DE2721942C3

DE2721942C3 - Vorrichtung zum Aufbereiten einer Meßflüssigkeit zum Einsatz in analytisch optischen Geräten

Info

Publication number: DE2721942C3
Application number: DE2721942A
Authority: DE
Inventors: Georg Dr. 5600 Wuppertal Frank
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1977-05-14
Filing date: 1977-05-14
Publication date: 1980-02-07
Also published as: IT1094667B; FR2390724A1; BR7803016A; JPS6027375B2; NL190427B; SE7805408L; NL7805189A; AU3600878A; GB1582224A; BE866993A; AU514940B2; IT7823384A0; DE2721942A1; CH637216A5; DE2721942B2; JPS53141688A; NL190427C; AT371253B; ES469792A1; FR2390724B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Aufbereiten einer Meßflüssigkeit zum Einsatz in analytisch optischen Geräten und geht aus von einer verschlossenen, mit einer genau eindosierten Reaktionslösung gefüllten Küvette und einer in die Küvette einbringbaren Kapillare zum Eindosieren der Probenflüssigkeit in die Reaktionslösung. Die Erfindung wird insbesondere bei der analytischen Untersuchung von Körperflüssigkeiten angewandt.

Im Bereich der hämatologischen, klinisch-chemischen und biochemischen Untersuchungen werden zunehmend »Fertig-Tests« angeboten, die es dem Benutzer erlauben, ohne selbst Reagenzien ansetzen /u müssen, schnell und einfach Bestimmungen hamatologischer, klinisch-chemischer unci biochemischer Parameter durchzuführen.

In neuerer Zeit sind insbesondere verschließbare Küvcttcn (DE-OS 2 422 260) bekanntgeworden, die als Kunststoff-Einweg-Meßküvetten (vorzugsweise aus Polystyrol) ausgebildet sind und mit einem Kunststoffdeckel luftdicht verschlossen werden.

Dabei wird bei der Massenfertigung der Deckel durch Verschweißen, z. B. mittels Ultraschall, mit der Küvette verbunden. Der Deckel besitzt eine Sollbruchstelle, die man mittels eines Zapfens aufbrechen kann. Durch die so erzeugte öffnung im Küvettendeckcl kann die zu analysierende Probe in die Küvette eingebracht werden.

Die Küvette selbst enthält schon die vollständige Reagenzflüssigkeit. Zur photometrischen Bestimmung der Erythrozytenzahl muß /. B. der Anwender nur noch 5 μΐ Blut mit einer Volumen-kalibrierten Glaskapillare durch die öffnung im Deckel in die Küvette einbringen. Sobald das Blut vollständig mit dem Reagenz vermischt ist, kann die phntometrische Messung erfolgen Dieses Verfahren zeichnet sich besonders dadurch aus, daß der Anwender weder das Rca·· genz selbst ansetzen oder lösen muß_v hoch daß er für die Analyse Hilfsgeräte wie z. B. Pipetten benötigt. Dadurch wird die Analyse erheblich vereinfacht, so daß sie auch von nicht speziell ausgebildeten Personen richtig ausgeführt werden kann,

Die beschriebenen Verfahren haben folgende

Nachteile:

- Beiden »Fertig-Tests« müssen meist noch Pipettierungen durchgeführt werden. Dazu werden teuere und empfindliche Hilfsgeräte wie z. B. Eppendorf-Pipetten benötigt. Die Pipettierung selbst stellt eine Fehlerquelle dar. Oft steht das benötigte Lösungsmittel, z. B. destilliertes Wasser, nicht in der geforderten Qualität (z. B. Quarz-destilliertes Wasser) zur Verfugung.

Das vollständige Reagenz bzw. das vollständige Reagenz-Probe-Gemisch muß noch in ein Meßgefäß, z. B. eine Glasküvette überführt werden, bevor der eigentliche Meßvorgang stattfinden kann. Dies ist ein zusätzlicher Arbeitsscbritt, der weitere Fehlermöglichkeiten einschließt, so z. B. nicht ganz saubere oder nicht ganz trockene (Volumenfehler!) Küvetten oder Rückstände von Detergenzien in den Küvetten.

Insgesamt ist die Handhabung dieser »Fertig-Tests« jedoch noch so kompliziert, daß man berechtigterweise nicht von einem »Fertig-Test« sprechen kann, und daß sich für nicht speziell ausgebildete Personen noch eine ganze Reihe von Fehlerquellen bei der Handhabung dieser Tests ergeben.

— Der in der DE-OS 2422 260 beschriebene Test erfüllt bereits weitgehend die Anforderungen an einen »Fertig-Test«. Der Anwender muß weder Reagenzien auflösen, noch verschiedene Lösungen exakt mischen, noch das fertige Reagenz-Prohe-Gemisch in ein Meßgefäß überführen. Er muß lediglich die zu analysierende Probe exakt dosiert in die Küvette einbringen, dies kann z. B. einfach durch Volumen-kaiibrierte Glaskapillaren erfolgen und die Küvette in das Photometer überführen.

Dadurch werden mögliche Fehlerquellen (Pipettieren) von vornherein ausgeschaltet und der Analysenvorgang so vereinfacht, daß selbst ungeschultes Personal die Analyse richtig durchführen kann.

Leider gibt es jedoch für biochemische, hamatologische und klinisch-chemische Analysen nur wenig Reagenzieii, die im gebrauchsfertigen Zustand über längere Zeit (6 Monate) haltbar sind (Vertrieb!).

Dies gilt insbesondere für die modernen enzymatischen Methoden. So z. B. für die Blutzuckerbestimmung mit Glucose-Oxidase/Peroxidase, mit Hexokinase^Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase oder mit Glucose-Dehydrogenase/Mutarotase, ebenso für die enzymatisch^ Bestimmung der Harnsäure, des Harnstoffs, der Triglyceride und des Cholesterins und natürlich auch für die Aktivitätsbestimmungen der Enzyme selbst.

Aber auch Reagenzien für nicht enzymatische Bestimmungen sind gebrauchsfertig oft nicht über längere Zeit (6 Monate) haltbar. Dies gilt z. B. für die Bestimmung des Bilirubins mit dia/otierter Sulfanilsäure nach Jcndrassik und Grot [2] oder mit 2,5-Dichlorphenyldiazoniumsalz nach Wahlefeld et al. [3], ebenso für die Bestimmung des Creatinine mit Pikrinsäure/NaOH nach Popper et al. [4],

Die Verwendung von Einweg-Meßküvetten bringt weitere Probleme mit sich. Glas scheidet als Material für Einweg-Meßküvetten aus, da Glasküvetten in der für photometrische Messungen benötigten Qualität viel zu teuer sind.

Die Verwendung von Kunststoffen, z. B. Polystyrol, erlaubt zwar pine preisgünstige Massenherstellung von Einweg-Meßküvetten, bringt jedoch häufig Probleme hinsichtlich der Haltbarkeit der Reagenzien mit

So ist Polystyrol nicht absolut wasserdampfundurchläsaig. Falls man dagegen keine geeigneten Maßnahmen trifft, ändert sich dadurch das Volumen der Reagenzflüssigkeit in der verschlossenen Küvette während der Lagerzeit. Da es bei den durchzuführenden Analysen immer auf ein bekanntes, genau festgelegtes Mischungsverhältnis ankommt, erhält man dadurch falsche Ergebnisse.

Polystyrol ist auch für viele Gase durchlässig. Das wirkt sich z. B. negativ auf die Haltbarkeit des Reagenzes zur Bestimmung von Hämoglobin als Hämiglobin-Cyanid aus. Dieses Reagenz enthäJt neben einer Puffersubstanz und einem Detergenz zur Hämolyse der Erythrozyten noch Kaliumhexacyanoferrat (III), das Hämoglobin zu Hämiglobin oxydiert und KCN das Hämiglobin in Hämiglobin-Cyanid überführt. Das Hämiglobin-Cyanid wird anschließend photometrisch bestimmt.

Das in dem Reagenz enthaltene KCN steht mit HCN im Gasraum über der Flüss.^keit im Gleichgewicht. HCN kann jedoch durch die i'olystyrolwand der Küvette diffundieren, so daß der CN -Gehalt des Reagenzes mit einer Halbwertzeit von ca. 4 Wochen abnimmt. Dadurch ergibt sich eine - für den Verkauf - nicht ausreichende Haltbarkeit des Reagenzes.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es nun, die oben beschriebenen Lebensdauerprobleme zu überwinden und Fertig-Tests zu entwickeln, bei denen vorgefertigte Kunststoff-Einweg-Küvetten verwendet werden können, die es dem Anwender erlauben, ohne Zusatzgeräte wie z. B. Pipetten, und ohne besondere Ausbildung in kurzer /.eit richtige Analysenergebnisse zu erhalten.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß wenigstens ein Reaktionspartner in fester Phase in einer in die Küvette einbringbaren Kapillare vorliegt. Vorteilhaft ist diese Kapillare gleichzeitig die Dosierkapillare zum Eindosieren der Probenihjssigkeit in die Küvette. Selbstverständlich kann aber auch eine zusätzliche Kapillare vorgesehen werden. Darüber hinaus können beide Kapillaren mit Renktionspartnern gefüllt werden.

Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind schließlich mehr als zwei Kapillaren zum Zwecke des Einbringens von Probenflüssigkeit und Reaktionspartnern in die Küvette vorgesehen.

Vorzugsweise sind die Reaktionspartner in fein verteilter Form auf der Innenwand der Kapillare aufgebracht.

Auf diese Weise kann das Spektrum der Reaktionspartner erheblich erweitert werden. Häufig lassen sich nämlich alle Reaktionspartner gar nicht zusammen in einc'.ösungaufbewahren.dasie dann innerhalb kurzer Zeit instabil werden oder miteinander reagieren. Durch die Verlagerung solcher instabiler Komponenten in die Kapillaren wird dieses Problem in elegantei Weise gelöst. Damit können weitere Reaktionen für das in der DE-OS 2 422 260 beschriebene Analysenverfiihrcn erschlossen werden, die bisher auf Grund der Instabilität der Reaktionspartner hierfür nicht geeignet waren. Die mit einem Reaktionspartner beschichteten Kapillaren bleiben, trocken aufbewahrt, über lange Zeit (mehr als 6 Monate) stabil, während die in der Lösung stabilen Reaktionspartner in üblicher Weise genau dosiert in die Meßküvette eingeschweißt werden.

Der Anwender kann nun

a) mit der auf der Innenoberfläche beschichteten Kapillare die Probe (Flüssigkeit, Blut, Plasma, Serum) aufnehmen und die gefüllte Kapillare in die Kunststoff-Einweg-Küveffe einbringen. Damit hat er mit einem sehr einfachen und schnell > ausführbaren Arbeitsschritt das Reagenz koiTH plettiert und die zu analysierende Probe exakt dosiert. Nach einer eventuell nötwendigen Reaktionszeit kann die Probe in einem Meßgerät (z. B. Photometer) analysiert werden. In diesem Falle muß die verwendete Kapillare natürlich volumenkalibriert sein und die auf der Innenoberfläche der Kapillare aufgebrachte Komponente des Reagenzes darf das Fiillvolumen nicht verfälschen.

b) die auf der Innenoberfläche beschichtete Kapillare in die vorgefertigte Kunststoff-Einweg-Meßküvette einbringen und dadurch das Reagenz komplettieren. Die zu analysierende Probe (Flüssigkeit, Blut, Plasma, Serum) kann anschließend zugegeben werden (z. B. mit einer volumenkalibrierten Kapillare). Nach einer eventuell notwendigen Reaktionszeit kann die Probe in einem Meßgerät (z. B. Photometer) analysiert werden. Muß bei der Bestimmung ein -'"> Reagenzienleerwert bestimmt werden, εο kann man diesen vor der Zugabe der zu analysierenden Probe bestimmen.

Muß ein Probenleerwert bestimmt werden, bringt man zweckmäßigerweise die Probe zuerst Mi in die vorgefertigte Kunststoff-Einweg-Meßküvette ein, bestimmt den Leerwert, komplettiert das Reagenz durch Zugabe der beschichteten Kapillare und bestimmt anschließend den Analysenwert. Dadurch kann in einer Kunststoff- i~> Einweg-Meßküvette sowohl der Probenleerwert als auch der Analysenwert bestimmt werden. Dadurch spart man eine Küvette und die Probenmenge, die ansonsten für die Bestimmung des Probenleerwertes erforderlich wäre.

c) mit der auf der Innenfläche beschichteten Kapilliirp pir.p wpitprf inctahilp Knmnnncntp 7 R eine Enzymsuspension oder die Suspension eines Enzymgemisches aufnehmen, in die vorgefertigte Kunststoff-Einweg-Meßküvette einbringen und dadurch das Reagenz komplettieren.
Die Zugabe der Probe kann je nachdem ob ein Reagenzienleerwert oder ein Probenleerwert bestimmt werden muß, vor oder nach der Zugabe der instabilen Komponenten erfolgen. >n

Das unter a) beschriebene Verfahren hat sich z. B. besonders bewährt bei der Bestimmung des Hämoglobins als Hämoglobincyanid.

1,25 ml des mit Ausnahme des KCN vollständigen Reagenzes werden in die Kunststoff-Einweg-Meßküvette eingeschweißt. Das KCN (70 μg pro Kapillare) befindet sich fein verteilt auf der inneren Oberfläche einer volumenkalibririerten Kapillare von 5 μΐ Inhalt. Mit dieser Kapillare wird die Probe, in diesem Fall Biut, aufgenommen. Durch die Kapillarwirkung füllt sich die Kapillare selbsttätig, sobald man sie mit dem Biut in Berührung bringt. Das KCN löst sich sofort im Blut und beeinflußt die Genauigkeit der Probedosierung nicht meßbar. Die Kapillare wird, nachdem sie sich mit Blut gefüllt hat, in die Kunststoff-Einweg-Meßküvette eingebracht. Durch leichtes Schütteln der Meßküvette wird der Kapillarinhalt mit dem Küvetteninhalt vermengt und dadurch gleichzeitig das Reagenz komplettiert sowie die Probe dosiert. Nach einer Reaktionszeit von 3 Minuten kann der Hämoglobirigehalt der Probe direkt in einem Photometer bestimmt werden.

Das unter b) beschriebene Verfahren hat sich besonders bei der BilirubinbestimmUng mit 3,5^Diöhlörphenyldiazöniumsälz nach Wahlef eld et al. [3] bewährt.

Bei dieser Bestimmung muß ein Probenleerwert berücksichtigt werden Da für die Bilirubinbestimmung relativ viel Probematerial Qe 50 μ.1 Serum für Probenleerwert und Analyse) benötigt wird, ist es hier besonders vorteilhaft, daß Probenleerwert und Analyse in einer Meßküvette (d. h. mit 50 μΙ Probe) bestimmt werden können.

In die Kunststoff-Einweg-Meßküvette sind 1,25 ml des mit Ausnahme des 2,5-Dichlordiphenyldiazoniümsalzes vollständigen Reagenzes eingeschweißt. Mit einer Kapillare wird die Probe (z. B. 50 μΐ Serum) zugegeben, leicht geschüttelt und der Reagenzienleerwert in einem Photometer bestimmt. Anschließend wird die Kapillare, an deren inneren Oberfläche sich das 2,5-Dichlorphenyldiazoniumsalz befindet, in die Küvette eingebracht und leicht geschüttelt. Nach der Reaktionszeit (10 Minuten) wird der Analysenwert im Photometer bestimmt. Das Ergebnis, den Bilirubingehalt der Probe, erhält man, indem man von dem Analysenwert den Probenleerwert subtrahiert und die Differenz mit einem feststehenden Faktor multipliziert.

Das unter c) beschriebene Verfahren wird bevorzugt angewandt, wenn für die Bestimmung mehrere in Lösung instabile Komponenten benötigt werden, wie z. B. bei der enzymatischen Cholesterinbestimmung nach Röschlau et al. [5] mit anschließender Farbreaktion nach Trinder [6].

In der verschweißten Kunststoff-Einweg-Meßküvette befinden sich 1,5 ml eines Phosphatpuffer/ Phenol / Methanol / Hydro xypoIyäthoxydodecan-Gemisches.

4-Aminophenazon bildet mit Phenol und dem w ο Hoc i-»^i r\f>r ?nz?^rrri—*iz^r'H~T^% ' ^rms^öt^^n'* dss Cijc lesterins entsteht, die Farbkomponente (4-(p-Benzochinonmonoimino)-phenazon), die photometrisch bestimmt wird.

4-Aminophenazon wird in fester Form auf die innere Oberfläche einer Glas- oder Kunststoff-Kapillare aufgebracht, da es in Lösung mit Phenol zusammen schon bei der Lagerung die zu bestimmende Farbkomponente bildet, die nach der enzymatischen Reaktion bestimmt werden soll.

Die mit 4-Aminophenazon beschichtete Kapillare wird nun dazu verwendet, um das z. B. in Ammoiumsulfat suspendierte Enzymgemisch (ca. 20 μΐ Cholesterinesterase/Cholesterinoxidase/Peroxidase) in die Kunststoff-Einweg-Meßküvette einzubringen. Durch leichtes Schütteln wird der Inhalt der Kapillare mit dem Inhalt der Küvette vermischt und dann der Reagenzienleerwert photometrisch bestimmt. Nun wird die zu analysierende Probe (Flüssigkeit, Serum, Plasma) mit einer volumenkalibrierten Kapillare (z. B. 10 μΐ) zudosiert, die Küvette leicht geschüttelt und nach einer Reaktionszeit von ca. 15 Minuten der Aiialysenwert im Photometer bestimmt. Das Ergebnis, den Cholesteringehalt der Probe, erhält man, indem man den Reagenzienleerwert vom Analysenwert subtrahiert und die Differenz mit einem feststehenden Faktor multipliziert.

Mit der beschriebenen Erfindung ist es zum ersten Male möglich geworden für hämatologische, klinisch-chemische Und biochemische Untersuchungen Küvetten-Feffig-Tesfs anzubieten, die im Gegensatz Zu den auf dem Markt befindlichen Mono-Tests, Einglas-Tests oder Ein-Tests wirkliche Feftig-Tests sind. Geg^über den bestehenden Systemen ergeben sich eine gfmze Reihe zum Teil überraschende Vorteile: - Die Verwendung von Kunststdff-Eihweg-Meßkiivetten erlaubt es, das gleiche Gefäß zur Probenvorbereitung und zur Messung zu verwenden. Dadurch braucht der Anwender die Probe nicht mehr in einem besonderen Reaktionsgefäß mit dem Reagenz zu mischen und anschließend in das Meßgefäß zu überführen. Dies bedeutet sowohl eine Kostenersparnis (keine Reaktionsgefäße nötig!) als auch eine Arbar.

Da die vorgefertigte Kunststoff-Einweg-Meßküvette alle flüssigen Bestandteile der Reaktiönslösung exakt dosiert enthält und die instabilen Komponenten sich exakt dosiert auf der inneren Oberfläche einer Kapillare (Glas oder Kunststoff) befinden, läßt sich die Reaktionslösung einfach und leicht durch Einwerfen der Kapillare in die Kunststoff-Einweg-Meßküvette komplettieren. Fehler beim Auflösen und Dosieren der instabilen Komponente werden dadurch ausgeschlossen. Dem Anwender werden Pipettier- ^chrilte erspart. Dadurch läßt sich die Analyse einfacher, schneller und genauer durchführen. Das Aufbringen der instabilen Komponenten auf die innere Oberfläche einer Kapillare hat besondere Vorteile:

- Kleine Mengen (Mikrogramm) können exakt in die Kapillare eingebracht und gehandhabt werden.

- Zuschlagstoffe werden nicht benötigt (z. B. Füllstoffe und Bindemittel bei der Tablettenherstellung), dadurch können die Zuschlagstoffe die häufig sehr empfindlichen Reaktionen nicht stören.

- Durch das Fehlen der Zuschlagstoffe wird ein schnelles Lösen der instabilen Komponente gewährleistet (ca. 1 min), während Tabletten z. B. 10 min bis zum vollständigen Auflösen benötigen.

- Trübungen, die oft durch Zuschlagstoffe hervorgerufen werden und die die photometrische Analyse erschweren, werden vermieden.

- Der direkte Kontakt gefährlicher Stoffe mit der Haut (Finger) wird vermieden.

- Die Haltbarkeit der Tests wird wesentlich verlängert, da auch instabile Komponenten einer Reaktionslösung, trocken und kühl aufbewahrt, oft jahrelang haltbar sind.

- Die Reaktionszeit läßt sich verkürzen und damit auch die Analysenzeit. So wird z. B. bei der Hämoglobin-Bestimmung mit der Hämiglobincyanid-Methode der pH-Wert der Lösung auf 7,2 eingestellt. Dies ist ein Kompromiß zwischen Reaktionsgeschwindigkeit, die mit zunehmendem pH-Wert der Lösung abnimmt und der Haltbarkeit der Lösung, die mit zunehmendem pH-Wert zunimmt, denn bei einem niedrigeren pH-Wert wird HCN schneller aus der Lösung ausgetrieben und die Reaktionslösung dadurch schnell unbrauch-Bei einem ph·'Wert von 7,2 beträgt die Reaktionszeit 3 Minuten.

Bei einem pH-Wert von 6,8 betragt die Reaktionszeit nur noch ί Minute, die Lösung ist jedoch nicht mehr über längere Zeit stabil, Verwendet man jedoch eine mit KGN innen beschichtete Kapillare, so kann man bei guter Stabilität den pH-Wert der Lösung auf z, B. 6,8 einstellen und damit die Reaktionszeit deutlich verkürzen.

- Da für die Komplettierung der Reagenzien dieser Kiivetten-Fertig-Tests keine Hilfsmittel (Pipetten, Meßzylinder u. ä.) benötigt werden, eignen sich diese Tests in idealer Weise für einen mobilen Einsatz, soz. B. im Rettungshubschrauber, Notarztwagen oder beim Hausbesuch, zumal für diese Tests ein tragbares, batteriebetriebenes Photometer (Compur Miniphotometer M 1000)

-'» zur Verfügung steht.

- Die Verwendung der Kunststoff-Einweg-Meßküvetten bietet auch Preisvorteile. Einerseits werden keine Zusatzgeräte (Pipetten, Probegefäße. Reaktionsgefäße) benötigt, andererseits

.'■> werden immer nur so viele Küvetten-Fertig-

Tests durch Zugabe der instabilen Komponenten komplettiert wie benötigt werden, dadurch müssen keine teueren Reagenzien verworfen (z. B. wegen mangelnder Stabilität) werden. Durch die

in problemlose Handhabung werden Fehler vermieden und dadurch Wiederholungsanalysen einspart.

- Durch die problemlose Handhabung, die Fehlermöglichkeiten weitgehend auschließt, können

π auch nicht speziell ausgebildete Personen die

Analysen durchführen und dabei richtige Ergebnisse erhalten. Dadurch können diese Tests auch durchgeführt werden, wenn kein speziell ausgebildetes Personal zur Verfügung steht (z. B. J» Nachtdienst, wenn keine MTA zur Verfügung

steht. Entwicklungsländer).
Die Möglichkeit, nicht speziell ausgebildetes Personal mit der Durchführung dieser Küvetten-Fertig-Tests zu beauftragen ermöglicht weitere Kostenein-4) sparungen.

Ausführungsbeispiele

Als Meßküvette dient die in der Zeichnung schematisch dargestellte Küvette aus Glas oder Kunststoff.

w Sie ist etwa zur Hälfte mit der Reaktionslösung 1 gefüllt und am oberen Ende hermetisch durch eine Kappe 2 abgeschlossen. Die Kappe 2 dient gleichzeitig als Griff für die Küvette, damit sie beim Anfassen nicht verschmutzt wird. An der Kappe 2 befindet

>i sich ein Zapfen 3, der eine Sollbruchstelle 4 aufweist. Bricht man den Zapfen 3 seitlich ab, so entsteht in der Kappenoberfläche ein kreisrundes Loch. Durch dieses Loch können die Kapillaren 5 und 6 eingeführt werden. Die Kapillare 5 dient z. B. zum Eindosieren der Flüssigkeitsprobe. Die Kapillare 6 ist auf ihrer Innenseite mit einem Reaktionspartner in fester Form beschichtet. An Stelle in Form einer Beschichtung kann der feste Reaktionspartner auch in loser Schüttung das Kapillarenvolumen ausfüllen. Beim Einbrin-

ö5 gen der Kapillaren 5 und 6 und kräftigem Schütteln der Küvette gehen der Inhalt der Kapillare 5 und der Reaktionspartner in der Kapillare 6 in die Reaktionslösting 1 über. Außerdem legen sich die Kapillaren 5

Und 6 in Folge der Adhäsionskräfte in den Ecken der Küvette an und stören daher den optischen Strahlengang im Photometer nicht. Es sind Fälle denkbar, in denen beide Kapillaren 5 und 6 auf der Innenseite mit verschiedenen Reaktionspartnern beschichtet sind, wobei die Kapillare 5 gleichzeitig zum Eindosie* ren dient. Ferner besteht die Möglichkeit, daß nur mit einer Kapillare gearbeitet wird. In diesem Fall ist die zum Dösierfn verwendete Kapillare 5 gleichzeitig der Träger für einen Reaktionspartner.

Als Photometer können handelsübliche Geräte benutzt werden, wie sie z. B. in der Deutschen Auslegeschrift 2448206 beschrieben sind.
A) Hämoglobinbestimmung mit der Hämoglobincyanid-Methode

Hierbei wird Hämoglobin durch Kaliumhexacyanoferrat (III) zu Hämiglobin oxydiert und dieses mit Kalium-Cyanid in Hämiglobincyanid überführt.

Meßgröße ist die Extinktion des Hämiglohincyanlds bei 540-546 nm.

Geräte: Sepktral- oder Filterphotometer

mit Meßwellenlänge von 540oder 546 nm.
Reagenzien: Kunststoff-Einweg-Meßküvetten

mit Deckel.

Schichtdicke: 1,00 cm Inhalt: 1,25 ml Reagenz folgender Zusammensetzung:
0,6 mmol/1 Kaliumhexacyano-

ferrat (III)
2,5 mmol/1 Phosphatpuffer pH

7,2 (oder pH 6,8)
1,5 mmol/1 Natriumchlorid
0,05% Detergenz

(z. B. Saponin)

Volumenkalibrierte Glaskapillaren mit 5 μΐ Inhalt (Länge: 32 mm Innendurchmesser 0,446 mm), die auf der inneren Oberfläche mit 70 μg KCN beschichtet sind.

Durchführung

Die Sollbruchstelle 4 im Deckel 2 der Kunststoff-E:"\veg-Mcßküvettc winJ mitieis des dafür vorgesehenen Zapfens 3 aufgebrochen. Mit der volumenkalibrierten Glaskapillare 5 werden z. B. von einem Blutstropfen auf der Fingerbeere oder aus einem Probengefäß, indem sich das Blut befindet, 5 μΐ Blut aufgenommen. Blutreste, die sich eventuell außen an der Kapillare befinden, werden abgestreift und die blutgefüllte Kapillare 5 in die Küvette eingeworfen. Die Öffnung im Deckel 2 wird mit einem Klebeetikett verschlossen. Durch Schütteln der Meßküvette wird das Blut mit dem Reagenz 1 vermischt, dabei ist darauf zu achten, daß die Meßküvette nur am Deckel und am Boden angefaßt wird, so daß eine Verschmutzung der Küvettenwände (Meßflächen) nicht stattfinden kann. Nach Ablauf der Reaktionszeit (bei pH 7,2 drei Minuten, bei pH 6,8 eine Minute) kann die Extinktion der Analyse gegen eine noch unbenutzte Kunststoff-Einweg-Meßküvette (= Reagenzienleerwert) im Photometer gemessen werden. Das Ergebnis, die Hämoglobinkonzentration des Blutes in Gramm Hämoglobin je 100 ml Blut erhält man, indem man die Extinktion mit 36,8 multipliziert.

Herstellung der KCN-innenbeschichteten Kapillaren:

70 mg KCN werden in 5 ml geeignetem 5-ösungs-

■?»

mittel (z. B. Methanol, Äthanol) gelöst. Die Kapillaren 5 werden durch Eintauchen in diese Lösung gefüllt. Unter leichtem Vakuum wird das Lösungsmittel abgezogen, dadurch verteilt sidh das KCN gleichmäßig auf der inneren Oberfläche der Kapillare. Trocken gelagert sind diese Kapillaren mindestens 12 Monate stabil.

Wefdert die Kunststoff-Einweg Meßküvetten wasserdampfundurchlässig veipackt (z. B. durch Einsiegeln in Aluminium-Tiefziehfolie), so ist der Inhalt bei Volumenkonstanz ebenfalls mindestens 12 Monate stabil.

Meßbereich und Empfindlichkeit der Bestimmung entsprechen völlig der in der DIN Vornorm 58931 beschriebenen Rcferenzmethode.

Richtigkeit und Präzision wurden durch Mehrfachanalysen von Kontrollblut (4 C von Co u 11e r-Cο u ·ί ter, CH 60 von Merz und Dade) überprüft. Bei der Bestimmung des Hämoglobins mit den Fertig-KüveUen erhält man die gleichen Ergebnisse wie bei der Bestimmung des Hämoglobins mit dem Hämoglobinometcr der Coulter Electronics GmbH.

Aus den Ergebnissen der an 40 Humanblutproben durchgeführten Vergleichsuntersuchungen errechnete sich die Regressionsgerade

y = 0,9669 *+0,3570

(y= Fertigküvette; X = Hämoglobinometer) und der Korrelationskoeffizient r- +0,9985.

Nach diesen Werten besteht zwischen den beiden Verfahren eine sehr enge Korrelation.
B) Bilirubinbestimmung mit 2,5-Dichlorphenyldiazoniumsalz

Bei dieser Bestimmung wird das Gesamt-Bilirubin mit 2,5-Dichlorphenyldiazoniumchlorid zu dem entsprechenden Azobilirubin gekuppelt. Indirektes Bilirubin wird durch ein Detergenz freigesetzt.

Meßgröße ist die Extinktion des Azobilirubins bei 546 nm.

Geräte: Spektral oder Filterphotometer

mit Meßwellenlänge von 546 nm.

Reagenzien: Kunststoff-Einweg-Meßküvetten

mit Deckel.

Schichtdicke: 1,00 cm. Inhalt 1,25 ml Reagenz folgender Zusammensetzung:
0.1 N Salzsäure
1 °/c Detergenz

Volumenkalibrierte Glaskapillaren mit 20 μΐ Inhalt (Länge 30 mm Innendurchmesser 1,302 mm), die auf der inneren Oberfläche mit 2,5-DichIorphenyIdiazoniumchlorid beschichtet sind.
Voluinenkalibrierte Glaskapillaren (50 μΐ) zum Dosieren der Probe.

Durchführung

Die Sollbruchstelle 4 im Deckel 2 der Kunststoff-Einweg-Meßküvette wird mittels des dafür vorgesehenen Zapfens 3 aufgebrochen. Mit einer volumenkalibrierten Glaskapillare 5 werden 50 μΐ Probe, z. B. Serum oder Plasma, in die Meßküvette eingebracht. Nachdem die öffnung im Deckel mit dem Klebeetikett verschlossen wurde, wird die Probe durch leichtes Schütteln der Meßküvette mit dem Reagenz vermischt. Dabei ist darauf zu achten, daß die Meßflächen

nicht berührt Werden. Nun bestimmt man im Photo^ meter die Extinktion der Meßküvette (E_x = Probenieerwert). Anschließend wird die Glaskapillare 6, die das 2,5-DichlorphenyIdiazoniumchlorid enthält, in die Meßküvette eingebracht, die Küvette wird leicht geschüttelt bis sich das 2,5-Dichlorphenyldiazoniumchlorid gelöst hat (ca. 15 Sekunden). Nach Ablauf der Reaktionszeit (mindestens 10 Minuten bei Zimmertemperatur) kann die Extinktion der Analyse (E₂) im Photometer bestimmt werden.

Das Ergebnis, die Konzentration des Gesamt-Bilirubins in Milligramm je 100 ml Probe (Serum oder Plasma), erhält man, indem man den Probenleerwert (E_x) vom Analysenwert (E₂) abzieht und die Differenz mit 44,5 multipliziert.

Herstellung der mit 2,5-Dichlorphenyldiazoniumchlorid innenbeschichteten Kapillaren:

125 mg 2,5-DichlorphenyIdiazoniumchlorid werden in 10 ml geeigneter Flüssigkeit (z. B. Äther! suspendiert. Volumenkalibrierte Glaskapillaren mit 20 μΐ Inhalt werden durch Eintauchen in diese Lösung gefüllt. Unter leichtem Vakuum wird die Flüssigkeit abgezogen. Dadurch verteilt sich das 2,5-Dichlorphenyldiazoniumchlorid gleichmäßig auf der inneren Oberfläche der Kapillare. Trocken und kühl gelagert sind diese Kapillaren mindestens 12 Monate stabil. Werden die Kunststoff-Einweg-Meßküvetten wasserdampfundurchlässig verpackt (z. B. durch Einsiegeln in Aluminium-Tiefziehfolie), so ist der Inhalt bei Volumenkonstanz ebenfalls mindestens 12 Monate stabil.

Meßbereich und Empfindlichkeit der Bestimmung entsprechen der von Wahlefeld et al. [3] beschriebenen Methode.

Richtigkeit und Präzision wurden durch Mehrfachanalysen von Kontrollseren überprüft. Bei der Bestimmung des Gesamt-Bilirubins mit den Fertig-Küvetten erhält man Ergebnisse, die gut mit den Ergebnissen der Bestimmung des Gesamt-Bilirubins mit der von Wahlefeld et al. [3] beschriebenen Methode übereinstimmen.

Aus den Ergebnissen der an 40 Proben durchgeführter; Vcrgicichsüfiiciauuiuiigen errechnete sich die Regressionsgerade

y= 0,9392· *+0,1804

(y = Fertigküvette; X= Testpackung, Bilirubin DPD-Methode von Boehringer Mannheim) und der Korrelationskoeffizient r= +0,9931.

Nach diesen Werten besteht zwischen den beiden Verfahren eine sehr enge Korrelation.
C) Enzymatische Cholesterinbestimmung mit Cho-Iesterinesterase, Cholesterinoxidase, Peroxidase und anschließender Farbreaktion nach TRIN-DER.

Bei dieser Methode werden Cholesterinester durch Cholesterinesterase gespalten. Cholesterin wird durch Cholesterinoxidase zu 4⁴-Cholestenon oxydiert. Das dabei entstehende H₂O₂ wird mit Phenol und 4-Aminophenazon durch Peroxidase zur Farbkomponente, dem 4-(p-Benzochinon-monoimino)-phenazon umgesetzt. Meßgröße ist die Extinktion des 4-(p-Benzochinon-monoimino)-phenazon bei 546 nm.

p
Geräte: Spektral oder Filterphotometer

mit Meßwellenlänge von 546 nm. Reagenzien: Kunststoff-Einweg-Meßküvetten

mit Deckel. Schichtdicke 1,00 cm.

Inhalt 1,50 ml Reagenz folgender Zusammensetzung:
0,4 mmol/I Kaliumphosphatpuffer pH 7,7
lOmmol/1 Phenol
1,8 mmol/1 Methanol
0,4% Hydroxypolyäthoxy-

dödecari

Volumenkalibrierte Glaskapillaren mit 20 μΐ

'" Inhalt (Länge 32 mm, Innen

durchmesser 0,892), die auf der inneren Oberfläche mit 4-Aminophenazon beschichtet sind.
Volumenkalibrierte Glaskapillaren (20 μΐ) zum Dosieren der

Probe.

Enzymgemisch in 3,2 M Ammoniumsulfatlösung, bestehend aus ?()Ii/ml Cholesterinesterase

-'" 6 U/ml Cholesterinoxidase

4 U/ml Peroxidase

Durchführung

Die Sollbruchstelle im Deckel der Kunststoff-Ein- -'"> weg-Meßküvette wird mittels des dafür vorgesehenen Zapfens aufgebrochen. Mit der volumenkalibrierten Glaskapillare, die auf der inneren Oberfläche mit 4-Aminophenazon beschichtet ist, werden 20 μΐ des Enzymgemisches in die Meßküvette eingebracht und ι» durch leichtes Schütteln mit dem Inhalt vermischt. Dadurch wird das Reagenz zur Cholesterinbestimmung komplettiert. Nun wird in einem Photometer die Extinktion der Meßküvette (E_x = Reagenzienleerwert) bestimmt. Anschließend werden mit einer π volumenkalibrierten Glaskapillare 20 μΐ der Probe (Serum oder Plasma) in der Meßküvette angebracht und durch leichtes Schütteln mit dem Reagenz vermischt. Nach Ablauf der Reaktionszeit (mindestens 10 Minuten bei Zimmertemperatur) wird die Extinkto tion der Analyse (E₂) im Photometer bestimmt.

Das Ergebnis, die Konzentration des Cholesterins in Milligramm je 100 ml Probe (Serum oder Plasma) ernäit man, indem man den Reagenzienieerwert (E_x) vom Analysenwert (E₂) abzieht und die Differ J:iz mit π 652 multipliziert.

Herstellung der mit 4-Aminophenazon innenbeschichteten Kapillaren:

457 mg 4-Aminophenazon werden in 20 ml geeigneter Flüssigkeit (z. B. Dichlormethan, Benzol) ge-".(i löst. Volumenkalibrierte Glaskapillaren mit 20 μΐ Inhaltwerden durch Eintauchen in diese Lösung gefüllt. Bei ca. 60° C wird die Flüssigkeit unter leichtem Vakuum abgezogen. Dadurch verteilt sich das 4-Aminophenazon gleichmäßig auf der inneren Oberfläche der r> Kapillare.

Kühl und trocken aufbewahrt sind diese Kapillaren mindestens 12 Monate stabil.

Werden die Kunststoff-Einweg-Meßküvetten wasserdampfundurchlässig, z. B. durch Einsiegeln in Aluminium-Tiefziehfolie verpackt, so ist der Inhalt bei Volumenkonstanz mindestens 12 Monate stabil.

Das Enzymgemisch wird in Glasgefäßen aufbewahrt und ist bei Lagerung bei +4⁰C mindestens 12 Monate stabil.

Meßbereich und Empfindlichkeit der Bestimmung entsprechen der von Röschlau et ai. [5] beschriebenen Methode.

Richtigkeit und Präzision wurden durch Mehrfach-

analysen von Kontrollseren überprüft. Bei der Cholesterinbestimmung mit den Fertig-Küvetten erhält man Ergebnisse, die gut mit den Ergebnissen der Cholesterinbestimmung mit der Methode nach Röschlau et al. [5] übereirtftimmen, wobei die Testpackung Cholesterin CHOD-PAP-Methode von Boehringer Mannheim verwendet wurde.

Aus den Ergebnissen der an 40 Proben durchgeführten Vergleichsuntersuchungen errechnete sich die Regressionsgerade >·= 0,9905 · .Y+2,734 (j>=Fertigküvette; JF-Testpackung Cholesterin CHOD-PAP-Methode, Boehringer Mannheim) und der Korrelationskoeffizient r= + 0,9885.

Nach diesen Werten besteht zwischen den beiden Verfahren eine enge Korrelation.
D) Enzymatische Blutzuckerbestimmung mit GIucoseoxidase, Peroxidase und anschließender Farbreaktion nach TRINDER (Beispiel für mehrere empfindliche Komponenten in der Kapillare).

Bei dieser Methode wird Glucose durch GIucoseoxidase zu Gluconsaure oxydiert. Dts dabei entstehende H,O wird mit Phenol und 4-Aminophenazon durch Peroxidase zur Farbkomponentc. dem 4-(p-Benzochinon-monoimino)-phenazon umgesetzt

Meßgröße ist die Extinktion des 4-(p-Ben/ochinon-monoimino)-phenazon hei M6 nm.
Geräte: Spektral oder Filterphotometer

mit Meßwellenlänge von 546 nm. Reagenzien: Kunststoff-Einweg-Meßküvetten mit Deckel. Schichtdicke 1 cm.
Inhalt 1.5 ml Reagenz folgender Zusammensetzung:
0.1 rr.moli Phosphatpuffer

pH 7.(1

4 mmol I Phenol
Volumenkalibrierte Glaskapillaren mit 10 μΐ Inhalt (Lange 10 mm; Innendurchmesser 1. 12 mm), die auf der inneren Oberfläche mit einer Mischung aus Glucoseoxidase. Peroxidase und 4-Aminophenazon beschichtet sind

Volumenkalibrierte Glaskapillaren mit 10 μΙ Inhalt zum Dosieren der Probe

Durchführung

Die SoHbruchstelle im Deckel der Kunststoff-Einweg-Meßküvette wird mittels des dafür vorgesehenen Zapfens aufgebrochen. Die volumenkalibrierte Glaskapillare, die das Glucoseoxidase/Peroxidase/4-Aminophenazon-Gemisch enthält, wird in die Meßküvette eingebracht, dadurch wird das Reagenz komplettiert. Direkt danach werden 10 μΐ Probe (z. B. Serum oder Plasma) mit einer volumenkalibrierten Glaskapillare in die Meßküvette eingebracht. Durch leichtes Schütteln wird der Inhalt der Kapillaren mit dem Inhalt der Meßküvette vermischt, Anschließend wird in einem Photometer die Extinktion der Meßküvette (E₁ = Reagenzien^ Und Probenleerwert) bestimmt. Nach Ablauf der Reaktionszeit (mindestens 20 Minuten bei Zimmertemperatur) wird die Extinktion der Analyse (E₂) im Photometer bestimmt.

Das Ergebnis, die Glücosekonzentratiort in Milli* gramm je 100 ml Probe (Serum oder Plasma) erhält

man, indem man den Reagenzien- und Probenleerwert (E₁) vom Analysenwert (E₂) abzieht und die Differenz rnit 597 multipliziert.

Herstellung der mit Glucoseoxidase/Peroxidase/ 4-Aminophenazon innen beschichteten Kapillaren: 500 mg Glucoseoxidase (Reinheitsgrad Π100 U/mg), 50 mg Peroxidase (Reinheitsgrad Π 100 U/mg) und 520 mg 4-Aminophenazon werden in 10 ml geeignetem Lösungsmittel (z. B. Aceton oder Dichloräthan) suspendiert. Volumenkalibrierte Glaskapillaren von 10 ul Inhalt werden durch Eintauchen in diese Suspension gefüllt. Unter leichtem Vakuum wird die Flüssigkeit abgezogen, dadurch verteilen sich die Enzyme und das 4-Aminophenazon gleichmäßig auf der inneren Oberfläche der Kapillare.

Kühl und trocken aufbewahrt sind diese Kapillaren mindestens 15 Monate stabil.

Werden die Kunststoff-Einweg-Mcßküvetten wasserdampfundurchlässig, z. B. durch Einsiegeln in AIuminium-Tiefziehfolie verpackt, so ist der Inhalt der Volumenkonstanz mindestens 15 Monate stabil.

Die Bestimmung ist im Bereich von 50-400 mg/ Glucose je 100 ml Probe linear. Bei höheren Glucosekonzentrationen muß die Probe verdünnt werden.

Richtigkeit und Präzision wurden durch Mehrfachanalysen von Kontrollseren überprüft.

Man erhält bei der GIucose-Bestimmung mit den Fertig-Küvette.. Ergebnisse, die gut mit den Ergebnissen übereinstimmen, die man erhält, wenn man zur Bestimmung der Glucose die Automatenpackung Glucose GOD-PAP-Methode von Boehringer Mannheim verwendet.

Aus den Ergebnissen, der an 40 Proben durchgeführten Vergleichsuntersuchungen, errechnete sich die Regressionsgerade y= 0,9828 X+ 0,7491 (y = Fertigküvette. X = Automatenpackung Glucose GOD-PAP-Methode. Boehringer Mannheim) und der Korrelationskoeffizient r= + 0,9923.

Nach diesen Werten besteht zwischen beiden Verfahren eine enge Korrelation.
E) F.nzymatische Blutzuckerbestimmung mit der Glucose-Dehydrogenase-Methode (Beispiel für UV-Test)

Bei dieser Methode wird /3-D-Glucose durch die Glucose-Dehydrogenase in D-Gluconolacton überfuhrt Dabei wird NAD (Nicotinamidadenindinucleotid = Coenzym) zu NADH₂ redu ziert. Das Hnzym Mutarotase beschleunigt die Bildung der /Ϊ-D-Glucose aus a-D-GIucose. Meßgröße ist die Extinktion des NADH₂ bei 340 oder 3ftf> nm

Gerrite Spektral oder Filterphotometer

mit Meßwellenlänge von 340 oder 366 nm.

Reagen/ien Kunststoff-Einweg-Meßküvetten mit Deckel. Schichtdicke 1 cm; Inhalt 1,5 ml Reagenz folgender Zusammensetzung: I).l mmol/l Phosphatpuffer

pH 7,6

Volürrtenkalibricrte Glaskapillaren mit 10 μΐ Inhalt (Länge 10 mm; Innendurchmesser 1,12 mm)j die auf der inneren' Oberfläche mit einer Mischung aus Glucosö-Deriydrögenasei Mufa* rotäse und NAD beschichtet sind. Völumönkalibnefte ÖlaskapiUa*

27

Γ\ λ O

ren mit 10 μ! Inhalt zum Dosieren der Probe.

Durchführung

Bei dieser Methode wird ein Reagenzienleerwert (ist für jede Packung nur einmal erforderlich) bestimmt. Dazu wird eine Meßküvette mit Puffer gegen eine Meßküvette mit Puffer und innenbeschichteter Kapillare gemessen. Die Extinktionsdifferenz ist der Reagenzienleerwert (E₀). In eine geöffnete Meßküvette wird die Probe (z. B. 10 μΐ Serum oder Plasma) eingebracht und mit dem Puffer vermischt. Nun wird im Photometer der Probenleerwert bestimmt (E₁). Anschließend wird die innen mit Glucose-Dehydrogenase/Mutarotase/NAD beschichtete Kapillare in die Meßküvette eingebracht und der Inhalt durch leichtes Schütteln mit dem Inhalt der Meßküvette vermischt. Nach Ablauf der Reaktionszeit (10 Minuten bei Zimmertemperatur) wird die Extinktion der Analyse (E₂) im Photometer bestimmt.

Das Ergebnis, die Glucosekonzentration in Milligramm je 100 ml Probe, erhält man nach folgender Formel:

Ergebnis = E₂ - (E₁ + E₀ Ϊ x 824

Herstellung der mit Glucose-Dehydrogenase/Mutarotase/NAD innen beschichteten Kapillaren:

100 Einheiten Glucose-Dehydrogenase (Units)

3,8 Einheiten Mutarotase (Units) und

14,6 mg NAD

werden in 10 ml geeignetem Lösungsmittel (z. B. Dichlormethan, Dichloräthan) suspendiert. VoIumerkalibrierte Glaskapillaren von 10 μΐ Inhalt werden durch Eintauchen in diese Suspension gefüllt. Unter leichtem Vakuum wird das Lösungsmittel abgezogen, dadurch vei teilen sich die Enzyme und das NAD gleichmäßig auf der inneren Oberfläche der Kapillare.

Kühl und trocken aufbewahrt sind die Kapillaren mindestens 15 Monate stabil.

Die wasserdampfundurchlässig verpackten Kunststoff-Einweg-Meßküvetten sind ebenfalls mindestens 15 Monate haltbar. Meßbereich und Empfindlichkeit der Bestimmung entsprechen der von Banauch et al. [7] beschriebenen Methode.

Man erhält bei der Glucose-Bestimmung mit den Fertig-Küvetten Ergebnisse, die gut mit den Ergebnissen der Glucosebestimmung nach Banauch [7] übereinstimmen, wobei die Testpackung Glucose (Gluc-DH-Methode, UV-Test) von Merck verwendet wiirde.

Aus den Ergebnissen, der an 40 Proben durchgeführten Vergleichsuntersuchungen, errechnete sich die Regressionsgerade y= 0,9926 ^+2,4120 (y = Fertigküvette; A - Merckotest® Glucose) und der Korrelationskoeffizient r= +0,9941.

Nach diesen Werten besteht zwischen den beiden

Verfahren eine enge Korrelation.

F) Bestimmung der Chöliriesteräse-Aktivität nach

Oman (Beispiel für eine kinetische Methode)

Bei der Von Ellrnan et al. (8) beschriebenen Me*

thöde spaltet die GhoÜnesterase Acetylthiöchö-

Ünjodid in Essigsäure" und Thiocholinjodid.

Thiocholinjodid reduziert die 5,5'*Öithiobis-2<·

iiitrobenzoesäure (DTND) zu S-Thio-2-nitro^

benzoesäure, die phötömetriseh bei 40S mn be

Stimmt wird,

Meßgröße ist die Extinktionsänderung der 5-Thio-2-nitrobenzoesäure bei 405 ran.
Geräte: Spektral oder Filterphotometer

ϊ mit Meßwellenlänge von 405 nm

und auf 25° C temperierbarem Küvettenhalter.

Reagenzien: Kunststoff-Einweg-Meßküvetten mitDeckel. Schichtdicke 1,00 cm; Ό Inhalt 1,5 ml Reagenz folgender

Zusammensetzung:
50 mmol/1 Phosphatpuffer

pH 7,2

0,1% Saponin

η Volumenkalibrierte Glaskapillaren mit 10 μΐ Inhalt (Länge 10 mm; Innendurchmesser 1,12 mm), die auf der inneren Oberfläche mit einer Mischung von 2" Acetylthiocholinjodid und

DTNB beschichtet sind.
Volumenkalibrierte Glaskapillaren mit 5 μΐ Inhalt zum Dosieren der Probe.

Durchführung

Da Enzymaktivitätsbestimmungen sehr stark temperaturabhängig sind, muß die Aktivitätsbestimmung der Cholinesterase bei genau 25° C erfolgen. Dazu

jo wird die Kunststoff-Einweg-Meßküvette auf diese Temperatur vorgewärmt (z. B. im temperierbaren Küvettenhalter des Photometers). Durch Einbringen der mit Acetylthiocholinjodid und DTNB innen beschichteten Kapillare v. ird das Reagenz komplettiert.

Ji Anschließend werden mit einer volumenkalibrierten Kapillare 5 μΐ Probe (z. B. Serum, Plasma oder Vollblut) zugegeben und durch leichtes Schütteln mit dem Reagenz vermischt. Die Meßküvette wird in den auf 25° C temperierten Küvettenhalter des Photometers

■ίο gestellt. Nach 30 Sekunden wird die Anfangsextinktion (E₁) abgelesen.

Genau 60 Sekunden später wird E₁ bestimmt. Nochmals 60 Sekunden spater wird E₃ betimmt. Die Extinktionsdifferen/ pro Minute erhält man als Mit-

4i telwert von E₁ — E_x und E, — E₁. Das Ergebnis, die Aktivität der Cholinesterase in Units je Milliliter (U/ ml) erhält man. indem man die Extinktionsdifferenz pro Minute (Δ E/min) mit 22,6 multipliziert.

Herstellung der mit Acetylthio-holinjodid und DTNB innen beschichteten Kapillaren.

?.,25 g Acetylthiocholinjodid und 150 mg 5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB) werden in 10 ml geeignetem Lösungsmittel (z. B. Methanol oder Äthanol) suspendiert. Volumenkalibrierte Glaskapil-

« laren von 10 μΐ Inhalt werden durch Eintauchen in diese Suspension gefüllt. Unter leichtem Vakuum wird das Lösungsmittel abgezogen, dadurch verteilt sich das Acetylthiocholinjodid und die DTNB gleichmäßig auf der inneren Oberfläche der Kapillare.

Kühl und trocken aufbewahrt sind diese Kapillaren mindestens 15 Monate stabil»

Dig wasserdampfundurchlässig verpackten Kunst* stöff-Einweg*Meßküvetten!sind ebenfalls mindestens 15 Monate haltbar, Meßbereich und Empfindlichkeit

entsprechen der von Frank [9] bescliriebenen Me"* thode.

Richtigkeit und Präzision wurden durch Mehffächanalysen von Kontrollseren überprüft. Man erhält bei

der Aktivitätsbestimmung der ChoUnesterase mit den Fertjg-Küvetten Ergebnisse, die gut mit den Ergebnissen der Cholinesteraseaktivitätsbestimmung nach Ellmap.n et al. [8] übereinstimmen, wobei die Testpackung Cholinesterase vonBoehringer Mannheim verwendet wurde.

Aus den Ergebnissen der an 40 Proben durchgeführten Vergleichsuntersuchungen errechnete sich die Regressio nsgerade

y= 1,0030 ■ X- 0,0210

(j> = Fertigküvette; Jt= Testpackung Cholinesterase von Boehringer Mannheim) und der Korrelationskoeffizient r= + 0,9963.

Nach diesen Werfen besteht zwischen beiden Verfahren eine enge Korrelation.

Literatur

[1] C. Steffen:

18

Photometrische Bestimmung der ErythQrzjtenzahl

Ärztl. Lab. 5 (195^CJ) 76-77 [2] L. Jendrassik et al.:

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Biochem. Pharmacol. 7 (1961) [9] G. Frank:

Z. Analyt. Chem. 279 (1976)

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zum Aufbereiten einer Meßflüssigkeit zum Einsatz in analytisch optischen Geräten, bestehend aus einer verschlossenen, mit einer genau eindosierten Reaktionslösung gefüllten Küvette und einer in die Küvette einbringbaren Dosierkapillare zum Eindosieren der Probenflüssigkeit in die Reaktionslösung, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Reaktionspartner in fester Phase in einer in die Küvette einbringbaren Kapillare (5, 6) vorliegt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare gleichzeitig die Dosierkapillare (5) für die Probenflüssigkeit ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kapillare (6) mit dem Reaktionspartner zusätzlich zur Dosierkapillare (5) vorgesehen ist.

4. Von lvhtung nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß beide Kapillaren (S, 6) Reaktionspartner enthalten.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als zwei Kapillaren zum Zwecke des Einbringens von Probenflüssigkeit und Reaktionspartnern in die Küvette vorgesehen sind.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionspartner in fein verteilter Form auf der Innenwand der Kapillaren (5, 6) ausbracht sind.

7. Vorrichtung nach Ansoruch 1, 2 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Hämoglobinkonzentrationsbestimmungdie Reaktionslösung (1) in der Küvette aus einer phospl.atgepufferten KaIiumhexacyanoferrat (111)/Natriumchlorid-Lösung besteht und die zum Eindosieren der Probe verwendete Kapillare (5) mit Kaliumcyanid beschichtet ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, 3 u. 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bilirubinbestimfnung im Blut die Reaktionslösung aus 0,1 η Salzsäure besteht und neben der zum Eindosieren der Blutprobe verwendeten Kapillare (5) eine weitere Kapillare (6) vorgesehen ist, die mit 2.5-Dichlorphenyldiazoniumchlorid beschichtet ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1, 3 u. 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Cholesterinbeitimmung die Reaktionslösung aus einer Kaliumphosphat gepufferten Phenoi-Methanol-Lösung mit Zusatz von Hydrnxypolyäthoxydodecan betteht und neben der zum Eindosieren des Serums ©der Plasma verwendeten Kapillare (5) eine weitere Kapillare (6) zur Hntnahme eines aus Chole-•terinesterase.C'holesterinoxidase und Peroxidase bestehenden Enzymgemisches vorgesehen ist. die »lit 4-Aminophena/on beschichtet ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1, 3 u 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Durchführung einer enzymatischen Blutzuckerbestimmung nach Trinder die Reaktionslösung i aus phosphatgepuffertem Phenol besteht und neben der zum Ein" dosieren der Serurri- oder Plasmaprobc Verwendeten Kapillare (5) eine weitere Kapillare (6) vorgesehen ist, die mit einer Mischung aus Glucoseoxidäse, Peroxidase und 3-Aminophenazoii beschichtet ist,

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, 3 u. 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Durchfülirung einer enzymatischen Blutzuckerbestimmung mit der Glucose-Dehydrogenase-Methode die Reaktionslösung aus einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert 7,6 besteht und neben der zum Eindosieren verwendeten Kapillare (5) eine weitere Kapillare (6) vorgesehen ist, die mit einer Mischung aus Glucose-Dehydrogenase, Mutarotase und Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) beschichtet ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 1, 3 u. 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität nach EIlman die Reaktionslösung aus einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert 7,2 besteht und neben der zum Eindosieren verwendeten Kapillare (5) eine weitere Kapillare (6) vorgesehen ist, die mit einer Mischung aus Acetylthiocholinjodid und Dithiobis-2-nitrobenzoesäure beschichtet ist.