JPH04232861A - 簡易酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、簡易酵素免疫測定法に
関し、詳しくは試料中の分析対象物の有無を判定する特
異的な結合反応を用いる分析方法を応用して分析対象物
を簡便で迅速かつ特異的に検出する方法に関する。本発
明の対象とされる試料としては、例えば血清、血漿、全
血、尿、糞便などすべての生物学的流体及びその産物が
ある。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応を用いる免疫診断は、臨床
的に非常に有用であり、認知されてきている。すなわち
、人体のある疾病において、特異的なタンパク質を検出
することにより当該疾病の発見、診断を行うことができ
る。

【０００３】現在、免疫診断方法として酵素、アイソト
ープ、蛍光物質等を使用した定量的な検出方法と、赤血
球凝集反応やラテックス凝集反応を利用した定性的な検
出方法が広く用いられている。前者の方法は感度も良く
、定量できるという利点がある反面、特別の施設、測定
機器を要する上に操作が煩雑であるという欠点がある。 すなわち、測定上のバックグラウンドを押さえるために
未反応物質を洗浄、除去する操作が必要不可欠となる。 さらに、抗体もしくは抗原、酵素もしくはアイソトープ
を標識した特異的タンパク質、増感させるための基質、
反応停止液等の数種の試薬を必要とする。これに対して
後者の方法は特別の施設、測定機器を必要とせず、簡便
な方法であるが、凝集像の判定に測定者の主観が入り、
正確に判定することができず、信頼性に欠けるばかりで
なく、得られた結果を保存できないという欠点がある。

【０００４】そのため、特別な施設、機器、試薬等を必
要とせず、簡便かつ迅速で、検査に必要な感度を有して
おり、保存が可能で再現性の良い結果を得ることができ
る検査方法が望まれている。

【０００５】本発明者らはさきに試料中の分析対象物の
有無を判定する特異的な結合反応を用いる分析方法にお
いて、分析対象物と特異的に反応する抗体を含有する試
験片を装着した上部基材と、金属コロイド粒子を標識し
た分析対象物と特異的に反応する物質を含有する多孔性
かつ弾力性を有する部材を設けた下部基材よりなる分析
器具の試験片と多孔性かつ弾力性を有する部材のいずれ
か一方もしくは両方に分析対象物を滴下し、次いで上部
基材と下部基材とを前記試験片と多孔性かつ弾力性を有
する部材とが接合するように圧着させることにより反応
せしめ、しかる後接合面を分離し、試験片上に結合した
金属コロイド粒子により特定物質の有無を検出すること
を特徴とする分析方法並びに上部基材と下部基材よりな
る分析器具であって、上部基材の中央部に１又は複数個
の試験片装着部を設け、該試験片装着部に対応する下部
基材の位置に分析対象物と特異的に反応する物質を含有
させるための多孔性かつ弾力性を有する部材を設けたこ
とを特徴とする分析器具を完成し、これを平成２年１０
月２６日付で出願した。（特願平２−２８７１４２）し
かしながら、金属コロイドを標識とする方法は、簡便か
つ迅速に特異的タンパク質を検出する方法としては極め
て優れているが感度及び着色の点で十分満足するもので
はなかった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、こ
の分析器具を用いて金属コロイド粒子の代りに酵素、標
識抗体を利用することにより、感度に優れ、着色が明瞭
で簡便かつ迅速に特異的タンパク質を検出する方法を見
出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は試料中の分析対象物の
有無を判定する特異的な結合反応を用いる分析方法にお
いて、分析対象物と特異的に反応する抗体を含有する試
験片を装着した上部基材と、酵素を標識した分析対象物
と特異的に反応する抗体を含有する多孔性かつ弾力性を
有する部材を設けた下部基材よりなる分析器具を用い、
この多孔性かつ弾力性を有する部材に分析対象物を滴下
し、次いで上部基材と下部基材とを前記試験片と多孔性
かつ弾力性を有する部材とが接合するように圧着させる
ことにより反応せしめ、しかる後接合面を分離し、試験
片上に発色基質を滴下し、反応物を発色せしめ、その着
色により、分析対象物の有無を高感度で判定することが
できることを見出し、本発明を完成させた。

【０００８】本発明の方法と器具の基本原理は、上部（
反応相）と下部（反応試薬と分析対象物の混合物）を圧
着させることにより反応を行い、次いで分離することに
より反応を終了させ、この反応生成物に発色基質を滴下
し、発色させ、可視的に分析対象物の有無を判定するも
のである。

【０００９】したがって、本発明は朱肉と印鑑の関係を
応用したものとみることができ、朱肉に相当する部位で
ある下部には反応試薬を保持し、印鑑に相当する部位で
ある上部には試験片を有することに特色がある。すなわ
ち、上部の試験片と下部の反応相を圧着させることによ
り反応相の多孔性かつ弾力性を有する部材中に含まれて
いる試薬（分析対象物と特異的に反応する物質）が浸出
し、試験片との間で反応が行われ、次いで上部と下部を
分離することにより、試薬の過剰量が多孔性かつ弾力性
を有する部材中に再度吸収され、特異的に反応した成分
のみを試験片上に残存させ、さらに発色基質を滴下し、
酵素反応による着色により分析対象物の有無を判定する
ものである。このような反応形式から、本発明の方法は
抗原抗体反応を用いた免疫圧着測定法（イムノスタンプ
法）と呼称される。

【００１０】本発明の分析器具を図面により説明すると
、第１図と第２図は本発明の分析器具の１態様を示した
もので、第１図は該器具の全体見取図であり、第２図は
該器具の断面図である。

【００１１】図示した如く、本発明の分析器具は上部基
材（１）と下部基材（２）より主として構成され、これ
らは接続部位（３）により接続している。基材（１）の
中央部には１又は複数個の試験片（５）を装着する部位
（４）が設けてある。試験片には、試料中の分析対象物
と特異的に反応する抗体が含まれている。なお、この部
位（４）は後記する反応相と試験片が密着できるように
基材（１）表面より突出させることが望ましい。

【００１２】一方、基材（２）には試薬を含浸させるた
めの多孔性かつ弾力性を有する部材（好適には、スポン
ジ様物質）（６）が内蔵されている。ここで部材（６）
の位置は前記試験片装着部位に対応する位置とすること
が必要である。部材（６）を内蔵させる態様は任意であ
り、例えば、図示したように、基材（２）を底部（７）
、側壁（８）及び開口を有する上部（９）よりなる空室
状に形成したり、所定の厚みを有する基材上面の一部を
穿って窪みを形成したりして部材（６）を内蔵させるス
ペースを設ける。

【００１３】多孔性かつ弾力性を有する部材は、液体状
もしくは凍結乾燥状態の試薬並びに液体状の試料を含浸
、保持する能力を有し、かつ基材（１）と基材（２）を
圧着させたとき、その内容物を容易に排出、分散させる
性質を有するものである。また、基材（１）と基材（２
）を分離させた場合に、物理作用により排出されていた
内容物を再吸収し、試験片もしくは基材（２）上に残存
させない性質を有している。

【００１４】基材（１）と基材（２）の圧着又は分離を
確実に行わせるために、基材（１）には止め口（１０）
を、基材（２）にはツメ（１１）をそれぞれ設けること
が望ましい。これらを接合することにより基材（１）と
基材（２）を密着させて目的とする反応を確実に行わせ
ることができる。

【００１５】基材（１）と基材（２）の材質は適宜決定
すればよいが、製作上の利点を考慮すると、接続部位（
３）を含め合成樹脂とし、一体成形により製造すること
が好ましい。

【００１６】次に、本発明において使用できる抗体とし
てはポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体いず
れにおいても好適である。

【００１７】また、本発明において使用できる酵素標識
物の酵素としては様々のものがあるが、その中でペルオ
キシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクト
シダーゼ、グルコースオキシダーゼ等が特に好適である
。

【００１８】抗体に酵素を標識する方法にはいくつかの
方法があるが、各々に課せられた最も重要な条件は１）
酵素及び抗体の活性低下をおこさない。２）結合が安定
で長期間の保存に耐えること。３）なるべく操作が煩雑
でなく、容易に標識抗体が得られることなどである。こ
れらの条件を満すものとして現在までに開発されてきた
酵素標識法は大きく分けて２種に分類できる。その１つ
は酵素と抗体とを化学的に結びつける方法であり、グル
タールアルデヒド法（Ｓ．Ａｖｒａｍｅａｓ，Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍｓｔｒｙ，６，４３，１９６９）や過ヨウ
素酸酸化法（Ｐ．Ｋ．Ｎａｋａｎｅ，Ａ．Ｋａｗａｏｉ
，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，　２２
，１０８４，１９７４）はこれに該当する。もう一つは
抗体等を仲立ちとして酵素と第一抗体を結ぶ方法であり
、この方法ではアビジン−ビオチン法（Ｓ．Ｍ．Ｈｓｕ
，Ｌ．Ｒａｉｎｅ，Ｈ．Ｆａｎｇｅｒ，　Ａｍ．Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，７５，７３４−７３８，１９
８１）が知られている。本発明においてはいずれの標識
法を用いても測定が可能である。

【００１９】本発明に用いられる標識抗体の作製の一態
様として、たとえば、ペルオキシダーゼで標識した抗体
を得る方法が知られている。詳しくはペルオキシダーゼ
のアミノ基をすべて１−フルオロ−２，４−ジニトロベ
ンゼン（ＦＤＮＢ）によりブロックし、次いでジニトロ
ベンゼン化されたペルオキシダーゼの糖の部分の隣接水
酸基を過ヨウ素酸で切断し、アルデヒド基を新生する。 過剰の過ヨウ素酸はエチレングリコールを加えて不活性
化し、反応を停止する。

【００２０】次に０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ９．５）で透析した後、新生したアルデヒド基と抗体
のアミノ基とを反応させると、シッフ塩基が形成される
。次いでシッフ塩基の反応成績体を化学的に安定化する
ために水素化硼素ナトリウムで還元する。還元後、過剰
の水素化硼素ナトリウムを透析により除去すると所望の
酵素標識抗体が得られる。さらに、得られたこの標識抗
体をゲル濾過にて精製し、使用するのが好ましい。

【００２１】また発色基質としては、ペルオキシダーゼ
の場合には過酸化水素と３，３′−５，５′−テトラメ
チルベンチジンおよび３，３′−ジアミノベンチジンが
用いられ、またアルカリフォスファターゼの場合はブロ
モ−クロロインドールホスフェイトニトロ−プル−テト
ラゾリウム原体が用いられる。

【００２２】さらに発色剤の反応条件としては通常の酵
素反応と同様でよく、特に温度については規定はしない
が、室温で行なうのが最も好ましい。

【００２３】次に、試験片の作製法について述べる。前
述のように、試験片には分析対象物と特異的に結合する
抗体が含浸してあるが、試験片の素材としては、例えば
活性化されたニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン
（ＰＶＤＦ）、ナイロン６６等の多孔性膜が好適である
。これら膜の切片に第１の領域として分析対象物を特異
的に結合する物質（例えばモノクロナール抗体、抗原な
ど）を、第２の領域として対照の物質、すなわち酵素標
識抗体と結合する物質（例えば分析対象物、抗マウスＩ
ｇＧなど）を含浸させ、室温で１晩反応させて固相化を
行う。

【００２４】この試験片が被検試料や反応試薬により非
特異的吸着することを防止するため、膜表面の物質が吸
着している部分以外をスキムミルクやウシ血清アルブミ
ン等でマスキングし、乾燥させる。

【００２５】本発明の分析器具を用いて検査する場合の
検査結果の表示方法は任意であり、例えば、分析対象物
が陽性の場合は＋，◎，‖，・・などで表示し、陰性の
場合は−，●，｜，・などで表示することにより器具が
正常に作動しているか否かを明確にすることができる。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例により詳しく説明する
。

【００２７】実施例１ ヒトヘモグロビンの測定 〈抗ヒトヘモグロビンポリクロナール抗体の精製〉活性
化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製〉にヒトヘモグ
ロビンを結合したヘモグロビン−セファロースカラム（
５ｍｌ）を５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
した。次にヤギ抗ヒトヘモグロビン抗体（医学生物学研
究所社製）１ｍｌを同ホウ酸緩衝液１ｍｌに混合し、カ
ラムに吸着させた。その後、同ホウ酸緩衝液にて洗浄後
、０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出を行
なった。２８０ｎｍの吸光値により活性画分を集め、６
０％飽和硫安を加えた。懸濁液を３０００ｒｐｍ　で３
０分間遠心分離を行ない、沈査を集め、ＰＢＳで４℃、
一晩透析を行なった。その結果、精製抗ヒトヘモグロビ
ンポリクロナール抗体６ｍｇを得た。

【００２８】〈抗ヒトヘモグロビン抗体固相化シート〉
固相化シートとしてニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ社製、０．４５μｍ）を使
用した。第１の領域として、精製抗ヒトヘモグロビンポ
リクロナール抗体をＰＢＳにて０．５ｍｇ／ｍｌ濃度に
なるように調製したものをニトロセルロースシートに垂
直方向に印字した。第２の領域として同一シート上にウ
サギ抗ヤギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製）をＰＢＳで０．
５ｍｇ／ｍｌに調製したものを平行方向に印字し、室温
にて１晩反応させ、固相化した。

【００２９】これをスキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）を
ＰＢＳにて３％濃度に調製したものを３７℃にて３時間
含浸させ、マスキングを行ない乾燥させたものを抗ヒト
ヘモグロビン抗体固相化シートとした。

【００３０】〈ペルオキシダーゼ標識抗ヒトヘモグロビ
ン抗体の作製〉西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社
製、グルードＩＣ）５ｍｇに対し、０．３Ｍ重炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ８．１）を１ｍｌを加え、溶解する
。その後、１％１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼ
ン（メルク社製、ＦＤＮＢ）・エタノール溶液０．１ｍ
ｌを加え、室温で１時間反応させる。

【００３１】アミノ基をブロックしたＤＮＰ−ペルオキ
シダーゼに０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１ｍｌをさ
らに加え、室温で３０分間反応させる。過剰の過ヨウ素
酸は０．１６Ｍエチレングリコール１ｍｌを加え、室温
で１時間撹拌し、分解する。その後、０．０１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を用い、４℃で１夜透析
を行ない、ＤＮＰ−アルデヒド−ペルオキシダーゼ反応
成績体を得る。

【００３２】一方、精製抗ヒトヘモグロビン抗体はあら
かじめ５ｍｇ／ｍｌになるように０．０１Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９．５）で調製し、１ｍｌを同緩衝液
にて４℃で１夜透析を行なう。

【００３３】ＤＮＰ・アルデヒド−ペルオキシダーゼ反
応成績体と精製抗ヒトヘモグロビン抗体を混合し、室温
で３時間反応させる。反応後、水素化硼素ナトリウム５
ｍｇを加え４℃で１夜放置する。さらに０．８５％塩化
ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７．１）にて、４℃で１夜透析する。

【００３４】得られたペルオキシダーゼ標識抗ヒトヘモ
グロビン抗体はそのままでも使用できるが、好ましくは
未反応物質を除くため、以下の処理を行なう。

【００３５】すなわち、あらかじめ０．８５％塩化ナト
リウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．１）で平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（
２．６ｃｍ×１００ｃｍ、ファルマシア社製）によるゲ
ル濾過により精製を行ない、２８０ｎｍと４０３ｎｍの
２波長の吸収のある画分を集め、精製ペルオキシダーゼ
標識抗ヒトヘモグロビン抗体を得る。

【００３６】〈発色剤〉０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（
ｐＨ７．２）２０ｍｌ中に、３，３′−ジアミノベンチ
ジン１０ｍｇ、３０％過酸化水素１０μｌを加え発色剤
とした。

【００３７】ヒトヘモグロビンの検出方法基材（１）の
部位（４）に前記した円形のヤギ抗ヒトヘモグロビン抗
体固相化試験片を装着した。また、上記部位（４）に対
応する基材（２）の位置にスポンジ様物質（６）を装着
し、これにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトヘモグロビ
ン抗体を液体のまま２００μｌ含浸させた。さらに、試
料がヒトヘモグロビン溶液の場合は、その２００μｌを
スポンジ様物質（６）上に滴下し、糞便の場合は、採便
棒にて採便し、ＰＢＳに懸濁したものをスポンジ様物質
（６）上に同様に滴下した。

【００３８】次いで、接続部位（３）を折り曲げて基材
（１）と基材（２）を圧着して室温で５分間放置して反
応させた後、両者を分離して、発色剤を滴下した。

【００３９】ヒトヘモグロビンを含有する試料について
、第１の領域の発色を視覚により観察し、さらに第２の
領域の対照の着色をも観察して測定結果が正当であるか
否かの確認を行った。その結果、ヒトヘモグロビンを含
有する試料については第１の領域及び第２の領域の双方
のラインが観察されたのに対し、ヒトヘモグロビンを含
有しない試料は第２の領域のみのラインが観察された。

【００４０】実施例２ ヒトヘモグロビン溶液での検出感度 ヒトヘモグロビン（シグマ社製、２回結晶）を０．１％
ＢＳＡ／ＰＢＳにて各々０．０１，０．１，１．０，１
０，１００，１０００μｇ／ｍｌに希釈して検体とした
。

【００４１】前記試験片及びペルオキシダーゼ標識抗体
を装着した分析器具のスポンジ様物質（６）面に検体２
００μｌを滴下し、基材（１）と基材（２）を圧着して
室温で５分間放置して反応させた後、両者を分離し、判
定を行った。なお、対照として金コロイド粒子法、ラテ
ックス凝集法（ＯＣ−ヘモディア、栄研化学社製）、マ
イクロプレートを用いた酵素免疫測定法（チェックメイ
ト・ヘモ、わかもと製薬社製）を用いた。

【００４２】その結果、表１に示すように、ヒトヘモグ
ロビン溶液（表中、Ｈｂと略記した。以下、同じ）での
検出感度は１０ｎｇ／ｍｌであった。この感度は対照と
した金コロイド粒子法、ラテックス凝集法の１μｇ／ｍ
ｌの感度より優れており、酵素免疫測定法と同程度であ
った。

【００４３】

【表１】

【００４４】実施例３ ヒトヘモグロビン添加糞便での検出感度便潜血陰性便に
ヒトヘモグロビンを糞便１ｇあたり各々１０，２０，６
０，１００，１０００，１００００，１０００００μｇ
添加し、よく混和したものを検体とした。

【００４５】これを採便スティックに採取し、ＰＢＳに
懸濁させ、実施例２と同様に２００μｌ滴下し同様の操
作を行なった。その結果、表２に示すようにヒトヘモグ
ロビン添加糞便での測定感度は１０μｇ／ｇであった。 この感度は対照の金コロイド粒子法、ラテックス凝集法
より優れており、本発明の分析方法が臨床検査法及び検
査キットとして有用であることが確認された。

【００４６】

【表２】

【００４７】実施例４ 特異性試験 ａ．他動物ヘモグロビンに対する反応性他の動物ヘモグ
ロビン（シグマ社製、２回結晶、ウシ、ウマ、ブタ、ヤ
ギ、ヒツジ、イヌ）を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて１０
０μｇ／ｍｌに希釈して検体とした。

【００４８】対照としてヒトヘモグロビンを同濃度に用
い、実施例２と同様の方法にて操作を行なった。

【００４９】その結果、表３に示したように、本発明の
方法は他動物のヘモグロビンでの着色はみられず、ヒト
ヘモグロビンにのみ特異的であった。

【００５０】

【表３】

【００５１】ｂ．アルブミンに対する反応性ヒト血清ア
ルブミン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン（生化
学工業社製）をＰＢＳにて１００μｇ／ｍｌに希釈して
検体とした。

【００５２】一方、対照としてヒトヘモグロビンを同濃
度にて用い、前述の実施例２と同じ方法にて操作を行な
った。

【００５３】その結果、表４に示すように、アルブミン
での着色はみられず、本発明の方法はヒトヘモグロビン
にのみ特異的であった。

【００５４】

【表４】

【００５５】ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン、ＢＳＡ：ウ
シ血清アルブミン、ＯＡ：卵白アルブミン、ｈＨｂ：ヒ
トヘモグロビン 実施例５ 糞便検体での反応 糞便検体１２例を各々採便スティックに採取し、ＰＢＳ
に懸濁させ、実施例２と同様に２００μｌ滴下し、以下
同様に操作を行なった。

【００５６】その結果、表５に示したように１２検体の
うち５検体が陽性であった。また対照とした金コロイド
粒子法およびラテックス凝集法は２検体のみ陽性であり
検出感度が秀れていることが示された。

【００５７】

【表５】

【００５８】実施例６ 尿中ｈＣＧの検出 （１）抗体固相化試験片の調製 抗α−ｈＣＧモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏ
ｔｅｃ社製）をＰＢＳにて０．５ｍｇ／ｍｌに調製し、
ニトロセルロースシート（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　
Ｓｃｈｕｅｌｌ社製０．４５μｍ）上に垂直方向に印字
した。また、同一シート上に抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐ
ｅｌ社製）をＰＢＳにて０．５ｍｇ／ｍｌ調製し、水平
方向に印字を行い、室温にて一晩固相化した。これにＰ
ＢＳにて３％に調製したスキムミルクを用い３７℃にて
３時間含浸させ、マスキングを行い、試験片とした。

【００５９】（２）ペルオキシダーゼ標識抗β−ｈＣＧ
抗体の調製 抗β−ｈＣＧモノクロナール抗体（Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏ
ｔｅｃ社製）を５ｍｇ／ｍｌになるように０．０１Ｍ炭
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）で調製し、同緩衝液
にて４℃で１夜透析を行なう。

【００６０】西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社製
、グレードＩＣ）５ｍｇに、０．３Ｍ炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８．１）を１ｍｌ加え溶解する。その後１％
１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（メルク社製
、ＦＤＮＢ）・エタノール溶液０．１ｍｌを加え、室温
で１時間反応させる。アミノ基をブロックしたＤＮＰ−
ペルオキシダーゼに０．０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１
ｍｌをさらに加え、室温で３０分間反応させる。

【００６１】過剰の過ヨウ素酸は０．１６Ｍエチレング
リコール１ｍｌを加え、室温で１時間撹拌して、分解す
る。その後０．０１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
５）を用い、４℃で１夜透析を行ないＤＮＰ・アルデヒ
ドペルオキシダーゼを得る。

【００６２】次にＤＮＰ・アルデヒド−ペルオキシダー
ゼと抗β−ｈＣＧモノクロナール抗体を混合し室温で３
時間反応させる。反応後、水素化硼素ナトリウム５ｍｇ
を加え４℃で１夜放置する。さらに０．８５％塩化ナト
リウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．１）に対し、４℃で１夜透析する。

【００６３】得られたペルオキシダーゼ標識抗β−ｈＣ
Ｇモノクロナール抗体はそのままでも使用できるが、好
ましくは未反応物質を除くため、以下の処理を行なう。

【００６４】すなわち、あらかじめ０．８５％塩化ナト
リウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．１）で平衡化したセファクリルＳ−２００カラム（
２．６ｃｍ×１００ｃｍ，　ファルマシア社製）による
ゲル濾過で精製を行ない、２８０ｎｍと４０３ｎｍの２
波長の吸収のある画分を集め、精製ペルオキシダーゼ標
識抗β−ｈＣＧモノクロナール抗体を得る。

【００６５】（３）ｈＣＧの検出法 前記の抗α−ｈＣＧモノクロナール抗体固相化シート（
試験片）を分析器具の基材（１）上部に接着した。基材
（２）には酵素標識抗β−ｈＣＧ抗体を凍結乾燥したも
のを付着させたスポンジ様物質を挟みこんだ。

【００６６】妊娠者尿又は非妊娠者尿を基材（２）のス
ポンジ様物質に含浸させ、基材（１）と基材（２）を圧
着し、室温で５分間静置後、分離した後、発色基質を滴
下させた。

【００６７】その結果、妊娠者の尿では（＋）の符号が
、非妊娠者の尿では（−）の符号が出現し、可視的に判
定を行うことができた。

【００６８】

【発明の効果】本発明によれば、特異的な結合反応を利
用した人体の疾病の診断等に有用な分析方法が提供され
る。また本発明を実施するのに使用する器具は、本発明
者らによって平成２年１０月２６日付で出願しており、
極めて簡単かつ迅速に人体の疾病の診断を行うことがで
きる。

【００６９】特に本発明は金属コロイド粒子を用いた場
合よりも測定結果が可視的に高感度で判定できるという
利点を有している。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の分析器具の１態様を示したもので、該
器具の全体見取図である。

【図２】本発明の分析器具の１態様を示したもので、該
器具の断面図である。

【符号の説明】

１　　　　基材 ２　　　　基材 ３　　　　接続部位 ４　　　　装着部位 ５　　　　試験片

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　試料中の分析対象物の有無を決定する
   特異的な結合反応を用いる分析方法において、分析対象
   物と特異的に反応する抗体を含有する試験片を装着した
   上部基材と酵素を標識した分析対象物と特異的に反応す
   る抗体を含有する多孔性かつ弾力性を有する部材を設け
   た下部基材よりなる分析器具の多孔性かつ弾力性を有す
   る部材に分析対象物を滴下し、次いで上部基材と下部基
   材とを前記試験片と多孔性かつ弾力性を有する部材とが
   接合するように圧着させることにより反応せしめ、しか
   る後接合面を分離し、試験片上に発色基質を滴下し、酵
   素反応による着色により分析対象物の有無を判定するこ
   とを特徴とする簡易酵素免疫測定法。
2. 【請求項２】　　試験片が、分析対象物の有無にかかわ
   らず酵素と発色基質の存在下で着色する試薬を含有する
   コントロールゾーンを備えたものである請求項１記載の
   分析方法。