JP2940007B2

JP2940007B2 - 酵素電極

Info

Publication number: JP2940007B2
Application number: JP1209046A
Authority: JP
Inventors: 英樹遠藤; 真人荒井; 聡中嶋; 耕一滝澤
Original assignee: Omron Corp
Current assignee: Omron Corp
Priority date: 1989-08-11
Filing date: 1989-08-11
Publication date: 1999-08-25
Anticipated expiration: 2014-08-25
Also published as: JPH0372254A

Description

【発明の詳細な説明】（イ）産業上の利用分野この発明は、酵素反応を利用して、検体中の基質濃度
を電気的に測定する酵素電極に関する。

（ロ）従来の技術従来、酵素電極としては円柱状のいわゆるペンシル型
のものが知られていたが、この種の酵素電極は性能面、
生産性においても多くの問題を有していた。そこで、こ
れらの問題を克服すべくいわゆるプレーナ型の微小酵素
電極が提案されている。

このプレーナ型の微小酵素電極の断面を第７図に示し
ている。22は、例えばプラスチックフィルム等の絶縁材
料よりなる、平板上の電極支持基材である。この電極支
持基材22上には、白金（Pt）等の金属よりなる作用電極
23、対照電極24が薄膜形成されている。さらに電極支持
基材22上には、絶縁性保護膜25が形成され、感応部23
a、24a及び図示しない接続部を除いて、両電極23、24が
被覆・絶縁される。なお、接続部には、それぞれ外部接
続用のリード（図示せず）が接続される。

29は、固定化酵素膜であり、第１の高分子層29a、酵
素層29b、第２の高分子層29cの三層より構成されてい
る。この第１の高分子層29a、第２の高分子層29cにはア
セチルセルロースが用いられており、アセチルセルロー
ス溶液中に電極支持基材22をディップして（ディップコ
ーティング）により形成されている。一方、酵素層29b
は反応に際して過酸化水素（H₂O₂）を生成する酵素、例
えばグルコースオキシダーゼの溶液を第１の高分子層29
aに滴下して形成される。

この従来酵素電極21は、作用電極23、対照電極24間に
所定の電圧を印加した状態で検体中に浸漬される。この
時、検体中の基質、例えばグルコースの濃度に対応した
電極電流が得られるので、この電極電流に予め作成した
検量線を適用することによりグルコース濃度を知ること
ができる。

（ハ）発明が解決しようとする課題上記従来の酵素電極では、第１の高分子層29a、第２
の高分子層29c共にアセチルセルロースで構成している
ため、以下に列挙する問題点があった。

酵素反応で生成する過酸化水素に対する感度が低く、
基質測定用、例えばグルコース測定用の検量線における
直線濃度範囲が狭い。

アスコルビン酸等の検体中の干渉物質濃度が高くなる
と、その影響を受けて正確な測定を行えない。

検体中の高分子物質、例えばタンパク質等が固定化酵
素膜に付着し易く、電極出力が影響を受ける。

固定化酵素膜の機械的強度が弱く、破損しやすい。

アセチルセルロースは、簡易なディップ・コーティン
グ方法で製膜できるものの、膜厚を均一化することが難
しく、個々の酵素電極間の、電極出力のばらつきが大き
い。

アセチルセルロースは、製造メーカあるいはロットに
より、アセチル化率等の特性が異なり、電極出力に影響
を与える。

アセチルセルロース溶液の調製が煩雑である。

本発明は上記に鑑みなされたものであり、電極間の電
極出力のばらつきが少なく、正確な測定を行える酵素電
極の提供を目的としている。

（ニ）課題を解決するための手段及び作用上記課題を解決するため、第１請求項の酵素電極は、
電極支持基材と、この電極支持基材上に膜形成される電
極と、この電極を感応部を除いて被覆絶縁する絶縁膜
と、少なくとも前記感応部を被覆する固定化酵素膜とを
備え、この固定化酵素膜は、前記感応部に接する第１の
高分子層と、この第１の高分子層上に形成される酵素層
と、この酵素層を覆う第２の高分子層との３層よりなる
ものにおいて、前記第１の高分子層を陽イオン交換性高
分子層としたことを特徴とするものである。

この陽イオン交換性高分子の陽イオン交換機能によ
り、過酸化水素に対する感度が上がり、検量線の直線濃
度範囲が広がるとともに、検体中の干渉物質の影響を受
けにくくなる。また、陽イオン交換性高分子には機械的
強度、耐薬品性に優れたものがあり、このような高分子
を用いて固定化酵素膜の機械的強度を上げ、化学的にも
安定なものとすることができる。さらに、陽イオン交換
性高分子の溶液はすでに市販されており、この溶液を用
いてディップコーティングにより第１の高分子層を形成
しても、その膜厚は均一であり、個々の酵素電極間のば
らつきを小さくすることができる。

（ホ）実施例本発明の一実施例を、第１図乃至第６図に基づいて説
明する。

この実施例酵素電極は、検体中のグルコース濃度の測
定に適用されるもので、酵素としてグルコースオキシダ
ーゼ（GOD）を使用している。以下、製造工程を追いな
がら実施例酵素電極を説明する。

第２図（ａ）（ｂ）は、プラスチックフィルム（電極
支持基材）2₀の表面に、作用電極３及び対照電極４を複
数組一括して形成した状態を示している。このプラスチ
ックフィルムは、絶縁性、耐熱性のあるものが選定さ
れ、また作業上適切な大きさ（例えば50mm×50mm、厚さ
0.125mm）のものを使用する。なお、電極支持基材とし
ては、他の絶縁性素材よりなる板材の使用が可能であ
り、プラスチックフィルムに限定されるものではない。

作用電極３及び対照電極４は、並行して配列される白
金等の金属薄膜であり、スパッタリング、真空蒸着等の
薄膜形成法が適用され、一括してプラスチックフィルム
2₀表面に形成されている。

第３図（ａ）（ｂ）は、プラスチックフィルム2₀表面
に絶縁性保護膜５を形成した状態を示している。この絶
縁性保護膜５は、プラスチックフィルム2₀表面を感光性
ポリイミドである感光性樹脂膜で被覆し、この感光性樹
脂膜にホトマスク（図示せず）をかけて露光した後、現
像、リンス処理を施し、不要部分を除去したものである
（ホトリソグラフィー）。この除去された部分からは、
作用電極３及び対照電極４が、それぞれ感応部3a、4a、
接続部3b、4bとして露出する。これらの面積、特に感応
部3a、4aの面積は、ホトリソグラフィーを適用している
ので、高い精度で定めることができる。この実施例で
は、作用電極感応部3aと対照電極感応部4aとの面積比は
1:4とされている。なお、感応部の形状、面積比等は上
述のものに限定されるものではなく、適宜設計変更可能
である。

第４図（ａ）（ｂ）は、プラスチックフィルム2₀を個
々のプラスチックフィルム２に切断し、リード線７を接
続した状態（下地電極と呼ばれる）を示している。

プラスチックフィルム2₀の切断はそれが薄いこともあ
り、はさみやカッターナイフなど容易な手段を用いて行
うことができる。リード線７、７は、帯状の絶縁体7aに
支持されており、リード線７、７はそれぞれ作用電極接
続部3b、対照電極接続部4bに、はんだまたは銀ペースト
を用いて、それぞれ電気的に接続される。接続部3b、4b
上には、エポキシ樹脂８が盛られ、リード線７、７の接
続箇所が絶縁補強される。

第１図（ａ）（ｂ）は、第４図（ａ）（ｂ）に示す下
地電極６に固定化酵素膜９を形成し、酵素電極１として
完成した状態を示している。この固定化酵素膜９は、ナ
フィオン層9a、酵素層9b、ポリウレタン層9cの三層より
構成されている。以下、固定化酵素膜９の形成過程を従
来の酵素電極21と比較しながら説明する。

まず、下地電極６上にナフィオン層9aを形成する。ナ
フィオン（Nafion）は、陽イオン交換性高分子の一つで
あり、以下に示す構造を有している。

現在、エタノールを溶媒とするナフィオン溶液（５
％）が市販されており、このナフィオン溶液に上記下地
電極６をディップして、ナフィオン層9a（厚さは約１μ
ｍ）が形成される。

これに対し従来の酵素電極21では（第７図参照）、２
％アセチルセルロース溶液（溶媒は、アセトン、シクロ
ヘキサンを40:10の比率で混合したもの）を調製し、こ
のアセチルセルロース溶液に下地電極をディップして、
第１のアセチルセルロース層29aを形成している。

次に、上記ナフィオン層9a上には、酵素層9bが形成さ
れる。酵素層9bは、グルコースオキシダーゼ溶液を、ナ
フィオン層9a上に滴下して乾燥させてなるものである。
このグルコースオキシダーゼ溶液は、以下のＡ液及びＢ
液を混合して調製される。

Ａ液：グルコースオキシダーゼ20mgを0.1モルリン酸緩
衝液（pH6.0）100μに溶解したものＢ液:0.1モルリン酸緩衝液（pH6.0）で調製された0.5％
グルタルアルデヒド溶液100μ 酵素層の形成は、従来の酵素電極21においても、全く
同様である。なお、第１図（ｂ）において、酵素層9bは
作用電極感応部3a上のみに形成されているが、さらに大
きく形成することもできる。

最後に、ポリウレタン層9cをやはりディップ・コーテ
ィングにより形成する。この時使用されるのは、２％の
ポリウレタン溶液であり、これはテトラハイドロフロン
にポリウレタンを溶解して調製される。

これに対し、従来の酵素電極21では（第７図参照）、
３％のアセチルセルロース溶液（溶媒：アセトン、エタ
ノールを40:10の比率で混合したもの）に下地電極をデ
ィップして、第２のアセチルセルロース層29cが形成さ
れる。

次に、実施例酵素電極１の特性を従来酵素電極21と比
較しながら説明するが、その前に特性測定に使用された
測定系11を、第６図を参照しながら説明する。

12は、恒温槽であり、内部にpH7.0に調製された0.1モ
ルリン酸緩衝液13が貯溜されている。このリン酸緩衝液
13中には、酵素電極１（21）が浸漬される。また、この
リン酸緩衝液13はスターラ14で撹拌されており、15は、
このスターラ14の回転子である。酵素電極１のリード線
７、７は、エレクトロンメータ16に接続され、所定の電
圧（この測定では5.5V）が加えられるとともに、電極出
力が表示される。

このリン酸緩衝液13中には、マイクロピペット（図示
せず）により、所定量のグルコース溶液が滴下される。
グルコースは酵素電極１の固定化酸素膜９内で以下に示
す反応を生じさせる。

この生成したH₂O₂は、作用電極感応部3aで酸化され、
その酸化電流を電極出力として検知することにより、化
学量論的にグルコースの濃度を知ることができる。

したがって、まずH₂O₂に対する電極出力を確認する必
要がある。第５図（ａ）は、H₂O₂濃度に対する電極出力
を示しており、白丸（○）は、下地電極６にナフィオン
層9aのみを形成したものの電極出力、黒丸（●）は、下
地電極に第１のアセチルセルロース層29aのみを形成し
たものの電極出力を示している。

第５図（ｂ）は、いくつかのグルコース濃度に対する
電極出力を示している。図中白丸（○）は、固定化酵素
膜９を完全に形成した酵素電極１の電極出力を示してお
り、黒丸（●）は、やはり固定化酵素膜29を完全に形成
した従来の酵素電極21の電極出力を示している。この図
中のプロットされた点を結んで検量線とし、未知の検
体、例えば血液中のグルコース濃度を定量することがで
きるが、実施例酵素電極１の場合（○）は、従来の酵素
電極21（●）と比較して、優れた直線性が得られてい
る。

なお、この実施例では、第１の高分子層をナフィオン
層、第２の高分子層をポリウレタン層としているが、第
１の高分子層をナフィオン層、第２の高分子層をアセチ
ルセルロース層とすることも、第１の高分子層をアセチ
ルセルロース層、第２の高分子層をポリウレタン層とす
ることも可能であり、適宜設計変更可能である。

また、上記実施例では、酵素としてグルコースオキシ
ダーゼを用いているが、酵素はこれに限定されるもので
はなく、適宜変更可能である。

（ヘ）発明の効果以上説明したように、第１請求項の酵素電極は、第１
の高分子層を陽イオン交換性高分子層としてなるもので
あるから、以下のｉ〜ｖ項に列挙する利点を有する。

i :直線濃度範囲が広い検量線が得られる。

ii :アスコルビン酸等、検体中の干渉物質の影響を受け
にくい。

iii:固定化酵素膜の機械的強度が向上し、耐薬品性にも
優れ化学的に安定なものとなる。

iv :ディップ・コーティング法でも均一な層厚が得ら
れ、個々の酵素電極の電極出力のばらつきが小さくな
る。

v :陽イオン交換性高分子溶液はすでに市販されており
調製の手間が不要である。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）は、本発明の一実施例に係る酵素電極の外
観斜視図、第１図（ｂ）は、同酵素電極の第１図（ａ）
中Ｉ−Ｉ線における断面図、第２図乃至第４図は、同酵
素電極の製造工程を説明する図であり、第２図（ａ）
は、プラスチックフィルム表面に作用電極及び対照電極
を形成した状態を示す斜視図、第２図（ｂ）は、同プラ
スチックフィルムの第２図（ａ）中II−II線における断
面図、第３図（ａ）は、同プラスチックフィルム表面に
絶縁性保護膜を形成した状態を示す斜視図、第３図
（ｂ）は、同プラスチックフィルムの第３図（ａ）中II
I−III線における断面図、第４図（ａ）は、実施例酵素
電極を構成する下地電極の斜視図、第４図（ｂ）は、同
下地電極の第４図（ａ）中IV−IV線における断面図、第
５図（ａ）は、同下地電極の過酸化水素濃度に対する電
極出力を従来と比較して示す図、第５図（ｂ）は、実施
例酵素電極のグルコース濃度に対する電極出力をやはり
従来と比較して示す図、第６図は、実施例酵素電極の特
性測定に適用された測定系を説明する図、第７図は、従
来の酵素電極の断面図である。 2:プラスチックフィルム、 3:作用電極、3a:作用電極感応部、 4:対照電極、4a:対照電極感応部、 5:絶縁性保護膜、9:固定化酵素膜、 9a:ナフィオン層、9b:酵素層、 9c:ポリウレタン層。

フロントページの続き (72)発明者中嶋聡京都府京都市下京区中堂寺南町17番地サイエンスセンタービル株式会社立石ライフサイエンス研究所内 (72)発明者滝澤耕一京都府京都市下京区中堂寺南町17番地サイエンスセンタービル株式会社立石ライフサイエンス研究所内 (56)参考文献特開平１−170848（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−274254（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−149554（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−67442（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 27/327

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】電極支持基材と、この電極支持基材上に膜
形成される電極と、この電極を感応部を除いて被覆絶縁
する絶縁膜と、少なくとも前記感応部を被覆する固定化
酵素膜とを備え、この固定化酵素膜は、前記感応部に接
する第１の高分子層と、この第１の高分子層上に形成さ
れる酵素層と、この酵素層を覆う第２の高分子層との３
層よりなる酵素電極において、前記第１の高分子層を陽イオン交換性高分子層としたこ
とを特徴とする酵素電極。