CN101568834A - 待测组分的免疫测定方法 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分的方法，其包括在与该样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物存在下使含血红蛋白样品中的待测组分与能结合该组分的抗体反应；在免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分中抑制血红蛋白的干扰的方法，其包括在不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物存在下使含血红蛋白样品中的待测组分与能结合该组分的抗体反应；含血红蛋白样品中的待测组分的免疫测定试剂，其包括胆汁酸衍生物。

Description

待测组分的免疫测定方法
技术领域
本发明涉及免疫测定含有血红蛋白，免疫测定试剂的样品中的待测组分的方法，以及抑制血红蛋白在免疫测定方法中的干扰的方法。
背景技术
在免疫测定血液中的存在于血细胞，如红细胞和白细胞外的待测组分的方法中，将通过从全血中除去血细胞而制得的血清或血浆用作样品。然而，由于血细胞的去除需要特殊设备，如离心机，并且比较麻烦，因此已经有建议用全血作为样品的测定方法(见专利文献1)。当用全血作为样品时，存在着测量受到样品中因溶血而污染的血细胞组分，如血红蛋白或血细胞膜组分干扰的问题。这些组分影响光学检测系统，抑制免疫反应，并且还吸附待测物质。现在已有一些关于用全血作为样品进行免疫测定的方法的报道，这些方法未伴有溶血避免了这些问题(见专利文献2，3，4和5)。
当测量血细胞中的组成，如细胞内的蛋白质时，必须将血细胞溶解，因此不能使用没有伴有溶血的上述方法。在这种情况下，使用的方法包括用流式细胞术分离感兴趣的血细胞，然后将分离出的细胞溶解，并测量血细胞中的预期组分，但这些方法需要特殊设备进行流式细胞术，并且比较麻烦。
另一方面，作为测量细胞内蛋白质的便利方法的例子，将用表面活性剂制备的全血中的血细胞溶解物作为测量样品免疫测定MxA蛋白的方法已有报道(非专利文献1和2)。
[专利文献1]日本专利申请特开平No.(JP-A)H10-48214(未审查，公开的日本专利申请)
[专利文献2]JP-A(特开平)H06-265554
[专利文献3]WO 96/04558
[专利文献4]WO 02/73203
[专利文献5]JP-A(特开平)2004-45395
[非专利文献1]Journal of Interferon Research，(USA)，1992，Vol.12，No.2，p.67-74
[非专利文献2]Pediatric Research，(USA)，1997，Vol.41，No.5，p.647-650
发明内容
[本发明要解决的问题]
本发明的目的是提供免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分，以抑制血红蛋白干扰的方法和试剂，以及在免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分的方法中抑制血红蛋白干扰的方法。
[解决问题的手段]
本发明的发明人发现，在免疫测定样品中的待测组分的方法中，所述组分可以通过在胆汁酸衍生物存在下与能与所述组分结合的抗体反应而精确测量，所述胆汁酸衍生物不同于所述样品中所固有的胆汁酸衍生物，因此完成了本发明。更具体地，本发明涉及以下[1]-[24]。
[1]免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分的方法，其包括在与所述样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物存在下使待测组分与能结合所述组分的抗体反应。
[2]根据[1]的方法，其包括使含血红蛋白样品中的待测组分进一步在聚氧乙烯非离子型表面活性剂存在下与能结合所述组分的抗体反应。
[3]根据[1]或[2]的方法，其中免疫测定的方法是夹心法或竞争法。
[4]根据[1]或[2]的方法，其中使组分与能结合所述组分的抗体反应是：
(1)使所述组分与能结合所述组分的第一抗体和能结合所述组分的标记第二抗体反应，
(2)使所述组分与标记竞争性物质和既能结合所述组分又能结合所述竞争性物质的抗体反应，或
(3)使所述组分与竞争性物质和既能结合所述组分又能结合所述竞争性物质的标记抗体反应。
[5]根据[1]-[4]任一项的方法，其中不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物是具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
[6][1]-[4]任一项的方法，其中不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物是具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
[7][5]的方法，其中具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]丙磺酸盐(以下简称为CHAPS)或3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]-2-羟基丙磺酸盐(以下简称为CHAPSO)。
[8]根据[6]的方法，其中具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是N，N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)胆酰胺(以下简称为BIGCHAP)或N，N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)脱氧胆酰胺(以下简称为脱氧-BIGCHAP)。
[9]根据[2]-[8]任一项的方法，其中聚氧乙烯非离子型表面活性剂是聚氧乙烯烷基苯基醚。
[10]根据[1]-[9]任一项的方法，其中样品是全血。
[11]根据[1]-[10]任一项的方法，其中待测组分是MxA蛋白。
[12]含血红蛋白样品中的待测组分的免疫测定试剂，其包括胆汁酸衍生物和选自以下(1)-(3)的组分：
(1)能结合所述组分的第一抗体和能结合所述组分的标记第二抗体；
(2)标记竞争性物质和既能结合所述组分又能结合所述竞争性物质的抗体；以及
(3)竞争性物质和既能结合所述组分又能结合所述竞争性物质的标记抗体。
[13]根据[12]的试剂，还包括聚氧乙烯非离子型表面活性剂。
[14]根据[12]或[13]的试剂，其中胆汁酸衍生物是具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
[15]根据[12]或[13]的试剂，其中胆汁酸衍生物是具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
[16]根据[14]的试剂，其中具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是CHAPS或CHAPSO。
[17]根据[15]的试剂，其中具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是BIGCHAP或脱氧-BIGCHAP。
[18]根据[13]-[17]任一项的试剂，其中聚氧乙烯非离子型表面活性剂是聚氧乙烯烷基苯基醚。
[19]在免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分中抑制血红蛋白干扰的方法，其包括在不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物存在下使含血红蛋白样品中的待测组分与能结合所述组分的抗体反应。
[20]根据[19]的方法，其中不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物是具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
[21]根据[19]的方法，其中不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物是具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
[22]根据[20]的方法，其中具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是CHAPS或CHAPSO。
[23]根据[21]的方法，其中具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是BIGCHAP或脱氧-BIGCHAP。
[24]根据[19]-[23]任一项的方法，其包括使含血红蛋白样品中的待测组分进一步在聚氧乙烯非离子型表面活性剂存在下与能结合所述组分的抗体反应。
[本发明的效果]
本发明提供了使含血红蛋白样品中的待测组分能得以准确测量的免疫测定方法及用于该方法的试剂，还提供了在免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分的方法中抑制血红蛋白干扰的方法。
本发明的最佳实施方式
(1)含血红蛋白的样品
本发明的免疫测定方法中使用的含血红蛋白样品的例子包括含有血红蛋白的样品和怀疑含有血红蛋白的样品。含有血红蛋白的样品和怀疑含有血红蛋白的样品的例子包括全血，由全血制备的含红细胞的血细胞级分，怀疑溶血的血浆或血清，红细胞和添加了血红蛋白的任意样品。关于全血，可以使用采集自受试者的血液本身和已处理的血液，优选已处理的血液。这样处理的例子包括抗凝处理和溶血处理，这些处理可以组合使用。
在待测组分为血细胞的胞内组分的情况下，全血优选为经溶血处理的血液，尤其优选为经抗凝和溶血两种处理的血液。抗凝处理的例子包括向采集的血液中加入EDTA，肝素等的处理。溶血处理的例子包括加入表面活性剂或皂苷溶液，与低渗溶液混合，冻融和超声。
(2)待测组分
本发明中的待测组分不受特别限制，只要其是可能含有血红蛋白的样品中的组分即可，组分的例子包括核酸，蛋白质，脂质，维生素和多糖。核酸的例子包括DNA，RNA，ATP，ADP，AMP和cAMP。蛋白质的例子包括酶，激素和各种类型的肽。
本发明中的优选组分包括细胞内含有的物质和细胞内由各种细胞因子，如干扰素诱导产生的蛋白质。
组分的具体例子是细胞质内由I-型干扰素诱导产生的MxA蛋白(Mol.Cell.Biol.，9，5062-5072，1989；J.Virol.64，1171-1181，1990)。
(3)胆汁酸衍生物
本发明中的胆汁酸衍生物是与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物。与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物不受特别限制，只要其是能促成本发明的免疫测定方法和抑制血红蛋白干扰的方法的胆汁酸衍生物即可，优选为具有两性表面活性剂功能或非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物的例子包括3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]丙磺酸盐(以下简称为CHAPS)和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]-2-羟基丙磺酸盐(以下简称为CHAPSO)。
具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物的例子包括N，N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)胆酰胺(以下简称为BIGCHAP)和N，N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)脱氧胆酰胺(以下简称为脱氧-BIGCHAP)。
胆汁酸衍生物显示出抑制血红蛋白在待测组分与能结合该组分的抗体的反应中的干扰的效果，尤其是，优选使用CHAPS，CHAPSO，BIGCHAP和脱氧-BIGCHAP。
胆汁酸衍生物以临界胶束浓度(cmc)的1至50倍的浓度范围使用，尤其优选cmc浓度的1至10倍。在本发明中，胆汁酸衍生物可以单独使用(一种类型)，或者可以两种或两种以上类型的胆汁酸衍生物组合的形式使用。
(4)聚氧乙烯非离子型表面活性剂
聚氧乙烯非离子型表面活性剂在本发明的免疫测定方法中起增强测量灵敏度的作用，其优选在免疫反应期间存在。
本发明中的聚氧乙烯非离子型表面活性剂的例子包括聚氧乙烯烷基苯基醚，聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，优选聚氧乙烯烷基苯基醚。聚氧乙烯烷基苯基醚中的烷基的例子包括辛基和壬基。聚氧乙烯烷基苯基醚的具体例子(市场上可以买到的产品)是Nonidet P-40(聚氧乙烯壬基苯基醚)。
在本发明中，聚氧乙烯非离子型表面活性剂可以单独使用(一种类型)，或者可以两种或两种以上类型的聚氧乙烯非离子型表面活性剂组合的形式使用。在本发明的免疫测定方法中，聚氧乙烯非离子型表面活性剂的浓度优选为0.01％-2.0％，更优选0.05％-1.8％，尤其优选0.1％-1.4％。
(5)抗体和标记抗体
本发明的免疫测定方法中所使用的抗体不受特殊限制，只要其为特异性结合待测组分的抗体即可；并且，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体，但优选单克隆抗体。此外，本发明中使用的抗体包括抗体片段。具体例子包括除去了Fc部分的抗体片段，如通过将抗体用木瓜蛋白酶处理后得到的Fab，通过胃蛋白酶处理得到的F(ab’)2和通过胃蛋白酶处理及还原处理得到的Fab’。尤其是，优选抗体片段为F(ab’)2。
本发明中所使用的抗体可以通过标准方法用待测组分或其部分作为抗原获得，也可以使用市场上可以买到的产品。
在待测组分是MxA蛋白的情况下，特异性结合MxA蛋白的抗体的例子包括分别由杂交瘤细胞系KM1122，KM1123，KM1124(FERMBP-4729)，KM1125，KM1126，KM1127，KM1128，KM1129，KM1130，KM1131，KM1132(FERM BP-4730)，KM1133，KM1134和KM1135(FERM BP-4731)产生的抗人MxA蛋白单克隆抗体KM1122，KM1123，KM1124，KM1125，KM1126，KM1127，KM1128，KM1129，KM1130，KM1131，KM1132，KM1133，KM1134和KM1135，其在国际公开No.WO 96/05230中有描述。
本发明中的标记抗体是可以用于本发明的免疫测定待测组分的方法的抗体，其通过稍后描述的方法用本发明中所使用的抗体和下文所述标记物来产生。
(6)竞争性物质和标记竞争性物质
在本发明中，术语“竞争性物质”是指能与本发明的免疫测定方法中所使用的“能结合待测组分的抗体”结合，与所述组分竞争结合的物质；也包括所述组分本身。“竞争性物质”在用竞争法测量样品中的待测组分时使用。因此，竞争法中所使用的能结合待测组分的抗体是能结合待测组分，竞争性物质和标记竞争性物质的抗体。当抗体与组分结合形成免疫复合物时，其也与竞争性物质结合形成免疫复合物。
竞争性物质优选为结构上与能结合待测组分的抗体识别的表位相同的物质。另外，关于与能结合待测组分的抗体结合的能力，竞争性物质优选具有与所述组分相当的水平。作为竞争性物质，待测组分本身是优选的。
本发明中的标记竞争性物质是可以用于本发明的免疫测定待测组分的方法的物质，其通过稍后所述方法用上述竞争性物质和稍后所述标记物产生。
(7)免疫测定方法
本发明的免疫测定方法是测量含血红蛋白样品中的待测组分的免疫测定方法，其包括在与该样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物的存在下，使含血红蛋白样品中的组分与能结合该组分的抗体反应。
含血红蛋白样品和与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物的比例优选为1∶1-1∶1000，在含血红蛋白样品为全血的情况下，优选1∶2-1∶49的比例，尤其优选1∶4-1∶9的比例。向含血红蛋白样品中加入与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物时，加入期间的温度优选为约2℃-40℃，测量优选在加入后24小时内进行。
免疫测定方法不受特别限制，只要其是基于抗原-抗体反应的方法即可，并且对操作方法，有或无标记物，标记物的类型，载体及有或无B/F分离没有限定。
抗原-抗体反应可以是竞争性反应法或非竞争性反应法。
检测方法可以是其中抗原-抗体反应的结果通过凝集等直接检测的非标记法，或其中抗原-抗体反应的结果用标记物检测的标记法，从测量灵敏度的角度出发，尤其优选标记法。
在本发明的免疫测定方法中，可以使用需要B/F分离的异相法，或不需要B/F分离的均相法。
关于反应相，可以采用所有反应都在液相中完成的液相法，或反应在免疫反应的一部分反应物固定在固相的态中完成的固相法。
测量方法的具体例子包括“Bio Kensayaku Kaihatsu Manual(Biological Diagnostic Agent Development Manual)”，CMC；由Ishikawa，E等人共同编辑的“Koso Meneki Sokuteiho(Enzyme Immunoassay)”第三版，Igaku-Shoin；和文献Nippon Rinsho(Japanese Journal of ClinicalMedicine)，Vol.53，No.9中所述方法。
作为本发明的免疫测定方法的具体例子，下文显示了测量方法1-4的方法，但本发明不受其限制。测量方法1是为非竞争性反应法的夹心法，测量方法2和3是其中样品中的待测组分与竞争性物质竞争的竞争法，测量方法4是不进行免疫复合物和未包含在免疫复合物中的标记抗体或标记竞争性物质的分离(B/F分离)的均相法。
测量方法1
依次进行以下步骤(a)-(e)的方法：
(a)使含血红蛋白样品中的待测组分在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物存在下，或在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物及聚氧乙烯非离子型表面活性剂存在下与特异性结合该组分的第一抗体反应，形成第一抗体与该组分的免疫复合物：
(b)使步骤(a)中产生的免疫复合物在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物存在下，或在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物及聚氧乙烯非离子型表面活性剂存在下与能结合该组分的标记第二抗体反应，形成第一抗体，该组分和标记抗体的免疫复合物；
(c)将步骤(b)中形成的免疫复合物与未包含在免疫复合物中的标记抗体分离开来；
(d)测量步骤(b)中产生的免疫复合物中的标记量；和
(e)根据步骤(d)中测得的免疫复合物中的标记量确定样品中组分的浓度。
第一抗体优选固定在不溶性载体上。步骤(a)和步骤(b)可以依次或同时进行。只要第二抗体可以与已结合第一抗体的组分结合，第一抗体所识别的组分的位点可以与第二抗体所识别的组分的位点相同或不同，优选这些位点不同。此外，如下文所述，在步骤(e)中，样品中组分的浓度可以用显示该组分浓度与测得值(由标记产生的信息的量)之间关系的校正曲线来确定，该校正曲线预先用已知浓度的组分制备。
测量方法2
依次进行下述步骤(a)-(d)的测量方法：
(a)使含血红蛋白样品中的待测组分和标记竞争性物质在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物存在下，或在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物及聚氧乙烯非离子型表面活性剂存在下与既能结合该组分又能结合该标记竞争性物质的抗体反应，形成抗体与标记竞争性物质的免疫复合物和抗体与组分的免疫复合物；
(b)将抗体与标记竞争性物质的免疫复合物与未反应的标记竞争性物质分离开来；
(c)测量步骤(a)中形成的抗体与标记竞争性物质的免疫复合物中的标记量；和
(d)根据步骤(c)中测得的免疫复合物中的标记量确定样品中组分的浓度。
抗体优选固定在不溶性载体上。此外，如下文所述，在步骤(d)中，样品中组分的浓度可以用显示该组分浓度与测得值(由标记产生的信息的量)之间关系的校正曲线来确定，该校正曲线预先用已知浓度的组分制备。
测量方法3
依次进行下述步骤(a)-(d)的测量方法：
(a)使含血红蛋白样品中的待测组分和竞争性物质在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物存在下，或在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物及聚氧乙烯非离子型表面活性剂存在下与通过将标记与既能结合该组分又能结合该竞争性物质的抗体结合产生的标记抗体反应，形成标记抗体与竞争性物质的免疫复合物和标记抗体与该组分的免疫复合物；
(b)将标记抗体与竞争性物质的免疫复合物与未反应的标记抗体和标记抗体与组分的免疫复合物分离开来；
(c)测量标记抗体与竞争性物质的免疫复合物中的标记量；和
(d)根据步骤(c)中测得的免疫复合物中的标记量确定样品中组分的浓度。
竞争性物质优选固定在不溶性载体上。在竞争性物质具有与组分相同的结构的情况下，在步骤(a)中使用固定在不溶性载体上的竞争性物质。此外，如下文所述，在步骤(d)中，样品中组分的浓度可以用显示该组分浓度与测得值(由标记产生的信息的量)之间关系的校正曲线来确定，该校正曲线预先用已知浓度的组分制备。
测量方法4
包括下述步骤(a)-(c)的测量方法：
(a)使含血红蛋白样品中的待测组分在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物存在下，或在与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物及聚氧乙烯非离子型表面活性剂存在下与其中能结合该组分的第一抗体被标记物1标记的标记抗体1和其中能结合该组分的第二抗体被不同于标记物1的标记物2标记的标记抗体2反应，形成标记抗体1，组分和标记抗体2的免疫复合物；
(b)测量步骤(a)中形成的免疫复合物中标记物1和标记物2间相互作用的变化的量；和
(c)根据步骤(b)中测得的相互作用的变化的量确定样品中组分的量。
只要第二抗体可以与已结合第一抗体的组分结合，第一抗体所识别的组分的位点可以与第二抗体所识别的组分的位点相同或不同，优选这些位点不同。此外，如下文所述，在步骤(c)中，样品中组分的浓度可以用显示该组分浓度与测得值(由标记产生的信息的量)之间关系的校正曲线来确定，该校正曲线预先用已知浓度的组分制备。
如上文所述，测量方法1-3是包括B/F分离的异相法。测量方法1的步骤(c)和测量方法2及3的步骤(b)是B/F分离的步骤。在抗体或竞争性物质被固定在不溶性载体的情况下，B/F分离可以很容易地通过先除去反应溶液，然后洗涤不溶性载体来进行。更具体地说，通过在抗原-抗体反应后除去反应溶液，然后用洗涤液洗涤不溶性载体，可以将不溶性载体上形成的免疫复合物与未反应的被标记物(标记抗体和标记竞争性物质)分离开来。
洗涤液的例子包括磷酸盐缓冲盐水(pH7.2，含0.15mol/L氯化钠的10mmol/L磷酸盐缓冲液；以下称作PBS)，含表面活性剂的PBS和下文所述水性介质。所述表面活性剂的例子包括非离子型表面活性剂，如吐温20。
此外，在测量方法1中，当第一抗体被固定在不溶性载体上时，可以在步骤(a)和步骤(b)之间插入洗涤不溶性载体的步骤，以除去未反应的反应物。在这种情况下，步骤(b)变成了使步骤(a)中形成的免疫复合物与能结合组分的标记第二抗体反应，形成第一抗体，组分和标记抗体的免疫复合物的步骤。
在测量方法2中，在能结合组分的抗体未固定在不溶性载体上的情况下，在步骤(c)中，使固定有不能结合标记竞争性物质但能结合抗体的结合物质的不溶性载体与免疫复合物反应，产生与该不溶性载体结合的免疫复合物。除去反应溶液后，洗涤不溶性载体，以将免疫复合物与未包含在免疫复合物内的标记竞争性物质分离开来。此外，在固定有不能结合标记竞争性物质但能结合抗体的结合物质的不溶性载体存在下，步骤(a)的形成免疫复合物的反应的进行同时带来了免疫复合物的形成和免疫复合物在不溶性载体上的固定化，先除去反应溶液然后洗涤不溶性载体导致了免疫复合物与未包含在免疫复合物内的标记竞争性物质的分离。不能结合标记竞争性物质但能结合抗体的结合物质的例子包括能结合抗体恒定区的抗体。在组分不是蛋白的情况下，可以在步骤(c)中加入蛋白沉淀剂，如硫酸铵或聚乙二醇，使仅免疫复合物沉淀下来。反应混合物离心后，免疫复合物可以与未包含在免疫复合物内的标记竞争性物质分离。
在测量方法1中，在第一抗体未固定在不溶性载体上的情况下，包含在免疫复合物内的标记抗体与未包含在免疫复合物内的标记抗体的分离可以通过在B/F分离步骤中加入固定有不能结合标记抗体但能结合第一抗体的结合物质的不溶性载体，然后除去反应溶液，并洗涤不溶性载体来进行。此外，包含在免疫复合物内的标记抗体与未包含在免疫复合物内的标记抗体的分离可以通过在免疫复合物形成的步骤中，在固定有不能结合标记抗体但能结合第一抗体的结合物质的不溶性载体存在下形成免疫复合物，然后除去反应溶液，并洗涤不溶性载体来进行。不能结合标记抗体但能结合第一抗体的结合物质的例子包括，在用来产生第一抗体的动物品种与用来产生用于标记抗体的抗体
(第二抗体)的动物品种不同的情况下，针对用来产生第一抗体的动物品种的免疫球蛋白的抗体；和在第一抗体是具有恒定区的抗体，标记抗体是不具有恒定区的抗体片段，如Fab或F(ab’)2，或Fab’的情况下，能与第一抗体的恒定区特异性结合的抗体。
(8)不溶性载体
固定抗体或竞争性物质的不溶性载体不受限制，只要其可以稳定地容纳抗体或竞争性物质即可。不溶性载体的优选材料的例子包括聚合物材料，如聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚乙烯甲苯，聚丙烯，聚乙烯，聚氯乙烯，尼龙，聚甲基丙烯酸酯，明胶，琼脂糖，纤维素，硝化纤维素，醋酸纤维素，醋酸纤维素和聚对苯二甲酸乙二酯，玻璃，陶瓷，磁性颗粒及金属。不溶性载体的优选形式的例子包括管，珠，板，微粒，如胶乳，及棒。例如，每板具有96孔的聚苯乙烯微量滴定板是优选的。
(9)抗体或竞争性物质在不溶性载体上的固定化
将抗体或竞争性物质固定在不溶性载体上的方法的例子包括已知方法，如使用物理键的方法，使用化学键的方法，或其组合。物理键的例子包括静电键，氢键和疏水键。化学键的例子包括共价键和配位键。在用聚苯乙烯微量滴定板作为免疫测定方法的不溶性载体的情况下，固定化的方法的例子有向板的孔中加入抗体或竞争性物质的溶液，然后在4℃-30℃孵育1小时至1天，进行物理吸附。
抗体或竞争性物质可以直接或间接固定在不溶性载体上。间接固定的例子包括一种方法，该方法包括向固定有亲和素的不溶性载体加入生物素化抗体或生物素化竞争性物质，和通过生物素与亲和素之间的特异性结合将抗体或竞争性物质固定至不溶性载体。此外，可以将能与所述抗体特异性结合的抗体或能与所述竞争性物质特异性结合的抗体固定在不溶性载体上，所述抗体或所述竞争性物质可以通过这样的抗体固定在不溶性载体上。或者，抗体或竞争性物质可以通过共价键经连接体固定在不溶性载体上。
连接体不受限制，只要其可以在抗体或组分的官能团与不溶性载体侧链的官能团之间形成共价键即可。例如，在优选实施方案中，连接体是同时具有可以与抗体或组分的官能团反应的第一反应基团和可以与不溶性载体侧链的官能团反应的第二反应基团的分子。优选第一反应基团与第二反应基团不同。抗体或竞争性物质的官能团和不溶性载体表面上具有的官能团的例子包括羧基，氨基，缩水甘油基，巯基，羟基，酰胺基，亚氨基，N-羟基琥珀酰基和马来酰亚胺基。连接体上的反应基团的例子包括如芳基叠氮，碳二亚胺，酰肼，醛，羟甲基膦，酰亚胺酯，异氰酸酯，马来酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，五氟苯基(PFP)酯，补骨脂素，吡啶基二硫化物和乙烯基砜的基团。
(10)抗体或待测组分的标记
标记抗体或待测组分的标记物的例子包括酶，荧光物质，发光物质，放射性同位素，生物素，异羟基洋地黄毒苷(digoxigenin)，含有标签序列的多肽，金属胶体颗粒和有色乳胶颗粒。
酶的例子包括碱性磷酸酶，过氧化物酶，半乳糖苷酶，葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase)和萤光素酶。
荧光物质的例子包括荧光素异硫氰酸酯(FITC)和罗丹明B异硫氰酸酯(RITC)。其它荧光物质的例子包括量子点(Science，281，2016-2018，1998)，藻胆蛋白，如藻红蛋白，以及荧光发射蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)，红色荧光蛋白(RFP)，黄色荧光蛋白(YFP)和蓝色荧光蛋白(BFP)。
发光物质的例子包括吖啶鎓(acridinium)及其衍生物，钌络合物和洛粉碱(lophine)。对于钌络合物，优选带有电子供体的电化学发光化合物(在Clin.Chem.37，9，1534-1539，1991中描述)。
放射性同位素的例子包括3H，14C，35S，32P，125I和131I。
含有标签序列的多肽的例子包括FLAG肽(FLAG标签，Asp TyrLys Asp Asp Asp Asp Lys)，多组氨酸(His标签，His His His His HisHis)，myc表位肽(myc标签，Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu)和血凝素表位肽(HA标签，Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala)。
抗体或待测组分的标记可以通过在抗体或组分的官能团与标记物的官能团之间形成有或无连接体的共价键的反应来完成。官能团的例子包括羧基，氨基，缩水甘油基，巯基，羟基，酰胺基，亚氨基，羟基琥珀酰酯基，马来酰亚胺基和异硫氰酸酯基。可以进行这些官能团之间的缩合反应。
形成不带连接体的键的方法的例子包括使用碳二亚胺化合物，如EDC的方法。在这种情况下，可以使用活性酯，如NHS或其衍生物。异硫氰酸酯基与氨基之间的缩合反应由于其不需要其它试剂，只要在中性至弱碱性条件下混合即可进行反应，因而是优选的。
连接体不受限制，只要其可以在标记物与抗体之间经其各自的官能团成键即可。例如，在优选实施方案中，连接体是在同一分子内具有可以与抗体的氨基酸残基反应的第一官能团和可以与标记物侧链的官能团反应的第二官能团的分子。优选第一官能团与第二官能团不同。连接体的官能团的例子包括上文所述官能团。
以化学方法制备放射性同位素键的方法的例子包括在AntibodyImmunoconj.Radiopharm.，3，60，1990中描述的方法。
在标记物是酶，亲和素，荧光发射蛋白，藻胆蛋白或多肽，如包括标签序列的多肽的情况下，可以按下法产生标记抗体：产生含有编码标记物和抗体的融合蛋白的DNA的表达载体，将表达载体引入适宜的宿主，并培养宿主(分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)。编码融合蛋白的DNA可以通过使用各自编码抗体和标记物的DNA的PCR等的克隆，和通过连接酶反应连接各个DNA来获得。
在上述(6)的测量方法4中描述的均相法中使用的标记物1和2的例子包括通过与待测组分结合，并藉此靠近来引发相互作用的标记物。这种标记物的例子包括表现出荧光共振能量转移(FRET)的荧光物质。FRET是第一荧光物质受激发光激发时产生的荧光能量被用作靠近第一荧光物质的第二荧光物质的荧光能量的现象，其发生在两种荧光物质彼此间距离为1-10nm时。表现出FRET的荧光物质组合的例子包括其中一种物质的荧光波长谱与另一种物质的激发波长谱有一定重叠的组合。荧光物质的例子包括荧光蛋白，低分子量有机荧光染料和无机化合物。表现出FRET的荧光蛋白组合的例子包括CFP[绿色荧光蛋白(GFP)的黄色突变体]和YFP[绿色荧光蛋白(GFP)的青色突变体]的组合。低分子量有机荧光染料组合的例子包括Cy3和Cy5的组合。无机化合物的例子包括量子点(Science，281，2016-2018，1998)。
此外，均相法中标记物组合的例子还包括表现出生物发光共振能量转移(BRET)的产生化学发光的酶和荧光物质的组合。表现出BRET的酶和荧光物质的组合的例子包括酶降解其底物时形成的发光波长谱与荧光物质的激发波长谱之间有重叠的组合。组合的例子包括作为酶的Renilla萤光素酶(Rluc)，作为底物的Deep Blue C(由PackardBioScience公司生产)等，及作为荧光物质的GFP的组合。在这种情况下，Rluc降解底物，产生了波长为395nm的光；GFP靠近Rluc时，GFP接收了该光的能量，并发射出可以检测的波长为510nm的荧光。
均相法中标记物组合的例子包括其中酶在标记物1和标记物2互相靠近，并在某一定向上结合时显现出活性的物质的组合。标记物的组合的例子包括作为标记物1的β-半乳糖苷酶的Δα亚基和作为标记物2的β-半乳糖苷酶的Δω亚基的组合，及作为标记物1的Rluc的N末端结构域和作为标记物2的Rluc的C末端结构域的组合。
(11)抗原-抗体反应
抗原-抗体反应优选在水性介质中进行。反应温度为，例如，0℃-50℃，优选为4℃-40℃。反应时间优选为5分钟至20小时。
(12)标记量的测量
测量免疫复合物中的标记量的适宜方法可以根据标记物进行选择。更具体地说，在标记物是色素，即吸收某一波长的光的物质，或者测量由凝集等导致的浊度(吸光度)变化的量的情况下，可以使用分光光度计，多孔板读数器等。在标记物为荧光物质的情况下，可以使用荧光分光光度计，荧光多孔板读数器等。当标记物为发光物质时，可以使用发光光度计，发光多孔板读数器等。在标记物为放射性同位素的情况下，放射性同位素的量可以通过用闪烁计数器，γ-孔计数器等测量放射性来测定。
在标记为酶的情况下，标记的量可以通过测量酶活性来测定。例如，标记的量可以通过使酶的底物与酶反应，然后测量形成的物质来测定。
在酶是过氧化物酶的情况下，过氧化物酶的活性可以通过，例如分光光度计，荧光分光光度计等测量。通过分光光度法测量过氧化物酶活性的方法的例子包括一种方法，该方法包括使过氧化物酶与过氧化氢和氧化色原的组合物，即过氧化物酶的底物反应，及用分光光度计或多孔板读数器测量反应溶液的吸光度。氧化着色色原的例子包括无色型色原(leuco-type chromogen)和氧化偶合色原(oxidativecoupling-coloring chromogen)。
无色型色原是在过氧化氢和过氧化物质，如过氧化物酶存在下自己转化为染料的物质。具体例子包括四甲基联苯胺，邻苯二胺，10-N-羧甲基氨甲酰基-3，7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)，10-N-甲基氨甲酰基-3，7-双(二甲氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)，N-(羧甲氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯胺钠盐(DA-64)，4，4’-双(二甲氨基)二苯胺和双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)。
氧化偶合着色色原是在过氧化氢和过氧化物质，如过氧化物酶存在下通过两种化合物的氧化偶合形成染料的物质。两种化合物的组合的例子包括偶合剂和苯胺类化合物(Trinder试剂)的组合，及偶合剂和酚类化合物的组合。偶合剂的例子包括4-氨基安替吡啉(4-AA)和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙。苯胺类化合物的例子包括N-(3-磺丙基)苯胺，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)，N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)，N，N-二甲基-3-甲基苯胺，N，N-双(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺，N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)，N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰基乙二胺和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)。酚类化合物的例子包括苯酚，4-氯苯酚，3-甲基苯酚和3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)。
通过荧光分光光度法测量过氧化物酶活性的方法的例子包括一种方法，该方法包括使过氧化物酶与过氧化氢和荧光物质的组合物，即过氧化物酶的底物反应，及用荧光分光光度计，荧光多孔板读数器等测量产生的荧光的强度。荧光物质的例子包括4-羟基苯乙酸，3-(4-羟基苯基)丙酸和香豆素。
通过发光测量法测量过氧化物酶活性的方法的例子包括一种方法，该方法包括使过氧化物酶与过氧化氢和发光物质的组合物，即过氧化物酶的底物反应，及用发光强度计，发光多孔板读数器等测量产生的冷光的强度。发光物质的例子包括鲁米诺化合物和光泽精化合物。
在酶是碱性磷酸酶的情况下，碱性磷酸酶活性可以通过，例如，发光测量法测量。通过发光测量法测量碱性磷酸酶活性的方法的例子包括一种方法，该方法包括使碱性磷酸酶与其底物反应，及用发光强度计，发光多孔板读数器等测量产生的冷光的发光强度。碱性磷酸酶的底物的例子包括3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧环丁烷二钠盐(AMPPD)，2-氯-5-{4-甲氧基螺[1，2-二氧环丁烷-3，2’-(5’-氯)三环[3.3.1.13，7]cane]-4-基}苯基磷酸二钠盐(CDP-StarTM)，3-{4-甲氧基螺[1，2-二氧环丁烷-3，2’-(5’-氯)三环[3.3.1.13，7]癸烷]-4-基}苯基磷酸二钠盐(CSPDTM)和[10-甲基-9(10H)-吖啶叉基]苯氧甲基磷酸二钠盐(LumigenTM APS-5)。
在酶是β-D-半乳糖苷酶的情况下，β-D-半乳糖苷酶活性可以通过，例如，分光光度法(比色法)，发光测量法或荧光分光光度法测量。通过分光光度法(比色法)测量β-D-半乳糖苷酶活性的方法的例子包括使用邻硝基phe-β-D-吡喃半乳糖苷的方法。通过发光测量法测量β-D-半乳糖苷酶活性的方法的例子包括一种方法，该方法包括使β-D-半乳糖苷酶与其底物反应，及通过发光强度计，发光多孔板读数器等测量反应溶液的发光。β-D-半乳糖苷酶的底物的例子包括Galacton-Plus(由Applied Biosystems生产)及其类似物。通过荧光分光光度法测量β-D-半乳糖苷酶活性的方法的例子包括一种方法，该方法包括使β-D-半乳糖苷酶与其底物反应，及通过荧光分光光度计，荧光多孔板读数器等测量反应溶液的荧光。β-D-半乳糖苷酶的底物的例子包括4-甲基伞形酮-β基-D-吡喃半乳糖苷。
在酶是萤光素酶的情况下，萤光素酶活性可以通过，例如，发光测量法来测量。通过发光测量法测量萤光素酶活性的方法的例子包括一种方法，该方法包括使萤光素酶与其底物反应，及通过发光强度计，发光多孔板读数器等测量反应溶液的发光。萤光素酶的底物的例子包括萤光素和腔肠素。
在标记物是除荧光物质，发光物质，放射性同位素或酶之外的其它标记物的情况下，可以根据一种方法进行检测，该方法包括：使其中能与标记物特异性结合的物质被荧光物质，发光物质，放射性同位素，酶等标记的被标记物与构成免疫复合物的标记抗体或标记竞争性物质的标记物结合；通过使用上文所述标记能与标记物结合的物质的荧光物质，发光物质，放射性同位素或酶进行测量。能与标记物特异性结合的物质的例子包括能与标记物特异性结合的抗体，能与生物素(标记物)特异性结合的物质即亲和素或链亲和素。此外，还可以根据包括以下步骤的方法进行检测：使能与标记物特异性结合的物质，如能与标记物特异性结合的抗体和亲和素或链亲和素与免疫复合物的标记物结合；然后使标记抗体与标记物结合，其中标记抗体通过用荧光物质，发光物质，放射性同位素，酶等标记能与物质结合的抗体来形成，所述物质能与标记物(抗体的例子包括能与抗体的恒定区特异性结合的抗体，和能与亲和素或链亲和素特异性结合的抗体)特异性结合；和通过使用上文所述荧光物质，发光物质，放射性同位素或酶进行测量。
这种检测中所用抗体，能与亲和素或链亲和素或标记物特异性结合的抗体，能与抗体的恒定区特异性结合的抗体，能与亲和素或链亲和素特异性结合的抗体可以是多克隆或单克隆抗体，或其中Fc部分已被去除的抗体片段，如Fab，通过胃蛋白酶处理得到的F(ab’)2和通过胃蛋白酶处理及还原处理得到的Fab’。
(13)待测组分的测定
对于待测组分的测定，必需用标准品，即，已知浓度组分的溶液制备显示组分浓度与测得值(由标记产生的信息的量)之间关系的校正曲线。组分的浓度可以如下法测定：制备校正曲线；用样品进行测量；和将所得测定值与预先产生的校正曲线关联起来。
(14)水性介质及其它共存物质
用于本发明的免疫测定方法的水性介质的例子包括去离子水，蒸馏水和缓冲液，优选缓冲液。用于制备缓冲液的缓冲剂不受特别限制，只要其具有缓冲能力即可。缓冲液的例子包括pH为1-11的缓冲液，如乳酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，醋酸盐缓冲液，琥珀酸盐缓冲液，邻苯二甲酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，三乙醇胺缓冲液，二乙醇胺缓冲液，赖氨酸缓冲液，巴比妥酸盐缓冲液，咪唑缓冲液，苹果酸盐缓冲液，草酸盐缓冲液，甘氨酸缓冲液，硼酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液，甘氨酸缓冲液或Good’s缓冲液。
Good’s缓冲液的例子包括2-吗啉基乙磺酸(MES)缓冲液，双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液，N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)缓冲液，哌嗪-N，N’-双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液，2-[N-(2-乙酰胺基)氨基]乙磺酸(ACES)缓冲液，3-吗啉基-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液，2-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]乙磺酸(BES)缓冲液，3-吗啉基丙磺酸(MOPS)缓冲液，2-{N-[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)缓冲液，N-(2-羟乙基)-N’-(2-磺乙基)哌嗪(HEPES)缓冲液，3-[N，N-双(2-羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸(DIPSO)缓冲液，2-羟基-3-{[N-三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(TAPSO)缓冲液，哌嗪-N，N’-双(2-羟基丙烷-3-磺酸)(POPSO)缓冲液，N-(2-羟乙基)-N’-(2-羟基-3-磺丙基)哌嗪(HEPPSO)缓冲液，N-(2-羟乙基)-N’-(3-磺丙基)哌嗪(EPPS)缓冲液，tricine[N-三(羟甲基)甲基甘氨酸]缓冲液，vicine[N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸]缓冲液，3-[N-三(羟甲基)甲基]氨基丙磺酸(TAPS)缓冲液，2-(N-环己基氨基)乙磺酸(CHES)缓冲液，3-(N-环己基氨基)-2-羟基丙磺酸(CAPSO)缓冲液和3-(N-环己基氨基)丙磺酸(CAPS)缓冲液。
缓冲液的浓度不受特别限制，只要其是适于测量的浓度即可，优选为0.001-2.0mol/L，更优选0.005-1.0mol/L，尤其优选0.01-0.1mol/L。
在本发明的免疫测定方法中，金属离子，盐，糖，表面活性剂，防腐剂，蛋白，蛋白稳定剂等可以一起出现。
金属离子的例子包括镁离子，锰离子和锌离子。
盐的例子包括氯化钠和氯化钾。
糖的例子包括甘露醇和山梨醇。
防腐剂的例子包括叠氮钠，抗生素(链霉素，青霉素，庆大霉素等)，BioAce，Proclin 300和Proxel GXL。
蛋白的例子包括牛血清白蛋白(BSA)，胎牛血清(FBS)，酪蛋白和BlockAce(由Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)。
蛋白稳定剂的例子包括过氧化物酶稳定缓冲液(由DakoCytomation生产)。
(15)免疫测定试剂
本发明的免疫测定试剂可以用于本发明的免疫测定方法，其包括上文提及的(3)的胆汁酸衍生物，必要时还包括聚氧乙烯非离子型表面活性剂。本发明的免疫测定试剂的例子包括一种试剂，该试剂包括选自以下(i)-(iii)的组分，(3)的胆汁酸衍生物，必要时还包括聚氧乙烯非离子型表面活性剂：
(i)能结合组分的第一抗体和能结合组分的标记第二抗体；
(ii)标记竞争性物质和既能结合组分又能结合竞争性物质的抗体；以及
(iii)竞争性物质和既能结合组分又能结合竞争性物质的标记抗体。
本发明的免疫测定试剂的形式不受特别限制，只要其为促成本发明的免疫测定方法的形式即可。试剂的形式的例子包括液体形式，冻干形式等。在使用冻干形式的试剂的情况下，先将试剂溶解于前述水性介质等之中后，再将试剂用于测量。
关于本发明的免疫测定试剂中所使用的胆汁酸衍生物，能结合组分的抗体，竞争性物质，能结合组分的标记抗体和标记竞争性物质，前述胆汁酸衍生物，前述能结合组分的抗体，前述竞争性物质，前述能结合组分的标记抗体和前述标记竞争性物质可以分别使用。此外，本发明的免疫测定试剂必要时可以包括前述水性介质，前述金属离子，前述盐，前述糖，前述表面活性剂，前述防腐剂，前述蛋白，前述蛋白稳定剂等。
此外，本发明的免疫测定试剂可以试剂盒的形式储存和分发。试剂盒的例子包括由两种试剂组成的试剂盒和由三种试剂组成的试剂盒，构成试剂盒的试剂中的组成可以由本领域技术人员适当选择。例如，通过将胆汁酸衍生物溶解在水性介质中制得的溶液可以作为样品的稀释用溶液组成试剂盒，其可以是构成试剂盒的试剂之一。
(16)抑制样品中的血红蛋白干扰的方法
本发明提供了在免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分的方法中抑制血红蛋白干扰的方法。在免疫测定待测组分的方法中，血红蛋白的干扰可以通过与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物的共存来抑制。与样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物的共存抑制了样品中血红蛋白的干扰，从而产生了准确的测量。
在下文中，将参照实施例对本发明进行具体描述，其不应被解释为限制本发明的范围。
[实施例1]
[1]抗MxA蛋白单克隆抗体的制备
产生单克隆抗体KM1124的杂交瘤细胞系KM1124(FERMBP-4729)和产生单克隆抗体KM1135的杂交瘤细胞系KM1135(FERMBP-4731)各自以5-20×106细胞/动物的量向经降植烷(pristane)处理的8周龄雌性裸鼠(Balb/c)腹膜内注射。10-21天后，杂交瘤细胞在小鼠腹水中癌化，收集小鼠腹水。将收集到的腹水以3000rpm离心5分钟，以除去固体内容物，收集上清液。通过辛酸沉淀法(抗体-实验室手册(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，1988)从上清液中纯化单克隆抗体，分别得到单克隆抗体KM1124和KM1135。
KM1124是能与从人MxA蛋白的氨基末端开始计数的第220-297个残基中的表位结合的小鼠单克隆抗体，KM1135是能与从人MxA蛋白的氨基末端开始计数的第10-220个残基中的表位结合的小鼠单克隆抗体。
[2]重组MxA蛋白的制备
用通过在pET-14b载体(由Novagen，EMD Biosciences生产)的NdeI和BamHI之间插入含有编码人MxA蛋白的cDNA的NdeI-BamHI片段而产生的人MxA蛋白表达载体pET14b-MxA(Nucleic Acids Res.，32，643-652，2004)转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株。该转化体表达已加入N末端His标签的MxA蛋白。
将所得转化体接种入5mL含氨苄西林的LB培养基中，在37℃振荡培养细胞，直至600nm处的光密度(OD600)达到0.5。将该培养液接种入250mL含氨苄西林的LB培养基中，在37℃振荡培养细胞，直至600nm处的光密度达到0.3-0.5。向该培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，使最终浓度为0.4mmol/L，随后再在37℃振荡培养2小时，之后结束培养。将培养液在4℃以3000rpm离心10分钟，以收集细菌细胞。在-80℃储存细菌细胞，直至制备MxA蛋白。
由于MxA蛋白以包涵体的形式存在于细菌细胞中，因此将细菌细胞在冰上融化，加入20mL冰冷的结合缓冲液(5mmol/L咪唑，0.5mol/L氯化钠，20mmol/L Tris-HCl，pH7.9)，得到悬浮液。将细菌细胞悬浮液超声处理5次，每次30秒，以使细胞破裂，然后在4℃以4000rpm离心10分钟。除去上清液，沉淀悬浮在加入的20mL冰冷的结合缓冲液中。同样再次进行超声处理和离心。除去上清液，向沉淀中加入20mL含有6mol/L尿素的结合缓冲液，得到悬浮液。进行类似的超声处理后，混合物在冰上放置30分钟，使包涵体溶解，然后在4℃以10,000rpm离心30分钟。收集上清液，然后经0.45nm微孔滤膜过滤。
向所得溶液中加入0.5mL Ni-NTA His·Bind树脂(由Novagen，EMD Biosciences生产)，然后在4℃全部旋转混合2小时，使MxA蛋白经His标签与树脂结合。该混合物在4℃以3000rpm离心2分钟，以回收树脂。向树脂中加入10mL含有6mol/L尿素的冰冷结合缓冲液后，全部混合物在4℃以3000rpm离心2分钟，以回收树脂。重复该洗涤操作后，之后向树脂中另加入10mL冰冷的洗涤缓冲液(6mol/L尿素，60mmol/L咪唑，0.5mol/L氯化钠，20mmol/L Tris-HCl，pH7.9)，全部混合物在4℃以3000rpm离心2分钟，以回收树脂。
将10mL冰冷的洗脱缓冲液(6mol/L尿素，1mol/L咪唑，0.5mol/L氯化钠，20mmol/L Tris-HCl，pH7.9)加入到树脂中，在4℃全部旋转混合2小时，以从树脂上洗脱MxA蛋白。混合物随后在4℃以3000rpm离心2分钟，收集上清液作为MxA蛋白溶液。
[3]抗MxA蛋白抗体固定化板的制备
将[1]中制得的抗MxA蛋白单克隆抗体KM1135用PBS稀释至浓度为5μg/mL，混合物以100μL/孔的量分配在96孔微量滴定板(由NalgeNunc International生产)中。将滴定板放置3天后，吸除上清液，加入25％BlockAce(由Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)和300μLPBS，滴定板在室温下放置过夜，以进行阻断。除去阻断溶液后，用PBS洗涤。滴定板用真空干燥器干燥3天后用作抗MxA蛋白单克隆抗体固定化板。
[4]过氧化物酶标记的抗MxA蛋白抗体的制备
通过下文所述马来酰亚胺法使[1]中制备的抗MxA蛋白单克隆抗体KM1124与过氧化物酶(以下简称POD)结合，得到POD标记抗MxA蛋白抗体。
首先，用0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.0)取代含有2mg抗MxA蛋白抗体KM1124的溶液的溶剂，加入0.086mg 2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(由PIERCE生产)。搅拌混合物，搅拌后继续在30℃反应30分钟。用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G25(由Amersham Bioscience生产)柱(1.5cm直径×30cm)除去反应溶液中未反应的2-亚氨基硫杂环戊烷，并收集巯基化KM1124。
同时，将摩尔比相当于抗MxA蛋白抗体KM1124的5倍量的2.5mg POD(由TOYOBO生产，过氧化物酶I-C)溶解在250μL 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。溶液在30℃加温5分钟，加入0.72mg溶解在N，N-二甲基甲酰胺(由Nacalai Tesque生产)中的N-(6-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺(EMCS，由DOJINDO Laboratories生产)，搅拌混合物，反应继续在30℃进行30分钟。用0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Sephadex G25柱(1.5cm直径×30cm)将反应溶液进行凝胶过滤，以除去未反应的EMCS，并收集马来酰亚胺化POD。
将以上获得的巯基化抗MxA蛋白抗体KM1124的溶液与马来酰亚胺化POD的溶液混合，在30℃反应1小时。所得标记抗体用POD标记稀释剂(液体组合物)缓冲液[50mmol/L Bis-Tris(由DOJINDOLaboratories生产)，0.1％BSA(由InterGen生产)]稀释800倍。
[5]样品稀释剂的制备
各自制备以下组合物的样品稀释剂：
HEPES(pH8.0)                0.1mol/L
表面活性剂                  (类型和浓度见表1)
NaCl                        1.5mol/L
BSA                         0.1％
叠氮钠                      0.1％
[6]使用夹心酶联免疫吸附法的MxA蛋白测定系统的构建
上述[2]中制备的MxA蛋白溶液用上述[5]中制备的样品稀释剂稀释成浓度为0(只有缓冲液)，3.2，6.3，12.5，25，50，100和200ng/mL的MxA蛋白溶液，将这些溶液用作测量用样品。
向上述[3]中产生的抗MxA蛋白抗体固定化板中加入100μL测量用样品，然后混合物在室温孵育1小时，使测量用样品中的MxA蛋白与抗体结合。除去测量用样品后，加入400μL洗涤液(含0.05％吐温20(由KANTO CHEMICAL生产)的PBS)，再除去洗涤液，如此重复该洗涤操作5次。接着加入100μL[4]中制备的POD标记的抗MxA蛋白抗体溶液，继续在室温下反应30分钟。除去标记抗体，重复进行加入400μL洗涤液，然后除去洗涤液的洗涤操作5次。在暗处加入100μL含0.05％四甲基联苯胺和过氧化氢的POD的发色底物TMBlue(由Serological生产)，继续在室温反应10分钟。加入100μL 0.5mol/L硫酸，并在室温孵育10分钟，使反应终止。用板读数器测量450nm波长处的吸光度。结果显示，吸光度随着测量用样品中MxA蛋白浓度的增加而增大，这证明了MxA蛋白可以被测量。
实际上，在测量血液中的MxA蛋白浓度的情况下，以这种方式获得的校正曲线被用来测定血液中的MxA蛋白。
[7]使用血液的MxA蛋白的加样回收试验
使用用EDTA·2Na采血管从两名病毒感染的MxA蛋白阳性患者和三名健康个人采集的血液。
将该血液用[5]的样品稀释剂稀释10倍，所得样品根据方法[6]测量各样品中的MxA蛋白浓度，将测得的浓度定义为未添加MxA蛋白样品(以下简称A)的MxA蛋白浓度。
接着，向9份这些样品溶液中加入1份上述[2]中制备的500ng/mLMxA蛋白溶液，制得的样品根据方法[6]测量各样品中的MxA蛋白浓度，将测得的浓度定义为添加MxA蛋白样品(以下简称B)的MxA蛋白浓度。按下式计算MxA蛋白回收率(％)：
MxA蛋白回收率(％)＝(B-A)/50*100            (式1)
理论上，当血红蛋白的干扰被完全抑制时，MxA蛋白回收率(％)应变成100％，当血红蛋白干扰出现时，其值将减小。
对比实施例1
除了将实施例1中[5]的组合物去除表面活剂后的样品稀释剂用作样品稀释剂外，通过与实施例1类似的方法进行加样回收试验。
对比实施例2
通过与实施例1类似的方法进行加样回收试验，其中用0.2％Nonidet P40作为实施例1中[5]的组合物中的表面活性剂。
表1
Figure A20078004814500361
表1显示，测量中胆汁酸衍生物的加入增加了MxA蛋白回收率的水平，这表明血红蛋白的干扰被抑制了。
[实施例2]
对归因于向以上[5]中所述含4.9％CHAPS的样品稀释剂组合物中加入了Nonidet P-40的灵敏度进行检测。以0％，0.2％，1％和1.4％的量向上述[5]的样品稀释剂中加入Nonidet P-40，制备浓度为0(仅含缓冲液)，3.2，6.3，12.5，25，50，100和200ng/mL的在上述[2]中制得的MxA蛋白的溶液，通过实施例1的[6]中所述方法测量吸光度(Abs)。结果见表2。
表2
Figure A20078004814500371
表2显示，根据Nonidet P-40量的不同，吸光度的增加引起了灵敏度的增加。
[实施例3]
将用EDTA·2Na采血管从两名病毒感染的MxA蛋白阳性患者和三名健康个人采集的血液用作样品。
按照与实施例1类似的方法测定MxA蛋白回收率，除了用含有4.9％CHAPS的样品稀释剂，含有4.9％CHAPS和1.4％Nonidet P-40的样品稀释剂作为样品稀释剂。结果见表3。
表3
Figure A20078004814500381
表3显示，加入Nonidet P-40时，回收率仍未减少。
工业实用性
本发明提供了免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分的方法，其实现了对血红蛋白干扰的抑制，并适用于临床诊断。

Claims (24)

1.免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分的方法，其包括在与所述样品中所固有的胆汁酸衍生物不同的胆汁酸衍生物存在下使待测组分与能结合所述组分的抗体反应。
2.根据权利要求1的方法，其包括使含血红蛋白样品中的待测组分进一步在聚氧乙烯非离子型表面活性剂存在下与能结合所述组分的抗体反应。
3.根据权利要求1或2的方法，其中免疫测定的方法是夹心法或竞争法。
4.根据权利要求1或2的方法，其中使组分与能结合所述组分的抗体反应为：
(1)使所述组分与能结合所述组分的第一抗体和能结合所述组分的标记第二抗体反应，
(2)使所述组分与标记竞争性物质和既能结合所述组分又能结合所述竞争性物质的抗体反应，或
(3)使所述组分与竞争性物质和既能结合所述组分又能结合所述竞争性物质的标记抗体反应。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物是具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物是具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
7.权利要求5的方法，其中具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]丙磺酸盐(以下简称为CHAPS)或3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵]-2-羟基丙磺酸盐(以下简称为CHAPSO)。
8.根据权利要求6的方法，其中具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是N，N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)胆酰胺(以下简称为BIGCHAP)或N，N-双(3-D-葡糖酰胺丙基)脱氧胆酰胺(以下简称为脱氧-BIGCHAP)。
9.根据权利要求2-8任一项的方法，其中聚氧乙烯非离子型表面活性剂是聚氧乙烯烷基苯基醚。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中样品是全血。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中待测组分是MxA蛋白。
12.含血红蛋白样品中的待测组分的免疫测定试剂，其包括胆汁酸衍生物和选自以下(1)-(3)的成分：
(1)能结合所述组分的第一抗体和能结合所述组分的标记第二抗体；
(2)标记竞争性物质和既能结合所述组分又能结合所述竞争性物质的抗体；以及
(3)竞争性物质和既能结合所述组分又能结合所述竞争性物质的标记抗体。
13.根据权利要求12的试剂，其还包括聚氧乙烯非离子型表面活性剂。
14.根据权利要求12或13的试剂，其中胆汁酸衍生物是具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
15.根据权利要求12或13的试剂，其中胆汁酸衍生物是具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
16.根据权利要求14的试剂，其中具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是CHAPS或CHAPSO。
17.根据权利要求15的试剂，其中具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是BIGCHAP或脱氧-BIGCHAP。
18.根据权利要求13-17任一项的试剂，其中聚氧乙烯非离子型表面活性剂是聚氧乙烯烷基苯基醚。
19.在免疫测定含血红蛋白样品中的待测组分中抑制血红蛋白干扰的方法，其包括在不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物存在下使含血红蛋白样品中的待测组分与能结合所述组分的抗体反应。
20.根据权利要求19的方法，其中不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物是具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
21.根据权利要求19的方法，其中不同于样品中所固有的胆汁酸衍生物的胆汁酸衍生物是具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物。
22.根据权利要求20的方法，其中具有两性表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是CHAPS或CHAPSO。
23.根据权利要求21的方法，其中具有非离子型表面活性剂功能的胆汁酸衍生物是BIGCHAP或脱氧-BIGCHAP。
24.根据权利要求19-23任一项的方法，其包括使含血红蛋白样品中的待测组分进一步在聚氧乙烯非离子型表面活性剂存在下与能结合所述组分的抗体反应。
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