CN115279909A - 转录调控核苷酸序列及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了具有组成型启动子活性的核酸，以及这种具有组成型启动子活性的核酸在植物中表达目的多核苷酸的用途。

Description

转录调控核苷酸序列及其使用方法

发明领域

本文描述了具有组成型启动子活性的核酸，以及这种具有组成型启动子活性的核酸在植物中表达目的多核苷酸的用途。

背景

修饰植物以改变和/或改善表型特征(如生产率或质量)需要在植物组织中过表达或下调内源基因或表达异源基因。这种遗传修饰依赖于根据需要驱动和控制基因表达的手段的可用性。实际上，遗传修饰依赖于合适的启动子的可用性和使用，所述启动子在植物中是有效的并且调节基因表达以在植物中产生所需效果。

简述

在一个方面中，本文描述了用于调控目的多核苷酸表达的重组基因，所述重组基因包含具有组成型启动子活性的核酸，所述核酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核酸序列或其功能性片段为至少80％同一。在一些实施方案中，具有组成型启动子活性的核酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列为至少80％(或至少90％、95％、98％或至少99％)或更高的同一。在一些实施方案中，具有组成型启动子活性的核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核酸序列。

在一些实施方案中，重组基因还包含至少一个与具有组成型启动子活性的核酸可操作地连接的目的多核苷酸。在一些实施例中，目的多核苷酸是除草剂耐受性编码序列、杀昆虫编码序列、杀线虫编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物和生物胁迫耐受性编码序列，或修饰植物性状(如产量、谷粒质量、养分含量、淀粉质量和数量、氮固定和/或利用，以及油含量和/或组成)的序列。在一些实施方案中，目的多核苷酸相对于具有组成型启动子活性的核酸是异源的。

在另一个方面中，本公开提供了包含本文所述的重组基因的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。

在另一个方面中，本公开提供了包含本文所述的重组基因或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是植物细胞。

在另一个方面中，本公开提供了包含本文所述的重组基因或载体或本文所述的具有组成型启动子活性的异源核酸的植物或植物部分或种子。在一些实施方案中，植物或植物部分或种子是单子叶植物或植物部分。在一些实施方案中，植物或植物部分或种子是双子叶植物或植物部分或种子。在一些实施方案中，植物或植物部分对于重组基因是半合子的。在一些实施方案中，植物或植物部分对于重组基因是纯合的。

在另一个方面中，本公开提供了一种在宿主细胞中表达目的多核苷酸的方法，其包括(a)将本文所述的具有组成型启动子活性的核酸、重组基因或载体引入或提供到宿主细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞是植物细胞。在一些实施方案中，由目的多核苷酸编码的积累的蛋白质的可检测量为提取的总可溶性蛋白的约0.01％-1.15％(或约0.05％-1.15％、或约0.1％-1.15％、或约0.5％-1.15％、或约1％-1.15％)。如本文所用的术语“总可溶性蛋白(TSP)”是指能够溶解在适于通常通过机械破坏促进的蛋白质定量的缓冲液中的所有蛋白质。

在另一个方面中，本公开提供了一种产生植物或植物部分或种子的方法，包括(a)将本文所述的具有组成型启动子活性的核酸、重组基因或载体引入植物细胞中；和(b)从所述植物细胞再生植物或植物部分。在一些实施方案中，将重组基因的两个或更多个拷贝引入植物细胞中。

在另一个方面中，本公开提供了一种在植物中提供杀虫活性的方法，包括将包含编码杀虫蛋白的多核苷酸序列的重组基因引入或提供到植物的宿主细胞中。在一些实施方案中，杀虫蛋白是杀昆虫蛋白。在一些实施方案中，将重组基因的两个或更多个拷贝引入植物细胞中。

附图简述

图1描述了质粒pBay 02059的组分，包括SEQ ID NO:1(P-bdc 16-1.2)所示的具有组成型启动子活性的核酸和昆虫抗性基因。图1示出了根据一个实施方案的主题的一个方面。

图2提供了如实施例2所述的，分别在SEQ ID NO:2(P-bdc16-1.3)、SEQ ID NO:3(P-bdc16-1.4)和SEQ ID NO:4(P-bdc16-1.5)中列出的SEQ ID NO:1(P-bdc16-1.2)的各种缺失变体的示意图。

图3提供了显示与SEQ ID NO 1、2、3和4所示的核苷酸序列可操作地连接时，昆虫抗性基因的表达水平的图。

图4是显示天然大豆glyma13g33190的表达数据(RNA-seq)的图，从其衍生了启动子P-bdc 16-1.2(SEQ ID NO:1)。

图5是显示两个大豆栽培种(成熟度组(MG3)和成熟度组8(MG8))的初级转化体(T0)中每总可溶性蛋白(TSP)表达的昆虫抗性基因百分比的柱状图。

图6是显示了在两个大豆栽培种(MG3和MG8)的初级转化体(T0)中表达的每总可溶性蛋白(TSP)表达的昆虫抗性基因的百分比的散点图。

图7是显示两个大豆栽培种(MG3和MG8)中作为来自pBay02059载体的T1分离事件的一个或两个拷贝的每总可溶性蛋白(TSP)表达的昆虫抗性基因百分比的柱状图。

图8是显示了在MG3大豆栽培种中作为来自pBay02059载体的T1分离事件的一个或两个拷贝的每总可溶性蛋白(TSP)表达的昆虫抗性基因的百分比的散点图。

图9是显示了MG8栽培种中作为来自pBay02059载体的T1分离事件的一个或两个拷贝的每总可溶性蛋白(TSP)表达的昆虫抗性基因百分比的散点图。

发明详述

本公开提供了具有组成型启动子活性的分离核酸和包含所述具有组成型启动子活性的核酸的重组基因，其指导可操作地连接的目的多核苷酸在植物细胞、植物或植物部分或种子中的组成型转录/表达。本发明是基于以下发现：包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核酸序列及其功能性片段的具有组成型启动子活性的核酸在植物中具有组成型启动子活性，并提供目的多核苷酸(例如，编码杀昆虫蛋白的多核苷酸)的中等表达水平。这种中等表达允许蛋白质(如昆虫抗性蛋白质/杀昆虫毒素)以一定水平表达，使得蛋白质作为杀昆虫剂有效地起作用而对植物没有不利影响(例如毒性)。

在一个方面中，本文描述了用于调节目的多核苷酸表达的重组基因，所述重组基因包含具有组成型启动子活性的核酸，所述核酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核酸序列或其功能性片段为至少80％(或至少90％，95％，98％，或至少99％)同一。在一些实施方案中，具有组成型启动子活性的核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核酸序列。

如本文所用的，“具有启动子活性的核酸”是指启动子的核苷酸序列。

如本文所用的术语“其功能性片段”是指长度比SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的具有组成型启动子活性的核酸短，但仍保留SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的具有组成型启动子活性的核酸的活性的核酸序列。例如，在一些实施方案中，具有组成型启动子活性的核酸的功能性片段包含长度为至少850bp、至少900bp或至少1000bp的核苷酸序列，并且保留具有组成型启动子活性的核酸的活性。

表达载体

本发明的另一个目的涉及包含本发明的重组基因的载体。

术语“载体”包括噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体以及人工染色体，如细菌或酵母人工染色体。此外，该术语还涉及靶向构建体，其允许靶向构建体随机或定点整合到基因组DNA中。这样的靶构建体包含足够长度的DNA用于同源或异源重组，如下面详细描述的。包含本发明的多核苷酸的载体可以包含用于在宿主中繁殖和/或选择的选择性标记。可以通过本领域熟知的各种技术将载体掺入宿主细胞中。如果引入宿主细胞中，则载体可以驻留在细胞质中或可以掺入基因组中。在后一种情况下，应当理解，载体可以进一步包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。载体可以通过常规转化或转染技术引入原核或真核细胞中。如本发明内容中所用的术语“转化”和“转染”、缀合和转导旨在包括本领域熟知的将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞中的多种方法，包括磷酸钙、氯化铷或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、天然感受态、基于碳的簇、化学介导的转移、电穿孔或粒子轰击(例如“基因枪”)。用于宿主细胞(包括植物细胞)的转化或转染的合适方法可以在Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其他实验室手册，如Methods in Molecular Biology,1995,Vol.44，Agrobacteriumprotocols，编辑：Gartland和Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey中找到。或者，质粒载体可以通过热休克或电穿孔技术来引入。如果载体是病毒，可以在施用于宿主细胞前，使用合适的包装细胞系将其在体外包装。逆转录病毒载体可以是具有复制能力的或复制缺陷的。在后一种情况中，病毒繁殖通常将仅发生在互补宿主/细胞中。

本文提及的载体可适合作为克隆载体，即可在微生物系统中复制。这样的载体确保在细菌、酵母或真菌中的有效克隆，并使植物的稳定转化成为可能。必须提及的那些特别是适用于T DNA介导的转化的各种二元和共整合载体系统。通常，这样的载体系统的特征在于它们至少含有农杆菌介导的转化所需的vir基因和界定T-DNA(T-DNA边界)的序列。这些载体系统还可以包含另外的顺式调节区，如启动子和终止子和/或选择标记，用其可以鉴定合适的转化的宿主细胞或生物体。虽然共整合载体系统具有排列在同一载体上的vir基因和T DNA序列，但二元系统基于至少两种载体，其中一种载体携带vir基因，但不含T-DNA，而第二种载体携带TDNA，但不含vir基因。因此，最后提到的载体相对较小，易于操作，并且可以在大肠杆菌和农杆菌中复制。二元载体及其用途的概述可在Hellens等，Trends inPlant Science(2000)5，448-451中找到。此外，通过使用适当的克隆载体，可以将本发明的重组基因引入宿主细胞或生物体(如植物或动物)中，并因此用于植物的转化，如在以下文献中公开和引用的那些：Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press，BocaRaton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transferin Higher Plants；见：Transgenic Plants，vol.1，Engineering and Utilization，编辑：Kung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，见：Transgenic Plants，vol.1，Engineering and Utilization，编辑：Kung和R.Wu，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225。

本发明的载体可以是表达载体。在这样的表达载体中，重组基因包含具有如上所述的组成型启动子活性的核酸，其允许在真核细胞或其分离的级分中表达。除了本发明的重组基因外，表达载体还可以包含另外的调控元件，包括转录以及翻译增强子。表达载体也可以是基因转移或靶向载体。源自病毒(如逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒)的表达载体可用于将本发明的重组基因或载体递送到靶向的细胞群中。本领域技术人员熟知的方法可用于构建重组病毒载体；参见例如Sambrook，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.(1994)中描述的技术。

合适的表达载体骨架可以源自本领域已知的表达载体，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)或pSPORTI(GIBCO BRL)。典型的融合表达载体的其它实例是pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.，和Johnson，K.S(1988)Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白和蛋白A分别于编码待表达的担保之的目的核酸融合。pTrc载体的靶基因表达基于通过宿主RNA聚合酶从杂合trp-lac融合启动子的转录。来自pET 11d载体的靶基因表达基于T7-gn10-lac融合启动子的转录，其由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导。这种病毒聚合酶通过宿主菌株BL21(DE3)或HMS 174(DE3)从常驻L-原噬菌体提供，所述常驻L-原噬菌体含有在lacUV 5启动子转录控制下的T7 gn1基因。用于在酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari等(1987)EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。适用于其他真菌(如丝状真菌)的载体和构建载体的方法包括以下文献中详细描述的那些：van denHondel，C.A.M.J.J.,&Punt,P.J.(1991)“Genetransfer systems and vector development for filamentous fungi，见：AppliedMolecular Genetics of fungi,J.F.Peberdy等编辑，pp.1-28，Cambridge UniversityPress:Cambridge，或见：More Gene Manipulations in Fungi(J.W.Bennett&L.L.Lasure，编辑，pp.396-428:Academic Press:San Diego)。其他合适的酵母载体是例如pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。

在一些实施方案中，本文所述的包含重组基因的一种载体(或多种载体)在合适的生物体(即表达宿主)中繁殖和扩增。在一些实施方案中，在合适的生物体中繁殖和扩增载体的一个拷贝。在一些实施方案中，在合适的生物体中繁殖和扩增载体的两个或更多个(例如3、4、5、6、7、8个或更多个)拷贝。

本文所用的术语“重组基因”是指线性或环状核酸分子。它包括DNA以及RNA序列，其能够指导特定核苷酸序列在适当宿主细胞中的表达。通常，它包含与目的多核苷酸可操作地连接的启动子，所述目的多核苷酸任选地可操作地连接终止信号和/或其他调控元件。本发明的重组基因的特征在于其应包含具有如本文所定义的组成型启动子活性的核酸。重组基因还可以包含核苷酸序列正确翻译可能需要的序列。编码区通常编码目的蛋白质，但也可以以有义或反义方向编码目的功能性RNA，例如反义RNA或非翻译RNA。包含目的多核苷酸序列的重组基因可以是嵌合的，这意味着其组分中的至少一种相对于其他组分中的至少一种是异源的。重组基因也可以是天然存在但以可用于异源表达的重组形式获得的基因。重组基因可以完全在胞外组装(例如，通过重组克隆技术)。然而，也可以使用部分内源组分组装重组基因。例如，可以通过将启动子序列置于(或插入)内源序列的上游来获得重组基因，从而使其功能性地连接并受所述启动子序列控制。同样，待表达的核酸序列可以置于(或插入)内源启动子序列的下游，从而形成重组基因。在另一个实施方案中，此类重组基因将包含与目的核苷酸序列连接的转录起始区。这种重组基因可以具有多个限制性位点，用于将目的基因插入到调控区的转录调控下。重组基因可另外含有选择标记基因。该盒将在5'-3'转录方向上包括在植物中有功能的转录和翻译起始区、目的DNA序列以及转录和翻译终止区。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于目的DNA序列可以是天然的，或者可以源自另一种来源。方便的终止区可从根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒获得，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区和下文描述的其他终止区(也参见Guerineau 1991；Proudfoot1991；Sanfacon 1991；Mogen 1990；Munroe 1990；Balias 1989；Joshi 1987)。重组基因还可以包含多克隆位点。在这种情况下，多克隆位点可以以允许待引入多克隆位点的多核苷酸与转录调节序列可操作连接的方式排列。除了上述组分之外，本发明的重组基因可以包含同源重组所需的组分，即来自靶基因座的侧翼基因组序列。然而，还考虑了基本上由具有组成型启动子活性的核酸组成的重组基因，如下文所定义的。

术语“可操作地连接”或“功能性地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，如果两个序列的位置使得调节DNA序列影响编码DNA序列的表达(即，编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下)，则调节DNA序列被称为与编码RNA或多肽的DNA序列“可操作地连接”或“缔合”。编码序列可以以有义或反义方向与调节序列可操作地连接。

如本文所用的术语“启动子”指通常位于其编码序列上游(5’)的核苷酸序列，通过提供RNA聚合酶和正确转录所需的其他因子的识别，来控制编码序列的表达。“启动子”包括短DNA序列的基础启动子，在一些情况下，其包括TATA框和作用是具体说明转录起始位点的其他序列，所述基础启动子上可添加用于增强表达的调控元件。“启动子”还指包括基础启动子和调控元件的核苷酸序列，其能够控制编码序列或功能性RNA的表达。该类型的启动子序列包括近端和更远距离的上游元件，后一类元件通常被称为增强子。因而，“增强子”是刺激启动子活性的DNA序列，并可以是启动子内在的元件或插入的异源元件，以增强启动子的水平或组织特异性。它可以在两个方向(正常方向或折返的方向)发挥作用，即使当移动到启动子上游或下游时，也能够发挥功能。增强子和其他上游启动子元件都结合介导其效应的序列特异性的DNA结合蛋白。启动子可以整个源自天然基因，或包括源自天然可见的不同启动子的不同元件，或者甚至包括合成的DNA片段。

启动子还可以含有蛋白质因子结合所涉及的DNA序列，其响应生理的或发育的条件，控制转录起始的效率。“起始位点”是围绕第一核苷酸周围的位置，第一核苷酸是转录序列的一部分，也定义为位置+1。基因的所有其他序列及其控制区根据该位点编号。下游序列(即，3’方向的其他蛋白质编码序列)命名为正的，而上游序列(5’方向上的大部分控制区)命名为负的。在缺少上游激活的条件下失活的或启动子活性极大降低的启动子元件，例如TATA元件，被称为“基础”或“核心”启动子。在存在合适的转录因子的条件下，基础启动子发挥允许转录的功能。因而，“基础”或“核心”启动子仅由转录起始需要的所有基本元件构成，例如TATA框和/或起始物(initiator)。

如本文所用的术语“组成型启动子”指能够在植物的所有的或几乎所有的发育阶段过程中，在所有的或几乎所有的植物组织中表达开放阅读框的启动子(ORF)。每种转录激活元件都不表现出绝对的组织特异性，而以达到转录活性最高的植物组织中至少1％的水平在大部分植物组织中介导转录激活。“组成型表达”指使用组成型启动子的表达。

如本文中使用的，术语“顺式调控元件”或“启动子基序”指这样的顺式作用转录调控元件，所述元件产生基因表达整体控制的一方面。顺式元件可以发挥结合转录因子的功能，所述转录因子是调控转录的反式作用蛋白质因子。一些顺式元件结合一种以上的转录因子，转录因子可以不同的亲和力与一种以上的顺式元件相互作用。本发明的启动子理想的含有可以产生或调节基因表达的顺式元件。可以通过多种技术鉴别顺式元件，包括删除分析，即从启动子的5‘末端或中间删除一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹的DNA结合蛋白质分析；甲基化干扰、电泳移动性迁移测定；由连接介导PCR的体内基因组足迹，和其他的常规测定；或通过常规的DNA序列比较方法，用已知的顺式元件进行DNA序列相似性分析。可以通过诱变(或取代)一个或多个核苷酸，或通过其他常规方法，进一步研究顺式元件的精细结构。可以通过化学合成，或通过从包括此类元件的启动子中分离，来获得顺式元件，还可以合成含有额外的侧翼核苷酸的顺式元件，所述侧翼核苷酸含有促进子序列操作的有效的限制性酶切位点。

关于核酸分子或DNA的术语“异源的”是指与在自然界中不与之可操作地连接的或在自然界中在不同位置与之可操作地连接的第二核酸分子可操作地连接，或被操纵以变得可操作地连接的核酸分子。例如，本发明的启动子在其天然环境中与其天然编码序列功能性连接，而在本发明中，其连接可能来自相同生物体、不同生物体或合成编码序列的另一编码序列。还应当理解，在本发明的启动子控制下的编码序列与所述启动子是异源的，因为其序列已经通过例如突变(如插入、缺失等)被操纵，使得所述编码序列的天然序列被修饰并因此变得与本发明的启动子异源。此外，如果是合成的、源自另一种不可杂交的生物体(转基因的)、另一种可杂交的生物体(顺式基因的)或与对照植物(顺式基因的)(例如野生型植物)相比给予其天然基因组定位的相同生物体，则具有组成型启动子活性的核酸对于包含它的植物、植物部分或种子是异源的。应当理解，给予的基因组定位意指具有组成型启动子活性的核酸位于另一个染色体上或位于同一染色体上，但离其在野生型植物中的天然基因组定位10kb或更多，例如10kb，优选5kb或更多，例如5kb，更优选1000bp或更多，例如1000bp，甚至更优选500bp或更多，例如500bp，特别优选100bp或更多，例如100bp，最优选10bp或更多，例如10bp。

在宿主细胞中表达

在另一个方面中，本文描述了一种在宿主细胞中表达目的多核苷酸的方法，包括将本文所述的重组基因或载体引入宿主细胞中并在宿主细胞中表达目的多核苷酸。

本文所用的术语“表达”是指植物中内源基因、ORF或其部分、转基因或顺式基因的转录和/或翻译。例如，在反义构建体的情况下，表达可以仅指反义DNA的转录。此外，表达是指有义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定积累。表达也可以指蛋白质的产生。

启动子(有或无增强子)的“表达模式”是表达水平的模式，显示所述启动子在植物中的何处和哪个发育阶段起始转录。当一个启动子的表达模式表现出与其他启动子的表达模式极少重叠时，认为该组启动子的表达模式是互补的。可以通过测量标准转录的报告子mRNA的“稳态”浓度，来确定启动子的表达水平。该测量是间接的，因为报告子mRNA的浓度不仅取决于其合成速率，而且取决于mRNA降解的速率。因此，稳态水平是合成速率和降解速率的产物。然而，当转录序列相同时，可认为降解速率以固定的速率进行，因而该值可作为合成速率的测量。当以该方式比较启动子时，本领域技术人员可获得的技术是杂交S1-RNA酶分析、northern印迹和竞争性RT-PCR。该技术列表并非以任何方式代表所有可获得的技术，而是描述用于分析转录活性和mRNA表达水平的常用程序。实践上，所有启动子的转录起点分析揭示，转录开始处通常不仅有单个碱基，而是或多或少成簇的起始位点集合，每种负责mRNA的若干起点。由于该分布在启动子与启动子之间不同，故每群的报告子mRNA序列也彼此不同。由于每种mRNA或多或少倾向于降解，因此预期不同的报告子mRNA没有单一的降解速率。已显示，对于多种真核启动子序列，围绕起始位点(“起始物”)的序列在确定由所述特定的启动子指导的RNA表达水平中扮演了重要角色。这还包括部分的转录序列。因而启动子与报告子序列的直接融合导致亚优化的转录水平。分析表达模式和水平的常用程序是通过确定细胞中蛋白质积累的“稳态”水平。本领域技术人员已知的报告子基因的常用候选物是β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)和有荧光特性的蛋白质，例如水母(Aequora victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)。然而，原则上，更多蛋白质适合该目的，只要所述蛋白质不干扰基本的植物功能。多种工具适用于定量和确定分布。检测系统是可以方便的创造的，或者基于例如免疫化学、酶学、荧光检测和定量是可获得。使用原位分析蛋白质表达，可以确定植物组织提取物或完整组织中的蛋白质水平。一般而言，具有一个嵌合的启动子报告子构建体的单个转化系可随其报告子基因的表达水平而改变。还经常观察到的是这样的现象，即此类转化体不表达任何可检测的产物(RNA或蛋白质)。表达的变化通常归因于为“位置效应”，虽然该失活的分子机制通常尚不清楚。

目的多核苷酸的表达可以通过各种熟知的技术来确定，例如通过如WO 02/102970中所述的Northern印迹或原位杂交技术。

核酸

如本文所用的术语“核酸“指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物，包括含有糖、磷酸和碱基的单体(核苷酸)，所述碱基是嘌呤或嘧啶。除非具体限制，该术语涵盖了含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其与参照核酸具有相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外指出，特定的核酸序列还暗示性的涵盖了保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补的序列，以及明确述及的序列。具体而言，可以通过产生这样的序列来实现简并密码子取代，所述序列中一个或多个选定(或所有)密码子的第3位被混合的碱基和/或脱氧次黄甘残基取代(Batzer 1991；Ohtsuka 1985；Rossolini 1994)。“核酸片段”是给定核酸分子的部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传材料，而核糖核酸(RNA)参与DNA内所含信息向蛋白质中转移。术语“核苷酸序列”指可以是单链或双链的DNA或RNA的聚合物，任选的含有能够整合到DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。术语“核酸”或“核酸序列”还可以与基因、cDNA、DNA和基因编码的RNA互换的使用。

“分离的核酸”，与本文所用的“分离的DNA”可互换使用，是指不存在于其天然基因组环境中的核酸，无论其长度和序列如何。分离的DNA可以例如是指与基因组环境物理分离的DNA，如基因组DNA的片段。分离的DNA也可以是人工产生的DNA，如化学合成的DNA，或如通过扩增反应产生的DNA，如本领域熟知的聚合酶链式反应(PCR)。分离的DNA可以进一步指在其不是天然存在的DNA背景下存在的DNA。例如，分离的DNA可以是指存在于质粒中的DNA片段。此外，分离的DNA可以是指存在于与其天然存在的背景不同的另一染色体背景中的DNA片段，如，例如在基因组中与天然位置不同的另一位置、在与其天然存在的物种不同的另一物种的基因组中，或在人工染色体中。

还考虑了具有组成型启动子活性的核酸的核酸变体，其保留了具有组成型启动子活性的野生型核酸的活性。如本文关于序列(例如，多肽或核酸序列，如-例如-本发明的具有组成型启动子活性的核酸)所用的术语“变体”旨在表示基本上相似的序列。可以使用众所周知的分子生物学技术，如，例如聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定如这些天然存在的等位基因变体。

变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，如通过使用定点诱变产生的那些。通常，本发明的核苷酸序列变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的天然(野生型或内源)核苷酸序列或其功能性片段将具有至少70％，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，通常至少80％，例如81％-84％，至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％，至98％和99％核苷酸序列同一性。

如本文中使用的，“序列同一性”或“同一性”在两条核酸或多肽序列的上下文中指，当比对具体比较窗口的最大对应程度时，两条序列中的残基是相同的。当序列同一性的百分比用于指蛋白质时，应认识到不相同的残基位置通常是由于保守氨基酸取代而不同的，其中氨基酸残基被具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能特性。当序列以保守取代而不同时，可以上调百分比序列同一性，校正取代的保守性质。由此类保守性取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行该调节的手段是本领域技术人员普遍已知的。典型的，这涉及将保守性取代按部分而非完全错配来打分，从而增加了百分比序列同一性。因而，例如，当相同的氨基酸得分为1，非保守性取代得分为0时，保守性取代的得分在0和1之间。保守性取代的评分按例如程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.)中执行的计算。

术语多核苷酸序列的“基本同一性”是指使用标准参数使用所述的算法程序之一，多核苷酸包含与参考序列相比具有至少70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，或79％，至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，或89％，至少90％，91％，92％，93％，或94％，和至少95％，96％，97％，98％，或99％的序列同一性。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。

核苷酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子是否在严格条件下彼此杂交(见下文)。通常，严格条件选择为在限定的离子强度和pH下比特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，严格条件涵盖约1℃至约20℃范围内的温度，这取决于如本文另外限定的所需严格程度。如果编码的多肽基本上相同，则严格条件下彼此不杂交的核酸仍然基本上相同。这可能发生在例如使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时。两个核酸序列基本上相同的一个指示是由第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽免疫交叉反应时。

“严格的杂交条件”和“严格的杂交洗涤条件”在核酸杂交实验(例如Southern和Northern杂交)的上下文中，是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH下)。特异性通常是杂交后洗涤的函数，其关键的因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂合体，Tm可以由Meinkoth和Wahl，1984的等式近似得到：

Tm＝81.5℃+16.6(log₁₀M)+0.41(％GC)-0.61(％form)–500/L

其中，M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟苷和胞苷核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，而L是杂合体按碱基对计的长度。每1％的错配降低Tm约1℃；因而可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件，来杂交具有理想同一性的序列。例如，如果查找具有>90％同一性的序列，则可以减少Tm 10℃。一般而言，选择的严格条件比特定序列与其互补体在定义的离子强度和pH下的热熔点I低约5℃。然而，严格的严格条件可以使用在比热熔点I低约1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等的严格条件可以使用在比热熔点I低约6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可以使用在比热熔点I低约11、12、13、14、15或20℃下杂交和/或洗涤。使用该等式，杂交和洗涤组成，以及理想的T，本领域技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液的严格条件中的变化是被内在描述的。如果理想的错配程度导致低于45℃(含水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T，则优选的增加SSC浓度，使得可以使用更高的温度。对核酸杂交的广泛性指导可见于Tijssen,1993中。一般而言，高严格的杂交和洗涤条件选择比特定序列在定义的离子强度和pH下的热熔点Tm低约5℃。

高严格的洗涤条件的实例是在72℃的0.15MNaCl中约15分钟。严格的洗涤条件的实例是在65℃的0.2x SSC中洗涤15分钟(参见，Sambrook，见上文，关于SSC缓冲液的描述)。通常，在高严格的洗涤之前进行低严格的洗涤，以去除背景探针信号。对例如超过100个核苷酸的二聚体的示例性中等严格的洗涤是在45℃的1x SSC中15分钟。对例如超过100个核苷酸的二聚体的示例性低严格的洗涤是在40℃的4至6x SSC中15分钟。对于短的探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件典型的涉及在pH 7.0至8.3下，少于约1.5M的盐浓度，更优选约0.01至1.0M的Na离子(或其他盐)浓度，温度典型的是至少约30℃，而对于长探针(例如，>50个核苷酸)是至少约60℃。还可以用添加破坏稳定的试剂(例如甲酰胺)来实现严格的条件。一般而言，信号噪声比是特定杂交测定中不相关探针所观察到的2X(或更高)，提示检测到特异性杂交。如果编码的蛋白质是基本相同的，即使在严格条件下彼此不杂交的核酸也仍然是基本相同。这发生在例如当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时。

非常严格的添加选择是与特定的探针的Tm相等的。对在滤膜上具有超过100个互补残基的互补核酸的高严格杂交条件的实例是50％甲酰胺，例如在37℃下，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和在60至65℃下在0.1x SSC中洗涤。示例性低严格条件包括在37℃下，用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液杂交，在50至55℃下，在1x至2x SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格添加包括在37℃下，在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，和在55至60℃下，在0.5x至1xSSC中洗涤。

以下是可用于克隆与本发明的参考核苷酸序列基本相同的核苷酸序列的杂交/洗涤条件组的实例：参考核苷酸序列优选在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中与参考核苷酸序列杂交，在50℃下在2×SSC、0.1％SDS中洗涤(非常低的严格条件)，更理想地在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，在50℃下在1×SSC、0.1％SDS中洗涤(低严格条件)，更理想地仍然在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，在50℃下在0.5×SSC、0.1％SDS中洗涤(中等严格性条件)，优选在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，在50℃下在0.1×SSC，0.1％SDS中洗涤(高严格条件)，更优选在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，在65℃下在0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤(非常高的严格条件)。

在一些实施方案中，本文所述的核酸分子可以被“优化”以增强在目的植物中的表达(参见，例如WO 91/16432；Periak 1991；Murray 1969)。以这种方式，可以利用植物优选的密码子合成基因或基因片段中的开放阅读框(关于宿主优选的密码子使用的讨论，参见，例如，Campbell&Gowri.1990)。因而，可以优化核苷酸序列用于在任何植物中表达。认识到可以优化或合成所有的或任何部分的基因序列。即，还可以使用合成的或部分优化的序列。变体核苷酸序列和蛋白质还涵盖了源自诱变和重组程序的序列和蛋白质，例如DNA改组。使用此类程序，可以操作一种或多种不同的编码序列，来产生具有理想特性的新的多肽。以此方式，从相关多核苷酸序列的群体中产生重组多核苷酸的文库，所述多核苷酸序列包含具有实质的序列同一性的序列区域，并可以在体外或体内同源重组。此种DNA改组的策略是本领域已知的(参见例如Stemmer 1994；Stemmer 1994；Crameri 1997；Moore 1997；Zhang1997；Crameri 1998；和US 5,605,794,6,8,10和12,837,458)。

目的多核苷酸

本文所用的术语“目的多核苷酸”是指在本文所述的具有组成型启动子活性的核酸的控制下表达的核酸。目的多核苷酸可以编码在如本文提及的植物细胞、植物或植物部分中期望其存在的多肽。这样的多肽可以是合成种子贮藏化合物所需的酶，或者可以是种子贮藏蛋白。应当理解，如果目的多核苷酸编码多肽，则可能需要将核酸转录为RNA并将转录的RNA翻译成多肽。目的多核苷酸还可以包括生物活性RNA分子和反义RNA、核酶、微小RNA或siRNA。例如，由于反义RNA、核酶、微小RNA或siRNA的种子特异性表达，可以降低种子中不希望的酶活性。上述生物活性RNA分子的潜在生物学作用原理是本领域熟知的。此外，本领域技术人员熟知如何获得编码此类生物活性RNA分子的核酸。应当理解，生物活性RNA分子可以通过目的核酸的转录直接获得，即不翻译成多肽。优选地，在本发明的具有组成型启动子活性的核酸的控制下表达的至少一种目的多核苷酸相对于所述具有组成型启动子活性的核酸是异源的，即它不是天然地在其控制下，但所述控制是以非天然方式产生的(例如通过基因工程方法)。

与本文所述的任何重组基因相关的可操作连接可以通过本领域已知的各种方法来实现，包括体外和体内程序。因此，本发明的重组基因或包含这种重组基因的载体可以通过使用本领域熟知的标准重组和克隆技术来实现(参见例如Maniatis 1989；Silhavy1984；Ausubel 1987)。

可操作的连接可以-例如-包括本文所述的具有组成型启动子活性的核酸(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其功能性片段)与待表达的核酸序列，和-任选地-其他调控元件，如，例如聚腺苷酸化或转录终止元件、增强子、内含子等的顺序排列，其排列方式使得具有组成型启动子活性的核酸可以在适当条件下表达目的核酸序列的过程中实现其功能。术语“适当的条件”可以意指重组基因在植物细胞中的存在。优选的排列是，其中待表达的目的核酸序列以两个序列共价连接的方式置于本发明的具有组成型启动子活性的核酸的下游(即，以3'方向)。任选地，可以在两个序列之间插入另外的序列。此类序列可以是例如接头或多克隆位点。此外，可以插入编码融合蛋白的部分的序列(在意图表达由目的核酸编码的蛋白质的融合蛋白的情况下)。优选地，待表达的目的多核苷酸与本发明的具有组成型启动子活性的核酸之间的距离不超过200个碱基对，优选不超过100个碱基对，更优选不超过50个碱基对。

在一些实施方案中，通过将本文所述的具有组成型启动子活性的核酸(例如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或其功能性片段)插入植物基因组中来组装重组基因。这种插入将导致与目的核酸序列的可操作连接，所述目的核酸序列本身已经存在于基因组中。通过插入，由于具有组成型启动子活性的核酸的转录调控性质，目的核酸以组成型方式表达。插入可以是定向的或偶然的。插入是定向时，可以通过例如基因编辑来实现。通过这种程序，可以将天然启动子与本发明的具有组成型启动子活性的核酸交换，从而修饰内源基因的表达谱。具有组成型启动子活性核酸也可以以表达内源基因的反义mRNA的方式插入，从而诱导基因沉默。

类似地，待表达的目的多核苷酸可以插入植物基因组中，所述植物基因组包含在其天然基因组环境中具有组成型启动子活性的核酸(即与其天然基因连接)，插入的方式使得插入的序列与具有组成型启动子活性的核酸可操作地连接，从而形成本发明的重组基因。

重组基因可用于多种表达目的，如，例如蛋白质的表达，或反义RNA、正义或双链RNA的表达。核酸序列的表达可以赋予植物农艺学上有价值的性状。

在一些实施方案中，目的多核苷酸获自昆虫抗性基因；疾病抗性基因，如，例如，细菌疾病抗性基因、真菌疾病抗性基因、病毒疾病抗性基因或线虫疾病抗性基因；除草剂抗性基因；影响谷粒组成或质量的基因；养分利用基因；真菌毒素减少基因；雄性不育基因；选择标记基因；筛选标记基因；阴性选择标记；阳性选择标记；影响植物农艺特征(即产量、可立性等)的基因；或环境或胁迫抗性基因，即赋予除草剂抗性或耐受性、昆虫抗性或耐受性、疾病抗性或耐受性(病毒、细菌、真菌、卵菌或线虫)、胁迫耐受性或抗性(例如对干旱、热、寒冷、冷冻、过量水分、盐胁迫或氧化胁迫的抗性或耐受性)、增加的产量、食物含量和构成、物理外观、雄性不育、干燥、可立性、繁殖力、淀粉性质或数量、油数量和质量、氨基酸或蛋白质组成等的一种或多种基因。

“抗性”是指作为活性剂施用、感染病原体或暴露于胁迫的结果而基本上没有呈现出表型变化的植物。“耐受性”是指尽管其可能作为感染的结果而呈现出一些表型变化，但其繁殖能力基本上未降低或代谢基本上未改变的植物。

在一些实施方案中，目的多核苷酸是选择标记基因。如本文所用的，术语“选择标记基因”是指在生长培养基中存在相应的选择化合物(例如除草剂)的情况下，与未用所述植物重组基因转化并且因此不包含选择标记基因的植物或植物细胞相比，赋予用所述选择标记的植物重组基因转化的植物或植物细胞生长优势的基因。选择标记基因和/或所述标记基因的植物重组基因对于待转化的植物可以是异源的，因此在待转化的植物中不是天然存在的。

在一些实施方案中，选择标记基因是阴性选择标记基因。阴性选择标记基因赋予对选择化合物(例如除草剂)的抗性和/或增加的耐受性。示例性选择标记基因包括但不限于如WO/2011/095460中所述的HPPD抑制剂，其通过引用整体并入本文；草丁膦乙酰转移酶(PAT；也称为双丙氨磷抗性；bar；De Block等(1987)Plant Physiol 91：694-701；EP 0 333033；美国专利号4,975,374)、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS；美国专利号5,633,435)或草甘膦氧化还原酶基因(美国专利号5,463,175)，其赋予对草甘膦^TM(N-(膦酰基甲基)甘氨酸)的抗性(Shah等(1986)Science 233：478)。草甘膦^TM降解酶(草甘膦^TM氧化还原酶；gox)、磺酰脲失活乙酰乳酸合酶和咪唑啉酮失活乙酰乳酸合酶(例如具有例如S4和/或Hra突变的突变ALS变体溴苯腈^TM降解腈水解酶(bxn)卡那霉素-或G418-抗性基因(NPTII；NPTI)，其编码例如新霉素磷酸转移酶(Fraley等，(1983)，Proc Natl Acad Sci USA 80:4803)，其表达赋予对抗生素卡那霉素和相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的抗性的酶，麦草畏降解酶(O-脱甲基酶、加氧酶、铁氧还蛋白)(Behrens等2007 Science316：1185-1188；美国专利号7,022,896)标记基因，其赋予对D-氨基酸(例如D-丙氨酸和D-丝氨酸)施加的毒性作用的抗性(WO03/060133)。这个竞争中的标记基因可以是来自酵母瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)(Rhodosporidium toruloides)的daol基因(EC:1.4.3.3；GenBank登录号：U60066)和大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC：4.3.1.18；GenBank登录号：J01603)。

在一些实施方案中，选择标记基因是阳性选择标记，与未转化的植物相比，其赋予转化的植物生长优势。示例性阳性选择标记包括但不限于甘露糖-6-磷酸异构酶(与甘露糖组合)、UDP半乳糖-4-差向异构酶(与例如半乳糖组合)或甘露糖-6-磷酸异构酶与甘露糖组合。

在一些实施方案中，选择标记基因是乙酰羟酸合酶(AHAS)基因，或突变的AHAS基因。乙酰羟酸合酶(也称为乙酰乳酸合酶或ALS)是在植物和微生物中发现的蛋白质，其催化支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)合成的第一步。优选地，其具有酶学委员会代码EC2.2.1.6中所述的酶活性。突变的AHAS蛋白优选地赋予对至少一种咪唑啉酮除草剂的抗性。咪唑啉酮除草剂是本领域熟知的，并且优选包括灭草烟、灭草喹、咪草烟、甲基咪草烟、咪草啶酸和咪草酯。优选地，咪唑啉酮除草剂是灭草喹。更优选地，咪唑啉酮除草剂是咪草烟。最优选地，咪唑啉酮除草剂是灭草烟。

示例性突变的AHAS基因公开于WO 2004/005516或WO 2008/124495中，其全部公开内容通过引用并入本文。更多突变的AHAS基因公开于WO2006/015376或WO2007/054555或US20100287641中。突变的AHAS酶赋予对咪唑啉酮除草剂的抗性。

更多的选择标记基因是赋予对D-氨基酸施加的毒性作用的抗性或增加的耐受性的标记基因。此类标记基因可编码能够代谢D-氨基酸的蛋白质。D-氨基酸可以是D-丙氨酸和D-丝氨酸。标记基因可以编码D-丝氨酸解氨酶、D-氨基酸氧化酶和D-丙氨酸转氨酶。编码能够代谢D-氨基酸的蛋白质的此类标记基因的优选实例是如国际专利公开号WO 03/060133、WO 05/090584、WO 07/107,516和WO 08/077,570中公开的那些，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，目的多核苷酸是编码除草剂抗性蛋白的除草剂抗性基因。示例性除草剂抗性基因包括但不限于编码草丁膦乙酰转移酶(bar和pat)的基因、草甘膦耐受性EPSP合酶基因、编码草甘膦氧化还原酶的草甘膦降解酶基因gox、deh(编码使茅草枯失活的脱卤素酶)、除草剂抗性(例如磺酰脲和咪唑啉酮)乙酰乳酸合酶和bxn基因(编码降解溴苯腈的腈水解酶)。bar和pat基因编码酶膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，其使除草剂膦丝菌素失活并防止该化合物抑制谷氨酰胺合成酶。5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(EPSP合酶)通常被除草剂N-(膦酰基甲基)甘氨酸(草甘膦)抑制。然而，编码草甘膦抗性EPSP合酶的基因是已知的。deh基因编码茅草枯脱卤素酶并赋予对除草剂茅草枯的抗性。bxn基因编码将溴苯腈转化为非除草降解产物的特异性腈水解酶。

在一些实施方案中，目的多核苷酸是编码昆虫抗性蛋白的昆虫抗性基因或其变体。此类变体可包括合成衍生的序列，包括但不限于作为两个或更多个目的多核苷酸(例如，两个或更多个昆虫抗性基因)的融合体的序列。示例性昆虫抗性基因包括但不限于编码杀昆虫蛋白(如Cry和Cyt蛋白)的基因以及编码杀昆虫蛋白(如称为“VIP”蛋白的营养期杀昆虫蛋白)的基因，所有这些都是本领域技术人员熟知的。此类基因的实例包括Cry1，如Cry1A，Cry1B，Cry1C，Cry1D，Cry1E，Cry1F和Cry1L家族的成员；Cry2，如Cry2A家族的成员；Cry9，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员；和Vip3家族的成员等。本领域技术人员将理解，植物可以包含赋予目的农艺性状的任何基因。示例性昆虫抗性基因包括但不限于苏云金芽孢杆菌晶体毒素基因或Bt基因(Watmd 1985)。Bt基因可以提供对鳞翅目或鞘翅目害虫(如欧洲玉米螟(ECB)和玉米根虫(CRW))的抗性。用于此类实施方案中的Bt毒素基因可包括CryIA(b)和CryIA(c)基因。在这方面，也可以使用来自其它苏云金芽孢杆菌物种的内毒素基因，其影响昆虫的生长或发育。蛋白酶抑制剂还可以提供昆虫抗性(Johnson 1989)，并且因此将在植物转化中具有实用性。设想使用来自番茄或马铃薯的蛋白酶抑制剂II基因pinII是特别有用的。编码昆虫消化系统抑制剂的其他基因或编码促进抑制剂产生的酶或辅因子的基因也可以是有用的。半胱氨酸蛋白酶抑制剂和淀粉酶抑制剂，例如来自小麦和大麦的那些，可以举例说明这个组。

此外，编码凝集素的基因可以赋予另外的或替代的杀虫剂性质。凝集素(最初称为植物血凝素)是多价碳水化合物结合蛋白，其具有凝集来自一系列物种的红细胞的能力。凝集素最近被鉴定为具有抗象鼻虫、ECB和根虫活性的杀昆虫剂(Murdock 1990；Czapla&Lang，1990)。预期有用的凝集素基因包括例如大麦和小麦胚芽凝集素(WGA)和水稻凝集素(Gatehouse 1984)，其中WGA是优选的。

引入昆虫害虫中时，控制对对抗昆虫有活性的大的或小的多肽的产生的基因，如，例如裂解肽、肽激素以及毒素和毒液，形成本发明的另一个方面。例如，预期针对特定昆虫害虫的保幼激素酯酶的表达也可导致杀昆虫活性，或可能导致变态停止(Hammock 1990)。

植物和宿主细胞

还考虑了包含本文所述重组基因的宿主细胞或非人生物体。它们可以是原核或真核生物。包括微生物和高等生物。微生物的实例是细菌、酵母、藻类和真菌。优选的细菌是埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)或蓝细菌属(Cyanobacterium)(如，例如集胞蓝细菌属(Synechocystis))和Brock Biology of Microorganisms第八版(第A-8、A-9、A10和A11页)中描述的其他细菌。在一些实施方案中，包含本文所述的重组基因的细胞或非人生物体是植物细胞或植物(如本文所定义的)。在一些实施方案中，植物对于重组基因是半合子的。在一些实施方案中，植物对于重组基因是纯合的。

微生物的其它实例是能够感染植物并将DNA转移到其基因组中的那些，尤其是农杆菌属(Agrobacterium)的细菌，优选根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。优选的酵母是假丝酵母属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)、汉逊氏酵母属(Hansenula)和毕赤酵母属(Pichia)。优选的真菌是曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、棉阿舒囊霉属(Ashbya)、脉孢霉属(Neurospora)、镰刀霉属(Fusarium)和白僵菌属(Beauveria)。

在一些实施方案中，宿主细胞是植物细胞、植物、植物种子或其它植物部分、非人动物或多细胞微生物。如本文所用的术语“植物”是指光合作用的真核多细胞生物体。植物包括绿藻(绿藻门(Chlorophyta))、红藻(红藻门(Rhodophyta))、灰绿藻(Glaucophyta)、藓类和苔类(苔藓植物(bryophytes))、无籽维管植物(木贼、石松类、蕨类植物)和种子植物(被子植物和裸子植物)。术语“植物”涵盖整个植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、芽、茎、叶、根、花以及组织和器官，其中上述每一种包含目的基因/核酸。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉、小孢子和繁殖体，同样其中上述每一种包含目的基因/核酸。

本文所用的术语“植物部分”包括植物的所有组分，包括种子、芽、茎、叶、根、花、植物组织和植物器官、植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉、微孢子和繁殖体。“繁殖体”是能够发育成完整植物的植物的任何种类的器官、组织或细胞。繁殖体可以基于营养繁殖(也称为营养繁殖、无性繁殖或营养克隆)或有性生殖。因此繁殖体可以是种子或非生殖器官的部分，如茎或叶。特别地，对于禾本科(Poaceae)，合适的繁殖体也可以是茎的部分，即茎插条。

特别考虑了包含本文所述的重组基因或载体的植物、植物部分或种子。重组基因或载体可以存在于生物体的细胞质中，或者可以通过异源或同源重组掺入基因组中。可以将宿主细胞，特别是从植物或动物获得的那些宿主细胞引入发育中的胚胎中，以获得包含本文所述的宿主细胞的镶嵌或嵌合生物体，即生物体，即植物。合适的生物体是例如适合于表达重组基因的所有生物体。

表达编码影响昆虫角质层完整性的酶的基因的植物形成本发明的另一个方面。此类基因包括编码例如几丁质酶、蛋白酶、脂肪酶的那些基因以及用于产生尼克霉素(一种抑制几丁质合成的化合物)的基因，预期引入任何这些基因以产生昆虫抗性玉米植物。编码影响昆虫蜕皮的活性的基因，如影响蜕皮类固醇UDP-葡糖基转移酶产生的那些，也落入本发明有用的转基因的范围内。

编码促进产生降低宿主植物对昆虫害虫的营养质量的化合物的酶的基因也包括在本发明中。例如，可以通过改变植物的甾醇组成来赋予植物杀虫活性。甾醇由昆虫从其饮食中获得，并用于激素合成和膜稳定性。因此，通过表达新基因(例如直接促进不需要的甾醇产生的那些或将需要的甾醇转化为不需要的形式的那些)来改变植物甾醇组成可能对昆虫生长和/或发育具有负面影响，并因此赋予植物杀昆虫活性。脂氧合酶是天然存在的植物酶，已显示其对昆虫表现出抗营养作用并降低其饮食的营养质量。因此，本发明的其他实施方案涉及具有增强的脂氧合酶活性的植物，其可能对昆虫摄食具有抗性。

植物、植物部分和种子的性质不受限制；例如，植物、植物部分或种子可以是单子叶植物或双子叶植物。在一些实施方案中，植物、植物部分或种子来自单子叶植物。在一些实施方案中，植物或植物部分来自双子叶植物。根据本公开使用的植物细胞的实例包括但不限于衍生自以下属的细胞(或整个植物或植物部分)；菠萝属(Ananas)、芭蕉属(Musa)、葡萄属(Vitis)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、木瓜属(Carica)、鳄梨属(Persea)、李属(Prunus)、Syragrus、可可属(Theobroma)、咖啡属、亚麻属、天竺葵属、木薯属、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属、芸苔属、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属、曼陀罗属、天仙子属、番茄属(Lycopersicon)、烟草属、茄属、碧冬茄属、洋地黄属、Majorana、芒果属(Mangifera)、菊苣属(Cichorium)、向日葵属、莴苣属(Lactuca)、麦雀属(Bromus)、芦荟属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、龙面花属(Nemesia)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属、狗舌草属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、南瓜属、香瓜属(Cucumis)、Browaalia、黑麦草属(Lolium)、苹果属(Malus)、芹菜属(Apium)、棉属(Gossypium)、野豌豆属(Vicia)、香豌豆属(Lathyrus)、羽扇豆属(Lupinus)、豆薯属(Pachyrhizus)、紫藤属、Stizolobium、剪股颖属(Agrostis)、梯牧草属(Phleum)、鸭茅属(Dactylis)、高粱属(Sorghum)、狗尾草属(Setaria)、玉蜀黍属(Zea)、稻属(Oryza)、小麦属(Triticum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、甘蔗属(Saccharum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、钝叶草属(Stenotaphrum)、狗牙根属(Cynodon)、薏苡属(Coix)、北美箭竹属(Olyreae)、菰属(Phareae)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、番石榴属(Psidium)、西番莲属(Passiflora)、鹰嘴豆属(Cicer)、菜豆属(Phaseolus)、Lens和落花生属。

在一些实施方案中，植物细胞包括来自禾本科(poaceae)的细胞(或整个植物或植物部分)，例如大麦属、黑麦属、燕麦属、高粱属、须芒草属、绒毛草属、黍属、稻属、玉蜀黍属、小麦属等属，例如大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、Hordeummurinum、Hordeum secalinum、二棱大麦(Hordeum distichon)、Hordeum aegiceras、六棱大麦(Hordeum hexastichon)、六行大麦(Hordeum hexastichum)、不规则型大麦(Hordeumirregulare)、大麦(Hordeum sativum)、Hordeum secalinum、黑麦(Secale cereale)、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、普通栽培燕麦(Avena fatua var.sativa)、杂种燕麦(Avena hybrida)、高粱(Sorghum bicolor)、石茅(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、弯头高粱(Sorghum cernuum)、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬杆高粱(Sorghum durra)、Sorghumguineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱(Sorghum nervosum)、甜高粱(Sorghumsaccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、Sorghum vulgare、Holcus halepensis、Sorghum miliaceum、稷(Panicum militaceum)、稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia)、玉米(Zea mays)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)的属和种。

在一些实施方案中，待使用的植物是包含大量脂质化合物的油料作物，例如花生、油菜、卡诺拉(canola)、向日葵、红花、罂粟、芥子、大麻、蓖麻油植物、橄榄、芝麻、金盏草、石榴、月见草、毛蕊花、蓟、野蔷薇、榛、杏、昆士兰果、鳄梨、月桂、南瓜/美国南瓜、亚麻、大豆、阿月浑子果、琉璃苣、木本(油棕、椰子、核桃)或作物，例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、棉花、木薯、胡椒、万寿菊、茄科(Solanaceae)植物，例如马铃薯、烟草、茄子和西红柿、野豌豆属物种、豌豆、苜蓿或灌木(咖啡、可可、茶)、柳属物种和多年生草本和饲料作物。根据本发明的植物可以是油料作物，例如花生、油菜、卡诺拉、向日葵、红花、罂粟、芥子、大麻、蓖麻油植物、橄榄、金盏草、石榴、月见草、南瓜/美国南瓜、亚麻、大豆、琉璃苣、木本(油棕、椰子)。

还考虑了生产植物或植物部分(包括植物组织、植物器官、植物或种子)的方法，包括将本文所述载体的重组基因导入植物细胞中，并使植物细胞再生以形成植物组织、植物器官、植物或种子。

还考虑了给植物提供杀虫活性的方法，包括将包含编码杀虫蛋白的核苷酸序列的本文所述载体的重组基因引入植物细胞中，并使植物细胞再生以形成植物或植物部分，包括植物组织、植物器官、植物或种子，从而给植物提供杀虫活性。在一些实施方案中，杀虫活性是杀昆虫活性。

可用许多本领域公认的方法将重组基因引入植物细胞中。植物物种可以用本文所述的DNA构建体或重组基因转化，通过DNA介导的植物细胞原生质体转化，随后根据本领域熟知的程序从转化的原生质体再生植物。

可以用本文所述的载体转化能够随后克隆繁殖的任何植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生。如本文所用的，术语“器官发生”是指芽和根从分生组织中心依次发育的过程；本文所用的术语“胚胎发生”是指芽和根以协调的方式(不是顺序地)一起发育的过程，无论是从体细胞还是配子，所选择的特定组织将根据可用于和最适合于待转化的特定物种的克隆繁殖系统而变化，示例性的组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和多叶分生组织)。

植物可以采取多种形式。例如，植物可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；植物可以是克隆转化体(例如，所有细胞被转化以含有重组基因)；植物可包含转化和未转化组织的嫁接物(例如，在柑橘属物种中嫁接至未转化接穗的转化根茎)。转化的植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自交以产生纯合的第二代(或T2)转化植物，并且T2植物通过经典育种技术进一步繁殖。显性选择标记(例如npt II)可以与重组基因相关联以帮助育种。

植物的转化可以用单个DNA分子或多个DNA分子进行(即共转化)，并且这两种技术都适用于本文所述的重组基因。许多转化载体可用于植物转化，并且本发明的重组基因可与任何此类载体联合使用。载体的选择将取决于所选择的转化技术和用于转化的靶物种。

用于将构建体引入植物细胞宿主的多种技术是可用的并且是本领域技术人员已知的。示例性技术包括使用根癌农杆菌(A.tumefaciens)或发根农杆菌(A.rhizogenes)作为转化剂用DNA转化、脂质体、PEG沉淀、电穿孔、DNA注射、直接DNA摄取、微粒轰击、粒子加速等(参见例如EP 295959和EP 138341)(参见下文)。然而，可以用本文所述的重组基因转化除植物细胞之外的细胞。植物表达载体和报告基因以及农杆菌和农杆菌属介导的基因转移的一般描述可以在Gruber等(1993)中找到。

可以将含有基因组或合成片段的表达载体引入原生质体或完整组织或分离的细胞。可以将表达载体引入完整组织中。培养植物组织的一般方法例如由Maki等(1993)；和Phillips等(1988)提供。可以使用直接基因转移方法(如微粒介导的递送、DNA注射、电穿孔等)将表达载体引入玉米或其他植物组织中。表达载体也可以用弹道(biolistic)装置使用微粒介质递送引入植物组织中。参见，例如Tomes等(1995)。本发明的载体不仅可用于表达结构基因，还可用于外显子捕获克隆或启动子捕获程序，以检测各种组织中的差异基因表达(Lindsey 1993；Auch&Reth 1990)。

在一些实施方案中，农杆菌属的Tl和Ri质粒的二元型载体可用于转化多种高等植物，包括单子叶和双子叶植物，如大豆、棉花、油菜、烟草和水稻(Pacciotti 1985:Byrne1987；Sukhapinda 1987；Lorz 1985；Potrykus，1985；Park 1985:Hiei 1994)。使用T-DNA转化植物细胞已经得到了广泛的研究，并且被充分描述(EP 120516；Hoekema，1985；Knauf，1983；和An 1985)。

本领域技术人员可利用其他转化方法，例如直接摄入外源DNA构建体(参见EP295959)、电穿孔技术(Fromm 1986)或用包被了核酸构建体的金属颗粒的高速弹轰击(Kline 1987和US 4,945,050)。一旦被转化，本领域技术人员可以再生细胞。特别相关的是目前描述的用于将外源基因转化到重要经济作物中的方法，例如油菜(De Block 1989)、向日葵(Everett 1987)、大豆(McCabe 1988；Hinchee 1988；Chee 1989；Christou 1989；EP301749)、稻(Hiei 1994)和玉米(Gordon-Kamm 1990；Fromm 1990)。

本领域技术人员可以理解，方法的选择取决于转化针对的植物的类型，即，单子叶或双子叶。转化植物细胞的合适方法包括但不限于显微注射(Crossway 1986)、电穿孔(Riggs 1986)、农杆菌介导的转化(Hinchee 1988)、直接基因转移(Paszkowski 1984)和使用可获得自Agracetus,Inc.,Madison,Wis.And BioRad,Hercules,Calif的设备进行弹道颗粒加速(参见例如，US 4,945,050和McCabe 1988)。还参见Weissinger 1988；Sanford1987(洋葱)；Christou 1988(大豆)；McCabe 1988(大豆)；Datta 1990(稻)；Klein 1988(玉米)；Klein 1988(玉米)；Klein 1988(玉米)；Fromm 1990(玉米)；和Gordon-Kamm 1990(玉米)；Svab 1990(烟草叶绿体)；Koziel 1993(玉米)；Shimamoto 1989(稻)；Christou 1991(稻)；欧洲专利申请EP 0 332 581(鸭茅和其他禾本科)；Vasil 1993(小麦)；Weeks 1993(小麦)。

使用直接基因转移或农杆菌介导的转移的方法通常但不必需用可选择的标记进行，所述标记可提供对抗生素(例如，卡那霉素、潮霉素或氨甲喋呤)或除草剂(例如草胺磷(phosphinothricin))的抗性。对于某些植物物种，不同的抗生素或除草剂选择标记是优选的。转化中常规使用的选择标记包括对卡那霉素和相关的抗生素产生抗性的nptII基因(Messing&Vierra,1982；Bevan 1983)、对除草剂草胺磷产生抗性的bar基因(White 1990，Spencer 1990)、对抗生素潮霉素产生抗性的hph基因(Blochlinger&Diggelmann)，产生对氨甲喋呤的抗性的dhfr基因(Bourouis 1983)。

用于生产和进一步表征稳定转化的植物的方法是本领域技术人员普遍已知的。作为实例，将转化的植物细胞置于恰当的选择培养基中，用于选择转化的细胞，然后生长为愈伤组织。从愈伤组织生长出枝条。通过在生根培养基中生长，从枝条产生试管苗。各种构建体一般连接成用于选择植物细胞的标记。常规而言，所述标记可以是对杀生剂(特别是抗生素，例如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素、氯霉素、除草剂等)有抗性的。特定的标记允许比较缺少所导入的DNA的细胞，来选择转化的细胞。可以从序列制备包括本发明的转录盒的DNA构建体的组分，所述序列对宿主是天然的(内源)或外来的(外源)。“外来”意指序列不可见于导入构建体的野生型宿主中。异源构建体可含有至少一个区域对于转录起始区所来源的基因而言不是天然的。

为了验证转移的目的多核苷酸在转化的细胞和植物中的存在，可以实施多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员普遍已知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印记、原位杂交和基于核酸的扩增方法，如PCR或RT-PCR或Taqman；“生物化学”测定，例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹)或通过酶功能检测蛋白质产物的存在；植物部分测定，例如种子测定；以及通过分析完整再生植物的表型，例如疾病或害虫抗性。

可以通过使用本领域技术人员普遍已知的技术，从细胞系或任何植物部分中分离DNA，来确定预先选定的核酸片段的存在。注意并非总存在完整的序列，可能是由于细胞内序列的重排或缺失。

在一些实施方案中，可以通过聚合酶链式反应(PCR)确定通过本发明方法导入的核酸元件的存在。使用这些技术扩增核酸的离散片段，并通过凝胶电泳检测。该类型的分析允许确定预先选定的核酸片段是否以稳定的转化子的形式存在，但不能验证所导入的预先选定的核酸片段是否整合到宿主细胞基因组中。此外，使用PCR技术不能确定转化子是否具有外源基因导入到基因组的不同位点中，即，转化子是否是独立来源的。考虑使用PCR技术将能够克隆与所导入的预先选定的DNA片段相邻的宿主基因组DNA的片段。

已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配的引物等的方法。

可以使用Southern杂交技术，确定DNA整合到宿主基因组中的肯定性证据，以及转化子的独立身份。使用该技术，可以鉴别导入到宿主基因组中的特定DNA序列以及侧翼的宿主DNA序列。因而，给定转化子的Southern杂交模式可发挥鉴别所述转化子的特征的作用。此外，可以通过Southern杂交验证所导入的预先选定的DNA片段在高分子量DNA中的存在，即，验证所导入的预先选定的DNA片段已经整合到宿主细胞基因组中。Southern杂交技术提供了使用PCR获得的信息，例如，存在预先选定的DNA片段，但也证实了与基因组的整合以及表征了各个单个的转化子。

考虑使用Southern杂交技术的修饰形式——点或缝印迹杂交技术，可以获得与源自PCR的相同的信息，例如存在预先选定的DNA片段。

PCR和Southern杂交技术都可用于证实向后代传递了预先选定的DNA片段。在大部分例子中，给定转化子的特征性Southern杂交模式将在后代中分离为一个或多个孟德尔遗传的基因(Spencer 1992)；Laursen 1994)，表示基因的稳定继承。种系传递，以及在愈伤组织、R0植物和转化基因分离的R1后代中，转化DNA的相同的Southern印迹杂交模式和强度，都提示愈伤组织和亲代转化子(R0)的非嵌合性质。

DNA分析技术可以使用从植物的任何部分分离的DNA来进行，而RNA可能只在特定的细胞或组织类型中表达，因而必需从这些组织制备用于分析的RNA。PCR技术还可用于检测和定量从导入的预先选定的DNA片段产生的RNA。在该PCR应用中，首先必须将RNA逆转录成DNA，使用酶例如逆转录酶，然后通过使用常规的PCR技术扩增DNA。在大部分例子中，PCR技术虽然有效，但却不能证实RNA产物的完整性。通过Northern印迹可以获得关于RNA产物性质的其他信息。该技术将证实RNA样本的存在，并给出关于所述RNA完整性的信息。还可以使用点或缝印迹Northern杂交，来确定RNA样本的存在或缺少。这些技术是修饰的Northern印迹，且仅证实RNA样本的存在或缺少。

虽然Southern印迹和PCR可用于检测所讨论的预先选定的DNA片段，但它们没有提供关于预先选定的DNA片段是否表达的信息。可以通过特异性鉴别所导入的预先选定的DNA片段的蛋白质产物，或评估由其表达产生的表型改变，来评估表达。

对特定蛋白质的生产和鉴别的测定可利用蛋白质的物理化学、结构学、功能或其他的特性。独特的物理化学或结构特性允许通过电泳方法分离和鉴别蛋白质，例如天然的或变性的凝胶电泳或等电聚焦，或者通过色谱技术例如离子交换或凝胶排阻色谱。单个蛋白质的独特结构提供了使用特定抗体以诸如ELISA测定的模式检测其的存在的机会。可以使用具有甚至更高特异性的方法的组合，例如Western印迹，其中抗体用于定位已通过电泳技术分离的单个基因产物。可以使用其他技术绝对验证目标产物的身份，例如通过纯化后氨基酸测序来评估。虽然上述是最常使用的，但也可以额外使用其他程序。

测定程序也可用于通过其功能性，尤其是酶催化涉及特定底物和产物的特定化学反应的能力来鉴定蛋白质的表达。这些反应之后可以通过物理或化学程序提供和定量底物的损失或反应产物的产生。实例随待分析的酶而变化。

非常常见的是，通过评价其表达的表型结果来确定基因产物的表达。这些测定也可以采取许多形式，包括但不限于分析植物的化学组成、形态或生理特性的变化。形态变化可以包括更大的个头或更粗的茎。最常见的是，在被称为生物测定的仔细控制的条件下评估植物或植物部分对施加的处理的响应的变化。

提供了本文所述的具有组成型启动子活性的核酸在调控可操作地连接的核酸在植物中的表达或鉴定具有组成型启动子活性的其它核酸中的用途。

生产食品、饲料或工业产品的方法包括：a)获得本发明的植物、植物部分或种子，和b)从植物、植物部分或种子制备食品、饲料或工业产品。该方法还可以包括：其中a)食品或饲料是油、粗粉、谷物、淀粉、面粉或蛋白质，或b)工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养品。

应当理解，本发明不限于如此描述的特定方法、方案、细胞系、植物种或属、构建体和试剂。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求来限制。必须注意到如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非文中另外清楚地限定了。因此，例如，提及“一个载体”是指一个或多个载体，并且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。

序列表

作为本公开的单独部分，本申请包含计算机可读形式的序列表(文件名：202017P2_Seqlisting.txt；大小：5,022字节：创建：2020年11月20日)，其通过引用整体并入。

实施例

除非在实施例中另有说明，否则所有重组DNA技术均根据Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的第1和2卷以及Brown(1998)Molecular Biology，Labfax，第二版，Academic Press(UK)的第I和II卷中所述的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中，由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版。聚合酶链式反应的标准材料和方法可见于Dleffenbach和Dveksier(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和McPherson等(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第1版，Springer Verlag，德国。

实施例1-大豆基因glyma13g33190的启动子区的克隆

为了克隆命名为P-bdc16-1.2，SEQ ID NO:1的大豆基因glyma13g33190(Soybase注释Glyma 1.1)的启动子区，将来自Thorne的含有glyma13g33190基因的启动子序列的质粒用作用于SEQ ID NO:1的PCR扩增的模板，使用来自NEB(Ipswich，MA，USA)的Q5高保真DNA聚合酶试剂盒。用适体和序列特异性引物(正向引物：ctccgaatatctcttagttgaaaaaaaacatttc(SEQ ID NO:5)；反向引物：TTTCTTTCTTGCTTTCTTATGATTCT CTTCTTCTC(SEQ ID NO:6))对质粒DNA进行PCR。适体是与克隆位点邻近的目的载体序列互补的短DNA序列。使用0.8％(w/v)琼脂糖凝胶上的电泳分离了PCR产物。根据制造商的说明书(SGI-DNA，Madison，Wis.，USA)，使用Gibson组装试剂盒，从凝胶提取大小约为1080bp的片段，纯化并组装到我们专有的植物基因表达载体pBay01339中，该载体用SbfI和BsgI酶预消化。对所得载体pBay02059进行测序并与来自Thome的P-bdc16-1.2序列比对，发现了100％比对。

P-bdc16-1.2最初是通过PCR扩增从大豆(Glycine Max cultivar Thome)基因组DNA克隆的。

实施例2-启动子缺失变体

通过PCR介导的克隆，从P-bdc16-1.2的5’端产生一系列200bp缺失。简言之，从pBay02059的质粒DNAPCR扩增大小为480bp(SEQ ID NO:4)、680bp(SEQ ID NO:3)和880bp(SEQ ID NO:2)的大豆基因glyma13g33190的启动子区。以与实施例1中所述相同的方式进行了PCR。PCR引物由这些截短启动子中的每一个的适体和序列特异性引物组成，其共享相同的3'端。适体是与克隆位点邻近的目的载体序列互补的短DNA序列。在这种情况下，目的载体是pBay02059。使用1％(w/v)琼脂糖凝胶上的电泳分离了PCR产物。从凝胶切下大小为480bp(SEQ ID NO:4)、680bp(SEQ ID NO:3)和880bp(SEQ ID NO:2)的片段，纯化并根据制造商的说明书(SGI-DNA，Madison，Wis.，USA)用Gibson组装试剂盒组装到用SbfI和BsgI酶预消化的pBay02059中。所得质粒pBay2206、pBay02207、pBay02208分别含有P-bdc16-1.3(880bp-SEQ ID NO:2)、P-bdc16-1.4(680bp-SEQ ID NO:3)、P-bdc16-1.5(480bp-SEQ IDNO:4)。结果显示在图2中。

实施例3-烟草瞬时测定

将pBay02059、pBay 2206、pBay02207和pBay02208的质粒DNA转化至农杆菌菌株EHA105中(Hood等，1986)。将所得的含有这些质粒的农杆菌用于农杆菌渗入本氏烟草(Nicotiana Benthamian)完全展开的幼叶中(Wydro等人，2006)。在农杆菌渗入后两天收集渗入的叶样品。分析这些样品中的报告子(昆虫抗性基因)表达(总可溶性蛋白的百分比，％TSP)。结果显示在图3中。

实施例4-其他表达分析

进行了从其衍生启动子P-bdc16-1.2(SEQ ID NO:1)的天然大豆glyma13g33L90的表达数据(RNA-seq)。在GENEWIZ(South Plainfield，NJ)用大豆组织(栽培品种Thome)产生RNA-seq数据。如图4中所示，P-bdc16-1.2(SEQ ID NO:1)在所有测试的植物组织中组成型表达，包括茎、叶、根和花籽/豆荚。

实施例5-大豆栽培种中的稳定转化

使用根癌农杆菌转化方法产生了稳定的转化事件，所述方法利用来自成熟半种子的起始材料，如Agrobacterium Protocols第275-284页(Luth等，2015)中所述的。将来自载体pBay02059的质粒DNA转化到农杆菌株EHA105(Hood等，1986)中，也用于稳定转化实验。起始材料源自适于转化的两个大豆栽培种，其代表两个不同的成熟度组(MG)，MG3和MG8。通过除草剂选择和拷贝数PCR两者确认了成功的基因转移，以选择含有单个T-DNA插入的T0事件。参见表1和图5。

表1.

水平	数量	平均	标准误差	上限95％	下限95％
						MG3大豆	24	0.031533	0.00335	0.02480	0.03826
MG8大豆	27	0.024887	0.00316	0.01854	0.03123

在阳性事件鉴定后，在v2-v3生长阶段取样，以利用对引入的昆虫抗性基因特异性的测定法通过ELISA(图6)确认相对蛋白质表达。

实施例6-目的多核苷酸在大豆栽培种中的表达

选择代表昆虫抗性基因的蛋白质表达的T0代四分位数范围的事件(MG3大豆n＝9个事件，MG8大豆n＝8个事件)。播种分离的T1种子，并使植物在典型的温室条件下生长。出苗后不久，对所有植物取样以获得拷贝数，并分析了昆虫抗性基因和除草剂选择标记。参见表2以及图7和8。

表2.

ELISA分析样品在v3-v4生长阶段从如下每个事件中取样-一个0个拷贝(无效)和多达三个1个拷贝(半合子)和2个拷贝(纯合子)的载体。参见图9。

参考文献：

Hood,E.E.,G.L.Helmer,R.T.Fraley和M.-D.Chilton.1986.The hypervirulenceof Agrobacterium tumefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outsideofT-DNA.J.Bacteriol.168:1291-1301.

Wydro M.,E.Kozubek和P.Lehmann.2006.Optimization of transientAgrobacterium-mediated gene expression system in leaves ofNicotianabenthamiana.Acta Biochimica Polonica.Vol.53,No 2/2006,289-298.

序列表

<110> 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司(BASF Agricultural SolutionsSeed US LLC)

<120> 转录调控核苷酸序列及其使用方法

<130> 202017

<160> 6

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1080

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine Max)

<400> 1

ctccgaatat ctcttagttg gaaaaaaaca tttcatcttt taaaaactag atcaaacttg 60

ttgtttccac cacaaattgg tttgctttaa gggataatta tgatttttga tctgtggact 120

tttttggatt tttaatttta gtctttaaac aaaaaattag ctagttgtaa ttgttaaagt 180

tatcatccgt taacattttt ggtcccttcc attaagtgtt gtcattaaca gatgatgtga 240

cgatagctgt gagtgtcatg tggtacttat ttgtggcaat ttattttgtt acgattttgg 300

ctgtcagaaa atgcttactg agttgctttg aaaggtatta aacatttttc tacggtttaa 360

aacctctaga aattgctact catgcataca tcatcaacaa attttgtata aagacgattc 420

tcccacaaag tttcatcttt ttttttaata acacaaattc atatagactt aattcactca 480

atcacctatg agtaaagatt gcgtctgaga agaatttacc acacatttct agctttatca 540

tcatatatat ttttcaaaat ttgaggtgaa cataccatca attcatcatc acactaactt 600

aatggtaaac accatcatct atacttttcc aaattacaac atcaggcttt ccatccaaat 660

ggaaagtcat aatagagtta ttgtttgggc atgaaaaatg gttctcaatc ttgtaaggaa 720

aaacttaagt ttaatcccga catagtacac ttttaaatct ggattgatga ttagtcttat 780

aattagtcaa aaagattcta attaaggtgg tataaaaaaa tgatcaacta atgtgatgaa 840

actgaagaaa caatttgagc taattgatat taaaaaaaaa aaactctgta aagttaaagg 900

aataatttga aaccaaaaat aaaaaacaat tgtattttaa cctaatagta tttaaattaa 960

aaataataat atactccgag aagaagggaa tatataagaa gagcggcgga gctaaagaag 1020

agagtgggca tagtagacga gaaaggagaa gaagagaatc ataagaaagc aagaaagaaa 1080

<210> 2

<211> 880

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 2

ggtcccttcc attaagtgtt gtcattaaca gatgatgtga cgatagctgt gagtgtcatg 60

tggtacttat ttgtggcaat ttattttgtt acgattttgg ctgtcagaaa atgcttactg 120

agttgctttg aaaggtatta aacatttttc tacggtttaa aacctctaga aattgctact 180

catgcataca tcatcaacaa attttgtata aagacgattc tcccacaaag tttcatcttt 240

ttttttaata acacaaattc atatagactt aattcactca atcacctatg agtaaagatt 300

gcgtctgaga agaatttacc acacatttct agctttatca tcatatatat ttttcaaaat 360

ttgaggtgaa cataccatca attcatcatc acactaactt aatggtaaac accatcatct 420

atacttttcc aaattacaac atcaggcttt ccatccaaat ggaaagtcat aatagagtta 480

ttgtttgggc atgaaaaatg gttctcaatc ttgtaaggaa aaacttaagt ttaatcccga 540

catagtacac ttttaaatct ggattgatga ttagtcttat aattagtcaa aaagattcta 600

attaaggtgg tataaaaaaa tgatcaacta atgtgatgaa actgaagaaa caatttgagc 660

taattgatat taaaaaaaaa aaactctgta aagttaaagg aataatttga aaccaaaaat 720

aaaaaacaat tgtattttaa cctaatagta tttaaattaa aaataataat atactccgag 780

aagaagggaa tatataagaa gagcggcgga gctaaagaag agagtgggca tagtagacga 840

gaaaggagaa gaagagaatc ataagaaagc aagaaagaaa 880

<210> 3

<211> 680

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 3

attttgtata aagacgattc tcccacaaag tttcatcttt ttttttaata acacaaattc 60

atatagactt aattcactca atcacctatg agtaaagatt gcgtctgaga agaatttacc 120

acacatttct agctttatca tcatatatat ttttcaaaat ttgaggtgaa cataccatca 180

attcatcatc acactaactt aatggtaaac accatcatct atacttttcc aaattacaac 240

atcaggcttt ccatccaaat ggaaagtcat aatagagtta ttgtttgggc atgaaaaatg 300

gttctcaatc ttgtaaggaa aaacttaagt ttaatcccga catagtacac ttttaaatct 360

ggattgatga ttagtcttat aattagtcaa aaagattcta attaaggtgg tataaaaaaa 420

tgatcaacta atgtgatgaa actgaagaaa caatttgagc taattgatat taaaaaaaaa 480

aaactctgta aagttaaagg aataatttga aaccaaaaat aaaaaacaat tgtattttaa 540

cctaatagta tttaaattaa aaataataat atactccgag aagaagggaa tatataagaa 600

gagcggcgga gctaaagaag agagtgggca tagtagacga gaaaggagaa gaagagaatc 660

ataagaaagc aagaaagaaa 680

<210> 4

<211> 480

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 4

aatggtaaac accatcatct atacttttcc aaattacaac atcaggcttt ccatccaaat 60

ggaaagtcat aatagagtta ttgtttgggc atgaaaaatg gttctcaatc ttgtaaggaa 120

aaacttaagt ttaatcccga catagtacac ttttaaatct ggattgatga ttagtcttat 180

aattagtcaa aaagattcta attaaggtgg tataaaaaaa tgatcaacta atgtgatgaa 240

actgaagaaa caatttgagc taattgatat taaaaaaaaa aaactctgta aagttaaagg 300

aataatttga aaccaaaaat aaaaaacaat tgtattttaa cctaatagta tttaaattaa 360

aaataataat atactccgag aagaagggaa tatataagaa gagcggcgga gctaaagaag 420

agagtgggca tagtagacga gaaaggagaa gaagagaatc ataagaaagc aagaaagaaa 480

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 5

ctccgaatat ctcttagttg aaaaaaaaca tttc 34

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 6

tttctttctt gctttcttat gattctcttc ttctc 35

Claims (19)

1.一种分离的具有组成型启动子活性的核酸，其选自：

a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸或其功能性片段，和

b)包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的核苷酸序列的核酸或其功能性片段。

2.一种用于调控目的多核苷酸表达的重组基因，所述重组基因包含根据权利要求1的具有组成型启动子活性的核酸。

3.权利要求2的重组基因，其中所述重组基因还包含至少一个与具有组成型启动子活性的核酸可操作地连接的目的多核苷酸。

4.权利要求2至权利要求3任一项的重组基因，其中目的多核苷酸编码杀昆虫蛋白或除草剂选择标记。

5.一种载体，其包含根据权利要求1的具有组成型启动子活性的核酸或权利要求2至权利要求4任一项的重组基因。

6.权利要求5的载体，其中所述载体是表达载体。

7.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1的具有组成型启动子活性的异源核酸、权利要求2至权利要求4任一项的重组基因或权利要求5或权利要求6的载体。

8.权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。

9.一种植物、植物部分或种子，其包含根据权利要求1的具有组成型启动子活性的异源核酸、权利要求2至权利要求4任一项的重组基因或权利要求5或权利要求6的载体。

10.一种用于在宿主细胞中表达目的多核苷酸的方法，其包括

(a)将根据权利要求1的具有组成型启动子活性的核酸、权利要求2至权利要求4任一项的重组基因或权利要求5或权利要求6的载体引入宿主细胞中，和

(b)在所述宿主细胞中表达至少一种目的多核苷酸。

11.权利要求10的方法，其中所述宿主细胞是植物细胞。

12.权利要求10或权利要求11的方法，其中由目的多核苷酸编码的积累的蛋白质的可检测量为提取的总可溶性蛋白质的约0.01％-1.15％。

13.一种用于产生植物或植物部分的方法，其包括

(a)将根据权利要求1的具有组成型启动子活性的核酸、权利要求2至权利要求4任一项的重组基因或根据权利要求5或权利要求6的载体引入植物细胞中；和

(b)再生所述植物细胞以形成植物或植物部分。

14.一种在植物中提供杀虫活性的方法，其包括

(a)将根据权利要求1的具有组成型启动子活性的核酸、权利要求2至权利要求4任一项的重组基因或根据权利要求5或权利要求6的载体引入植物的宿主细胞中；和

(b)在所述宿主细胞中表达编码杀虫蛋白的多核苷酸，从而在植物中提供杀虫活性。

15.权利要求14的方法，其中杀虫蛋白是杀昆虫蛋白。

16.根据权利要求1的具有组成型启动子活性的核酸用于调控可操作地连接的核酸在植物中的表达的用途。

17.根据权利要求1的具有组成型启动子活性的核酸用于鉴定具有组成型启动子活性的其他核酸的用途。

18.一种生产食品、饲料或工业产品的方法，其包括

a)获得权利要求9的植物、植物部分或种子；和

b)从植物、植物部分或种子制备食品、饲料或工业产品。

19.权利要求18的方法，其中

a)食品或饲料是油、粗粉、谷物、淀粉、面粉或蛋白质，或

b)工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养品。

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