JPS61155849A - 反応生成量検出方法 - Google Patents
反応生成量検出方法Info
- Publication number
- JPS61155849A JPS61155849A JP59275636A JP27563684A JPS61155849A JP S61155849 A JPS61155849 A JP S61155849A JP 59275636 A JP59275636 A JP 59275636A JP 27563684 A JP27563684 A JP 27563684A JP S61155849 A JPS61155849 A JP S61155849A
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- Japan
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- Pending
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の属する技術分野〕
この発明は、酵素電極を用いて酵素反応による生成物質
濃度を検出して試料中の目的物質濃度を定量する際に、
生成物質の反応生成量を検出する方法に関する。
濃度を検出して試料中の目的物質濃度を定量する際に、
生成物質の反応生成量を検出する方法に関する。
グルコースの定量において％酵素グルコースオキシダー
ゼ（ＥＣｌ、 １．３．４ ）の酵素反応により生成す
る過酸化水素（ｋ４ｘＯ＊ ）を過酸化水素電極で検出
し１、得られる反応電流値からグルコース一度を算出す
る方法が既に知られている。
ゼ（ＥＣｌ、 １．３．４ ）の酵素反応により生成す
る過酸化水素（ｋ４ｘＯ＊ ）を過酸化水素電極で検出
し１、得られる反応電流値からグルコース一度を算出す
る方法が既に知られている。
ＨｚＯｚ ２Ｍ” ＋ Ｏｓ ＋ ２ｅ
−（２１この際に、酵素を不溶化し膜状とした固定化酵
素膜を口金陽極と銀陰極から成る過酸化水素電極の表面
に密着させ、酵素電極を構成して使用する方法が一般的
である。
−（２１この際に、酵素を不溶化し膜状とした固定化酵
素膜を口金陽極と銀陰極から成る過酸化水素電極の表面
に密着させ、酵素電極を構成して使用する方法が一般的
である。
グルコース濃度に基づく反応電流値は、試料注入後酵素
反応の平衡状態により定常状態に達するため、この定常
電流値を計測してグルコース濃度に換算する方法が広く
行なわれている。近年の膜特性の向上により、通常の測
定系では７〜１５秒程度で定常状態に達するため、安定
かつ大きな反応電流値を得ることができる。
反応の平衡状態により定常状態に達するため、この定常
電流値を計測してグルコース濃度に換算する方法が広く
行なわれている。近年の膜特性の向上により、通常の測
定系では７〜１５秒程度で定常状態に達するため、安定
かつ大きな反応電流値を得ることができる。
しかしながら、酵素反応は（１）式のように酸素（０２
）を消費して進行する。したがって安定した定常状態を
得るためには、酵素電極と接する試料あるいは測定液中
に十分な濃度の酸素が存在することが必要である。この
ため、従来°は緩衝液などで酸棋分圧の低い全血試料な
どを希釈して測定することが行なわれてきた。
）を消費して進行する。したがって安定した定常状態を
得るためには、酵素電極と接する試料あるいは測定液中
に十分な濃度の酸素が存在することが必要である。この
ため、従来°は緩衝液などで酸棋分圧の低い全血試料な
どを希釈して測定することが行なわれてきた。
【、かじながら、試料あるいは測定液中のグルコースな
どの基質濃度が高いときは、酸素の消費量が多くなり、
相対的に酸素不足の状況が生じる。
どの基質濃度が高いときは、酸素の消費量が多くなり、
相対的に酸素不足の状況が生じる。
したがりて、版素の供給が不十分な場合、例えば全血試
料をそのまま酸素電極に接触させると、過酸化水素の生
成は定常状態に達せずピークを示す応答曲線となるため
、従来の定常状態測定法は適用できないといった問題が
あった。
料をそのまま酸素電極に接触させると、過酸化水素の生
成は定常状態に達せずピークを示す応答曲線となるため
、従来の定常状態測定法は適用できないといった問題が
あった。
第３図に、膜厚加μ溝、酵素活性０．００６ Ｕ、４”
の固定化グルコースオキシダーゼ膜と過酸化水素電極（
白金陽極−銀陰極）からなる酵素電極を、グルコースを
含む被験液（１００ＷＬｆ／ｄｔ）と接触させたときの
経時変化を示す。ここで、ｌは試料を注入した時点１曲
疏２は酸素分圧が１３０關Ｈ２のときの反応出力の経時
変化２曲線３は酸素分圧が５ｃ１ｔｎＨｆのとさの反応
出力の経時変化である。常温、常圧下で大気と平衡にな
っている測定液中の酸素分圧は１３０１麿Ｈｐ前後の値
であり、曲線２かられかるように、酵素電極の出力は試
料注入後１０〜２０秒で定常状態に達する。したがって
この定常物流を計測すれば、測定液中のグルコースを定
量することができる。
の固定化グルコースオキシダーゼ膜と過酸化水素電極（
白金陽極−銀陰極）からなる酵素電極を、グルコースを
含む被験液（１００ＷＬｆ／ｄｔ）と接触させたときの
経時変化を示す。ここで、ｌは試料を注入した時点１曲
疏２は酸素分圧が１３０關Ｈ２のときの反応出力の経時
変化２曲線３は酸素分圧が５ｃ１ｔｎＨｆのとさの反応
出力の経時変化である。常温、常圧下で大気と平衡にな
っている測定液中の酸素分圧は１３０１麿Ｈｐ前後の値
であり、曲線２かられかるように、酵素電極の出力は試
料注入後１０〜２０秒で定常状態に達する。したがって
この定常物流を計測すれば、測定液中のグルコースを定
量することができる。
しかしながら、５９１ｍＨｆ程度の低酸素分圧下では曲
線３で示されるように、試料注入後５〜８秒は曲線２と
ほぼ同等な出力が得られるが、試料注入後約１０秒で最
大出力に達すると、反応出力は徐々に低下する。この低
下の度合はクルコース濃度が高いほど、また酸素分圧が
低いほど大きい。したがって曲線２では従来行なわれて
いるように、例えば注入後加秒の出力からグルコース濃
度を定量できるが１、曲線３では注入後加秒の出力から
直接グルコース濃度への換算・はできない。
線３で示されるように、試料注入後５〜８秒は曲線２と
ほぼ同等な出力が得られるが、試料注入後約１０秒で最
大出力に達すると、反応出力は徐々に低下する。この低
下の度合はクルコース濃度が高いほど、また酸素分圧が
低いほど大きい。したがって曲線２では従来行なわれて
いるように、例えば注入後加秒の出力からグルコース濃
度を定量できるが１、曲線３では注入後加秒の出力から
直接グルコース濃度への換算・はできない。
また、Ｉｉ＆素不足が顕著にならない４〜７秒の短時間
で計測して、その時の出力をグルコース濃度に換算する
ことも考えられるが、酸素分圧が一定の試料を用いた場
合でも、固定化グルコースオキシターゼ膜の膜厚（１５
〜２５μ惧）や酸素活性（０，００３〜０．０２ 隻−
）の変動に伴い、試料注入後最大値が得られる時間は変
化し、著しい場合は３〜２０秒の範囲で変動する。この
ため、十分な出力を得るには膜厚や酸素活性により計測
時間をその都度慎重に選定する必要があり、自動化分析
には不適であるばかりか、計測時間の誤差が出力に大き
く影響するという欠点がある。
で計測して、その時の出力をグルコース濃度に換算する
ことも考えられるが、酸素分圧が一定の試料を用いた場
合でも、固定化グルコースオキシターゼ膜の膜厚（１５
〜２５μ惧）や酸素活性（０，００３〜０．０２ 隻−
）の変動に伴い、試料注入後最大値が得られる時間は変
化し、著しい場合は３〜２０秒の範囲で変動する。この
ため、十分な出力を得るには膜厚や酸素活性により計測
時間をその都度慎重に選定する必要があり、自動化分析
には不適であるばかりか、計測時間の誤差が出力に大き
く影響するという欠点がある。
この発明は、上述した酸素の供給不足により反応生成物
の定常状態が得られない場合の反応生成量検出方法を提
供するものであり、究極的には。
の定常状態が得られない場合の反応生成量検出方法を提
供するものであり、究極的には。
酸素の低分圧条件下での目的物質濃度を酵素電極法によ
り定量しようとするものである。
り定量しようとするものである。
この発明は、低い酸素分圧条件下での酵素電極の反応出
力の経時変化を詳細に検討し得られたもので、被積層に
試料を注入した時点から酸素電極の反応出力を一定時間
ごとに逐次電気的に検出することにより一定時間内の反
応出力の増加量な計算し、この増加量が最大値を与えた
後、更に異なる一＝定遅延時間にわたり増加量を算出し
、一定の遅延時間が経過した後裔増加量の和、すなわち
総和を算出するとこの計算値が反応生成量に対応するこ
とに着目したもので、要するに定常状態測定法が適用で
きない場合でも一定時間内の反応増加量を観測し、比較
的短時間にわたって増加量の和を計算することにより、
酸素供給不足による反応阻害の影魯を受けにくい状態で
目的物質濃度が定量できるようにしたものである。
力の経時変化を詳細に検討し得られたもので、被積層に
試料を注入した時点から酸素電極の反応出力を一定時間
ごとに逐次電気的に検出することにより一定時間内の反
応出力の増加量な計算し、この増加量が最大値を与えた
後、更に異なる一＝定遅延時間にわたり増加量を算出し
、一定の遅延時間が経過した後裔増加量の和、すなわち
総和を算出するとこの計算値が反応生成量に対応するこ
とに着目したもので、要するに定常状態測定法が適用で
きない場合でも一定時間内の反応増加量を観測し、比較
的短時間にわたって増加量の和を計算することにより、
酸素供給不足による反応阻害の影魯を受けにくい状態で
目的物質濃度が定量できるようにしたものである。
以下本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
第２図は、第３図中の一定時閲Δｔを０．２５秒に設定
し、第３図の曲ＷＡ３で示される反応出力Ｖｏｕｔを０
．２５秒ごとに電気的に検出し、Δｔごとの出力増加賀
ΔＶｉ （ΔＶｉ ＝ Ｖｉ＋ｒ −Ｖｉ ）を経過時
間とともにプロットして得た曲線である。試料の注入時
点１からΔＶｉは徐々に増加し、約５秒後で最大となり
（時点４）、その後減少を続は時点１から約１２秒で零
となり、その後は負の値となった。
し、第３図の曲ＷＡ３で示される反応出力Ｖｏｕｔを０
．２５秒ごとに電気的に検出し、Δｔごとの出力増加賀
ΔＶｉ （ΔＶｉ ＝ Ｖｉ＋ｒ −Ｖｉ ）を経過時
間とともにプロットして得た曲線である。試料の注入時
点１からΔＶｉは徐々に増加し、約５秒後で最大となり
（時点４）、その後減少を続は時点１から約１２秒で零
となり、その後は負の値となった。
第１図は、第２図で得られた一定時間Δｔ（０，２５秒
）の増加量ΔＶｉを最大値を示した時点４から３秒後（
時点５）までさらに計測し、注入時点Ｉから時点５まで
のΔ■Ｉの総和を計算し、経過時間とともにプロ、トし
て得た曲線である。この曲線は、第３図で示した曲線の
残余電流を差し引いて、△Ｖｉが最大値を示した時点か
ら３秒後までプロ。
）の増加量ΔＶｉを最大値を示した時点４から３秒後（
時点５）までさらに計測し、注入時点Ｉから時点５まで
のΔ■Ｉの総和を計算し、経過時間とともにプロ、トし
て得た曲線である。この曲線は、第３図で示した曲線の
残余電流を差し引いて、△Ｖｉが最大値を示した時点か
ら３秒後までプロ。
トしたものと同等となった。この時点５の出力Ｖｃａｌ
が試料中のグルコース積度に対応し、低酸素分圧下で反
応阻害の影響を受けないで、しかも最も出力信号を大き
くして計測できる時点である。
が試料中のグルコース積度に対応し、低酸素分圧下で反
応阻害の影響を受けないで、しかも最も出力信号を大き
くして計測できる時点である。
このことは、酸素分圧刃〜６０ ｑＭＩＨＰの全血試料
を用いた実験から明らかとなった。
を用いた実験から明らかとなった。
この実施例において、遅延時間（時点４から時点５まで
の時間）は、穐々の膜厚（１５〜２５μ惰）と酵素活性
（０，００３〜０．０２ Ｕ／＊ ）を有する固定化グ
ルコースオキシダーゼ膜を用いて、全血試料６２列から
経験的に好適な範囲を見い出す努力を行なって決定した
。すなわち、時点５を時点４から３秒後に設定すると、
得られる値は時点４の値と比較して平均１〜２％の低値
を示し、６秒後では４〜６％の低値、 １０秒後では１
０−２０％の低値が得られた。そしてＱ回の実験結果か
ら、遅延時間は２〜４秒の範囲が好ましいことがわかっ
た、一方、一定間隔時間Δｔは、電子回路上の制約もあ
るが、０．２５〜０．５秒の範囲が好ましい。
の時間）は、穐々の膜厚（１５〜２５μ惰）と酵素活性
（０，００３〜０．０２ Ｕ／＊ ）を有する固定化グ
ルコースオキシダーゼ膜を用いて、全血試料６２列から
経験的に好適な範囲を見い出す努力を行なって決定した
。すなわち、時点５を時点４から３秒後に設定すると、
得られる値は時点４の値と比較して平均１〜２％の低値
を示し、６秒後では４〜６％の低値、 １０秒後では１
０−２０％の低値が得られた。そしてＱ回の実験結果か
ら、遅延時間は２〜４秒の範囲が好ましいことがわかっ
た、一方、一定間隔時間Δｔは、電子回路上の制約もあ
るが、０．２５〜０．５秒の範囲が好ましい。
Δｔを０．２５秒、遅延時間を３秒に設定し、グル；−
ス１００ ｗＪｄｌおよび３００ ｙＪｄｔ、酸素圧５
ｇ １諷Ｈ１（１）グルコース標準溶液を測定し、それ
ぞれ９８−の結果を得た。また１０回の連続測定を行な
い、ＣＶ値２〜３、％の結果が得られ、短時間でかつ低
酸素分圧条件下でも十分適用できる反応生成量検出方法
であることがわかった。また、全血６２例の従来法との
相関は、ｙ ＝ ０．８７ ｘ＋３．５ （Ｙ ：本発
明による方法９．Ｘ：希釈試料による従来法）、 ｒ
＝０．９６と良好な結果が得られ゛た。
ス１００ ｗＪｄｌおよび３００ ｙＪｄｔ、酸素圧５
ｇ １諷Ｈ１（１）グルコース標準溶液を測定し、それ
ぞれ９８−の結果を得た。また１０回の連続測定を行な
い、ＣＶ値２〜３、％の結果が得られ、短時間でかつ低
酸素分圧条件下でも十分適用できる反応生成量検出方法
であることがわかった。また、全血６２例の従来法との
相関は、ｙ ＝ ０．８７ ｘ＋３．５ （Ｙ ：本発
明による方法９．Ｘ：希釈試料による従来法）、 ｒ
＝０．９６と良好な結果が得られ゛た。
なお、本発明による反応生成量検出方法は、上述したグ
ルコースのみに限定されるものではなく。
ルコースのみに限定されるものではなく。
酵素反応により過酸化水素が生成される酵素電極一般に
適用することができる。
適用することができる。
以上の説明から明らかなようにこの発明によれば、酵素
電極の反応出力を一定時間ごとに電気的に検出し、一定
時間内の反応出力の増加量を算出し、この増加量の最大
値が得られた後、更に所定時間増加量を計測して、試料
注入時点からの反応出力の増加量の総和を算出し、この
値を試料中の目的物１ｘｆｌｋ度に換算するようにした
ため、酸素の低分圧条件下での目的物質濃度が、酸素膜
の膜厚や酸素活性に左右されることな（、酵素電極法に
より定量することが可能となった。
電極の反応出力を一定時間ごとに電気的に検出し、一定
時間内の反応出力の増加量を算出し、この増加量の最大
値が得られた後、更に所定時間増加量を計測して、試料
注入時点からの反応出力の増加量の総和を算出し、この
値を試料中の目的物１ｘｆｌｋ度に換算するようにした
ため、酸素の低分圧条件下での目的物質濃度が、酸素膜
の膜厚や酸素活性に左右されることな（、酵素電極法に
より定量することが可能となった。
第１図は本発明の実施例による過酸化水素の反応生成量
の経時変化を示す線図、第２図は酵素電極の出力増加量
と経過時間との関係を示す線図、第３図は酵素電極の反
応出力と経過時間との関係を示す線図である。 １・・・試料注入時点、２・・・酸素が十分ある場合の
応答曲線、３・・・低酸素分圧条件での応答曲線。 ４・・・反応増加量の最大時点、５・・・計測終了時点
。 ０ ．５ １０ ｌｓ、２６ ５時間／
妙 才Ｉ図 θ Ｓ １０ ＸＳ ２０ ２
５’綺関／秒 才２図 ０ ．５’ １０ １５ ２０ ２５時
間／牧 才 ３ 図
の経時変化を示す線図、第２図は酵素電極の出力増加量
と経過時間との関係を示す線図、第３図は酵素電極の反
応出力と経過時間との関係を示す線図である。 １・・・試料注入時点、２・・・酸素が十分ある場合の
応答曲線、３・・・低酸素分圧条件での応答曲線。 ４・・・反応増加量の最大時点、５・・・計測終了時点
。 ０ ．５ １０ ｌｓ、２６ ５時間／
妙 才Ｉ図 θ Ｓ １０ ＸＳ ２０ ２
５’綺関／秒 才２図 ０ ．５’ １０ １５ ２０ ２５時
間／牧 才 ３ 図
Claims (1)
- 被検液に試料を注入した時点から酵素電極の反応出力を
一定時間ごとに電気的に検出して、一定時間内の反応出
力の増加量を算出し、この増加量の最大値が得られた後
更に所定時間増加量を計測して、試料注入時点からの反
応出力の増加量の総和を算出し、この総和値を試料中の
目的物質濃度に換算して定量することを特徴とする反応
生成量検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59275636A JPS61155849A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 反応生成量検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59275636A JPS61155849A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 反応生成量検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61155849A true JPS61155849A (ja) | 1986-07-15 |
Family
ID=17558217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59275636A Pending JPS61155849A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | 反応生成量検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61155849A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63304150A (ja) * | 1987-04-09 | 1988-12-12 | ノバ・バイオメディカル・コーポレーション | グルコース検定用酵素電極及びグルコース検定方法 |
| WO1996008714A1 (fr) * | 1994-09-13 | 1996-03-21 | Toto Ltd. | Procede et appareil de mesure de concentration de matiere |
-
1984
- 1984-12-28 JP JP59275636A patent/JPS61155849A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63304150A (ja) * | 1987-04-09 | 1988-12-12 | ノバ・バイオメディカル・コーポレーション | グルコース検定用酵素電極及びグルコース検定方法 |
| WO1996008714A1 (fr) * | 1994-09-13 | 1996-03-21 | Toto Ltd. | Procede et appareil de mesure de concentration de matiere |
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