3显示了用于大豆转化的二元载体17900的图示，用编码SEQ ID NO：49的一种双子叶植物密码子优化的燕麦HPPD基因赋予了HPPD抗性。对于草丁膦选择，这种二元载体还包含双重PAT选择标记。 

图4显示了用于大豆转化的二元载体17901的图示，用编码SEQ ID NO：50的一种双子叶植物密码子优化的燕麦HPPD基因赋予了HPPD抗性并且还赋予了对草甘磷的耐受性(选择标记)。 

发明详细说明 

本发明提供了针对向植物赋予羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)除草剂抗性或耐受性的组合物和方法。组合物包括对于具有HPPD酶活性的天然和突变体HPPD多肽的氨基酸序列，及其变体和片段。还提供了编码本发明的突变体HPPD多肽的核酸。进一步提供了用于向植物赋予除草剂抗性或耐受性、特别是对某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性的方法。还提供了用于在一个作物场所的大田中选择性地控制杂草以及用于测定、表征、鉴定和选择提供了除草剂耐受性的本发明的突变体HPPD的方法。 

在本发明的上下文中，术语羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-HPPD)以及对羟基苯丙酮酸双加氧酶(p-HPPD)是同义的。 

“HPPD除草剂”是漂白剂的除草剂，并且它们的主要作用位点是HPPD。许多是熟知的并且在此别处被描述并且在文献(Hawkes“Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase(HPPD)-The Herbicide Target.”In Modern Crop Protection Compounds.Eds. 

and Schirmer.Weinheim，Germany：Wiley-VCH，2007.Ch.4.2，pp.211-220；Edmunds“Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase(HPPD)Inhibitors：Triketones.”In Modern Crop Protection Compounds.Eds. 

and Schirmer.Weinheim，Germany：Wiley-VCH，2007.Ch.4.2，pp.221-242)中。如在此所使用的，术语“HPPD除草剂”是指直接或间接地抑制HPPD的除草剂，其中这些除草剂 是漂白剂，并且其中HPPD的抑制是除草剂的对于植物的作用模式的至少一部分。 

如在此所使用的，当与由类似经受的非耐受样植物所展示的进行比较时，基本上基本上“耐受”一种除草剂的植物当用所述除草剂进行处理时展示出一个移到右边的剂量/反应曲线。此类剂量/反应曲线具有标绘在x轴上的“剂量”以及标绘在y轴上的“杀死或破坏百分比”、“除草效果”等。为了产生一种给定的除草效果，耐受性植物典型地需要非耐受样植物的差不多至少两倍的除草剂。当经受典型地被农业社会采用的为了杀死大田中的杂草的浓度和速率的除草剂时，基本上“低抗”除草剂的植物展示出很少的(如果有的话)坏死、溶解、萎黄病或其他损伤或至少没有一个在产量上有显著影响。 

如在此所使用的，“非转基因样植物”是与转基因植物类似或相同的但是不包含赋予除草剂抗性的转基因的植物。 

如在此所使用的，术语“赋予”是指向植物提供一种特征或性状，如除草剂耐受性或抗性和/或其他所希望的性状。 

如在此别处所使用的，术语“异源的”是指来自另一个来源。在DNA的背景下，“异源的”是指任何外来的“非自身”DNA，包括来自相同种类的另一个植物的DNA。例如，在本申请中，转基因地表达回到大豆植物中的大豆HPPD基因将仍被描述为“异源的”DNA。 

在此使用的冠词“一种”和“一个”是指一个或多于一个(即，至少一个)的该冠词的合乎语法的对象。作为举例，“要素”，“要素”(“元件”)表示一种或多种要素。贯穿本说明书，单词“包括”或其变体例如“包括了”或“包括”应被理解为是指包括一种所述要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤，但是不排除任何其他要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤。 

在此定义了或另外表征了许多种额外的术语。 

HPPD序列 

本发明的这些组合物包括分离的或基本上纯化的天然的和突变体HPPD多核苷酸以及多肽连同包括HPPD多核苷酸的宿主细胞。确切地，本发明提供了HPPD多肽，这些突变体HPPD多肽具有HPPD酶活性并且在植物中赋予对于某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性，以及它们变体和片段。还提供了编码本发明的天然的和突变体HPPD多肽的核酸。 

本发明的突变体HPPD多肽相对于它们从其衍生的初始野生型序列在一个或多个位置处具有氨基酸变化，并且展示出对于一种或多种HPPD抑制剂除草剂的增强的耐受性。相对于同样的未突变的初始酶，展示出对于一种HPPD除草剂的增强的耐受性的HPPD酶可以如此实行，因为这些HPPD酶展示出： 

a)对于自然底物(4-羟基苯丙酮酸)较低的K_m值； 

b)对于将4-羟基苯丙酮酸转化成尿黑酸盐的较高的k_cat值； 

c)较低的表观速率常数值k_on，它管理形成一种酶：HPPD抑制剂除草剂复合体； 

d)增加的速率常数值k_off，它管理解离一种酶：HPPD抑制剂除草剂复合体；和/或 

e)由于c)和d)中的一个或两者的变化，增加的平衡常数值K_i(也称为K_d)，它管理解离酶：HPPD抑制剂除草剂复合体。编码此类改进的突变的HPPD的DNA序列用于提供本发明的HPPD植物、作物、植物细胞以及种子，它们相比于同样表达未突变的初始酶的同样的植物提供了对于一种或多种HPPD除草剂的增强的耐受性或抗性。 

在此发现，在k_off值方面的增加是在改进一种HPPD的赋予HPPD除草剂抗性的能力方面的特定值，然而，在25℃下至少在高于5000s^-1M^-1的范围内在k_on方面的改变具有相对小的影响。所以，例如，化合物B和C展示出类似的关于SEQ ID NO：1的HPPD的K_d值，但是关于B和C，k_off值大约10倍差别。因此，表达SEQ ID NO：1的HPPD的转基因植物对化合物B展示出比对化合物C更优越的抗性。 

因此优选的HPPD是如选择的与其他HPPD酶相比展示出对于一种或多种类型的HPPD除草剂的优越的耐受性并且其中耐受性使在体外由参数(k_offx k_cat/K_m HPP)的数值来表征的那些，并且其中k_off是决定HPPD酶与除草剂的复合体的解离速率的速率常数，并且k_cat/K_m HPP是催化转化数除以对于底物HPP(4-羟苯基丙酮酸)的K_m值。 

因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于表征并且选择赋予优越水平的对HPPD除草剂的耐受性的HPPD的体外方法，这种方法是基于测量并且比较这些k_cat/K_m HPP和k_off值或这些参数的功能性等同物。 

选择编码HPPD的基因的定点突变从而编码选自那些在此列出的氨基酸变化(单独地或优选组合地)。编码此类突变形式的HPPD的基因对于制造抵抗抑制HPPD的除草剂的作物植物是有用的。如此修饰的HPPD基因特别适合用在转基因植物中，以便向作物植物赋予除草剂耐受性或抗性。在一个优选的实施方案中，这些HPPD从植物中得到。 

许多HPPD序列在本领域中是已知的并且通过进行相应于那些在此所述的氨基酸置换可以用来产生突变体HPPD序列。例如，可以检查一种已知的或怀疑的HPPD序列的氨基酸基序SEQ ID NOs：15-19的存在以及所进行的在此描述的相应变化。可替代地，在不从植物得到HPPD的情况下，可以基于序列排队以及对于在此指定的基序的相似性来进行对于在此所指示的等效变化。可替代地，有待通过突变而改进的序列可以使用标准的序列比对工具与例如SEQ ID NO：1进行比对，并且可以在参比序列中在相应的位置处进行在此所述的关于SEQ ID NO：1的相应的氨基酸置换。 

在具体的实施方案中，本发明的这些组合物包括一种突变体HPPD多肽，该突变体HPPD多肽与SEQ ID NO：1(燕麦的HPPD氨基酸序列)或与SEQ ID NO：2、或与SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：4或与SEQ ID NO：5或与SEQ ID NO：6或与SEQ ID NO：7或与SEQ ID NO：8具有至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，其中该多肽具有HPPD酶活性，并且其中该多肽包含相应于在表1的第1栏中列出的氨基酸位置的一个或多个置换。 

表1.示例性的HPPD突变 

关于SEQ IDNO：1的易突变氨基酸位置	置换或添加
		217	A、I、L
326	R、K、H、N、I、L、T、S、Q
		339	E、D、G、C、N、Q、S、A、L
358	M、F、Y、I、A、W、V
		408	R、K、H、E、D、N、Q、A、S、T
411	S、T

在不同的实施方案中，在第1栏中列出的一个或多个位置处的一个氨基酸被任何其它的氨基酸所代替。在另一个实施方案中，该多肽包括一个或多个氨基酸置换、添加、或缺失，相应于在表1的第2栏中列出的一个或多个氨基酸置换或添加。在又另一个实施方案中，该多肽包括一个或多个置换，相应于在表2的第1栏中列出的氨基酸的保守性变体。 

例如，该多肽可以包括相应于SEQ ID NO：1的氨基酸位置339的一种突变，其中该氨基酸被谷氨酸或谷氨酸的保守置换所代替。 

在具体的实施方案中，本发明的突变体HPPD多肽的氨基酸序列是选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NOs：20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、31、33、34、35、36、37、38、39、40、41、49以及50。 

术语“多肽”、“肽”、以及“蛋白”在此可互换地使用，指的是氨基酸残基的聚合物。这些术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然发生的氨基酸以及天然发生的氨基酸聚合物的一种人工化学类似物。本发明的多肽可以从一种在此披露的核酸或通过使用标准分子生物学技术来产生。例如，本发明的一种截短的蛋白可以通过在一种适当的宿主细胞中表达本发明的一种重组核酸或可替代地通过组合体外步骤(如蛋白酶消化和纯化)来产生。 

因此，本发明还提供了包括编码突变体HPPD多肽的多核苷酸序列的核酸分子，这些突变体HPPD多肽具有HPPD酶活性并且在植物中赋予对于某些类别的抑制HPPD的除草剂的抗性或耐受性，以及它们的变体和片段。总体上，本发明包括编码在此所述的任何突变体HPPD多肽的任何多核苷酸序列，连同编码相对于在此所述的突变体HHPD多肽具有一个或多个保守性氨基酸置换的HPPD多肽的任何多核苷酸序列。提供功能上相似的氨基酸的保守性置换表在本领域中是所熟知的。以下五组各自包含彼此保守性置换的氨基酸：脂肪族的：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳香族的：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性的：精氨酸I、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性的：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码一种与SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7或8具有至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的氨基酸序列，其中该HPPD氨基酸序列来自一种植物，其中该多肽具有HPPD酶活性，并且其中该多肽包含如以下所讨论的一个或多个置换、添加、或缺失。 

在另一个实施方案中，本发明提供了一种选自下组的多核苷酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NOs：50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、84以及85。 

如在此所使用的，“核酸”包括引用一种处于单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非被另外限制，包括已知的具有天然核苷酸的重要性质的类似物(例如肽核酸)，因为它们以一种类似于天然发生的核苷酸的方式杂交到单链核酸上。 

如在此所述的，术语“编码”或“编码的”当用在一种指定的核酸的背景下时是指该核酸包括必需的信息从而将该核苷酸序列直接翻译成一种特定的蛋白质。用来编码一种蛋白质的信息通过密码子的使用而详细说明。一种编码蛋白质的核酸在该核酸的翻译区域之内可以包括非翻译序列(例如，内含子)或可以缺乏此类插入的非翻译序列(例如，在cDNA中)。 

本发明包括分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。一种“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质、或它的生物学活性部分是基本上或基本上不含通常与该多核苷酸或蛋白质相伴随的或相互作用的组分(如在它的天然发生环境中所发现的)。因此，一种分离或纯化的多核苷酸或蛋白质当通过重组技术产生时是基本上不含其他细胞物质或培养基的，或当用化学方法合成时是基本上不含化学前体或其他化学品的。最佳地，一种“分离的”多核苷酸不含天然地在多核苷酸从其衍生的生物的基因组DNA中的多核苷酸的侧翼(即位于多核苷酸的5′和3′端)的序列(最佳地蛋白质编码序列)。例如，在不同的实施方案中，分离的多核苷酸可以包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、或0.1kb的天然地在多核苷酸从其衍生的细胞的基因组DNA中的多核苷酸的侧翼的核苷酸序列。基本上不含干涉酶活性的并且能够关于其催化、动力学的和分子特性进行表征的一种蛋白质包括：具有小于 大约98％、95％、90％、80％、70％、60％或50％(按干重计)的污染蛋白的相当粗制的蛋白制品(例如重组地产生在细胞提取物中)以及通过本领域中已知的方法进一步进行纯化以具有40％、30％、20％、10％、5％、或1％(按干重计)的污染蛋白的制品。 

本发明的这些蛋白质能够以不同的方式进行改变，包括氨基酸置换、缺失、截短、以及插入。用于这样的操作的方法在本领域中是通常是已知的。例如，突变体HPPD蛋白的氨基酸序列变体和片段可以通过在DNA中的突变来制备。用于诱变和多核苷酸修改的方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154：367-382；美国专利号4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan出版公司，纽约)以及其中引用的参考文献。关于通常不影响感兴趣的蛋白质的生物活性的适当的氨基酸置换的指导可以发现于Dayhoff et al.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，华盛顿)的模型中。保守置换(如将一个氨基酸用具有相似特性的另一个氨基酸进行代换)可能是最佳的。 

本发明的这些多核苷酸还可以用来从其他生物特别是其他植物中分离出相应的序列。以这种方式，如PCR、杂交等方法可以用来鉴定此类序列(基于它们与在此列出的序列的序列同源性)。 

在一种PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于在PCR反应中从感兴趣的任何植物提取出的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中通常是已知的。参见，例如，Sambrook et al.(1989)Molecular Clonmg：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。还参见Innis et al.，eds.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，New York)；Innis and Gelfand，eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press，New York)；以及Innis and Gelfand，eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，New York)。 

在杂交技术中，一种已知的多核苷酸的全部或部分被用作一种探针，该探针选择性地杂交到存在于来自一种选择的生物的一组克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组文库或cDNA文库)中的其他相应的多 核苷酸上。这些杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以被标记有一种可检出的基团如³²P或任何其他可检出的标记。用于制备用于杂交作用的探针以及用于构建cDNA和基因组文库的方法在本领域中通常是已知的并且披露于Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2^nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。 

对于“杂交到”或“特异性杂交到”是指一种分子在严谨条件下仅可与一种特定的核苷酸序列结合、双链化(duplexing)或杂交，这是在该序列存在于一种复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时进行的。“基本上基本上结合”是指在一种探针核酸与一种靶标核酸之间的互补性杂交，并且包含了少量错配，这些错配可以通过降低该杂交介质的严谨性来调节，从而实现所希望的目标核酸序列的检测。 

在核酸杂交实验的背景下(例如，Southern及Northern杂交)的“严谨杂交条件”和“严谨杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异地杂交。对核酸杂交的一种广泛指导发现于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″Elsevier，New York。通常，对于在一个限定的离子强度和pH下的特异序列，高严谨杂交和洗涤条件被选择为比热融点(T_m)大约低5℃。典型地，在“严谨条件”下，一种探针将会与它的目标子序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。 

T_m是50％的目标序列与一种完全匹配的探针进行杂交所处的温度(在限定的离子强度及pH下)。极度严谨条件被选择为等于对于一种特定探针的T_m。对于互补核酸(它们在Southern或Northern印迹中在滤器上具有超过100个互补的残基)的杂交的严谨杂交条件的一个实例是在42℃下、具有1mg肝素的50％甲酰胺、将杂交进行过夜。高严谨性洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72℃下持续约15分钟。严谨洗涤条件的一个实例是在65℃下，0.2X SSC洗涤持续15分钟(参见，Sambrook，以下，对于SSC缓冲剂的说明)。通常，一种高严谨洗涤之前会先进行一种低严谨洗涤，以便去除背景探针信号。对于一个例如多于100个核苷酸的双链体的实例性中 等严谨性洗涤是1X SSC，在45℃持续15分钟。对于一种例如超过100个核苷酸的双链体(duplex)的低严谨洗涤的一个实例是在40℃下的4-6X SSC持续15分钟。对于短探针(例如，大约10至50个核苷酸)，严谨条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7.0至8.3下，大约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐类)，并且该温度典型地是至少约30℃。通过加入去稳定剂例如甲酰胺也可以实现严谨条件。通常，在特定的杂交测定中对于不相关探针观察到高2倍(或更高)的信噪比，表明检测到特异杂交。如果它们所编码的蛋白是基本上完全相同的，这些在严谨条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本上完全相同的。例如，当使用该遗传密码允许的最大程度的密码简并而生成核酸的拷贝时，则发生这种情况。 

以下是可以用来克隆核苷酸序列(这些序列与本发明的参比核苷酸序列是同源物)的杂交/洗涤条件的设置的例子：一种参比核苷酸序列优选地与在以下条件下的参比核苷酸序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄、1mM EDTA中在50℃下，并且在2X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中在50℃下，并且在1X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，仍然更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中在50℃下，并且在0.5X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中在50℃下，并且在0.1X SSC、0.1％SDS中在50℃下洗涤，更优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中在50℃下，并且在0.1X SSC、0.1％ SDS中在65℃下洗涤。 

所披露的核苷酸序列的片段和变体以及由此所编码的蛋白质也被涵盖在本发明中。″片段″意指一部分的核苷酸序列或一部分的氨基酸序列以及因此由此编码的蛋白。一种核苷酸序列的片段可以编码保留了突变体HPPD蛋白的生物活性并且因此具有HPPD酶活性的蛋白片段。可替代地，作为杂交探针或在诱变以及改组反应(为了产生仍进一步的HPPD变体)中有用的一种核苷酸序列的片段通常并不编码保留了生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可以在从编码本发明的多肽的至少大约20个核苷酸、大约50个核苷酸、大约100个核苷酸、以及高达全长核苷酸序列的范围内变化。 

编码本发明的突变体HPPD蛋白的生物活性部分的核苷酸序列的片段将编码至少15、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、180、200、250、300、350个连续的氨基酸，或高达存在于本发明的全长突变体HPPD多肽中的总数目的氨基酸。作为杂交探针或PCR引物有用的核苷酸序列的片段通常不需要编码HPPD蛋白的生物活性部分。 

如在此所使用的，在引用一种特定的多核苷酸时，“全长序列″是指具有一种天然或突变的HPPD序列的整个核酸序列。“天然序列″意指一种内源序列，即，在生物体的基因组中发现的一种非工程化的序列。 

因此，本发明的核苷酸序列的片段可以编码突变体HPPD的生物活性部分，或它可以是片段，该片段可以用作杂交探针等或PCR引物(使用以下披露的方法)。突变体HPPD多肽的生物活性部分可以通过分离本发明的这些核苷酸序列之一的部分、表达所编码的突变体HPPD蛋白的部分(例如，通过体外重组表达)、并且评价所编码的突变体HPPD蛋白的部分的活性来制备。是本发明的一种核苷酸序列的片段的核酸分子包括至少15、20、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、或1300个连续的核苷酸，或高达存在于在此披露的全长核苷酸序列中的数目的核苷酸。 

“变体”意指基本上基本上类似的序列。对于多核苷酸，一种变体包括在参比多核苷酸之内的或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或在突变体HPPD多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。如在此所使用的，“参比”多核苷酸或多肽对应地包括突变体HPPD核苷酸序列或氨基酸序列。如在此所使用的，“天然”多核苷酸或多肽对应地包括天然发生的核苷酸序列或氨基酸序列。本领域的普通技术人员将认识到本发明的这些核酸的变体将被如此构建从而使得开放阅读框得以维持。对于多核苷酸，保守性变体包括编码本发明的这些突变体HPPD多肽之一的氨基酸序列的那些序列(由于遗传密码的简并性)。如这些天然发生的等位基因变体可以使用熟知的分子生物学技术、例如使用以下概述的聚合酶链式反应(PCR)以及杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，像例如通过使用定点诱变产生的但是仍然编码本发明的一种突变体HPPD蛋白的那些。通常，本发明的一种特定的多核苷酸的变体将具有与该特定的多核苷酸至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如通过在此别处所述的序列比对程序和参数所确定的。 

本发明的特定多核苷酸(即参比多核苷酸)的变体还可以通过比较由一个变体多核苷酸编码的多肽与由该参比多核苷酸编码的多肽之间的百分比序列同一性来评价。因此，例如，披露了编码了一种多肽的多核苷酸，该多肽与SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、49以及50的多肽具有一个给定百分比的序列同一性。在任何两个多肽之间的百分比序列同一性可以使用在此别处描述的序列比对程序和参数来计算。其中本发明的任何给定的多核苷酸对是通过比较它们编码的两个多肽共有的百分比序列同一性来评价的，在两个被编码的多肽之间的百分比序列同一性是跨过在此所述的HPPD序列的全部的至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。 

“变体”蛋白意指从一种参比蛋白通过在该突变体HPPD蛋白中的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失或添加和/或在该突变体HPPD蛋白中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的置换而衍生的一种蛋白质。由本发明涵盖的变体蛋白是生物学活性的，即它们继续具有突变体HPPD蛋白的所希望的生物活性，即，如在此所述的HPPD酶活性和/或除草剂耐受性。此类变体可以产生于例如遗传多态性或产生于人的操作。本发明的一种突变体HPPD蛋白的生物活性变体将具有与该突变体HPPD蛋白跨过该突变体HPPD蛋白的氨基酸序列的全部的至少大约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如通过在此别处所述的序列比对程序和参数所确定的。本发明的一种蛋白质的一种生物活性变体可能不同于以少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个(如6-10个)、少至5个(如4、3、2个、或甚至1个)氨基酸残基的蛋白质。 

用于比较的序列比对方法在本领域中是所熟知的并且可以使用数学算法来完成，这些数学算法如Myers and Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法；以及Karlin and  Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，如在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中的修改。对于序列比较可以利用这些数学算法的电脑实现方式以确定序列同一性。此类实现方式包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(从Intelligenetics，Mountain View，California可获得)；ALIGN程序(版本2.0)以及GCG Wisconsin Genetics Software Package版本10中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、以及TFASTA(从Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，California，USA可获得)。 

基因叠加 

在某些实施方案中，本发明的编码天然或突变体HPPD多肽或它们的保留了HPPD酶活性的变体的这些多核苷酸(例如编码了选自下组的一个氨基酸序列的核苷酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、49以及50)可以与任何感兴趣的多核苷酸序列的组合进行叠加从而产生具有一种所希望的性状的植物。如在此所使用的一种性状是指从一个特定的序列或序列组得到的表型。例如，编码突变体HPPD多肽或它们的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸可以与任何其它的编码赋予一种所希望的性状的多肽的多核苷酸进行叠加，这些性状包括但不局限于：对于疾病、昆虫、以及除草剂的抗性，对于热和干旱的耐受性，缩短的作物成熟时间，改进的工业加工(例如，用于将淀粉或生物质转化为可发酵的糖类)、以及改进的农艺学品质(例如，高油含量和高蛋白含量)。 

在本发明的一个具体的实施方案中，多核苷酸可以被叠加(或可替代地，表达盒可以被叠加在一个单个的多核苷酸上)从而在一种植物内表达多于一种类型的HPPD多肽。当例如一种HPPD特别适合用于提供对一种类别的HPPD除草剂的抗性而另外一种提供对不同类别的HPPD除草剂的更好的耐受性时，这是特别有利的。当一种多肽表达固有的除草剂抗性但是稍微不稳定时，叠加HPPD多肽同样是一种优点。通过形成混合的的酶二聚体，这种抵抗除草剂的HPPD然后可以在与例如相似的但是较不温度稳定的HPPD的混合的表达中进行稳定。 

可以与本发明的编码突变体HPPD多肽或它们的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸进行叠加的示例性多核苷酸包括编码了赋予对于害虫/病原体如病毒、线虫、昆虫或真菌等等的抗性的多肽的多核苷酸。可以与本发明的多核苷酸进行叠加的示例性多核苷酸包括编码以下多肽的多核苷酸，这些多肽是：具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽，如其他苏芸金芽胞杆菌毒性蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；以及Geiser et al.(1986)Gene 48：109中)、凝集素(Van Damme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24：825)、五邻体(pentin)(描述于美国专利号5,981,722)，等等；用于疾病或除草剂耐受性所希望的性状(例如，伏马菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)的多核苷酸；无毒力以及疾病抗性基因(Jones et al.(1994)Science 266：789；Martin et al.(1993)Science 262：1432；Mindrinos et al.(1994)Cell 78：1089)；编码了赋予对于某些类别的茁长素和乙酰辅酶A羧化酶除草剂的抗性的一种芳氧基链烷酸酯双加氧酶的一种基因(例如，在PCT公开号WO 2008/141154、WO 2007/053482或在美国专利号6,153,401中的一种给出了对于2，4D的抗性的tfdA基因)；编码了赋予麦草畏抗性的麦草畏单加氧酶的一种基因(Behrens et al.(2007)Science，316，1185)；编码了赋予对于抑制HST的除草剂的抗性的一种尿黑酸茄呢基转移酶(HST)的一种基因(PCT公开号WO 2010/029311)；编码了赋予对于一种包含腈的除草剂的抗性的一种腈水解酶(例如，bxnA溴草腈腈水解酶)的一种基因；导致除草剂耐受性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；草甘磷抗性(例如，5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因，描述于美国专利号4,940,935和5,188,642中；或草甘磷N-乙酰转移酶(GAT)基因，描述于Castle et al.(2004)Science，304：1151-1154；并且于美国专利申请公开号20070004912、20050246798、以及20050060767))；草丁膦抗性(例如，草丁膦乙酰转移酶基因PAT和BAR，描述于美国专利号5,561,236和5,276,268中)；一种细胞色素P450或它的赋予对于尤其HPPD除草剂的除草剂抗性或耐受性的变体(美国专利申请公开号20090011936；美国专利号6,380,465；6,121,512；5,349,127；6,649,814；以及6,300,544；以及PCT公开号WO2007/000077)；以及对于以下的加工或过程产物所希望的性状：如高油(例如，美国专利号6,232,529)；改性的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；PCT公开号WO 94/11516))；改性淀粉(例 如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、以及淀粉脱支酶(SDBE))；以及聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合成酶、以及乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)，有助于聚羟基烷酸酯(PHA)的表达)。 

因此，在一个实施方案中，将编码一种天然的或突变体HPPD多肽或它的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸与一个或多个编码赋予对于一种除草剂的抗性或耐受性的多肽的多核苷酸进行叠加。在一个实施方案中，所希望的性状是对于一种HPPD抑制剂的抗性或耐受性。在另一个实施方案中，所希望的性状是对于草甘磷的抗性或耐受性。在另一个实施方案中，所希望的性状是对于草丁膦的抗性或耐受性。在进一步的实施方案中，所希望的性状是对于一种HST抑制剂除草剂、一种茁长素除草剂或一种PSII除草剂的的抗性或耐受性。 

这些叠加的组合可以通过任何方法来产生，这些方法包括但不局限于：通过常规的或顶交方法的杂交育种植物、或遗传转化。如果这些序列是通过遗传转化这些植物来进行叠加的，所感兴趣的多核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，包括一个或多个所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶标。这些性状可以在一个共转化方案中与由转化盒的任何组合提供的感兴趣的多核苷酸同时引入。例如，如果将引入两个序列，这两个序列可以包含在分开的转化盒(反式)中或包含在相同的转化盒(顺式)中。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子来驱动。在某些情况下，可能希望的是引入一个抑制所感兴趣的多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其它的抑制盒或过量表达盒的任何组合进行组合以在该植物中产生所希望的性状组合。进一步认识到的是，多核苷酸序列可以在一个所希望的基因组位置处使用位点特异性重组系统进行叠加。参见，例如，PCT公开号WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855、以及WO 99/25853。 

植物表达盒 

本发明的组合物可以额外地包含用于在一个感兴趣的植物中转化和表达的核酸序列。这些核酸序列可能存在于DNA构建体或表达盒中。如此处 使用的“表达盒”是指能够在适当的宿主细胞中指引一种特定核苷酸序列的表达的一种核酸分子，包含可操作连接到感兴趣的核苷酸序列(即，一种单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合而编码一种突变体HPPD多肽或它的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸)的一个启动子，该感兴趣的核苷酸序列可操作地连接到终止信号。它还典型地包含正确翻译该核苷酸序列所需要的序列。该编码区通常对一种感兴趣的蛋白质进行编码，但是还可以对一种感兴趣的功能性RNA进行编码，例如在正义或反义方向上的反义RNA或一种非翻译RNA。包含该感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意味着至少一个它的组分相对于至少一个它的其他组分是异源的。该表达盒还可以是一种天然发生的表达盒，但已经是以在对异源表达有用的一个重组体形式而获得的。然而，典型地，该表达盒对于宿主是异源的，即，该表达盒的特定DNA序列并不天然发生于该宿主细胞中，并且必须已通过一个转化事件而被引入该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。在该表达盒中核苷酸序列的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有当该宿主细胞暴露于一些特殊的外界刺激时才引发转录。另外，该启动子对于一种特定的组织或器官或发育阶段也可以是特异性的。 

本发明涵盖了用能够表达一种感兴趣的多核苷酸(即一种单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合而编码一种突变体HPPD多肽或它的保留了HPPD酶活性的变体的多核苷酸)的表达盒来转化植物。该表达盒在5′-3′的转录方向上包括一个转录和翻译的起始区(即，一个启动子)和一个多核苷酸开放阅读框。该表达盒可以任选地包括在植物中起作用的一个转录和翻译终止区(即，终止区)。在一些实施方案中，该表达盒包括一种选择标记基因从而允许选择稳定的转化体。本发明的表达构建体还可以包括一个前导序列和/或一个允许感兴趣的多核苷酸的诱导型表达的序列。对于允许诱导型表达的序列的实例参见Guo et al.(2003)Plant J.34：383-92和Chen et al.(2003)Plant J.36：731-40。 

该表达构建体的调节序列可操作地连接到感兴趣的多核苷酸。对于“可操作地连接”意指在启动子与第二序列之间的功能性连接，其中该启动子序列引发和介导了对应于该第二序列的DNA序列的转录。通常，可操作地连接表示被连接的核苷酸序列是邻近的。 

在本发明的实践中可以使用任何能够在感兴趣的植物中驱动表达的启动子。该启动子可以是天然的或模拟的或外来的或与该宿主植物是异源的。当在此用来提及一个核酸序列(例如，DNA或RNA序列)或基因时，术语“异源的”和“外源的”是指源自对于特定的宿主细胞是外来的来源的、或者如果源自相同的来源则是自其原始形式进行修饰的一种序列。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于该特定宿主细胞是内源性的但是已经通过例如使用DNA改组而修饰的一种基因。这些术语还包括一种天然发生的DNA序列的非天然发生的多份拷贝。因此，这些术语是指一种DNA节段，它对于该细胞是外来的或异源的或与该细胞是同源的但是处于在其中通常找不到该元件的该宿主细胞核酸之内的一个位置。表达了外源DNA节段以产生外源性多肽。 

“同源的”核酸(例如，DNA)序列是与它被引入其中的宿主细胞天然相关联的一种核酸(例如，DNA或RNA)序列。 

有待包括的启动子的选择取决于几个因素，包括但不限于：效率、可选择性、诱导性、所希望的表达水平、以及细胞优先表达或组织优先表达。对于本领域的技术人员而言，通过相对于序列来适当地选择并且定位启动子以及其它的调节区而调整该序列的表达是一种惯例。用于表达一个或多个转基因的启动子可以是强的植物启动子、病毒启动子、或嵌合启动子，组成这些启动子的元件如：来自任何基因的(或合成的，基于植物基因TATA盒的分析)TATA盒，其任选地融合到对于植物启动子的TATA盒的5’上(这指向组织以及暂时适当的基因表达)，任选地融合到1个或多个增强子上(如35S增强子、FMV增强子、CMP增强子、RUBISCO SMALL SUBUNIT增强子、PLASTOCYANIN增强子)。 

示例性的组成型启动子包括例如：Rsyn7启动子的核心启动子以及其它的披露于WO 99/43838和美国专利号6,072,050中的组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)，等等。其他组成型启动子包括在例如美国专利号5,608,149； 5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；以及6,177,611中。 

适当的植物或嵌合启动子对于如在某些组织中的转基因的表达的应用是有用的，同时将其他组织如种子或生殖组织中的表达最小化。示例性的细胞类型启动子或组织优先启动子优选在靶组织中驱动表达、但也可以在其他细胞类型或组织中导致某种表达。用于在植物基因组DNA中鉴定并表征启动子区的方法包括例如在以下参考文献中所说明的那些：Jordano，et al.，Plant Cell，1：855-866(1989)；Bustos，et al.，Plant Cell，1：839-854(1989)；Green，et al.，EMBO J.7，4035-4044(1988)；Meier，et al.，Plant Cell，3，309-316(1991)；以及Zhang，et al.，Plant Physiology 110：1069-1079(1996)。 

在本发明的其他实施方案中，诱导型启动子可能是所希望的。诱导型启动子驱动响应于外部刺激(如化学试剂或环境刺激)的转录。例如，诱导型启动子可以响应于激素(如赤霉酸或乙烯)、或响应于光或干旱而赋予转录。 

许多种用于表达盒中的转录终止子是可获得的。这些转录终止子负责超过该转基因的转录终止以及正确的mRNA多聚腺苷酸化。该终止区可以是与该转录引发区天然在一起的、可以是与感兴趣的可操作地连接的DNA序列天然在一起的、可以是与该宿主植物天然在一起的、或者可以是源自另一种来源(即，对于该启动子、该感兴趣的DNA序列、该宿主植物、或它们的任何组合是外来的或异源的)。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些，并且包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子以及豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。此外，可以使用一种基因的天然转录终止子。 

一般地，该表达盒将包括一种选择标记基因用于选择转化的细胞。利用选择标记基因来选择转化的细胞或组织。 

已经发现众多序列增强了来自转录单位之内的基因表达并且这些序列可以与本发明的基因结合使用以增加它们在转基因植物中的表达。 

已经显示不同的内含子序列增强了特别是在单子叶植物的细胞中的表达。例如，已经发现玉米Adhl基因的内含子当引入玉米细胞中时显著增强了在其同源启动子下野生型基因的表达。已经发现内含子1是特别有效的并且增强了在具有氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中的表达(Callis et al.，Genes Develop.1：1183-1200(1987))。在同一个实验体系中，来自玉米青铜 色1基因(maize bronze 1gene)的内含子在增强表达方面具有相似的效果。常规地已经将内含子序列结合到植物转化载体中，典型地在非翻译前导序列中。 

也已知许多源自病毒的未翻译的前导序列增强了表达，并且这些在双子叶植物的细胞中是特别有效的。确切地说，已经显示来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)、以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增强表达方面是有效的(例如，Gallie et al.Nucl.Acids Res.15：8693-8711(1987)；Skuzeski et al.Plant Molec.Biol.15：65-79(1990))。本领域中已知的其他前导序列包括但不限于：细小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，and Moss，B.PNAS USA 86：6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒属前导序列，例如，烟草蚀纹病毒(TEV)前导序列(Allison et al.，1986)；玉米矮花叶病毒(MDMV)前导序列；病毒学154：9-20；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak，D.G.，and Samow，P.，Nature 353：90-94(1991))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译的前导序列(AMV RNA 4)(Jobling，S.A.，and Gehrke，L.，Nature 325：622-625(1987))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，D.R.et al.，Molecular Biology of RNA，pages 237-256(1989))；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel，S.A.et al.，Virology 81：382-385(1991)。还参见，Della-Cioppa et al.，Plant Physiology 84：965-968(1987)。 

本发明还涉及包括一个或多个以上所述的表达盒的核酸构建体。该构建体可以是载体，如一种植物转化载体。在一个实施方案中，该载体是包括多核苷酸的植物转化载体，该多核苷酸包括在SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52中列出的序列。 

植物 

如在此使用的，术语“植物部分”或“植物组织”包括植物细胞、植物原生质体、植物可以由之再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物簇(plant clumps)、以及在植物或以下植物的部分中完整的植物细胞，这些植物的部分是如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、 外壳、茎、根、根尖、花药，等等。上述术语还包括植物产品，例如谷物、果实、以及坚果。 

在本发明中有用的植物包括对于至少一种多核苷酸是转基因的植物，该多核苷酸单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子进行组合而编码一种突变体HPPD多肽或它的保留了HPPD酶活性的变体。所选择的植物的类型取决于多种因素，包括例如：收获的植物原料的下游使用、植物物种对转化的适应性、以及植物将要生长、收割、和/或加工的所处条件。普通技术人员将进一步认识到用于选择用于本发明适当的植物种类的另外的因素包括：高产量潜力、良好的茎强度、对特殊病的抵抗力、耐旱性、快速干燥以及足以允许储存和输送至市场而具有最小损失的谷物质量。 

根据本发明的植物包括出于生产人类或动物所寻求的、用作口服消费的、或者是在一个工业、药学、或商业过程中加以利用的植物材料的目的而种植的任何植物。本发明可以应用于多种植物的任何品种，包括但不仅限于：玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、高粱、一般的豆类、油菜(rape)/低芥酸菜籽、苜蓿、亚麻、向日葵、红花、粟、黑麦、甘蔗、甜菜、可可、茶树、芸苔属、棉花、咖啡、甘薯、亚麻、花生、以及三叶草；蔬菜(例如，莴苣、番茄、葫芦、木薯、马铃薯、胡萝卜、萝卜、豌豆、扁豆、甘蓝、花椰菜、西兰花、孢子甘蓝(tea，Brassica，cotton，coffee，sweet potato，flax，peanut，clover；vegetables such as lettuce，tomato，cucurbits，cassava，potato，carrot，radish，pea，lentils，cabbage，cauliflower，broccoli，Brussels sprouts)、胡椒(pepper)、以及菠萝)；果树(例如，柑橘属的树、苹果树、梨树、桃树、杏树、胡桃树、鳄梨树、香蕉树、以及椰子树)；以及花卉(例如，兰花、康乃馨、以及玫瑰)(tree fruits such as citrus，apples，pears，peaches，apricots，walnuts，avocado，banana，and coconut；and flowers such as orchids，carnations and roses)。在本发明的实践中有用的其他植物包括多年生的禾本科植物，如柳枝稷(switchgrass)、草原草(prairie grasses)、印度草(Indiangrass)、大须芒草(Big bluestem grass)等等。认识到可以使用多种植物的混合物。 

此外，术语“作物”应当理解为还包括由于常规育种方法或遗传工程方法而赋予了对多种除草剂或多种除草剂类别(例如像ALS抑制剂，如氟嘧磺隆、氟丙磺隆和三氟啶磺隆、EPSPS(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯合成酶) 抑制剂、GS(谷氨酰胺合成酶)抑制剂)(primisulfuron，prosulfuron and trifloxysulfuron，EPSPS(5-enol-pyrovyl-shikimate-3-phosphate-synthase)inhibitors，GS(glutamine synthetase)inhibitors)的耐受性的作物。由于常规育种方法或遗传工程方法而被赋予了对多种除草剂或多种除草剂类别的耐受性的作物的实例包括草甘膦和草丁膦耐受性作物品种，它在RoundupReady 

知LibertyLink 

商标名下是可商购的。根据本发明的方法对于保护大豆作物是特别适合的，这些大豆植物被赋予了对草甘磷和/或草丁膦的耐受性，并且其中HPPD除草剂与其他此类除草剂(草丁膦和/或草甘磷)一起被用在除草程序中用于除草。 

进一步考虑到本发明的构建体可以被引入具有改进的对于具体的下游使用是适合的或最佳的特性的植物品种中。例如，在植物中天然发生的遗传变异性导致了植物具有对于HPPD抑制剂或其他除草剂的抗性或耐受性，并且此类植物在本发明的方法中同样是有用的。根据本发明的方法可以通过将提供了一个水平的耐受性的转基因与大豆栽培品种进行杂交来进一步优化，其中大豆栽培品种展示了增强水平的发现于小百分比的大豆系中的对于HPPD抑制剂的耐受性。 

植物转化 

一旦已经将一种抗或耐受除草剂突变体HPPD多核苷酸单独地或与编码赋予所希望的性状的多肽的一种或多种额外的核酸分子结合而克隆到一个表达系统中，它就是被转化到了一种植物细胞中。本发明的这些表达盒可以以多种领域公认的方式被引入到植物细胞中。在多核苷酸的背景下，术语“引入”(例如，一个感兴趣的核苷酸构建体)旨在表示以这样一种方式将该多核苷酸提供给该植物，使得该多核苷酸获得对一种植物细胞的内部的接近。其中有待引入一个以上的多核苷酸，这些多核苷酸可以作为单个核苷酸构建体的部分而进行组装，或者作为分开的核苷酸构建体，并且可以位于相同的或不同的转化载体上。因此，或作为育种方案的一部分，例如在植物中的在一个单一的转化事件中、在分开的转化事件中可以将这些多核苷酸引入到感兴趣的宿主细胞中。本发明的这些方法并不取决于一种用于引入一个或多个多核苷酸到植物中的具体方法，仅仅是获得这个或这些多核苷酸对于植物的至少一个细胞的内部的接近。在本领域中已知的用于将多个多核苷酸引 入到植物中的方法包括但不限于瞬时转化方法、稳定转化方法、以及病毒介导的方法。 

在一个多核苷酸的背景下的“瞬时转化”旨在表示多核苷酸被引入到植物中，并且并没有整合到该植物的基因组中。 

在被引入到植物中的一个多核苷酸的背景下，对于“稳定地引入”或“被稳定地引入”旨在表示该引入的多核苷酸被稳定地结合到植物基因组中，并且因此该植物被该多核苷酸稳定地转化。 

“稳定转化”或“被稳定地转化”旨在表示一种多核苷酸，例如一种这里描述的被引入到植物中的核苷酸构建体整合到该植物的基因组中并且能够被它的后代更具体地多个连续世代的后代继承。 

对于那些在植物转化领域的普通技术人员而言，用于植物转化的可获得的众多转化载体是已知的，并且与本发明有关的基因可以与任何这样的载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标种类。对于某些目标种类，可以优选不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中常规使用的选择标记包括赋予对卡那霉素以及相关抗生素的抗性的nptll基因(Messing & Vierra Gene 19：259-268(1982)；Bevan et al.，Nature 304：184-187(1983))、赋予对除草剂草丁膦(还被称作草胺膦；参见White et al.，Nucl.Acids Res 18：1062(1990)，Spencer et al.Theor.Appl.Genet 79：625-631(1990)以及美国专利号5,561,236以及5,276,268)的抗性的pat和bar基因、赋予对抗生素潮霉素的抗性的hph基因(Blochinger & Diggelmann，Mol.Cell Biol.4：2929-2931)、以及赋予对甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因(Bourouis et al.，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))、赋予对草甘膦的抗性的EPSPS基因(美国专利号4,940,935和5,188,642)、也赋予对草甘膦的抗性的草甘膦N-乙酰基转移酶(GAT)基因(Castle et al.(2004)Science，304：1151-1154；美国专利申请公开号20070004912，20050246798和20050060767)、以及提供代谢甘露糖的能力的6-磷酸甘露糖异构酶基因(美国专利号5,767,378和5,994,629)。可替代地，以及在一个优选的实施方案中，本发明的HPPD基因与作为选择剂的一种HPPD除草剂的使用结合，它自身被用作选择标记。 

用于再生植物的方法在本领域也是熟知的。例如，已经利用Ti质粒载体用于递送外源DNA，以及直接DNA摄入、脂质体、电穿孔、显微注射、以及微弹。此外，可以利用来自农杆菌属的细菌来转化植物细胞。以下是用 于转化双子叶和单子叶植物二者的代表性技术连同代表性质体转化技术的说明。 

对于使用根癌农杆菌的转化而言，很多载体是可获得的。这些载体典型地携带至少一个T-DNA边界序列并且包括例如pBIN19(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))的载体。对于在农杆菌转化中有用的载体的构建，参见，例如，美国专利申请公开号2006/0260011。 

没有使用根癌农杆菌的转化避免了在选择的转化载体中对于T-DNA序列的需要，并且因此除了例如以上描述的包含T-DNA序列的那些载体以外，可以利用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括经由基因枪法、原生质体摄入(例如PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择很大程度上取决于对于被转化的种类的优先选择。对于此类载体的构建，参见，例如，美国专利申请公开号20060260011。 

为了在植物质体中表达本发明的核苷酸序列，使用了质体转化载体pPH143(参见PCT公开号WO 97/32011，实例36)。该核苷酸序列被插入到pPH143中，由此取代PROTOX编码序列。这种载体接下来用于质体转化以及对于大观霉素抗性的转化体的选择。可替代地，该核苷酸序列被插入到pPH143中，这样它取代了aadH基因。在这种情况下，对PROTOX抑制剂具有抗性的转化体进行了选择。 

用于双子叶植物的转化技术在本领域也是熟知的，并且包括基于农杆菌的技术以及不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及直接通过原生质体或细胞的外源基因材料的摄入。这可以通过PEG或电穿孔介导的摄入、基因枪介导的递送、或显微注射来完成。由Paszkowski et al.，EMBO J.3：2717-2722(1984)，Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.199：169-177(1985)，Reich et al.，Biotechnology 4：1001-1004(1986)，以及Klein et al.，Nature 327：70-73(1987)描述了这些技术的实例。在每一情况下，使用本领域已知的标准技术将这些转化的细胞再生为完整的植物。 

对于双子叶植物的转化，农杆菌介导的转化是一种优选的技术，因为它的高转化效率以及它的对于许多不同的种类的广泛实用。农杆菌转化典型地涉及将携带感兴趣的外源DNA的二元载体(例如，pCIB200或pCIB2001)转移到一个适当的农杆菌菌株中，该二元载体可以依赖于由该宿主农杆菌菌株(例如用于pCIB200以及pCIB2001的CIB542菌株(Uknes et  al.Plant Cell 5：159-169(1993)))或者在一个共驻留Ti质粒上亦或在染色体上携带的vir基因的互补物。通过使用携带重组二元载体的大肠杆菌以及携带一种质粒(例如pRK2013)并且能够将该重组二元载体移动到目标农杆菌菌株中的辅助大肠杆菌菌株的三亲本杂交方法来实现该重组二元载体到农杆菌的转移。可替代地，可以通过DNA转化将该重组二元载体转移到农杆菌中(Hofgen & Willmitzer，Nucl.Acids Res.16：9877(1988))。 

通过重组农杆菌转化目标植物物种通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养，并且遵循本领域中熟知的科学试验计划。将转化的组织在存在于二元质粒T-DNA边界之间的携带有抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上再生。 

另一种用基因转化植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上注入惰性的或生物学活性的粒子。美国专利号4,945,050、5,036,006、以及5,100,792(都是授予Sanford等人)中披露了这种技术。通常，这种方法涉及在细胞上在有效穿透该细胞的外表面并提供掺入在其内部中的条件下注入惰性的或生物学活性的粒子。当使用惰性粒子时，可以通过用含有所希望的基因的载体包被这些粒子以将该载体引入细胞中。可替代地，可以用载体围绕目标细胞使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物学活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自包含被试图引入的DNA)注入到植物细胞组织中。 

多数单子叶植物种类的转化现在也已经变成了常规操作。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术的直接基因转移进入原生质体、以及粒子轰击进入愈伤组织。可以用单一DNA种类或多种DNA种类(即，共转化)进行转化，并且这两种技术都适合用于本发明中。共转化可能具有避免完全型载体构建以及生成对于感兴趣的基因与选择标记具有非伴性基因座的转基因植物的优点，使得能够在随后的世代中去除该选择标记(如果这被认为是所希望的话)。然而，使用共转化的一个缺点是小于100％的频率，分离的DNA种类以该频率被整合到基因组中(Schocher等人Biotechnology 4：1093-1096(1986))。 

欧洲专利EP 0 292 435和EP 0 392 225、以及PCT公开号WO 93/07278描述了用于从良种近交系玉米制备愈伤组织和原生质体、使用PEG或电穿孔转化原生质体、以及从转化的原生质体再生玉米植物的技术。 Gordon-Kamm等人(Plant Cell 2：603-618(1990))和Fromm等人(Biotechnology 8：833-839(1990))已经公开了使用粒子轰击用于转化源于A188的玉米系的技术。此外，PCT公开号WO 93/07278和Koziel等人(Biotechnology 11：194-200(1993))描述了通过粒子轰击用于转化良种近交系玉米的技术。这种技术利用了从授粉之后14-15天的玉米穗切除的1.5-2.5mm长的未成熟玉米胚以及用于轰击的一台PDS-1000He Biolistics装置。 

水稻的转化也可以通过利用原生质体或粒子轰击的直接基因转移技术来进行。原生质体介导的转化已经对Japonica型和Indica型进行了描述(Zhang et al.Plant Cell Rep 7：379-384(1988)；Shimamoto et al.Nature 338：274-277(1989)；Datta et al.Biotechnology 8：736-740(1990))。使用粒子轰击也可常规地转化两种类型(Christou et al.Biotechnology 9：957-962(1991))。此外，PCT公开号WO 93/21335描述了通过电穿孔用于转化水稻的技术。 

欧洲专利EP 0 332 581描述了用于产生、转化以及再生早熟禾亚科原生质体的技术。这些技术允许转化鸭茅属和小麦。此外，已经由Vasil等人(Biotechnology 10：667-674(1992))使用粒子轰击进入C型长期可再生愈伤组织的细胞，以及还有Vasil等人(Biotechnology 11：1553-1558(1993))和Weeks等人(Plant Physiol.102：1077-1084(1993))使用离子轰击未成熟胚和未成熟胚来源的愈伤组织描述了小麦的转化。然而，用于小麦转化的一种优选的技术涉及通过离子轰击未成熟胚的小麦转化并且在基因递送之前包括高蔗糖步骤或高麦芽糖步骤。在轰击之前，将任意数目的胚(长度为0.75-1mm)在具有3％蔗糖(Murashiga & Skoog，Physiologia Plantarum 15：473-497(1962))以及3mg/l 2，4-D的MS培养基上进行铺板用于诱导体细胞坯，这允许在黑暗中进行。在选择进行轰击的那天，将胚从诱导培养基中取出并且放置在渗压剂上(即，以希望的浓度(典型地是15％)添加有蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。允许这些胚质壁分离2-3小时，然后进行轰击。每个目标板二十个胚是典型的，尽管不是关键性的。使用标准方法使一种适当的携带基因的质粒(如pCIB3064或pSOG35)沉淀在微米大小的金颗粒上。使用约1000psi的爆破压力，使用标准的80目网筛，用DuPont BIOLISTICS 

氦装置射击每个板的胚。在轰击之后，将这些胚放回到黑暗中恢复约24小时(仍在渗压剂上)。24小时后，从渗压剂上取出这些胚并将其放回到诱导培养基 上，在这里在再生之前它们停留约1个月。约1个月之后，将具有发育中的胚性愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基中(MS+1mg/升NAA、5mg/l GA)，该再生培养基进一步包含适当的选择剂(在pCIB3064的情况下是10mg/l的basta而在pSOG35的情况下是2mg/l的甲氨蝶呤)。约1个月之后，将发育的嫩枝转移到更大的被称为“GA7”的灭菌容器中，这些容器包含半浓度的MS、2％的蔗糖、以及相同浓度的选择剂。 

还已经描述了使用农杆菌转化单子叶植物。参见，PCT公开号WO 94/00977、美国专利号5,591,616、以及Negrotto et al.，Plant Cell Reports 19：798-803(2000)。例如，水稻(亚洲栽培稻)可以用于产生转基因植物。可以使用不同的水稻培养品种(Hiei et al.，1994，Plant Journal 6：271-282；Dong et al.，1996，Molecular Breeding 2：267-276；Hiei et al.，1997，Plant Molecular Biology，35：205-218)。还有，以下描述的各种培养基组分可以在量上变化或者被替换。通过在MS-CIM培养基(MS基础盐，4.3g/l；维生素B5(200X)，5ml/升；蔗糖，30g/l；脯氨酸，500mg/l；谷氨酰胺，500mg/l；酪蛋白水解物，300mg/l；2，4-D(1mg/ml)，2ml/升；用1N KOH调节pH到5.8；植物凝胶，3g/l)上进行培养而开始胚胎发生的响应和/或从成熟的胚建立培养物。将或者在培养物响应的初始阶段的成熟胚或已建立的培养系进行接种并且与含有所希望的载体构建的根癌农杆菌菌株LBA4404(农杆菌属)进行共培养。将农杆菌(来自甘油母液)在固体YPC培养基(100mg/l大观霉素或任何其他适当的抗生素)上在28℃培养大约2天。将农杆菌重新悬浮于液态MS-CIM培养基中。将该农杆菌培养物稀释至OD⁶⁰⁰为0.2-0.3，并且添加乙酰丁香酮直到最终浓度为200μM。在将该溶液与这些水稻培养物混合之前添加乙酰丁香酮以诱导农杆菌以将DNA转移到植物细胞中。为了接种，将这些植物培养物浸入细菌悬浮液中。去除该液体的细菌悬浮液并将接种的培养物放在共培养培养基上，然后在22℃下孵育2天。然后将这些培养物转移到具有替卡西林(400mg/l)的MS-CIM培养基中以抑制农杆菌的生长。对于使用PMI选择标记基因的构建体(Reed et al.，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 37：127-132)，在7天后将培养物转移到含有甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基(具有2％的甘露糖、300mg/l的替卡西林的MS)中，并且在黑暗中培养3-4周。然后将抗性菌落转移到再生诱导培养基(不具有2，4-D、0.5mg/l的IAA、1mg/l的玉米素、200mg/l的特美汀、2％的甘露糖 以及3％的山梨糖醇的MS)中并且在黑暗中生长14天。然后将增殖中的菌落转移到另一轮的再生诱导培养基中并且移到光照生长室中。将再生的嫩枝转移到带有GA7-1培养基(不含激素以及含2％的山梨糖醇的MS)的GA7容器中持续2周，然后在它们足够大并具有足够的根时将其移到温室中。将植物移栽到温室的土壤中(T₀代)生长至成熟，并且收获T₁代种子。 

通过用本发明中的感兴趣的核酸序列的转化获得的植物可以是各种各样的植物种类的任何一种，包括单子叶植物和双子叶植物的那些；然而，在本发明的方法中所使用的植物在此优先选自在别处列出的农学上重要的目标作物的列表。与对于产量和质量重要的其他特征相结合到本发明的一种基因的表达可以通过育种结合到植物系中。育种的方法和技术在本领域中是已知的。参见，例如，Welsh J.R.，Fundamentals of Plant Genetics and Breeding，John Wiley & Sons，NY(1981)；Crop Breeding，Wood D.R.(Ed.)American Society of Agronomy Madison，Wis.(1983)；Mayo O.，The Theory of Plant Breeding，Second Edition，Clarendon Press，Oxford(1987)；Singh，D.P.，Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests，Springer-Verlag，NY(1986)；以及Wricke and Weber，Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding，Walter de Gruyter and Co.，Berlin(1986)。 

对于质体的转化，将烟草“Xanthienc”的种子是在T琼脂培养基上在1″圆形排列中每个板发芽7个，并且在播种12-14天后用1μm钨粒子进行轰击(M10，Biorad，Hercules，Calif.)，这些粒子包被有基本上如所描述的来自质粒pPH143和pPH145的DNA(Svab，Z.and Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)。将轰击的种苗在T培养基上孵育2天，在这之后将它的叶子剪去并且在光亮中(350-500μmol光子/m²/s)将轴外面向上放置于含有500μg/ml二盐酸大观霉素(Sigma，St.Louis，Mo.)的RMOP培养基板上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.and Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)。将轰击后三至八周出现在褪色的叶子下面出现的抗性嫩枝亚克隆到相同的选择培养基上，允许其形成愈伤组织，并且将次级嫩枝分离并进行亚克隆。在独立的亚克隆中的转化质体基因组拷贝(同质体性(homoplasmicity))的完整分离是由Southern印迹的标准技术进行评定的(Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor)。将BamHI/EcoRI-消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.(1987)Plant Mol  Biol Reporter 5，346349)在1％的三羟甲基氨基甲烷-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上分开、转移到尼龙膜(Amersham)上、并且用³²P-标记的随机引物DNA序列进行探测，这些DNA序列对应于一个0.7kb BamHI/HindIII DNA片段，该片段来自包含rps 7/12质体靶向序列的一部分的pC8。使同质的嫩枝在含大观霉素的MS/IBA培养基上无菌地生根(McBride，K.E.et al.(1994)PNAS 91，7301-7305)并转移到温室中。 

工程化进入以上描述的转基因的种子以及植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长被传递，并且可以因此在子代植物中被维持和繁殖。一般而言，维持和繁殖利用了已知的农业方法，开发这些方法以适合特定的目的(如耕种、播种或收获)。 

可以进一步在植物育种中利用根据本发明的转基因植物和种子的有利的遗传特性。取决于所希望的特性，可以采取不同的育种措施。相关的技术是在本领域内是熟知的，并且包括不仅限于：杂交、近亲繁殖、回交育种、多系育种、变种混合、种间杂交、非整倍体技术、等等。因此，根据本发明的转基因种子和植物可以用于改良植物系的育种，这些植物系例如增加常规方法(例如除草剂或杀虫剂处理)的效力或由于它们的修饰的遗传特性而允许免除所述的方法。 

使用适合的选择标记(如卡那霉素)、二元载体(如来自农杆菌)以及植物再生(如从烟草叶盘))的许多合适的转化方法在本领域是熟知的。任选地，一个对照种群的植物同样用表达对照HPPD的多核苷酸进行了转化。可替代地，既然如此，一种未转化的双子叶植物(如拟南芥或烟草)可以被用作对照(在任何情况下，表达它自己的内源性HPPD)。 

除草剂抗性 

本发明提供了已经用编码赋予对除草剂的抗性或耐受性的一个突变体HPPD或它的变体的核酸分子(单独地或与一个或多个编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相结合)转化的转基因植物、植物细胞、组织、和种子。 

在一个实施方案中，本发明的转基因植物表现出对以一个从约5至约2000克每公顷(g/ha)的量施用的除草剂的抗性或耐受性，该除草剂的量包括，例如约5g/ha、约10g/ha、约15g/ha、约20g/ha、约25g/ha、约30 g/ha、约35g/ha、约40g/ha、约45g/ha、约50g/ha、约55g/ha、约60g/ha、约65g/ha、约70g/ha、约75g/ha、约80g/ha、约85g/ha、约90g/ha、约95g/ha、约100g/ha、约110g/ha、约120g/ha、约130g/ha、约140g/ha、约150g/ha、约160g/ha、约170g/ha、约180g/ha、约190g/ha、约200g/ha、约210g/ha、约220g/ha、约230g/ha、约240g/ha、约250g/ha、约260g/ha、约270g/ha、约280g/ha、约290g/ha、约300g/ha、约310g/ha、约320g/ha、约330g/ha、约340g/ha、约350g/ha、约360g/ha、约370g/ha、约380g/ha、约390g/ha、约400g/ha、约410g/ha、约420g/ha、约430g/ha、约440g/ha、约450g/ha、约460g/ha、约470g/ha、约480g/ha、约490g/ha、约500g/ha、约510g/ha、约520g/ha、约530g/ha、约540g/ha、约550g/ha、约560g/ha、约570g/ha、约580g/ha、约590g/ha、约600g/ha、约610g/ha、约620g/ha、约630g/ha、约640g/ha、约650g/ha、约660g/ha、约670g/ha、约680g/ha、约690g/ha、约700g/ha、约710g/ha、约720g/ha、约730g/ha、约740g/ha、约750g/ha、约760g/ha、约770g/ha、约780g/ha、约790g/ha、约800g/ha、约810g/ha、约820g/ha、约830g/ha、约840g/ha、约850g/ha、约860g/ha、约870g/ha、约880g/ha、约890g/ha、约900g/ha、约910g/ha、约920g/ha、约930g/ha、约940g/ha、约950g/ha、约960g/ha、约970g/ha、约980g/ha、约990g/ha、约1,000g/ha、约1,010g/ha、约1,020g/ha、约1,030g/ha、约1,040g/ha、约1,050g/ha、约1,060g/ha、约1,070g/ha、约1,080g/ha、约1,090g/ha、约1,100g/ha、约1,110g/ha、约1,120g/ha、约1,130g/ha、约1,140g/ha、约1,150g/ha、约1,160g/ha、约1,170g/ha、约1,180g/ha、约1,190g/ha、约1,200g/ha、约1,210g/ha、约1,220g/ha、约1,230g/ha、约1,240g/ha、约1,250g/ha、约1,260g/ha、约1,270g/ha、约1,280g/ha、约1,290g/ha、约1,300g/ha、约1,310g/ha、约1,320g/ha、约1,330g/ha、约1,340g/ha、约1,350g/ha、约1,360g/ha、约1,370g/ha、约1,380g/ha、约1,390g/ha、约1,400g/ha、约1,410g/ha、约1,420g/ha、约1,430g/ha、约1,440g/ha、约1,450g/ha、约1,460g/ha、约1,470g/ha、约1,480g/ha、约1,490g/ha、约1,500g/ha、约1,510g/ha、约1,520g/ha、约1,530g/ha、约1,540g/ha、约1,550g/ha、约1,560g/ha、约1,570g/ha、约1,580g/ha、约1,590g/ha、约1,600g/ha、约1,610g/ha、约1,620g/ha、约1,630g/ha、约 1,640g/ha、约1,650g/ha、约1,660g/ha、约1,670g/ha、约1,680g/ha、约1,690g/ha、约1,700g/ha、约1,710g/ha、约1,720g/ha、约1,730g/ha、约1,740g/ha、约1,750g/ha、约1,760g/ha、约1,770g/ha、约1,780g/ha、约1,790g/ha、约1,800g/ha、约1,810g/ha、约1,820g/ha、约1,830g/ha、约1,840g/ha、约1,850g/ha、约1,860g/ha、约1,870g/ha、约1,880g/ha、约1,890g/ha、约1,900g/ha、约1,910g/ha、约1,920g/ha、约1,930g/ha、约1,940g/ha、约1,950g/ha、约1,960g/ha、约1,970g/ha、约1,980g/ha、约1,990g/ha、或约2,000g/ha。 

在一个不同浓度的除草剂的范围内，以基于植物损伤、分生组织的漂白症状等的常规方式评估了主要植物转化事件的范围的除草剂耐受性或抗性水平的平均值和分布。这些数据可以以如下方式来表达，例如源自剂量/反应曲线(具有标绘在x轴上的“剂量”以及标绘在y轴上的“杀伤百分比”、“除草效果”、“出现绿色植物的数量”等)的GR50值，其中增加的GR50值对应于增加的固有抑制剂耐受性水平(例如增加的k_off/K_mHPP值)和/或表达的HPPD多肽的表达水平。 

本发明的这些方法对于保护农作物免受HPPD抑制剂除草剂的除草损伤是特别有用的。例如，HPPD抑制除草剂是适当地选自下组，该组由以下各项组成：二环吡喃酮(bicyclopyrone)(CAS RN 352010-68-5)、苯并双环酮(benzobicyclon)(CAS RN 156963-66-5)、吡草酮(benzofenap)(CAS RN 82692-44-2)、螺旋多司酮(ketospiradox)(CAS RN 192708-91-1)或其游离酸(CAS RN 187270-87-7)、异恶氯草酮(isoxachlortole)(CAS RN 141112-06-3)、异恶唑草酮(isoxaflutole)(CAS RN 141112-29-0)、甲基磺草酮(mesotrione)(CAS RN 104206-82-8)、磺酰草吡脱(pyrasulfotole)(CAS RN 365400-11-9)、苄草唑(pyrazolynate)(CAS RN 58011-68-0)、匹唑芬(pyrazoxyfen)(CAS RN 71561-11-0)、磺草酮(sulcotrione)(CAS RN 99105-77-8)、特呋三酮(tefuryltrione)(CAS RN 473278-76-1)、tembo三酮(tembotrione)(CAS RN 335104-84-2)、以及苯吡唑草酮(topramezone)(CAS RN 210631-68-8)；包括在可应用时，它们的农业上可接受的盐。 

使用的方法 

本发明进一步提供了在一种包括作物植物和杂草的场所选择性地控制杂草的方法，其中这些植物是通过上述本发明的任何方法获得的，其中该方法包括对该场所施用杂草控制量的一种或多种除草剂。在此描述的任何转基因植物可以在本发明的这些方法内使用。术语“场所”可以包括土壤、种子、和苗、连同已经长成的植物。可以合适地在作物或杂草的苗前或苗后使用除草剂。 

术语“杂草控制量”表示机能上包括除草剂的量，该除草剂的量能够影响给定的杂草的生长或发育。因此，该量可以小到足以简单地阻止或抑制给定的杂草的生长或发育，或者该量可以大到足以不可逆地破坏一种给定的杂草。 

因此，本发明提供了一种在场所控制杂草的方法，包括对该场所施用杂草控制量的一种或多种除草剂，其中该场所包括已经用编码赋予HPPD除草剂的抗性或耐受性的突变体HPPD多肽或它的变体的核酸分子进行转化的转基因植物(单独地或与一种或多种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合)。在一个实施方案中，该希望的性状是对一种除草剂的抗性或耐受性，该除草剂包括例如选自下组的除草剂，该组由以下各项组成：一种HPPD抑制剂、草甘膦、以及草铵膦(glyphosate，and glufosinate)。在另一个实施方案中，该场所包括一种已经用上述核酸分子的任何组合进行转化的转基因植物，这些核酸分子包括编码一种赋予对一种除草剂的抗性或耐受性的突变体HPPD多肽或它的变体的一种或多种核酸分子，这些核酸分子与至少一种、至少两种、至少三种、或至少四种编码赋予所希望的性状的多肽的额外的核酸分子相组合。 

在一个实施方案中，本发明提供了对于控制在作物大田中不想要的植物种类有用的转基因植物和方法，其中这些作物植物通过转化来表达编码突变体HPPD多肽的基因而被赋予对HPPD化学性质的抗性，其中以能够杀死不想要的植物种类(杂草种类、或例如在所希望的作物植物的大田中的残留或“劣种”或“自生”植物作物)或损害其生长的量而应用了作为过多施用的的一种HPPD除草剂。该施用可以是在这些作物植物或这些不想要的种类的苗前或苗后，并且可以与作物对其天然耐受或通过表达一种或多种其他除草剂抗 性转基因而对其具有抗性的其他除草剂的施用相结合。参见，例如，美国专利申请公开号No.2004/0058427和PCT公开号WO 98/20144。 

在另一个实施方案中，本发明还涉及一种保护作物植物免受除草剂损伤的方法。在作物植物的培养中，特别是在一个商业规模上，正确的作物轮作对于产量稳定性(实现经过一个长时期的具有良好质量的高产量)以及对于农艺学商业的经济成功是极其重要的。例如，穿过大面积的美国主要玉米生长区(“中央玉米带”)，在超过75％的情况下，大豆是作为玉米的后茬作物而生长。使用HPPD抑制剂除草剂来进行在玉米作物中的选择性杂草控制正在逐渐实现。虽然这个类别的除草剂对于这个目的具有优良的适宜性，但是它可以在后茬作物中导致对这些作物植物的农艺学上不可接受的植物毒性损害(“残余”损害)。例如，某些大豆品种对此类HPPD抑制剂除草剂的甚至非常少的残余是敏感的。因此，本发明的除草剂抗性或耐受性植物对于在来自先前施用的除草剂的任何短期残留的一个场所进行种植也是有用的(例如，通过在施用一种除草剂后的下一年种植一种本发明的转基因植物，以降低来自该除草剂的土壤残余的损害的风险)。 

实例 

现在本发明参照以下实例进行描述。提供这些实例仅用于说明性目的，并且本发明不限于这些实例，但是更确切地说涵盖了所有的由于在此提供的传授的内容而明显的变体。 

实例1 

燕麦属衍生的HPPD SEQ ID NO：1的克隆、表达和测定以及对于不同的HPPD除草剂的k_cat、K_mHPP以及k_off的值的确定。 

由GeneArt(德国雷根斯堡)合成了一种DNA序列(对于在大肠杆菌中的表达是密码子优化的)，该序列编码了来自燕麦的HPPD(SEQ ID NO：1)，将其克隆到pET24a中并且在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，用50μg/ml卡那霉素进行选择(如PCT公开号WO 02/46387中所描述)。使用在30℃下生长的过夜培养物，以1∶100的比率接种在摇瓶中的3×1升LB。使培养物在37℃、220rpm下生长直至达到A^1cm600nm为0.6-0.8。将温度降到15℃并且用0.1mM IPTG进行诱导。将培养物生长过夜，并且在10,000 g下在15分钟的离心之后收集这些细胞。将这些细胞保存在-20℃下直至提取。将来自3升摇瓶培养物(约12g)的细胞沉淀物以1ml缓冲剂∶1g细胞糊(cell paste)的比率融化在提取缓冲液(50mM Tris、10mM抗坏血酸钠、2mM DTT、2mM AEBSF、10μM胰蛋白酶抑制剂、1mM EDTA、pH7.66)中。 

在30,000psi下使提取物通过细胞破碎仪，并且在4℃在50,000g下离心25分钟。可以该提取物任选地向下流过 

G25与缓冲液进行交换。上清液在液氮中形成珠粒并且在-80℃下储存。通过蛋白印迹分析并且使用纯的燕麦属(1-10ng)作为标准对HPPD表达的水平进行估计。将提取物以1∶6000进行稀释并且将1-10μl加载到12％SDS PAGE上。此外，通过用 

(英国伦敦帝国化学工业公司)染色来比较诱导的和未诱导的SDS PAGE从而对表达进行定量。将凝胶印迹到PVDF膜上并且使用兔抗小麦HPPD(1∶6600)血清作为第一抗体以及羊抗兔FITC-连接的抗体(1∶600)作为第二抗体进行蛋白质印迹。通过在Fluorimager^TM 595(英国白金汉郡GE Healthcare公司)上进行扫描来进行条带的检测并且通过使用ImageQuant^TM(英国白金汉郡GE Healthcare公司)来进行峰值定量。从所有转化的菌株中再分离出质粒DNA并且对跨编码区的DNA序列进行确认。 

从蛋白质印迹，在大肠杆菌提取物中表达的SEQ ID NO：1多肽的表达水平被估计为在33.5mg/ml的总的可溶性蛋白浓度之外约10-14mg/ml。 

通过活性位点滴定还更精确地估计了提取物中活性HPPD的浓度。例如，将一定体积范围的提取物(典型地0-20μl)加入到pH 7.0并且在25℃的包含25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶以及3nmoles的¹⁴C-标记的化合物A(1.81GBq/mmol)的50mM双三羟基氨基丙烷(BisTrisPropane)缓冲液中，总最终测定体积为425μl。 

化合物A 

3分钟之后通过加入100μl 1mM‘冷的’结构A将放射性标记蛋白结合反应淬灭。通过快速层析向下流入一个NAP5 G25 Sephadex 

柱子(英国白金汉郡GE Healthcare公司)将蛋白质交换进入pH 7.0的包含0.1M KCl的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂中并且使用一台Tri-Carb 2900TR闪烁计数器(Perkin Elmer，Wellesley，MA)对结合到蛋白质部分上的¹⁴C以Optiphase闪烁体进行测量。从如在PCT申请公开号WO 02/46387中所述的滴定来计算提取物中HPPD结合位点浓度，并且在一种提取物中被估计为94.9、78.3、以及82.3(平均值85.2)μM并且在另一个实例中为47.2μM。 

表达的HPPD的K_mHPP和k_cat值是基于在25℃在pH 7.0的包含25mM抗坏血酸盐钠、4μg/ml牛过氧化氢酶(Sigma，St.Louis，MO)、以及一定浓度范围(典型地0.5x-10x K_m)的4-羟基苯丙酮酸的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂的溶液中进行的测定来估计的。典型地在最终体积为110μl中的这些测定是通过加入酶开始的并且在20秒或优选10或15秒钟之后随着涡旋混合加入20μl 25％高氯酸而精确地终止。将测定溶液转移到Chromacol 03-CVG HPLC小瓶中，密封并且通过注射到反向Aqua C185μ75x 4.6mm HPLC柱子上以1.5ml/min流动5.5％乙腈0.1％TFA(缓冲剂A)来确定在40μl等分部分中形成的尿黑酸盐的量。在1.5ml/分钟下通过以下各步骤来洗脱该柱子：使用缓冲液A洗涤2分钟、然后在缓冲液A和100％乙腈的30/70混合物中洗涤2分钟，并且进一步在缓冲液A中洗涤3.5分钟。尿黑酸盐的洗脱是通过在292nm处的UV来监测的并且通过与标准校准曲线进行比较来对各反应中形成的量进行定量。 

使用一个非线性最小二乘法拟合使用Grafit 4^TM软件(英国米德塞克斯Erithacus软件公司)确定了K_m和V_max值(例如图1)。通过将最大速率、V_max(以nmol/秒来表示)除以HPPD酶的纳摩尔的数量(基于通过活性位点滴定而确定的浓度)确定了K_cat值。 

根据与图1中所示数据所产生的那些类似的一组分开的实验，就HPPD SEQ ID NO：1的一个提取物而言，K_m值被估计为6.17、4.51、6.09、6.13、4.37、4.62、5.41、5.13以及6μM(K_m平均值＝5.38μM)。相应的k_cat值是4.92、6.25、7.08、6.26、5.5、6.77、6.89、7.12以及7.39s^-1(k_cat平均值＝6.46s^-1)。注意对于这个计算，并且在此标准地是，Mr被取为约94kD并且假设每个二聚体一个活性位点(即，半位点活性以及抑制剂结合；参见 Garcia et al.(2000)Biochemistry，39：7501-7507；Hawkes“Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase(HPPD)-The Herbicide Target.”In Modern Crop Protection Compounds.Eds. 

and Schirmer.Weinheim，Germany：Wiley-VCH，2007.Ch.4.2，pp.211-220)。对于该替代的假设是每个单体一个活性位点，则计算的k_cat值应当只需相应地并且系统地减半。 

对于酶：抑制剂复合体的形成的结合速率(由结合速率常数(k_on)决定)、EI以及解离速率(由解离速率常数(k_off)决定)是通过本领域已知的方法并且基本上如Hawkes et al.(2001)Proc.Bright.Crop.Prot.Conf.Weeds，2：563-568以及PCT公开号WO 02/46387中所述来确定的。 

例如，通过在零时间并且在不同时间点处(0-180s)将约60皮摩尔HPPD加入在pH 7.0并且在25℃的包含25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶(Sigma，St.Louis，MO)以及过量的(约300皮摩尔)¹⁴C抑制剂的处于425μl的总测定体积的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲液中，然后加入并且快速混合100μl‘冷的’1mM结构A淬灭放射性标记的结合反应来测量结合速率。然后通过快速层析向下进入一个NAP5 G25 Sephadex 

柱子(英国白金汉郡GE Healthcare公司)将在不同时间淬灭的蛋白质样品交换进入pH 7.0的包含0.1M KCl的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂中并且使用一台Tri-Carb 

2900TR闪烁计数器(Perkin Elmer，Wellesley，MA)对结合到蛋白部分上的¹⁴C的量以Optiphase闪烁体进行定量。按照下面的方案来拟合数据从而取得表观二级速率常数(k2)的值，该值决定酶和放射性标记的抑制剂的结合速率。使用了一定范围的酶和抑制剂浓度。任选地，可以从类似实验得到该速率常数，其中在这种情况下酶(处于约0.05-0.2μM结合位点)和未标记的抑制剂(处于约0.5至2μM)在pH 7.0并且25℃的包含25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶(Sigma，St.Louis，MO)的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂中反应一个短时间(0-60s)的范围，并且然后通过快速稀释到包含100-200μM HPP的测定溶液中进行淬灭用于通过对30-40s(即在该测定的时间尺度上抑制剂分离和结合不会显著发生的一个足够短的时间)之后尿黑酸盐形成的HPLC/UV定量进行立即测定(如上所述)。另外的实例的方法描述于PCT公开号WO 02/46387中。 

从交换速率研究得到多个解离速率(以下方案中的k1)，其中测试抑制剂(I)或它的交换配偶体(J)被放射性标记并且根据以下方案进行数据 拟合。如在Hawkes et al.(2001)Proc.Bright.Crop.Prot.Conf.Weeds，2：563-568中注释的，HPPD制品典型地显示出(至少关于某些抑制剂的解离)包含抑制剂结合位点的5％-40％的更快的交换(较弱的结合)部分。少量的这种效应是由于非特异性结合引起的，它可以容易地减去或考虑到。对于多数抑制剂，这种效应是小的；关于像化合物A的结构，这样一种效应可能是由于前手性引起的。当快速和缓慢交换部分是通过抑制剂完全区别时，在此所测量的解离速率通常仅仅是指主要的较慢的交换部分，它代表了存在于所测试的提取物中的60％-95％的大部分的HPPD抑制剂结合位点。 

例如通过将约200皮摩尔的HPPD结合位点(如上所述在一个用结构A进行的3分钟反应中通过活性位点滴定来确定)预孵育在pH 7.0并且在25℃的包含25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶(Sigma，St.Louis，MO)的包含25℃的约1.0纳摩尔¹⁴C抑制剂的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂(总测定体积为1.3ml)中来确定解离速率。30分钟之后，通过在充分混合下加入100μl 1mM‘冷的’结构A来起始交换反应，并且立即抽取150μl并且加载到一个NAP5柱上，通过快速(＜2分钟)色谱向下进入一个NAP5 G25 Sephadex 柱子(英国白金汉郡GE Healthcare公司)将该蛋白交换进入pH 7.0的包含0.1M KCl的50mM双三羟基氨基丙烷缓冲剂中，并且使用一台Tri-Carb 

2900TR闪烁计数器(Perkin Elmer，Wellesley，MA)对结合到蛋白质上的¹⁴C的量以Optiphase闪烁体进行测量。在经过根据需要的数分钟或数小时的不同时间处以相同方式移开并且测量另外的等分部分从而确定交换动力学。 

在有用于更好地区别相对快的(例如，当在25℃下t1/2＜15分钟时)这些解离速率的方法的一个变体中，该实验的温度从25℃降低到冰温。在这种情况下，通过将约200皮摩尔的HPPD预孵育在25℃的总测定体积为1.3ml的包含约1.0纳摩尔¹⁴C抑制剂的反应缓冲液中(50mM BTP pH 7、25mM抗坏血酸钠、4μg/ml牛过氧化氢酶、以及10％甘油)来确定解离速 率。30分钟之后，将反应器转移到冰上。在冰温下持续另外的10分钟之后，通过在充分混合下加入100μl 1mM结构A来启动该交换反应，并且抽出150μl并且在冷室中在约5℃至8℃下加载到并且快速向下交换到一个NAP5柱子上，从而在冰温下在从交换开始的不同时间对保持结合在该蛋白质上的放射性标记的量进行定量。 

可以间接地测量HPPD抑制剂的解离速率(k1)，这些抑制剂不是放射性标记可容易获得的或存在其他测量问题(例如高水平的背景非特异性蛋白结合，这可能被测量为放射性标记结合，这种结合保持高浓度的‘冷’抑制剂的存在)。在这种情况下，首先与未标记的抑制剂一起形成酶复合物(约0.1至0.2μM)，然后通过用一种高浓度的¹⁴C-标记的结构A(或放射性标记的D)赶走(chase off)它并且监测在该标记结合到蛋白质时的速率而得到交换动力学。结构A是一种具有已知动力学特性的特别有效的抑制剂。在20倍或更高的过量结构A下在＞90％的平衡时将占据与在此所测试的其他抑制剂以及实际上的大多数其他抑制剂处于交换竞争的结合位点，(本领域普通技术人员当然可以设计该实验/相对浓度并且因此拟合这些数据)。示例性的方法还描述于PCT公开号WO 02/46387中。 

针对以下化合物，对于燕麦属衍生的HPPD SEQ ID NO：1得到了示例性的结合和解离速率数据(以及衍生的K_i值)。 

化合物A(¹⁴C 1.81GBq/mmol) 

如使用直接放射化学法在25℃下所确定的解离速率k1＝1.67E-05s^-1。 

如使用直接放射化学法在25℃下所确定的结合速率k2＝8.50E+04M^-1s^-1。 

K_d＝1.96E-10M。 

K_d/K_m比率＝0.000036。 

因此，k_off被评估为＝1.67E-05s^-1

化合物B(¹⁴C 1.81GBq/mmol) 

在25℃下解离速率k1(av)＝8.1E-04s^-1(单独的实验产生k1＝8.00E-04、8.88E-04、7.50E-04以及8.00E-04s^-1，如通过直接放射化学法所确定的)。 

在冰温下测量的k1＝1.58E-05s^-1(初始的单独的实验产生1.16E-05s^-1、1.0E-05s^-1、1.2E-05s^-1、1.5E-05s^-1)。随后，更好地考虑到非特异性结合值的更广泛的实验连贯地出现在接近并且平均大约1.58E-05s^-1(1.58E-05s^-1、1.5-05s^-1、1.67-05s^-1、1.5-05s^-1、1.58-05s^-1、1.58-05s^-1、1.5-05s^-1)。 

在25℃下结合速率k2(av)＝6.7E+04s^-1M^-1(单独的实验产生k2＝6.35E+04、7.50E+04、6.2E+04，如通过直接放射化学法确定的)。对于甲基磺草酮而言(它具有相对快速的解离速率)，基于以活性为基础的方法对于结合速率的估计是更加可变的，在25℃下其范围从4.2E+04s^-1M^-1、4.9E+04s^-1M^-1至7.5E+04s^-1M^-1。 

因此从这些放射化学数据中估计K_d为1.16E-08M^-1，相应于K_d/K_m比率为0.00217。 

因此k_off被估计为在25℃下8.1E-04s^-1并且在0℃下1.58E-05s^-1。 

化合物C(¹⁴C 0.774GBq/mmol) 

在25℃下解离速率k1(av)＝5.3E-05s^-1(初始实验产生了k1＝7.80E-05s^-1、9.17E-05s^-1、4.5E-05s^-1、6E-05s^-1、7E-05s^-1以及7.80E-05s^-1；然而更准确地考虑到非特异性结合效应的一个后续组的实验使得可能前面的高值是离群值)。基于之后的更连贯的值，解离速率k1(av)＝5.3E-05s^-1，基于单独的实验值6.5-05s^-1、5.0-05s^-1、5.67-05s^-1、4.67-05s^-1、5.17-05s^-1、4.67-05s^-1、4.67-05s^-1、以及6.0-05s^-1。 

结合速率k2(在25℃下如通过直接放射化学法估计是7.50E+03s^-1M^-1)与在25℃下来自基于酶活性的方法的估计值7.50E+03s^-1M^-1、7.80E+03s^-1M^-1、7.60E+03s^-1M^-1、7.20E+03s^-1M^-1以及1.0E+04s^-1M^-1是良好一致的。 

基于放射化学法K_d的估计值＝7.1E-09M。 

因此，K_d/K_m比率的估计值＝0.0013。 

因此，k_off被估计为5.3E-05s^-1

化合物D(¹⁴C 1.036GBq/mmol) 

如使用直接放射化学法所确定的在25℃下解离速率k1＝3.96E-05s^-1(单独的测量为4.17E-05s^-1以及3.75E-05s^-1)。如在一系列间接解离速率实验中测定的解离速率是4.25-05s^-1、4.66-05s^-1、4.5-05s^-1、4.83-05s^-1、3.83-05s^-1、4.5-05s^-1、4.5-05s^-1、4.33-05s^-1、5.0-05s^-1。从所有数据中取得的对于解离速率的平均值是4.39E-05s^-1。 

如通过直接放射化学法所确定的在25℃下结合速率k2＝3.20E+04M^-1s^-1。这与来自基于活性的方法的估计值(对于结合速率为3.20E+04M^-1s^-1以及5.7E+04M^-1s^-1)很好地一致。 

基于放射化学法K_d的估计值＝1.36E-9M。 

K_d/K_m比率的估计值＝0.00025。 

因此，k_off被估计为4.39E-05s^-1。 

化合物E 

如使用间接放射化学法所初始确定的在25℃下解离速率k1＝4.17E-05s^-1(基于单独的测量为5.50E-05s^-1以及2.85E-05s^-1)。根据一系列进一步的测量，初始较高的值将显得是一种离群值，其中获得的值是3.67E-05s^-1、3.17E-05s^-1、2.67E-05s^-1、3.17E-05s^-1、2.67E-05s^-1、3.33E-05s^-1、3.08E-05s^-1、2.02E-05s^-1、3.00E-05s^-1，以及一个新的平均k_off值被估计为2.96E-05s^-1。 

如通过直接非放射化学法所确定的在25℃下结合速率k2＝1.30E+05M^-1s^-1。 

K_d的估计值＝2.28E-10M。 

K_d/K_m比率的估计值＝0.000042。 

因此，k_off被估计为2.96E-05s^-1

化合物F 

根据一系列间接解离速率测量结果(7.08E-05s^-1、6.00E-05s^-1、7.00E-05s^-1以及6.83E-05s^-1)，平均的k_off值被估计为6.72E-05s^-1。 

实例2 

来自不同植物的HPPD SEQ ID NOs：1-14的克隆、表达和测定以及对于不同的HPPD除草剂的k_cat、K_mHP以及k_off的值的确定 

将由GeneArt(德国雷根斯堡)合成的编码来自不同植物的相应于SEQ ID NOs：1-14的HPPD多肽的对于大肠杆菌密码子使用优化的DNA序列克隆到pET24a中并且在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，用50μg/ml卡那霉素进行选择(如在PCT申请公开号WO 02/46387中所描述)。使细胞生长，制备蛋白提取物，并且如实例1中所描述进行HPPD活性位点滴定以及(对多种不同的除草剂的k_cat、K_mHPP、以及k_off值的)动力学测量。 

包含了相应于SEQ ID NO：1的HPPD作为实验中的一个内部对照。对于SEQ ID NO：1的不同的动力学参数的平均绝对值详细列于以上实例1中。在以下表2中的数据提供了来自对于SEQ ID NOs：2-14的这些测量结果的数据，表达为对于相应的SEQ ID NO：1的对照值的一个比例。因此，对于SEQ ID NO：1的所有的参数值被给定为1.0并且该表中的所有的值与对于SEQ ID NO：1的那些是相当的。 

表2 SEQ ID NOs：2-14的HPPD的动力学参数 

‘k_offB’、‘k_offC’等，是指通过与实例1中所述的HPPD抑制剂除草剂B-F的放射性标记交换而测量的解离速率。 

从表2中的数据清楚的是，相对于SEQ ID NO：1，一些HPPD是内在地较多抵抗不同的除草剂B-F的而其他是内在地较少抵抗不同的除草剂B-F的，并且因此或多或少地适合用于在转基因植物中赋予抗性。此外，一些展示出相对于SEQ ID NO：1的HPPD较大的或较小的k_cat/K_m值。对于每种除草剂，确定适合性或另外给定的HPPD序列的有关比较参数是k_cat/K_m(相对于对于SEQ ID NO：1)值与相应的对于除草剂的k_off速率(相对于对于SEQ ID NO：1)的倍数。 

因此，例如，从看麦娘属(Alopecurus)得到的SEQ ID NO：3的HPPD对于甲基磺草酮(B)给定了对于这个倍数的一个大约2.3的值，意味着它比SEQ ID NO：1有效大约2.3倍更抵抗于甲基磺草酮，如果所有条件是相等的，当同样在转基因植物中表达时，将赋予更高(可能大约两倍)水平的对于甲基磺草酮的耐受性。 

类似地，相同的序列还提供了胜过SEQ ID NO：1的对于测试的其他除草剂(苯吡唑草酮、tembo三酮以及衍生自异恶唑草酮的二酮腈等)的增强的(尽管在较小程度上)耐受性。同样，可以看出SEQ ID NOs：6、7以及8的HPPD也赋予了优点。在另一方面，一些测试的其他范围的HPPD显得比SEQ ID NO：1的HPPD对于提供对任何除草剂的耐受性显著地更不有效。因此，例如，来自野黍属(Erichola)、拟南芥属以及鬼针草属(Bidens)的HPPD显得是具有与SEQ ID NO：1的HPPD类似的催化活性，但是对于甲基磺草酮更敏感＞20倍，同时假单胞菌属酶两者都是较不催化有效的(对于SEQ ID NO：1 k_cat/K_m约0.2)并且对于甲基磺草酮是更敏感的。因此，在此所述的许多新的HPPD序列(例如SEQ ID NOs：2-8)提供了胜过现有技术的显著改进(关于用于提供对于HPPD除草剂并且特别是关于所例证的化学类别的耐受性提供更好的选项)。 

实例3 

HPPD的突变体变种的克隆、表达和测定以及对于不同的HPPD除草剂的k_cat、K_mHPP以及k_off的值的确定。 

使细胞生长，制备蛋白提取物，并且如实例1中所描述进行HPPD活性位点滴定以及k_cat、K_mHPP、以及k_off值的动力学测量。 

在本实例中，使用衍生自SEQ ID NO：1的以下HPPD序列： 

通过在位置358处将L取代为M，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：20。 

通过在位置217处将V取代为I，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：21。 

通过在位置217处将V取代为L，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：22。 

通过在位置326处将A取代为R，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：23。 

通过在位置326处将A取代为K，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：24。 

通过在位置326处将A取代为I，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：25。 

通过在位置339处将I取代为E，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：26。 

通过在位置339处将I取代为D，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：27。 

通过在位置339处将I取代为C，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：28。 

通过在位置408处将G取代为R，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：29。 

通过在位置358处将L取代为M并且在位置326处将A取代为R，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：30。 

通过在位置358处将L取代为M、通过在位置326处将A取代为R、并且通过在位置217处将V取代为I，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：31。 

通过在位置358处将L取代为M并且在位置217处将V取代为I，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：32。 

通过在位置326处将A取代为R并且在位置217处将V取代为I，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：33。 

通过在位置358处将L取代为M、通过在位置326处将A取代为K、并且通过在位置217处将V取代为I，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：34。 

通过在位置358处将L取代为M、通过在位置326处将A取代为R、并且通过在位置217处将V取代为L，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：35。 

通过在位置358处将L取代为M、通过在位置326处将A取代为R、通过在位置217处将V取代为I、并且通过在位置339处将I取代为E，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：36。 

通过在位置358处将L取代为M、通过在位置326处将A取代为R、通过在位置217处将V取代为L、并且通过在位置339处将I取代为E，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：37。 

通过在位置412处将G取代为H，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：42。 

通过在位置412处将G取代为C，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：43。 

通过在位置297处将Q取代为A，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：44。 

通过在位置283处将Q取代为N，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：45。 

通过在位置297处将Q取代为G，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：46。 

通过在位置358处将L取代为A，将SEQ ID NO：1改变为HPPD SEQ ID NO：47。 

在本实例中，使用了衍生自SEQ ID NO：3的以下HPPD序列： 

通过在位置359处将L取代为M并且在位置327处将A取代为R，将SEQ ID NO：3改变为HPPD SEQ ID NO：40。 

通过在位置359处将L取代为M、通过在位置327处将A取代为R、并且通过在位置218处将V取代为I，将SEQ ID NO：3改变为HPPD SEQ ID NO：41。 

在本实例中，使用了衍生自SEQ ID NO：7的以下HPPD序列： 

通过在位置353处将L取代为M并且在位置321处将A取代为R，将SEQ ID NO：7改变为HPPD SEQ ID NO：38。 

通过在位置353处将L取代为M、通过在位置321处将A取代为R、并且通过在位置213处将第一个V取代为I，将SEQ ID NO：7改变为HPPD SEQ ID NO：39。 

包含了相应于SEQ ID NO：1的HPPD作为实验中的一个内部对照。对于SEQ ID NO：1的HPPD的不同的动力学参数的平均绝对值详细列于以上实例1中。在以下表3-5中的数据提供了来自对于SEQ ID NOs：20-47和50的这些测量结果的数据，表达为相应的对于SEQ ID NO：1的对照值的一个比例。因此，对于SEQ ID NO：1的所有参数值被给定为1.0。 

表3 SEQ ID NOs：20-29的HPPD的动力学参数 

表4 SEQ ID NOs：30-36的HPPD的动力学参数 

表5 SEQ ID NOs：37-47和50的HPPD的动力学参数 

从表3-5中所描述的数据清楚的是，相对于SEQ ID NO：1，一些HPPD是内在地较多抵抗不同的除草剂B-F的而其他是内在地较少抵抗不同的除草剂B-F的，并且因此或多或少地适合用于在转基因植物中赋予抗性。再次，对于每种除草剂，确定适合性或另外给定的HPPD序列的有关比较参数是k_cat/K_m(相对于对于SEQ ID NO：1)值与相应的对于除草剂的k_off速率(相对于对于SEQ ID NO：1)的倍数。因此，具有在SEQ ID NO：1的位置L358、V217、I339以及A326处相对于SEQ ID NO：1的单个氨基酸改变的那些序列(例如SEQ ID NOs：20-29)不仅在对于一种或多种测试除草剂(B-F)的解离速率(k_off)方面显示出显著的增加而且保持催化有效(即k_cat/K_m保持大约相同或比SEQ ID NO：1改进)。因此，例如，SEQ ID NO：26的HPPD(它具有相对于SEQ ID NO：1的一种I339E氨基酸置换)在对于除草剂B、D、E和F的固有耐受性方面相对于SEQ ID NO：1展示出显著(约1.5倍)的改进。类似地，不同的其他单个氨基酸置换(SEQ ID NOs：20-29的L358M、V217I、V217L、G408R、I339D、I339C、A326R、A326I以及A326K)还提供了在对于一种或多种除草剂的固有耐受性方面的改进。 

SEQ ID NO：29(具有相对于SEQ ID NO：1的一种G408R变化)展示出SEQ ID NO：1的HPPD的仅大约四分之一至三分之一的催化活性。然而，在催化活性方面的这种不足更多地是通过在k_off值(决定化合物B和E从该酶上的解离速率)方面的8X或更多的增加来补足的。另外的证据证明突变G408对于突变体酶赋予了有利的特性。例如，一种G408A置换具有与SEQ ID NO：1(k_cat/K_m)的HPPD类似的催化活性，并且与SEQ ID NO：1相比在与甲基磺草酮的酶∶抑制剂复合体的解离速率(k_off)方面展示出1.45倍的增加。相对于SEQ ID NO：1，G408A突变体HPPD还展示出在关于抑制剂D的k_off值方面大于1.5X的增加以及在关于抑制剂E的k_off值方面大于3.5X的增加。这样，通过这些披露的突变赋予的额外的改进，对于HPPD除草剂(并且特别是对于在此所例证的结构类别)的商业水平的的耐受性是更容易获得的。 

为了提供任何程度的有用的耐受性，一种突变必须提供一种在除草剂结合方面在数字大小上的降低(在此被测量为在除草剂从酶上的解离速率方面的增加)，这比任何催化不足(在此测量为k_cat/K_m)更为重要。甚至更有价值的是可以与彼此组合在一起并且结合到多种HPPD序列(例如在表2中列出的HPPD)中的那些突变，从而组合起作用并且相对于天然HPPD提供附加的、或更优选地协同水平的除草剂耐受性。 

因此，例如，从燕麦属得到的SEQ ID NO：30的变体HPPD(SEQ ID NO：23的A326R置换与SEQ ID NO：20的L358M置换组合)提供了超过两个单个的突变中的任何一个的水平的HPPD除草剂抗性并且确实提供了几乎倍增的增加。所以，例如SEQ ID NO：30的HPPD比SEQ ID NO：1大约3.5倍更抵抗于甲基磺草酮，并且因此，如果所有条件是相等的，当同样在转基因植物中表达时将赋予更高水平(优选大约三倍或更大的倍数)的对于甲基磺草酮的耐受性。相同的HPPD序列(即SEQ ID NO：30)还提供了比SEQ ID NO：1增强的耐受性(关于所测试的其他除草剂)并且值得注意地例如是比SEQ ID NO：1大约3倍更耐受于苯吡唑草酮和异恶唑草酮(二酮腈)。SEQ ID NO：31的HPPD(将SEQ ID NO：21的V217I置换与SEQ ID NO：20的L358M置换以及SEQ ID NO：23的A326R置换进行组合)相应地显示出胜过SEQ ID NO：1的HPPD的甚至仍进一步的(约5.8倍)在对于甲基磺草酮以及其他除草剂的抗性方面的增强。类似地，SEQ ID NO：36的HPPD(仍进一步将SEQ ID NO：26的I339E变化加入到SEQ ID NO：31的那些上)比SEQ ID NO：1的HPPD是仍然甚至更耐受于(大约9.8倍)甲基磺草酮的。这证明了可以将所有这些氨基酸位置处的变化进行组合从而提供增强水平的固有的酶除草剂耐受性。 

此外，这些相同的突变改变还起作用并且有利地改变了HPPD的特征，除了来自燕麦属的SEQ ID NO：1以外。因此，例如，SEQ ID NO：40组合了与在SEQ ID NO：30中等效的氨基酸变化，但是这次在SEQ ID NO：3的看麦娘属HPPD中。这两种突变改变以及看麦娘属HPPD酶的胜过燕麦属的益处大约倍增地起作用，从而考虑到k_cat/K_m和k_off值，SEQ ID NO：40的HPPD相对于SEQ ID NO：1在对于甲基磺草酮的固有耐受性方面展示出大于10倍的改进。类似地，SEQ ID NO：39组合了与在SEQ ID NO：31中等效的氨基酸变化，但是这次在SEQ ID NO：7的早熟禾属HPPD中。因此，相比于SEQ  ID NO：31的HPPD(比SEQ ID NO：1的HPPD大约好3.2倍)，SEQ ID NO：39对于化合物D展示出显著更好的耐受性(比SEQ ID NO：1的HPPD大约好4.7倍)。SEQ ID NO：41也组合了与在SEQ ID NO：31中等效的氨基酸变化，但是这次在SEQ ID NO：3的看麦娘属HPPD中。SEQ ID NO：41的HPPD展示出高水平的对化合物E(比SEQ ID NO：1的HPPD大约高5.8倍)以及还对甲基磺草酮(比SEQ ID NO：1的HPPD大约高13.8倍)两者的固有耐受性。 

实例4 

由烟草中表达的异源HPPD酶赋予的除草剂耐受性的制备和评价 

在本实例中，天然的和突变体HPPD是，例如，SEQ ID NOs：1-14和20-47。编码了这些HPPD的DNA序列(对于烟草是优化的，或任选地根据一种目标作物如大豆进行密码子优化的)是合成地制备的并且从GeneArt(德国雷根斯堡)商业地获得的。每个序列被设计成具有5’Nde1和3’BamH1位点以有助于直接克隆并且然后克隆到一个合适的二元载体中用于基于农杆菌属的植物转化。 

在一个具体的实施方案中，将编码碧冬茄属(petunia)EPSPS叶绿体转运肽(SEQ ID NO：48)至HPPD SEQ ID NOs：13和14以及小麦HPPD(SEQ ID NO：5，在PCT公开号WO 02/46387中；UNIPROT：A7WK82)的N端融合的烟草优化的基因克隆到表达构建体中并且转化到烟草中。编码CTP/HPPD的核苷酸序列被PCR进行编辑(或初始地合成)以包括5’XhoI位点、TMVΩ增强子(SEQ ID NO：86)以及3’KpnI位点(并且为了除去任何此类内部位点)。 

使用XhoI/KpnI切断该表达盒(包括TMV Ω5’前导序列、CTP和4-HPPD基因)并且克隆到类似地消化的pBIN 19(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))中(在双重增强的35S启动子(SEQ ID NO：87)之后并且在NOS 3’转录终止子(SEQ ID NO：88)之前)并且然后转化到大肠杆菌TOP 10感受态细胞中。使用从该大肠杆菌中回收的DNA来转化根癌农杆菌LBA4404，并且在包含利福平和卡那霉素的培养基上选择转化的细菌。使用本领域中已知的方法或如在此所述使烟草组织经受农杆菌介导的转化。例如，使用包含表达HPPD的二元载体的根癌农杆菌的母板来接种包含100mg/l利福平加上 50mg/l卡那霉素的10ml LB(L肉汤)(使用单一的菌落)。在28℃下在200rpm摇动下将这种培养物孵育过夜。使用这种整个的过夜培养物来接种50ml体积的包含相同抗生素的LB。再一次，在28℃下在200rpm摇动下将这种培养物培养过夜。通过在3000rpm下离心15分钟使这些农杆菌细胞沉淀，然后再悬浮于包含30g/l蔗糖、pH 5.9的MS(Murashige and Skoog)的培养基中至OD(600nM)＝0.6。将这种悬浮液以25ml等分部分分配到皮氏培养皿中。 

克隆地微繁殖的烟草嫩枝培养物被用来切除嫩叶(还没有完全展开)。将中脉和外叶缘移开并且弃去，并且将剩余的叶片切成1平方cm。将这些叶片转移到农杆菌悬浮液中持续20分钟。然后将外植体移开，在无菌滤纸上轻拍以移除过量的悬浮液，然后转移到固体NBM培养基(在pH 5.9下的包含30g/l蔗糖、1mg/l BAP(苯甲酸嘌呤)以及0.1mg/l NAA(萘乙酸)并且用8g/l植物琼脂进行固化的MS培养基)上，使各外植体的背轴面与该培养基相接触。每个皿转化约7个外植体，然后将该皿密封并且在光照培养箱中在25℃下保持16小时光周期持续3天。 

然后将这些外植体转移到包含100mg/l卡那霉素加上抗生素的NBM培养基上以进一步阻止农杆菌的生长(具有250mg/l羧苄青霉素的200mg/l特美汀)。然后每2周在这种相同的培养基上进行进一步的传代培养。 

当嫩枝开始从愈伤组织叶外植体再生时，将这些移到嫩枝伸长培养基中(MS培养基，30g/l蔗糖、8g/l植物琼脂、100mg/l卡那霉素、200mg/l特美汀、250mg/l羧苄西林、pH 5.9)。在2周内这些稳定的转基因植物容易地生根。为了对每个事件提供多种植物，以最终允许对每种转基因植物的一种以上的除草剂测试，将所有生根的嫩枝进行微繁殖从而产生3个或更多个生根的克隆。 

使用引物(这些引物扩增了该HPPD转基因内的500bp片段)通过PCR对在结合卡那霉素的培养基上正在生根并且显示出旺盛的枝生长的推定的转基因植物进行分析。在未转化的烟草上的这种相同的引物集的评估结论性地显示出这些引物不会扩增来自天然烟草HPPD基因的序列。 

将转化的嫩枝分成2或3个克隆并且从卡那霉素抗性愈伤组织进行再生。这些嫩枝在包含卡那霉素的MS琼脂上生根。使存活的生根的外植体再 生根从而提供了来自各事件的约40-50个卡那霉素抗性的并且PCR阳性的事件。 

一旦生根，将这些小植株从琼脂转移并且盆栽到具有50％泥炭、具有缓释肥料的50％John Innes Soil No.3的3英寸圆形盆中，有规律地浇水从而在温室中建立8至12天。温室条件被调节到白天约24℃至27℃；夜间18℃至21℃并且大致14小时的光周期。将湿度调节到大约65％并且光水平是在台式水平(bench level)下高达2000μmol/m²。 

因此产生了三个转基因群体，这些群体各自具有约40个烟草植株并且可替代地包含一种编码小麦HPPD(A7WK82)、HPPD SEQ ID NO：12或HPPD SEQ ID NO：13的HPPD基因。然后基于相同的大小从每个群体中选择大约30个植物的亚群用于喷雾试验。然后将所有的植物用600g/ha的甲基磺草酮进行喷雾。将Callisto 与0.2％-0.25％X-77 

表面活性剂混合在水中并且从适当的轨道喷雾器上的喷杆进行喷雾，该喷雾器以2mph移动，其中喷嘴距离植物顶部约2英寸。喷雾量是200l/ha。针对损害对这些植物进行评定并且在处理后14天进行评分(DAT)。在表6中描述了这些结果。 

在表6中的黑框表示在那个特定的事件中的植物是绿色的，而灰框表明这些植物是部分漂白的。剩余的白框表示这些植物是完全漂白的。根据表6中描述的数据可以清楚的是，对于同样表达的HPPD，仅仅小麦HPPD(A7WK82)赋予了有用水平的对甲基磺草酮的耐受性(即，直到至少2-4X的一个正规大田施用率而仍正常健康)。相比之下，SEQ ID NO：13(来自拟南芥属)以及SEQ ID NO：14(来自荧光假单胞菌)的HPPD没有提供在该喷雾率的有效耐受性。33个小麦HPPD事件中的五个显示出＜或等于10％的损害(零至轻度矮化)。根据所表达的HPPD的这种在甲基磺草酮耐受性方面的差异是与表2中描述的体外数据(表明拟南芥属和假单胞菌属HPPD都没有很好的对甲基磺草酮的固有耐受性)并且还与描述了小麦HPPD(在体外和在植物体内两者)对于这些之一的相对显著优越性的公开数据(Hawkes et al(2001)in Proc.Brit Crop Prot.Conf.(Weeds)，p 563.British Crop Protection Council以及PCT公开号WO 02/46387)两者是完全一致的。 

表6 

表7描述了用600g/ha异恶唑草酮的克隆植物的损伤14DAT的评定，具有如表6中所述的相同的事件，来自相同时间平行进行的一个实验。 

表7 

喷雾了异恶唑草酮的所有植物被损伤，其中仅仅3/33的表达小麦HPPD的事件表现出小于20％的损伤。再次，表达了拟南芥属HPPD的植物中没有一个可观地显出抗性，而假单胞菌属HPPD确实赋予了某种程度的耐受性，其中4/32的植物显示出50％的损伤或更少。再次，这与体外动力学数据(表2和PCT公开号WO 02/46387)广泛一致，显示出虽然展示出对于HPP的高K_m值并且因此展示出相对差的k_cat/K_m值，假单胞菌属HPPD并没有展示出相对高的对异恶唑草酮的二酮腈(即化合物D)的k_off值。 

上述数据广泛建立了确定体外酶动力学的预测力，如通过相对值(k_cat/K_m)x k_off所确定的，从而预见一种给定的HPPD当在一个作物植物中表达时能赋予多少的对一种给定的HPPD除草剂的耐受性。 

在另外的实例中，将编码HPPD SEQ ID NOs.1至14以及HPPD SEQ NOs：20-47的烟草优化的基因克隆(这次没有任何CTP)到表达构建体中(如以下所述)并且转化到烟草中。编码HPPD的核苷酸序列被PCR进行编辑(或初始地合成)以包括5’XhoI位点、TMV Ω增强子以及3’KpnI位点(并且为了除去任何此类内部位点)。使用XhoI/KpnI切断该表达盒(包括TMVΩ前导序列和4-HPPD基因)并且克隆到类似地消化的pBIN 19(Bevan，Nucl.Acids Res.(1984))中(在双重35S启动子之后并且在Nos基因转录终止子 之前)并且然后转化到大肠杆菌TOP 10感受态细胞中。再次，再生了烟草植物的转基因群体并且在温室中进行评定，如以上所述。 

实例5 

大豆转化载体的构建 

用以下各项来构建用于双子叶植物(大豆)转化的二元载体：启动子(例如包含CaMV 35S的合成启动子)以及驱动HPPD编码序列(例如SEQ ID NOs：1-8和20-41)的表达的FMV转录增强子，紧接着Nos基因3’终止子。基于HPPD基因编码区的预测的氨基酸序列，HPPD基因被密码子优化以用于大豆表达。在这种情况下，HPPD本身并不被用作选择标记，通过加入转化选择标记基因来构建包含HPPD表达盒的农杆菌二元转化载体。例如，二元转化载体17900(SEQ ID NO：51)包含编码HPPD变体(SEQ ID NO：49)的表达盒，该表达盒连接有两个PAT基因盒(具有35S启动子并且具有CMP启动子，并且其中两个PAT基因都紧接着nos终止子)用于在转化过程期间进行基于草铵膦的选择。另一种二元转化载体(17901；SEQ ID NO：52)包含编码HPPD变体(SEQ ID NO：24)的表达盒并且还有EPSPS选择标记盒。将载体17901转化到大豆中，并且使用不成熟种子目标物的农杆菌介导的转化使用草甘磷选择得到转基因植物。这些编码HPPD基因的DNA序列被密码子优化的以用于在双子叶植物中表达。 

使用本领域的普通技术人员所熟知的方法(如重叠PCR、DNA合成、限制性片段亚克隆以及连接)的组合来构建上述实例的二元载体。它们的独特结构在图3(载体17900)以及图4(载体17901)中并且在序列表SEQ ID NOs：51和52中变得清楚。关于这些载体的另外的信息提供如下。 

在图3(载体17900)中所使用的缩写被定义如下： 

cAvHPPD-04 

起点：1024 终点：2343 

编码SEQ ID NO：49的大豆密码子优化的燕麦HPPD基因 

cPAT-03-01 

起点：3209 终点：3760 

PAT Hoescht AO2774合成的产绿色链霉菌，植物密码子；与Q57146草胺膦乙酰转移酶蛋白相同 

cPAT-03-02 

起点：5062 终点：5613 

PAT Q57146产绿色链霉菌草胺膦乙酰转移酶蛋白，cPAT-03-01DNA，具有突变的BamH1、Bgl2位点 

cSpec-03 

起点：6346 终点：7134 

也被称为aadA；编码酶氨基糖甙3′腺苷酰转移酶的基因，赋予了对大观霉素和链霉素的抗性用来将载体保持在大肠杆菌和农杆菌中。 

cVirG-01 

起点：7434 终点：8159 

来自pAD1289的virG(推定的)(具有TTG起始密码子)。virGN54D来自Hansen et al.1994，PNAS 91：7603-7607中所描述的pAD1289 

cRepA-01 

起点：8189 终点：9262 

RepA，pVS1复制蛋白 

eNOS-01 

起点：168 终点：259 

来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)。 

eFMV-03 

起点：396 终点：589 

来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区 

e35S-05 

起点：596 终点：888 

在CMV 35S增强子区中C至T以及C至A的碱基对变化。 

eTMV-02 

起点：953 终点：1020 

被考虑用来增强表达的TMV Ω5′UTR引导序列。EMBL：TOTMV6 

eFMV-03 

起点：4054 终点：4247 

来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区 

e35S-05 

起点：4254 终点：4546 

在CMV 35S增强子区中C至T以及C至A的碱基对变化 

eNOS-01 

起点：4557 终点：4648 

来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)。 

bNRB-05 

起点：4 终点：259(互补序列) 

右边缘/NOST-DNA区；可以影响多个启动子。EMBL Nos：J01826、V00087、AF485783。 

bNRB-01-01 

起点：101 终点：125(互补序列) 

根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的右边缘重复序列 

bNLB-03 

起点：5937 终点：6066(互补序列) 

根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的左边缘区 

起点：5972 终点：5996(互补序列) 

根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的25bp左边缘重复序列区 

prCMP-04 

起点：4655 终点：5051 

夜香树黄叶卷曲病毒启动子以及引导序列。Genbank 

登录号AF364175。还参见美国专利申请公开号20040086447。prCMP-01在5′端上具有1个碱基对平截并且在3′端上具有2个碱基对平截 

pr35S-04-01 

起点：2664 终点：3184 

来自CMV的35S启动子。EMBL：CAMVG2 

oVS1-02 

起点：9305 终点：9709 

来自假单胞菌的质粒pVS1的复制起始区和分隔区(Itoh等人，1984，Plasmid 11：206-220)；类似于GenBank 

登录号U10487；在根癌农杆菌宿主中用作复制起始区。 

oCOLE-06 

起点：10387 终点：11193(互补序列) 

从pUC19得到的在大肠杆菌中起作用的ColE1复制起始区 

tNOS-05-01 

起点：2360 终点：2612 

合成胭脂碱合成酶终止子 

tNOS-05-01 

起点：3794 终点：4046 

合成胭脂碱合成酶终止子 

tNOS-05-01 

起点：5642 终点：5894 

合成胭脂碱合成酶终止子 

在图4(载体17901)中所使用的缩写被定义如下： 

cAmHPPD-01 

起点：1024 终点：2346 

编码SEQ ID NO：50的烟草密码子优化的大穗看麦娘HPPD基因 

cGmEPSPS-01 

起点：3675 终点：5252 

双重突变型大豆EPSPS cDNA的大豆密码子优化形式 

cSpec-03 

起点：6346终点：7134 

也被称为aadA；编码酶氨基糖甙3′腺苷酰转移酶的基因，赋予了对大观霉素和链霉素的抗性用于将载体保持在大肠杆菌和农杆菌中。 

cVirG-01 

起点：7434 终点：8159 

来自pAD1289的virG(推定的)(具有TTG起始密码子)。virGN54D来自Hansen et al.1994，PNAS 91：7603-7607中所描述的pAD1289 

cRepA-01 

起点：8189 终点：9262 

RepA，pVS1复制蛋白 

eNOS-01 

起点：168 终点：259 

来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)。 

eFMV-03 

起点：396 终点：589 

来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区 

e35S-05 

起点：596 终点：888 

在CMV 35S增强子区中C至T以及C至A的碱基对变化 

eTMV-02 

起点：953 终点：1020 

被考虑用来增强表达的TMV Ω5′UTR引导序列。EMBL：TOTMV6 

eFMV-03 

起点：4054 终点：4247 

来自玄参花叶病毒(FMV)的增强子区 

e35S-05 

起点：4254 终点：4546 

在CMV 35S增强子区中C至T以及C至A的碱基对变化 

eNOS-01 

起点：4557 终点：4648 

来自15235的推定的NOS增强子序列(如在某些二元载体的右边缘中所发现的)。 

bNRB-05 

起点：4终点：259(互补序列) 

右边缘/NOST-DNA区；可以影响多个启动子。EMBL Nos：J01826、V00087、AF485783。 

bNRB-01-01 

起点：101 终点：125(互补序列) 

根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的右边缘重复序列bNLB-03 

起点：5937 终点：6066(互补序列) 

根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的左边缘区 

起点：5972 终点：5996(互补序列) 

根癌农杆菌胭脂碱ti质粒的T-DNA的25bp左边缘重复序列区prCMP-04 

起点：4655终点：5051 

夜香树黄叶卷曲病毒启动子以及引导序列。Genbank 

登录号AF364175。还参见美国专利申请公开号20040086447。prCMP-01在5′端上具有1个碱基对平截并且在3′端上具有2个碱基对平截 

oVS1-02 

起点：9305 终点：9709 

来自假单胞菌的质粒pVS1的复制起始区和分隔区(Itoh等人，1984，Plasmid 11：206-220)；类似于GenBank 

登录号U10487；在根癌农杆菌宿主中用作复制起始区 

oCOLE-06 

起点：10387 终点：11193(互补序列) 

从pUC19得到的在大肠杆菌中起作用的ColE1复制起始区 

tNOS-05-01 

起点：2360 终点：2612 

合成胭脂碱合成酶终止子 

tNOS-05-01 

起点：3794 终点：4046 

合成胭脂碱合成酶终止子 

实例6 

大豆的转化以及除草剂抗性植物的选择 

可以将大豆植物材料适当地转化并且通过本领域的普通技术人员熟知的多种方法再生育性植物。例如，可以通过以下各项得到育性的形态学正常的转基因大豆植物：1)从例如不成熟的子叶、下胚轴或其他适合的组织生 产体细胞胚性组织；2)通过粒子轰击或用农杆菌感染来进行转化；以及3)再生出植株。在一个实例中，如在美国专利号5,024,944中所描述的，从大豆的不成熟胚中切除子叶组织，优选地将胚轴移出，并且在包含激素的培养基中进行培养从而形成体细胞胚性植物材料。使用例如直接DNA方法、DNA包被的微弹轰击或用农杆菌感染来将该材料转化，在一种适合的选择培养基上进行培养并且任选地还在选择剂的连续存在下再生成育性转基因大豆植物。选择剂可以是抗生素如卡那霉素、潮霉素或除草剂(如草胺膦或草甘磷)，或可替代地，选择可以是基于可见标记基因(如GUS)的表达。可替代地，用于转化的靶组织包括分生组织而不是体细胞克隆胚性组织或任选地是花或形成花的组织。可以找到大豆转化的其他实例，例如通过物理的DNA递送方法，如粒子轰击(Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182；McCabe et al.(1988)Bio/technology 6：923-926)、噬菌体颈须法(Khalafalla et al.(2006)African J.of Biotechnology 5：1594-1599)、气溶胶束注射(美国专利号7,001,754)、或通过农杆菌介导的递送方法(Hinchee et al.，(1988)Bio/Technology 6：915-922、美国专利号7,002,058、美国专利申请公开号20040034889、美国专利申请公开号20080229447、Paz et al.(2006)Plant Cell Report 25：206-213)。还可以将HPPD基因递送到细胞器中，例如用来赋予增加的除草剂抗性的质体(参见美国专利申请公开号20070039075)。 

可以用不同的转化方法用上述的包含HPPD基因变体的二元载体来产生大豆转基因植物。任选地，该HPPD基因可以提供选择和鉴定转基因组织的手段。例如，如所述(参见例如美国专利申请公开号20080229447)使用一种载体来转化不成熟的种子目标物从而直接使用HPPD抑制剂(例如甲基磺草酮)作为选择剂来产生转基因HPPD大豆植物。任选地，HPPD基因可以在其他序列的旁边存在于多核苷酸中，这些其他序列提供选择/鉴定转化的组织的另外的手段，包括例如提供对卡那霉素、潮霉素、草胺膦、氟丙嘧草酯、或草甘膦具有抗性的已知基因。例如，将包含如在实例4中所述的PAT或EPSPS选择标记基因的不同的二元载体转化到不成熟大豆种子目标物中，从而使用如所述的农杆菌介导的转化以及草铵膦或草甘膦选择而产生HPPD除草剂耐受性植物(参见，例如，美国专利申请公开号20080229447)。 

可替代地，选择标记序列可以存在于分开的多核苷酸上并且使用例如一种共转化或共选择的方法。可替代地，除了选择标记基因之外，可以使用一种可评分的标记基因(例如GUS)来鉴定转化的组织。 

如所述可以使用一种用于大豆转化的基于农杆菌的方法使用草铵膦、草甘膦或HPPD抑制剂甲基磺草酮作为选择剂使用不成熟的大豆种子来产生转基因植物(美国专利申请公开号20080229447)。 

实例7 

大豆T₀转基因植物的生长、分析以及除草剂耐受性的评估 

将来自组织培养物的T₀植物放到温室中，在温室中将它们移植到在2”方形盆中的混合有1％颗粒性Marathon (宾夕法尼亚州Mainland市奥林匹克园艺制品公司)(5-10g/galRedi-Earth 

Mix)的水饱和的土壤(华盛顿州贝尔维尤市Sun Gro Horticulture公司Redi-Earth 

Plug and Seedling Mix)中。将这些植物用潮湿拱顶进行覆盖并且置于具有以下环境条件的一个Conviron室(北达科他州彭比纳)中：白天24℃；夜间18℃；16小时光照以及8小时黑暗光周期；并且80％相对湿度。 

在植物已经被建立在土壤中并且出现新的生长(约1至2周)之后，将植物取样并且使用适当的用于HPPD基因的探针、或启动子(例如prCMP和prUBq3)通过Taqman^TM分析对所希望的转基因的存在进行测试。所有的阳性植物和一些阴性植物被移植到含有MetroMix 

380土壤的4”方形盆中(华盛顿州贝尔维尤市Sun Gro Horticulture公司)。以推荐的比率将Sierra 17-6-12缓释肥料掺入土壤中。阴性植物充当对于喷雾实验的对照。然后将这些植物重新安置在一个标准温室中以与适应环境(约1周)。这些环境条件典型地是：白天27℃；夜间21℃；16小时光周期(具有环境光照)；环境湿度。在适应环境(大约1周)后，这些植物准备用所希望的除草剂进行喷雾。将这些除草剂耐受性转基因大豆植物生长至成熟用于种子生产。使用转基因种子和子代植物来进一步对它们的除草剂耐受性性能以及分子特征进行评估。 

因此，使载体17900(图3)和载体17901(图4)(来自相同的表达盒，可替代地表达SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50)的T1大豆植物生长并且对 一定范围的HPPD除草剂的耐受性进行测试，与同样表达HPPD SEQ ID NO：1的相似植物进行比较。 

本说明书中提到的所有专利、专利申请以及公开文献都指示了本发明涉及的本领域的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请以及公开文献均通过引用结合在此，其程度如同每个单独的公开文献或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而结合。 

虽然本发明参照具体实施方案进行披露，所清楚的是在不偏离本发明的真实精神和范围下本发明的其他实施方案和变更可以由其它的本领域的普通技术人员来设计。所附的权利要求包括所有这些实施方案以及等同变体。 

Claims (23)

1.分离的多肽，包括选自下组的氨基酸序列：

a)包括在SEQ ID NOs：2-8、20-41、49以及50的任何一个中所列出的氨基酸序列的多肽；

b)与a)的多肽具有至少大约99％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

c)与a)的多肽具有至少大约99％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

d)与a)的多肽具有至少大约99％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

e)与a)的多肽具有至少大约99％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

f)与a)的多肽具有至少大约99％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

g)与a)的多肽具有至少大约98％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

h)与a)的多肽具有至少大约98％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

i)与a)的多肽具有至少大约98％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

j)与a)的多肽具有至少大约98％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

k)与a)的多肽具有至少大约98％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

l)与a)的多肽具有至少大约97％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

m)与a)的多肽具有至少大约97％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

n)与a)的多肽具有至少大约97％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

o)与a)的多肽具有至少大约97％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

p)与a)的多肽具有至少大约97％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

q)与a)的多肽具有至少大约96％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

r)与a)的多肽具有至少大约96％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

s)与a)的多肽具有至少大约96％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

t)与a)的多肽具有至少大约96％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

u)与a)的多肽具有至少大约96％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

v)与a)的多肽具有至少大约95％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

w)与a)的多肽具有至少大约95％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

x)与a)的多肽具有至少大约95％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

y)与a)的多肽具有至少大约95％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

z)与a)的多肽具有至少大约95％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

aa)与a)的多肽具有至少大约94％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

bb)与a)的多肽具有至少大约94％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

cc)与a)的多肽具有至少大约94％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

dd)与a)的多肽具有至少大约94％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

dd)与a)的多肽具有至少大约94％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

ff)与a)的多肽具有至少大约93％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

gg)与a)的多肽具有至少大约93％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

hh)与a)的多肽具有至少大约93％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

ii)与a)的多肽具有至少大约93％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

jj)与a)的多肽具有至少大约93％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

kk)与a)的多肽具有至少大约92％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

ll)与a)的多肽具有至少大约92％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

mm)与a)的多肽具有至少大约92％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

nn)与a)的多肽具有至少大约92％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

oo)与a)的多肽具有至少大约92％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

pp)与a)的多肽具有至少大约91％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

qq)与a)的多肽具有至少大约91％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

rr)与a)的多肽具有至少大约91％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

ss)与a)的多肽具有至少大约91％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

tt)与a)的多肽具有至少大约91％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

uu)与a)的多肽具有至少大约90％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代；

vv)与a)的多肽具有至少大约90％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列G(I，V)LVD(R，K)，其中L被任何其它的氨基酸取代；

ww)与a)的多肽具有至少大约90％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列DH(V，I，M)VGN，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代；

xx)与a)的多肽具有至少大约90％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)，其中A或P被任何其它的氨基酸取代；

yy)与a)的多肽具有至少大约90％序列同一性的多肽，其中该多肽具有HPPD酶活性并且包括序列CGGFGKGN，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代；

zz)包括氨基酸序列(L，I，R)(V，A)(G，A)DVL(S，T)的多肽，其中第一个L、I、或R被任何其它的氨基酸取代，其中该多肽具有HPPD酶活性；

aaa)包括氨基酸序列G(I，V)LVD(R，K)的多肽，其中L被任何其它的氨基酸取代，其中该多肽具有HPPD酶活性；

bbb)包括氨基酸序列DH(V，I，M)VGN的多肽，其中第一个V、I、或M被任何其它的氨基酸取代，其中该多肽具有HPPD酶活性；

ccc)包括氨基酸序列GGF(E，D)F(M，L)(A，P)的多肽，其中A或P被任何其它的氨基酸取代，其中该多肽具有HPPD酶活性；以及

ddd)包括氨基酸序列CGGFGKGN的多肽，其中第二个G或K被任何其它的氨基酸取代，其中该多肽具有HPPD酶活性。

2.如权利要求1所述的分离的多肽，其中该多肽进一步包括相应于在表1中列出的氨基酸取代的一个或多个氨基酸取代或缺失。

3.编码如权利要求1所述的分离的多肽的分离的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的选自下组的分离的多核苷酸，该组由以下各项组成：SEQ ID NOs：53-82、84以及85。

5.分离的多核苷酸，该多核苷酸在严谨条件下与如权利要求3所述的分离的多核苷酸杂交，其中这些严谨条件是选自下组：

a)在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA，及在2X SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；

b)在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA，及在1X SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；

c)在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA，及在0.5X SSC中洗涤；

d)在50℃的0.1％SDS，优选在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA中，及在0.1X SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；以及

e)在50℃的7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄、1mM EDTA，及在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤。

6.如权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中该分离的多核苷酸的核苷酸序列被优化用于在植物中进行表达。

7.表达盒，该表达盒包括可操作地连接于启动子的如权利要求3所述的分离的多核苷酸，该启动子在植物或植物细胞中驱动表达。

8.如权利要求7所述的表达盒，进一步包括可操作地连接的编码多肽的分离的多核苷酸序列，该多肽赋予希望的性状。

9.如权利要求8所述的表达盒，其中这种希望的性状是对除草剂的抗性或耐受性。

10.如权利要求9所述的表达盒，其中所述希望的性状是对HPPD抑制剂、草甘磷、或草铵膦的抗性或耐受性。

11.如权利要求10所述的表达盒，其中赋予希望的性状的所述多肽是细胞色素P450或它的变体。

12.如权利要求10所述的表达盒，其中赋予希望的性状的所述多肽是EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)(5-enol-pyrovyl-shikimate-3-phosphate-synthase)。

13.如权利要求10所述的表达盒，其中赋予希望的性状的所述多肽是草胺膦乙酰转移酶(PAT)。

14.包括如权利要求7所述的表达盒的载体。

15.如权利要求14所述的载体，其中该载体包括SEQ ID NOs：51或52之一。

16.用于在植物中赋予对HPPD抑制剂的抗性或耐受性的方法，该方法包括将如权利要求7所述的表达盒引入到该植物中。

17.转化的植物细胞，包括如权利要求7所述的表达盒。

18.如权利要求17所述的转化的植物细胞，其中这种转化的植物细胞是来自选自下组的植物：水稻、大麦、马铃薯、甘薯、低芥酸菜籽、向日葵、黑麦、燕麦、小麦、玉米、大豆、甜菜(sugar beet)、烟草、芒草、柳枝稷、红花、树类、棉花、木薯、番茄、高粱、苜蓿、甜菜、以及甘蔗。

19.如权利要求17所述的转化的植物细胞，其中这种转化的植物细胞是大豆植物细胞。

20.包括如权利要求17所述的植物细胞的植物、植物部分、或种子。

21.在包括作物植物和杂草的场所控制杂草的方法，其中该作物植物包括根据权利要求20所述的植物，该方法包括对该场所施用杂草控制量的一种或多种HPPD抑制剂。

22.如权利要求21所述的方法，其中一种或多种HPPD抑制剂是选自下组：二环吡喃酮(bicyclopyrone)(CAS RN 352010-68-5)、苯并双环酮(benzobicyclon)(CAS RN 156963-66-5)、吡草酮(benzofenap)(CAS RN82692-44-2)、螺旋多司酮(ketospiradox)(CAS RN 192708-91-1)或其游离酸(CAS RN 187270-87-7)、异恶氯草酮(isoxachlortole)(CAS RN141112-06-3)、异恶唑草酮(isoxaflutole)(CAS RN 141112-29-0)、甲基磺草酮(mesotrione)(CAS RN 104206-82-8)、磺酰草吡脱(pyrasulfotole)(CASRN 365400-11-9)、苄草唑(pyrazolynate)(CAS RN 58011-68-0)、匹唑芬(pyrazoxyfen)(CAS RN 71561-11-0)、磺草酮(sulcotrione)(CAS RN99105-77-8)、特呋三酮(tefuryltrione)(CAS RN 473278-76-1)、tembo三酮(tembotrione)(CAS RN 335104-84-2)、苯吡唑草酮(topramezone)(CAS RN210631-68-8)、以及它们的农业化学上可接受的盐。

23.如权利要求21所述的方法，其中一种或多种HPPD抑制剂是甲基磺草酮。

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