JPH07270422A - 検定装置の吸収材層における発色を低減する方法および該方法に従って処理された吸収材層 - Google Patents

検定装置の吸収材層における発色を低減する方法および該方法に従って処理された吸収材層

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JPH07270422A
JPH07270422A JP7092541A JP9254195A JPH07270422A JP H07270422 A JPH07270422 A JP H07270422A JP 7092541 A JP7092541 A JP 7092541A JP 9254195 A JP9254195 A JP 9254195A JP H07270422 A JPH07270422 A JP H07270422A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】酵素検出系を用いて被検体の検定を行なう検定
装置を構成する吸収材層を、前記検出系に用いられる酵
素に特異的な酵素阻害剤を含有する溶液で飽和させる。 【効果】吸収材層における発色を抑制し、検定の際の背
景色を減じて検定の精度を向上させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、膜ベ−スの検定装置
および免疫検定方法に関し、さらには複数の膜をベ−ス
とする装置および選択的に透過し得る膜を含む免疫検定
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】今日、いくつかの検定装置が市販されて
いる。典型的には、これらの装置では、フィルタまたは
膜に直接に、もしくは抗体固定化ラテックス粒子のトラ
ッピングにより間接的に固定化された捕獲抗体を用い
て、サンドイッチ免疫検定が行なわれている。検体また
はその抽出物は、固定化捕獲抗体を有するフィルタまた
は膜を含む装置に適用される。これらの市販の装置は、
毛管作用を利用して、試料および試薬をフィルタまたは
膜を通してその下に存在する吸収材に流入させる。最後
に、一方の構成要素が適切なシグナル発生置換基、例え
ば酵素ラベルで標識されたサンドイッチを形成する。基
質の添加は、酵素と反応して着色反応生成物を生成する
ことにより酵素標識を検出するであろう。酵素は、その
存在が抗原の存在を必要とするサンドイッチの構成要素
に結合するので、着色反応は抗原の存在をも示す。これ
らの装置にはいくつかの不利な点があり、その一つに、
低い検定感度がある。例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピ
ンのような主要分析物を測定するために、これらの検定
に、通常1011標的分子／ｍｌをも含む検体が必要であ
る。低感度の理由の一つは、検定装置における毛管流動
速度の制御が困難なことにある。反応が終了する前に、
試薬が毛管流動によって反応域から離脱してしまう。サ
ンドイッチの形成または酵素の検出における抗原- 抗体
相互作用および他の段階により多くの時間をかければ、
動力学が改良され、より少量の分析物の検出が可能とな
る。多層構造を有するいくつかの検定装置には、吸収材
に背景色が発生し、弱い陽性結果と陰性結果との識別を
妨げるという別の問題がある。
【０００３】毛管流動速度の制御の困難さを解消するた
めの一つの試みが、1982年12月28日に Tomらに発行され
た米国特許 4,366,241号に記載されており、これはサン
ドイッチ免疫検定を行なうための方法および装置を開示
している。この装置は、免疫学的な対の一構成要素が吸
着する免疫吸着層、液体吸収部材および吸収性の強い抗
液体流動ディスクを含むものとして記述されている。こ
の吸収性の強い抗液体流動ディスクは、液体の吸収層へ
の侵入を遅らせ、免疫吸収部材を通して流動する液体の
均一な流動速度を達成する。流動は、免疫吸収部材の免
疫学的な対の一構成要素が固定されている特定の領域に
限定されることはない。
【０００４】Tom らは、さらに、中間層に酵素を添加し
て検出層からの化合物の移動を妨げることにより、多層
免疫吸収帯の第１層におけるシグナルの発生を妨げるこ
とを開示している。第13欄に記載された実施例は、検出
用酵素（detector enzyme ）が第１層および第３層に存
在することを記述している。このシステムは、検出を第
３層で行なうように設計されている。基質は、第１層に
は添加されない。その代わり、それは、第３層にその場
で生成する。別の酵素が第１層と第３層との間の層に存
在しており、この酵素は、基質が第３層から第１層に移
動するのを妨げ、第３層でのみ検出が行なわれるように
する。ここには、酵素に直接作用する酵素阻害剤を用い
て吸収材層を処理することにより、吸収剤層における背
景色を減少することは教唆されていない。
【０００５】1986年12月30日に Valkirsらに発行された
米国特許 4,532,901号および1978年5月30日に Rupe ら
に発行された米国特許 4,092,115号の両者は、フィルタ
または膜上に位置する構造を有する装置に関し、これら
のフィルタまたは膜は試薬が結合し得る透過膜上への試
料の流動を可能にするものである。
【０００６】1986年11月18日に Hossum らに発行された
米国特許 4,623,461号は、種々の免疫検定に使用しうる
横断流動診断装置（transverse flow diagnostic devic
e ）を開示する。この装置は、全ての流体および反応体
が、フィルタ部材を通して、フィルタ最上面の局在部分
上の適用した点からフィルタの周辺部分に外に向けて流
動するように組み立てられている。装置の周辺部分に位
置する吸収部材は、横断毛管作用（transverse capilla
ry action ）を働かせてフィルタ平面における適用点か
ら液体を外側に吸引する。
【０００７】1983年10月 4日に Cole らに発行された米
国特許 4,407,943は、その表面が免疫化学的に活性化さ
れた微孔性膜のゼイン固定内部表面および外部表面への
抗原または抗体の固定化を開示している。膜を通して流
動する大量の流体に露出した、大比率の表面を有する構
造は、この表面との反応性の接触の可能性を増加させ、
反応時間を減少させる試みに用いられる。インキュベ−
ション時間は、流体の流動速度が、ドロップが膜の上部
に載っているときにそのドロップによって作用する流体
静力学的圧力のみによって決定されるように、流体を膜
の上面に滴下する技法によって支配される。吸収剤層
は、それを通して試薬を吸引するための毛管作用を働か
せるためには使用されない。
【０００８】1981年 1月20日に Cole らに発行された米
国特許 4,236,999号は、液体試料の予め定められた成分
を試験するための多層装置を開示している。この試験装
置は、液体レザバを規定する、伸縮する頂部および基台
部材を具備し、頂部部材は、微孔性膜の周辺に向かって
開口している１以上の試験ウェルを有する。微孔性膜
は、その内部表面および外部表面に固定された共反応体
（co-reactant ）を有し、この共反応体は分析物と反応
することが可能である。弾性部材が押し下げられた場合
には、膜は、ブロッティングまたは毛管作用によって、
試験ウェルを通過する全ての液体を吸収することが可能
な吸収材部材と接触する。吸収材層およびそれを膜の下
層と接触させる部材がないと、液体は膜を通過しない。
装置が押し下げられていない場合には、液体は微孔性膜
を通過しないであろう。この吸収材層は、実質的に非湿
潤性、すなわち、通常の水溶液に対してはオシメのイン
ナ−ライニングと比較し得る表面層と、実質的に湿潤性
の層とを有する。
【０００９】1975年 6月10日に Bagshawe に発行された
米国特許 3,888,629号は、マトリックスパッドを有する
容器と、液体をマトリックスパッドを通して流動させる
マトリックスパッドの支持体とを具備する、ラジオイム
ノアッセイへの使用に適した反応セルを開示している。
このマトリックスは、分析物と結合し得る多孔質吸収材
料を含んでいる。所望の化学反応は、マトリックス中で
起こり得る。実質的にマトリックスと接触している多孔
セル材料を用いることにより、迅速なろ過が誘導され
る。
【００１０】1973年 3月27日に Liotta に発行された米
国特許 3,723,064号は、物質の濃度を定量的に決定する
積層試験装置を開示している。この装置は、ほぼ４層か
らなる。第１多孔層は試薬系を含浸し、この第１層に隣
接して被検流体に対して異なる透過性を有する複数の領
域を含む膜があり、第２層に隣接して多孔質透過層があ
り、表示ストリップが続く。ここでは、選択的透過性
は、分析物との化学反応、または膜層の細孔サイズによ
るサイズ選択で起こる。
【００１１】ミリポア・イムノザイム・トキソプラズマ
抗体試験（Millipore Immunozyme Toxoplasma Antibody
Test ）を記述する文献、No.PB 847 （1979）は、微孔
性免疫吸収材、多孔質疎水性層および吸収材ブロッタ
（absorbent blotter ）を有するカセットを開示してい
る。カセット頂部が押し下げられたときに、その内部に
存在する液体は免疫吸収材を通過してブロッタに流れ込
む。このようにして、この装置は、吸収材層に形成され
ることがある背景色が上層における結果の検出を妨げる
ことを防止する。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】この発明は、酵素検出
システムが用いられた場合に背景色を減少させるための
検定装置の吸収材層の酵素阻害剤による処理に関する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】この出願において、「選
択的透過性」という用語は、もし存在していたとして、
有機溶媒のような他の液体を通過させるかどうかにかか
わらず、水溶液を実質的に通過させない（すなわち、実
質的に不透水性の）材料を指す。
【００１４】この発明に従って、種々のタイプの受容体
分子、例えば、以下で議論されるように特定の免疫もし
くは非免疫結合対の一要素を捕獲試薬として使用するこ
とができる。適切な捕獲試薬の選択は、関心のある分析
物、関心のある分析物を検出するために必要な検定感度
等の種々の基準に依存する。この発明の好ましい態様
は、捕獲試薬としてモノクロ−ナル抗体または免疫反応
性モノクロ−ナル抗体断片を使用する。しかしながら、
適当な親和性を有するモノクロ−ナル抗体が得られない
場合には、所望の感度を達成するために、必要な親和性
を有するポリクロ−ナル抗体が好ましい。
【００１５】捕獲試薬に加えて、陽性および陰性標準試
薬を透過性層表面に結合させて検定および検出システム
が適性に機能しているかどうかを決定することもでき
る。
【００１６】試料が検出用抗体（detector antibody ）
と前インキュベ−トすることなく装置に添加された場合
には、適切な陽性標準は精製抗原であり得る。分析物を
含有する試料との前インキュベ−ションが行なわれる場
合には、それは検出用抗体に結合した抗原であり得る。
これは、抗原と検出用抗体との捕獲された複合体をこの
検定で検出することが可能であることを示すが、そのよ
うな複合体を形成または捕獲可能であることは示してい
ない。検出用抗体上のビオチンが試験された、鍵となる
基（key group tested）である場合には、結合したビオ
チンを有するいかなる物質でも前記複合体と置き換える
ことができ、かつ陽性標準としても役立つ。そのような
物質には、ビオチニル化（biotinylated）ウシ血清アル
ブミンまたは他のビオチニル化タンパク質が含まれる。
他の可能な陽性標準物質は、抗-酵素のような検出系の
成分に対する抗体である。これは、検出系における酵素
が膜上に捕獲される場合に陽性の結果が得られることを
示している。他のタイプの陽性標準も可能である。この
ように、適切な陽性標準の選択は、一定の条件を満たし
た場合（抗原が存在した場合、またはビオチンが存在し
た場合、あるいは酵素が捕獲された場合等）の陽性反応
を試験するために企図される。
【００１７】良好な陰性標準物質は、捕獲抗体と同じ種
およびサブクラスのモノクロ−ナル抗体であって、捕獲
試薬と等しい濃度（単位面積当たりの量）で適用された
ものである。この陰性標準抗体は、被検抗原、または検
出系の成分に対する（この検定において）論証可能な親
和性は持たない。このように、適切に使用された場合に
は、陰性標準は非特異的反応に対する試験を提供する。
【００１８】捕獲試薬がスポットされる透過性層に使用
し得る材料には、種々の天然または合成材料が含まれ、
これらは個別の材料であっても材料の組み合わせであっ
てもよく、有機、無機またはそれらの組み合わせであっ
てもよい。透過性層は吸収性が強い、すなわち検定にお
いて使用される溶質の移動を実質的に妨げることなくそ
れを通しての水溶液の流動を可能にしなければならな
い。選択された材料はまた、下に記述されるように、装
置の局所領域に、捕獲試薬が共有結合的もしくは非共有
結合的に、直接もしくは間接的に結合し得るものでなけ
ればならない。用途を見出し得る典型的な材料は、多糖
体、例えば、紙、酢酸セルロ−ス、ニトロセルロ−スお
よび焼成ニトロセルロ−ス等のセルロ−ス材；シリカ、
不活性化アルミナ、硅藻土、ＭｇＳＯ4 または塩化ビニ
ル、塩化ビニル- プロピレン共重合体、および塩化ビニ
ル- 酢酸ビニル共重合体のようなポリマ−を有する、多
孔質ポリマ−マトリックスに実質的に均一に分散された
無機細分材料等の無機材料；天然に産生する、例えば木
綿と、合成された、例えばナイロン布との両者を含む
布；多孔質ゲル、例えば、シリカゲル、アガロ−ス、デ
キストリン、およびゼラチン；ポリマ−フィルム、例え
ばポリアクリルアミド等である。
【００１９】特に、タンパク質が共有結合的に結合し得
る膜についても言及することができる。そのリストに
は、市場から購入し得る下記のものが含まれる。約 0.5
ないし約 5μｍのポアサイズを有する微孔性親和性膜、
接触した際にタンパク質を固定する高密度の共有結合サ
イトを提供する化学的に予め活性化された表面を有する
膜、および基本膜（base membrane ）が、 7ないし 9の
ｐＨ範囲においてリジンまたはアルギニンのε- アミノ
基によってタンパク質の固定を可能にするよう化学的に
誘導された親水性フッ化ポリビニリデンである、化学的
に活性化された親水性微孔性膜。高感度検定について
は、膜の選択は、膜のブロッキングによる非特異的な結
合を妨げる能力に主に依存する。これは、選択された試
薬、ブッロク剤、および膜それ自体に順に依存する。こ
の発明の実施において好ましい膜は、化学的に活性化さ
れた親水性微孔性膜である。
【００２０】この多層装置の選択的透過性層は、検定条
件下において、水溶液の流動を妨げる。この流動に対す
る抵抗は、検定の全体の感度の他に、捕獲試薬が検定に
使用される他の試薬に接触する時間を増加させ、それに
よりサンドイッチの形成および酵素の検定における、後
に続く工程を改善するので、重要である。選択的透過性
層には流動特性が公知である多種の組成物を使用するこ
とができ、これには、ポリエチレン、ポリエチレン裏打
ポリテトラフルオロエチレンおよび繊維状多孔質ポリテ
トラフルオロエチレンが含まれる。この発明の実施にお
いては、繊維状多孔質ポリテトラフルオロエチレンが選
択的透過性膜の好ましい材料である。膜の繊維状多孔性
は、表面に沿った放射状の流動を助長し、それにより液
体を選択的透過性層の孔が位置する中心へ流動させるよ
うに見える。検定の間、水性試薬は、水性検定試薬に対
して選択的透過性である繊維状多孔質ポリテトラフルオ
ロエチレン膜を通過しない。
【００２１】繊維状多孔質ポリテトラフルオロエチレン
膜は、約 1ないし約60μｍの範囲をとる種々のポアサイ
ズおよび約 0.063ｍｍないし約 0.065ｍｍの範囲をとる
種々の厚さのものが利用可能である。製造方法により、
これらの膜は、本来の繊維の寸法および配置まで標準ろ
紙の構造を再現する。
【００２２】この発明に実施において、繊維状多孔質ポ
リテトラフルオロエチレンまたは他の選択的透過性膜は
約 0.1ないし約 0.15 ｍｍの範囲の厚さ、および約 5μ
ｍないし約 6μｍのポアサイズを有していることが好ま
しい。約0.15ｍｍをこえる厚さを有する膜は、孔を通過
する液体の滑らかな流動を妨げることがあるので、避け
ることが好ましい。一方、選択的透過性膜が薄すぎる場
合には、装置が組み立てられたときに破損する可能性が
ある。また、より薄い膜はより透明になる傾向にあり、
このため、選択的透過性層の下に位置する吸収材層に発
生した色を中間膜を通して見ることを可能にする。中間
層を通しての色の透過は、弱い陽性結果と陰性結果との
識別の困難さを増加させる。
【００２３】吸収材層は、過剰の試薬溶液の貯蔵部とし
て役立つ。したがって、色の生成に必要な全ての反応体
は吸収材層に存在する。吸収材層中における着色の発生
は望ましいものではないので、吸収材層に種々の試薬を
添加して吸収材層における背景色の生成を減少させるこ
とができる。驚くべきことに、また思いがけないこと
に、この発明によって、酵素ベ−スの検出システムを用
いた場合に、検出のために選択された酵素に特異的な酵
素阻害剤で飽和させることにより吸収材層における着色
の発生を最小に止めることが可能であることが見出され
た。
【００２４】アルカリホスファタ−ゼは、多くの異なる
リン酸エステルを加水分解し、比較的広い特異性を有す
る酵素である。この特異性は、構造上関連のある、異な
る多数の基質に対して作用することが可能であるという
ものであるが、割合が非常に異なる。これは、多種の検
定様式において検出システムの一部として非常に頻繁に
使用される。アルカリホスファタ−ゼに対する多数の阻
害剤が知られている。Ｂｅ++およびＺｎ++は、アルカリ
ホスファタ−ゼを阻害する。アルカリホスファタ−ゼに
よって触媒された反応の生成物である無機リン酸塩もま
た、反応の重要な阻害剤である。システイン、ヒスチジ
ンおよびフェニルアラニンを含む多くのアミノ酸は、ア
ルカリホスファタ−ゼの弱い阻害剤である。ＥＤＴＡ
（エチレンジアミン四酢酸）のようなキレ−ト剤は阻害
剤である。これは、おそらく、キレ−ト剤が必須のＺｎ
++イオンを酵素の構造から除去してしまうためである
（アルカリホスファタ−ゼは亜鉛金属結合タンパクであ
って、その活性には構成上の亜鉛を必要とするが、過剰
の亜鉛イオンは上述のように酵素を阻害する）。インド
ソベンゾエ−ト、インドアセタミド、および1,3,4,5-テ
トラクロロ-3α-6α- ジフェニルグリコウリルもまたア
ルカリホスファタ−ゼを阻害する。
【００２５】西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰ）お
よびβ- ガラクトシダ−ゼは、種々の検定様式において
検出に通常使用される別の酵素である。ＨＲＰは、アジ
ド、フッ化物、ヒドロキシルアミン、過酸化ヒドロメチ
ル水素（hydromethylhydrogen peroxide）および還元剤
によって阻害される。β- ガラクトシダ−ゼは、重金
属、有機水銀化合物、金属キレ−ト剤、アルコ−ルおよ
びナトリウムイオンを含む高濃度アルカリイオンによっ
て阻害される。
【００２６】酵素の阻害について記述された複数の刊行
物が存在するにもかかわらず、酵素検出システムを用い
る検定装置の吸収材層における背景色発生の減少への酵
素阻害剤の使用を述べたものはない。下に記述するよう
に、酵素検出は検出の好ましい方法であり、背景色生成
の減少は弱い陽性結果と陰性結果との識別を容易にする
ので、驚くべきことに、また思いがけないことに、酵素
の阻害は、吸収材における背景色生成を正常化するため
の最高の道具であった。
【００２７】使用される検定装置、選択された検定用酵
素、選択された酵素に対して特異的な選ばれた阻害剤、
および阻害剤の溶解度特性等の因子に依存して、下に記
述される実施例の多くの変形が可能であることは明らか
にされなければならない。これらの変形は、発明の範囲
にある。
【００２８】以下では、背景色生成を最小にするため
に、この発明の装置の吸収材層をどのように処理したか
を説明する。
【００２９】吸収材層を 200ｍＭ塩化亜鉛および 0.3％
のアルキルアリ−ルポリエ−テルアルコ−ルのような界
面活性剤を含有するイソプロパノ−ル溶液で飽和させ
た。例えば、トリトンＸ-100（Triton X-100）がアルキ
ルアリ−ルポリエ−テルアルコ−ルである。表面活性剤
は層を親水性にし、過剰の亜鉛イオンは、この場合アル
カリホスファタ−ゼである検出用酵素を阻害することに
より吸収層における色の発生を妨げる。吸収層を親水性
にするために、当業者に公知のいかなる界面活性剤をも
使用することができる。アルキルアリ−ルポリエ−テル
アルコ−ルは、単に、適切であろうと思われる多くの界
面活性剤の１つである。
【００３０】同様に、阻害剤を溶解する溶媒の選択は重
大なものではない。以下の２つの考察が適切な溶媒の選
択に考慮される。(1) その溶媒における阻害剤の溶解度
限界の値、および (2)この溶媒で飽和された後吸収材層
がいかに素早く乾燥するか、である。
【００３１】吸収材層の表面上に亜鉛イオンを固定化す
る必要はなかった。これは、吸収材の過剰の吸収能力
が、吸収材層から他の層へ亜鉛イオンまたは試薬が移動
するのを妨げたためである。これにより、亜鉛イオンは
吸収材層中に留まってアルカリホスファタ−ゼを阻害
し、透過性層の表面上の色発生を妨げなかった。検定装
置の構造、選択された阻害剤および吸収材層の能力によ
り、吸収材層に阻害剤を固定化することが好ましい。
【００３２】固体塩化亜鉛は、 0.3％の界面活性剤アル
キルアリ−ルポリエ−テルアルコ−ルを含有するイソプ
ロパノ−ル、メタノ−ル、クロロホルム、または上述の
基準を満たす他の溶媒に直接溶解し得る。Mineral Rese
arch,Inc.(Harrisburg,NC)から購入することが可能な50
％塩化亜鉛水溶液を、吸収剤層を飽和させるための溶液
の調製に使用することも可能である。
【００３３】50％塩化亜鉛水溶液を使用した場合には、
0.3％のアルキルアリ−ルポリエ−テルアルコ−ルを含
有するイソプロパノ−ルのガロン当り前記溶液約 206ｇ
を溶解してイソプロパノ−ル溶液中に塩化亜鉛の最終濃
度 200ｍＭを達成するように計量した。別の試みは、洗
剤を含有するイソプロパノ−ルで吸収剤層を飽和し、こ
の層を乾燥させ、その後吸収剤層を塩化亜鉛溶液で飽和
させることである。
【００３４】吸収剤層（複数）に適切な材料の選択は重
大なものではない。これらの材料には、セルロ−ス、酢
酸セルロ−ス、ポリエステル、多孔質ポリエチレンおよ
びポリエチレンテレフタレ−トのような他のポリオレフ
ィンが含まれる。重要なことは、事実上選択的透過性層
を移動する色がないように、吸収剤層を、背景色の発生
を最小にする適切な阻害剤溶液で飽和させることであ
る。
【００３５】選択的透過性層の必要不可欠な特徴は、透
過性膜上にスポットされた捕獲試薬の直下に、選択的透
過性層を通して伸びる１ないし約７個の孔を有してお
り、孔（複数）のサイズは捕獲試薬によって覆われる領
域よりも小さい領域を覆う。この発明の好ましい態様
は、選択的透過性層に５個の孔を有している。図１に示
すように、１つの孔は中心にあり、残りの孔は中心孔の
周りに対称的に配置されている。検定の終りに陽性結果
を定義する円形捕獲試薬スポットの明確な輪郭を得るこ
とが可能である限りにおいて、別のタイプの配置も可能
である。
【００３６】孔の形状が重要でないのに対して、孔のサ
イズは重要である。孔は、円形、楕円形、矩形等であり
得るが、孔が大きすぎる場合には流れの制御は失われ
る。捕獲抗体スポットの直径をこえる単独の孔が使用さ
れる場合には、感度が失われる。また、より大きな孔
は、ドットの代わりに、最上層を通してより暗い円を見
せる傾向にあり、これは弱い陽性結果との混同を招く可
能性がある。これらの孔は、約25μｍ×約1000μｍ（ab
out 25 micrometers by about 1000 micrometers）のサ
イズであり得る。この発明の好ましい態様は、上述した
ように配置された５個の孔を有する選択的透過性層を使
用する。好ましい孔のサイズは、約 100μｍ×約 300μ
ｍである。このサイズの孔は、30ゲ−ジ針を用いること
により得られる。これらの寸法を有する５個の孔は、捕
獲試薬スポットの下の約 0.4ないし10％の領域を占め、
透過性層上面の領域と比較した場合、これは透過性層の
上面全域の約0.04％ないし 1％を構成するものと見積も
られている。
【００３７】前述の層を有する装置を第２図に示す。こ
れは、キャップ1 、透過性層2 、O-リング3 、上述の孔
9 を有する選択的透過性層4 、タブ8 を有するベ−ス7
に順に置かれている本体6 内に収納された吸収剤プラグ
5 を有している。装置が組み立てられたときには、O-リ
ング3 がキャップ内に押し込まれているので、透過性層
2 、選択的透過性層4 、および吸収剤プラグ5 は互いの
直接下にある。タブ8を引き下げると、低真空が発生す
る。これは、試薬が装置を通して適切に流動することを
保証する。続く流動は、毛管作用によって容易に起こ
る。
【００３８】遠心、ろ過またはそれらの組み合わせのよ
うな、通常用いられている実験室技法は、検定の前に、
検体から特定の物質を除去することが可能である。透過
性膜のポアサイズよりも大きな寸法を有する特定の物質
を含有する検体に対しては、いくつかの試料処理工程が
必要である。そのようなサイズの特定の物質は透過性層
の表面に捕獲される。そこでは、背景汚染が起こる可能
性があり、それにより検定の実施を妨げる。
【００３９】この発明を用いて検出および／または定量
することができる物質は、以下に説明される。ポリペプ
チドおよびタンパク質、多糖類、核酸、およびそれらの
組み合わせ、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコ
ンドリア、核、細胞膜等。典型的なタンパク質は、核タ
ンパク質、糖タンパク質、硬タンパク質、プロテオグリ
カン、ムコタンパク質、ヒストン、アルブミン、インシ
ュリン、ペプシン等である。さらに、グルカゴン、卵胞
刺激ホルモン、黄体形成ホルモン等のペプチドおよびタ
ンパクホルモンの他に、フィブリノ−ゲン、トロンビン
等の血液凝固因子に言及することもできる。ウイルスに
関しては、以下に言及することができる。アデノウイル
ス；単純ヘルペス、帯状水痘、ヘルペスウイルスＢ、サ
イトメガロウイルス、エプスタイン- バ−ウイルス、ヒ
トヘルペスウイルス６型のようなヘルペスウイルス；ポ
ックスウイルス；ピコルナウイルス；オルソミクソウイ
ルス；パラミクソウイルス；コロナウイルス；ラプドウ
イルス；トガウイルス；ブンヤウイルス；アレナウイル
ス；風疹ウイルス；アルボウイルス；レオウイルス；肝
炎；レトロウイルス；腫瘍ウイルス等。
【００４０】前に、捕獲試薬にポリクロ−ナル抗体を使
用することができると述べたが、この発明の好ましい態
様は、上述のように、捕獲試薬にモノクロ−ナル抗体を
用いる。モノクロ−ナル抗体はまた、検出用抗体に好ま
しく使用される。この発明のモノクロ−ナル抗体を調製
する方法は公知であり、多種の刊行物に引用されてい
る。それらのうち以下のものは参考として組み込まれて
いる。Kohlerおよび Milstein 、Nature、256 ：495-49
7 （1975）、Pereira ら、Infection and Immunity、29
巻、No.2、724-732 頁（1980年 8月）、B.Mishell およ
び S.Schiigi編、Selected methods in cellular immun
ology 、W.H.Freeman Co. 、San Francisco （1980）に
おけるOiら、Immunoglobulin producing hybrid cell l
ines、351-371 頁、および Galfre ら、Preparation of
Monoclonal Antibodies： Strategies および Procedu
res 、Methods in Enzymology 73、1-46頁（1981）。こ
こでこれらの技術をさらに説明することはしない。検定
において使用する特定の試薬の感度により、最良の捕獲
抗体はポリクロ−ナルまたはモノクロ−ナルのいずれか
である。
【００４１】透過性膜への結合は、直接であろうと間接
であろうと、共有結合であろうと非共有結合であろう
と、公知の技術を使用して達成することができる。好ま
しい態様において、捕獲試薬は共有結合的に透過性膜に
結合し、洗浄により、または次の試薬を添加した際に試
薬が失われるのを避ける。
【００４２】この発明によると、検出に使用されるモノ
クロ−ナル抗体は、通常の技術を用いて標識される。受
容体システムまたは特異的結合対の一要素を標識として
使用することができる。
【００４３】特異的結合対は、免疫タイプのものでも非
免疫タイプのものでもよい。免疫特異的結合対の例に
は、抗原- 抗体システムまたはハプテン／抗- ハプテン
システムである。フルオレセイン／抗- フルオレセイ
ン、ジニトロフェニル／抗- ジニトロフェニル、ビオチ
ン／抗- ビオチン、ペプチド／抗- ペプチド等に言及す
ることができる。特異的結合対の抗体要素は、当業者に
は普通の慣例法によって調製することができる。そのよ
うな方法には、特異的結合対の抗原要素、または合成ペ
プチドのような合成もしくは遺伝的に処理し得る抗原の
一部で動物を免疫することが含まれる。特異的結合対の
抗原要素に免疫原性でない、すなわちハプテンである場
合には、それを担体タンパク質に共有結合させて免疫原
性にすることができる。
【００４４】非免疫結合対には、２つの成分が互いに自
然親和性を共有し、かつ抗体ではない系が含まれる。典
型的な非免疫対は、ビオチン- ストレプトアビジン、内
因性因子- ビタミンＢ12、葉酸- 葉酸塩結合タンパク質
等である。
【００４５】標識モノクロ−ナル抗体と特異的結合対の
一要素とを共有結合させるために種々の方法が利用され
る。方法は、特異的結合対の要素の性質、所望の結合の
型、および抗体の様々な結合化学に対する耐性を基にし
て選択される。例えば、ビオチンは、市販の活性誘導体
を利用することによりモノクロ−ナル抗体に共有結合さ
せることができる。これらのいくつかは、タンパク質の
アミノ基に結合するビオチン-N- ヒドロキシスクシンイ
ミド；カルボジイミドによって含水炭素部分、アルデヒ
ドおよびカルボキシル基に結合するビオチンヒドラジ
ド；およびスルフヒドリル基に結合するビオチンマレイ
ミドおよびヨ−ドアセチルビオチンである。 フルオロ
セインが使用される場合には、フルオレセインイソチオ
シアネ−トを用いてタンパク質アミン基に結合させるこ
とができる。ジニトロフェニル基が使用される場合に
は、2,4-ジニトロベンゼンスルホネ−トまたは2,4-ジニ
トロフルオロベンゼンを用いてタンパク質アミン基に結
合させることができる。モノクロ−ナル抗体と特異的結
合対とを結合させるために利用し得る他の標準的な結合
方法には、カルボジイミド結合、ホモ二官能性架橋（ho
mobifunctional crosslinking ）、およびヘテロ二官能
性架橋（heterobifunctional crosslinking ）が含まれ
る。カルボジイミド結合は、ある物質のカルボキシル基
を他の物質のアミン基に結合させる効果的な方法であ
る。カルボジイミド結合は、市販の試薬、1-エチル-3-
(3-ジメチル- アミノプロピル）- カルボジイミド（Ｅ
ＤＡＣ）を使用することにより容易になる。
【００４６】二官能価のイミドエステルを含むホモ二官
能性架橋剤は、市販品を利用することができ、ある物質
のアミン基と他の物質のアミン基との結合に使用され
る。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの異なる官能基を有
する試薬である。最もありふれた市販のヘテロ二官能性
架橋剤は、１つの官能基としてアミン反応性N-ヒドロキ
シ- スクシンイミドエステルを、第２の官能基としてス
ルフヒドリル反応基を有している。最もありふれたスル
フヒドリル反応基は、マレイミド、ピリジルジスルフィ
ドおよび反応性ハロゲンである。官能基の１つは、照射
により種々の基と反応する光活性アリ−ルニトレンであ
ってもよい。この発明による好ましい方式は、N-ヒドロ
キシスクシンイミドエステルによってモノクロ−ナル抗
体をビオチンと結合させることである。
【００４７】シグナル検出を容易にするために、モノク
ロ−ナル抗体または特異的結合対の要素のいずれかをレ
ポ−ティングシステムの成分で標識する。レポ−ティン
グシステムという用語は、選択されたレポ−タ−および
このレポ−タ−をモノクロ−ナル抗体もしくは特異的結
合対の成分と架橋させる手段を指す。したがって、レポ
−タ−はモノクロ−ナル抗体もしくは特異的結合対の要
素と、直接もしくは間接的に、共有結合的もしくは非共
有結合的に結合することができる。レポ−タ−は、放射
性同位体、酵素、蛍光体、磁性体、化学発光物質または
電気化学物質であり得る。通常使用されている２つの放
射性同位体は、 125Ｉおよび 3Ｈである。標準的な放射
性同位体標識手順には、クロルアミンＴ、ラクトペルオ
キシダ−ゼおよび 125Ｉに対する Bolton-Hunter法なら
びに 3Ｈに対する還元メチル化が含まれる。
【００４８】酵素もまた、免疫検定のレポーターとして
使用される。これらには、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ラクタ
マーゼ、ウレアーゼおよびリゾチームが含まれる。酵素
を用いた標識は、前に特異的結合対でのモノクローナル
抗体の標識のために述べたように、ジアルデヒド、カル
ボジイミド結合、ホモ二官能性結合剤を用いることによ
り容易になる。選択された標識方法は、酵素に有効な官
能基および標識される物質、並びに結合条件に対する両
者の耐性に依存する。この発明において用いられる標識
方法は、Engvall and Pearlmann, Immunochemistry 8,
871 (1971)、Avrameas and Ternynek, Immunochemistry
8, 1175 (1971) 、Ishikawa et al., J.Immunoassay 4
(3):209-327 (1983)および Jablonski, Anal.Biochem.
148:199 (1985)によって記述されたものを含む、現在用
いられている通常の方法の１つであり得る。標識は、ス
ペ−サ−または特異的結合対の別の要素を用いるような
間接法によってなされてもよい。この例は、非標識スト
レプトアビジンおよびビオチニル化酵素、非標識ストレ
プトアビジンおよび連続的もしくは同時に添加されたビ
オチニル化酵素を用いたビオチニル化抗体の検出であ
る。酵素活性の検出は、普通に知られた方法によって、
色素産生の、蛍光発生の、磁性の、化学発光のまたは電
気化学的な変化を測定することにより、容易にすること
ができる。
【００４９】レポ−タ−は現存する蛍光体、磁性体、ま
たは化学発光物質であり得る。加えて、レポ−タ−は電
気化学的手段によって検出することができる。これらの
レポ−タ−を用いた標識の方法のいくつかは上述されて
いる。好ましい態様においては、レポ−タ−として酵
素、アルカリホスファタ−ゼが使用され、基質に5-ブロ
モ-4- クロロインドキシルホスフェイト（以下、ＢＣＩ
Ｐ）および 2、2'-ジ-(p-ニトロフェニル) -5,5'-ジフェ
ニル-3,3'-（ 3,3'-ジメトキシ-4,4'-ジフェニレン）-
ジテトラゾリウムクロリド（以下、ＮＢＴ）が使用され
る。
【００５０】この発明において有用なモノクロ−ナル抗
体は、他の免疫グロブリンクラスと同様にＩｇＧタイプ
であり得る。
【００５１】さらに、これらのモノクロ−ナル抗体は、
標的に依存する多数の抗原性決定基に対するものでもよ
い。説明としては、ヌクレオカプシドタンパク、糖タン
パクまたはウイルスエンベロ−プに関連する抗原性決定
基に言及することができる。
【００５２】ウイルス検出に対する好ましい態様におい
ては、この発明はまた、採取および移送システム、特
に、この発明の免疫検定による試験のための試料を移送
するシステムを用いる。
【００５３】採取システムにはウイルスを採取する適切
な手段が利用され、移送システムには緩衝界面活性剤溶
液を有するチュ−ブが利用される。試料を採取した後、
検体は緩衝界面活性剤に浸漬される。直接浸漬すると試
料中のウイルスが溶解し、それにより抗原が試験を受け
易くなり、かつ移送の間安定になる。この溶液は、試料
中のタンパク質の互いの、もしくは接触する表面への非
免疫性結合を最小にするキャリアタンパクも含む。
【００５４】以下の界面活性剤は、この発明の範囲内に
あるものとして言及することができ、制限するものとし
て解釈されるものではない。ポリオキシエチレンエ−テ
ルおよびアルキルフェノキシポリエトキシ化合物のよう
な非イオン性界面活性剤；アルキル／アリ−ルスルホネ
−ト／スルフェ−トのようなイオン性界面活性剤；両性
イオン界面活性剤；オクチルグルコピラノシドおよびド
デシルマルトシドのような胆汁塩およびその誘導体。
【００５５】典型的なキャリアタンパクには、血清、ア
ルブミン、ゼラチンおよびカゼインが含まれる。
【００５６】検定システムに適合し得るいかなる緩衝剤
も発明の実施に使用することができる。
【００５７】最も好ましい態様においては、緩衝剤はリ
ン酸緩衝生理食塩水、界面活性剤はNONIDET P-40 （Ｎ
Ｐ40）およびキャリアタンパクはウシ血清アルブミンで
ある。
【００５８】
【実施例】以下の実施例は発明を説明するためのもので
あり、これらに制限されるものではない。
【００５９】例 １ モノクロ−ナル抗体の調製 55307 として同定される捕獲モノクロ−ナル抗体および
55306 として同定される検出用モノクロ−ナル抗体を、
Infection and Immunity、Vol.29、No.2、724-732 頁
（1980年 8月）に記載された L.Pereiraらの方法、およ
び B.Mishell andS.Schiigi編、Selected Methods in C
ellular Immunology 、W.H.Freeman Co.,San Francisco
の Immunoglobulin Producing Hibrid Cell Lines 、35
1-371 頁に記載された Oi らの方法に従って調製した。
【００６０】55306 および 55307の両者は、ＨＳＶ-1ま
たはＨＳＶ-2のいずれかからの糖タンパクｇＤと反応す
る。エピト−プの特異性は、非標識抗体を固相抗原に対
するビオチン標識抗体と競合させることにより決定され
る。非標識抗体が標識抗体の結合を阻害しない場合に
は、これらの抗体は異なるエピト−プに対するものであ
ることが決定される。抗体 55306および 55307は、ＨＳ
Ｖ 1および 2抗原ｇＤの異なるエピト−プに対する特異
性を有することが見出された。
【００６１】モノクロ−ナル抗体は、40％飽和硫酸アン
モニウムを用いた塩分画および Sephacryl S-300（Phar
macia, Inc., Piscataway, NJ ）でのゲルろ過によって
腹水から精製される。
【００６２】抗体ビオチニル化 抗体 55306溶液を 0.1Ｍ ＮａＨＣＯ3 緩衝液、ｐＨ
8.4に対して透析し、 1ｍｌ当り 1ｍｇの濃度に調節し
た。ジメチルスルホキシド 0.1ｍｌに 50 倍モル過剰の
ビオチン-N- ヒドロキシスクシンイミドエステル（Sigm
a Chemical Co.(St.Louis, MO)および Calbiochem (San
Diego, CA) を含む様々な源から市販品を購入）の溶液
を添加して室温で 2時間反応させ、 2Ｍトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノ- メタン（以下、トリス- ＨＣｌ緩
衝液という）、ｐＨ 8.0、 0.1ｍｌを添加した。15分
後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ 7.4、中の
1％ウシ血清アルブミン（Sigma ） 1ｍｌを添加し、こ
の溶液をＰＢＳに対して透析した。ビオチン化抗体は 4
℃で保存した。
【００６３】検定試薬、材料および装置 検定材料 透過性膜として使用するために、上述の化学的に活性化
された膜（Cat.No.IASD00005）を Millipore Corporati
on（Bedford, MA ）から購入した。
【００６４】図２に示す外形5 を有する、塩化亜鉛処理
吸収剤プラグは、Pore TechnologyLimited （Somervill
e, MA）によって以下のように製造された。多孔質ポリ
エチレンプラグを 200ｍＭ塩化亜鉛および 0.3％トリト
ンＸ-100を含有するイソプロパノ−ルで飽和した。50％
塩化亜鉛水溶液は、Mineral Research Inc. （Harrisbu
rg, NC）から購入した。この塩化亜鉛水溶液を、 0.3％
トリトンＸ-100を含有するイソプロパノ−ルのガロン当
り 206ｇ溶解した。プラグを、酵素- 阻害剤含有溶液で
飽和し、その後除去して使用の前に乾燥させた。
【００６５】10倍濃縮ＰＢＳ（Cat.No. 310-4200）を G
IBCO（Grand Island, NY）から購入し、蒸留水で 1／10
に希釈した。
【００６６】HIPURE液体ゼラチン（45％ w/v）を Norla
nd Products, Inc. （695 Joyce Kilmer Avenue, New B
runswick, NJ）から得た。以下、これをゼラチンとい
う。
【００６７】ストレプトアビジンおよびアルカリホスフ
ァターゼを Scripps Labortories（San Diego, CA ）か
ら購入し、ここに参考として組み込まれている E.Engva
lland P.Perlmann, Immunochemistry 8, 871 (1971)に
記述された一工程グルタルアルデヒド法を用いて結合さ
せた。
【００６８】酵素検定の基質は、トリス- ＨＣｌ緩衝液
中のＢＣＩＰ／ＮＢＴであった。これらの試薬は、Kirk
egaard and Perry、Gaithersburg, MDのような企業から
購入した。
【００６９】捕獲および検出用モノクロ−ナル抗体を上
述のように調製して精製し、検出用抗体を上述のように
ビオチニル化した。
【００７０】標準抗原調製品は UT 0329841 HVS-1 であ
った。陰性抗原は UT 041185であった。両者は Viral A
ntigens, Inc. (Memphis, Tennessee)から購入した。
【００７１】標準抗原調製品および陰性標準は、下記の
ように、試料希釈液中に希釈した。
【００７２】検定溶液 ＰＢＳを10倍希釈液として購入し、上述のように、蒸留
水で 1／10に希釈した。
【００７３】標準抗原希釈液は、0.05％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、 0.7％ Nonidet P-40 、および 0.1％
アジドを含有するＰＢＳ、ｐＨ 7.4であった。この溶液
をポアサイズ 0.22 μｍの膜を通してろ過した。
【００７４】検出用抗体希釈液は、 4％加熱正常ウサギ
血清 (GIBCO)、0.85％ＮａＣｌおよび 0.1％アジドを含
有する 0.2Ｍヘペス緩衝液、ｐＨ 7.5であった。この溶
液は、使用前に50℃で一晩加熱し、ポアサイズ 0.22 μ
ｍのフィルタを通してろ過した。
【００７５】結合体希釈液は、 1％ＢＳＡ、0.05％トゥ
イ−ン20、および 0.1％アジドを含有するＰＢＳ、ｐＨ
7.4であった。この溶液は 0.22 μ膜を通してろ過し
た。
【００７６】基質緩衝液は、Kirkegaard and Perryから
購入した。この溶液は 0.22 μ膜を通してろ過した。
【００７７】洗浄緩衝液は、0.05％トゥイ−ン20を添加
した基質緩衝液であった。
【００７８】停止溶液は 1.0Ｎ ＨＣｌであった。
【００７９】上述の 55306として同定されるビオチニル
化検出用抗体を、上述の検出用抗体希釈液中に 1／40に
希釈した。標準抗原調製品および陰性抗原調製品を上述
の標準抗原希釈液で希釈した。ストレプトビオチン- ア
ルカリホスファタ−ゼ結合体を結合体希釈液中に 1／50
0 に希釈し、基質を、基質緩衝液にＢＣＩＰ 1ｍｌおよ
びＮＢＴ 1ｍｌを添加することにより、使用直前に調製
した。
【００８０】装置の作製 透過性膜を、上述の 55307として同定される捕獲モノク
ロ−ナル抗体 2μｌでスポットした。この捕獲試薬は、
スポッティングの前に、 2ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈され
た。
【００８１】膜を約 5ないし30分間乾燥させた後、加湿
チャンバ内において約37℃で、ＰＢＳ中の 5％ゼラチン
を用いて一晩ブロックした。ブロッキング溶液は膜を通
して注意深く吸引し、膜は使用前に乾燥させた。
【００８２】約 3-4μｍの径を有する捕獲抗体スポット
の下の領域における、約 100×約 300μｍの５個の孔
は、繊維状多孔質ポリテトラフルオロエチレン膜に形成
された。最良の結果は、30ゲ−ジの針を用いて捕獲抗体
スポットの下の領域に５個の孔を形成することにより得
られた。４個の孔が、中央の第５の孔の周りに対称的に
配置された対称配置が最適に作用した。
【００８３】装置は、上述の通りに組み立てられた。
【００８４】検定手順 ポリエチレンチュ−ブ中で、抗原 0.2ｍｌを、検出用抗
体希釈液に希釈した検出用抗体 0.2ｍｌと混合し、室温
で 1-10 分間インキュベ−トして抗原をビオチニル化検
出用抗体と反応させた。標準抗原以外の試料を検定する
場合には、上述のように、次に特定の物質の除去が必要
となることもあることに注意しなければならない。
【００８５】インキュベ−ション後、混合物を検定装置
に入れた。タブを押し下げて、孔を通した良好な試薬の
流動が始まることを確実にした。約 5分以内に、試料液
体は装置に吸収された。さらに 5分間（試料添加から10
分間）室温でインキュベ−ションを続け、抗原- ビオチ
ニル化抗体を捕獲試薬と結合させた。次に、室温で10分
間インキュベ−トした結合体 0.2ｍｌを添加して、スト
レプトアビジン- アルカリホスファタ−ゼ結合体をビオ
チニル化ビオチニル化検出用抗体と結合させた。その
後、洗浄緩衝液 0.4ｍｌを添加した。洗浄緩衝液が十分
に吸収されたときに、基質 0.2ｍｌを装置に添加し、室
温でイキュベ−トして色を発現させた。10分後、停止溶
液 0.2ｍｌを添加した。
【００８６】膜は、結果を記録するために保存する前
に、取り外し、水で洗浄し、かつ乾燥させることができ
る。乾燥膜は、光から保護されたならば、数か月間安定
である。
【図面の簡単な説明】
【図１】検定装置を構成する、孔を有する (b)層の平面
図。
【図２】検定装置の外形を示す断面の正面図。
【符号の説明】
1…キャップ、 2…透過性層、 3…Ｏ−リング、 4…選
択的透過性層、5…吸収材プラグ、 6…装置本体、 7…
ベース、 8…タブ、 9…孔
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パトリシア・アン・カシラ アメリカ合衆国、ニューハンプシャー州 03087、ウインドハム、ケント・ストリー ト 16

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酵素検出系を用いて検定装置の吸収材層
    における発色を低減する方法であって、前記吸収材層
    を、前記検出系の酵素に特異的な酵素阻害剤を含有する
    溶液で飽和することを具備した方法。
  2. 【請求項２】 前記酵素阻害剤が塩化亜鉛である請求の
    範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】 酵素検出系を用いて検定装置の吸収材層
    における発色を低減する方法であって、該吸収材層を、
    アルカリホスラターゼに特異的な酵素阻害剤を含有する
    溶液で飽和することを具備した方法。
  4. 【請求項４】 前記阻害剤が塩化亜鉛である請求の範囲
    第３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 請求の範囲第１項に記載の方法に従って
    処理された吸収材層。
  6. 【請求項６】 前記酵素阻害剤が塩化亜鉛である請求の
    範囲第５項に記載の吸収材層。
  7. 【請求項７】 前記阻害剤が塩化亜鉛である請求の範囲
    第３項に記載の方法に従って処理された吸収材層。
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