KR101185827B1 - 삼나무종자의 초저온 저장방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 삼나무종자(Japanese cedar seed)의 초저온 저장방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에 침지시킨 후 액체질소에 저장하는 단계; 상기의 액체질소에 저장한 나무종자를 해동시키는 단계; 및 상기의 해동한 삼나무종자를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액에 침지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 삼나무종자의 초저온 저장방법에 관한 것이다.
본 발명은 초저온 저장기술을 이용하여 삼나무종자를 저장함에 있어서 초저온 동결보호제 및 해동한 삼나무종자를 폴리에틸렌글리콜 용액으로 프라이밍(priming) 처리를 이용하여 초저온이 아닌 보통의 방법으로 저장한 삼나무종자와 대비시 동등 수준 이상의 발아율을 가지고, 발아가 빨리 진행되며, 발아율 값(Germination value) 특성이 우수한 삼나무종자의 초저온 저장방법을 제공할 수 있다.
삼나무종자, 초저온 저장, 초저온 동결보호제, PEG
Description
본 발명은 삼나무종자(Japanese cedar seed)의 초저온 저장방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에 침지시킨 후 액체질소에 저장하는 단계; 상기의 액체질소에 저장한 삼나무종자를 해동시키는 단계; 및 상기의 해동한 삼나무종자를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액에 침지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 삼나무종자의 초저온 저장방법에 관한 것이다.
삼나무(Japanese cedar)는 목재와 수목자체로 관상용으로 난대와 한대기후대에서 오랫동안 가치를 인정받고 있는 수종이다. 삼나무 종자의 표준 발아율은 30％ 정도로 매우 낮은 발아율을 보이며, 저장성도 매우 낮아서 상온보관 시 2～3년 내에 종자의 활력이 소실되어서, 육묘업자들은 주로 영양번식을 해오고 있다. 특히 삼나무 종자와 같이 유류종자는 일반 저장도 어렵고, 초저온 저장도 어려운 저장성의 문제점이 있다. 저장성종자에서는 초저온 저장이 수월하게 이루어지고 있으나, 삼나무 종자의 경우는 액체질소에 저장 시 발아율이 무처리 종자의 68％로 저하된다.
산림유전자원의 현지외보존방법 중 대다수의 수종에 대해서는 종자은행을 이용한 방법이 가장 효율적으로 여겨져 왔으며, 초저온 저장방법이 장기저장 방법으로 중요한 기여를 하고 있다. 그러나 몇몇의 산림종자는 종자의 활력이 급격히 소실되므로 효율적인 저장방법의 개발이 필요하다. 농업 종자의 경우 155종에서 초저온 저장을 이용한 간편하고 저비용의 저장방법이 개발되었다. 서호주 지역의 희귀 및 위기종의 40％가 초저온저장 기술로 보존이 가능함을 보고하였다. 그러나, 많은 수목류의 수종 중 비저장성 종자는 일반종자은행으로 저장이 불가능하다. 따라서, 초저온 저장법을 이용한 유전자원의 보존은 수목류의 생물다양성유지를 위한 안정적인 가이드방법으로 매우 중요하며, 저비용, 다양한 적용성을 가진 기술의 개발이 요구되고 있다. 경제적 측면에서도 현지외보존원을 이용한 경우 1그루 1년 관리비용 75～100USD($)인 반면에 초저온저장은 1USD($)로 경제적 측면에서도 높은 효율성을 가진다.
본 발명은 액체질소에 저장 전에 초저온동결보호제의 처리와 초저온저장 후 해동시킨 종자에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액을 이용한 삼투프라이밍 종자처리기술로 장기저장이 불가능한 유류종자인 삼나무 종자의 초저온 저장을 가능하게 하였다. 삼투프라이밍 처리는 초저온동결보호제의 유독성의 문제점도 해소할 수 있는 초저온저장 종자의 복원율을 높일 수 있는 종자처리 방법으로 산림유전자원의 장기저장후 처리 방법으로 크게 활용될 기술로 기대된다.
초저온 온도에서는 화학적, 생물물리적(biophysical) 반응율이 초동결(ultra-frozen) 조직과 세포의 발달에 유해할 정도로 느리게 되지만, 급속냉동과 같은 적절한 기술을 이용하면 세포의 생존에는 아무 영향을 미치지 않는다. 액체질소에서의 종자의 생존율이 향상된 초저온 보존이 증명되고 있다.
초저온저장 기술은 1970년대에 식물조직에 처음으로 적용된 것으로 고가의 장비가 필요하기 때문에 널리 이용되지 않았으나, 최근에는 바로 액체질소에 침지시키는 기술(one-step freezing)의 개발로 고가의 장비가 불필요하게 되었다.
식물에서 초저온 동결보호제인 유리화용액(vitrification solution)을 이용한 초저온저장기술은 1989년에 처음 보고되었다. 이 기술은 유리화용액에 15분에서 2시간 정도 식물절편을 처리한 후 바로 액체질소에 넣는 방법이다.
초저온 동결보호제는 침투성과 비침투성의 두 가지가 있는데, 가장 일반적으로 사용된 것은 침투성 초저온 동결보호제 및 비침투성 초저온 동결보호제의 혼합물인 PVS2(Plant vitrification soultion No.2)와 침투성인 DMSO (dimethyl sulphoixide)이다. DMSO는 저온에서의 빠른 침투성으로 선호되어 왔으나, 고농도에서의 독성이 단점이다. Touchell 과 Dixon은 15％ 농도의 DMSO와 35％ 농도의 DMSO가 16개 수종의 종자에서 효과가 있다고 보고한 바 있다. 수목류에서는 주로 배, 배축, 어린 싹에 대해 시트러스(Citurs), 커피나무(Coffee), 파풀러스(Populus),퀘르커스(Quercus)에서 PVS2가 효과적이라고 보고되었다. 유류성분이 높은 Pinus pinea 종자도 초저온 저장으로 발아율이 무처리 종자의 24％로 감소하였다. 이에 대해 Vertucci는 Pisum sativaum, Helianthus annuus, Glycine max 같은 유류성분 이 높은 종자에서 초저온에 감수성이 있다고 보고한바 있으나 구체적인 처리방법은 보고되지 않았다.
종자프라이밍 방법은 빠르고 균일한 유묘의 출현을 목적으로 하고 건조에 의한 종자의 건조감수성을 감소시킨다. 초저온저장에서 가장 선행되는 조건이 탈수이므로 종자의 초저온 저장을 위해서는 8％ 이하의 수분함량을 유지해야한다. 이렇게 건조된 종자가 수분을 빨리 흡수할 때, 세포벽이 손상되는 흡수피해가 발생된다. 이런 흡수피해를 최소화하기 위해 삼투압을 이용한 프라이밍 처리를 사용한다. 삼투압용액의 농도를 조절하여 종자에 흡수되는 물의 량을 조절하는 원리이다. 이는 종자의 구조와 건조정도에 따라 적절한 수준의 삼투농도를 구명해야한다.
본 발명의 목적은 초저온 저장기술을 이용하여 삼나무종자를 저장하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에 침지시킨 후 액체질소에 저장하는 단계; 상기의 액체질소에 저장한 삼나무종자를 해동시키는 단계; 및 상기의 해동한 삼나무종자를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액에 침지하는 단계를 포함하는 삼나무종자의 초저온 저장방법을 나타낸다.
본 발명은 초저온 저장기술을 이용하여 삼나무종자를 저장함에 있어서 초저온 동결보호제 및 해동한 삼나무종자를 폴리에틸렌글리콜 용액으로 프라이밍(priming) 처리를 이용하여 초저온이 아닌 보통의 방법으로 저장한 삼나무종자와 대비시 동등 수준 이상의 발아율을 가지고, 발아가 빨리 진행되며, 발아율 값(Germination value) 특성이 우수한 삼나무종자의 초저온 저장방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 삼나무종자의 초저온 저장방법을 나타낸다.
본 발명은 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에 침지시킨 후 액체질소에 저장하는 단계; 상기의 액체질소에 저장한 삼나무종자를 해동시키는 단계; 및 상기의 해동한 삼나무종자를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액에 침지하는 단계를 포함하는 삼나무종자의 초저온 저장방법을 나타낸다.
상기에서 초저온 동결보호제 용액에 침지하는 삼나무종자는 평균종자수분함량이 7～8％인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 초저온 동결보호제 용액에 침지하는 삼나무종자는 상대습도 40～50％를 유지하는 염화칼슘(CaCl2) 포화용액 상자에 3～5일간 넣어 평균종자수분함량이 7～8％이 되도록 처리한 것을 사용할 수 있다.
상기에서 초저온 동결보호제는 30～40％ 농도의 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 사용할 수 있다.
상기에서 초저온 동결보호제는 35％ 농도의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용할 수 있다.
상기에서 초저온 동결보호제는 디메틸설폭사이드(DMSO) 10～20％(w/v), 에틸렌글리콜 10～20％(w/v), 글리세롤 20～40％(w/v) 및 잔부의 물로 이루어진 것을 사용할 수 있다.
상기에서 초저온 동결보호제는 디메틸설폭사이드(DMSO) 15％(w/v), 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 15％(w/v), 글리세롤(glycerol) 30％(w/v) 및 잔부의 물로 이루어진 것)을 사용할 수 있다.
상기에서 DMSO와 디메틸설폭사이드, 에틸렌글리콜, 글리세롤 및 잔부의 물로 이루어진 것 이외에 초저온 동결보호제는 에틸렌글리콜(ehtylene glycol), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 글리세롤(glycerol) 또는 수크로오스(sucrose)를 사용할 수 있다.
상기에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에의 침지는 20～25℃에서 1～3시간 동안 실시할 수 있다.
상기에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에의 침지는 25℃에서 2시간 동안 실시할 수 있다.
상기에서 삼나무종자를 넣는 액체질소는 -200℃～-190℃ 온도의 액체질소를 사용할 수 있다.
상기에서 삼나무종자를 넣는 액체질소는 -196℃ 온도의 액체질소를 사용할 수 있다.
상기에서 액체질소에 저장한 삼나무종자의 해동은 30℃～40℃의 항온수조(water bath)에 넣고 10～20분 동안 급속해동 시킬 수 있다.
상기에서 액체질소에 저장한 삼나무종자의 해동은 37℃의 항온수조(water bath)에 넣고 15분 동안 급속해동 시킬 수 있다.
상기에서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액은 삼투압농도가 -0.4MPa인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액은 중량평균분자량이 400～8000이고, 삼투압농도가 -0.4MPa인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액은 삼투압농도가 -1.2MPa인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액은 중량평균분자량이 400～8000이고, 삼투압농도가 -1.2MPa인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액은 삼투압농도가 -0.4MPa～-1.2MPa인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액은 중량평균분자량이 400～8000이고, 삼투압농도가 -0.4MPa～-1.2MPa인 것을 사용할 수 있다.
상기에서 해동한 삼나무종자를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액에의 침지는 10～20℃의 암(暗)상태에서 2～4일간 회전배양기에서 실시할 수 있다.
상기에서 해동한 삼나무종자를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액에의 침지는 15℃의 암(暗)상태에서 3일간 회전배양기에서 실시할 수 있다.
본 발명에서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 대신 만니톨(manitol)을 사용할 수 있다.
본 발명의 삼나무종자의 초저온 저장방법에 대해 다양한 방법에 의해 실시해본바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 삼나무종자의 초저온 저장방법을 제공하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 삼나무종자의 초저온 동결보호제 처리, 액체질소 저장, 급속해동, PEG 프라이밍 처리
① 초저온 동결보호제 처리
삼나무종자의 초저온 동결보호제 처리는 삼나무종자를 액체질소에 저장직전에 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에 넣고 25℃에서 2시간 동안 침지하였다(도 1 참조). 침지한 후 초저온 동결보호제 용액에서 삼나무종자를 꺼내어서 바로 cryo tube에 옮겨 담은 후 바로 액체질소통에 보관하였다.
본 발명에 이용된 초저온 동결보호제는 PVS2[디메틸설폭사이드(DMSO) 15％(w/v), 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 15％(w/v), 글리세롤(glycerol) 30％(w/v), 증류수 40%(w/v)]를 사용하였다.
② 액체질소 저장
삼나무종자를 상대습도 45％를 유지하는 CaCl2 포화용액 상자에 넣어 평균종자수분함량이 7.83％로 조절한 후 10ml 크기의 초저온용 cryo-tube에 삼나무종자를 담아 뚜껑을 밀폐한 후 튜브 랙에 꽂아서 -196℃의 액체질소에 바로 넣었다(도 2 참조).
③ 액체질소에 저장되었던 삼나무종자의 급속해동
액체질소에 저장되었던 삼나무종자가 들어가 있던 초저온용 튜브채를 꺼내는 즉시 37℃ 항온수조(water bath)에 넣어 15분간 급속 해동시켰다(도 3 참조).
④ PEG 삼투프라이밍 처리
삼투압 농도를 -0.4MPa인 PEG8000(분자량이 8000인 PEG) 용액을 만들었다(MICHEL, B. E. (1983): Evaluation of the water potentials of solutions of polyethylene glycol 8000 both in the absence and presence of other solutes. Plant Physiology 72:66-70.) .
삼투압 농도가 -0.4MPa인 PEG 용액에 각각 급속 해동시킨 삼나무종자를 넣고 15℃에서 암(暗)상태에서 3일간 회전배양기에 처리를 하였다.
일반적으로 종자의 삼투프라이밍 처리는 종자에 삼투압의 원리로 천천히 수분을 흡수시켜, 종자가 발아직전까지의 생리대사작용을 진행토록 한 후 유근이 내종피를 뚫고나오는 발아라는 단계 직전에 종자를 재건조시켜 수분만 재공급되면 바로 발아할 수 있도록 함으로써 발아속도와 발아의 균일성을 향상시키는 종자 처리 기법이다.
본 발명에서는 건조된 삼나무종자가 수분을 흡수 시 갑작스런 흡수로 인해 세포막이 파괴되어 발아율을 저하시키는 원인이 됨에 착안하여 흡수장해를 극복하도록 삼투프라이밍 처리로 발아율을 높이도록 하였다. 이 원리는 건조된 삼나무종자는 높은 고삼투압 상태이므로 두 가지 삼투용액에서 수분을 흡수시키는 원리인데, 물보다는 높은 삼투농도이므로 바로 파종하여 물을 흡수할 때 보다 천천히 수 분을 흡수하도록 하는 것이다. 또한 두 가지 농도의 삼투용액에서 흡수 시에도 적절한 흡수정도를 조절할 수 있는 삼투농도, 처리온도, 기간을 찾는 것은 종자의 구조나 상태에 따라 상이하다. 또한 프라이밍 처리 시 회전배양기에서 넣음으로써 3일간의 침지 처리 시에도 종자호흡을 가능케 한다(도 4 참조).
⑤ 발아 분석(germination analysis)
발아검사는 두장의 필터페이퍼를 깐 9cm 페트리디쉬에 삼나무종자를 50립씩 4반복으로 파종한 후 광상태의 20℃ 항온기에서 28일간 매일 발아율을 조사하였다. ISTA(국제종자협회) 규정에 따라 유근이 2mm이상 종피를 뚫고 나온 상태를 발아되었다고 간주하였다.
발아율은 4개의 반복의 평균값으로 표시하였다. 평균발아일수(mean germination time, MGT)는 MGT=∑nidi/n (n=총 발아된 종자수, ni는 di일에 발아된 종자수, 발아시험기간 중 발아일수로 Yousheng and Sziklai의 방법(YOUSHENG, C. and O. SZIKLAI (1985): Preliminary study on the germination of Toona sinensis (A. Juss.) Roem. seed from eleven Chinese provenances. Forest Ecology and Management 10: 269-281.)으로 계산하였다. MGT값이 작을수록 발아가 빨리 되었음을 나타내므로 종자의 활력이 높음을 알 수 있다. Germination value (GV)는 GV=PV x MDG로 PV는 누적발아율에서 가장 높은 수치이고, MDG는 평균발아일수이다(CZABATOR, F. J. (1962): Germination value: an index combining speed and completeness of pine seed germination. Forest Science 8: 386-396.). GV값이 높 을수록 종자의 활력이 좋은 것을 의미한다.
<실시예 2>
① 초저온 동결보호제 처리
삼나무종자의 초저온 동결보호제 처리는 삼나무종자를 액체질소에 저장직전에 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에 넣고 25℃에서 2시간 동안 침지하였다. 침지한 후 초저온 동결보호제 용액에서 삼나무종자를 꺼내어서 바로 cryo tube에 옮겨 담은 후 바로 액체질소통에 보관하였다.
본 발명에 이용된 초저온 동결보호제는 PVS2[디메틸설폭사이드(DMSO) 15％(w/v), 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 15％(w/v), 글리세롤(glycerol) 30％(w/v), 증류수 40%(w/v)]를 사용하였다.
② 액체질소 저장
삼나무종자를 상대습도 45％를 유지하는 CaCl2 포화용액 상자에 넣어 평균종자수분함량이 7.83％로 조절한 후 10ml 크기의 초저온용 cryo-tube에 삼나무종자를 담아 뚜껑을 밀폐한 후 튜브 랙에 꽂아서 -196℃의 액체질소에 바로 넣었다.
③ 액체질소에 저장되었던 삼나무종자의 급속해동
액체질소에 저장되었던 삼나무종자가 들어가 있던 초저온용 튜브채를 꺼내는 즉시 37℃ 항온수조(water bath)에 넣어 15분간 급속 해동시켰다.
④ PEG 삼투프라이밍 처리
삼투압 농도를 -1.2MPa인 PEG8000(분자량이 8000인 PEG) 용액을 만들었다(MICHEL, B. E. (1983): Evaluation of the water potentials of solutions of polyethylene glycol 8000 both in the absence and presence of other solutes. Plant Physiology 72:66-70.).
삼투압 농도가 -1.2MPa인 PEG 용액에 각각 급속 해동시킨 삼나무종자를 넣고 15℃에서 암(暗)상태에서 3일간 회전배양기에 처리를 하였다.
<실시예 3>
① 초저온 동결보호제 처리
삼나무종자의 초저온 동결보호제 처리는 삼나무종자를 액체질소에 저장직전에 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에 넣고 25℃에서 2시간 동안 침지하였다. 침지한 후 초저온 동결보호제 용액에서 삼나무종자를 꺼내어서 바로 cryo tube에 옮겨 담은 후 바로 액체질소통에 보관하였다.
본 발명에 이용된 초저온 동결보호제는 35％ 농도의 DMSO(dimethyl sulfoxide, MeSO)를 사용하였다. DMSO는 저온에서도 급속히 침투되는 특성으로 효과가 좋은 반면 독성이 높아 부작용이 보고 되는바 저농도로 시간을 조절하였다.
② 액체질소 저장
삼나무종자를 상대습도 45％를 유지하는 CaCl2 포화용액 상자에 넣어 평균종자수분함량이 7.83％로 조절한 후 10ml 크기의 초저온용 cryo-tube에 삼나무종자를 담아 뚜껑을 밀폐한 후 튜브 랙에 꽂아서 -196℃의 액체질소에 바로 넣었다.
③ 액체질소에 저장되었던 삼나무종자의 급속해동
액체질소에 저장되었던 삼나무종자가 들어가 있던 초저온용 튜브채를 꺼내는 즉시 37℃ 항온수조(water bath)에 넣어 15분간 급속 해동시켰다.
④ PEG 삼투프라이밍 처리
삼투압 농도를 -0.4MPa인 PEG8000(분자량이 8000인 PEG) 용액을 만들었다(MICHEL, B. E. (1983): Evaluation of the water potentials of solutions of polyethylene glycol 8000 both in the absence and presence of other solutes. Plant Physiology 72:66-70.).
삼투압 농도가 -0.4MPa인 PEG 용액에 각각 급속 해동시킨 삼나무종자를 넣고 15℃에서 암(暗)상태에서 3일간 회전배양기에 처리를 하였다.
<실시예 4> 삼나무종자의 초저온 동결보호제 처리, 액체질소 저장, 급속해동, PEG 프라이밍 처리
① 초저온 동결보호제 처리
삼나무종자의 초저온 동결보호제 처리는 삼나무종자를 액체질소에 저장직전에 삼나무종자를 초저온 동결보호제 용액에 넣고 25℃에서 2시간 동안 침지하였다. 침지한 후 초저온 동결보호제 용액에서 삼나무종자를 꺼내어서 바로 cryo tube에 옮겨 담은 후 바로 액체질소통에 보관하였다.
본 발명에 이용된 초저온 동결보호제는 35％ 농도의 DMSO(dimethyl sulfoxide, MeSO)를 사용하였다. DMSO는 저온에서도 급속히 침투되는 특성으로 효과가 좋은 반면 독성이 높아 부작용이 보고 되는바 저농도로 시간을 조절하였다.
② 액체질소 저장
삼나무종자를 상대습도 45％를 유지하는 CaCl2 포화용액 상자에 넣어 평균종자수분함량이 7.83％로 조절한 후 10ml 크기의 초저온용 cryo-tube에 삼나무종자를 담아 뚜껑을 밀폐한 후 튜브 랙에 꽂아서 -196℃의 액체질소에 바로 넣었다.
③ 액체질소에 저장되었던 삼나무종자의 급속해동
액체질소에 저장되었던 삼나무종자가 들어가 있던 초저온용 튜브채를 꺼내는 즉시 37℃ 항온수조(water bath)에 넣어 15분간 급속 해동시켰다.
④ PEG 삼투프라이밍 처리
삼투압 농도를 -1.2MPa인 PEG8000(분자량이 8000인 PEG) 용액을 만들었다(MICHEL, B. E. (1983): Evaluation of the water potentials of solutions of polyethylene glycol 8000 both in the absence and presence of other solutes. Plant Physiology 72:66-70.)
삼투압 농도가 -1.2MPa인 PEG 용액에 각각 급속 해동시킨 삼나무종자를 넣고 15℃에서 암(暗)상태에서 3일간 회전배양기에 처리를 하였다.
<시험예 1>
삼나무종자에 아무런 처리를 하지 않은 군, 아무런 처리를 하지 않은 삼나무 종자를 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 군, 실시예 1에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제를 처리한 후 바로 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 다음 PEG 삼투프라이밍 처리를 하지 않은 군, 실시예 3에서 초저온 동결보호제를 처리한 후 바로 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 다음 PEG 삼투프라이밍 처리를 하지 않은 군에 대한 각각의 삼나무종자에 대한 발아율, 평균발아일수(mean germination time, MGT), 활력을 실시예 1의 ⑤발아 분석(germination analysis)에 의해 측정하고 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.
초저온저장을 하지 않은 무처리 종자의 평균발아율이 25％, 평균발아일수가 15일, GV값이 1.05 이었다. 초저온 동결보호제 처리 없이 바로 액체질소에 담근 종자는 17％의 발아율로 5％ 수준의 던컨통계분석 시 유의차 있게 감소하였다.
초저온 동결보호제의 전처리 결과 35％ 농도의 DMSO 전처리한 종자는 초저온 피해를 극복하는 효과를 보였다. 발아율이 초저온 저장을 하지 않은 무처리종자와 같은 수준의 28％까지 보였으며, 평균발아일수도 12일로 비록 통계적으로 유의차는 보이지 않았지만 무처리 종자보다 3일이나 빠르고 GV값도 3배나 높은 활력을 보였다(표 1 참조).
한편 초저온 동결보호제가 삼나무종자를 초저온 저장 후 삼나무종자의 발아에 미치는 사진을 도 5에 나타내었다.
표 1. 초저온 동결보호제의 종류에 따른 초저온저장 후 발아율, 평균발아일수, gemination value에 미치는 효과
| 처리 | 발아율(％) | MGT(일수) | GV |
| (1)무처리 | 25.0±3.83z ay | 15.14±2.44 nsx | 1.05±0.5 ns |
| (2)무처리+LNw | 17.0±2.03 b | 13.38±2.41 | 0.55±0.16 |
| (3)PVS2+LN | 13.0±3.83 b | 15.12±4.59 | 0.39±0.44 |
| (4)DMSO+LN | 28.0±2.86 a | 12.20±1.49 | 3.39±2.60 |
z평균값(4반복)±표준편차,
y항목별로 다른 글씨는 던컨의 다중검정법에서 p=0.05 (5％)수준에서 처리 간 차이가 있음을 나타냄.
xns: 유의차 없음(not significantly different)을 나타낸다.
wLN: 액체질소에서 저장(preserve in liquid nitrogen)을 나타낸다.
(1)삼나무종자에 아무런 처리를 하지 않은 군을 나타낸다.
(2)아무런 처리를 하지 않은 삼나무종자를 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 군을 나타낸다.
(3)실시예 1에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제를 처리한 후 바로 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 다음 PEG 삼투프라이밍 처리를 하지 않은 군을 나타낸다.
(4)실시예 3에서 초저온 동결보호제를 처리한 후 바로 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 다음 PEG 삼투프라이밍 처리를 하지 않은 군을 나타낸다.
<시험예 2> PEG 프라이밍 처리가 초저온저장 후 종자 발아에 미치는 효과
삼나무종자에 아무런 처리를 하지 않은 군, 아무런 처리를 하지 않은 삼나무 종자를 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 군, 실시예 1에서 초저온 동결보호제 전처리 없이 삼나무종자를 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군, 실시예 2에서 초저온 동결보호제 전처리 없이 삼나무종자를 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군에 대한 각각의 삼나무종자에 대한 발아율, 평균발아일수(mean germination time, MGT), 활력을 실시예 1의 ⑤발아 분석(germination analysis)에 의해 측정하고 그 결과를 아래의 표 2에 나타내었다.
초저온 동결보호제 전처리 없이 바로 액체질소에 저장된 종자를 파종 전에 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 결과 -0.4MPa의 PEG용액으로 프라이밍 처리로 초저온저장을 하지 않는 무처리 종자와 같은 발아율과, 평균발아일수는 5일이나 빨라지고 GV도 값도 두 배로 향상하는 효과를 보였다.
이는 앞의 시험예 1의 결과보다도 의미 있는 측면이 DMSO는 독성이 있는 물질이므로 이런 독성물질의 처리 없이 무독한 방법으로 높은 효율의 초저온저장기법의 개발로 또 다른 의미가 있다.
한편 PEG 프라이밍 처리가 삼나무종자를 초저온 저장 후 삼나무종자의 발아에 미치는 사진을 도 6에 나타내었다.
표 2. PEG 프라이밍 처리가 초저온저장 후 종자 발아에 미치는 효과
| 처리 | 발아율(％) | MGT(일수) | GV |
| (1)무처리 | 25.0±3.83z ay | 15.14±2.44 a | 1.05±0.5 nsx |
| (2)무처리+LNw | 17.0±2.03 b | 13.38±2.41 ab | 0.55±0.16 |
| (3)LN+ -0.4MPa PEGv | 25.0±3.57 a | 10.21±1.22 b | 1.93±2.15 |
| (4)LN+ -1.2MPa PEG | 15.0±2.01 b | 9.29±2.20 b | 0.60±0.06 |
z평균값(4반복)±표준편차,
y항목별로 다른 글씨는 던컨의 다중검정법에서 p=0.05 (5％)수준에서 처리 간 차이가 있음을 나타냄.
xns: 유의차 없음(not significantly different)을 나타낸다.
wLN: 액체질소에서 저장(preserve in liquid nitrogen)을 나타낸다.
(1)삼나무종자에 아무런 처리를 하지 않은 군을 나타낸다.
(2)아무런 처리를 하지 않은 삼나무종자를 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 군을 나타낸다.
(3)실시예 1에서 초저온 동결보호제 전처리 없이 삼나무종자를 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군을 나타낸다.
(4)실시예 2에서 초저온 동결보호제 전처리 없이 삼나무종자를 액체질소에 3일간 처리한 후 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군을 나타낸다.
<시험예 3>
삼나무종자에 아무런 처리를 하지 않은 군, 실시예 1에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 군, 실시예 1에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군, 실시예 2에서 삼나무종자를 초 저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군에 대한 각각의 삼나무종자에 대한 발아율, 평균발아일수(mean germination time, MGT), 활력을 실시예 1의 ⑤발아 분석(germination analysis)에 의해 측정하고 그 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
PVS2 전처리 시 초저온저장 후 발아율이 저하하였으나, 삼투프라이밍 처리로 무처리종자와 같은 활력으로 회복시키는 효과를 보였다. 또한 비록 통계상 유의차는 없었지만, 대조구보다 평균발아소요일도 빨라지고, GV도 향상되는 효과를 보였다(표 3 참조).
표 3. PVS2 초저온 동결보호제 전처리 후 초저온 저장된 종자에 PEG 농도별 프라이밍 처리가 종자발아에 미치는 효과
| 처리 | 발아율(％) | MGT(일수) | GV |
| 무처리 | 25.0±3.83z ay | 15.14±2.44 nsx | 1.05±0.5 ns |
| 대조구(PVS2+LNw처리만) | 13.0±3.83 b | 15.13±4.59 | 0.39±0.44 |
| PVS2+ LN+ -0.4MPa PEG | 22.0±2.33 a | 12.81±4.18 | 1.14±0.87 |
| PVS2+ LN+ -1.2MPa PEG | 21.0±2.00 a | 11.48±2.91 | 1.05±0.61 |
z평균값(4반복)±표준편차,
y항목별로 다른 글씨는 던컨의 다중검정법에서 p=0.05 (5％)수준에서 처리 간 차이가 있음을 나타냄.
xns: 유의차 없음(not significantly different)을 나타낸다.
wLN: 액체질소에서 저장(preserve in liquid nitrogen)을 나타낸다.
(1)삼나무종자에 아무런 처리를 하지 않은 군을 나타낸다.
(2)실시예 1에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 군을 나타낸다.
(3)실시예 1에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군을 나타낸다.
(4)실시예 2에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군을 나타낸다.
<시험예 4>
삼나무종자에 아무런 처리를 하지 않은 군, 실시예 3에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 군, 실시예 3에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군, 실시예 4에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군에 대한 각각의 삼나무종자에 대한 발아율, 평균발아일수(mean germination time, MGT), 활력을 실시예 1의 ⑤발아 분석(germination analysis)에 의해 측정하고 그 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
DMSO 초저온동결보호제 전처리 초저온 저장된 종자에 PEG 프라이밍 처리는 무처리 종자의 발아율과 차이가 없었으나, 평균발아일수가 통계적으로 유의성 있게 크게 빨라지는 효과를 보였다. GV값은 통계적으로 유의하지는 않지만 크게 향상되었다(표 4 참조).
표 4. DMSO 초저온동결보호제 전처리 후 초저온 저장된 종자에 PEG 농도별 프라이밍 처리가 종자발아에 미치는 효과
| 처리 | 발아율(％) | MGT(일수) | GV |
| 무처리 | 25.0±3.83z ay | 15.14±2.44 a | 1.05±0.5 nsx |
| 대조구(DMSO+LNw처리만) | 28.0±2.86 a | 12.30±1.49 b | 3.39±2.60 |
| DMSO+LN+-0.4MPa PEG | 28.0±2.86 a | 7.62±0.51 c | 3.06±2.19 |
| DMSO+LN+-1.2MPa PEG | 19.0±3.87 b | 12.03±2.44 b | 0.88±0.61 |
z평균값(4반복)±표준편차,
y항목별로 다른 글씨는 던컨의 다중검정법에서 p=0.05 (5％)수준에서 처리 간 차이가 있음을 나타냄.
xns: 유의차 없음(not significantly different)을 나타낸다.
wLN: 액체질소에서 저장(preserve in liquid nitrogen)을 나타낸다.
(1)삼나무종자에 아무런 처리를 하지 않은 군을 나타낸다.
(2)실시예 3에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 군을 나타낸다.
(3)실시예 3에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군을 나타낸다.
(4)실시예 4에서 삼나무종자를 초저온 동결보호제 전처리 한 후 액체질소에 3일간 처리한 다음 해동시킨 후 PEG 삼투프라이밍 처리를 한 군을 나타낸다.
상기 시험예 1 내지 시험예 4의 결과에서처럼 본 발명은 삼나무종자를 초저 온저장시 초저온 동결보호제를 이용하여 삼나무종자를 처리한 후 액체질소에 저장 및 해동한 다음 PEG를 이용한 삼투프라이밍 처리를 실시함으로써 삼나무종자의 활력을 복원시켜 발아율을 증진시킴으로서 삼나무의 복원율을 높일 수 있는 기술을 제공할 수 있어 산림자원의 하나인 삼나무의 보존에 크게 기여할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은 과거 -40℃까지 서서히 동결해야하는 고가의 동결장비를 필요로 하는 단점을 보완한 간편하고 저렴한 원 스텝(one step) 동결법으로 상온저장시 2～3년 내 종자의 발아력을 상실하고, 초저온저장이 불가능한 유류종자의 장기저장을 가능하게 할 수 있다.
한편 본 발명은 삼나무종자를 초저온저장 후 종자의 활력을 복원시켜 발아율을 증진시킴으로서 유전자원의 복원율을 높일 수 있는 기술로 산림유전자원의 보존에 크게 기여할 수 있다.
도 1은 삼나무종자를 초저온 동결보호제로 전처리하는 사진이다.
도 2는 액체질소 탱크속으로 삼나무종자를 초저온 저장하는 사진이다.
도 3은 액체질소로 초저온 저장된 삼나무종자를 급속 해동하는 사진이다.
도 4는 초저온저장 후 급속 해동된 삼나무종자를 PEG 삼투용액처리 한 사진이다.
도 5는 본 발명에서 초저온 동결보호제 전처리로 초저온저장 후 삼나무종자가 액체질소에 저장하지 않은 무처리 종자의 발아와 같은 발아율을 보이는 효과를 보여주는 사진이다.
도 6은 초저온저장 후 해동된 종자에 발아에 PEG 프라이밍 처리를 함으로써 발아율이 회복되는 효과를 보여주는 사진이다.
Claims (8)
- 삼나무종자를 30～35％ 농도의 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 디메틸설폭사이드(DMSO) 10～20％(w/v), 에틸렌글리콜 10～20％(w/v), 글리세롤 20～40％(w/v) 및 잔부의 물로 이루어진 초저온 동결보호제 용액에 20～25℃에서 1～3시간 동안 침지시킨 후 액체질소에 저장하는 단계;상기의 액체질소에 저장한 삼나무종자를 해동시키는 단계; 및상기의 해동한 삼나무종자를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액에 침지하되, 해동한 삼나무종자의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액에의 침지는 10～20℃의 암상태에서 2～4일간 회전배양기에서 실시하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 삼나무종자의 초저온 저장방법.
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- 제1항에 있어서,액체질소는 -200℃～-190℃ 온도의 액체질소인 것을 특징으로 하는 삼나무종자의 초저온 저장방법.
- 제1항에 있어서,해동은 30℃～40℃의 항온수조(water bath)에 넣고 10～20분 동안 급속해동 시키는 것 임을 특징으로 하는 삼나무종자의 초저온 저장방법.
- 제1항에 있어서,폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액은 삼투압농도가 -0.4MPa～-1.2MPa인 것을 특징으로 하는 삼나무종자의 초저온 저장방법.
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