JPH0823545B2 - 簡易酵素電極 - Google Patents

簡易酵素電極

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JPH0823545B2
JPH0823545B2 JP61218066A JP21806686A JPH0823545B2 JP H0823545 B2 JPH0823545 B2 JP H0823545B2 JP 61218066 A JP61218066 A JP 61218066A JP 21806686 A JP21806686 A JP 21806686A JP H0823545 B2 JPH0823545 B2 JP H0823545B2
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由照 野添
征夫 軽部
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、簡易酵素電極に関し、酵素センサー、例え
ば血液中や尿中のグルコース濃度測定用の簡易型グルコ
ースセンサー等に用いることができる簡易酵素電極に関
するものである。
〔従来の技術とその問題点〕
酵素センサー、例えばグルコースセンサーを目的別に
分類すると、臨床検査機器への組み込みを目指したも
の、簡易グルコース計を目指したもの、人工膵臓への組
み込みを目指したものなどが挙げられる。臨床検査機器
へ組み込まれたグルコースセンサーは、すでに市販品も
あり、その特徴として、少量生産のため量産性は高くな
いが、測定回数を多くするため、酵素固定化し、酵素再
利用を計っていること、また被検液の希釈、血球分離、
標準液による較正、恒温槽の利用など、臨床検査機の装
備充実によりセンサーに対する設計の規制が少ないこと
が挙げられる。
簡易グルコース計に関しては、使い捨て、家庭向によ
る使い良さを意図するため、精度は臨床検査機器用ほど
必要ではないが、被検液の希釈や較正が実質的に出来な
いなど使用条件が厳しく、センサー間の測定誤差が少な
くかつ、量産生の高いものでなければならない。
簡易グルコース計用として、現在主流になっているも
のは、グルコースオキシダーゼ、パーオシシダーゼ、色
素を試験紙に組み入れ、グルコース濃度による色調変化
を、目視あるいは測定器で検出する比色法を用いたもの
である。これは、被検液中の色素、例えば赤血球などに
より測定誤差を生み、精度誤差が大きく、一度つけた被
検液を一定時間後に測定者が拭き取るなど、取扱も容易
とは言えない。
一方、ドライケミストリーでは、比色法の精度向上が
計られ、臨床検査方面で応用されているが、正確な被検
液量が必要で、簡易型としてみた場合、一検体あたりの
測定時間が長い、被検部の恒温化、複雑な検出光学系な
ど、測定が大がかりになっている。
本発明の目的は、測定誤差が少なく、取扱が容易で、
簡易型の酵素センサー等に用いられるように、小型で量
産でき、しかも、ダイナミックレンジの拡大が可能にな
る簡易酵素電極を提供することである。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、簡易酵素電極において、電気絶縁基板上に
形成された導電性の少なくとも対極と作用極とを備えた
感応部と、前記感応部と測定器本体とを電気的に接続す
る接続部と、前記感応部の領域を制限し、当該感応部と
前記接続部間を外部と絶縁する絶縁体でおおわれた絶縁
部とからなる電極を有し、前記感応部の前記作用極上に
固着された酵素固定化膜と、この酵素固定化膜をおおう
ように固着される高分子膜とを形成し、前記酵素固定化
膜は、酵素を含んだ吸水性感応性樹脂を用いたフォトリ
ソグラフィー技術によって作成され、前記高分子膜は、
グルコース,コレステロール,尿酸などの基質の透過を
制限するものであって、かつ、非溶媒性の光硬化性樹脂
あるいは二液性または一液性の常温硬化性樹脂で印刷、
あるいは感光性樹脂でフォトリソグラフィー技術によっ
て作成されることを特徴としている。
感応部の極は、基板上の同一平面上に作用極、対極お
よび参照極の3極から構成し、あるいは作用極(陽極)
および対極(陰極)の2極から構成することができる。
感応部および接続部の電極素材は、カーボン粉末、あ
るいは銀粉末を含んだ導電性印刷インクを用いた印刷に
よって作成することが好ましい。
また、酵素固定化膜は、酵素を含んだ感光性樹脂を用
いたフォトリソグラフィー技術によって作成する。この
場合、感光性樹脂としては、通常市販されているものを
使用できる。例えばスチルバゾリウム残基を付加した吸
水性のポリビニルアルコール、ベンゾインエチルエーテ
ルを重合開始剤とする吸水性のポリエチレングルコール
メタクリレートなどが挙げられる。
高分子膜は、光硬化性樹脂、あるいは二液性または一
液性の常温硬化性樹脂で印刷、あるいは感光性樹脂で、
フォトリソグラフィーによって作成する。光硬化性樹
脂、二液性または一液性樹脂、あるいは感光性樹脂を用
いると、 印刷技術、フォトリソグラフィー技術を用いること
ができ、量産性および再現性が高い。
非溶媒系なので、酵素に対して安全である、という
利点がある。
光硬化性樹脂としては、ウレタンアクリレート、ポリ
エステルアクリレート、エポキシアクリレートが挙げら
れ、これに反応性希釈剤や光重合開始剤等を配合するこ
とができる。二液性の常温硬化性樹脂としてはイソシア
ネートとポリオールを配合したものや、エポキシ樹脂
系,シリコン樹脂系等が挙げられ、これらの他にいずれ
も市販のものを使用できる。感光性樹脂としては、水ま
たは水を主成分とした現像液で現像できるものが好まし
く、例えばポリビニルアルコール類、2−エチルヒドロ
キシメタクリレートとポリビニルアルコール、コロネー
トLとポリエチレングルコールモノアクリレートとポリ
ビニルアルコールを配合した感光性樹脂等を用いること
ができる。
本発明の酵素電極に用いられる酵素としては、グルコ
ースオキシダーゼの他に通常酵素電極に使用されている
酸化還元酵素が使用でき、例えばグルコースオキシダー
ゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダ
ーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、キサンチンオキシダー
ゼ、ピルベートオキシダーゼ、サルコシンオキシダー
ゼ、ウレートオキシダーゼ、アスコルベートオキシダー
ゼ、グリセロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼなど
が挙げられる。
以下、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明の酵素電極をグルコースセンサーに用いる場合
を例に説明する。
電気絶縁性の基板の同一面上に、導電性インクを用い
て作用極、対極および参照極の3極、あるいは作用極
(陽極)、対極(陰極)の2極によるH2O2電極を形成
し、感応部に感光性樹脂を用いて酵素固定化膜を作成
し、その上に光硬化性樹脂や二液性の非溶媒性の硬化性
樹脂を硬化させて、オーバーコート膜である高分子膜を
作成する。
この場合、電極部を印刷技術で、また感応部の酵素固
定化を印刷技術、あるいはフォトリソグラフィー技術を
用いて作成することができるので、量産性が高い。ま
た、オーバーコート膜により、グルコース、H2O2の拡散
の安定化が計られ、十分な測定レンジが得られるため、
被検液の希釈などの煩雑な操作の必要がないという利点
がある。
また、オーバーコート膜の効果を考えると、例えばオ
ーバーコート膜がないポリビニルアルコール酸素固定化
膜だけの場合、グルコース応答は8mM(144mg/dl)程度
しか得られない。
これは、次式: で表されるグルコースオキシダーゼの反応において、溶
液中のO2量および膜中へのO2の拡散による供給量に限度
があり、グルコースが過剰に供給された状態になれば、
応答が飽和する。その量が、8mM程度である。
そこで、グルコースの透過量を減らし、ダイナミック
レンジを広げるのがオーバーコート膜の1つの役目であ
る。
さらに、ポリビニルアルコール膜は、吸水性があり、
膨潤して電極への密着性が悪くなり、電極表面へのH2O2
の拡散が変化し、応答電流の不安定化が生じる。オーバ
ーコート膜は、このポリビニルアルコール膜の密着性を
向上させる効果がある。
次に、本発明の簡易酵素電極の実施例を図面に基づき
説明する。
〔実施例〕
図1は、酵素電極を伝導性インクによって作成した電
極パターンを示す概略平面図である。
ポリエステル基板上に作用極1、対極2および参照極
3を印刷し、耐水性電気絶縁体で感応部4と接点(外部
接続部)5とを分離する絶縁部を形成する。
第2図は、感応部4の断面を示し、作用極1上に酵素
を含んだ感光性樹脂による酵素固定化膜6、その上に二
液性または一液性常温硬化性樹脂、光硬化性樹脂などに
よるオーバーコート膜7を形成する。
グルコースセンサに使用した場合、感応部4上に被検
液を滴下すると、被検体中のグルコースは、オーバーコ
ート膜7によって拡散制限を受けて、透過したグルコー
スがグルコースオキシダーゼ固定化膜6中に達しると、
そこでO2の存在のもとに、グルコノラクトンに変換さ
れ、O2はH2O2に還元される。そのH2O2を、作用極上で酸
化する酸化電流から、あらかじめ求められている検量線
(酸化電流対グルコース濃度)をもとにして、グルコー
ス濃度が算出される。この時、作用極には、H2O2酸化電
位として、参照極3を基準として900mV(Ag/AgCl)を印
加した。また、対極2は電流供給のための極である。
また、バイオセンサーとして多項目化する場合には、
本発明の酵素電極の感応部4の作用極を複数化して、例
えば、第3図に示したような電極構成において、作用極
8にグルコースオキシダーゼ、作用極9にコレステロー
ルオキシダーゼ、作用極10にウレードオキシダーゼの酵
素固定化膜を用い、対極2および参照極3を設け、グル
コース,コレステロールおよび尿酸を同時に測定するこ
とができる。
以下、実施例を更に具体的な材料および数値に基づき
説明する。
実施例1 作用極の作成: スチルバゾリウム残基を1.3mol%で付加したポリビニ
ルアルコールの感光性樹脂11.0wt%の水溶液1g中に2.5m
gのグルコースオキシダーゼを溶かし、これを第2図の
感応部4の作用極1上に塗布し、乾燥した後330〜490nm
の近紫外線3mW/cm3の強度で5分間露光させて固着し
た。さらに、その上にイソシアネートとポリオールを混
合させた液を塗布し、24時間室温で硬化させ、ポリウレ
タン膜を形成した。
参照極の作成: 導電性カーボンインクで作成した2mm2の参照極上に、
p−キノン0.2Mエタノール液を5μ塗布し、乾燥後、
光硬化性ウレタンアクリレートを約20μmの厚みにして
硬化させた。
p−キノン電極は、 の酸化還元電極反応で、pHに依存する。依存性は−59mV
/pHであるが、血液の場合pHが7.35〜7.45と安定してい
るので問題はない。時間安定性も50mV±5mV以内で、測
定時間中は十分安定である。このp−キノン電極のpH依
存性を第4図に示す。
グルコースの検出: このようにして作成した作用極および参照極を用い、
作用極に850mV印加して、このグルコースセンサーのグ
ルコース検量線を求めた。その結果を第5図に示す。
これはpH7.2の0.1Mリン酸緩衝液中で、温度30℃にお
いて求めたものである。0.5mM(9mg/dl)から100mM(18
00mg/dl)以上のグルコース濃度まで応答した。
実施例2 実施例1のポリビニルアルコールにグルコースオキシ
ダーゼを固定化した膜上に、ウレタンアクリレート系光
硬化樹脂(東亜合成化学、商品名アロニックスM1200と
アロニックス150を1:1に混合)を塗布し、3mW/cm(33
0nm〜490nm)の近紫外線を10分照射して硬化させた。こ
のグルコースセンサーも100mM(1800mg/dl)以上まで応
答が得られた。
実施例3 実施例1のポリビニルアルコールにグルコースオキシ
ダーゼを固定化した膜上に、シリコン系光硬化性樹脂
(信越化学、商品名KP601)を塗布し、3mW/cm(330nm
〜498nm)の近紫外線を10分照射して硬化させ、10μm
の厚みに成膜した。このセンサーは、グルコース100mM
(1800mg/dl)まで応答が得られた。
実施例4 この実施例では参照電極を除き、作用極と対極の2極
法を用いた。実施例1と同様に感応部の作用極上にポリ
ビニルアルコール(スチルバゾリウム基)にグルコース
オキシダーゼ2.5mg/g混合したものを、塗布し、近紫外
線で硬化させ、酵素固定化膜を作成し、さらにその上に
ポリウレタン膜を形成した。作用極に対極との間に900m
Vを印加し、実施例1と同様にグルコースの検量線を求
めた。その結果を第6図に示す。
このセンサーは、グルコース100mM(1800mg/dl)まで
応答が得られた。
〔発明の効果〕 以上、本発明の酵素電極によれば、 電極部を導電性インクと絶縁レジストを用いて、印
刷により簡単に作成できる、 感応部の酵素固定化膜を、感応性樹脂オーバーコー
ト膜と非溶媒の二液性または一液性効果性樹脂、あるい
は光効果樹脂の印刷、フォトリソグラフィー技術を用い
て容易に作成できる、 という特徴を持ち、量産性が高く軽量化が可能なので簡
易型の酵素センサーに組み込むことができ、オーバーコ
ート膜によりグルコースなどの基質の透過制限と、酵素
固定化膜の密着性の向上による応答の安定化が得られる
結果、応答レンジが広くなり、例えばグルコースでは10
0mM(1800mg/dl)以上まで可能となった。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の実施例による電極パターンを示す概略
平面図、 第2図は第1図の感応部を示す断面図、 第3図は本発明を多項目化した酵素電極に使用した例を
示す概略断面図、 第4図は本発明実施例に使用するp−キノン電極のpH依
存性を示すグラフ、 第5図は本発明実施例1によるグルコースセンサーのグ
ルコース検量線を示すグラフ、 第6図は本発明実施例4によるグルコースセンサーのグ
ルコース腎濾線を示すグラフである。 1……作用極、2……対極、3……参照極、 4……感応部、6……接点、6……酵素固定化膜、 7……オーバーコート膜、 8〜10……作用極
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 27/30 353 C

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】電気絶縁基板上に形成された導電性の少な
    くとも対極と作用極とを備えた感応部と、前記感応部と
    測定器本体とを電気的に接続する接続部と、前記感応部
    の領域を制限し、当該感応部と前記接続部間を外部と絶
    縁する絶縁体でおおわれた絶縁部とからなる電極を有
    し、 前記感応部の前記作用極上に固着された酵素固定化膜
    と、この酵素固定化膜をおおうように固着される高分子
    膜とを形成し、 前記酵素固定化膜は、酵素を含んだ吸水性感応性樹脂を
    用いたフォトリソグラフィー技術によって作成され、 前記高分子膜は、グルコース,コレステロール,尿酸な
    どの基質の透過を制限するものであって、かつ、非溶媒
    性の光硬化性樹脂あるいは二液性または一液性の常温硬
    化性樹脂で印刷、あるいは感光性樹脂でフォトリソグラ
    フィー技術によって作成されることを特徴とする簡易酵
    素電極。
  2. 【請求項2】前記感応部は、前記基板の同一平面上に設
    けられた作用極,対極および参照極の3極を有すること
    を特徴とする特許請求の範囲第1項記載の簡易酵素電
    極。
  3. 【請求項3】前記感応部と接続部の電極素材は、カーボ
    ン粉末、あるいは銀粉末を含んだ導電性印刷インクを用
    いた印刷によって作成されることを特徴とする特許請求
    の範囲第1項または第2項記載の簡易酵素電極。
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