DK170103B1 - Elektrokemisk biosensor samt biosensormembran - Google Patents

Description

i DK 170103 B1

ELEKTROKEMISK BIOSENSOR SAMT BIOSENSORMEMBRAN

Opfindelsen angår en elektrokemisk biosensor af den i 5 krav l's indledning nævnte art.

Elektrokemiske biosensorer har været genstand for megen opmærksomhed siden en glucosesensor første gang blev beskrevet af Clark et al. i "Annals of the New York 10 Academy of Science" 102 (1962) 29-45.

I elektrokemiske biosensorer indgår et immobiliseret enzym, som anvendes til at nedbryde en biokemisk analyt eller et substrat - oftest under forbrug af oxygen.

15 Koncentrationen eller aktiviteten af substratet måles med sådanne biosensorer ved at bestemme den forbrugte mængde oxygen eller den dannede mængde af et reaktionsprodukt fra substratets omsætning med oxygen, for eksempel hydrogenperoxid. En forudsætning for at der kan 20 opnås en lineær sammenhæng mellem biosensorens signal og substratkoncentrationen er dels, at der er overskud af oxygen til stede ved enzymet, da oxygen - og ikke substratet - ellers-bliver den begrænsende faktor, og dels at substratkoncentrationen ved enzymet er væsent-25 ligt mindre end enzymets Km-værdi, hvor Km er Michae-lisMenten konstanten.

Et eksempel på elektrokemisk biosensor er en elektrokemisk glucosesensor, hvor enzymet glucoseoxidase anven-30 des til at nedbryde glucose ifølge reaktionsskemaet: glucose + 02 + gluconsyre + H202 DK 170103 B1 2

Som det fremgår af reaktionsskemaet er det muligt at måle koncentrationen eller aktiviteten af glucose i en prøve ved at bestemme enten den forbrugte mængde oxygen eller den dannede mængde hydrogenperoxid. Den dannede 5 mængde hydrogenperoxid kan måles polarografisk ved oxidationsreaktionen: H202 ->· 2H+ + 02 + 2e* 10 Under førnævnte forudsætning af at der er overskud af oxygen til stede, og at substratkoncentrationen ved enzymet er væsentlig mindre end enzymets Km-værdi, kan H202-oxidationsstrømmen benyttes som et udtryk for glu-coseindholdet.

15

Der har været meget udviklingsarbejde forbundet med at tilvejebringe biosensorer, der ved måling direkte på helblod har et lineært respons over hele det klinisk relevante koncentrationsområde for den biokemiske ana-20 lyt. Glucosesensorer med lineært respons over hele det klinisk relevante glucoseområde (0,5-30 mM) er nu beskrevet, dels i beskrivelsen til US patent nr. US 4759828 (Young) og dels af Shichiri M. et al. i "We-arable-type Artifical Endocrine Pancreas with Needle-25 type Glucose Sensor", Lancet 2 (1982) 1129-1131 og af Abe H. et al. i beskrivelsen til USA patent nr. US 4515584. Disse sensorers særlige responsegenskaber er opnået som følge af, at der mellem enzymet og den prøve, hvis glucoseindhold ønskes bestemt, er tilvejebragt 30 en membran, der begrænser diffusionen af glucosemoleky- * ler.

Det har nu vist sig, at biosensorer, der i lighed med glucosesensoren ifølge Shichiri eller Abe har en po-35 lyurethanmembran eksponeret over for prøven, ganske 4 DK 170103 B1 3 vist giver stort set sensoruafhængige måleresultater ved måling på vandige prøver, men derimod ikke er i stand til at give sensoruafhængige måleresultater, når prøven er helblod. Sensorerne giver i varierende grad 5 for lave målinger på helblod og også på vandige opløsninger, der efterfølger en helblodsmåling, uanset at de var i stand til at måle ens på vandige opløsninger, inden de blev benyttet til helblodsmåling.

10 Opfindelsens formål er derfor at tilvejebringe en biosensor, som i højere grad end de hidtil kendte biosensorer giver sensoruafhængige måleresultater ved helblodsmålinger .

15 Dette opnås med en biosensor, der er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Kombinationen af substratbegrænsende lag og et beskyttelseslag, som omfatter eller består af et cellulose-20 eller et cellulosederivatmateriale er hidtil ukendt og gør det som nævnt muligt at tilvejebringe en biosensor, som er væsentligt forbedret i forhold til biosensorer uden dette beskyttelseslag. Således elimineres med beskyttelseslaget den store sensor til sensor varia-25 tion, som sensorerne uden beskyttelseslag udviser i forbindelse med helblodsmålinger. Dette vil også fremgå af nedenstående sammenligningseksempel.

Det mest foretrukne materiale til beskyttelseslaget 30 omfatter regenereret cellulose, såsom cellofan, men en række celluloseplastmaterialer, såsom celluloseethere eller celluloseestere, for eksempel celluloseacetat, cellulosebutyrat, cellulosepropionat, blandingsestere af disse og ethylcellulose og andre cellulosealkyl- og 35 arylethere, forventes også at være egnede. Blandt andre DK 170103 B1 4 hydrofile materialer, som forventes at være egnede som beskyttelseslag, kan nævnes polyhydroxyethylmethacry-lat.

5 Biosensorer anvendes såvel til in vitro målinger som til in vivo målinger, herunder ekstrakorporeale målinger, hvor prøven føres fra patienten til et målekammer og derefter tilbage til patienten. Et beskyttelseslag af cellofan er særdeles egnet til sådanne in vivo må-10 linger, da materialet er stærkt, tåler desinfektion, er ugiftigt og har god biokompabilitet.

Beskyttelseslaget har fortrinsvis en tykkelse på op til 100 jLtm, navnlig 10-50 μια og især 12-25 μια. Det fore-15 trækkes af hensyn til blandt andet biosensorens responstid at anvende det tyndest mulige beskyttelseslag.

I biosensoren ifølge opfindelsen kan dette eventuelt opnås ved at tilvejebringe beskyttelseslaget ved kemisk modifikation af det substratbegrænsende lags væk fra 20 enzymet vendende overflade, således at overfladen ved denne kemiske modifikation bibringes de hydrofile egenskaber ifølge opfindelsen. I en foretrukket udførelsesform ligger beskyttélseslaget og det substratbegrænsende lag tæt sammen. Det foretrukne substratbegrænsende 25 lag er et polyurethanlag, hvis let klæbende overflade er i stand til at fastholde celluloselaget.

Anvendelse af en cellulosemembran i glucosesensorer er i sig selv velkendt, for eksempel fra nedenstående 30 artikler, patenter og patentansøgninger.

I Clark 1962-artiklen, jvf. ovenfor, er sensormembranen en Cuprophane"-glucoseoxidase-Cuprophanemembran, og det primære formål med Cuprophanemembranerne er at fast-35 holde enzymet glucoseoxidase ved en elektrodeoverflade.

DK 170103 B1 5 I beskrivelsen til USA patent nr. US 3539455 (Clark) omtales en elektrokemisk glucosesensor, hvor en cellofanmembran indgår. Glucosesensoren er beregnet til måling på blod, og membranen tjener til at holde en-5 zymet glucoseoxidase på samme side af membranen som anoden og holde blodets enzymer, for eksempel det H202 spaltende katalase, fra det ved den enzymatiske gluco-seomsætning dannede h202.

10 I beskrivelsen til engelsk patent nr. GB 1442303 (Christiansen) omtales en elektrokemisk glucosesensor med en flerlaget membran, hvor det ene lag er et tyndt, tæt lag, som hindrer lavmolekylære stoffer, der ligesom H202 er oxiderbare ved glucosesensorens anodepotential, 15 i at komme i kontakt med anodens arbejdsoverflade.

Eksempler på sådanne oxiderbare lavmolekylære stoffer er urinsyre, ascorbinsyre og forskellige medikamenter, især paracetamol. Af hensyn til elektroderesponstiden er det nødvendigt, at det tynde lag er så tyndt, at et 20 mindre tæt lag må anvendes som bærelag. Til dette lag foreslås blandt andet Cuprophane, celluloseacetat eller polymeriseret protein, og til det tynde, tætte lag foreslås et hydrofobt materiale såsom siliconegummi eller et hydrofilt materiale såsom celluloseacetat.

25 I beskrivelsen til USA patent nr. US 4073713 (Newman) beskrives en glucosesensor med en flerlaget membran, hvor det nærmest anoden liggende lag eller inderlaget er et lag af siliconegummi, methylmethacrylat eller 30 celluloseacetat, som jvf. ovenfor hindrer at oxiderbare stoffer kommer i kontakt med anoden. Laget nærmest prøven eller yderlaget er en diffusionsbarriere, som dels hindrer passage af højmolekylære stoffer og dels giver mekanisk styrke. Der foreslås porøst polycarbonat DK 170103 B1 6 eller methylmethacrylat. Et enzympræparat findes mellem inderlaget og yderlaget. » I beskrivelsen til USA patent nr. US 4172770 (Semersky) 5 omtales et system, hvor en enkeltlaget eller dobbeltlaget membran af cellulosematerialet Spectrapor™ adskiller et reaktionskammer og en elektrokemisk sensor.

Denne membran i kombination med en kontrolleret strømningshastighed af prøve forbi membranen hindrer inter-10 fererende species i at komme i kontakt med sensorens aktive elektrodeflade.

I beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. EP 25110 (Suzuki) omtales en glucosesensor med en flerla-15 get membran bestående af en indre filtermembran, en enzymmembran og en ydre asymmetrisk semipermeabel membran fremstillet af celluloseacetat omfattende et tyndt semipermeabelt yderlag og et tykt porøst inderlag. Den asymmetriske semipermeable membran angives at forbedre 20 sensorens stabilitet ved måling på helblod i forhold til en sensor med en traditionel semipermeabel ydre membran af reproduceret cellulose eller polycarbonat. Glucosesensorens linearitetsområde er ikke omtalt, og der er kun beskrevet målinger på blod indeholdende 0,2 25 mM glucose, det vil sige et glucoseindhold langt under de klinisk interessante værdier.

I beskrivelsen til USA patent nr. US 3948745 (Guil-bault) beskrives en amperometrisk sensor, for eksempel 30 en glucosesensor med en ydre cellofanmembran og et lag af en polymer indeholdende kemisk bundet glucoseoxida-se. Sensoren angives som egnet til blodanalyse og cel- .

lofanmembranen angives at være permeabel for den kemiske forbindelse, som bestemmes med sensoren, men be-35 skrivelsen indeholder ingen data for sensoren.

DK 170103 B1 7

Endelig omtales i beskrivelsen til USA patent nr. US 4005002 (Racine) en sensor for glucose eller lactat med en mod prøven vendende cellofanmembran. Der måles på en fortyndet biologisk væske, hvilket angives at være 5 nødvendigt af hensyn til sensorens levetid. Sensoren måler ikke på reoxidation af H202, men på reoxidation af en reduceret acceptor.

Ingen af de ovenfor omtalte litteratursteder leder til 10 at det skulle være ønskeligt eller nærliggende at benytte et ydre hydrofilt beskyttelseslag i en glucose-sensor af den type, som har en membran omfattende et substratbegrænsende lag, og som på grund af tilstedeværelsen af dette lag har et til kliniske anvendelses-15 formål relevant linearitetsområde.

Der findes flere typer elektrokemiske biosensorer.

Specielt kan nævnes potentiometriske, polarografiske, konduktometriske, redoxmediatorbaserede og FET-baserede 20 sensorer, og blandt de polarografiske findes så vel sensorer, der baserer substratbestemmelsen på en bestemmelse af 02 og sensorer, der baserer substratbestemmelsen på en bestemmelse af H202. Gronow M. et al. har givet en nærmere beskrivelse af de forskellige 25 typer elektrokemiske biosensorer i "Biosensors", Royal Society of Chemistry Special Publication, Molecular Biology and Biotechnology £4 (1985) 295-324.

Selv om opfindelsen her kun er eksemplificeret ved en 30 glucosesensor, anses den for at være i lige så høj grad nyttig i forbindelse med andre biosensorer, der måler koncentrationen eller aktiviteten af en biokemisk ana-lyt eller et substrat ved hjælp af et immobiliseret enzym. I særdeleshed anses opfindelsen for anvendelig i 35 forbindelse med biosensorer for følgende biokemiske DK 170103 B1 8 analytter, idet de respektive immobiliserede enzymer er nævnt umiddelbart efter analytten: lactat/lactatoxida- * sef cholesterol/cholesteroloxidase, hypoxanthin/hypo-xanthinoxidase og pyruvat/pyruvatoxidase.

5 I en foretrukket udførelsesform for sensoren ifølge opfindelsen er arbejdselektroden en platinanode med en blotlagt arbejdsoverflade, hvorpå der er tilvejebragt en belægning af celluloseacetat. Denne belægning hin-10 drer, at lavmolekylære stoffer såsom for eksempel as-corbinsyre og paracetamol, der er oxiderbare ved arbe jdselektr odens potential, når frem til arbejdselektroden, oxideres og dermed interfererer med substratbestemmelsen. Det har vist sig, at et ganske tyndt 15 lag af for eksempel 2-25, fortrinsvis 3-15 og især 5-10 μιη's tykkelse er tilstrækkeligt til at hindre de interfererende stoffer i at genere glucosebestemmelsen.

Laget ønskes så tyndt som muligt af hensyn til sensorens responstid, som stiger med stigende tykkelse af 20 celluloseacetatlaget.

I en yderligere foretrukket udførelsesform for opfindelsen er det substratbegrænsende lag et hydrofobt plastlag, især et polyurethanlag. Tykkelsen af de hy-25 drofobe plastlag er fortrinsvis 0,1-10 μιη, navnlig 0,2-5 μιη og især 0,5-3 μη.

Opfindelsen angår også en sensormembran af den i indledningen til krav 7 angivne type og med de ejendomme-30 ligheder, der er angivet i krav 7, 8, 9 og 10.

Opfindelsen vil nu blive nærmere forklaret i forbindelse med tegningen, hvor DK 170103 B1 9 FIG. 1 viser et billede af sensoren ifølge opfindelsen anbragt i et målekammer; FIG. 2 et eksploderet billede af en udførelsesform for 5 sensoren ifølge opfindelsen, og FIG. 3 et billede af sensormembranen i sensoren ifølge opfindelsen.

10 På tegningen anvendes i de forskellige figurer samme referencenumre til at betegne samme dele.

Den i FIG. 1 viste sensor 1 ifølge opfindelsen er anbragt således, at sensorens frontflade 2 danner den ene 15 væg i et målekammer 3. En tilførselskanal 4 munder ud i målekammeret 3, og en fraførselskanal 5 udgår fra målekammeret. Herudover står målekammeret 3 ikke i forbindelse med omgivelserne, når sensoren 1 er monteret.

Sensoren 1 er monteret i en rørformet del 6, som udgår 20 fra en overflade 7 af den blok, hvori målekammeret 3 er tilvejebragt. Målekammeret 3 ligger i overfladen 7 og omsluttes af den rørformede del 6.

Den i FIG. 1 viste blok 8 med målekammeret 3 er af den 25 type, som anvendes i blodgasanalysatoren ABL500, som fremstilles og sælges af RADIOMETER A/S, København,

Danmark. Blokken indeholder flere serielt forbundne målekamre med tilførselskanaler og fraførselskanaler i samme konfiguration som målekammeret 3, tilførselskana-30 len 4 og fraførselskanalen 5.

FIG. 2 viser mere detaljeret en udførelsesform for sensoren 1 ifølge opfindelsen. Sensoren består af en basisdel 9, en kappe 10, en membran 11, en membranring 35 12. Når bortses fra membranen 11 og den nedenfor om- DK 170103 B1 10 talte celluloseacetatbelægning, og at Pt-tråden har en afvigende tykkelse, er sensoren opbygget ganske iden- t tisk med en sensor, der fremstilles og forhandles under betegnelsen E909 fra RADIOMETER A/S, København, Dan-5 mark.

Basisdelen 9 omfatter en arbejdselektrode 13 i form af en 250 μτη platintråd 17 indsmeltet i en glasstav 16.

Basisdelen omfatter ligeledes en Ag/AgCl referencee-10 lektrode 14 i form af en ringformet belægning på glasstaven 16. Ved den forreste del af glasstaven 16 er platintråden 17 blotlagt, og på denne ende af glasstaven 16 er påført en ikke-vist celluloseacetatbelægning som nærmere beskrevet nedenfor i Eksempel 1. Ved sin 15 bageste ende har sensoren 1 en kontaktdel 5 med elektrisk ledende forbindelse til arbejdselektroden 13 og referenceelektroden 14. Basisdelen har endvidere et fikseringsorgan 18 med en flange 19, som tjener til at fastholde kappen 10 på basisdelen 9 efter snaplåsprin-20 cippet. Endelig er der ved den mod sensorens frontflade 2 vendende side af fikseringsorganet 18 en gummipakning 20, som tætner det rum 21, der dannes, når kappen 10 er monteret på basisdelen 9.

25 Kappen 10, som er fremstillet af et transparent plastmateriale, er rørformet og let konisk og har på den indre overflade ved sin brede ende fremspring 22, som er indrettet til at gå i indgreb med fikseringsorganet 18.

30 '

Membranen 11, som er vist mere detaljeret i FIG. 3, er en lamineret membran omfattende et 14 μτα. beskyttelseslag 24 af cellofan, et 1 μιη polyurethanlag 25, et ca. 1 μια glucoseoxidaselag 26 og et 1 μη polyurethan inderlag 35 27. Membranen har en større udstrækning end den lille DK 170103 B1 11 åbning i kappen 10, og kan således dække denne åbning og foldes op omkring ydersiden af kappen 10, hvor den fastlimes og yderligere fastholdes af membranringen 12.

Når membranen er korrekt monteret på kappen 10, vender 5 beskyttelseslaget 24 udad og inderlaget 27 ind mod lysningen i kappen 10. Membranen 11 fremstilles som beskrevet nedenfor i Eksempel 1.

Inden kappen 10 monteres på basisdelen 9 påfyldes en 10 elektrolyt med den i Eksempel 1 nærmere beskrevne sammensætning. Elektrolytten skaber den nødvendige elektriske kontakt mellem arbejdselektroden 13 og referenceelektroden 14.

15 For til slut at anskueliggøre størrelsesordenen af sensoren ifølge opfindelsen og den tilhørende måleopstilling kan det nævnes, at den lille åbning i kappen 10, det vil sige den membrandækkede åbning, har en diameter på ca. 7 mm, og at membranen har en tykkelse 20 på ca. 17 jum. Yderligere kan det nævnes, at målekammeret 3 rummer ca. 5 /il prøve og har en cirkulær åbning med en største diameter på ca. 3,5 mm ved overfladen 7. Tilførselskanalen 4' og fraførselskanalen 5 er rørformede boringer med et cirkulært tværsnit med en diameter 25 på ca. 0,7 mm.

De nedenfor omtalte forsøgsresultater er opnået med den i FIG. 2 viste udførelsesform for sensoren ifølge opfindelsen anbragt i det i FIG. 1 viste målekammer.

30 I målesituationen lægges en polarisationsspænding på +0,625 V på arbejdselektroden i forhold til referenceelektroden, og måleopstillingen termostateres til 37°C. Efter at en prøve er blevet indført i målekam-35 meret 3 og bragt i kontakt med sensoren 1 registreres DK 170103 B1 12 på en ikke vist printer arbejdselektrodestrømmens forløb med tiden efter omsætning af elektrodestrømmen til et spændingssignal. Alternativt opsamles arbejdselek-trodesignalet hvert halve sekund fra 5 til 25 sekunder 'i 5 efter at målekammeret 3 er fyldt med prøve. Disse værdier for arbejdselektrodesignalet databehandles sammen med data fra en forudgående kalibrering og udprintes som mM glucose. Der kalibreres på vandige opløsninger indeholdende henholdsvis 0 mM og 10 mM glucose med den 10 i Eksempel 1 under afsnittet Materialer og metoder nærmere beskrevne sammensætning.

Opfindelsen illustreres yderligere af nedenstående eksempler.

15

Eksempel 1

Materialer og metoder 2 0 Udgangsmaterialer

High Rejective Cellulose Acetate Membrane; S-18914 fra Yellow Springs Instruments, Ohio, USA Nitromethan; Aldrich Chemie, Stenheim, Vesttyskland 25 Celluloseacetat/butyrat; Eastman 4623 fra Eastman Kodak Co., Rochester, USA

Celluloseacetat; Eastman 394-60 fra Eastman Kodak Co.,

Rochester, USA

Polyurethan; Desmopan™ 786 fra Bayer AG, Dormagen, 30 Vesttyskland ?

Tetrahydrofuran; E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland Ν,Ν-Dimethylformamid; E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland Glucoseoxidase; G-7141 fra Sigma, St. Louis, USA Glutaraldehyd, G-6257 fra Sigma, St. Louis, USA

DK 170103 B1 13

Na-EDTA, Titriplex™ III, Art. 8418 fra E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland

Na-benzoat; M 6290 fra Bie og Bentsen A/S, Rødovre,

Danmark 5 NaH2P04, HjO Z.A.; Art. 6346 fra E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland

Na2HP04, 2H20 z.A.; Art. 6580 fra E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland

NaCl z.A. ACS, ISO; Art. 6404 fra E. Merck, Darmstadt, 10 Vesttyskland

Kathon™ 886 MW; Rohm and Haas Co., Philadelphia, USA Glucose; D(+)-Glucose, wasserfrei Art. 8337, fra E.

Merck, Darmstadt, Vesttyskland

Cellophane; Dialysierschlauch 44110 Visking 20/32 fra 15 Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Vesttyskland

Ovenstående udgangsmaterialer er anvendt ved den herefter beskrevne fremstilling af elektrolyt, kalibreringsvæsker og membraner.

20

Kalibreringsyæske 1-0 mM_ glucose En opløsning uden indhold af glucose anvendes dels som rensevæske i måleopstillingen og dels som kalibreringsvæske. Denne væske har følgende sammensætning: 25 0,56 g Na-EDTA 0,92 g Na-benzoat 1,52 g NaH2P04, 2H20 6,90 g Na2HP04, 2H20 30 2,72 g NaCl 60 μΐ Kathon™ 886 MW Ionbyttet vand ad 1 1 DK 170103 B1 14

Kalibreringsvæske 2 - 10_mM glucose Denne væske har den samme sammensætning som kali-breringsvæske 1 bortset fra, at den yderligere indeholder glucose i en koncentration på 10 mM.

5 5

Elektrolyt

Som elektrolyt anvendes samme væske som kalibreringsvæske 1.

10 Polyurethanmembran Først fremstilles en opløsning med sammensætningen: 1,9 g Polyurethan 41,0 ml Tetrahydrofuran 15 9,0 ml Ν,Ν-Dimethylformamid

Denne opløsning doseres på en glasplade gennem en 0,1 mm spalte i en metalklods, som langsomt med hånden føres hen over glaspladen. Efter en vis fordampningstid 20 (ca. 10 min.) aftages membranen fra glaspladen og udvaskes i ionbyttet vand og hænges til tørre. Tykkelsen . af den således fremstillede membran er ca. 1 ^m.

Enzymoplgsning 25 Enzymopløsningen har sammensætningen: 1 mg Glucoseoxidase 100 μΐ Kalibreringsvæske 1 8 μΐ Glutaraldehyd 30

Celluloseacetatbelægning

Til celluloseacetatbelægningen på glasstavens frontflade fremstilles en opløsning af High Rejective Cellulose Acetate Membrane S-18914 i Nitromethan. Den nær-35 mere sammensætning af opløsningen er en fabrikations- DK 170103 B1 15 hemmelighed, der tilhører producenten Yellow Springs Instruments, Ohio, USA.

Opløsningen påføres på glasstavens frontflade med en 5 fin pensel og tørrer ved henstand. Lagtykkelsen er 5-10 μχη.

Fremstilling_af sensormembran

Af det i afsnittet "Udgangsmaterialer" nævnte Cellopha-10 ne Dialysierschlauch udskæres et stykke på ca. 2x2 cm.

Dette stykke, hvis tykkelse er 14 μιη, lægges sammen med et stykke af den ovenfor beskrevne polyurethanmembran af tilsvarende størrelse. 2-3 μΐ enzymopløsning påføres på at andet stykke polyurethanmembran af tilsvarende 15 størrelse som det første. Den første membrandel bestående af cellofanlag og polyurethanlag og den anden membrandel bestående af polyurethanlag med enzymopløsning trykkes sammen, hvorved der dannes en membran bestående af et cellofanlag, et polyurethanlag, et 20 enzymlag og et polyurethanlag i nævnte rækkefølge.

Polyurethanlaget i den anden membrandel kan om ønsket erstattes af et andet inderlag, for eksempel mikroporøs polypropylen af typen Celgard™ 3401.

25 Den således fremstillede membran tørres ved henstand og limes derefter på den i FIG. 2 viste kappe med Loctite™ (Cyanoacrylat Adhesive 414).

Resultater 30 2 sensorer af den i FIG. 2 viste type, og hvori sensor membranen var fremstillet som ovenfor beskrevet, blev monteret i to ens, tilstødende målekamre i den i forbindelse med FIG. 1 viste måleopstilling. Der måltes på en opløsning bestående af kalibreringsvæske 1 tilsat 5 16 DK 170103 B1 inM glucose (5 mM glucose) og på blod. Der opnåedes de i tabel 1 viste resultater.

Tabel 1 $ 5

Sensor Sensor

Prøve nr. 1 nr. 2

5 mM glucose 5,07 mM 5,12 mM

Blod 3,96 mM 3,94 mM

10 5 mM glucose 5,29 mM 5,25 mM

5 mM glucose 5,10 mM 5,13 mM

Det ses, at de to elektroder giver indbyrdes overensstemmende målinger både ved måling på blod og ved må-15 ling på vandig prøve, og at målingerne på de vandige prøver før og efter blodprøven stemmer pænt overens.

Sensoren har et linearitetsområde på 0,5-30 mM glucose og gode stabilitetsegenskaber. Langtidsforsøg viste 20 ingen forringelse i måleegenskaberne for membraner, der har været opbevaret tørt ved stuetemperatur i 2 1/2 måned. Membraner, der har været anvendt i den i FIG. 1 viste forsøgsopstilling og mellem målingerne hele tiden været i kontakt med kalibreringsvæske l, har vist sig 25 at bevare måleegenskaberne efter 4 ugers funktion ved 37eC.

Sammenlianingseksempel 2 sensorer af den i FIG. 2 viste type, og hvori sensor-30 membranen var fremstillet som ovenfor beskrevet dog med udeladelse af celluloselaget i sensormembranen, blev monteret i den i forbindelse med FIG. 1 viste måleopstilling. Der måltes på henholdsvis 5 mM glucose og på blod. Der opnåedes de i tabel 2 viste resultater.

35 DK 170103 B1 17

Tabel 2

Sensor Sensor

Prove a b

5 5 mM glucose 5,15 mM 5,19 mM

Blod 4,93 mM 4,16 mM

Blod 3,98 mM 1,99 mM

5 mM glucose 4,55 mM 2,17 mM

5 mM glucose 4,70 mM 2,10 mM

10

Det ses, at de to elektroder giver indbyrdes overensstemmende målinger ved første måling på vandig prøve, men giver meget forskellige målinger på blod, især anden gang. Det bemærkes, at der er tale om samme blod-15 prøve. Målingerne på vandig prøve er indbyrdes overensstemmende før blodmålingerne, men derefter både for lave og forskellige fra elektrode a til elektrode b.

Claims (8)

1. Elektrokemisk biosensor omfattende en arbejds-elektrode, en referenceelektrode og en membran V 5 omfattende et substratbegrænsende lag og et enzym lag kendetegnet ved, at der ved det substratbegrænsende lag er tilvejebragt et mod prøven vendende beskyttelseslag, som 10 omfatter eller består af et cellulosemateriale eller et cellulosederivatmateriale.

2. Elektrokemisk biosensor ifølge krav 1, kendetegnet ved, 15 at beskyttelseslaget omfatter et lag af rege nereret cellulose eller en celluloseplast, såsom en celluloseether eller en celluloseester.

3. Elektrokemisk biosensor ifølge krav 1-2, 20 kendetegnet ved, at beskyttelseslaget har en tykkelse på op til 100 μιη, fortrinsvis 10-50 μιη og især 12-25 μιη. 1 2 Elektrokemisk biosensor ifølge krav 1-3, 25 kendetegnet ved, at arbejdselektroden er en platinanode, og at platinanoden har en blotlagt arbejdsoverflade, hvorpå -der er tilvejebragt en belægning af celluloseacetat. 30 x 2 Elektrokemisk biosensor ifølge krav 4, kendetegnet ved, at celluloseacetatbelægningen er i direkte kontakt med platinanoden og har en tykkelse på 2-25 μιη, 35 fortrinsvis 3-15 μιη og især 5-10 μιη. DK 170103 B1 19

6. Elektrokemisk biosensor ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at det substratbegrænsende lag er et hydrofobt plastlag, fortrinsvis et polyurethanlag. 5

7. Biosensormembran omfattende et substratbegrænsende lag, et enzymlag og et inderlag, kendetegnet ved, at der ved det substratbegraensende lag er tilveje-10 bragt et mod prøven vendende beskyttelseslag, som omfatter eller består af et cellulosemateriale eller et cellulosederivatmateriale.

8. Biosensormembran ifølge krav 7, 15 kendetegnet ved, at beskyttelseslaget omfatter et lag af regenereret cellulose eller en celluloseplast, såsom en celluloseether eller en celluloseester.

9. Biosensormembran ifølge krav 7-8 kendetegnet ved, at beskyttelseslaget har en tykkelse på op til 100 jum, fortrinsvis 10-50 μηι og især 12-25 μιη.

10. Biosensormembran ifølge krav 7-9, kendetegnet ved, at det substratbegrænsende lag er et hydrofobt plastlag, fortrinsvis et polyurethanlag.