JP2001523003A - ハプトグロビンの分析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
細胞を分離した後の血漿や血清中のHp濃度はそれぞれの動物で異なり、その動
物の健康状態に関係している。Hpは感染、炎症または外傷によって濃度が劇的
に増加するたんぱく類の一種である。これらのたんぱく質は急性期たんぱく質と
呼ばれている。
価値ある診断情報を提供する。獣医学において、Hpを測定することは牛や羊の
健康状態を評価する上で特に重要である。なぜならこれらの種ではHpが感染に
対して特に強い反応を示し、循環血中濃度が100倍にも増加する。他の種にお
いて、例えば人間、犬、猫及び豚においても、血漿濃度は2から3倍に増加し、
これは診断情報を与えるのに十分であるため、Hpの測定は重要である。さらに
これら他の種においては、Hp濃度の低下は溶血性貧血を示唆するので、診断情
報として価値がある。さらに、Hpの測定はげっ歯動物またはネズミといった実
験室用動物の、炎症や感染のマーカーとしても同様に重要である。
基づいている。
るための慣用の試験法として、人間のHpに特異的な抗血清を用いて、抗体に基
づく方法により行われている。最も汎用されている方法は免疫比濁分析であり、
溶液中の抗体―Hp錯体の沈殿の形成を測定し、Hp濃度に関連付けている。し
かし、免疫比濁分析評価は、適切な抗血清を連続的に供給するといった準備が必
要であり、通常の生化学的試験に比べてコストがかかる。それに加えて、動物診
断用施設においては、ある種に対する抗血清に基づく試験は、それぞれの種に対
して検証しなければならず、そして新しい抗血清を用いたら、その都度検証を繰
り返さなければならない。
、という発見に基づいている。しかしこの方法は、微かに酸性な条件下で検出さ
れる、錯体に固有のペルオキシダーゼ活性を利用する方法に取って替わられた。
遊離のヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性が阻害されて、錯体の活性がHp含
有量に比例的になるときは、これよりHpの標準試料に基づく検量線から、定量
することができる。
用され、免疫分析システムよりも多用されている。なぜなら検証についての要求
が穏やかで、全ての種に適用でき、そして試薬が安価なので、抗体を使う分析法
に比べはるかにコストがかからないからである。しかしこの試験の自動化版はグ
アイアコールという試薬を用い、これは不快な臭気を発するため、多くの研究施
設のスタッフに受け入れられなかった。この分析法が試薬提供業者に一般的に受
け入れられなかったのもこの理由による。ペルオキシダーゼ反応に他の試薬を用
いようとする試みがなされ、テトラメチルベンジジン(TMB)を用いる手作業によ る方法が開発された(Conner J. et al Research in Vet. Sci.(1988) 44, 82-8
8)。しかしHpの自動分析はまだ実用化されていない。これはTMBが不安定だか
らであろう。本発明者らによって、ハプトグロビンを含まない血清試料(ブラン
ク)がかなりのレベルのペルオキシダーゼ活性を示し、TMBによる誤った陽性結 果を示すと報告された。そしてこの見せかけのペルオキシダーゼ活性が、自動化
または半自動化する際に障害になると考えられる。
ている。しかし、ここでは酸性のpHが遊離のヘモグロビンのペルオキシダーゼ
活性を完全に不活性化するのに十分ではないとして、遊離のヘモグロビンのペル
オキシダーゼ活性を十分に除去するために界面活性剤を加えている。しかしなが
ら、血清または血漿中に存在する成分が分析の正確さに影響を与え得るという点
は全く示されていない。
ることである。
が上記した形式の分析にとって有用でない「ペルオキシダーゼ効果」を示してい
るという本発明者による発見に一部基づいている。
る。その分析方法は以下に示す工程から成り立っている。
他のたんぱく類によるペルオキシダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの反応
試薬を含む反応混合物を形成する工程;
せて、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体を形成させる工程;及び
るか、実質的に不活性化するような酸性pH条件下で前記ハプトグロビン/ヘモ
グロビン錯体のペルオキシダーゼ活性量を測定する工程。
この活性はpH4.1で不活性化されると以前報告された。(Makimura, S. and Su
zuki, N. (1982) Jpn. J. Ven. Sci. 44, p15-21.)しかし米国特許第4,685,552
号によって、そのようなpHにおいても低レベルのペルオキシダーゼ活性が残る
ことが示された。それゆえ本分析に於いてはpHを4.1以下に、例えば3.6〜4.0 に、特に3.8とした。
れるものでも良いが特に、人間を含む霊長類と同様に、げっ歯動物、ウシ科動物
、羊のような動物、イヌ科動物、ネコ科動物、豚のような動物、馬のような動物
などの哺乳類由来のものが挙げられる。また試料はミルクや腹水その他の体液で
もよいし、またはイン・ビトロ培養媒体でもよい。
る必要がある。なぜなら高濃度では標準プロットが直線にはならず、ハプトグロ
ビン濃度を正確に求めることができないからである。しかし試験結果の直線性を
増して、希釈を必要としなくなるような試験操作が開発され得ることは当業者に
は容易に理解できるだろう。例えば、適当な状況ではより少ない試料を用いても
よい。
。つまり、もし試験対象がウシ科動物ならば、ウシ科動物のヘモグロビンが使用
されることになる。しかし、有利なことに、試験試料の動物と異なる種類の動物
のヘモグロビンを用いても分析できることがわかった。こうしてただ一種のヘモ
グロビンを用いることで、多種類にわたる動物に対して分析が可能であることが
わかった。ヘモグロビンは好ましくはメトヘモグロビンであるが、場合によって
はオキシヘモグロビンも使用できる。
たんぱく質は、40g/Lほどの濃度で試験試料中に存在している。本発明者ら
はブランクとして測定する際のゼロ試料として用いる、最適溶媒を探索している
際に、アルブミンが分析に大きく干渉していることがわかった。この干渉はアル
ブミン濃度が1、5、10%(10、50、100g/L)において見られた。
る裏付けは別として、血清、血漿または他の試験試料中に存在する、アルブミン
及び他のたんぱく類がヘモグロビンまたはヘモグロビンから遊離したヘマチンに
結合して、通常ヘモグロビンがペルオキシダーゼ活性を示さないようなpH(p H3.6〜4.0)においてもペルオキシダーゼ活性を保持していることが考えられる 。さらにこれが自動吸光分光分析が今まで一般的に採用されなかった理由である
。つまりハプトグロビンが存在しない状態でペルオキシダーゼ活性がゼロになら
ないのである。以前は試料を大幅に希釈(500倍)したり、不活性なクロモゲ
ン(例えばグアイアコール)を使うことで、無意識にまたは偶発的にこの「ペル
オキシダーゼ効果」が最小限にされていた。
シダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの反応試薬を用いることにより、試料
の大幅な希釈を必要とせず、より活性なクロモゲンを使用できる。
果を減少させる少なくとも一つの前記反応試薬は、a)ジスルフィド結合に対し
て有効な還元剤、b)たんぱく質結合阻害剤、及び/またはc)カオトロピック
剤から独立して選択される。
を減少するために用いられる。しかし当業者ならわかるであろうが、前記の反応
剤を多量に用いると、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯形成反応を阻害するので 、避けなければならない。例えば、8-アニリノ-1-ナフチレンスルホン酸 (ANS
)をたんぱく質結合阻害剤として、そしてジチオスレイトールをジスルフィド結 合に対して効果的な還元剤として、それぞれ約10mmol/L、4mmol/
Lの濃度で使用した場合、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体のペルオキシダー ゼ活性をほぼ完全に阻害する結果となる。このように当業者は適切に調整するこ
とにより、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体のペルオキシダーゼ活性量に実質 上影響を与えずに、見せかけの「ペルオキシダーゼ効果」のみを減少させること
ができる。
リトール、システイン、メルカプトエタノール、グルタチオン、4,4‘−ジチ
オジピリジン、または5,5’−ジチオ(2−ニトロ安息香酸)である。
アゾールである。
ナトリウムである。
、界面活性剤の使用は試料中のアルブミンや他のたんぱく質によるペルオキシダ
ーゼ効果を減少させるのに重要であると考えられていた。界面活性剤はこのよう
な効果を有しているようであるが、それとともに分析において他の成分の可溶化
を保持する上で重要であることがわかった。さらにまた、低濃度の界面活性剤が
好ましい、なぜなら高濃度( 例えば、25g/L)ではみかけのペルオキシダー ゼ効果を増加させるからである。このように、界面活性剤は好ましくは、20g
/L以下の全濃度で、さらに好ましくは10g/L以下の全濃度で反応混合物に
加えられる。
0,40,60,80など);ポリオキシエチレン−p−t−オクチフェノール
(Triton X−45,X−100など);及び/またはポリオキシエチレン(P
EG)アルコール類(Brij 35,36など)のような非イオン性界面活性剤、
またはドデシル硫酸ナトリウム、CHAPS、及びセトリミドのようなイオン性
界面活性剤である。
応させる、好ましくは10分以内、より好ましくは5分以内である。
れているので、錯体の固有のペルオキシダーゼ活性を利用し、錯体を検出するこ
とが可能である。次に、既知濃度のハプトグロビンを用いて作成した標準曲線を
参照することにより、ペルオキシダーゼ活性レベルを試料中のハプトグロビンレ
ベルに関連付けることができる。
用い検出する。つまりペルオキシダーゼ活性は結果としてクロモゲンの色の変化
として表され、これは特定波長で分光光学的に検出される。このようなクロモゲ
ン基質を用いたペルオキシダーゼの検出は、ヘモグロビン濃度、グルコース濃度
、そして以前のアルブミンが分析に対して影響を及ぼすことが知られていないと
きのハプトグロビン濃度の分析の分野においてよく知られている。以下に例を示
す。Bauer, K. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1981) Vol. 19 pp971-976; Re
ijic, R. et al, Clin. Chem. (1992) Vol. 38 pp522-525 and Conner, J.G. an
d Eckersall, P.D. Research in Vet. Sci. (1988), 44, pp82-88 。
ノ−4−ヒドロキシベンゼンスルホン酸(AHBS)、テトラメチルベンジジン(TMB) )と同様に、当業者にとっては明らかであるが、本分析ではo−フェニレンジア
ミンジハイドロクロライド、o−ジアニジジン、 Na−2−OH-3−5−ジクロロ
ベンゼンスルホネート、2,2'−アジノ−ジ(3−エチルベンズチアゾリン)− 6−スルホン酸(ABTS)、8−アニリノ−1−ナフチレンスルホン酸(ANS)及
び4−ヨードフェノールを付随的に共反応試薬とする4−アミノアンチピリンク
ロモトロピック酸を使用できる。
以下の工程を含んでいる。
して有効な還元剤またはカオトロピック剤、及びたんぱく質結合阻害剤を含有す
る反応混合物を形成する工程;
か、実質的に不活性化するような酸性下で前記ハプトグロビン/ヘモグロビン錯 体のペルオキシダーゼ活性をクロモゲン基質を用いて分光光学手段により測定す
る工程。
する。この共酸化反応で青色クロモゲンが形成され、これは600nmの光を吸
収し、フェノールのみを共反応剤として用いた以外は同条件において生成した赤
色クロモゲンよりも強い吸収を示す。ANSと4−アミノアンチピリンの組み合わ せはペルオキサイドの定量において以前に報告されている。(Chung et al,(199
3), Talanta 40, p981-988)。
のキットは下記のi)、ii)及びiii)を含む。 i)ヘモグロビン; ii) a)ジスルフィド結合に対して有効な還元剤、b)たんぱく質結合阻害剤、
及び/またはc)カオトロピック剤から独立して選択される、アルブミン及び/
または他のたんぱく類が分析に与える影響を減少させるような少なくとも一つの
反応剤試薬;及び iii)ペルオキシダーゼ活性量を測定用のクロモゲン。
剤及び/ または既知のハプトグロビン濃度の標準血清といった成分を含んでいて
も良い。当業者にとっては明らかなように、キットの成分は、試験管、微量滴定
プレート、及び分光光度計といった機器を用いてハプトグロビンの分析を行うこ
とができる。これは、ここで述べる自動生化学分析においても同様である。
されるわけではない。
Vet Sci, 44 15-21) の方法に従って準備された。 クロモゲンクエン酸緩衝溶液:pH3.8のクエン酸緩衝液(0.5mol/L)、0.
01%のチオメルサレートを含む保存溶液
Lに)。 作業クロモゲン緩衝溶液:フェノール(20mmol/L)、4−アミノフェ
ナゾン(4−アミノアンチピリン)(1.6mmol/L)、8-アニリノ-1- ナフタレンスルホン酸(1mmol/L)、ジチオエリスリトール(0.39m
mol/L)、tween 20(1%)を含むクロモゲンクエン酸緩衝溶液。 基質:過酸化水素(H2O2)100μLの過酸化水素水(30%)を25mLのdH2O
に加える。 標準:ハプトグロビン濃度が2.05g/Lの溶液をBSA(2%)に希釈して、濃度を1
.03、0.51、0.125g/Lとしたもの。及びゼロ(ブランク)としてBSA(2%)を 用いる。 試料:血清または血漿。 対照用試料:Hp濃度が既知の血清(高濃度、低濃度)、それぞれの分析で繰り
返し用いられる。 検定:1日1回。
クロモゲン緩衝作業溶液が初期反応試薬1(10mL)、及び過酸化水素が初期反
応試薬2(10mL)である。 b) 7.5μLの標準、試験用試料または対照用試料を200μLヘモグロビンと 混合する。 c) 50秒後、90μLのクロモゲンを加える。 d) さらに25秒後、50μLの基質(H2O2)を加え、600nmでの吸光度増
加を測定する。 e) 次の50秒間にかけての吸収の変化は、標準と未知試料の吸収変化を比較す
ることで結果を計算するのに用いた。
濃度が2g/Lの場合、分析結果は十分に直線となる。他の種類の動物に対して
は、2g/L以上の試料は希釈が必要である。
ン分析の典型的な結果を表1に示した。標準試料ではハプトグロビン濃度と60
0nmにおける吸光度変化は直線的な関係を示した(表中には示していない)。
あることが明らかになった。BSA(5%)及び胎児ウシ血清においても同様に、 結果は0.01mg/mL以下であった。これはアルブミンの結合が除去されていな
い実施例2の結果と比較するとよい。
ンクとして用いたとき、NaCl溶液と比べて、ODの変化が小さく、違いは0.004吸 収単位(AU)であった。
に使われていた反応剤(ANS 、ジチオエリスリトール、及びtween 20)を除い
て、比較分析を行った。 この実施例では、クロモゲン溶液が8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸、 ジチオエリスリトール、またはtween 20を含んでいないことを別にすれば、他
の条件は実施例1と同様にして、分析を行った。反応試薬はフェノール(20m mol/L)を含み、クロモゲン共反応試薬として4-アミノフェナゾン(4-アミ ノアンチピリン)(1.6mmol/L)を含んでいる。そして500nmでの吸 収を測定した。
。試料中のハプトグロビン濃度の定量分析を行った場合、ハプトグロビン濃度は
0.59mg/mLであると間違った結果を示した。胎児ウシ血清もまた大きな反応 を示し、ハプトグロビンの存在を示唆する間違った陽性結果を与えた。
る乳腺炎にかかった9頭の乳牛から得た血清に対してハプトグロビン濃度が定量
された。研究室に提出された、炎症や感染症を有していない乳牛からの12の血
清(Dr.J.L.Fitzpatrick, department of Veterinary Clinical studies, Unive
rsity of Glasgow Veterinary Schoolとの共同研究から)に対してもハプトグロ
ビン分析を行った。
値に比べて10倍大きかった。感染動物において濃度に大きな幅があるのは、感染
の段階の違う動物からの試料であり、急性期のピークにおけるものや回復期にお
けるものがあるからである。
れはたぶん、炎症症状が明らかに見られない状態では、動物は準臨床的な状態に
あり、濃度を少し上げるからである。無菌状態に置かれた動物以外の大部分の動
物はこのような低レベルのハプトグロビンを有しているとが考えられる。しかし
一般的にそれがどの程度のものかを明確にするには、更なる研究が必要である。
しかしながら、この分析は乳腺炎における急性反応を証明するのに効果的であっ
た。
活性剤のみの効果を評価するために、Schmitt et al の推奨する条件(米国特許
第4,695,552号)を真似て反応試薬を用い、比較分析を行った。この実施例では 反応剤と、分析器への仕込み条件を変更し、MIRA分析器を用いて、自動分析を行
った。
l/L)、サポニン(3g/L)。 基質:過ホウ酸ナトリウム(32mmol/L) 標準:NaCl溶液を用いて希釈することを除けば、実施例1と同様。 対照試料は実施例1と同様。
クロモゲンが開始反応試薬1(10mL)、及び過ホウ酸ナトリウムが開始反応試
薬2(10mL)である。 b) 2.5μLの標準、試験用試料または対照用試料を200μLのヘモグロビン と混合する。 c) 50秒後、90μLのクロモゲンを追加する。 d) さらに25秒後、20μL基質(過ホウ酸ナトリウム)を加え、405nm
における吸光度増加を測定する。 e) 続く50秒間の吸収変化は、標準試料の吸光度の変化を対象用試料の吸光度
の変化と比較した結果を計算するのに用いた。
ロモゲン/界面活性剤系の吸光度変化に大きな効果がある。そして、0.31〜0.72 mg/mLのハプトグロビンを含むという、間違った結果が、20〜50g/L
のアルブミンを含み、ハプトグロビンを含まない血清試料に対して示された。多
種の動物において、アルブミンの標準値は25〜40g/Lのオーダーであり、
この程度の濃度のアルブミンでは、ハプトグロビン分析は実質的に影響されない
。
他の条件は実施例4(クロモゲンとしてABTS)と同様に分析した。結果を表5に
示した。
が見られた。2%と5%のアルブミンにおける吸光度がそれぞれ変化し、見かけ
上、高いレベルのハプトグロビンを示すに至った。
1と同様な方法が使用された。試料量は2.5μL、過酸化水素反応試薬の量は2 0μLである。
明らかであった。すなわち、2%と5%のアルブミンや胎児ウシ血清の試料の6
00nmにおける吸光度はNaClのみの試料に比べて大きかった。反応後のセルの
視覚的検査により、全ての反応混合物中で沈殿が起こっていることがわかった。
このことは75秒後の吸光度に反映されており、それぞれのセルの吸光度は同様
に、tween 20の存在下で反応した場合に比べ平均で4倍も大きくなっている。
(表7)
後で、かつ過酸化水素の添加の直前に測定する。クロモゲン溶液とヘモグロビン
溶液とを混合することで沈殿が生じることは明らかであり、この沈殿はtween 2
0などの界面活性剤により生成を防ぐことができる。そして沈殿が吸光度に与え
る効果にはかなり幅があり、吸光度は0.1870から0.3151に及ぶ。沈殿は試料がNa
Cl溶液のときにも生成し、これらの結果により、界面活性剤は反応試薬の溶解性
を保持するためにハプトグロビンの分析に必要となる場合があることがわかる。
r. R. Parton, Institute of Biochemical and Life Sciences, University of
Glasgowとの共同研究)の一部である。感染から8日後、6匹の感染ラット(Spr
ague-Dawley)と6匹の非感染ラットからそれぞれ血清を採取し、ハプトグロビ ン分析まで-20℃で保管した。
染によって、4倍以上に増加したことがわかった。これにより宿主が感染に応答
するという、実験室的研究において、ハプトグロビン分析の有用性を証明した。
タレンスルホン酸、tween 20(1%)を含んでいるクエン酸緩衝溶液であり(す
なわち、ジチオエリスリトールは除いてある)、試料量は2.5μLである。
試薬を用いると、ペルオキシダーゼ活性に対するアルブミンの影響が抑制される
。そして2%までのアルブミンは分析に影響を与えない、一方5%までなら、微
細な影響を与えるのみである。
Claims (20)
- 【請求項1】 下記のa)、b)及びc): a)試料、ヘモグロビン、及び試料中に存在するアルブミン及び/またはその他
のたんぱく類によるペルオキシダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの反応試
薬を含む反応混合物を形成する工程; b)前記試料、ヘモグロビン、及び前記の少なくとも一つの反応試薬を反応させ
て、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体を形成させる工程;及び c)錯形成していないヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を十分に減少させる
か、実質的に不活性化するような酸性pH条件下で前記ハプトグロビン/ヘモグ
ロビン錯体のペルオキシダーゼ活性量を測定する工程を含む試料中のハプトグロ
ビン濃度を測定する分析方法。 - 【請求項2】 分析がpHが3.6から4.0の間で実施される請求項1記載の分
析方法。 - 【請求項3】 試料が血液試料である請求項1または2記載の分析方法。
- 【請求項4】 血液試料が血漿または血清試料である請求項3記載の分析方
法。 - 【請求項5】 試料がミルク、腹水、またはイン・ビトロ培養媒体である請
求項1または2記載の分析方法。 - 【請求項6】 ヘモグロビンが、試験に供される試料を採取した動物と同一
または異種の動物から取得されたものである先行するいずれかの請求項に記載の
分析方法。 - 【請求項7】 試料中に存在するアルブミンまたは他のたんぱく類によるペ
ルオキシダーゼ効果を減少させる少なくとも一つの反応試薬が、a)ジスルフィ
ド結合に対して有効な還元剤、b)たんぱく質結合阻害剤、及び/またはc)カ
オトロピック剤から独立して選択される先行するいずれかの請求項に記載の分析
方法。 - 【請求項8】 2種またはそれ以上の反応試薬が使用される請求項7記載の
分析方法。 - 【請求項9】 ジスルフィド結合に対して有効な還元剤が、ジチオスレイト
ール、ジチオエリスリトール、システイン、メルカプトエタノール、グルタチオ
ーン、4,4’−ジチオジピリジン、または5,5’−ジチオ(2−ニトロ安息
香酸)から独立して選択される請求項7または8記載の分析方法。 - 【請求項10】 たんぱく質結合阻害剤が、8−アニリノ−1−ナフチレン
スルホン酸(ANS)、プロトポルフィリン、ビリルビン、タウロデオキシコー
ル酸類(胆汁塩類)、ジクマロール、または2−メルカプトベンゾチアゾールか
ら独立して選択される請求項7乃至9のいずれかに記載の分析方法。 - 【請求項11】 カオトロピック剤がグアニジン塩酸塩、チオシアン酸カリ
ウムまたは塩化ナトリウムから独立して選択される請求項7乃至10のいずれか
に記載の分析方法。 - 【請求項12】 更に界面活性剤を使用する先行するいずれかの請求項に記
載の分析方法。 - 【請求項13】 界面活性剤が、反応混合物に20g/L未満の濃度で添加
される請求項12に記載の分析方法。 - 【請求項14】 界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビトールエステル
(Tween 20,40,60,80など);ポリオキシエチレン−p−t−オクチ
フェノール(Triton X−45,X−100など);及び/またはポリオキシエ
チレン(PEG)アルコール類(Brij 35,36など)のような非イオン性界
面活性剤、またはドデシル硫酸ナトリウム、CHAPS、及びセトリミドのよう
なイオン性界面活性剤から選択される請求項12または13記載の分析方法。 - 【請求項15】 ペルオキシダーゼ活性がクロモゲンと過酸化水素を使用し
て検出され、ペルオキシダーゼ活性が特定の波長での分光光学的なクロモゲンの
色の変化として認められる先行するいずれかの請求項に記載の分析方法。 - 【請求項16】 クロモゲン基質が、4−アミノフェノゾン、2−アミノ−
4−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、テトラメチルベンジジン、o−フェニレン
ジアミン二塩酸塩、o−ジアニシジン、Na−2−OH−5−ジクロロベンゼン
スルホネート、2,2’−アジノ−ジ−3−エチルベンズチアゾリン−6−スル
ホン酸(ABTS)、8−アニリノ−1−ナフチレンスルホン酸(ANS)及び
4−ヨードフェノールを付随的に共反応試薬とする4−アミノアンチピリンクロ
モトロピック酸から選択される請求項15に記載の分析方法。 - 【請求項17】 下記のa)、b)及びc): a)試験に供される試料、ヘモグロビン及び界面活性剤、ジスルフィド結合に有
効な還元剤またはカオトロピック剤及びたんぱく質結合阻害剤を含有する反応混
合物を形成する工程; b)反応混合物の成分を反応させ、ハプトグロビン/ヘモグロビン錯体を形成さ
せる工程;及び c)錯形成していないヘモグロビンのペルオキシダーゼ活性を十分に減少させる
か、実質的に不活性化するような酸性pH条件下で前記ハプトグロビン/ヘモグ
ロビン錯体のペルオキシダーゼ活性量をクロモゲン基質を用いて、分光光学的手
法により測定する工程を含む血液試料中のハプトグロビン濃度を測定する分析方
法。 - 【請求項18】 たんぱく質結合阻害剤/クロモゲン共反応剤の8−アニリ
ノ−1−ナフチレンスルホン酸(ANS)、及びクロモゲン基質の4−アミノア
ンチピリン及びフェノールを使用する請求項17記載の分析方法。 - 【請求項19】 下記のi)、ii)及びiii): i)ヘモグロビン; ii) a)ジスルフィド結合の還元剤、b)たんぱく質結合阻害剤、及び/または
c)カオトロピック剤から独立して選択される、アルブミン及び/または他のた
んぱく類が分析に与えるペルオキシダーゼ効果を減少させるような少なくとも一
つの反応剤試薬;及び iii)ペルオキシダーゼ活性量を測定用のクロモゲン、を含有する先行するいずれ
かの請求項に記載の分析方法で使用されるキット。 - 【請求項20】 更に界面活性剤を含む請求項19に記載のキット。
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