JP2014529083A - 定量マイクロ流体デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2011年9月27日に出願された米国仮特許出願第61/539,714号明細書、および2011年11月4日に出願された米国仮特許出願第61/555,977号明細書の利益および優先権を主張し、これらの内容はそれぞれ参照により本明細書に援用される。
材料
ALTアッセイ:
アラニン溶液:1M L−アラニン(Sigma Aldrich)、30mM α−ケトグルタル酸(Sigma Aldrich)、2mM KH2PO4(Sigma Aldrich)、20mM MgCl2(Sigma Aldrich)、2mMチアミンピロリン酸(MP Biosciences)、2mM 4−アミノアンチピリン(Sigma Aldrich)および25U/mL(0.1mg/mL)ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)(Sigma Aldrich)を含有する溶液は、200mMトリス緩衝液(pH=7.4)に溶解して調製した。
PVA溶液:2wt%PVA(87〜90%加水分解、MW=13,000〜23,000g/mol、Sigma Aldrich)および0.05%Triton X 100(Sigma Aldrich)を含有する溶液は、DI水に溶解して調製した。
デバイス製造
デバイスのパターンは、Adobe Illustrator CS3を使用して設計した。1枚のWhatman No.1クロマトグラフィー紙シート(8.5×11”)をレーザープリンタ(HP Color Laserjet 4520)に供給し、ALTゾーンと位置が合うように、シートの背面に黄色ストライプを印刷した。黄色ストライプの反対側にワックスが印刷されるように、このシートにデバイスの最上層(デバイスが読み取られる層)のワックスパターンを、Xerox 8560DNプリンタを使用して印刷した。ワックスが確実に紙の厚み全体にわたって移動するように、シートを150℃のオーブンで30秒間加熱した。Xerox 8560DNプリンタを使用して、デバイスの最下層(フィルタが接着される層)のワックスパターンをWhatman No.1クロマトグラフィー紙に印刷した。ワックスが確実に紙の厚み全体にわたって移動するように、このシートも150℃のオーブンで30秒間加熱した。
84%(w/v)NaCl、4%(w/v)NaHCO3、2%(w/v)KCl、2%(w/v)Na2HPO43H2O、3%(w/v)MgCl26H2O、3%(w/v)CaCl2、1%(w/v)Na2SO4、および7%(w/v)ウシ血清アルブミンを含有する人工血漿緩衝液は、DI水に溶解して調製し、pHを7.4に調節した。ALTとASTの両方の0U/L、40U/L、120U/L、200U/L、および400U/L含有保存溶液は、人工血漿緩衝液に溶解して調製した。これらの溶液各30μLを5つの個々のデバイスに添加した。デバイスを15分間反応させ、デスクトップスキャナ(Canon)を使用して走査した。得られた画像(図14)は、ALTアッセイではALTの増加に伴い黄色から赤色への色の諧調を示し、ASTアッセイではASTの増加に伴い暗青色からピンク色への色の諧調を示した。
標準的な統計的手法を使用して、ASTおよびALTのアッセイに関する検出限界(LOD)曲線を作成した。画像をデジタル化するデスクトップスキャナおよび値を得るための解析ソフトウェア(ImageJ)を使用することにより、各ゾーンの色強度を定量化した。LFTの出力信号対緩衝液試料(各濃度につきN=7)中のASTまたはALTの濃度の較正プロットを図15に示す。ASTに関して、実線はヒルの式:I=Imax[L]n/([L]n+[L50]n){式中、Imax=105.7、[L50]=260.9U/L、n=1.72、およびR2=0.99}の非線形回帰を表す。エラーバーは1標準偏差(σ)を表す。ALTに関して、実線はヒルの式:I=Imax[L]n/([L]n+[L50]n){式中、Imax=126.5、[L50]=331.33U/L、n=1.04、およびR2=0.96}の非線形回帰を表す。エラーバーは1標準偏差(σ)を表す。これらのアッセイでは両方とも、シグモイド曲線の直線部分がほぼ40〜200U/Lの濃度範囲に入る。算出されたLODは、ALTアッセイでは53U/L、ASTアッセイでは84U/Lであった。これらの値は、正常レベルと比較したとき、視認可能な変色を生じさせたALTおよびASTの最低濃度とよく一致した。
紙基材のトランスアミナーゼ検査の再現性を評価するために、正常レベルおよび高レベルのASTおよびALTを含有する試料で色強度を測定した(スキャナ/ImageJ解析)。合計10個のデバイスを使用して、各試料を測定した。各試料に関して、標準偏差を平均値で割ったものと定義される変動係数(%CV)から変動を調べた。結果(表1)から、AST検査とALT検査の両方とも、検査した4つの状態(高い/正常な血清および血液)全てにおいてCVが10%未満であったことが分かる。
検査の線形性は、既知の量(0、40、60、80、100、120、150、180、200、300、および400U/L)の精製されたALTおよびASTを新鮮な全血(静脈穿刺により入手)に添加し、ピペットで血液30μLをデバイスに移し、15分後に観察された色反応をデスクトップスキャナを使用してデジタル化することにより、評価した(図17)。画像解析ソフトウェア(ImageJ,NIH)を使用して各走査ゾーンで得られた色強度を定量値に翻訳した。これらの値を実際の濃度に対してプロットし、検量線(図16)を得た。両アッセイに関して、臨床上重要な範囲(40〜200U/L)で強い線形性が認められた。ALTプロットおよびASTプロットに関してそれぞれ、Rの二乗値0.95および0.98が測定された(各データ点につきN=3、エラーバーは+/−1の標準偏差を表す)。
所与の試料で測定された値を適切なビン(<3x×ULN(0〜119U/L)、3〜5x×ULN(120〜200U/L)、または>5x×ULN(>200U/L)に適正に分類する読み取り装置の能力に関する紙基材のトランスアミナーゼ検査の確度を評価するために、1組の臨床標本の検査を行った。これらの実験では、通常の臨床検査のために事前の5時間以内に患者から同時に(それぞれ、標準EDTA含有および血清分離器管に)採血された、対の全血標本と血清標本を30μLずつ検査したが、それに関して、血清標本の自動トランスアミナーゼ検査(Roche Modular Analytic System)の結果が入手可能であった(注目すべきことには、以前の検査からEDTAは紙基材でのアッセイに干渉しないことが分かった)。各紙アッセイは15分後に、自動検査の結果に盲目である3人の独立した読み取り者により目視で読み取られ;それぞれ独立して検査ゾーンの色を、読み取りガイドに記載の最も近い色/値に一致させ、結果をU/Lで記録した(最も近い10U/Lに丸めた)。
フィンガースティック法で得られた全血でのデバイスの性能を観察するために、実験を行った。小規模試験で、10人の健常被験者がそれぞれランセット(SurgiLance(商標)SLN300)を使用して指から血液の小滴(約30μL)を得、それをデバイス(例えば、図1に示す)に導入した。10/10のデバイスが十分に作動する、即ち、全てのゾーンが血漿で濡れ、全ての対照領域が適切に機能することが判明した。予想通り、この群では、ASTレベルおよびALTレベルは正常範囲(<60U/L)内であることが判明した。
本明細書で参照する特許文献および科学論文はそれぞれ、その開示内容全体があらゆる目的で参照により援用される。
本発明の精神またはその本質的特徴から逸脱することなく他の特定の形態でも本発明を具体化することができる。従って、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明に限定するものではなく、あらゆる点で本発明を説明するものと見なされるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の詳細な説明ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲に入る全ての変更は本明細書に包含されるものとする。
Claims (45)
- 生物液体試料中の検体を定量するための検査デバイスであって、
液体試料注入領域;
比色検査読み取り領域;
前記試料を吸収すると所定の色を維持または表示する陰性対照領域;
陽性対照領域、ならびに
前記注入領域への液体試料の塗布に応答して、液体を前記注入領域と前記読み取り領域および対照領域との間で輸送する液体流路;
を含む複数の機能領域を画定する多孔質親水性シート;
を備えるデバイスであり、
前記デバイス内に、前記試料中の検体の濃度に応じて前記読み取り領域に色のシェードまたはパターンを生じさせるように構成されている少なくとも1種の乾燥発色試薬が配置されており;
前記デバイス内に、前記陽性対照領域で反応して発色する乾燥発色試薬が配置されており;
検査の有効性が前記陽性対照領域の変色および前記陰性対照領域における所定の色の維持または表示により示されるデバイス。 - 生物液体試料中の検体を定量するための検査デバイスであって:
液体試料注入領域;
読み取り領域の背景となる色の領域を含む比色検査読み取り領域であって、前記背景となる色が前記読み取り領域で呈される色と光学的に相互作用して、塗布された試料中の異なる検体濃度の視覚的識別を改善する比色検査読み取り領域;
比色対照領域;
前記注入領域と、前記読み取り領域と対照領域の両方との間で液体を輸送する液体流路;
を含む複数の機能領域を画定する多孔質親水性シート
を備えるデバイスであり、
前記デバイス内に、前記注入領域への液体試料の塗布に応答して、運ばれ、前記試料中に検体が存在する場合、検体と反応し、試料中の検体の濃度に応じて前記読み取り領域に色のシェードを生じさせる乾燥発色試薬が配置されているデバイス。 - 互いに平行に配置された複数のシートを備え、その少なくとも2枚が前記シート間の液体流動連通を可能にする開口部を画定する液体不透過性バリア層により分離されている、請求項1または2に記載のデバイス。
- 前記読み取り領域の背景となる色の領域を備え、前記背景となる色が前記読み取り領域で呈される色と光学的に相互作用して、塗布された試料中の異なる検体濃度の視覚的識別を改善する、請求項1に記載のデバイス。
- 前記発色試薬が肝臓酵素と反応する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記試料が、高濃度のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、またはこれらの混合物を含有すると思われる血液試料である、請求項5に記載のデバイス。
- 湿潤時に乾燥時とは異なる外観を有する、前記シートに塗布された有色領域を備える陰性対照領域を備える、請求項1〜6のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記読み取り領域が、前記発色試薬により生成する有色種を捕捉する固定化バインダを備える前記シートの一領域を備え、前記試料中の検体の濃度が前記注入領域への液体の塗布に応答して呈色する前記領域の部分により示される、請求項1〜7のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記領域が連続的であり、前記試料中の検体の濃度が前記連続領域内の直線状の呈色範囲により示される、請求項8に記載のデバイス。
- 前記領域が複数の別個の領域を備え、前記試料中の検体の濃度が呈色する領域に数により示される、請求項8に記載のデバイス。
- 試料の塗布後、所定の時間間隔にわたり液体が供給され、リザーバが充填されてデバイスを読み取る準備が整っているという表示を備える、前記注入領域と液体連通している前記デバイス内に配置されたリザーバを備えるタイマーを画定する領域をさらに備える、請求項1〜10のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記タイマーは、液体が前記リザーバに到達し、前記表示を作動させるのに所要する、時間の長さを決定する所定の寸法のチャネルを備える、請求項11に記載のデバイス。
- 前記表示は、デバイスを読み取る準備が整っているときに視認可能な、印刷されたメッセージである、請求項11に記載のデバイス。
- 前記タイマーが陽性比色対照領域としても機能する、請求項11に記載のデバイス。
- 前記リザーバが前記読み取り領域の下流に配置されている、請求項11に記載のデバイス。
- 前記試料注入領域の下流に配置されたフィルタをさらに備える、請求項1〜15のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記発色試薬の下流且つ前記比色検査読み取り領域の上流に、前記検体と前記発色試薬との混合物を輸送する滞留領域をさらに備え、前記滞留領域は流動を妨げる疎水性表面を含む多数のマイクロ流路を備え、前記マイクロ流路の数および寸法は、前記混合物が通過する時、インキュベーション時間を所定の時間間隔内に設定する役割を果たす、請求項1〜16のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記滞留領域に、液体が前記滞留領域を通過する速度を遅らせる疎水性材料が含浸されている、請求項17に記載のデバイス。
- 前記シートの表面に疎水性材料を印刷し、前記疎水性材料が前記シートの細孔に吸収されるように加熱することにより前記滞留領域を形成する、請求項18に記載のデバイス。
- インキュベーション中、前記滞留領域で形成された複合体を捕捉するために、前記比色検査読み取り領域に固定化バインダをさらに備える、請求項17〜19のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記流路に沿って液体を吸引し、前記滞留領域および比色検査読み取り領域を通過させ、それにより前記比色検査読み取り領域から未結合の有色種を除去するために、前記比色検査読み取り領域の下流に吸着性リザーバをさらに備える、請求項17〜20のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記滞留領域を画定する平行に配置されたシートと流体連通している前記乾燥発色試薬を保持するシートをさらに備える、請求項17〜21のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記デバイスの次の要素:乾燥発色試薬を保持する領域;試料注入領域;比色検査読み取り領域;滞留領域;および吸着性リザーバ;の少なくとも2つが単一の前記多孔質親水性シート上に画定されている、請求項17〜22のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記シート間の液体流動連通を可能にする開口部を画定する前記バリア層を備えるパターニングされた接着剤層を備える、請求項3に記載のデバイス。
- 前記試料注入領域と前記読み取り領域が異なる前記シート上に配置されている、請求項3に記載のデバイス。
- 前記読み取り領域と前記乾燥発色試薬が異なる前記シート上に配置されている、請求項3に記載のデバイス。
- 前記読み取り領域の色を検体濃度に関連付けるカラーチャートをさらに備える、請求項1〜26のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記カラーチャートが前記シートと一体化されている、請求項27に記載のデバイス。
- それぞれの異なる乾燥発色試薬を使用する複数の読み取り領域を備える、請求項1〜28のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記流路が、液体流動の輸送方向を定め、前記親水性シートの厚みに実質的に浸透する液体不透過性境界により画定されている1本の親水性チャネルまたは親水性チャネルのパターンを備える、請求項1または2に記載のデバイス。
- 前記注入領域と液体流動連通している1つまたは複数の電極を備える電極アセンブリをさらに備える、請求項1または2に記載のデバイス。
- 生物液体試料中の1種または複数種の検体を測定するための検査デバイスの製造方法であって:
a.吸収性流動輸送を支持する第1の多孔質親水性シートを提供する工程;
b.前記多孔質シートの厚みに浸透し各要素を画定する疎水性バリアのパターンをそれぞれ備える検査デバイス要素の配列を前記シートに印刷する工程であって、そのそれぞれが:
液体流路;および
比色検査読み取り領域;
を含む複数の機能領域を備える工程;
c.前記第1のシートに第2の多孔質親水性シートをラミネートして、ラミネートを形成する工程;および
d.前記ラミネートを打ち抜いて個々の前記要素に分離し、多数の機能性検査デバイスを形成する工程;
を含む方法。 - 工程dの前に、前記検査デバイス要素のそれぞれに試薬をロボットでピペッティングする工程をさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 前記第2の多孔質親水性シートに試薬を付着させる工程をさらに含む、請求項32または33に記載の方法。
- 前記シート間の流体流動連通が実現するように構造部材を見当合わせするため、工程cの前に前記第1のシートと前記第2のシートを位置合わせする、請求項32〜34のいずれか一項に記載の方法。
- フィルタ要素の配列を画定する第3のシートを提供する追加の工程、および、前記第3のシートを前記第1および第2のシートにラミネートして、前記検査デバイス要素の関係する前記液体流路と流体連通しているフィルタ要素を位置決めする追加の工程をさらに含む、請求項32〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 工程cが前記第1のシートと前記第2のシートとの間に液体不透過性層を設ける工程を含む、請求項32〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体不透過性層が前記シートに粘着する、請求項37に記載の方法。
- 前記液体不透過性層を設ける工程が、接着剤をある一定のパターンでシートに塗布する工程を含む、請求項37または38に記載の方法。
- シートの表面の一領域に所定の濃度のインクを印刷することにより塗布し、前記インクを前記シートに浸透させ、前記インクを硬化させて、前記インクにより画定された流動を妨げる疎水性表面を含む多数のマイクロ流路を備える滞留領域を形成する工程をさらに含み、前記マイクロ流路の数および寸法は液体試料が前記滞留領域を通過する所定の時間間隔を設定する役割を果たす、請求項32〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シートの表面に比較的高密度の前記インクを印刷することにより塗布して、流路の境界を画定し、前記インクを前記シートに浸透させ、インクを硬化させて、前記滞留領域と流体連通する液体流路を画定する液体不透過性バリアを形成する追加の工程をさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 前記シートを、吸収性流動輸送を支持し、少なくとも一部が前記シートと液体連通している少なくとも1枚の追加の多孔質親水性シートにラミネートし、前記追加のシートが流路;比色検査読み取り領域;複合体を捕捉するための検査部位の固定化バインダ;第2の滞留領域;液体試料入口;対照部位;乾燥発色試薬リザーバ;吸着性リザーバ;および試料分割層からなる群から選択される少なくとも1つの要素を画定する追加の工程をさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 前記シートの表面に比較的高密度の前記インクを印刷することにより塗布し、流路;比色検査読み取り領域;複合体を捕捉するための検査部位の固定化バインダ;第2の滞留領域;液体試料入口;対照部位;乾燥発色試薬リザーバ;吸着性リザーバ;および前記シートと液体連通している試料分割層からなる群から選択される少なくとも1つの要素の境界を画定し、前記インクを前記シートに浸透させ、前記インクを硬化させて、前記要素の境界を画定する液体不透過性バリアを形成する追加の工程をさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 前記滞留領域と流体流動連通しているフィルタまたは発色試薬リザーバを設ける追加の工程を含む、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シートの表面の複数の領域に所定の濃度のインクをある特定の配列で印刷することにより塗布し、前記滞留領域の配列を形成し、前記シートを、吸収性流動輸送を支持し、少なくとも一部が前記シートと液体連通している少なくとも1枚の追加の多孔質親水性シートにラミネートし、前記追加のシートが流路;比色検査読み取り領域;複合体を捕捉するための検査部位の固定化バインダ;第2の滞留領域;液体試料入口;対照部位;乾燥発色試薬リザーバ;吸着性リザーバ;および試料分割層からなる群から選択される少なくとも1つの要素の対応する配列を画定する工程を含む、請求項40〜44のいずれか一項に記載の方法。
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