JPH11507380A - 多様な植物細胞の凍結保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物細胞の凍結保存方法、および、長期間もしくは短期間に亙る凍結保存から生存植物細胞を回復する方法に関する。凍結保存されるべき植物細胞は、培養内で増殖され得ると共に、凍結保護剤、及び選択的に安定剤、を含む溶液により予備処理され得る。安定剤は、エチレン阻害剤、酸素ラジカル捕捉剤、および２価陽イオンなどの膜安定剤が好適である。細胞は、増殖物を熱ショックに晒すことによっても安定化され得る。予備処理された細胞は、低温に順化されると共に、DMSO、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどの凍結保護剤がロードされる。ロードされた細胞は、例えば高濃度の凍結保護剤を含む溶液から成る溶化溶液により温置される。溶化された細胞は約20%以下の水分を含むと共に、細胞の遺伝子型的もしくは表現型的特徴をそれほど変化させずに長期間に亙り凍結保存温度で凍結され得る。植物細胞はまた、溶化溶液に晒す前に凍結乾燥することによっても凍結保存され得る。凍結保存と溶化との組合せにより、細胞の約80%乃至約95%の水分が除去される。細胞は好首尾に長期間に亙り凍結保存されると共に生存回復され得る。本発明はまた、凍結保存から生存植物細胞を回復する方法にも関する。細胞は略々室温で解凍されると共に、凍結保護剤および安定剤を含む媒体内で温置される。凍結保護剤は除去されると共に、細胞は液状もしくは半固体の増殖培地内で好首尾に温置且つ回復される。本発明はまた、凍結保存された細胞と、長期間もしくは短期間の凍結保存から回復された生存植物細胞とに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 多様な植物細胞の凍結保存方法 関連出願への言及： 本出願は、1995年6月7日に出願された合衆国特許出願第08/486,204号の一部継 続出願である。 発明の背景： １．発明の分野 本発明は、植物細胞の凍結保存方法、および、凍結保存された植物細胞の回復 方法に関する。本発明はまた、凍結保存から好首尾に回復された植物、生存植物 細胞および植物細胞培養組織に関する。 ２．背景の説明 凍結保存(cryopreservation)は、超低温で保存することにより生体物質の代謝 機能を減退してから停止することに基づいている。また、遺伝子変化を起こさず に植物および植物細胞を長期間に亙り凍結保存したり、それに引続き、特性およ び生合成能力を変化させずに通常の植物細胞を回復することは、植物繁殖、生体 医学調査および遺伝子工学と重要な関係を有している。更に、液体窒素の温度(- 196℃)では、細胞は殆ど全ての代謝作用を停止すると共に、この停止し乍らも生 存可能な状態で長期に亙って保持され得る。 植物セルを凍結保存するのは、汚染による損傷を防止すると共に、連続的な細 胞系統における遺伝子変化を最小限にし且つ有限細胞系統における老化および形 質転換を回避する為である。この点、所望の植物特性を保存する上で従来は田畑 に植物の群生を作り出していた、と言うのも、多くの植物は種子からは実際には 繁殖しないからである。しかし乍ら、この様に植物を田畑で貯蔵するには多大な 労力および土地が必要であると共に、気候、病気もしくは他の危険により損傷を 受ける危険性が高い。田畑の群生に代わるものとしては、通常のもしくは制限さ れた増殖条件下で植物組織を試験管内で培養する手法がある。但し、長期間の貯 蔵に対しては、定常的な継代培養を行わない方が望ましい、と言うのも、組織培 養に伴う変異、汚染、労務費用、および、人為的誤操作の危険性の問題があるか らである。 植物を含む殆どの生体物質は、凍結保存用の試薬剤および処理がなければ、凍 結温度への凍結およびそこからの解凍に耐えることな出来ない。多くの凍結保存 法は、低温凍結による悪影響から細胞を保護し得る特性を有している。凍結保存 の本質とは、損傷を最小限に制御した手法で細胞の脱水および細胞質ゾルの濃縮 を行い、例えば液体窒素内での急冷中における細胞質ゾル内での氷結晶を排除も しくは最小限にすることである。 従来の凍結保存処理においては、細胞の脱水は懸濁媒体を凍結により濃縮する ことで行われていた。また、脱水による有害な効果は、凍結保護剤の存在により 緩和されていた。即ち、細胞および器官などの試料は、まずジメチルスルホキシ ド(DMSO)もしくはエチレングリコールなどの凍結保存剤を含む溶液中で平衡化さ れる。この懸濁液は、その凝固点よりも僅かに低い温度にて氷結晶を散布するこ とにより冷却される。更に、この懸濁液は約-30℃と約-40℃との間などの中間的 な零度以下の温度に最適な速度で再度冷却され、最終的に液体窒素内で急冷され る。 微生物、接合体、および、接合体から得られた動物に対しては、常用の凍結保 存が可能であるが、植物細胞の凍結保存は通常的なものから程遠く、植物の個々 の種に対して別個のプロトコルが必要なことも多い。 ところで、イチイ(taxus)の木はタキソール(taxol)を生成するが、これはPaci fic yewの樹皮から最初に分離されたジテルペンアルカロイドである。イチイbre vifolia(M.C．Wani et al.， J.米国化学協会 93:2325-27.1971)を参照。実験に よれば、この化合物は不当な毒性を発揮することなく哺乳類の微小管の重合を効 果的に抑制することから、効果的な腫瘍阻害剤である。また、臨床的追跡によれ ば、不応性卵巣、乳ガンおよび他のガンに対してタキソールが極めて効果的であ ることが立証された。従って、タキソールは化学療法における画期的な発見であ る、と言うのも、その基本的な作用機構は従来の化学療法剤とは異なり、独特か つ根本的なものだからである(L.A．Rowinsky et al.，国立ガン研究所、82:1247 -59.1990)。 タキソール系において最も衝撃的な変形物までもが供給されている。それはひ とりの患者を処置するのに樹齢百年のPacific yewを３本ないし６本も必要と する、と言うのも、タキソールの平均的な収量が低いからである(Witherup et a l.,1990)。従って、処置および試験用に大量のタキソールを製造するとすれば、 数万本のイチイ(yew)を切り倒す必要がある。この点イチイの数は伐採により殆 ど絶滅していると共にPacific yewの数は減少していることから、医学的な研究 を行う上では別の形態によるタキソールの供給源を探さねばならない。タキソー ルの有用性、および、植物細胞中から増殖もしくは収穫され得る他の多くの化合 物は、“イチイ”および他の植物細胞の培養に対する興味を促進した。 然るに、植物細胞の生合成能力に対してそれらを培養することは、現在のテク ノロジに特別の問題を賦課する。即ち、長期間に亙り植物細胞を培養すると、当 初の分離物に存在した生合成能力が損なわれる結果になることが多い(Dhoot et al.，Ann．Bot．41:943-49,1977;Barz et al.，Ber.Dtsch.Bot.Ges.94:1-26,1 981)。また、表現型の変化も起き、細胞培養を更に複雑なものとする。植物細胞 、特に“イチイ(taxus)”を凍結する為のプロトコルは、タキソールなどの有用 な植物アルカロイドの製造を行う生合成方法を開発する上で重要なステップであ る。 発明の要約： 本発明は、現在の方法および対策に伴う問題および不利益を克服すると共に、 植物細胞を凍結保存し且つ凍結保存された生存植物細胞を回復する方法を提供す る。 本発明の一実施例は、植物細胞の凍結保存方法に関する。裸子植物もしくは被 子植物ともされ得る植物細胞は、凍結保存剤および安定剤により予備処理される と共に、低温に順化される。例えば２価の陽イオンなどの安定剤は、細胞膜を破 裂から保護する。予備処理は、エチレン作用阻害剤もしくはエチレン生合成阻害 剤などのエチレン阻害剤を含み得る。また、予備処理された植物細胞は溶化(vit rification)されると共に凍結保存温度で凍結される。２価の陽イオンは、溶化 段階もしくはローディング段階で含ませても良い。順化された細胞には、溶化剤 と同一ともされ得るローディング剤がローディングされ、ローディングされた細 胞は溶化溶液により溶化される。溶化された植物細胞は、例えば約−70℃と約− 200℃との間もしくはそれ以下の凍結保存温度にて凍結される。 本発明の別実施例は、植物細胞の凍結保存方法に関する。凍結保存されるべき 植物細胞は、凍結保存剤、エチレン阻害剤、２価陽イオンもしくは熱ショック蛋 白質により予備処理されると共に、低温に順化される。エチレン阻害剤は、エチ レン作用阻害剤もしくはエチレン生合成阻害剤としても良い。順化された植物細 胞は溶化されると共に凍結保存温度で凍結される。 本発明の別実施例は、植物細胞の凍結保存方法に関する。凍結保存されるべき 植物細胞は、溶化剤および安定剤を含む媒体中で低温にて第１期間に亙り培養さ れる。培養された植物細胞は更に、濃度の高い溶化剤を含む媒体内で第２期間に 亙り培養される。高濃度の溶化試薬中で溶化された植物細胞は、凍結保存温度で 凍結される。 本発明の別実施例は、植物細胞の凍結保存方法に関する。凍結保存されるべき 植物細胞は真空蒸発により凍結乾燥されると共に、溶化溶液中で溶化される。凍 結乾燥によれば細胞から約60%の水分が除去されるが、溶化と組合せれば約95%ま でも除去することが可能である。溶化されると共に凍結乾燥された植物細胞は、 例えば細胞を液体窒素中で急冷することにより、凍結保存温度で凍結されかつ保 存される。 本発明の別実施例は、植物細胞の凍結保存方法に関する。凍結保存されるべき 植物細胞は熱ショックにより予備処理される。熱ショックによれば、プロテイン の搾りが誘発され、細胞膜の破裂が部分的に安定する。予備処理は、エチレン作 用阻害剤もしくはエチレン生合成阻害剤などのエチレン阻害剤を含み得る。予備 処理された植物細胞は、溶化されると共に凍結保存温度で凍結される。２価陽イ オンは、予備処理もしくは溶化段階、または、ローディング段階で含ませても良 い。 本発明の別実施例は、凍結保存から植物細胞を回復する方法に関する。植物細 胞は、本発明に係る方法で凍結保存される。解凍された植物細胞は、凍結温度以 上の温度に暖められ、凍結保存剤および安定剤を含む媒体中に温置(incubate)さ れる。浸透剤は除去され、生存植物細胞が回復される。 本発明の別実施例は、凍結保存から植物細胞を回復する方法に関する。植物細 胞は、本発明に係る方法で凍結保存される。解凍された植物細胞は、凍結温度以 上の温度に暖められ、エチレン阻害剤、酸素ラジカル捕捉剤、２価陽イオン、凍 結保存剤もしくはこれらの組合せを含む媒体内で温置される。生存する植物細胞 は回復されて活力のある回復再増殖が見られると共に、細胞懸濁液中に迅速に設 置される。 本発明の別実施例は、凍結保存された植物細胞を凍結保存から回復する方法に 関する。凍結保存された植物細胞は凍結温度以上の温度に解凍され、凍結保存剤 および安定剤を含む媒体内に温置される。凍結保存剤は、細胞の混合物すなわち ペレットを希釈するなどして除去され、生存する植物細胞が回復される。 本発明の別実施例は、本発明の方法により凍結保存された生存植物細胞に関す る。凍結保存された植物細胞は、凍結保存により遺伝子的にもしくは表現型的に それほど変化しない。 本発明の別実施例は、凍結保存された植物細胞を懸濁液中で回復する方法に関 する。凍結保存された植物細胞は、凍結温度以上の温度に解凍される。解凍され た植物細胞は懸濁液体中に温置され、生存細胞は固体もしくは半固体培養を必要 とせずに液状媒体中で回復される。 本発明の別実施例は、本発明の方法により凍結保存された植物および植物細胞 と、本発明の方法により回復された生存植物および植物細胞に関する。細胞は凍 結保存プロセスにより遺伝子的にもしくは表現型的にそれほど変化せず、高い生 存率を示した。 本発明の他の実施例および利点は、以下の説明に部分的に示されると共にこの 説明から明らかになり、又は、本発明の実施から知れるであろう。 図面の説明： 図１(A)、(B)および(C)は、種々の凍結保存および回復プロトコルの概要であ る。 図２は、エチレン生成および阻害点の生合成経路を表す図である。 図３は、イチイ(Taxus)細胞の凍結保存処理を表す図である。 図４は、イチイchinensis懸濁培養系統K-1におけるバイオマス増加を示す図で ある。 図５は、６ヶ月間凍結保存された細胞(A)を、凍結保存されていない細胞(B) と比較したクロマトグラムである。 図６は、６ヶ月間凍結保存された細胞(A)を、凍結保存されていない細胞(B)と 比較したクロマトグラムである。 図７は、凍結保存された細胞の遺伝子的安定性のサザンブロット分析図である 。 図８は、凍結保存された細胞の遺伝子的安定性のPCR分析図である。 発明の説明： 本明細書中で実施される共に広範に記載された様に、本発明は、植物細胞の凍 結保存方法、凍結保存された植物細胞の回復方法、および、凍結保存から好首尾 に回復された生存植物細胞に関する。 植物細胞は、植物、または、植物細胞の酵素経路に特有な、組換えプロテイン もしくは独特の製品および化学試薬の製造に対して用途が拡大している。カルス などの植物細胞の培養は、継代培養を反復することで連続状態で維持され得る。 しかし乍ら、継代培養はしばしば、染色体数の増大、汚染の危険性の増大、自然 変異の蓄積、形態学的能力の減衰および喪失、生成物の生合成能力の減少、野性 型への選択された細胞系統の先祖返り、老化および悪性転換、無限細胞系統およ び望ましくない表現型の意図しない選択、に帰着することも多い。これらの要因 の各々は、市販の高価な化合物を製造する細胞培養システムの開発を相当に妨げ るものである。 動物組織を培養する際、細胞は数年に亙り凍結保存されるのが通常的であるが 、同様の凍結保存技術を植物細胞に対して適用することは相当に困難であること が立証されている。植物細胞、特に培養中の植物細胞は、増殖速度、倍加時間、 分裂指数、細胞の同調(cell synchrony)、核／細胞質比、および、液胞化(vacuo lation)の度合に関して種々の不均一性を示す。また、所定の培養中に存在する 細胞は、生理的および形態的に種々の変化を示す。更に、植物細胞の懸濁液およ び接着性の細胞培養は、凍結保存に対して異なるプロトコルを必要とする。更に 、不適切に実行された場合、凍結保存はそのプロセスが正に回避せんとした変異 を誘起することもあり得る。 驚くべきことに、一連の段階および特定の試薬を使用することにより、任意の 属および種の植物細胞の殆どが凍結保存されると共に好首尾に回復され得ること が発見された。これらの方法は、好首尾な植物細胞の凍結保存は細胞から相当の 量の水分を除去すると共に、適切な条件下にて細胞の生存度に重大な影響を与え ること無く重要な量の水を除去し得る、という観察結果に基づいている。案出さ れた凍結保存プロトコルは、通常的な再生手法により生存細胞を貯蔵、維持かつ 回復する上で非常に好結果であった。これらのプロトコルは、通常の単位操作に て確立され、生殖質の保存および細胞の保存の管理システムを創造することが可 能となる。これに加え、植物培養に関してはこれまで不可能と考えられていたプ ロセスである懸濁液中において細胞を全体的に回復することも可能となる。また 、凍結保存された細胞から収穫された製品は、元のすなわち親細胞からそれほど 変化していない、と言うのも、特に増殖および生存度、生成物形成および細胞バ イオマス増殖に関して表現型もしくは遺伝子型の変動が殆ど無いからである。そ のような変動は、観察可能なもしくは定量可能な表現型もしくは形態の変化から 決定される。これらの変化は、それらが表現型のパラメータを少なくない程度で 減少させたときに重要となる。 本発明のひとつの実施例は、植物細胞の凍結保存方法に関する。驚くべきこと に、これらの方法は多くの種類の植物細胞に対して再現かつ適用することができ る。従って、それらは、再現性に関して政府もしくは省庁の基準を必要とする物 質製造に対して極めて有用である。 基本的なプロセスは、予備処理（例えば、２価陽イオン、ラジカル捕捉剤、も しくは熱ショック等の凍結保存剤もしくは安定剤による予備培養）、低温順化、 段階的なもしくは単一回で回分量をローディングしもしくは溶化し、凍結乾燥し 、凍結し、解凍する段階を組合せることにより、細胞からの相当の量の水分を除 去する段階を含んでいる。これらの段階を非常に広範囲に組合せることが可能で あるが、各ステップは、生存植物細胞の特質と増殖特性とを望ましいものに保つ べく植物細胞を好首尾に凍結保存かつ回復する上で必ずしも必要とされるもので はない。これらのステップの可能な組合せの種々の実施例の幾つかは図１(A)、( B)および(C)に概略的に示されているが、これらの各変更例が単なる例示的なも のであることは理解される。植物の各型（たとえば、綱、目、科、属、種、亜種 および変種）は、凍結保存からの回復を最大限にするそれ自身の一連の好適条 件を確実に有している。本明細書中に開示された選択的な変更例からは、凍結保 存に対する最適なパラメータが容易に決定され得る。 裸子植物および被子植物を含め、これらのプロセスを用いることにより殆どの 植物の細胞は好首尾に凍結保存かつ回復され得る。凍結保存され得る裸子植物の 詳細な種類は、モミ属(Abies;firs)、イトスギ属(Cypressus;cypresses)、イチ ョウ属(Ginkgo;maidenhair tree)、ビャクシン属(Juniperus;juniper)、トウヒ 属(Picea;spruce)、マツ属(Pinus;pine)、トガサワラ（ベイマツ）属(pseudotsu ga;Douglas fir)・セコイア属(Sequoia)、イチイ属(Taxus;yew)、ツガ属(Tsuga; hemlock)、もしくはザミア属(Zamia;cycad)の種を含むものである。イチイ属の 内で更に有用な種の幾つかは、T.baccata（イチイ科ヨーロッパイチイ）,T.brev ifolia,T.canadensis,T.chinensis,T.cuspidata,T.floridana,T.globosa,T.medi a,T.nuciferaおよびT.wallichianaを含む。保存され得る被子植物は、単子葉植 物の細胞および双子葉植物の細胞を含む。単子葉植物細胞としては、からす麦属 (Avena;oat)、ココヤシ属(Cocos;coconut)、ヤマノイモ属(Dioscorea;yam)、オ オムギ属(Hordeum;barley)、バショウ属(Musa;banana)、イネ属(Oryza;rice)、 メダケ属(Saccharum;sugar cane)、モロコシ属(Sorghum;sorghum)、コムギ属(Tr iticum;wheat)およびトウモロコシ属(Zea;corn)の様々な種を含む。双子葉植物 は、Achyrocline属、Atropa属、アブラナ属(Brassica;mustard)、メギ属(Berber is)、Sophora属、マメ属、ルピナス属(Lupinus)、トウガラシ属(Capsicum)、Cat haranthus属、conospermum属、チョウセンアサガオ属(Datura)、ニンジン属(Dau cus;carrot)、ジギタリス属(Digitalis)、Echinacea属、Eschscholtzia属、ダイ ズ属(G1ycine;soybean)、ワタ属(Gossypium;cotton)、ヒヨス属(Hyoscyamus)、 トマト属(Lycopersicum;tomato)、リンゴ属(Malus;apple)、ムラサキウマゴヤシ 属(Medicago;alfalfa)、タバコ属(Nicotiana)、panax属、エンドウ属(Pisum;pea )、Rauvolfia属、Ruta属、ナス属(Solanunt;potato)および Trichosanthes属の様々な種を含む。 植物細胞は、新生の針葉、葉、根、樹皮、幹、地下茎、カルス細胞、原形質体 、細胞懸濁、器官もしくは器官系、頂芽分裂組織などの分裂組織、種子もしくは 胚として田畑から新たに収穫された試料であり得る。一般的に、培養中もしくは 凍結保存からの回復時において、継代の浅い細胞および初代培養が最大の生存度 を示す。代わりに、確立された試験管内培養からサンプル細胞を採取しても良い 。培養は長い間にわたり行われて来たが、例えば、特定の温度、特定の光強度ま たは特殊な増殖もしくは保持媒体などの試験管内条件で行われたのは最近のこと である。斯かる細胞は懸濁細胞(suspension cell)としてもしくは半固体栄養培 地により維持しても良い。 懸濁培養は、イチイ種のカルス培養、もしくは、凍結保存されたイチイ種の細 胞を解凍したものから導き得るものである。継代の浅い初代細胞系は極めて高価 値である、と言うのも、これらの培養は長期間の培養では失われる独特の特性を 示すからである。これらの細胞系の多くは、ジテルペンアルカロイド・タキサン (taxane)、エステル側鎖改変タキサン、タキソール(分子量853)、および、タキ サンの種々の他の変形物（バッカチン(baccatin)もしくは10−デアセチルバッカ チン(10-deacetylbaccatin)）を発現する。 培養用のイチイ細胞は、任意の植物物質から得ることが可能である。採集は、 北米ならびに他の国々に亙って行うことが出来る。細胞培養の為には、樹皮、形 成層、針葉、幹、種子、円錐果および根の任意の部分からの組織を選択かつ採用 し得る。但し、細胞培養を開始する為には、植物の針葉(needle)および分裂組織 領域、特に１ヶ月齢ないし３ヶ月齢の新生針葉が好適である。また、選択された 植物組織は、例えば、Tween 20を10滴だけ落とした4リットルの10%漂白剤溶液中 に20分間だけ浸して殺菌する。切断された組織は、極めて小さな寸法にして外植 培養される。 イチイの培養では、増殖形態、増殖性、生産プロファイル(productprofile)お よび他の特性が変動するのが通常である。個々の細胞系は増殖培地成分に対する 選択性により変化することから、細胞培養を誘起および増殖する為には、多くの 異なる増殖培地を使用しても良い。殺菌、カルス増殖開始および懸 濁増殖を行う方法、並びに、適切な栄養培地は、当業者公知である。 イチイの懸濁培養は、急速な増殖速度および高い細胞密度で行うことが可能で ある。様々なイチイ種の最初の培養は継代培養されるが、これは、例えばマクロ およびミクロの栄養、有機塩および増殖ホルモンを含む適切な培地内に移送する ことで行われる。培養液体は空気に晒されると共に、培養液を空気飽和処理すべ く撹拌し、または、空気を培養液内に吹込むのが好適である。培養組織は約20℃ で約3乃至7、好適には約4乃至約6のpHにて保たれる。斯かる培養組織は、例えば 濾過もしくは遠心分離により増殖培地から除去することにより収穫される。最も 高い生存度を示した細胞は、早期の誘導期もしくは早期の細胞分裂増殖期におけ るもの、または、細胞分裂もしくは有糸分裂を介して最新に継代されたものであ る。概略的には、増殖培養液中で4〜10日経過した、好適には増殖培養液中で5〜 8日経過した、更に好適には増殖培養液中で6〜7日経過したイチイ種の細胞懸濁 が使用に適している。 凍結保存の基本的ステップの各々を、以下に示す： 予備処理： 凍結保存されるべき植物細胞は、細胞の増殖間にもしくは細胞死滅によりもた らされた有害物質を培養媒体から除去することにより細胞の生存度を高める試薬 により予備処理される。これらの試薬は本明細書中では安定剤と称するが、それ らは、自然に産するもしくは人工的に製造されると共に培養媒体中に直接的に導 入され得る材料を含む。安定剤としては、活性酸素種および他のフリーラジカル の存在に付随する有害効果を中和する抗酸化剤もしくはラジカル捕捉剤である化 学試料が含まれる。上述の物質は、細胞膜、すなわち内部および外部の膜の両者 を損傷し、凍結保存および回復の程度を相当に低下させるものである。もし、こ れらの物質が除去されずもしくは無効とされなければ、生存度に対するそれらの 効果は経時的に蓄積され、実用上の貯蔵寿命を厳しく制限するであろう。更に、 細胞は死滅しもしくは疲労することから、付加的な有害物質が放出されて隣接細 胞が損傷かつ死滅する。 有用な安定剤には、酸素ラジカルなどの高反応／損傷性の分子を隔離する化学 物質および化学的化合物が含まれる。これらのラジカル捕捉剤および抗酸化剤の 具体的な例としては、還元形グルタチオン、1,1,3,3-テトラメチル尿素、1,1,3, 3-テトラメチル-2-チオ尿素、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸銀、ベタイン、N,N -ジメチルホルムアミド、N-(2-メルカプトプロピオニル)グリシン、β-メルカプ トエチルアミン、セレノメチオニン、チオ尿素、没食子酸プロピル、ジメルカプ トプロパノール、アスコルビン酸、システイン、ナトリウムジエチルジチオカル バミド、スペルミン、スペルミジン、鉄酸、セサモル、レソルシノール、没食子 酸プロピル、MDL-71,897、カダベリン、プトレッシン、1,3-および1,2-ジアミノ プロパン、デオキシグルコース、尿酸、サリチル酸、3-および4-アミノ-1,2,4- トリアゾール、安息香酸、ヒドロキシルアミン、および、これらの試薬の組合せ および誘導体が含まれる。 安定剤の別の群は、エチレン生合成および／またはエチレン作用を阻止するも しくは実質的に防止する試薬を含む。これらの化合物は、捕捉剤の特性も有して いる。エチレン阻害剤の効果は、エチレンの出現もしくは作用に十分に影響を与 えることにより、凍結保存プロセスの細胞回復を増大させたときに相当である。 尚、ストレスを受けたときに多くの植物細胞がエチレンを放出することは公知で ある。而して、エチレンは細胞を損傷して死滅に至らしめる。従って、エチレン の発生もしくはエチレンの作用を防止すれば、凍結保存プロセスからの細胞の生 存度および回復度を更に増大する。 図２に示される様に、エチレンの生合成には多数の経路があり、それと等しい 数の阻害剤がある。例えば、生合成経路は、ｓ-アデノシルメチオニン(SAM)(ACC 合成酵素＋SAM−＞ACC)、アミノシクロプロパンカルボキシル酸(ACC)(ACC＋ACC 酸化酵素−＞エチレン)、および、エチレン（エチレン＋エチレン酸化酵素−＞C O2)の転換点において生合成経路を阻害することが可能である。本発明の方法で 使用され得る多くの生合成阻害剤は、表１に示されている。 また、多数のエチレン作用の阻害剤もある。これらの化合物の幾つかは表２に 示されている。 一方、銀イオンが種々の植物において強力な抗エチレン剤として作用し、植物 組織および細胞培養物の寿命を改善することは1976年から知られている。例えば 、切断されたカーネーションを銀塩で予備処理すると寿命が延びる。銀イオンは 比較的に不動であることから、茎を基礎処理することは花に直接的に噴霧処理す ることよりも効果が低いと考えられる。また、銀イオンの低い移動性は、金属を チオ硫酸銀などの陰イオン錯体へと変化させることにより増大することが分かっ た。チオ硫酸自身はエチレン生合成に影響を与えず、また、エチレン作用を阻害 することも無い。 銀イオンにより仲介されたエチレン阻害は、同一の受容体箇所上で銅に置き代 わるという原理に基づいて説明される。同様に、銅は生合成に関する酵素反応も しくはエチレン作用に関与する金属である、と提案されている。この理論は、銀 と銅の大きさが類似しており、同一の酸化状態、および、両金属ともにエチレン と錯体を形成する能力を有していることから、信憑性がある。 チオ硫酸銀を含む銀塩は、合成を顕著に誘導する効果を有するものの、植物お よび植物細胞の培養におけるエチレン作用を阻害する。ACCおよびエチレン生合 成の両者に関する銀イオン（チオ硫酸銀の活性成分）の誘導効果は、ACC酸化酵 素の活量が増大したことによりACCからエチレンへの変換が増加したことを示唆 している。エチレン作用を阻害する銀塩の幾つかは、表３に示されている。 安定剤は凍結に先立って植物細胞と共に温置されるのが好ましく、これは、た とえ凍結プロセス、回復、解凍および再増殖の間におけるそれらの存在が望まし いとしてもである。例えば、エチレン生合成阻害剤およびエチレン作用阻害剤は 、解凍および再増殖の間に培養媒体中に存在するのが一層望ましい。この点、温 置は数時間ないし数日に亙り行うことができる、と言うのも、試薬自体は細胞に とり有害でなく、むしろ生存度を高めるからである。より感受性の高い植物細胞 系の幾つかは一層長い処理を要するが、その他のものは一層短い。温置の正確な 期間は、実験により容易に決定され得る。好適には、植物細胞は、安定剤もしく は安定剤の組合せと共に増殖培地内で約1日乃至約10日、より好適には約１日乃 至約７日、更に好適には約３日に亙り、培養される。典型的には、この時間の長 さは、培養媒体内で除去されるべきもしくは少なくとも細胞に有害でないレベル まで減少されるべき物質を損傷するに十分なものである。 温置は、液体状もしくは半固体状の培養媒体中で行うことができ、それは例え ば、増殖培地、代謝と細胞増殖とを促進する培養媒体、保持媒体、必ずしも細胞 増殖を促進はせずに塩と栄養とのバランスを保つ媒体、などである。細胞は凍結 保存に対して調製されていることから、それを保持媒体（次善もしくは低増殖培 養媒体：例えば、通常の増殖培地の４分の１の塩濃度）内で温置し、細胞の代謝 プロセスを減少させることが望ましいときもある。 予備処理は、室温もしくは植物細胞が通常的に培養される温度にて、細胞を予 備培養することにより達成し得る。好適には、予備培養は略々室温(20℃)にて行 って取扱を容易にするが、これは、殆どの植物細胞が室温にて十分に安定してい るからでもある。予備処理の間、安定剤は直接的に媒体に付加され得ると共に、 必要であれば補充することも出来る。安定剤の濃度安定剤の種類に依存するが、 一般的には、約1μM〜約1mM、好適には約10μM〜約100μMであり、また、１ 種類以上の安定剤を用いることは通常的でない。 予備処理は、ひとつ以上の浸透性試薬の存在下で細胞を温置する段階を含む。 有用性のある浸透性試薬の例は、サッカライドおよびサッカライド誘導体等の糖 、プロリンおよびプロリン誘導体などのアミノもしくはイミノ酸、もしくは、こ れらの試薬の組合せである。更に有用な糖および糖の誘導体の幾つかは、フルク トース、グルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、 およびトレハロースである。浸透性試薬は、次のローディング、凍結乾燥および ／または溶化の為に細胞を調製する濃度にて使用される。濃度は試薬毎に大きく 変化するが、一般的には約50mM乃至約2Mである。これらの濃度は、少量の試薬を 連続的にもしくは時間かけて段増的に（滴下的に）、所望レベルが達成されるま で付加することにより達成される。好適には、媒体内の浸透剤の濃度約0.1M乃至 約0.8Mであり、より好適には約0.2M乃至約0.6Mである。代わりに、約1重量%乃至 約10重量%の濃度の水性溶液として浸透剤を使用することもある。 予備処理はまた、細胞培地、ローディング溶液および／または溶化溶液中に、 脂質二重層（例えば、ステロール、リン脂質、糖脂質、糖タンパク質）内に挿入 する化合物もしくは２価陽イオンを単に付加する段階を含み得る。２価陽イオン は熱ショックおよび膜プロテインを安定すると共に、細胞膜と他の膜との間の静 電的反発を減少する。マグネシウム、マンガンおよびカルシウムを選択すれば好 適である、と言うのも、例えばCaCl2、MnCl2およびMgCl2の形態の安価で容易に 入手し得る２価陽イオンだからである。ナトリウムはトレース濃度以上では毒性 が高いので好適性が低い。好適な濃度は、約1mM乃至約30mM、より好適には約5mM 乃至約20mM、更に好適には約10mM乃至15mMである。これに加え、媒体中に２価陽 イオンが存在すると、凍結温度が下がると共に、細胞が凍結点を一層迅速に通過 することが可能となる。また、細胞間および細胞間氷結晶形成の両者の温度が凍 結時および解凍時に低下する。解凍および解凍後培養においてこれらの試薬が存 在することは重要である。 低温順化： 予備処理の間もしくは予備処理のいずれかの時点において、凍結保存されるべ き細胞は、培養温度から低下される温度であり凍結温度よりは高い温度に順化さ せ得る。これにより、細胞代謝を相当に遅らせると共に更に限界的な温度変化の 幾つかを通しての急速な温度遷移のショックを和らげることにより、細胞を凍結 保存プロセスに対して調製する。限界的な温度範囲は、例えば水結晶形成の臨界 温度近傍で細胞に損傷を与える危険性が高い温度範囲である。当業者に公知の如 く、これらの温度は溶液組成に幾分なりとも依存して変化する。殆どの細胞培養 媒体の基本的成分である水の場合、氷結晶の形成および再形成は約0℃乃至約50 ℃にて生ずる。順化は、所定の浸透可能性における細胞脱水の度合いを減少する 内因性の溶質の蓄積に帰着すると共に、極度の脱水の間のプロテインおよび膜の 安定に寄与する。これに加え、低温順化は溶化試薬と相乗的に作用すると共に細 胞膜の液体構造を変化させ、浸透排除および脱水の両者に対する許容差を増大す る。 順化は、段階的にもしくは漸進的に行うことができる。これらの段階は、細胞 が損傷を起こさずに低温に順化するに十分な時間に亙り、約0.5℃乃至約10℃の 幅で段階的に下げることが出来る。漸進的もしくは段階的のいずれにせよ、温度 勾配は、細胞が凍結点を可及的に迅速に通過する様に設計される。細胞は低下し た温度に対し、漸進的に、段階的もしくは連続的に、または、急激に順化するこ とが出来る。順化技術は当業者に公知であり、市販の順化剤を含むものである。 漸進的な順化は、目的温度が達成されるまで1時間当り約1℃で温置温度を下げて 行く段階を備えて成る。漸進的順化は、最も感受性が高く凍結保存するのが困難 と考えられる細胞に対して最も有用である。段階的順化は、低下された温度に所 定時間だけ細胞を置くと共に、更に低下された温度に別の所定時間だけ細胞を置 く段階を備えて成る。これらの段階は必要に応じて反復される。 懸濁細胞は、凍結および解凍において最大の生存率を達成する後誘導期もしく は早期細胞分裂期であり得る。これらの時期を越えた細胞は液胞化および分化に 高い度合を示すと共に大寸となり、従って、凍結による損傷の危険性が増大する と共に凍結および解凍時の生存度が減少する。 ローディングは、ひとつ以上の凍結保存剤の溶液中での細胞の平衡化を含む。 ローディング中に使用される試薬は、ローディング剤と称され得る。有用なロー ディング剤は、ひとつ以上の脱水剤、透過性もしくは非透過性の試薬、および、 浸透剤を含み得る。ローディングの適切な試薬は、細胞懸濁液中に導入されると 同時に細胞脱水を誘起する試薬を含む。DMSOおよびエチレングリコール等の透過 剤、並びに、フルクトース、スクロースもしくはグルコース、および、ソルビト ール、マンニトールもしくはグリセロールなどの透過性および非透過性の浸透剤 の組合せ、の両者を使用することが可能である。この段階は、約0.5M乃至約2Mも しくは約5重量%乃至約20重量%の中濃度の凍結保存剤を細胞質ゾル内に導入する ことにより細胞質ゾルの溶質濃度を増大するものである。平衡化に要する時間を 最小限にする為に、ローディングは略々室温で行うのが普通であるが、これは、 ローディングに最適な温度および他の条件が、生存細胞培養を維持する媒体、光 強度および酸素レベルなどの条件を整合させるとしてもである。 ローディング段階においては、単一の凍結保存剤もしくは異なる凍結保存剤の 組合せを、温置媒体内に連続的にもしくは段階的に直接付加することも可能であ る。段階的なローディングは、細胞に対するローディング剤の供給を容易にする 為に望まれることもある、と言うのも、それは単一の回分ローディングよりも幾 分なりとも緩やかだからである。段階的なローディングに対する付加間の時間増 分もしくは間隔は数分から数時間以上にも亙り得るが、1分乃至10分、更に好適 には約1分乃至約5分、更に好適には約1分乃至2分の間隔が好適である。段階的な ローディング段階における付加回数は、実践的なものとするのが通常であり、数 回からかなりの多数回に亙り得る。好適には、約20回以下、より好適には約10回 以下、更に好適には約5回以下である。当業者であれば、間隔時間および間隔数 は、細胞およびローディング剤の種類により容易に決定し得よう。細胞は、ひと つのもしくは複数のローディング試薬（連続的にもしくは段階的にローディング 剤の量を増大させたもの）を含む溶液内で温置され、試薬の細胞内および／また は細胞外の試薬濃度を平衡化される。実用上、温置時間は数分乃至数時間に亙る 。ローディングの保護効果は、細胞から少量の但し重要な量の水分を除去するこ とも含んでいる。これにより、細胞内の急激な水分喪失のショックが最小限とさ れ、細胞は引続く溶化および／もしくは凍結乾燥に対して調製される。 ローディングの後、凍結保存剤を含む増殖媒体は除去され、または、使用され るべき次の試薬（溶化剤）が同一もしくは類似の試薬であれば、ローディング剤 はそのままとして、溶化の為に濃度を単純に高め得る。 溶化(vitrification)： 凍結保存されるべき細胞は、予備処理、ローディングおよび／または凍結乾燥 に引続いて溶化される。溶化処理には幾つかの利点がある。システム内での氷結 晶形成を防止することにより、氷形成に通ずる複雑な変数を最適化する必要性が 無くなる。更に、試料は液体窒素中に直接的に投入され得ることから、この処理 では冷却を制御するに必要とされる多数の装置を必要としない。溶化処理はまた 、幾つかの異なる種類の細胞を含む複雑な組織に対する凍結保存処理を展開する 上で大きな可能性を与える。 溶化処理は、液体窒素中での急冷に先立ち、細胞すなわち試料の漸進的なもし くは段階的な浸透脱水を含む。溶化処理においては、液体窒素中での急冷に先立 ち、濃縮溶液中に直接的に露出することで細胞脱水が行われる。露出は、細胞に 溶化剤を継続的に付加して量を増大して漸進的に行い、または、段階的に行うが 、増加量は所定の間隔に亙り付加される。段階的な溶化に対する付加間の時間増 分すなわち間隔は数分乃至数時間以上に亙るが、好適には約1分乃至約10分、更 に好適には約1分乃至約5分、更に好適には約1分乃至約2分に亙るものである。段 階的な溶化処理における付加の数は、実践的なものとするのが通常であり、数回 から相当の多数回に亙り得る。好適には、約20回以下の付加とし、更に好適には 約10回以下とし、更に好適には約5回である。間隔および間隔の数は、当業者で あれば細胞および溶化剤の種類に応じて容易に決定することができる。細胞は、 単数のもしくは複数の溶化剤（連続的にもしくは段階的に増加された量）を含む 溶液内にて温置され、細胞内および／または細胞外における試薬の濃度を所望程 度に平衡化する。温置時間は実践的に数分乃至数時間に亙り変化する。理想的な 条件下では、細胞もしくは器官は、細胞内もしくは細胞外での氷形成無しに、極 めて急激な速度で冷却され得る。結果として、氷形成に影響する要因の全てが除 去され、従来の凍結保存処理と比較した場合に溶化処理の幾つかの実用的利点が ある。溶化によれば、複雑な組織および器官に対する凍結保存処理を発展させる 可能性が大きくなる。但し、システム内での相当の氷形成を除外することから、 溶化処理は従来の凍結保存処理よりも操作が複雑にはなる。更に、溶化により、 幾つかの試料での急冷感度の問題に対処すべく超急冷速度を使用することが可能 となる。しかも、冷却速度を制御する為の特殊なもしくは高価な装置設備も不要 となる。 溶化は低温方法であり、高度に濃縮された細胞質ゾルが超冷却され、実質的な 結晶化の無い固体状の準安定なガラスが形成される。任意の細胞を凍結保存する 上での主な困難性は、凍結および解凍の両者における細胞内の氷結晶の形成であ る。過剰な氷結晶形成は、細胞膜およびオルガネラの崩壊による細胞死滅に繋が る。氷結晶の形成を回避するひとつの方法は、形成される氷結晶が相当の損傷を 引起こすほど大きくならない様に細胞を急速に凍結することである。低水分含量 の細胞が急速に凍結されると、溶化する。但し、高水分含量の植物細胞などの細 胞を急速に凍結しても溶化は不可能である。高水分含量の細胞を溶化する為には 、溶化の為に急速に凍結することに加え、凍結点降下剤および氷結晶阻害剤が必 要とされる。適切に溶化された細胞は、小さ過ぎて光を回折しない氷結晶から成 る半透明の凍結非結晶固体を形成する。もし、溶化された細胞が約−40℃まで温 められ得れば、それは失透(devitrification)を起こす。失透において氷結晶は 、細胞生存において一般的に有害なプロセスにより、大きくなって固まる。溶化 溶液は、凍結時に溶化を増大し、または、解凍時に失透を妨げる。 凍結保存溶液の殆どは対象物質をガラスもしくはガラス状の物質に変換し得る が、但し、冷却速度が氷結晶の核形成および成長を防止すべく十分に急速である ことを条件とし、また、臨界的な冷却速度は溶液濃度に依存する。同様に、細胞 質ゾルが十分に濃縮されたならば細胞の溶化が実施され得る。凍結保存処理にお いて、これは、液体窒素内で急冷するに先立って極度に濃縮された溶液内で細胞 を脱水することにより達成される。また、凍結保存処理においては、溶化剤など の凍結保存剤の濃縮溶液中に試料を置くことにより溶化に必要なレベルまで細胞 質ゾルは濃縮される。濃度は、約4M乃至約10M、もしくは、約25重量%乃至約60重 量%が好適である。これにより、試料細胞の脱水が極度に行われる。7Mを越える 溶液は細胞から浸透的活性水の90%以上を除去するのが通常である；但し、各試 薬に対する正確な濃度は実験により決定することが可能である。使用され得る溶 化剤は、DMSO、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコ ール、エチレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、プロパンジオール およびこれらの物質の混合物とされ得る。 適切な溶化溶液は、DMSO(1〜50%)、プロピレングリコール(約5〜25%)、グリセ ロール(約0〜50%)、PEG-8000(約5〜20%)、エチレングリコール(約10〜75%)、エ チレングリコール／ソルビトール(約60/20重量パーセント〜約10/60重量%)、お よび、エチレングリコール／ソルビトール(約40/30重量%)を含む培養媒体を含む 。エチレングリコール／ソルビトールが好適であり、例えば、50/30%、45/35%、 40/40%、40/30%、30/50%、好適には30/40%の濃度で使用され得る。斯かる溶化溶 液は約1℃乃至約8℃、好適には2℃乃至6℃、より好適には約4℃の温度で使用さ れ得る。 溶化溶液への露出の結果としての損傷を最小限にする為に、脱水は約0℃乃至 約4℃にて可及的に短い露出時間で行われ得る。これらの条件下で試料中に凍結 保存剤は付加流入しない、と言うのも、水と溶質との透過係数に差があるからで ある。結果として、試料は収縮したままであり、且つ、溶化に必要とされる細胞 質濃度の増加が脱水により達成される。但し、凍結保護剤による細胞の平衡化（ ローディング）が、植物細胞もしくは器官の好首尾な溶化に常に必要とされるわ けでは無い。例えば、幾つかの場合、ローディング試薬による予備培養によりロ ーディング段階として同一の目的が達成される。 ローディングが必要とされる場合、それは、基本的に細胞膜ならびにプロテイ ンの脱水による不安定化を防止する役割を果たす。但し、ローディング段階が無 い場合、脱水および冷却／温暖段階に続く細胞の生存は少なくなる。従って、ロ ーディング段階に置ける細胞内エチレングリコールもしくは他の凍結保護剤は、 冷却時において細胞の溶化を助けるだけでなく、脱水段階中の損傷から細胞を保 護するものでもある。 凍結乾燥： 凍結乾燥は、凍結保存の前に真空蒸発により細胞の水分を減少することである 。真空蒸発は、減圧雰囲気中に細胞を載置する段階を含む。所望の水分除去速度 に依存して、約−30℃乃至−50℃の温度における減圧雰囲気は、100torr、ltorr 、0.01torr、もしくはそれ以下、とされ得る。減圧条件下での水分蒸発 速度は、細胞の65%の水分が一晩で除去され得る如く増大される。選択的な条件 により、水分除去は数時間以下で行われ得る。蒸発における熱喪失により、細胞 は冷却状態に保持される。真空レベルを注意深く調節することにより、真空蒸発 処理の間、細胞は冷却順化温度に保持され得る。真空を強力にすれば水分蒸発は 迅速になるが、細胞が凍結する危険性に晒される。凍結は、細胞に直接的に加熱 するかもしくは真空レベルを調節することにより制御され得る。細胞を最初に蒸 発チャンバ内に載置するときに高真空が加えられるが、これは、細胞内に残存す る熱が凍結を妨げるからである。脱水が進むと共に細胞の温度が低下するにつれ 、真空度を低下させもしくは加熱を行って凍結を防止し得る。半乾燥細胞は、蒸 発チャンバ内に拡散する傾向がある。この傾向は、処理の終了時に空気流をチャ ンバ内に戻すときに特に顕著である。もし空気流が半乾燥の細胞の付近を流れる と、それは細胞を吹き飛ばし、試料を相互汚染させる可能性もある。斯かる崩壊 を回避すべく、蒸発冷却は、細胞を乾燥させ乍らも遠心力により管内に幽閉する 真空遠心機中で行うことが出来る。このプロセスにおいて除去される水分の量は 、細胞の乾燥重量を測定することにより定期的に関しされ得る。所望の水分量が 除去されたとき、液体窒素中で直接凍結するに先立ち、溶化溶液は所定時間だけ 半乾燥細胞に直接的に付加され得る。 凍結 予備処理され、ローディングされ、溶化され且つ／または凍結乾燥された植物 細胞は、凍結保存温度に凍結することにより保存される。凍結段階は十分に迅速 にし、細胞の生存に有害な大寸の氷結晶形成を防止せねばならない。細胞は、既 に凍結保存温度に在る試薬に直接的に接触させ、直接的に凍結することもできる 。直接方法は、液体窒素もしくは液体ヘリウムなどの低温流体内に細胞を直接的 に浸漬、噴霧、射出もしくは注入する段階を含む。細胞はまた、液体窒素により 凍結された鋼鉄ブロックなどの冷却固体に直接的に接触され得る。また、細胞の 容器上に低温流体を直接的に注入しても良い。直接法はまた、低温にて空気など の気体に細胞を接触することも包含する。窒素もしくはヘリウムの低温気体流は 、細胞懸濁液中に直接的に噴射しもしくは吹込んでも良い。間接的方法は、細胞 を容器中に載置し、この容器を低温の固体、液体、気体に接触させる段階を含む 。 適切な容器としては、例えば、低温に耐える様に設計されたプラスチック小瓶、 ガラス小瓶もしくはアンプルがある。間接凍結の為の容器は、空気もしくは液体 に関して不透過性を有する必要は無い。例えば、プラスチックバッグ、もしくは アルミニウム箔が適切である。更に、容器が低温に耐え得る必要は無い。低温下 でプラスチック小瓶がヒビ割れし乍らも実質的に元のままであれば、使用するこ とが出来る。また、金属箔の一側を低温の気体、固体もしくは液体に接触させ乍 ら、他側に細胞の試料を載置して細胞を凍結しても良い。凍結は、氷結晶形成を 阻害すべく十分に迅速でなければならない。凍結時間は約5分もしくは、4分、3 分、2分、1分もしくはそれ以下とすべきである。臨界的な凍結時間は、単一の細 胞の基準枠から測定すべきである。例えば、液体窒素中に大量の細胞試料を注入 するには10分間かかるかも知れないが、この方法によれば個々の細胞は急速に凍 結される。 解凍： 本発明の別の実施例は、凍結保存された細胞の解凍方法に関する。細胞の生存 および細胞の回復に対しては、それらが当初に凍結されたのと実質的に同一の条 件で適切に解凍および回復を行うことが必須である。凍結保存された細胞の温度 が解凍の間に上昇するとき、失透(devitrification)と称されるプロセスにおい て小寸の氷結晶が集結して大きくなる。細胞内に大きな氷結晶があると、一般的 には細胞の生存に有害である。失透を防止すべく、凍結保存された細胞は可及的 に急速に解凍されねばならない。加熱速度は、少なくとも約30℃毎分乃至60℃毎 分とし得る。また、90℃毎分、140℃毎分乃至200℃毎分、もしくはそれ以上の急 速加熱速度も使用することが可能である。この点、急速加熱が望ましいが、植物 細胞は、室温よりも相当に高い温置温度で生存する能力が低い。従って、過熱を 防止すべく、細胞の温度を注意深く監視せねばならない。加熱方法としては、伝 導、対流、放射、電磁放射、もしくはそれらの組合せを含む任意のものが使用さ れ得る。伝導方法は、水浴内への浸漬、加熱ブロック内への載置、もしくは、開 放炎内への直接載置を含む。対流方法は、ヒートガンもしくは炉の使用を含む。 放射方法は、例えば、加熱ランプもしくは対流もしくは放射炉等の炉の使用を含 む。電磁放射は、極超短波炉および類似装置の使用を含む。幾つかの装置 は、これらの方法の幾つかを組合せて加熱を行う。例えば、炉は、対流および放 射により加熱を行う。加熱は、細胞および周囲溶液が液状になると同時に終了せ ねばならないが、それは0℃以上である。凍結保存された細胞は、凍結点を降下 させるひとつ以上の試薬の存在により凍結されていることも多い。これらの試薬 が存在するとき、凍結された細胞は0℃以下の温度、たとえば約−10℃、−20℃ 、−30℃、もしくは−40℃の温度で液化し得る。凍結保存された細胞の解凍は、 これらの温度のいずれか、もしくは、0℃以上の温度で終了することが出来る。 解凍後処理(Post-Thawing)： 溶化溶液の希釈および細胞からの凍結保存剤の除去はアンローディングと称さ れるが、これは、凍結保存された細胞試料の解凍に引続いて可及的に迅速かつ可 及的に早期に行わねばならない。凍結保存剤の細胞内濃度は高いことから、浸透 拡張を最小化し乍ら懸濁媒体を希釈することが好適である。従って、懸濁媒体の 希釈および試料標本内からの凍結保存剤流出は、高浸透圧媒体内での希釈もしく は段階的希釈により行われるのが通常である。 解凍された細胞は、生存を最大化すべく増殖条件に漸進的に順化され得る。ま た、溶化試薬は細胞障害性、細胞停止性もしくは変異原性であり得、解凍された 細胞から、細胞に影響を与えない速度にて除去せねばならない。除去方法として は、再懸濁および遠心分離、透析、順次洗浄、化学物質による生治療(bioremeda tion)および中和、もしくは、電磁放射などの多くのものが使用され得る。幾つ かの溶化溶液および浸透試薬を急速に除去すると、細胞のストレスおよび死滅を 増大することから、除去段階は漸進的に行わねばならない。除去速度は、低濃度 の浸透試薬もしくは溶化試薬を含む溶液により順次洗浄することにより制御する ことができる。除去速度が低い他の方法は、透過度の低い膜による透析、低濃度 の溶化試薬を含む半固体もしくは液状の媒体上での順次増殖を含む。他の方法と しては、凍結保存試薬に対する漸進的希釈、透析、生治療、中和および触媒的分 解を含む。 解凍処理および解凍後処理は安定剤の存在下で行い、生存を確かなものとする と共に、遺伝子および細胞の損傷を最小限とすることができる。例えば２価陽イ オンもしくはエチレン阻害剤などの安定剤は、凍結保存の結果として存在する破 壊的試薬を減少し、除去しもしくは中和する。斯かる破壊的試薬は、フリーラジ カル、酸化剤およびエチレンを含む。これらの試薬の幾つかは複数の特性を有し ており、この点に関しては極めて有用である。驚くべきことに、解凍段階および 解凍後段階で安定剤を付加したところ、生存度および再増殖速度が増大したこと である。 浸透剤もしくは溶化剤を容認できるレベルに減少した後、細胞は適切な媒体内 で再成長もしくは再増殖され得る。再増殖のためのひとつの方法は、解凍された 細胞を、寒天プレート等の半固体の増殖媒体内にカルスが形成されるまで載置す ることを含む。細胞はカルスから回復されると共に培養液体内で増殖され得る。 この代わりに、適切なホルモンを含む半固体媒体内に載置することにより、カル ス細胞の芽および根の成長を誘起しても良い。芽および根を有するカルス細胞は 、漸進的に順化し、植物が成長するまで温室内の滅菌土で増殖させても良い。温 室植物は、自然環境内で温室外で成長順化させても良い。代わりに、半固体媒体 を使用せずに細胞を解凍して再増殖させても良い。即ち、浸透剤および溶化剤を 除去した後、細胞を再増殖用の液体媒体中に直接的に載置しても良い。 本明細書中に開示された変更例のひとつ以上を含むことにより、種々の細胞種 類に対して凍結保存後の細胞回復を実質的に増大することが可能となる。これら の方法により、凍結保存剤、エチレン生成、細胞膜に伴う受容体を含む特定のタ ーゲットに対するエチレンの作用による毒性と、膜の不安定性と、膜の漏出とに 伴う問題が防止される。本明細書中に開示された方法からは、特定の細胞種類に 対しては特定の段階を組合せることが最適であるとして示された。例えば、トマ ト、ポテトおよびタバコの細胞は、２価陽イオンによる段階的なローディングお よび／または溶化を用いることにより凍結保存に良好に対処できる（プロトコル 10、12、13、14）。 植物細胞、例えば、タキソールを産出するイチイ(Taxus)の細胞、の凍結保存 を行うひとつの方法は、図３に概略的に示されている。簡単に述べると、初代分 離もしくは細胞培養からのカルス細胞増殖は、液体増殖媒体内での培養に適して いる。細胞が液体培養に対して調節された後、それらは、浸透剤および安定剤を 含む予備処理増殖媒体に24時間乃至72時間だけ移動される。予備培養された 細胞は次に、4℃で4時間に亙り予備処理培養の温置により低温順化される。低温 順化の後で細胞は遠心器に移動され、細胞を損傷すること無くペレット化する中 程度の遠心力を受ける。浸透剤および安定剤を備える予備処理媒体を含み得る上 清は、細胞ペレットから吸引されると共に廃棄される。安定剤及び溶化試薬を含 むと共に予備冷却された溶液が細胞ペレットに加えられる、且つ、細胞は穏やか に再懸濁される。溶化溶液により3分間処理した後、細胞を含む小瓶を液体窒素 内に浸けることにより細胞を低温保存貯蔵に置く。凍結保存された細胞は、液体 窒素内に約30分から数年に亙り貯蔵される。この細胞を復活させる為には、凍結 保存された細胞を含む小瓶を液体窒素から40℃の水浴に迅速に移動する。内容物 が液化したとき、小瓶は40℃浴から取り出される。即時生存度に関し、解凍され た細胞の一定量を染料放出分析により検査する。残りの細胞は、安定剤と漸進的 に低くなる濃度の浸透剤を含む低温増殖媒体により洗浄される。一連の洗浄によ り細胞から十分な浸透剤よび溶化剤が除去された後、細胞は液体培地内に直接的 に移動される。代わりに、細胞は塗付紙に載せられ、安定剤と、減少量の浸透剤 および溶化剤とを備える一連の半固体媒体に移動される。この一連の塗付は、浸 透剤および溶化剤が存在しない半固体媒体上で増殖すべく調節されるまで、継続 される。 図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃには、別の細胞凍結保存方法が開示されている。 この概略的図示内容から理解される様に、多くの好適変更例が可能である。例え ば、段階1においては、浸透剤（0.06M〜0.80Mの濃度のスクロース、ソルビトー ル、もしくはマンニトール）を含む液状媒体内で細胞のバイオマスが1〜6日間に 亙り予備培養される。段階2においては、ローディングが段階的に行われる。予 備培養された細胞バイオマスには凍結保護剤（栄養培地中にエチレングリコール ／ソルビトール40/30重量%を含む溶化溶液(V2N)を20%；または、栄養培地もしく は0.4Mスクロース溶液(pH5.6〜5.8)中に30%(w/v)グリコール、15%(w/v)のエチレ ングリコールおよび15%(w/v)のジメチルスルホキシドを含む溶化溶液(VS3)を20% )がローディングされる。液体内の細胞バイオマスは緩やかに混合されると共に 、氷、もしくは、0℃〜4℃の冷却剤内で5分間だけ温置される。この段階の直後 、液体内の凍結保護剤の濃度は段階的に増加されるが、 これは、溶化溶液の最終濃度が65%に達するまで1分間隔で5回に亙り冷却された1 00%溶化(V2NもしくはV3S)溶液を段階的に付加することにより行われる。このロ ーディング段階および0℃〜4℃の温置に費やされる合計時間は10分間である。混 合物（細胞バイオマス＋溶化物）は100xGの遠心分離に5分間まで（1分〜5分）掛 けられ、上清が廃棄される。 代わりに、段階2において、ローディングを単一段階で行うことが可能である 。予備培養された細胞バイオマスには凍結保護剤(栄養培地中にエチレングリコ ール／ソルビトール40/30重量%を含む溶化溶液V2Nを65%；または、栄養培地もし くは0.4Mスクロース溶液(pH5.6〜5.8)中に30%(w/v)グリコール、15%(w/v)のエチ レングリコールおよび15%(w/v)のジメチルスルホキシドを含む溶化溶液(VS3)を6 5%)がローディングされる。凍結保護剤を含む液体内の細胞バイオマスは穏やか に混合され、且つ、氷もしくは0℃〜4℃の冷却剤の上で10分間に亙り温置される 。 代わりに、ひとつ以上の膜安定剤を含む凍結保護剤により段階的にもしくは一 段階でローディングを行うことも可能である。全ての生体膜は共通の全体構造を 有している。それらは、非共有の相互作用により共に保持された脂質およびプロ テイン分子の集合である。脂質は二重層として配置され、膜の基本構造を提供す ると共に、殆どの水溶性分子の流れに対する比較的不透過性の障壁の役割を果た す。又、プロテイン分子は脂質二重層の内部に在り、膜の種々の機能を調節する 。幾つかのものは、例えばチャンネルプロテイン、担体タンパタ質、および能動 輸送に関わるタンパク質などの特定の分子を細胞内にもしくは細胞外へ輸送する 役割を果たす。他のものは膜関連反応を触媒する酵素であり、更に別のものは細 胞骨格と細胞外基質との間の構造的結合として、且つ／または、細胞の環境から の変換化学信号を受信する受容体として機能する。 幾つかの植物標本および細胞系は先に確立された凍結保存プロトコルに馴染ま ないが、これは、凍結保存剤の種類および濃度に対するそれらの感受性に部分的 に依存している。膜の不安定化に関しては少なくとも２つの潜在理由があり、そ れは、ローディングおよび脱水段階で使用された凍結保護剤の化学的毒性、及び 、（例えば溶化）濃縮溶液への露出の結果として生ずる極度の脱水である。また 、 冷却されもしくは暖められる間の氷形成、および、ガラスの破損による細胞の機 械的崩壊などの他の要因もまた、膜の不安定化に寄与する。 一方、凍結保存剤の濃縮溶液への露出の結果として生ずる厳しい脱水は、脂質 、タンパク質および核酸を含む生体分子の種々の配列内の構造遷移を引起こし得 る。これらの状態下では、プラズマ膜および他の細胞膜の超微細構造において幾 つかの変化が生ずる。これらの変化は、プラズマ膜内の特定の領域の形成を含む が、それは、タンパク質の親水性領域に会合した水、および、膜の脂質成分の除 去に繋がる。代わりに、植物細胞膜を透過性の凍結保存化合物（例えば、植物細 胞膜内のチャンネルプロテインを流体化する化合物）に植物細胞膜を接触させる ことにより不安定化も生じ得る。段階的なローディングおよび／または溶化は、 厳しい脱水から生ずる膜の不安定化を最小限なものとし得る。細胞体積、プラズ マ膜の透過性等の実質的な変化に関する他の特徴もまた、段階的ローディングに より最小限のものとされ得る。 熱ショック処理もまた、膜およびタンパク質を安定化させる。細胞バイオマス を浸透剤で予備培養した後における熱ショック処理は、細胞に凍結保存剤をロー ディングする前に行う必要は無い。但し、細胞バイオマスが浸透剤で予備培養さ れないときには、熱ショック処理が必要である。更に、細胞に対し、２価陽イオ ン(CaCl2.MnCl2またはMgCl2を5mM〜20mM)を含む溶化溶液（凍結保存剤）をロー ドすることは重要である（例えば、プロトコル11および12）。熱ショック処理は 通常、細胞バイオマスの予備培養の後に続いて行われる。それにより、凍結保存 後の細胞の生存度は約20%乃至約40%まで改善されることになる。この処理は、約 37℃の水浴シェーカ内で（予備培養されたもしくは予備培養されない）細胞もし くは細胞バイオマスを約4時間まで温置する段階を含む。この処理の後、（浸透 剤を含む／含まない）液体培地内の細胞は、凍結保存に使用（ローディング段階 ）される前に、4時間まで室温(23℃〜25℃)に置かれる。 熱ショック処理は、ストレスに適合する上で含まれる特定のタンパク質（熱シ ョックタンパク質）の新たな合成を誘起するものとして知られている。浸透剤で 予備培養されなかった細胞を熱ショック処理すると、凍結に耐えられない。熱シ ョックは、凍結の結果として生ずる細胞内の浸透剤の濃度の急激な増大に対し、 タンパク質および膜を安定化する熱ショックタンパク質を形成することにより、 耐性を誘起する。熱ショック処理は、約31℃〜約45℃、好適には約33℃〜約40℃ 、更に好適には約37℃の水浴内で細胞を培養することにより行われる。培養は、 数分から数時間、好適には約1時間〜約6時間、更に好適には約2時間〜約4時間に 亙り行われる。 CaCl2、MnCl2もしくはMgCl2等の２価陽イオンもまた、LN2温度に細胞を露出す る前に溶化溶液内に含まれ得る。溶化溶液内に含まれた２価陽イオンは、植物細 胞膜および熱ショックタンパク質を安定化するものと思われる。２価陽イオンは 、細胞膜のイオン中心間の静電反発を減少することにより、細胞膜を安定化する 。これに加え、２価陽イオンもまた、凍結および解凍中の氷核形成を防止し得る 。膜の脂質二重層内に入り込むステロール、リン脂質、糖脂質もしくは糖タンパ ク質などの他の化合物もまた、植物細胞膜を効果的に安定化する。これらの化合 物を２価陽イオンに代用し、植物細胞膜および／または熱ショックタンパク質の 安定化を行っても良い。 予備培養されたもしくは予備培養されない細胞バイオマス（4時間までの熱シ ョック処理を受けた／受けないもの）に対して凍結保存剤を段階的にローディン グする処理は前述と同様であるが、但し、溶化溶液(V2NもしくはV3S)が5mM〜20m Mの濃度で膜安定化剤２価陽イオン(例えばCaCl2、MnCl2、MgCl2)を含むことを除 く。 段階3において、溶化段階は段階的に行われる。従って、ローディングおよび 遠心分離の後で得られた細胞もしくは細胞バイオマスは、溶化溶液(V2Nもしくは VS3)で段階的に更なる処理が行われる。この段階は通常、遠心分離の後の細胞バ イオマスを急冷された凍結用小瓶へ移動する段階と、0℃における３分間の温置 期間の間に1分間隔で濃縮(100%)溶化溶液を付加する段階とを含む。温置期間の 終了時に、凍結用小瓶内の内容（細胞＋溶化溶液）は、LN2内への投入の前に、 穏やかに混合される。代わりに、単一段階で溶化を行うことも可能である。従っ て、ローディングおよび遠心の後に得られた細胞もしくは細胞バイオマスは、溶 化溶液(100%)により更に処理される。この段階は通常、遠心後の細胞バイオマス を冷却された凍結用小瓶へ移動する段階と、濃縮(100%)溶化溶液の付加段 階とを含む。凍結用小瓶の内容は穏やかに混合されると共に、LN2内への投入に 先立ち0℃で3分間だけ温置される。代わりに、CaCl2もしくはMgCl2などの２価陽 イオンを含む凍結保存剤により溶化を段階的にもしくは一段階により行うことも 可能である。 凍結保存剤によりローディングされた細胞バイオマスの溶化処理は上述と同様 であるが、但し、濃縮溶化溶液(V2NもしくはV3S)が約5mM〜約20mMの濃度で膜安 定化剤２価陽イオン(CaCl2もしくはMgCl2）を含むことを除く。 細胞の凍結は通常、LN2内で凍結用小瓶で急速に行われるか、または、溶化溶 液内の細胞を含む凍結用小瓶を、液体窒素(LN2)を含む貯蔵容器に迅速に移動す ることで行われる。 また、解凍は、凍結された細胞バイオマスもしくは細胞を含む凍結用小瓶を、 40℃もしくは60℃に設定された水浴内で急速に加温する（例えば、約20秒〜約45 秒）段階を含む。解凍後段階は、凍結用小瓶内の液化された細胞バイオマスを、 浸透剤（スクロース、ソルビトール、もしくはマンニトール；濃度1M〜20M）と エチレン阻害剤もしくはエチレン作用阻害剤(チオ硫酸銀；濃度は約5μM〜約20 μM)とを含む液体栄養培地を含む滅菌遠心チューブへ即時に移動する段階を含む 。内容物は穏やかに混合されると共に、室温でシェーカ(120rpm)により30分間温 置される。この後、遠心分離を行うと共に、ペレット内の細胞をブロッティング ペーパ上に載置された２層の滅菌フィルタ紙に移動（して細胞もしくは細胞バイ オマスからの過剰水分の除去を促進）する。細胞もしくは細胞バイオマスは、2 分間に亙り温置された。この温置期間の後、細胞を備えた上側のフィルタ紙は、 0.8M-0.1Mの低濃度スクロースで浸透剤を含む固体栄養媒体へ順次移動（して、 細胞の浸透調節を実施）する。各段階において、フィルタ紙上の細胞は1/2時間 乃至1時間だけ温置されると共に、付加的な浸透剤の存在無しに通常の栄養培地 に最終的に移動される。（通常の栄養培地内に浸透剤の付加の無い）この段階は 、25℃の暗所で24時間だけ温置が反復される。 代わりに、解凍直後のペレット内の細胞の解凍後処理は、浸透剤（スクロース 、ソルビトールもしくはマンニトール；濃度範囲：1M乃至2M)を含む液状媒体に より迅速に洗浄される。これは、浸透剤を含む液状栄養培地内で2分乃至5分だけ 細胞バイオマスを温置すると共に、1分間乃至3分間の100xgの遠心により行うの が通常である。この段階は、浸透剤およびエチレン阻害剤もしくはエチレン作用 阻害剤(5μM乃至20μMのチオ硫酸銀)を含む液体栄養培地内で細胞バイオマスを3 0分間だけ温置するに先立ち、もう一度繰り返される。 新たなカルスの再増殖は、1週間後に見られる。新たな細胞バイオマスの増殖 が増大したとき、カルス細胞はフィルタ紙から除去されて通常の固体栄養培地に 直接的に移動される。十分な増殖が生じた後（通常は２週間乃至３週間）後、液 状培地内にカルスを設置して細胞懸濁が開始される。 本発明の更なる実施例は、上述の方法により凍結保存された植物細胞に関して いる。細胞は、開示された一切の属もしくは種の細胞、または、上記凍結保存方 法が適用され得る細胞である。凍結保存された細胞は凍結貯蔵に適した温度に保 持され得る。好適には、細胞は液体窒素(約−196℃)、液体アルゴン、液体ヘリ ウムもしくは液体水素中に保持される。これらの温度は長期間の貯蔵に対して最 も適切であり、更に、温度の変動も最小限とされる。長期間の貯蔵は数ヶ月に亙 り、好適には数年に亙るが、回復時においても細胞の生存度はそれほど低下しな い。本発明はまた、凍結保存された細胞の効果的な回復方法に関していることか ら、細胞試料全体が死滅しなければ、その比較的大部分が死滅しても良い。細胞 もしくは植物は、存続する細胞から繁殖させ得る。短期間の貯蔵、即ち数ヶ月以 下の貯蔵が所望されることもあるが、−150℃、−100℃、もしくは、−50℃の貯 蔵温度さえも使用し得る。斯かる温度で保持する為には、ドライアイス（二酸化 炭素）および市販の冷凍庫も使用し得る。 本発明の別の実施例は、上述の凍結保存回復法により復活された植物および植 物細胞に関する。これらの細胞は、本明細書中に開示された属もしくは種、また は、凍結回復方法が適用された属もしくは種の細胞とされ得る。細胞は、凍結保 存された初代細胞、もしくは、斯かる細胞から増殖された細胞とされ得る。一様 な培養細胞から区別された植物は、相互関連機能を有する結合細胞の別個の塊で ある。 本発明の別の実施例は、凍結保存された細胞を移動かつ解凍する方法および装 置に関する。この方法により凍結保存された細胞は、引続く回復の為に中央貯蔵 所に貯蔵され得る。偶発的な死滅に対する安全性を高めるべく、凍結された細胞 系の各々は多数の場所に貯蔵され得る。回復の間、凍結保存された細胞を含む凍 結用小瓶は適切な容器に入れてレシピエントに対して輸送される。適切な容器と しては、輸送の間に凍結保存温度を維持し得る容器である。全ての細胞は、液体 窒素等の携帯用凍結保存剤により長期間貯蔵用の十分な低温にして輸送され得る 。即時解凍が指定された細胞は、コストを節約すべくドライアイスで輸送する。 貯蔵所からの細胞の回復キットは、凍結保存された細胞用の小瓶、適切な濃度の 浸透剤を備えた十分な媒体、溶化溶液、および、順次の洗浄用の安定剤を含み得 る。代わりに、洗浄溶液に代わりもしくは洗浄溶液に加え、細胞は、安定剤を備 えた複数個の半固体培地と、減少量の浸透および溶化溶液と共に発送され得る。 解凍の後、細胞は洗浄されて即時使用されるか、もしくは、半固体培地上に載置 されて溶化および浸透剤を漸進的に除去しても良い。搬送キットは更に、解凍後 生存度分析用の試薬と、解凍された細胞からのDNAと比較して遺伝子安定度を比 較する為の基準DNAサンプルとを含んでも良い。 以下の実験は、本発明の実施例を説明する為に示されており、本発明の範囲を 制限するものと解釈してはならない。 実施例： 実施例１：カルス開始および増殖 イチイ(Taxus)の針葉を野性植物および養殖植物から採取した。植物材料は、 希釈石鹸溶液で洗浄し、蒸留水で丹念に濯ぎ、且つ、亜塩素溶液（1%の次亜塩素 酸、pH7)で10分間だけ殺菌する。殺菌状態下で、この材料は滅菌蒸留水で3回に 亙り濯がれた。針葉は、100mgのL-アスコルビン酸（ビタミンＣ）を含む1%のポ リビニルピロリジン(PVP)溶液中で切断された。これらの針葉は、切断端を以て 半固体の培地Ｅ内に載置され、暗所にて24℃±1℃で温置される。培養物は毎日 観察し、微生物汚染の徴侯があるものは廃棄した。相当のカルス形成が観察され ると共に、カルスは外植体から20日間だけ分離され、かつ、表４に列挙された種 々のカルス増殖培地上に載置された。Taxus chinesisのカルスは、培地Ｄ（表４ ）に移動された。この処理の結果、外植体の90%以上のカルス誘導が生じた。同 一の処理が、T.brevifolia、T.canaensis、T.cuspidata、 T.baccata、 T.globosa、T.floridana、T.wallichiana、 T.mediaおよびT.chine nsisの培養を開始する上で好首尾に使用された。外植体から除去されたカルスは 、暗所にて24℃で培養された。カルスの健康な部分は、10日毎に新たな培地に移 動された。本発明に好適な成長および維持用培地を列挙する： 実施例２：懸濁細胞の懸濁開始および増殖 １グラムのカルス材料を、25mlの液体培地（表４）を含む125ml容量の三角フ ラスコに無菌的に植え付ける。フラスコをシリコーンフォームキャップでカバー すると共に、暗所にて24℃で120rpmの旋回シェーカ上に載置する。懸濁培養物は 約3〜10日で形成された。媒体の交換は、miraclothフィルタを含むブヒナー漏斗 を通してフラスコの内容物を吸引濾過すると共に新鮮な媒体内で全てのバイマス を再懸濁することにより開始された。また、毎週、25mlの新鮮な媒体を含む125m lフラスコに1〜2グラムの細胞を移動した。代表的な種の懸濁培養において達成 された典型的な増殖速度および細胞密度は、表５に示されている。 図４には、T-chinensis K-1系に対するバイオマス（含水および乾燥重量）の 増加分がプロットされている。最大の増殖速度は、最も急激にバイオマスが増加 した点の傾斜を測定することにより決定された。最大の倍加期間2.5日を有するT lchinensisの細胞培養も、これまでに報告されたTaxus種の懸濁培養よりも相当 に高い増殖速度を有している。典型的なTaxus培養における倍加期間は約7〜12日 である。 高密度の培養細胞は、細胞培養工程の生産性を最大限にする。これまでのT.br evifoliaの培養ではリットル当り1グラム乾燥重量以下の細胞密度であった(Chri stian et al.,1991)が、T.chinensisの懸濁培養は18日の増殖の後でリットル当 り8〜20グラム乾燥重量までの密度に達し得る。細胞の生存度は、 アセトン内の0.05%フロオレセインジアセテート(FDA)により着色する(J.M.Widho lm, Stain Technol 47;189-94,1972)し、次に、蛍光顕微鏡内で青色光励起で緑 色蛍光細胞の数をカウントすることにより測定された。細胞の生存度は、増殖相 に亙り90%より高かった。 実施例３：マンニトールによる予備培養後のイチイ細胞の生存度 6〜7日経過したイチイ細胞の懸濁培養を収穫し、0.16Mのマンニトール、0.22M のマンニトール、0.33Mのマンニトール、もしくは、0.44Mのマンニトール、を含 む新鮮な増殖培地内で再懸濁された。 マンニトールを含む増殖培地内で3日間温置した後、細胞は4℃で3時間だけ低 温順化された。順化された細胞は収穫されると共に、媒体内にエチレングリコー ル／ソルビトールが40/30wt.%の低温溶化溶液を含む4mlの小瓶に移された。小瓶 は4℃で3分間だけ温置されると共に、液体窒素内に浸漬して凍結された。小瓶は 液体窒素内に少なくとも10分間だけ保持され、これを解凍実験に使用する前に行 った。 凍結された細胞の小瓶は液体窒素貯蔵から取り出されると共に、内容物が液状 化するまで（1〜2分間）撹拌された。液状化された細胞は次に、1Mのソルビトー ルを含む滅菌媒体により5〜6回だけ、0.5Mのソルビトールを含む媒体により3回 だけ、0.1Mのソルビトールを含む媒体により３回だけ、且つ、ソルビトールを含 まない媒体により３回だけ、洗浄された。洗浄は、洗浄媒体内で細胞を再懸濁さ せると共に、50x9で2分間だけ遠心し、且つ、細胞ペレットから洗浄媒体を吸引 することにより実施された。細胞の生存度は、解凍後に直ちに測定された。数度 に亙る実験の概要を以下に列挙する。 実施例４：ソルビトールにより予備培養されたイチイ細胞の生存度 凍結されたイチイ細胞は、解凍されると共に、ソルビトールを0.15M、0.22M、 0.33M、0.44Mおよび0.80Mだけ含む新鮮な増殖媒体内で懸濁された。解凍後、直 ちに生存度が測定された。多数の試みの結果の要約を以下に列挙する： 実施例５：スクロースによる予備培養後のイチイ細胞の生存度 6〜7日経過したイチイ細胞の懸濁培養を収穫し、0.06M、0.12M、0.15M、0.29M 、および、0.58Mのスクロース、を含む新鮮な増殖培地内で細胞バイオマスが再 懸濁された。又、細胞は凍結保護され、凍結され、解凍され、且つ、透過的に調 節された。細胞の生存度は解凍後に直ちに測定された。多数の実験結果の概要が 表８に列挙されている： 実施例６：イチイ細胞の生存に関する浸透剤の効果 増殖媒体内の種々の浸透剤の効果を、該浸透剤により予備培養された、予備培 養期間後の、および、凍結保護かつ凍結された細胞懸濁を解凍した後の、Taxus 種細胞に関して測定した。３日間の細胞培養懸濁を行った細胞が、凍結保護に先 立ち、種々の浸透剤を含む増殖媒体内で予備培養された。凍結保護された細胞は 、液体窒素内で凍結されると共に、最小限１時間だけ保存された。予備培養期間 の終端（対照物）時と、凍結保護され且つ凍結された細胞の解凍の直後において 、生存度試験が行われた。 他の浸透剤を使用して観察された生存度と比較した場合、凍結保護かつ凍結さ れた後で解凍した直後に最も高いパーセンテージで生存度を示したものは、増殖 媒体内にマンニトールを使用して予備処理された細胞培養であった。 実施例７：Taxusの生存度に関する浸透剤および凍結保存剤の効果 Taxus（イチイ）の懸濁培養(KS1A)の細胞が収穫されると共に、媒体内に種々 の浸透剤を入れて予備培養された。試験された浸透剤は、トレハロース、プロリ ン、ソルビトール(0.15M-0.8M)、スクロース(2-20%)およびマンニトール(0.16M) を含むものである。生存度は、細胞懸濁の各々に対し、予備培養期間の終了時、 および、解凍の直後において評価された。再培養は、解凍後の浸透調節後に評価 された。使用された溶化溶液は、培養媒体内のエチレングリコール／ソルビトー ル／ペクチン、および、40/30wt.%のエチレングリコール／ソルビトールであっ た。結果は表１０に要約されている。最高の割合の生存度と最も活発な再増殖が 観察されたのは、予備培養にマンニトールを使用すると共に溶化溶液中の凍結保 護剤としてエチレングリコール／ソルビトールを使用した場合であった。 実施例８：生存に関する予備培養の効果 細胞培養からイチイ(Taxus)細胞を収穫すると共に、バイオマスが3%の濃度の マンニトールを含む増殖媒体中で室温で1日〜3日だけ懸濁された。ロードされた 細胞は4℃で3時間だけ温置され、かつ、培養溶媒中に40/30重量%のエチレングリ コール／ソルビトールから成る冷却溶化溶液を含む4ml小瓶に移動された。この 小瓶は4℃で3分間に亙り温置されると共に、液体窒素に浸漬して凍結された。小 瓶中に含まれた細胞は液体窒素中に少なくとも10分間だけ保持された。 凍結保存された細胞は解凍され、且つ、それらの生存度はFDAおよびトリパン ブルー着色法により測定された。マンニトールにより３日間だけ予備培養された 細胞は、マンニトールを含む媒体内で予備培養されなかった細胞よりも、遥かに 高い解凍後生存度を示した。 実施例９：解凍されたイチイ細胞の生存度に関するエチレングリコール／ソルビ トールの効果 Taxus種のKS1A系細胞の6〜7日間の細胞懸濁が、3%マンニトールで室温にて３ 日間だけ予備培養された。ロードされた細胞は4℃で3時間だけフラスコで温置す ることにより低温順化された。低温順化された細胞は4mlの凍結用小瓶に移動さ れ、低温溶化溶液が各々に対して付加されて混合された。4℃にて3分間だけ溶化 した後、細胞は液体窒素浸漬により凍結された。小瓶は液体窒素内に少なくとも 10分間だけ保持された。 凍結保存された細胞は、小瓶を液体窒素から取り出すことにより解凍されると 共に、40℃の水浴内で1〜2分間だけ撹拌された。解凍後生存度は、FDA着色分析 により測定された。 Taxus種のKS1A系細胞の細胞懸濁を評価する10個の試みが、異なるエチレング リコール／ソルビトール濃度で行われた。結果は表１２に要約されている。40/3 0wt.%の濃度のエチレングリコール／ソルビトールを含む溶化溶液内で凍結され た細胞懸濁が、他のエチレングリコール／ソルビトール濃度を使用して溶化され た細胞と比較して、最も高い解凍後生存度割合、並びに、最も活発な再増殖を示 した。 実施例１０：196℃貯蔵後のイチイ細胞の生存に関する凍結保存剤の効果 培養されたイチイ細胞が収穫されると共に、3%のマンニトールを含む新鮮な増 殖媒体内で3日間に亙り再懸濁された。細胞は3時間だけ低温順化されると共に、 ガラス賀陽駅を含む小瓶に移された。細胞懸濁は液体窒素浸漬により凍結された 。液体窒素により凍結された細胞は、40℃の水浴内で小瓶を1〜2分間だけ撹拌す ることにより解凍された。凍結保護剤としてのエチレングリコールと共に凍結さ れた細胞が最も高い生存度を示した。 実施例１１：溶化溶液へのバイオマスの機能としてのイチイ細胞の生存度 6〜7日間過ぎたTaxus種のKSlA系細胞の再冒険だくが収穫されると共に、3%の マンニトールを含む新鮮な媒体中で再懸濁されると共に室温で3日間だけ温置さ れた。4℃で３時間だけ低温順化したあと、細胞は、培養媒体内に40/30wt.%のエ チレングリコール／ソルビトールを含む4ml小瓶に移された。小瓶は4℃で3分間 だけ温置されると共に、液体窒素浸漬で凍結された。小瓶は、解凍する前に液体 窒素中に少なくとも10分間だけ保持された。 最高の生存度パーセントが観察されたのは、細胞バイオマス／溶化溶液量が16 7mg/mlのときであった。受容され得る生存度は、細胞バイオマス／溶化溶液比率 が143,200および250mg/mlのときであった。 実施例１２：イチイ細胞生存度に関する種々の方法段階の効果 最高の解凍後生存度に帰着するであろう段階を決定すべく、種々の方法段階が 評価された。細胞は、凍結保護剤を使用し／使用せずに、浸透予備処理を行い／ 行わず、低温処理を行い／行わず、且つ、溶化を行い／行わずに、凍結保存され た。 第１の試験においては、凍結保護剤を使用し／使用せずに、6〜7日経過したイ チイ細胞培養を凍結した。第２の試験においては、細胞を40/30wt%のエチレング リコール／ソルビトール溶化溶液処理を行い／行わずに、凍結した。第３の試験 においては、細胞は、3%のマンニトール増殖媒体内で3日間の温置を行う予備処 理を行い／行わずに、溶化かつ凍結された。第４の試験においては、低温順化を 行い／行わずに、細胞が予備処理されると共に溶化かつ凍結された。 各試験に対し、解凍後に直ちに生存度試験が行われた。3%のマンニトールを含 む増殖媒体により室温で3日間だけ予備増殖されるとともに、凍結保護に先立っ て2〜4時間だけ低温処理が行われた細胞が最も高い生存度割合を示した。また、 適切な生存度が観察されたのは、3%のマンニトールを含む増殖媒体により3日間 だけ予備増殖されると共に低温処理を行わずに凍結保護された細胞、および、増 殖媒体中で3日間だけ予備増殖されると共にマンニトールを含む増殖媒体中で24 時間だけ予備増殖され且つ凍結保護に先立って2〜4時間だけ低温処理が行わ れた細胞である。 細胞は、本明細書中に記述された方法によって行われた表示段階を使用して再 び生存度試験が行われた。 実施例１３：凍結保存前および凍結保存後の細胞の生存度及び増殖 以下のTaxus（イチイ）種細胞系が、凍結保存後の細胞生存度及び再増殖を決 定すべく評価された： KS1A;KEIR;647;1224;12-6;12-14;および12-20。 各細胞系の6〜7日経過した細胞懸濁が収穫されると共に、バイオマスが3%のマ ンニトールを含む新鮮な増殖媒体内で再懸濁された。細胞は室温で3日間だけ温 置され、その後、ロードされた細胞懸濁は4℃で3時間から温置された。低温順化 された細胞は、40/30wt.%のエチレングリコール／ソルビトールの低温溶化溶液 を含む4ml小瓶に移された。溶化溶液と細胞は穏やかに混合されると共に小瓶は4 0℃で3分間だけ温置された。その後、細胞懸濁は少なくとも10分間だけ液体窒素 に浸漬して凍結された。 凍結後、凍結された小瓶を液体窒素から40℃の水浴に1〜2分間だけ移動するこ とにより、細胞は解凍された。解凍後の細胞生存度はFDA着色分析により測定さ れた。また、細胞は、低温の滅菌1Mソルビトール媒体により5〜6回だけ洗浄され 、新鮮な1M媒体中で再懸濁された。 毒性を有する凍結保護剤を含まない細胞懸濁は、次に、ブフナー漏斗およびWh atmann54l濾紙を用いて滅菌条件下で個々に濾過された。細胞懸濁の各々に対し 、細胞を伴うフィルタは、0.5Mのソルビトールを含む半固体／増殖培地上に載置 され、室温で30分間だけ平衡化された。細胞を含む濾紙は、0.1Mのソルビトール を含む固体増殖培地に移動され、24時間だけ温置された。細胞を伴う濾紙は、ソ ルビトールを含まない半固体培地に移動されると共に、室温で24時間だけ温置さ れた。細胞を含む濾紙は次に、ソルビトールを含まない新鮮な半固体増殖培地に 再び移動されると共に、室温で付加的に24時間だけ温置された。半固体栄養培地 上のカルス細胞成長は、約2〜3週間で明らかになった。その後、液体増殖培地内 の細胞懸濁は、そのカルスから開始された。 以下に示す表１７から理解される如く、評価された細胞系の全てが、容認し得 る解凍後生存度および回復増殖を示した。 実施例１４：凍結保存時のイチイ細胞の増殖および生産物形成 6〜7日経過したイチイ細胞系KS1Aの細胞懸濁が凍結保存され且つ解凍された。 細胞は、増殖培地内の3%のマンニトールにより３日間だけ予備増殖されると共に 、凍結保護剤としては40/30wt.%のエチレングリコール／ソルビトールが使用さ れた。凍結および解凍を行う前後に、増殖倍加時間および生産物形成が評価され た。生産物収量は、懸濁液内の増殖の5日後に観察された。細胞内の核DNA内容物 を流動細胞計測法により観察し、凍結保存前では約22.7pg/核、かつ、凍結保存 後では22.9pg/核であることが見出された。凍結保存は、生産物形成に影響しな かった。 実施例１５：凍結保存後のイチイ細胞における増殖および生産物形成 イチイ種細胞系が凍結保存され、次に解凍されると共に解凍後の浸透調節が行 われた。液体培養内で細胞の懸濁が確立された後に、増殖および生産物形成が測 定された。増殖は、細胞懸濁が増殖培地内で確立された後の平均倍加時間を日数 で反映するものである。生産物形成は、懸濁液内で増殖が14日間行われた後に測 定された。結果は、表１９に列挙されている。 図５は、イチイ種細胞系1224から20日目の細胞外部分のクロマトグラムを示し ており、(A)は、凍結保存されなかった細胞懸濁の対照物を示しており、(B)は、 凍結保存、凍結、及び、6ヶ月の貯蔵の後に再生されるとともに解凍および解凍 後の浸透調節が行われた細胞懸濁を示している。ピーク１は10−デアセチルバッ カチン；ピーク２は9-ジヒドロバッカチンIII；ピーク３はバッカチンIII；ピー ク４は9-ジヒドロ-13-アセチルバッカチンIII；ピーク５はタキソール；ピーク ６は2-ベンゾイル-2-デアセチルバッカチンであり、ピーク７は2-ベンゾイル2- デアセチル-1-ヒドロジバッカチンIである。 図６は、イチイ種細胞系203から20日目の細胞外部分のクロマトグラムを示し ており、(A)は、凍結保存されなかった細胞懸濁の対照物を示しており、(B)は、 凍結保存、凍結、及び、3ヶ月の貯蔵の後に再生されるとともに解凍および解凍 後の浸透調節が行われた細胞懸濁を示している。ピーク１は10−デアセチルバッ カチン；ピーク２は9-ジヒドロバッカチンIII；ピーク３はバッカチンIII；ピー タ４は9-ジヒドロ-13-アセチルバッカチンIII；ピーク５はタキソール；ピーク ６は2-ベンゾイル-2-デアセチルバッカチンである。図５および図６から理解さ れる様に、生産物形成の形状は、対照細胞懸濁と、再生された細胞の懸濁とで実 質的に同一である。 実施例１６：凍結保存された細胞および凍結保存されない細胞の遺伝子安定性 細胞系は、単一のTaxus chinensis var.mairerツリーから形成された。これら の形成された細胞系の内のひとつが培養され、1年間だけ凍結保存され、かつ、 解凍された。遺伝子分析は、初代の樹木からの細胞および凍結保存された細胞に 関して行われ、凍結保存が細胞の遺伝子安定性に影響を与えたか否かに関して測 定された。各細胞系から僅か10μgの総計DNAが、制限エンドヌクレアの消化によ り４倍に処理されると共に、アガロースゲル電気泳動により寸法分画された。寸 法分画されたDNAはニトロセルロースの固体支持体上に移動されると共に、放射 ラベル核酸プローブ即ちJeffreyの33.6ミニサテライトプローブにハイブリッド 形成された。この高可変領域プローブは、図７のレーン1〜4において、4本の異 なる樹木のDNAからの異なる帯域パターンを示している。これと対照的に、初代 分離物(レーンA)、1年間だけ培養された細胞(レーンB)、及び、1年間だけ凍結保 存された細胞(レーンC)は、同じ樹木から1年後に分離された細胞(レーンDおよび E)と同一であった。この分析によっては、凍結保存により一切の変異は検出でき なかった。 実施例１７：凍結保存されたイチイ細胞の安定性 凍結保存期間の長さが遺伝子の安定性に何らかの影響を有するか否かを決定す る為に、イチイ細胞系1224を1時間乃至6ヶ月だけ凍結し、それらの遺伝子的安定 性を分析した。これらの凍結保存された細胞から解凍されると共に再回復された 生存培養増殖からDNAが抽出された。ゲノムを含む核酸リボソームコーディング および非コーディングDNAの3.1Kb多形領域が、重合酵素連鎖反応により増幅 されると共にエンドヌクレアDpnIIにより消化された。消化されたDNAはゲル電気 泳動を用いてサイズ分画されると共に、臭化エチジウムにより着色された後で視 認化された。この分析の結果は図８に示されている。初代細胞系および凍結保存 されなかった細胞系がレーンCおよびDに分析されている。関連の無い樹木から形 成された関連の無い２つの細胞系統は、異なる消化パターンを示した。これと対 照的に、1年間(レーンE)、１日(レーンF)、1週間(レーンG)、1ヶ月(レーンH)も しくは6ヶ月(レーンIおよびJ)だけ凍結保存された細胞にも、何らの遺伝子変異 が検出されなかった。これらの凍結保存されたおよび凍結保存されなかった細胞 の帯域パターンは、全て同一であった（レーンC乃至J）。 実施例１８：トマト細胞系の凍結保存 トマト細胞系の好首尾な凍結保存の為に、ローディングおよび溶化溶液が段階 的に漸進的に付加され、浸透の衝撃を減じた。ローディングおよび溶化溶液は、 30%(w/v)グリセロール、15%(w/v)エチレングリコール、および、15%(w/v)ジメチ ルスルホキシドを含んでいた。漸進的な付加を行わない場合、解凍後回復期間の 後に細胞は急激に増幅しなかった。解凍後の生存度および回復再増殖の影響が検 査され、その結果が表２０に示されている。 生存度（細胞の生存）が最も高かったのは、0.5Mのスクロースもしくは0.3Mソ ルビトールを夫々65%および70%だけ含む液状栄養培地内で3日間だけ細胞が予備 増殖された場合であった。これらの予備増殖条件は、細胞懸濁の解凍後における 細胞の活発な増殖も支援した。好首尾な凍結保存はまた、予備増殖期間および浸 透剤の濃度にも依存した。予備増殖期間を10日間まで延ばすと共に、浸透剤の濃 度を0.8M以上まで増大しても、細胞の生存度は増大しなかった。予備培養が無け れば、一段階もしくは段階的なローディングおよび溶化溶液付加方法のいずれに よっても、LN2温度において生存し得なかった。 生存度および再増殖再生は、予備増殖された細胞を熱ショック処理に対して4 時間まで露出すると共に、２価陽イオン(CaCl2.MgCl2)を添加することにより更 に増大した。この試みは、ルピナス、Sophora、conospermum、タバコおよびSola numの種から得られた細胞系、および、Taxus chinensisなどの種々のイチイ種か ら得られた強力な細胞系の凍結保存にも好首尾であった。多くの場合、これらの 植物種の細胞系の再増殖が顕微鏡で確認されたのはプレーティングから3〜4日後 であり、これと比較して、一段階のローディングおよび溶化方法では6〜10日で ある。細胞バイオマスを解凍後洗浄する上でエチレン作用阻害剤もしくはエチレ ン生合成阻害剤をを含む液状媒体を用いると、回復された細胞系 の品質が更に改善された。90%の生存率が一貫して達成されると共に、これらの 系から細胞懸濁が形成された後、迅速な増殖速度が観察された。 実施例１９ エチレン阻害剤による解凍後処理の影響 凍結用小瓶内の細胞バイオマスが、40℃〜60℃に設定された水浴内で20秒〜45 秒だけ急速加温された。この段階の直後、凍結用小瓶内で液状化された細胞バイ オマスが、1〜2mMの濃度の浸透剤（スクロース、ソルビトール、もしくはマンニ トール）、および、２μM〜20μMの濃度のエチレン阻害剤を含む液状栄養媒体を 含む滅菌遠心器に移された。内容物は穏やかに混合されると共に、シェーカ（12 0rpmの速度設定）上で室温にて30分だけ温置された。これに続き、遠心が行われ 、ペレットの細胞を吸収転移紙上に載置された二層の滅菌濾紙に移（して細胞も しくは細胞バイオマスからの過剰水分の除去を促進）した。細胞もしくは細胞バ イオマスは約2分間だけ温置された。温置の後、細胞が残った上側の濾紙を、0.8 M〜0.1Mの低濃度のスクロースを浸透剤として含む固体栄養培地に順次移動（し 、細胞の浸透調節を実施）した。各段階において、濾紙上の細胞は1/2〜1時間だ け温置され、最終的に、付加的な浸透剤の存在しない通常の固体栄養培地に移動 された。この段階は、24時間の間に２回反復された。次に、細胞バイオマスは暗 所にて25℃で、週ごとに移動を行って2〜3週間に亙り温置された。新たな細胞バ イオマスの増殖が増大したとき、カルス細胞は濾紙から除去され、通常の固体栄 養培地上に直接的に移動された。十分な増殖が生じた後、形成されたカルスから 液体培地内での細胞懸濁が開始された。細胞の生存度の観察は解凍後の様々な時 点で行われ、最も重要な観察は概略的に記録された。濾紙上の細胞は、浸透剤が 存在しない通常の固体培地に移動された。細胞増殖回復速度は、暗所における25 ℃での濾紙上の全ての温置に関し最初の3週間の間に観察された。 細胞もしくは細胞バイオマスの解凍後に関する代替処理もまた、有用である。 この処理は最初に、エチレン阻害剤を含まない1〜2Mの濃度の浸透剤(スクロース 、ソルビトールもしくはマンニトール)を含む液状媒体で細胞を迅速に洗浄する 段階を含む。これは、浸透剤を含む液状栄養培地内で細胞バイオマスを2〜5分間 だけ温置すると共に100gで1〜3分間だけ遠心することにより行われた。この段階 は、溶化溶液から有害な凍結保存剤を除去すべく２回反復され、次に、細 胞バイオマスが、浸透剤およびエチレン阻害剤(濃度範囲：2〜30μM)を含む液状 栄養培地内で30分間だけ温置された。 エチレン阻害剤は、エチレン生成、代謝もしくはエチレン作用を妨害する物質 である。それらは更に、エチレン生合成拮抗剤およびエチレンアクション拮抗剤 としても分類され得る。エチレン生合成拮抗剤は、エチレンへの生合成経路を妨 害する化合物である。この、阻害された生合成経路に沿った酵素の例には、ACC シンターゼ、ACCオキダーゼおよびエチレンオキシダーゼが含まれる。また、エ チレン生合成拮抗剤の例には、α−アミノイソブチル酸、アセチルサリチル酸、 メトキシビニルグリシン、アミノキシ酢酸などが含まれる。更に、エチレン作用 拮抗剤の例には、銀含有化合物、銀錯体もしくは銀イオン、二酸化炭素、1-メチ ルシクロプロペン、2.5-ノルボルナジエン、trans-シクロオクテン、cis-ブテン 、ジアゾ-シクロペンタジエン等が含まれる。適切な銀塩には、硝酸銀、チオ硫 酸銀、リン酸銀、安息香酸銀、硫酸銀、トルエンスルホン酸の銀塩、塩化銀、酸 化銀、酢酸銀、ペンタフルオロプロピオン酸銀、シアン酸銀、乳酸の銀塩、ヘキ サフルオロリン酸銀、亜硝酸銀、および、クエン酸の三銀塩が含まれる。種々の 銀塩によるイチイ生合成の促進の代表例は、表１および表２に示されている。 実験条件は、1.25Mの浸透剤および適切な濃度のSLTS（チオ硫酸銀）を含む栄 養液状培地を含んでいた。浸透剤は、スクロース、ソルビトールもしくはマンニ トールであった。対照条件は、1.25Mの浸透剤を含み乍らもSLTSを含まない栄養 液状培地を含んでいた。結果は表２１に示され、カルス細胞の増殖の度合いおよ び回復速度の割合を示している。 エチレン阻害剤を含む液体媒体により細胞を解凍後処理した処、回復された細 胞系の生存度および増殖速度は一貫して改善された。回復された細胞系の増殖速 度を増大する上では、チオ硫酸銀の濃度を2μMおよび20μMとするよりも、４μM 〜10μMとした方が一層効果的であった。使用した細胞系に依存し乍らも、90%ま での生存度割合が達成された。８μMおよび10μMのSLTSを含む解凍後液状媒体は 細胞増殖をさらに活発に促進し、且つ、浸透剤およびエチレン阻害剤を含まない 栄養培地上に細胞を塗付してから3〜4日後に、顕微鏡により細胞増殖が確認され た。 当業者であれば、本明細書および本明細書中に開示された本発明の実施例を考 慮することにより、本発明の他の実施例および使用法は明らかであろう。本明細 書中で引用した米国特許の全ては、言及したことにより全体的に明確に援用する 。また、本明細書および実施例は、添付の請求の範囲により示される本発明の真 の範囲および精神に関する単なる例示的なものと見做さねばならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 シュナベル−プレイクスタス，バーバラ アメリカ合衆国ニューヨーク州14850，イ サカ，ギャレット・ロード 111 (72)発明者 ユ，ビン アメリカ合衆国ニューヨーク州14850，イ サカ，グラハム・ロード 134，４ビー５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．a)凍結保存剤および安定剤により植物細胞を予備処理する段階と； b)予備処理された植物細胞を低温に順化する段階と； c)植物細胞にローディング剤をローディングする段階と； d)溶化溶液により植物細胞を溶化する段階と； e)溶化された植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と； を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 ２．a)凍結保存剤および安定剤により植物細胞を予備処理する段階と； b)植物細胞を溶化する段階と； c)溶化された植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と； を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 ３．a)植物細胞を凍結乾燥する段階と； b)凍結乾燥された植物細胞を溶化溶液中で溶化する段階と； c)溶化された植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と； を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 ４．a)浸透剤およびエチレン阻害剤で植物細胞を予備処理する段階と； b)植物細胞に凍結保護剤をローディングする段階と； c)植物細胞を凍結保存溶液で溶化する段階と； d)植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と； を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 ５．a)浸透剤および約5mM以上の２価陽イオンにより植物細胞を予備処理する 段階と； b)植物細胞に凍結保護剤をローディングする段階と； c)植物細胞を凍結保護溶液で溶化する段階と； d)溶化された植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と； を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 ６．a)植物細胞を熱ショックで予備処理する段階と； b)順化された植物細胞を溶化溶液で溶化する段階と； c)温置された植物細胞を凍結保存温度で凍結する段階と； を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 ７．植物細胞は、裸子植物もしくは被子植物である、請求項１乃至６に記載の 方法。 ８．裸子植物は、モミ属(Abies)、イトスギ属(Cypressus)、イチョウ属(Ginkg o)、ビャクシン属(Juniperus)、トウヒ属(Picea)、マツ属(Pinus)、トガサワラ （ベイマツ）属(Pseudotsuga)、セコイア属(Sequoia)、イチイ属(Taxus)、ツガ 属(Tsuga)もしくはザミア属(Zamia)の種である、請求項７記載の方法。 ９．イチイ(Taxus)種は、T.baccata（イチイ科ヨーロッパイチイ）,T.brevifo lia,T.canadensis,T.chinensis,T.cuspidata,T.floridana,T.globosa,T.media,T .nuciferaもしくはT.wallichianaである、請求項８記載の方法。 １０．被子植物は単子葉植物細胞もしくは双子葉植物細胞である、請求項７記 載の方法。 １１．単子葉植物細胞は、からす麦属(Avena)、ココヤシ属(Cocos)、ヤマノイ モ属(Dioscorea)、オオムギ属(Hordeum)、バショウ属(Musa)、イネ属(Oryza)、 メダケ属(Saccharum)、モロコシ属(Sorghum)、コムギ属(Triticum)およびトウモ ロコシ属(Zea)である、請求項１０記載の方法。 １２．双子葉植物細胞は、Achyrocline属、Atropa属、アブラナ属(Brassica) 、メギ属(Berberis)、トウガラシ属(Capsicum)、Catharanthus属、conospermum 属、チョウセンアサガオ属(Datura)、ニンジン属(Daucus)、ジギタリス属(Digit alis)、Echinacea属・Eschscholtzia属、ダイズ属(Glycine)、ワタ属(Gossypium )、ヒヨス属(Hyoscyamus)、トマト属(Lycopersicum)、リンゴ属(Malus)、ムラサ キウマゴヤシ属(Medicago)、タバコ属(Nicotiana)、panax属、エンドウ属(Pisum )、Rauvolfia属、Ruta属、ナス属(Solanunt)およびTrichosanthes属の種から成 る群から選択される、請求項１０記載の方法。 １３．植物細胞は、新生の針葉、樹皮、葉、幹、根、地下茎、カルス細胞、原 形質体、細胞懸濁、分裂組織、種子もしくは胚から得られる、請求項１乃至６記 載の方法。 １４．予備処理段階は、前記ローディング剤および前記安定剤を含む媒体内で 前記植物細胞を略々室温で約1時間乃至7日間に亙り培養する段階を含む、請求項 １記載の方法。 １５．ローディング剤は、糖類、アミノ酸もしくはそれらの組合せである、請 求項１記載の方法。 １６．糖類は、フルクトース、グルコース、マルトース、マンニトール、ソル ビトール、スクロース、トレハロース、および、それらの誘導体から成る群から 選択されたひとつ以上の糖類である、請求項１５記載の方法。 １７．ローディング剤は、約0.05M乃至約0.8M、もしくは、約1wt._%乃至約10wt ._%の濃度の水溶液として使用される、請求項１記載の方法。 １８．安定剤は、抗酸化剤、酸素ラジカル捕捉剤、２価陽イオン、エチレン阻 害剤、もしくは、それらの組合せである、請求項２記載の方法。 １９．安定剤は、還元形グルタチオン、テトラメチル尿素、テトラメチルチオ 尿素、ジメチルホルムアミド、メルカプトプロピオニルグリシン、メルカプトエ チルアミン、セレノメチオニン、チオ尿素、ジメルカプトプロパノール、アスコ ルビン酸、システイン、ナトリウムジエチルジチオカルバミド、チオ硫酸ナトリ ウム、チオ硫酸銀、没食子酸プロピル、スペルミン、スペルミジン、および、そ れらの組合せおよび誘導体から成る群から選択される、請求項１記載の方法。 ２０．安定剤は、約1μM乃至約1mMの濃度の水溶液として使用される、請求項 １記載の方法。 ２１．低温は約1℃乃至約15℃の間である、請求項１記載の方法。 ２２．ローディング段階は、重量で約0.5%乃至約10%の溶化剤を含む溶化溶液 内で前記植物細胞を温置する段階を含んで成る、請求項１、４および５に記載の 方法。 ２３．凍結保護剤は、DMSO、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチ レングリコール、エチレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、プロパ ンジオール、ソルビトール、マンニトール、およびそれらの混合物、から成る群 から選択される、請求項１、２、４および５に記載の方法。 ２４．凍結保護もしくは溶化溶液は、DMSO、プロピレングリコール、グリセロ ール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ブタンジオール、ホルム アミド、プロパンジオール、ソルビトール、マンニトール、およびそれらの混合 物、から成る群から選択された物質を含む、請求項１乃至６に記載の方法。 ２５．凍結保護もしくは溶化溶液は、重量で約20%乃至約60%の凍結保存剤を含 む、請求項１乃至６記載の方法。 ２６．凍結保護もしくは溶化溶液は植物細胞に加えられ、溶液に対する割合が 約250mg/ml以下のバイオマスを形成する、請求項１および３乃至６に記載の方法 。 ２７．ローディング剤および溶化剤は同一である、請求項１記載の方法。 ２８．浸透剤および凍結保護剤は同一である、請求項５記載の方法。 ２９．ローディングおよび溶化は実質的に同時に行われる、請求項１、４およ び５に記載の方法。 ３０．ローディングもしくは溶化は、単一段階もしくは複数段階の処理として 行われる、請求項１乃至６記載の方法。 ３１．凍結乾燥段階は、植物細胞から重量で約40%乃至約60%の水分を除去する 、請求項３記載の方法。 ３２．凍結乾燥および溶化は、植物細胞から重量で約75%乃至約95%の水分を除 去する、請求項３記載の方法。 ３３．植物細胞には、溶化に先立ちローディング剤がロードされる、請求項２ 、３、４および６に記載の方法。 ３４．植物細胞は、該植物細胞を、DMSO、プロピレングリコール、グリセロー ル、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトー ル、およびそれらの混合物、から成る群から選択される溶化剤を含む約0℃乃至 約4℃の溶化溶液により温置することにより溶化される、請求項１乃至６記載の 方法。 ３５．凍結段階は液体窒素中で急冷する段階から成る、請求項１乃至６記載の 方法。 ３６．凍結段階に先立ち、凍結保護剤を含む媒体内で前記植物細胞を培養する 段階を更に備えて成る、請求項３乃至６記載の方法。 ３７．凍結保護剤は、フルクトース、グルコース、マルトース、マンニトール 、ソルビトール、スクロース、トレハロース、および、それらの混合物並びに誘 導体から成る群から選択される、請求項３６記載の方法。 ３８．媒体は安定剤を更に含んでなる、請求項３６記載の方法。 ３９．安定剤は、酸化防止剤、酸素ラジカル捕捉剤、エチレン阻害剤、２価陽 イオン、もしくは、それらの組合せである、請求項３８記載の方法。 ４０．凍結保存温度は約-70℃以下である、請求項１乃至６記載の方法。 ４１．前記凍結保存温度で凍結保存された細胞を、1ヶ月以上の期間に亙り貯 蔵する段階を更に備えて成る、請求項１乃至６記載の方法。 ４２．期間は1年以上である、請求項４０記載の方法。 ４３．請求項１乃至６の方法により凍結保存された生存植物細胞。 ４４．凍結保存によっても前記細胞は遺伝子的もしくは表現型的にそれほど変 化せしめられない、請求項４２記載の生存植物細胞。 ４５．イチイ(Taxus)種である、請求項４２記載の生存植物細胞。 ４６．前記イチイ細胞はジテルペンを発出する、請求項４５記載の生存植物細 胞。 ４７．ジテルペンはタキソールである、請求項４６記載の生存植物細胞。 ４８．前記ジテルペンの発出は、凍結保存によりそれほど変化せしめられない 、請求項４６記載の生存植物細胞。 ４９．請求項１乃至６記載の方法により凍結保存された生存植物細胞の生殖細 胞保存物。 ５０．a)溶化剤および安定剤を含む媒体内で植物細胞を低温で第１期間に亙り 温置する段階と； b)上記溶化剤の濃度が高められた媒体内で植物細胞を第２期間に亙り温置する 段階と； c)凍結保存温度で植物細胞を凍結する段階と； を備えて成る、植物細胞の凍結保存方法。 ５１．第１期間は約1時間乃至約7日間である、請求項５０記載の方法。 ５２．第２期間は約30分乃至約2時間である、請求項５０記載の方法。 ５３．前記溶化剤の高められた濃度は、重量で約20%乃至約60%である、請求項 ５０記載の方法。 ５４．請求項５０の方法により凍結保存された生存植物細胞。 ５５．a)請求項１乃至６および５０の方法に従って、植物細胞を凍結保存する 段階と； b)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と； c)解凍された植物細胞を、凍結保護剤および安定剤を含む増殖媒体内で温置す る段階と； d)凍結保護剤を除去する段階と； e)生存植物細胞を回復する段階と； を備えて成る、凍結保存された植物細胞の回復方法。 ５６．a)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と； b)解凍された植物細胞を、エチレン阻害剤を含む増殖媒体内で温置する段階と ； c)生存植物細胞を回復する段階と； を備えて成る、凍結保存された植物細胞を回復する方法。 ５７．a)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と； b)解凍された植物細胞を、凍結保護剤および安定剤を含む増殖媒体内で温置す る段階と； c)凍結保護剤を除去する段階と； d)生存植物細胞を回復する段階と； を備えて成る、凍結保存された植物細胞の回復方法。 ５８．a)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と； b)解凍された植物細胞を、２価陽イオンを含む増殖媒体内で温置する段階と； c)生存植物細胞を回復する段階と； を備えて成る、凍結保存された植物細胞を回復する方法。 ５９．a)凍結保存された植物細胞を凍結以上の温度に解凍する段階と； b)解凍された植物細胞を懸濁液内で温置する段階と； c)懸濁液内で生存植物細胞を回復する段階と； を備えて成る、凍結保存された植物細胞を懸濁液内で回復する方法。 ６０．凍結保存された植物細胞は略々室温で解凍される、請求項５５乃至５９ に記載の方法。 ６１．凍結保護剤は、糖類、アミノ酸もしくはそれらの混合物である、請求項 ５５および５７に記載の方法。 ６２．凍結保護剤は、ソルビトール、マンニトール、スクロース、トレハロー ス、プロリン、および、それらの混合物から成る群から選択される、請求項５５ および５７に記載の方法。 ６３．安定剤は、抗酸化剤、酸素ラジカル捕捉剤、エチレン阻害剤、２価陽イ オン、もしくは、それらの組合せである、請求項５７記載の方法。 ６４．安定剤は、還元形グルタチオン、テトラメチル尿素、テトラメチルチオ 尿素、ジメチルホルムアミド、メルカプトプロピオニルグリシン、メルカプトエ チルアミン、セレノメチオニン、チオ尿素、ジメルカプトプロパノール、チオ硫 酸ナトリウム、チオ硫酸銀、アスコルビン酸、システイン、ナトリウムジエチル ジチオカルバミド、スペルミン、スペルミジン、没食子酸プロピル、および、そ れらの組合せおよび誘導体から成る群から選択される、請求項５７記載の方法。 ６５．温置段階および回復段階は液状媒体内で行われる、請求項５５乃至５９ 記載の方法。 ６６．凍結保護剤は、前記液状媒体により段階的にもしくは連続的希釈により 除去される、請求項５５乃至５９記載の方法。 ６７．温置は半固体媒体上で行われる、請求項５５乃至５９記載の方法。 ６８．除去段階は、浸透的に調節された細胞を、低下していく濃度で前記凍結 保護剤を含む増殖媒体により複数回だけ洗浄する段階を備えて成る、請求項５５ 乃至５９記載の方法。 ６９．回復された生存植物細胞はジテルペンを発出すると共に、ジテルペン発 出は凍結保存によりそれほど変化せしめられない、請求項５５乃至５９記載の方 法。 ７０．回復された植物細胞の約50%以上が生存する、請求項５５乃至５９記載 の方法。 ７１．回復された植物細胞の約70%以上が生存する、請求項５５乃至５９記載 の方法。 ７２．回復された植物細胞の約80%以上が生存する、請求項５５乃至５９記載 の方法。 ７３．解凍された植物細胞は、約0℃乃至約10℃にて増殖媒体内で温置される 、請求項５５乃至５９記載の方法。 ７４．増殖媒体は凍結保護剤から成る、請求項７３記載の方法。 ７５．凍結保護剤は所定期間後に除去されると共に、植物細胞の温置は増殖媒 体内および懸架液内で行われる、請求項５５乃至５９記載の方法。 ７６．増殖媒体は安定剤を含む、請求項５５乃至５９記載の方法。 ７７．安定剤は、抗酸化剤、酸素ラジカル捕捉剤、エチレン阻害剤、２価陽イ オン、もしくは、それらの組合せである、請求項７６記載の方法。 ７８．エチレン阻害剤は、エチレン生合成阻害剤もしくはエチレン作用阻害剤 である、請求項７７記載の方法。 ７９．エチレン作用阻害剤は銀塩である、請求項７８記載の方法。 ８０．銀塩は、チオ硫酸銀、硝酸銀、塩化銀、酢酸銀、リン酸銀、硫酸銀、亜 硝酸銀から成る群から選択される、請求項７９記載の方法。 ８１．エチレン生合成阻害剤は、スペルミジン、スペルミン、カテコール、n- プロピル没食予酸、ヒドロキノン、鉄酸、アラール(alar)、フェニルエチルアミ ン、サリチルアルコール、インドメタシンから成る群から選択される、請求項７ ８記載の方法。 ８２．２価陽イオンは、カルシウム、マグネシウムもしくはマンガンである、 請求項７９記載の方法。 ８３．植物細胞は半固体培地に移動される、請求項５５乃至５９記載の方法。 ８４．温置および回復は液状媒体内で行われる、請求項５５乃至５９記載の方 法。 ８５．温置は半固体培地上で行われる、請求項５５乃至５９記載の方法。 ８６．回復された生存植物細胞は活発に再増殖する、請求項５５乃至５９記載 の方法。 ８７．ローディングもしくは溶化は、単一段階もしくは複数段階にて行われる 、請求項５５乃至５９記載の方法。 ８８．複数段階は、1分間隔で5回に亙り凍結保護剤を植物細胞に添加する段階 から成る、請求項８７記載の方法。 ８９．請求項５５乃至５９の方法により回復された生存植物細胞。 ９０．請求項８９の生存植物細胞から繁殖された植物。 ９１．イチイ(Taxus)種である、請求項９０記載の植物。 ９２．請求項５５乃至５９の方法により回復された生存植物細胞の懸濁物。