DE602004012330T2 - Verfahren und kit zum nachweis von bestandteilen in einer probe - Google Patents

Verfahren und kit zum nachweis von bestandteilen in einer probe Download PDF

Info

Publication number
DE602004012330T2
DE602004012330T2 DE602004012330T DE602004012330T DE602004012330T2 DE 602004012330 T2 DE602004012330 T2 DE 602004012330T2 DE 602004012330 T DE602004012330 T DE 602004012330T DE 602004012330 T DE602004012330 T DE 602004012330T DE 602004012330 T2 DE602004012330 T2 DE 602004012330T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
kit
streptavidin
kit according
particles
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE602004012330T
Other languages
English (en)
Other versions
DE602004012330D1 (de
Inventor
Marc Ramael
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of DE602004012330D1 publication Critical patent/DE602004012330D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE602004012330T2 publication Critical patent/DE602004012330T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/587—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Mikroarrays sind Werkzeuge für die molekulare Protein-, DNA- und RNA-Diagnostik, die oft zum Erfassen von Nukleinsäuren und Proteinen verwendet werden. Derartige Parallelisationstechniken ermöglichen es, mehrere tausend Sequenzen in einer Reaktion oder einem Versuch zu untersuchen. Die meisten Anwendungen sind auf das Expressionsprofilieren zum ausreichenden Messen der Expression mehrerer tausend Gene, die von Interesse sind, gerichtet. Zur Zeit wird das Erfassen der Molekularbindung bei Mikroarrays durch Verwendung spezieller Fluoreszenzfarbstoffe wie Cy3 und Cy5 durchgeführt. Jedoch ist die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit derartiger Techniken durch die Beständigkeit des Fluoreszenzmarkers beschränkt.
  • Die sequenzselektive DNA-Erfassung ist im Zuge der Entwirrung der genetischen Basis von Krankheiten durch Wissenschaftler immer wichtiger geworden und diese neuen Informationen werden zum Verbessern der medizinischen Diagnostik und Behandlung verwendet. DNA-Hybridisierungstests an durch Oligonukleotid modifizierten Substraten werden im Allgemeinen zum Erfassen des Vorliegens spezifischer DNA-Sequenzen in Lösung verwendet. Die sich entwickelnde Aussicht auf Kombinations-DNA-Arrays für das Sondieren genetischer Informationen veranschaulicht die Wichtigkeit dieser heterogenen Sequenzassays für die Wissenschaft der Zukunft. In den meisten Assays wird die Hybridisierung von fluophorgelabelten Targets zu an der Oberfläche gebundenen Sonden durch Fluoreszenzmikroskopie oder Densitometrie überwacht. Obwohl die Fluoreszenzerfassung sehr empfindlich ist, ist ihre Anwendung durch die Kosten der Versuchsgeräte und durch Hintergrundemissionen aus den meisten allgemein vorkommenden Substraten beschränkt. Außerdem ist die Selektivität gelabelter Organonukleotidtargets für völlig komplementäre Sonden im Vergleich mit denjenigen mit Einbasenfehlanpassungen schlecht, was die Verwendung von Oberflächenhybridisierungstests für das Erfassen einzelner Nukleotidpolymorphismen verhindert. Ein anderer Nachteil besteht darin, dass die Beurteilung verarbeiteter Mikroarrays auf Fluoreszenzbasis äußerst kostspielige Laserscangeräte sowie höchst anspruchsvolle Software für das Analysieren der Daten, die durch die Laserscangeräte erzeugt werden, erfordert. Derartige Geräte stehen nicht allen Labors und vor allen Dingen nicht Labors mit beschränkten Ressourcen zur Verfügung. So besteht ein starker Nachteil dieser Technologie aus den Kapitalkosten und ihre Verwendung ist auf Labors mit ausreichenden Ressourcen beschränkt.
  • Eine begrenzte Anzahl von Dokumenten des Stands der Technik beschreiben Erfassungsverfahren und/oder Reagentien zur Verwendung in Festphasenassays, jedoch ist jede mit zahlreichen Nachteilen verbunden. Enzymatische Verfahren oder das Erfassungsverfahren auf der Basis von Gold an Mikroarrays sind in WO 00/72018 , EP 1164201 , EP 1096024 , WO 01177372A2 , US 2001/0010906A1 beschrieben. Die Patentanmeldung Nr. WO 0017201 beschreibt die Verwendung einer biotinylierten DNA an einem Mikroarray unter Anwendung von mit Streptavidin gelabeltem Gold. Andere Patentdokumente wie EP 1164201 , EP 1096024 und WO 01/77372A2 beschreiben Verfahren und Kits für das Erfassen und die Quantifizierung homologer Nukleotide, das Verfahren und den Kit für die Diagnose und Quantifizierung unter Anwendung der Sandwichhybridisierung an festem Träger ( US 2001/0010906A1 ). Das Patentdokument EP 1164201 beschreibt die Verwendung der invertierten Erfassung zum Identifizieren und/oder Quantifizieren von Nukleotidtargetsequenzen an Biochips unter Anwendung von Mikrofluiditätstechniken. Das Patentdokument EP 10960245 beschreibt ein Verfahren zum Erfassen homologer Sequenzen nach der Multiplex-PCR zum Erfassen von Staphylococcus-Mikroorganismen. Die Patentdokumente AU8366001 , AU7547501 , CA2397280 , WO 01/96604 und WO 99/20789 beschreiben eine Erfassungstechnik unter Anwendung von mit Streptavidin gelabelten Goldteilchen von mindestens 80 nm zum Sichtbarmachen von gebundenen Nukleinsäuren an Mikroarray. Das Patentdokument US 6451980 beschreibt eine Technik für die Signalsteigerung unter Anwendung einer hybriden Antikörperpolymersonde, wobei ein Teil der Sonde das Antigen erkennt und der andere Teil gegen DTPA (Diethylenpentaessigsäure) gerichtet ist. Das Patentdokument WO 02106511 (Genisphere) beschreibt eine Amplifikationstechnik, die bei Mikroarrays anwendbar ist, unter Anwendung eines Ansatzes auf der Basis von DNA-Dendrimer. Das Patentdokument WO 01/36681 (Digene) offenbart eine Technologie für das Erfassen von DNA/RNA-Hybriden an Mikroarrays unter Anwendung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch auf RNA/DNA-Hybride gerichtet ist, unter Sichtbarmachung unter Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen. Das Patentdokument WO 96/14314 (DAKO) beschreibt die Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers für das Erfassen von DNA/PNA-Nukleinsäurehybriden. Die Verwendung von Lectinen oder mit Biotinmolekülen beschichtetem Dextran spezifisch für die in situ-Hybridisierung ist im Patentdokument EP0151492 (ENZO) offenbart.
  • US 5,691,207 beschreibt ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe auf das Vorliegen eines Analyten hin, was das Immobilisieren von Goldsol und wahlweise eines Enzyms involviert, das in der Lage ist, ein Reaktionsprodukt auf einer festen Base zu bilden. W. M. Danker et al The Journal of Histotechnology, 1989, Band 12(1), Seite 9–13, beschreibt einen Vergleich von Immunzytochemie-Kits, bei denen ein Avidin-Biotin-Komplex, das indirekte Immungold-Silber-Enhancement oder Streptavidin-5 nm-Goldsol verwendet wird. US 2003/0186274 beschreibt ein Verfahren zum Erfassen oder Quantifizieren einer biologischen Substanz, die mit einem kolloidalen Metallteilchen gekoppelt ist, durch elektrochemische Erfassung unter Anwendung eines Schritts des Lösens des kolloidalen Metallteilchens durch chemische Behandlung vor dem Erfassen. US 2002/0000398 beschreibt ein Verfahren zum Trennen von Materialien unter Anwendung von kolloidalen, magnetisierbaren Anhäufungen, die mit einer oder mehreren Schichten neuartiger Polysaccharidderivate beschichtet sind.
  • Ein Erfassungsschema, das die Einfachheit, Empfindlichkeit und Selektivität von Verfahren des Stands der Technik verbessert, könnte gestatten, dass das volle Potential der Kombinationssequenzanalyse in der Praxis erreicht würde. Daher besteht für das Lesen und Analysieren von Arrays bei geringen Kosten, mit hoher Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit, ein Bedarf für eine Technik, die die Probleme des Stands der Technik überwindet.
  • Um die Verwendung dieser Technologie allgemein geeignet zu machen, wäre es vorteilhaft, eine Sichtbarmachungstechnik zur Hand zu haben, die es dem Forscher ermöglicht, die Hybridisierungsergebnisse mit dem nackten Auge ohne Anwendung von Laserscangeräten oder anderen Arten teurer Sichtbarmachungsgeräte zu beurteilen. Alternativ würde ein System, das die Verwendung billiger Lesegeräte, z. B. derjenigen, die die elektrische Leitfähigkeit und/oder Änderungen im Magnetfluss erfassen, ermöglicht, dazu beitragen, das empfindliche Untersuchen vom Arraytyp als Forschungs- und diagnostisches Werkzeug kostenwirksamer zu machen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die quantitative und/oder qualitative Erfassung von einer oder mehreren Komponenten in einer Probe, wobei jede Komponente in der Lage ist, sich an eine Sonde zu binden, umfassend Schritte in folgender Reihenfolge:
    • (a) Aufbringen einer oder mehrerer Proben auf einen festen Träger,
    • (b) Kontaktieren des festen Trägers mit einer oder mehreren biotingelabelten Sonden,
    • (c) Kontaktieren des festen Trägers mit einem Streptavidin-Metallteilchen-Komplex,
    • (d) Kontaktieren des festen Trägers mit Konjugat umfassend:
    • – ein oder mehrere Biotine,
    • – ein oder mehrere Polymere und
    • – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind,
    • (e) wahlweises Kontaktieren des festen Trägers durch Metallenhancementreagens und
    • (f) Lesen des festen Trägers zum quantitativen und/oder qualitativen Erfassen der Komponente.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei der Schritt (a) durch:
    • (a) Aufbringen einer oder mehrerer Sonden auf den festen Träger
    ersetzt wird und Schritt (b) durch:
    • (b) Kontaktieren des festen Trägers mit mit Biotin gelabelter Probe ersetzt wird.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei dem Schritt (a) Folgendes vorausgeht:
    • (a0) Aufbringen einer oder mehrerer Sonden auf den festen Träger.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei der feste Träger mit vorher aufgebrachter Sonde beliefert und Schritt (a) der obigen zweiten Ausführungsform oder Schritt (a0) der obigen dritten Ausführungsform nicht durch den Anwender durchgeführt wird.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das Lesen des Schritts (f) die Verwendung einer Farbtafel umfasst.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das Lesen des Schritts (f) eine Verwendung eines Geräts umfasst, das für das Erfassen von Änderungen der Leitfähigkeit und/oder des Stroms über den festen Träger geeignet ist.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das Lesen des Schritts (f) eine Verwendung eines Geräts umfasst, das für das Erfassen von Änderungen im Magnetfeld auf dem festen Träger geeignet ist.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das Lesen des Schritts (f) eine Verwendung eines Geräts umfasst, das für das Erfassen von Änderungen in der Oberflächenplasmonresonanz auf dem festen Träger geeignet ist.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das Metallenhancementreagens des Schritts (e) ein Silberenhancementreagens ist.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit für die quantitative und/oder qualitative Erfassung von einer oder mehreren Komponenten in einer Probe, wobei jede Komponente in der Lage ist, sich an eine Sonde zu binden, umfassend:
    • – Streptavidin-Metallteilchen-Komplex und
    • – einen festen Träger und
    • – Konjugat umfassend:
    • – Biotin,
    • – Polymer und
    • – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit wie oben beschrieben, des Weiteren umfassend eine oder mehrere Sonden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit wie oben beschrieben, wobei die Sonden biotinyliert sind.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit wie oben beschrieben, wobei der feste Träger mit einer oder mehreren Sonden vorbeladen ist.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei das Polymer eines Konjugats ein biologisch inertes Polymer ist, das in der Lage ist, sich an ein oder mehrere Metallteilchen zu binden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei ein Polymer eines von Albumin oder Dextran ist.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei das Konjugat ein oder mehrere Teilchen von Gold, Silber, Eisen, Nickel, Gadolin, Blei, Uran, Cäsium, Platin, Rhodium, Technetium, Tellur, Selen, Silicium, Kupfer, Zinn, Rhenium, Europium, Aluminium, Germanium, Chrom, Cadmium, Niob, Titan, Magnesium, Mangan, Molybdän, Antimon, Americium, Lithium und/oder Wolfram umfasst.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei das Konjugat ein oder mehrere Goldteilchen umfasst.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei das Konjugat ein oder mehrere Silberteilchen umfasst.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei die Metallteilchen des Konjugats einen Durchmesser zwischen 0,6 und 40 nm aufweisen.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit wie oben beschrieben zur Verwendung bei einem Verfahren wie oben beschrieben.
  • Ein Verfahren für das Verbessern der Bilderkennung einer oder mehrerer Komponenten in einem System durch Magnetresonanzbilderkennung, wobei jede Komponente in der Lage ist, sich an eine Sonde zu binden, kann folgende Schritte umfassen:
    • (i) Zugeben von einer oder mehreren biotingelabelten Sonden,
    • (ii) Zugeben von Streptavidin-Metallteilchen-Komplex zum System und
    • (iii) Erhalten eines Bilds unter Anwendung von Magnetresonanzbilderkennung.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zum Verbessern der Bilderkennung einer oder mehrerer Komponenten in einem System durch Magnetresonanzbilderkennung, wobei jede Komponente in der Lage ist, sich an eine Sonde zu binden, umfassend einen Streptavidin-Metallteilchen-Komplex.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit wie oben beschrieben, des Weiteren eine oder mehrere biotingelabelte Sonden umfassend.
  • Ein Kit wie oben beschrieben kann bei einem Verfahren zum Verbessern der Bildererkennung einer oder mehrerer Komponenten in einem System wie oben beschrieben verwendet werden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei die Sonde ein Antikörper, eine Nukleinsäure, Peptidnukleinsäure, ein Polypeptid oder ein Peptidligand ist.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex ein oder mehrere Teilchen von Gold, Silber, Eisen, Nickel, Gadolin, Blei, Uran, Cäsium, Platin, Palladium, Rhodium, Technetium, Tellur, Selen, Silicium, Kupfer, Zinn, Rheniun, Europium, Aluminium, Germanium, Chrom, Cadmium, Niob, Titan, Magnesium, Mangan, Molybdän, Antimon, Americium, Lithium und/oder Wolfram umfasst.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex ein oder mehrere Goldteilchen umfasst.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex ein oder mehrere Silberteilchen umfasst.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei die Metallteilchen des Streptavidin-Metallteilchen-Komplexes einen Durchmesser zwischen 0,6 und 40 nm aufweisen.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex Streptavidin und/oder Avidin umfasst.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex und/oder das Konjugat ein oder mehrere superparamagnetische Teilchen umfasst.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex ein oder mehrere superparamagnetische Teilchen umfasst und wobei die Schritte (d) und (e) nicht durchgeführt werden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei die superparamagnetischen Teilchen Eisenoxid umfassen.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei der Eisenoxidgehalt eines superparamagnetischen Teilchens zwischen 30 und 80% liegt.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei die superparamagnetischen Teilchen einen Durchmesser zwischen 50 und 400 nm aufweisen.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei mindestens eine Sonde in der Lage ist, sich an menschliches Papillomvirus zu binden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei die Sonde in der Lage ist, sich an ein menschliches Papillomvirusbeschichtungspolypeptid zu binden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben für die Erfassung, Diagnose und/oder Überwachung des Fortschreitens einer Infektion durch ein menschliches Papillomvirus (HPV).
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei mindestens eine Sonde in der Lage ist, sich an ein Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 52 und HPV 58 zu binden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei die Sonde in der Lage ist, sich an eine in Tabelle 1 aufgelistete Komponente zu binden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben für die Erfassung, das Diagnostizieren und/oder das Überwachen des Fortschreitens von oder der Anfälligkeit für einen oder mehrere der Krankheitszustände beim Menschen, wie in Tabelle 1 aufgelistet, durch Erfassen eines Polypeptids und/oder einer Nukleinsäure, das bzw. die einer Komponente darin entspricht.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei mindestens eine Sonde in der Lage ist, sich an eines von HCV, HIV, HVB, HTLV, Mycobakterien oder Staphylococcus aureus zu binden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben für die Erfassung, das Diagnostizieren und/oder das Überwachen des Fortschreitens von Infektionen, die durch eines oder mehrere von HCV, HIV, HVB, HTLV, Mycobakterien oder Staphylococcus aureus hervorgerufen werden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei mindestens eine Sonde in der Lage ist, sich an eines oder mehrere von Beta-Amyloiden, hTAU, phosphoTAU und APOE zu binden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben zur Verwendung für die Erfassung, Diagnose und/oder die Überwachung des Fortschreitens neurodegenerativer Krankheiten.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei mindestens eine Sonde in der Lage ist, sich an eines oder mehrere von ANA, Jo-1, Myeloperoxidase, RNP, Scl-70, Sm, SS-A, IgE, IgG-Subklassen und zirkulierenden Antikörpern zu binden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben für die Erfassung, das Diagnostizieren und/oder das Überwachen des Fortschreitens von malignen Krankheiten, Autoimmun- oder mit Allergie verbundenen Krankheiten.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben, wobei mindestens eine Sonde in der Lage ist, sich an Trinkwasser verschmutzende Mikroorganismen zu binden.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben für die Umweltprüfung von Wasser auf Bakterien.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren oder ein Kit wie oben beschrieben zur Verwendung für die Umweltprüfung von Nahrungsmittelbestandteilen auf genmodifizierte Komponenten, Listeria und Salmonella hin.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für das Färben von Komponenten in Zell- und/oder Gewebeabschnitten, wobei das Färben für das Sichtbarmachen mit Hilfe von Mikroskopie geeignet ist, umfassend die folgenden Schritte:
    • A) Inkubieren des Abschnitts mit einer oder mehreren biotinylierten Sonden, die gegen die Komponenten gerichtet sind,
    • B) Inkubieren des Abschnitts mit Streptavidin-Metallteilchen-Komplex,
    • C) Inkubieren des Abschnitts mit Konjugat umfassend:
    • – ein oder mehrere Biotine,
    • – ein oder mehrere Polymere und
    • – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind und
    • D) wahlweise Inkubieren des Abschnitts durch Metallenhancementreagens.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Reagentien zur Verwendung bei der Erfassung einer Komponente in einer Probe auf einem festen Träger, umfassend die Verwendung eines Konjugats umfassend Biotin, Polymer und Metallteilchen eines Durchmessers im Nanometerbereich (d. h. zwischen 0,1 und 500 nm), die an das Polymer gebunden sind. Sie betrifft des Weiteren Reagentien zur Verwendung zum Verbessern der in vivo-Bilderkennung und Verfahren für die Mikroskopie. Sie betrifft des Weiteren diagnostische Kits.
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung werden ein oder mehrere Proben auf dem festen Träger immobilisiert, eine oder mehrere Sonden werden darauf aufgebracht und die Bindung wird erfasst. So ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die für die quantitative und/oder qualitative Erfassung von einer oder mehreren Komponenten in einer Probe, wobei jede Komponente in der Lage ist, sich an eine Sonde zu binden, umfassend Schritte in folgender Reihenfolge:
    • (a) Aufbringen einer oder mehrerer Proben auf einen festen Träger,
    • (b) Kontaktieren des festen Trägers mit einer oder mehreren biotingelabelten Sonden,
    • (c) Kontaktieren des festen Trägers mit einem Streptavidin-Metallteilchen-Komplex,
    • (d) Kontaktieren des festen Trägers mit Konjugat umfassend:
    • – ein oder mehrere Biotine,
    • – ein oder mehrere Polymere und
    • – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind,
    • (e) wahlweises Kontaktieren des festen Trägers durch Metallenhancementreagens und
    • (f) Lesen des festen Trägers zum quantitativen und/oder qualitativen Erfassen der Komponente.
  • Die Erfinder haben festgestellt, dass, wenn das Signal einer spezifischen Wechselwirkung zwischen der Sonde und Komponente mit Hilfe des erfindungsgemäßen Streptavidin-Metallteilchen-Komplexes und Konjugats amplifiziert wird, eine empfindliche und reproduzierbare qualitative und/oder quantitative Anzeige von Komponenten angegeben wird.
  • Einer Ausführungsform der Erfindung gemäß geht dem Schritt (a) oben das Aufbringen der Sonde auf den festen Träger voraus, d. h.
    • (aO) Aufbringen einer oder mehrerer Sonden auf einen festen Träger,
    • (a) Kontaktieren des festen Trägers mit einer oder mehreren Proben,
    • (b) Kontaktieren des festen Trägers mit einer oder biotingelableten Sonden,
    • (c) Kontaktieren des festen Trägers mit einem Streptavidin-Metallteilchen-Komplex,
    • (d) Kontaktieren des festen Trägers mit Konjugat umfassend:
    • – ein oder mehrere Biotine,
    • – ein oder mehrere Polymere und
    • – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind,
    • (e) wahlweises Kontaktieren des festen Trägers durch Metallenhancementreagens und
    • (f) Lesen des festen Trägers zum quantitativen und/oder qualitativen Erfassen der Komponente.
  • Durch Aufbringen der Sonde auf den festen Träger vor dem Aufbringen der Probe wird die Probe selektiv an den festen Träger vor dem darauffolgenden Schritt gebunden, was zu einem reduzierten Hintergrundsignal führt. Die Sonde des Schritts (b) kann weniger selektiv als die Sonde des Schritts (a0) sein und immer noch ein besseres Signal zum Geräuschverhältnis liefern. Die Sonde des Schritts (a0) kann die gleiche wie die Sonde des Schritts (b) oder davon verschieden sein. Beispielsweise kann die Sonde des Schritts (a0) ein monoklonaler Antikörper und die Sonde des Schritts (b) kann ein polyklonaler Antikörper sein.
  • In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird eine oder mehrere Sonden auf dem festen Träger immobilisiert und eine oder mehrere Proben darauf aufgebracht. So ist eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren für die quantitative und/oder qualitative Erfassung einer oder mehrere Komponenten in einer Probe, wobei jede Komponente in der Lage ist, sich an eine Sonde zu binden, umfassend Schritte in der folgenden Reihenfolge:
    • (a) Aufbringen einer oder mehrerer Sonden auf einen festen Träger,
    • (b) Kontaktieren des festen Trägers mit einer oder biotingelableten Proben,
    • (c) Kontaktieren des festen Trägers mit einem Streptavidin-Metallteilchen-Komplex,
    • (d) Kontaktieren des festen Trägers mit Konjugat umfassend:
    • – ein oder mehrere Biotine,
    • – ein oder mehrere Polymere und
    • – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind,
    • (e) wahlweises Kontaktieren des festen Trägers durch Metallenhancementreagens und
    • (f) Lesen des festen Trägers zum quantitativen und/oder qualitativen Erfassen der Komponente.
  • Mit „Aufbringen", wie hier mit Bezug auf das Aufbringen einer oder mehrerer Proben oder Sonden auf einen festen Träger benutzt, ist das Absetzen einer oder mehrerer synthetischer oder biologischer Substanzen auf einen festen Träger gemeint. Das Absetzen kann durch ein manuelles Verfahren oder durch Anwendung eines Geräts erfolgen, was zu einer Maßnahme einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Betupfen, Pipettieren, Bedrucken, Strahlbedrucken, Auftropfen usw. führt.
  • Die Erfinder haben festgestellt, dass der Nanometermaßstab und manchmal der Subnanometer-Maßstab von Metallteilchen, die im Streptavidin-Metallteilchen-Komplex und Konjugat verwendet werden, extrem hohe Markierungsindizes gestattet. Dies bietet eine verbesserte Erfassungsempfindlichkeit. Des Weiteren erfordert ein erfindungsgemäßes Verfahren mindestens zwei Kontaktschritte (c) und (d), so dass die Zeit, die Anzahl erforderlicher Reagentien und die Fehlermöglichkeit stark reduziert werden. Die so erhaltene Farbänderung erlaubt nicht nur die Beurteilung mit einem Scangerät, sondern auch mit dem nackten Auge, so dass die Notwendigkeit optischer oder elektronischer Erfassungsgeräte umgangen wird.
  • Des Weiteren haben die Erfinder festgestellt, dass die Anwendung von erfindungsgemäßen Metallteilchen von Nanogröße zu einer Reihe verschiedener Eindämmungswirkungen führt, was die Eigenschaften des Metalls dramatisch ändert. Derartige Eigenschaften scheinen geändert zu werden, wenn die Einheit oder der Mechanismus, die bzw. der für diese Eigenschaft verantwortlich ist, innerhalb eines Raums eingeschlossen, der kleiner ist als die kritische Länge, die mit der Einheit oder dem Mechanismus assoziiert ist. Einige Veranschaulichungen derartiger Eigenschaften umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die elektrische Leitfähigkeit, die Dielektrizitätskonstante, die dielektrische Festigkeit, den dielektrischen Verlust, die Polarisation, die Permitivität, den kritischen Strom, die Superleitfähigkeit, Piezo elektrizität, den mittleren freien Weg, die Curie-Temperatur, das kritische Magnetfeld, die Permeabilität, die Koerzitivkraft, die Magnetostriktion, den Magnetowiderstand, den Hall-Koeffizienten, BHmax, die kritische Temperatur, den Schmelzpunkt, den Siedepunkt, den Sublimationspunkt, die Phasenumwandlungsbedingungen, den Dampfdruck, die Anisotropie, Haftung, Dichte, Härte, Duktilität, Elastizität, Porosität, Festigkeit, Widerstandsfähigkeit, Oberflächenrauigkeit, den Wärmedehnungskoeffizienten, die Wärmeleitfähigkeit, die spezifische Hitze, die latente Hitze, den Brechungsindex, das Absorptionsvermögen, das Emissionsvermögen, die Dispersivität, die Streuung, Polarisation, Azidität, Basizität, Katalyse, Reaktivität, Energiedichte, Aktivationsenergie, freie Energie, Entropie, den Frequenzfaktor, die Umweltfreundlichkeit, Bioaktivität, Biokompatibilität und die thermischen und Druckkoeffizienten von Eigenschaften.
  • Eine „Probe" stellt mindestens einen Teil einer Einheit dar, die bezüglich des Vorliegens und/oder der Konzentration einer oder mehrerer Komponenten getestet werden soll. Proben können beispielsweise von Tieren, Pflanzen, Bakterien, Viren, Mikroorganismen, Blut, Blutkomponenten, anderen Körperfluiden, Geweben, Zellen, Genom, Proteom, Trinkwasser, dem Boden, Haushaltsmüll, Industrieabfallstoffe, irgendwelchen Nahrungsmittel – flüssigen oder festen, geernteten Erzeugnissen, biologischen Präparaten, biochemischen Präparaten derivatisiert werden.
  • Das zum Labeln einer Probe verwendete Biotin kann irgendein Typ sein, der in der Lage ist, sich an Streptavidin, einschließlich Mutationen und Anteile zu binden. Verfahren zum Biotinylieren einer Probe sind unten beschrieben.
  • Mit „festem Träger" ist hier irgendein fester Träger gemeint, der in der Lage ist, Komponenten und/oder Proben zu immobilisieren. Derartige feste Träger sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Nitrocellulose, Glasobjektträger, Nylon, mit Silan beschichtete Objektträger, mit Nitrocellulose beschichtete Objektträger, Kunststoffe. Ein fester Träger kann in der Lage sein, einzelne getupfte Proben, mehrfache Proben und/oder Mikroarrays usw. zu halten. Ein fester Träger umfasst bevorzugt Nitrocellulose.
  • Aufeinanderfolgende Aufbringungs- und Kontaktschritte wie beispielsweise die Schritte (a0), (a), (b), (c) und (d) werden bevorzugt so durchgeführt, dass mindestens ein Teil des Kontaktbereichs jedes Schritts der gleiche ist. Das Kontaktieren kann an mehr als einem einzelnen Punkt an einem festen Träger erfolgen. Das Kontaktieren kann auch durch Bedecken einer Oberfläche eines Trägers mit einem einzigen Reagens erreicht werden. Das Kontaktieren kann auch durch ein manuelles Verfahren oder mit Hilfe eines Geräts erreicht werden, das zu einer Maßnahme, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, punktförmigem Aufbringen, Pipettieren, Drucken, Strahldrucken, Auftropfen, Einweichen usw. führt. Einer Ausgestaltung der Erfindung gemäß ist mindestens ein Teil und bevorzugt der größte Teil des Aufbring- oder Kontaktbereichs in den Schritten (a0), (a), (b), (c) und (d), wo zutreffend, die gleiche.
  • Mit „Lesen", wie hier verwendet, ist das Bestimmen der Konzentration der Komponenten aufgrund der Änderung der Eigenschaften des festen Trägers an der Position, wo die Probe oder Sonde aufgebracht wird, d. h. ein quantitatives Lesen, gemeint. Mit „Lesen", wie hier verwendet, ist auch das Bestimmen, ob eine Komponente vorliegt, aufgrund der Änderung der Eigenschaften des festen Trägers an der Position, wo die Probe oder Sonde aufgebracht ist, d. h. ein qualitatives Lesen, gemeint. Erfindungsgemäß kann eine Änderung der Eigenschaft des festen Körpers eine Farbänderung (z. B. von weiß nach rot, von weiß nach schwarz, von weiß nach grau) und/oder eine Änderung der elektrischen Leitfähigkeit und/oder eine Änderung im Magnetfeld an der Position, wo die Probe oder Sonde aufgebracht wird, sein. Es liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung, dass eine Änderung der Eigenschaft durch Oberflächenplasmonresonanz oder Ellipsometrie abgelesen werden kann.
  • Lesen kann das Benutzen der normalen Sicht zum Erfassen einer Farbänderung an dem festen Träger zum Bestimmen des Vorliegens oder der Abwesenheit einer Komponente oder zum Bestimmen der Konzentration einer Komponente bedeuten. Es liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung, dass das Lesen mit Hilfe einer Farbtafel erfolgen kann, die einen Vergleich der Farbe der Probe mit derjenigen bekannter Sonden- oder Komponentenkonzentrationen gestattet. Es liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung, dass eine hier offenbarte Farbänderung mit oder ohne einem elektronischen und optischen Messgerät gelesen werden kann. Beispielsweise kann eine Farbänderung des festen Trägers mit Hilfe eines Reflexionsgradlesers, wie unten beschrieben, gelesen werden.
  • Die Verwendung eines Reflexionsgradlesers zum Messen einer Farbänderung führt zu genauen Messwerten und gestattet die Bestimmung der Konzentration der Sonde oder Komponente. Die Konzentration einer unbekannten Komponente kann durch Interpolation auf einer Standardkurve errechnet werden, die mit mehreren Konzentrationen der Sonde oder Komponente erhalten wird.
  • Das Lesen kann das Anwenden eines optischen Abtasters zum Feststellen einer Farbänderung an dem festen Träger zum Bestimmen des Vorliegens oder der Abwesenheit einer Komponente oder zum Bestimmen der Konzentration einer Komponente bedeuten.
  • Das Lesen kann auch die Verwendung eines Geräts zum Messen einer Änderung der elektrischen Leitfähigkeit oder des elektrischen Stroms an der Position auf dem festen Träger, wo die Probe oder Sonde aufgebracht wird, zum Bestimmen der Konzentration der Komponenten bedeuten. Die Erfinder haben festgestellt, dass die Verwendung von elektrisch leitfähigen Metallteilchen in den erfindungsgemäßen Schritten (c) und/oder (d) zu einer Änderung der elektrischen Leitfähigkeit des festen Trägers führt. Die Änderung kann bequemerweise und präzise mit Hilfe eines Geräts abgelesen werden, das in der Lage ist, eine Änderung der Leitfähigkeit und/oder des Stroms über einen festen Träger zu erfassen. Dieses Gerät kann eine oder mehrere der folgenden charakteristischen Eigenschaften umfassen: eine oder mehrere elektrische Kontaktsonden, eine Schaltungsanordnung zum Messen der Leitfähigkeit und/oder des Stroms, einen analog-zu-digital-Umwandler. Einem Beispiel gemäß kontaktiert eine Sonde des Geräts eine obere Fläche des festen Trägers an der Position, wo die Probe oder Sonde aufgebracht wird, und eine zweite Sonde kontaktiert die selbe Position auf der unteren Fläche. Die Leitfähigkeit und/oder der Strom werden über diese Sonden hinweg durch das Gerät gemessen. Einem anderen Beispiel gemäß kontaktiert eine Sonde des Geräts eine obere Fläche des festen Trägers an der Position, wo die Probe oder Sonde aufgebracht wird, und die ganze untere Fläche des festen Trägers kontaktiert eine leitende Platte; die Leitfähigkeit und/oder der Strom über die Sonde und die Platte hinweg wird durch das Gerät gemessen. Letzteres Beispiel hat den Vorteil, dass das Messen von mehr als einer Probe die Bewegung nur der Probe, die die obere Fläche kontaktiert, erfordert.
  • Das Lesen kann auch die Anwendung eines Geräts um Messen einer Änderung des Magnetfelds bei einer Position auf dem festen Träger, wo die Probe oder Sonde aufgebracht wird, zum Bestimmen der Konzentration der Komponenten bedeuten. Die Verwendung von Metallteilchen, die ebenfalls magnetisch sind, in den erfindungsgemäßen Schritten (c) und/oder (d) können zu einer Änderung des Magnetfelds auf dem festen Träger führen. Die Änderung kann bequemerweise und präzise mit Hilfe eines Geräts abgelesen werden, das in der Lage ist, eine Änderung der Magnetkraft auf einem festen Träger zu erfassen. Das Gerät kann eine oder mehrere der folgenden charakteristischen Eigenschaften umfassen: eine oder mehrere Magnetfeld erfassende Sonden, eine Schaltungsanordnung zum Messen von Magnetfeldern, einen Analog-zu-digital-Umwandler. Einem Beispiel gemäß tastet eine das Magnetfeld erfassende Sonde des Geräts die Oberfläche des festen Trägers an der Position, wo die Probe oder die Molekularsonde aufgebracht wird, ab und das Magnetfeld auf dem festen Träger wird durch das Gerät gemessen.
  • Das Lesen kann auch die Anwendung eines Geräts bedeuten, bei dem die Oberflächenplasmonresonanz zum Erfassen einer Änderung der Oberflächeneigenschaften an dem festen Träger, wo eine Probe oder Sonde aufgebracht wird, verwendet wird.
  • Das Lesen kann auch die Verwendung eines Geräts bedeuten, das eine Änderung des polarisierten Lichts erfasst, das von der Oberfläche des festen Trägers zurückgestrahlt wird, wo eine Probe oder Sonde aufgebracht wird. Ein Beispiel eines derartigen Geräts ist ein Ellipsometer.
  • In vivo Bilderkennung
  • Eine andere Ausgestaltung, die jedoch nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist, ist ein Verfahren zum Verbessern der Bilderkennung einer oder mehrerer Komponenten in einem System durch Magnetresonanz, wobei jede Komponente in der Lage ist, sich an eine Sonde zu binden, umfassend die Schritte des:
    • (i) Zugeben einer biotingelabelten Sonde zu einem System,
    • (ii) Zugeben von Streptavidin-Metallteilchen-Komplex zu dem System und
    • (iii) Aufzeichnen eines Bilds des Systems unter Anwendung der Magnetresonanzbilderkennung.
  • Die Erfinder haben festgestellt, dass die Komplexe, die unter Anwendung von Metallteilchen einer Nanometer-Größe oder Subnanometer-Größe in Schritt (ii), z. B. 0,8 m, gebildet werden, grundlegend andere charakteristische Eigenschaften im Vergleich mit Konjugaten aufweisen, die um größere Teilchen herum aufgebaut werden, weshalb sie zur Verwendung zum Verbessern der in vivo-Bilderkennung geeignet sind. Die kleinen Nanoteilchen weisen eine enge Teilchenoberflächenkrümmung auf, weshalb sie weniger dazu neigen, eine strukturierte Wasserdipolschicht darum herum anzuziehen. So ist der hydrodynamische Radius daher reduziert. Auch weisen diese kleinen Metallteilchen eine geringere negative Nettoladung auf, so dass sie eine geringere ladungsbestimmte Abstoßung durchmachen, wenn sie sich der Probenoberfläche nähern. Diese charakteristischen Eigenschaften scheinen zu einer besseren Durchlässigkeit in biologischen Systemen, Organen und Organismen zu führen. Des Weiteren sind die Nanoteilchen des Schritts (ii) so klein, dass sie keine sterische Hinderung verursachen. Daher sind sie die idealen Marker zum Visualisieren von Wegen, beispielsweise des menschlichen Metabolismus.
  • Ein dem Bilderkennungsverfahren entsprechendes System kann eine biologische Einheit sein, bei der das Vorliegen und die Verteilung der Komponenten von Interesse ist. Beispiele von Systemen umfassen menschliche, tierische, pflanzliche, Zellen, Gewebe, Organe, Mikroorganismen.
  • Das Verfahren zum Verbessern der Bilderkennung von Komponenten in einem System kann durch einen Techniker durchgeführt werden.
  • Das Verfahren zum Verbessern der Bilderkennung von Komponenten in einem System kann zum Erfassen der Anfälligkeit für Krankheitszustände verwendet werden. Das Verfahren zum Verbessern der Bilderkennung von Komponenten in einem System kann zum Erfassen der Krankheitszustände, die in einem Patienten vorkommen, verwendet werden. Beispiele von Komponenten und Zuständen sind in Tabelle 1 bereitgestellt.
  • Eine „Komponente", wie hier verwendet, bedeutet irgendeine Substanz, die in der Lage ist, sich an eine Sonde zu binden, was die Identifikation der Komponente ermöglicht. Beispiele von Komponenten umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, DNA, cDNA, mRNA, RNA, Nukleinsäuren, Proteine, Polypeptide, Glykoproteine, Rezeptoren, Liganden, Signalisierproteine, Metabolite, Toxine, Zellen, Bakterien, Viren usw. Beispiele von Komponenten sind in Tabelle 1 bereitgestellt. Beispiele von Typen von Komponenten, die zum Erfassen durch Bilderkennung nützlich sind, umfassen Rezeptoren, Zelloberflächenproteine, Ribonukleinsäuren, Desoxyribonukleinsäuren, zytoplasmische Mittel, Kernantigene, Membranantigene, Hormone, Metabolite, Tumorantigene, Mitochondrienproteine, Mitochondrien-DNA und Mitochondrien-RNA, Nuklearproteine.
  • Eine „Sonde", wie hier verwendet, bedeutet irgendeine Verbindung, die in der Lage ist, sich spezifisch an eine Komponente zu binden. Ein Nukleinsäureoligomer, das sich an ein Gen bindet, ein Ligand, der sich an einen Rezeptor bindet, ein Antikörper, der sich an ein Antigen bindet, sind Beispiele von erfindungsgemäßen Wechselwirkungen zwischen Sonde/Komponente. Der vorliegenden Erfindung gemäß liegt die Bindungsaffinität zwischen einer Sonde und einer Komponente bei über 10 μm, 5 μm, 2 μm, 1 μm, 0,1 μm, 0,01 μm oder 1 nm. Beispiele von Sonden umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Nukleinsäuren, PNA, Proteine, Peptide, Antikörper, Liganden, Rezeptoren usw.
  • Das zum Labeln einer Sonde verwendete Biotin kann irgendein Typ sein, der in der Lage ist, sich an Streptavidin zu binden, einschließlich chemische Variationen desselben. Verfahren zum Biotinylieren einer Sonde sind unten beschrieben.
  • Mit „Streptavidin-Metallteilchen-Komplex", wie hier verwendet, ist ein Komplex gemeint, der Streptavidin und/oder Avidin und ein oder mehrere Metallteilchen umfasst. Das Streptavidin ist irgendein Typ von Streptavidin, der in der Lage ist, sich an Biotin zu binden, einschließlich Teile oder Mutationen von Streptavidin. Das Avidin ist irgendein Typ von Avidin, der in der Lage ist, sich an Biotin zu binden, einschließlich Teile oder Mutationen von Avidin. In einer Ausgestaltung der Erfindung können Metallteilchen an Streptavidin und/oder Avidin durch nichtkovalente Kräfte gebunden werden. In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung können Metallteilchen an Streptavidin und/oder Avidin durch kovalente Bindung gebunden werden. Verfahren zum Versorgen von Streptavidin und/oder Avidin mit einem oder mehreren Metallteilchen sind dem Fachmann bekannt. Die Typen von Metallteilchen und ihre Durchmesser sind unten im Einzelnen beschrieben.
  • Ein „Konjugat", wie hier verwendet, umfasst ein oder mehrere Polymere, die mit einem oder mehreren Biotinmolekülen gelabelt sind, und Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind. Das zum Labeln eines Polymers verwendete Biotin kann irgendein Typ sein, der in der Lage ist, sich an Streptavidin und/oder Avidin zu binden, einschließlich chemische Variationen desselben. Einer Ausgestaltung der Erfindung gemäß wird Biotin kovalent an ein Polymer angeknüpft – Verfahren dafür sind unten beschrieben. Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß kann die Anzahl von Biotinmolekülen, die an ein Polymer angeknüpft ist, weniger als, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder 1000 betragen und bevorzugt im Bereich von 1 bis 500, 1 bis 400, 1 bis 300, 1 bis 200, 1 bis 100 und am bevorzugtesten im Bereich von 5 bis 100 liegen.
  • Ein „Polymer", wie hier in einem erfindungsgemäßen Konjugat vorliegend, ist eine polymere Substanz mit einem Molekulargewicht von mehr als 500 Da, 1000 Da, 1500 Da, 2000 Da oder 2500 Da und am bevorzugtesten mehr als 500 Da. Es ist eine Ausgestaltung der Erfindung, dass ein Polymer keine spezifische Bindung einer Probe oder Sonde gegenüber aufweist. Es ist eine Ausgestaltung der Erfindung, dass ein Polymer biologisch inert ist. Anders ausgedrückt, besitzt es keine spezifische Bindung anderen biologischen Molekülen gegenüber und andere biologische Moleküle binden sich nicht spezifisch daran. Es ist eine Ausgestaltung der Erfindung, dass ein Polymer in der Lage ist, sich an ein oder mehrere Metallteilchen durch elektrostatische oder kovalente Wechselwirkungen zu binden. Die Polymere, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können chemisch synthetisierte Polymere oder natürlich vorkommenden Polymere sein. Beispiele chemisch synthetisierter Polymere umfassen Vinylpolymere, Aramidpolymere, Polyvinylamin, Poly(vinylalkohol), Poly(N-vinylcarbazol), Poly(vinylpyridin), Polypyrrol, Polyphenylpolymere, Poly(phenylensulfid), Poly(vinylidenfluorid), Poly(methylmethacrylat), Polymethylenpolymere, Polyimidazol, Polyimid, Polystyrol, Olefinpolymere, Elastomere, Ingenieurpolymere, Polyolefin, Polyester, Polycarbonat, Ingenieurkunststoffe, Epoxypolymere, Phenolpolymere, Polyurethan, Polydinenpolymere, Acrylpolymere, Polyacrylamid, Polyamid, Polyacetal, Polyether, Polyacetylen, Polyanilin, Polyisobutylen, Polyisopren, Poly(ethylenterephthalat), Polyenpolymere, Poly(vinylidenchlorid), Poly(vinylchlorid), Polycarbonat, Poly(vinylacetat), Polypropylen, Ethylenpolymere, Ionenaustauschharze (z. B. Nafion) und Silicon derivate. Beispiele natürlich vorkommender Polymere umfassen Agarose, Gellangummi, Cellulosepolymere, (z. B. Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose und Carboxymethylcellulose), Dextran, Dextrin, Alginatsalze, Hyaluronatsalze, Poly(glutaminsäure) Poly(lysin), Chitosan, Lignin, Carageen, Seidenfibroin, Agar, Polypeptid, Polysaccharid, Polyethylenglykol, Nukleinsäurekette, Pepsinnukleinsäure (PNA), Polyglykoprotein und Gelatine. Diese Polymere können auch Derivate davon, Polymere, die von einer oder mehreren Spezies ausgewählt unter den Polymeren und/oder Polymerderivaten, Polymer-Polymer-Komplexen, Polymerlegierungen, Polymermischungen und Polymerverbundstoffen sein. Ein Polymer kann eine oder mehrere der obigen Charakteristiken aufweisen. Es ist eine Ausgestaltung der Erfindung, dass ein Konjugat im Wesentlichen ein Polymer umfasst. Es ist eine andere Ausgestaltung der Erfindung, dass ein Konjugat mehr als ein Polymer umfasst. Es ist eine Ausgestaltung der Erfindung, dass ein Polymer Albumin- oder Dextranpolymer ist.
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung werden Metallteilchen an Polymer durch nichtkovalente Kräfte gebunden. In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung werden Metallteilchen an Polymer durch kovalente Bindung gebunden. Verfahren zum Versorgen von Polymer mit einem oder mehreren Metallteilchen sind dem Fachmann bekannt. Die Typen von Metallteilchen und ihre Parameter sind im Einzelnen unten beschrieben.
  • Einer Ausgestaltung der Erfindung gemäß sind, wenn ein Konjugat mehr als ein Polymer umfasst, alle Polymermoleküle (z. B. mindestens zwei Albuminmoleküle) die gleichen. Alternativ sind, wenn ein Konjugat eventuell mehr als ein Polymer umfasst, zwei Polymere (z. B. ein Molekül Albumin und ein Molekül Dextran) verschieden.
  • Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß sind, wenn ein Konjugat mehr als ein Biotin umfasst, alle Biotinmoleküle (z. B. mindestens zwei Biotinmoleküle) die gleichen. Alternativ sind, wenn ein Konjugat mehr als ein Biotin umfasst, mindestens zwei Biotine (z. B. ein Molekül Biotin und ein Molekül modifiziertes Biotin) verschieden.
  • Das Verfahren des Biotinylierens einer Probe, Sonde oder eines Polymers ist dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt und kann an Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren oder anderen Verbindungen durchgeführt werden. Beispielsweise kann Nukleinsäure durch Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Anwendung von biotinyliertem Primer bzw. biotinylierten Primern, das bzw. die für die Sequenz, die von Interesse ist, spezifisch ist bzw. sind, biotinyliert werden. Peptide und Proteine können unter Anwendung von Biotinylierungsreagentien biotinyliert werden, die beispielsweise den C-Terminus, N-Terminus und/oder reaktive Seitenketten des Proteins oder Peptids biotinylieren. Organische Polymerketten können unter Anwendung von Biotinylierungsreagentien, die beispielsweise reaktive Seitenketten anzielen, biotinyliert werden. Wahlweise können flexible Linker, wie beispielsweise Alkylketten, Polynukleotidketten, Polypeptidketten usw. zwischen dem Biotin und dem Target eingeführt werden. Derartige Linker können die Erfassung durch Reduzieren der sterischen Hinderung, die durch das Polypeptid verursacht wird, noch weiter verbessern. Die vorliegende Erfindung umfasst irgendein Verfahren für die Biotinylierung einer Probe, Sonde oder eines Polymers.
  • Metallteilchen
  • Die Metallteilchen des Streptavidin-Metallteilchen-Komplexes oder Konjugats können irgendwelche sein, die eine Farbänderung, eine Änderung der elektrischen Leitfähigkeit, eine Änderung im Magnetfeld oder einen verbesserten Kontrast bei der in vivo-Bilderkennung bereitstellen.
  • Die Teilchen, die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, umfassen eines oder mehrere von Gold, Silber, Eisen, Nickel, Gadolin, Blei, Uran, Cäsium, Platin, Palladium, Rhodium, Technetium, Tellur, Selen, Silicium, Kupfer, Zinn, Rhenium, Europium, Aluminium, Germanium, Chrom, Cadmium, Niob, Titan, Magnesium, Mangan, Molybdän, Antimon, Americium, Lithium, Wolfram, Thallium, Ruthen, Osmium, Iridium und/oder leitende oder halbleitende Metallsubstanzen.
  • Die Übergangsmetalle, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Teilchen, die aus irgendeiner Übergangsmetallelementspezies bestehen. Beispiele der Übergangsmetalle, die verwendet werden können, umfassen eines oder mehrere von Sc, Y, La, Ac (Scandiumgruppenelemente); Ti, Zr, Hf (Titangruppenelemente); V, Nb, Ta (Vanadiumgruppenelemente); Cr, Mo, W (Chromgruppenelemente); Mn, Tc, Re (Mangangruppenelemente); Fe, Ru, Os (Eisengruppenelemente); Co, Rh, Ir (Cobaltgruppenelemente); Ni, Pd, Pt (Nickelgruppenelemente); Cu, Ag und Au (Kupfergruppenelemente). Unter diesen Übergangsmetallelementen werden Edelmetalle wie Platin, Palladium, Rhodium, Iridium, Ruthen, Osmium, Silber und Gold vorgezogen.
  • Beispiele von Übergangsmetallen umfassen Edelmetallkomplexe und Organometallverbindungen von Edelmetall. Spezifische Beispiele umfassen Platinkomplexe, Palladiumkomplexe, Rhodiumkomplexe, Iridiumkomplexe, Ruthenkomplexe, Osmiumkomplexe, Silberkomplexe, Goldkomplexe und nicht-stöchiometrische Verbindungen derselben; und Ionen einer Reihe verschiedener Edelmetallkomplexe; z. B. Alkylkomplexe, Arylkomplexe, Metallcycluskomplexe, Carbenkomplexe, Olefinkomplexe, Arenkomplexe, Eta-Arylkomplexe, Cytopentadienyl komplexe, Hydridokomplexe, Carbonylkomplexe, Oxokomplexe und Stickstoffkomplexe.
  • Es ist eine Ausgestaltung der Erfindung, dass Metallteilchen des Streptavidin-Metallteilchen-Komplexes und Konjugats die gleichen Metallteilchen sind (z. B. sowohl der Komplex des Schritts (c) als auch das Konjugat des Schritts (d) umfassen Goldteilchen). Es ist eine Ausgestaltung der Erfindung, dass die Metallteilchen des Streptavidin-Metallteilchen-Komplexes und die Metallteilchen des Konjugats verschieden sind (z. B. kann der Komplex des Schritts (c) Goldteilchen umfassen, das Konjugat des Schritts (d) kann Silberteilchen umfassen). Es ist eine Ausgestaltung der Erfindung, dass die Metallteilchen des Komplexes oder Konjugats eine heterologe Mischung von Metallteilchen sind (z. B. der Komplex des Schritts (c) kann eine Mischung von Gold- und Silberteilchen umfassen).
  • Einer Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen Metallteilchen, die zur Verwendung zum Erfassen von Komponenten in einer Probe bevorzugt sind, wobei eine Farbänderung abgelesen wird, sind jedoch nicht darauf beschränkt, eines oder mehrere von Gold, Silber, Palladium, Rhodium, Iridium, Platin und Nickel.
  • Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen Metallteilchen, die zur Verwendung zum Erfassen von Komponenten in einer Probe bevorzugt sind, wobei eine Änderung der elektrischen Leitfähigkeit abgelesen wird, sind jedoch nicht darauf beschränkt, eines oder mehrere von Gold, Silber, Eisen, Kupfer und Nickel.
  • Einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen Metallteilchen, die zur Verwendung zum Erfassen von Komponenten in einer Probe bevorzugt sind, wobei eine Änderung des Magnetfelds abgelesen wird, sind jedoch nicht darauf beschränkt, eines oder mehrere von Gold, Silber und Eisen.
  • Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen Metallteilchen, die zur Verwendung zum Verbessern der erfindungsgemäßen in vivo-Bilderkennung bevorzugt sind, ein oder mehrere von Eisen und Gadolin, sind jedoch nicht darauf beschränkt sind.
  • Einer Ausgestaltung der Erfindung gemäß können Metallteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser im Nanometer- oder Subnanometerbereich aufweisen. In einer anderen Ausgestaltung können die Metallteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,6, 0,8 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 21 nm, 22 nm, 23 nm, 24 nm, 25 nm, 26 nm, 27 nm, 28 nm, 29 nm, 30 nm, 31 nm, 32 nm, 33 nm, 34 nm, 35 nm, 36 nm, 37 nm, 38 nm, 39 nm, 40 nm und 0,6 bis 1,0 nm, 1,0 bis 5,0 nm, 5,0 bis 10 nm, 10 bis 15 nm, 15 bis 20 nm, 20 bis 25 nm, 25 bis 30 nm, 30 bis 35 nm, 35 bis 40 nm und bevorzugt 0,6 bis 40 nm aufweisen.
  • Einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex oder das Konjugat ein oder mehrere Teilchen aus Gold mit einem Durchmesser von 0,6 bis 40 nm.
  • Einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex oder das Konjugat ein oder mehrere Teilchen aus Silber mit einem Durchmesser von 0,6 bis 40 nm.
  • Einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex oder das Konjugat ein oder mehrere Teilchen aus Platin mit einem Durchmesser von 0,6 bis 40 nm.
  • Einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex oder das Konjugat ein oder mehrere Teilchen aus Palladium mit einem Durchmesser von 0,6 bis 40 nm.
  • Die Anzahl von Metallteilchen, die in einem Komplex oder Konjugat vorliegen, kann weniger als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder 100 betragen und bevorzugt im Bereich von 5 bis 50000, 5 bis 100.000, bis 500.000, 5 bis 1.000.000 liegen.
  • Das „Metallverbesserungsreagens" von Schritt (f) ist irgendein metallhaltiges Reagens, wobei das Metall sich aufgrund von Reduktion ausfällt. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ein Silberenhancementreagens von Aurion (Niederlande), BBI (Großbritannien), Sigma-Aldrich (USA) oder Amersham (Großbritannien).
  • Superparamagnetteilchen
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung umfassen der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex und/oder das Konjugat Superparamagnetteilchen.
  • Einer Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex in Schritt (c) und/oder das Konjugat in Schritt (d) ein oder mehrere Superparamagnetteilchen und der feste Träger wird bezüglich einer Farbänderung abgelesen.
  • Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex oder das Konjugat ein oder mehrere Superparamagnetteilchen und der feste Träger wird bezüglich einer Änderung der elektrischen Leitfähigkeit oder des Magnetfelds abgelesen.
  • Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfassen der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex in Schritt (c) ein oder mehrere Superparamagnetteilchen, die Schritte (d) und (e) werden nicht durchgeführt und der feste Träger wird bezüglich einer Änderung der elektrischen Leitfähigkeit oder des Magnetfelds abgelesen.
  • Da die Bindung eines Streptavidin-Metallteilchen-Komplexes und wahlweise Konjugats, die Superparamagnetteilchen umfassen, auch zu einer Änderung der elektrischen Leitfähigkeit führt, kann diese charakteristische Eigenschaft bequemerweise unter Anwendung eines Ablesegeräts, wie oben erwähnt, ohne die Notwendigkeit von Präzisionsoptiken gemessen werden. Die Verwendung derartiger Teilchen führt auch zu einer Änderung im Magnetfluss, was geeigneterweise durch ein Lesegerät, wie oben erwähnt, abgelesen werden kann.
  • Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß umfasst der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex in Schritt (ii) ein oder mehrere Superparamagnetteilchen. Ein Superparamagnetteilchen bietet eine hohe Empfindlichkeit und einen hohen Kontrast bei Verwendung bei der Magnetresonanzbilderkennung.
  • Beispiele von Superparamagnetteilchen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Eisen, mit Latex beschichtetes Eisen, Eisenoxid und mit Latex beschichtetes Eisenoxid.
  • Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß weist ein Superparamagnetteilchen eine magnetische Empfindlichkeit im Bereich von 1 bis 100 emu/g, 10 bis 80 emu/g, 10 bis 70 emu/g, 10 bis 50 emu/g, 20 bis 50 emu/g und bevorzugt etwa 40 emu/g auf.
  • Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß weist ein Superparamagnetteilchen einen Eisenoxidgehalt im Bereich von 10 bis 80%, 20 bis 80%, 30 bis 80%, 40 bis 80%, 50 bis 80%, 60 bis 80%, 70 bis 80%, 10 bis 70%, 20 bis 70%, 30 bis 70%, 40 bis 70%, 50 bis 70%, 60 bis 70% und bevorzugt etwa 70% auf.
  • Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß liegt der Durchmesser eines Superparamagnetteilchens zwischen 50 und 400 nm, 50 und 300 nm, 50 und 200 nm, 50 und 100 nm, 100 und 400 nm, 100 und 300 nm, 100 und 200 nm, 200 und 400 nm, 200 und 300 nm, 150 und 250 nm und beträgt bevorzugt 200 nm.
  • Einer Ausgestaltung der Erfindung gemäß kann die Anzahl von Superparamagnetteilchen im Streptavidin-Metallteilchen-Komplex oder im Konjugat weniger als 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder 100 betragen und bevorzugt im Bereich von 5 bis 50000, 5 bis 100.000, bis 500.000, 5 bis 1.000.000 liegen.
  • In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung werden die Superparamagnetteilchen an Streptavidin (oder Avidin) oder Polymer unter Anwendung elektrostatischer Wechselwirkungen gebunden. In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung sind die Superparamagnetteilchen kovalent an Streptavidin (oder Avidin) oder Polymer gebunden.
  • Vorbehandlung
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung wird die Probe oder Sonde auf den festen Träger ohne Zugabe irgendwelcher zusätzlichen Reagentien zur Probe oder Sonde vor dem Aufbringen aufgebracht. In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird die Probe oder Sonde auf den festen Träger nach einem Konditionieren, das die Konzentration an Salz in der Probe erhöht, aufgebracht. Das Salz kann irgendein dissoziierendes, im Stand der Technik bekanntes Salz, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, sein. Das Konditionieren kann die Zugabe eines Volumens an Salzlösung bekannter Konzentration zu einem Volumen Probe oder Sonde umfassen. Der Konditionierschritt kann die Zugabe eines Volumens an Salzlösung einer bekannten. Konzentration zu einem unbekannten Volumen Probe oder Sonde umfassen. Die Salzkonzentration in der Probe kann so eingestellt werden, dass sie im Bereich von 100 mM bis 500 mM, 500 mM bis 1 M, 1 M bis 1,5 M, 1,5 M bis 2 M, 2 M bis 2,5 M, 2,5 M bis 3 M, 3 M bis 3,5 M, 3,5 M bis 4 M, 3,5 M bis 5 M, 0,5 M bis 2,5 M, 0,5 M bis 3 M oder 0,5 M bis 4 M, liegt.
  • Trocknen
  • In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung werden, nach Durchführen des Schritts in (a), die Proben oder Sonden nicht getrocknet oder gebrannt, bevor Schritt (b) durchgeführt wird. In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung lässt man die Proben oder Sonden, die auf den festen Träger in Schritt (a) aufgebracht worden sind, trocknen. Desgleichen kann auf den Schritt (a0) hin der Schritt (a) in Abwesenheit oder Gegenwart eines dazwischen eingeschobenen Trocknungsschritts erfolgen. Verfahren zum Trocknen sind im Stand der Technik bekannt und können, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Trocknen an der Luft, Trocknen in einem Brutschrank, Trocknen in einer Kammer unter niedrigem Druck mit wahlweisem Erhitzen umfassen. Einer anderen Ausgestaltung der Erfindung gemäß werden die Proben oder Sonden auf den festen Träger aufgebracht und durch aussetzen einer Temperatur zwischen 60 und 70 Grad Celsius, 65 bis 75 Grad Celsius, 70 bis 80 Grad Celsius, 75 bis 85 Grad Celsius, 80 bis 90 Grad Celsius, 65 Grad Celsius, 70 Grad Celsius, 75 Grad Celsius, 80 Grad Celsius, 85 Grad Celsius oder 90 Grad Celsius gegenüber gebrannt. Die Aussetzungszeit kann nicht mehr als 10 Minuten, 15 Minuten, 20 Minuten, 25 Minuten, 30 Minuten, 35 Minuten, 40 Minuten, 45 Minuten, 50 Minuten, 55 Minuten oder 60 Minuten dauern. Die Proben oder Sonden können getrocknet und dann gebrannt, nur getrocknet, nur gebrannt werden.
  • Lagerung
  • In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird der feste Träger nach dem Aufbringungsschritt in (a) oder (a0) gelagert. Die Temperatur, bei der der feste Träger, auf den die Probe oder Sonde aufgebracht wird, gelagert wird, kann zwischen 0 und 10 Grad Celsius, 2 und 10 Grad, 3 und 10 Grad Celsius, 4 und 10 Grad Celsius, 5 und 10 Grad Celsius, 6 und 10 Grad Celsius, 7 und 10 Grad Celsius, 0 und 5 Grad Celsius, 1 und 5 Grad Celsius, 2 und 5 Grad Celsius, 3 und 5 Grad Celsius, bei 1 Grad Celsius, 2 Grad Celsius, 3 Grad Celsius, 4 Grad Celsius, 5 Grad Celsius, 6 Grad Celsius, 7 Grad Celsius, 8 Grad Celsius, 9 Grad Celsius, 10 Grad Celsius liegen.
  • Waschschritte
  • Das Einführen von Waschschritten bei dem obigen Verfahren kann durch den erfahrenen Fachmann in Immunassays wie ELISA und Western Blots allgemein verstandenen Protokollen gemäß bestimmt werden. Beispielsweise kann bzw. können ein oder mehrere Waschschritte nach einem oder mehreren Kontaktierschritte unter Anwendung eines Waschreagens, wie eines Puffers, eingeführt werden. Beispielsweise können Waschvorgänge nach den Schritten (a0), (a), (b), (c), (d) und (e), wo zutreffend, durchgeführt werden. Bevorzugt wird eine Wäsche nach jedem Schritt durchgeführt. Beispiele von Puffern umfassen physiologische Kochsalzlösung, Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS), TRIS-Puffer, SSC-Puffer, SSPE-Puffer und Puffer, bei denen ein nicht spezifisches Bindungsprotein zum Reduzieren einer spezifischen Bindung reaktiver Komponenten zugegeben wird.
  • Feste Träger mit vorher aufgebrachter Sonde
  • Wie in einigen Ausführungsformen oben beschrieben, kann bzw. können eine oder mehrere Sonden vor Aufbringen einer Probe auf einen festen Träger aufgebracht werden. Einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gemäß wird ein fester Träger bereitgestellt, auf den eine Sonde vorher aufgebracht ist. In einer Ausgestaltung der Erfindung wird der feste Träger, auf den eine Sonde vorher aufgebracht ist, bereitgestellt, wobei die Sonde an einer oder mehreren Positionen positioniert ist, wobei die Sonde die gleiche Komponente erkennt. In einer Ausgestaltung der Erfindung wird der feste Träger, auf den eine Sonde vorher aufgebracht ist, bereitgestellt, wobei die Sonde an einer oder mehreren Positionen positioniert ist, wobei die Sonde verschiedene Komponenten erkennt. Ein Verfahren, bei der der feste Träger bereitgestellt wird, bei dem die Sonde vorher aufgebracht worden ist, ermöglicht es, eine Probe auf Komponenten hin zu untersuchen, ohne die Notwendigkeit, Sondenaufbringungsschritte durchzuführen. Des Weiteren ermöglicht ein Verfahren unter Anwendung eines festen Trägers, auf den eine Sonde vorher aufgebracht ist, und eine Sonde, die mehr als eine Komponente erkennt, es, dass einzelne Proben auf mehrere Komponenten hin mit einer einzigen Inkubation analysiert werden. Beispielsweise kann ein einzelner fester Träger zum Erfassen mehrerer kanzeröser oder vorkanzeröser Zustände durch Screenen einer einzigen Probe verwendet werden.
  • Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass sie nicht notwendigerweise ein optisches Lesegerät wie beispielsweise einen Laserscanner oder ein Rückstreumessgerät erfordert und daher zur Verwendung in Umgebungen, die von Laborbedingungen entfernt sind, geeignet ist. Die Erfindung erlaubt es, quantitative und/oder qualitative Resultate an der Stelle zu erhalten, wo die Probe genommen wird, beispielsweise in einer Hausarztpraxis, dem Heim eines Individuums, in Hospitalen, allgemein „im Feld" ohne analytische Spezialinstrumente. Des Weiteren bietet die Erfindung einen Assay, der so empfindlich ist wie oder noch empfindlicher als Assays, bei denen Fluoreszenz angewendet wird. Des Weiteren könnte der Assay durch einen Nichtspezialisten durchgeführt werden, da nicht unbedingt ein Spezialmessgerät erforderlich ist.
  • Kit
  • Eine andere Ausgestaltung der Erfindung ist ein Kit für die quantitative und/oder qualitative Erfassung von Komponenten in einer Probe umfassend Streptavidin-Metallteilchen-Komplex, festen Träger und Konjugat, umfassend Biotin, Polymer und Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind.
  • Ein derartiger Kit ermöglicht eine quantitative und/oder qualitative Erfassung von Komponenten auf einem festen Träger und/oder eine Erfassung von Komponenten in einem System durch Magnetresonanz.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit erlaubt es einem geschulten Fachmann, einen oder mehrere Schritte eines hier offenbarten Verfahrens auf bequeme Weise durchzuführen. Der Kit kann gestatten, dass ein erfindungsgemäßes Verfahren ohne die Notwendigkeit durchgeführt wird, die Konzentrationen an Reagentien zu messen oder zu bestimmen, um ein schnelles und reproduzierbares Untersuchen einer oder mehrerer Proben zu gestatten.
  • Eine andere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, wie oben beschrieben, umfassend einen festen Träger, wobei der Träger mit einer oder mehreren Sonden vorbeladen ist. In einer Ausgestaltung der Erfindung wird der feste Träger mit einer Sonde, die an einer oder mehreren Positionen positioniert ist, versehen, wobei die Sonde die gleiche Komponente erkennt. In einer Ausgestaltung der Erfindung wird der feste Träger mit einer Sonde versehen, die an einer oder mehreren Positionen positioniert ist, wobei die Sonde verschiedene Komponenten erkennt. In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird der feste Träger mit einer oder mehreren Sonden bereitgestellt, die in der Lage sind, sich an die Komponenten, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, zu binden. So ermöglicht ein Kit, der mit einem festen Träger ausgestattet ist, bei dem die molekulare Sonde vorher aufgebracht ist, es, eine Probe auf Komponenten hin zu untersuchen, ohne die Notwendigkeit, Aufbringungsschritte durchzuführen. Des Weiteren ermöglicht ein Kit, der mit einem festen Träger versehen ist, der mit mehr als einer Molekülsonde betupft ist, von denen jede in der Lage ist, eine andere Komponente zu erkennen, es, eine einzige Probe auf mehrere Komponenten hin mit einer einzigen Inkubation zu analysieren. Beispielsweise kann ein einziger fester Träger zum Erfassen mehrerer präkanzeröser oder kanzeröser Zustände, wie unten beschrieben, durch Screenen einer einzigen Probe verwendet werden.
  • Eine andere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zum Erfassen von Komponenten in einer Probe, wie hier offenbart, des Weiteren umfassend eine oder mehrere biotingelabelte Sonden. Jede Sonde kann für eine Komponente in einer zu erfassenden Probe spezifisch sein.
  • Eine andere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein Kit für die Erfassung von Komponenten in einer Probe, wie hier offenbart, des Weiteren umfassend ein Metallenhancementreagens. Einer Ausgestaltung der Erfindung gemäß liegt das Metallenhancementreagens in einem oder mehreren Behältern vor. Beispiele von erfindungsgemäßen Behältern sind oben angegeben.
  • Eine andere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein Kit für die Erfassung von Komponenten in einer Probe, wie hier offenbart, des Weiteren umfassend ein Reagens für die Biotinylierung von Sonden oder Proben, die geprüft werden sollen. Wie oben schon erwähnt, sind Verfahren und Reagentien zum Biotinylieren von Sonden und Proben im Stand der Technik bekannt.
  • Einer Ausgestaltung der Erfindung gemäß liegen der Komplex, das Konjugat und/oder die Reagentien für die Biotinylierung in getrennten Behältern vor. Erfindungsgemäß kann ein Behälter irgendein dicht geschlossenes oder erneut dicht schließbares Gefäß sein, das zum Halten einer Menge an Komplex, Konjugat und/oder Reagentien für die Biotinylierung geeignet ist. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Schraubenkappenphiolen, Druckkappenphiolen, Siegelbrechphiolen, Spritzen.
  • In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung umfasst der Kit ein oder mehrere zusätzliche Teile, um es der geschulten Person zu ermöglichen, einen oder mehrere der hier offenbarten Verfahrensschritte durchzuführen. Der Kit kann ein oder mehrere zusätzliche Reagentien umfassen, was es der geschulten Person ermöglicht, das vollständige Verfahren durchzuführen. Alternativ kann der Kit eine Mindestanzahl von Teilen, wie beispielsweise nur den Streptavidin-Metallteilchen-Komplex umfassen, der es einer geschulten Person ermöglicht, das hier offenbarte Verfahren durchzuführen. Ein erfindungsgemäßer Kit kann irgendeine Kombination von hier offenbarten Teilen oder Reagentien umfassen, um es einer geschulten Person zu ermöglichen, ein hier offenbartes Verfahren durchzuführen.
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung enthält der Kit Anweisungen zur Anwendung. In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung beschreiben die Anweisungen ein erfindungsgemäßes Verfahren, wie hier offenbart.
  • In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung kann der Kit für die Diagnose von Krankheiten, die Anfälligkeit für Krankheiten, die Überwachung des Fortschreitens von Krankheiten, die Überwachung des Fortschreitens von Krankheiten während der Behandlung, das Testen von Nahrungsmitteln, Wasser, dem Boden, das Testen auf Kontamination hin, das Testen auf das Vorliegen genetisch modifizierter (GM-)Nahrungsmittelkomponenten und/oder Organismen hin verwendet werden.
  • Erfassung von Zuständen
  • Eine andere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren und/oder einen Kit, wie hier offenbart, für die Erfassung des Vorliegens einer Komponente in einer Probe, wobei die zu prüfende Probe eine oder mehrere Komponenten umfassen kann, die mit einer Krankheit verbunden sind. Eine andere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren und/oder ein Kit, wie hier offenbart, für die Bilderkennung von Komponenten in einem System durch Magnetresonanz, wobei das System eine oder mehrere Komponenten umfassen kann, die mit einer Krankheit verbunden sind. Einer Ausführungsform gemäß ist eine Sonde ein Antikörper, der gegen die DNA, mRNA, cDNA oder ein Polypeptid gerichtet ist, die bzw. der die Komponente oder einen Teil derselben in einem erkrankten Individuum darstellt. Alternativ ist eine Sonde ein Nukleinsäure-(z. B. DNA-, PNA-, RNA-)Oligomer, das in der Lage ist, zu DNA, mRNA und/oder cDNA, die diese Komponente oder einen Teil derselben in dem erkrankten Individuum darstellen, zu hybridisieren. Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren und/oder einem erfindungsgemäßen Kit werden eine oder mehrere der hier offenbarten Ausführungsformen verwendet.
  • Beispiele von Komponenten, die mit Krankheiten verbunden und unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Kits mit Hilfe einer oder mehrerer Sonden erfassbar sind, die darauf gerichtet wird/werden, werden in Tabelle 1 bereitgestellt.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren und/oder ein erfindungsgemäßer Kit, die bzw. der für die Diagnose und Erfassung von Krebs in Individuen, beispielsweise für die Diagnose eines Typs von Krebs, für die frühe Erfassung von Krebs, für die Überwachung des Fortschreitens von Krebs in Individuen, die als schon an der Krankheit leidend diagnostiziert worden sind, zum Erfassen einer Rezidivierung von Krebs verwendet werden. Krebs ist immer noch eine häufig auftretende Krankheit es wäre zum Verlängern der Lebenserwartung vorteilhaft, die Krankheit im vorklinischen Zustand zu erfassen. Ein diagnostischer Assay, wie hier offenbart, macht dies möglich. Nicht einschränkende Beispiele von Komponenten, mit denen Krebs oder mehrere vererbte Zustände verbunden sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt und eine oder mehrere derselben sind unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder des erfindungsgemäßen Kits erfassbar. Eine Diagnose kann die Erfassung von einem oder mehreren der aufgeführten Moleküle erfordern. TABELLE 1: Liste von Komponenten, die mit Krankheit verbunden und unter Anwendung des erfindungsgemäßen Kits und/oder des erfindungsgemäßen Verfahrens erfassbar sind.
    Nummer Komponente Bemerkungen
    1. BRCA1 Brustkrebs 1, frühes Einsetzen
    2. TP53 Tumorprotein p53 (Li-Fraumeni-Syndrom)
    3. CFTR Transmembranleitfähigkeitsregulator für zystische Fibrose, ATP-Bindungskassette (Subfamilie C, Mitglied 7)
    4. APP Amyloid-Beta-(A4-)Vorläufer-Protein (Proteasenex-II, Alzheimerkrankheit)
    5. APOE Apolipoprotein E
    6. BRCA2 Brustkrebs 2, frühes Einsetzen
    7. HBB Hämoglobin, Beta
    8 APC Adenomatose Polyposis coli
    9. MYC Viraler Oncogenhomolog der v-myc-Myelozytomatose (Vögel)
    10. HD Huntington (Chorea Huntington)
    11. BCL2 B-Zellen-CLUlymphom 2
    12. ABL1 Viraler Onkogenhomolog 1 der murinen v-abl Abelsonleukämie
    13. BAX Mit BCLS assoziiertes X-Protein
    14. DMD Dystrophin (Muskeldystrophie, Duchenne- und Becker-Typen), umfasst DXS142, DXS164, DXS206, DXS230, DXS239, DXS268, DXS269, DXS270, DXS272
    15. CDKN2A Von Cyclin abhängiger Kinaseinhibitor 2A (Melanom, p16, hemmt CDK4)
    16. ATM Mutierte Ataxie-Telangiektase (umfasst die Komplementationsgruppen A, C und D)
    17. TNF Tumornekrosefaktor (TNF-Superfamilie, Mitglied 2)
    18. RB1 Retinoblastom 1 (einschließlich Osteosarkom)
    19. VEGF Gefäßendothelwachstumsfaktor
    20. ERBB2 Viraler Onkogenhomolog 2 der v-erb-b2-Erythroblastenleukämie, vom Oncogenhomolog abgeleitetes Neuro/Glioblastom (Vögel)
    21. FGG Fibrinogen, Gamma-Polypeptid
    22. HPRT1 Hypoxanthinphosphoribosyftransferase 1 (Lesch-Nyhan-Syndrom)
    23. MAPT Mit Mikrotubulus assoziiertes Protein tau
    24. MDM2 Mdm2, transformierte 3T3-Zelldoppelminute 2, p53 Bindungsprotein (Maus)
    25. RUNX1 Mit Runtkrankheit verbundener Transkriptionsfaktor 1 (akute myeloide Leukämie 1; aml1-Onkogen)
    26. SOD1 Superoxiddismutase 1, löslich (amyotrophische Lateralsklerose 1 (Erwachsener))
    27. CDKN1A Von Cyclin abhängiger Kinaseinhibitor 1A (p21, Cip1 )
    28. PAX6 Gepaartes Box-Gen 6 (Aniridie, Keratitis)
    29. NF1 Neurofibromin 1 (Neurofibromatose, von Recklinghausen-Krankheit, Watson-Krankheit)
    30. FN1 Fibronektin 1
    31. CASP3 Caspase 3, mit Apoptose verbundene Cysteinprotease
    32 PAH Phenylalaninhydroxylase
    33. GAPD Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase
    34. PTEN Phosphatase und Tensinhomolog (bei multiplen fortgeschrittenen Krebsen 1 mutiert)
    35. HFE Hämochromatose
    36. FGFR3 Fibroblastwachstumsfaktorrezeptor 3 (Achondroplasie, thanatophore Zwergbildung)
    37. EGFR Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (viraler/v-erb-b) Onkogenhomolog der Erythroblastleukämie, Vögel)
    38. DSCR1 Down-Syndrom, Gen 1, kritische Region
    39. MLH1 mutL-Homolog 1, Kolonkrebs, Nonpolypose Typ 2 (E. coli)
    40. PABPC1 Poly(A)-Bindungsprotein, zytoplasmatisch 1
    41. CYP3A5 Zytochrom P450, Subfamilie IIIA (Niphedipinoxidase), Polypeptid 5
    42 PSEN1 Presenilin 1 (Alzheimerkrankheit 3)
    43. FBN1 Fibrilin 1 (Marfan-Syndrom)
    44. MSH2 mutS-Homolog 2, Kolonkrebs, Nonpolypose-Typ 1 (E. coli)
    45 AKT1 Viraler Onkogenhomolog 1 des murinen v-akt-Thymoms
    46. CCND1 Cyclin D1 (PRAD1: Nebenschilddrüsenadenomatose 1)
    47. MTHFR 5,10-Methylentetrahydrofolat-reduktase (NADPH)
    48. AR Androgenrezeptor (Dihydrotestosteronrezeptor; testikuläre Feminisierung; Spinal- und Bulbärmuskelatrophie; Kennedy-Krankheit)
    49. TGFB1 Transformierender Wachstumsfaktor, Beta 1 (Camurati-Engelmann-Krankheit)
    50. IL6 Interleukin 6 (Interferon, beta 2)
    51 KRAS2 Viraler Onkogenhomolog des v-Ki-ras2-Kirsten-Rattensarkoms 2
    52. HRAS Viraler Onkogenhomolog des v-Ha-ras-Harvey-Rattensarkoms
    53 RET Ret-Proto-Onkogen (multiple Endokrinneoplasie und medulläres Schilddrüsenkarzinom 1, Hirschsprung-Krankheit)
    54 PPARG Peroxisom proliferativer aktivierter Rezeptor, gamma
    55. ACTB Actin, beta
    56. CDH1 Cadherin 1, Typ 1, E-Cadherin (epithelial)
    57. ESR1 Östrogenrezeptor 1
    58. IGF1 Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1 (Somatomedin C)
    59. GSTP1 Glutathion-S-Transferase pi
    60. IL8 Interleukin 8
    61. LPL Lipoproteinlipase
    62. FMR1 Fragil X-Geistesschwäche 1
    63. WT1 Wilms-Tumor 1
    64. IL1B Interleukin 1, beta
    65. CYP1A1 Zytochrom P450, Subfamilie I (durch aromatische Verbindung induzierbar), Polypeptid 1
    66. CTNNB1 Catenin (mit Cadherin assoziiertes Protein), beta 1 (88 kD)
    67. ITGA5 Integrin, alpha 5 (Fibronektinrezeptor, alpha-Polypeptid)
    68. FOS Viraler Onkogenhomolog des murinen v-fos FBJ-Osteosarkoms
    69. KIT Viraler Onkogenhomolog des v-kit Hardy-Zuckerman 4-Katzensarkoms
    70. ATP7B ATPase, Cu++ transportierend, Beta-Polypeptid (Wilson-Krankheit)
    71. IGF2 Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 2 (Somatomedin A)
    72. JUN Onkogenhomolog des v-jun-Sarkomvirus 17 (Vögel)
    73. CYP2C19 Zytochrom P450, Subfamilie IIC (Mephentyoin-4-hydroxylase), Polypeptid 19
    74. BCR Bruchgrenzenclusterregion
    75. FGFR2 Fibroblastwachstumsfaktorrezeptor 2 (bakterienexprimierte Kinase, Keratinozytwachstumsfaktorrezeptor, Schädel/Gesichts-Dysostose 1, Crouzon-Syndrom, Pfeiffer-Syndrom, Jackson-Weiss-Syndrom)
    76. CASP8 Caspase 8, mit Apoptose verbundene Cysteinprotease
    77. INSR Insulinrezeptor
    78 G6PD Glukose-6-phosphatdehydrogenase
    79. IL4 Interleukin 4
    80. DRD2 Dopaminrezeptor D2
    81. FGFR1 Fibroblastwachstumsfaktorrezeptor 1 (fms-verbundene Tyrosinkinase 2, Pfeiffer-Syndrom)
    82. COL1A1 Kollagen, Typ I, alpha 1
    83. BLM Bloom-Syndrom
    84. NF2 Neurofibromin 2 (bilaterales akustisches Neurom)
    85. MMP1 Matrixmetalloproteinase 1 (interstitielle Collagenase)
    86. 1L2 Interleukin 2
    87. GRB2 An Wachstumsfaktorrezeptor gebundenes Protein 2
    88. BCL2L1 BCL2-ähnliches 1
    89. PSEN2 Presenilin 2 (Alzheimerkrankheit 4)
    90. TNFRSF6 Tumornekrosefaktorrezeptor Superfamilie, Mitglied 6
    91. CD44 CD44-Antigen (Homingfunktion und indisches Blutgruppensystem)
    92. MMP9 Matrixmetalloproteinase 9 (Gelatinase B, 92 kD-Gelatinase, 92 kD Typ IV Collagenase)
    93. ABCB1 ATP-Bindungskassette, Unterfamilie B (MDR/TAP), Mitglied 1
    94. GSTM1 Glutathion-S-transferase M1
    95. IL1A Interleukin 1, alpha
    96. MET Metproto-Onkogen (Hepatozytwachstumsfaktorrezeptor)
    97. ABO ABO-Blutgruppe (Transferase A, Alpha-1-3-N-acetylgalactosaminyltransferase; Transferase B, Alpha-1-3-galactosyltransferase)
    98. NRAS Onkogenhomolog des Neuroblastom-RAS-virus (v-ras)
    99. NAT2 N-Acetyltransferase 2 (Arylamin-N-acetyltransferase)
    100. EGR1 Frühe Wachstumsreaktion 1
    101. TTR Transthyretin (Präalbumin, Amyloidos Typ I)
    102. SOD2 Superoxiddismutase 2, mitochondrial
    103. SCYA2 Kleines induzierbares Cytokin A2 (chemotaktisches Monozytprotein 1)
    104. NOS3 Stickoxidsynthase 3 (Endothelzelle)
    105. CDC2 Zellteilungszyklus 2, G1 zu S und G2 zu M
    106. STAT1 Signalumwandler und -aktivator der Transkription 1, 91 kD
    107. SNCA Synuclein, alpha (nicht-A4-Komponente des Amyloidvorläufers)
    108. CLU Clusterin (Komplementlyseinhibitor, SP-40, 40, sulfatiertes Glykoprotein 2, durch Testosteron unterdrückte Prostatabotschaft 2, Apolipoprotein J)
    109. CDKN1B Von Cyclin abhängiger Kinaseinhibitor 1B (p27, Kip1)
    110. TYR Tyrosinase (okulocutaner Albinismus IA)
    111. MADH4 MAD, Mothers against decapentaplegic homolog 4 (Drosophila)
    112. CDK2 Von Cyclin abhängige Kinase 2
    113. MMP3 Matrixmetalloproteinase 3 (Stromelysin 1, Progelatinase)
    114. YWHAZ Tyrosin-3-monooxygenase/Tryptophan-5-monooxygenaseaktivationsprotein, Zeta-Polypeptid
    115. CASP1 Caspase 1, mit Apoptose verbundene Cysteinprotease (Interleukin 1, beta, Convertase)
    116. PCNA Proliferierendes Zellkernantigen
    117. HLA-A, -B, -C Haupthistokompatibilitätskomplex, Klasse I, A, B, C
    118. APOB Apolipoprotein B (einschließlich Ag(x)-Antigen)
    119. CASP9 Caspase 9, mit Apoptose verbundene Cysteinprotease
    120. NOS2A Stickoxidsynthase 2A (induzierbar, Hepatozyten)
    121. IFNG Interferon, gamma
    122. APOA1 Apolipoprotein A-1
    123. AGT Angiotensinogen (Serin- (oder Cystein-)Proteinaseinhibitor, Clade A (Alpha-1-Antiproteinase, Antitrypsin), Mitglied 8)
    124. ADA Adenosindeaminase
    125. ICAM1 Interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 (CD54), menschlicher Rhinovirus-rezeptor
    126. CYP19 Zytochrom P450, Subfamilie XIX (Aromatisierung von Androgenen)
    127. SLC6A4 Trägerfamilie 6 für gelösten Stoff (Neurotransmittertransporter, Serotonin), Mitglied 4
    128. TNFRSF1A Tumornekrosefaktorrezeptor-Superfamilie, Mitglied 1A
    129. CD4 CD4-Antigen (p55)
    130. VWF Von Willebrand-Faktor
    131. ACTA1 Actin, alpha 1, Skelettmuskel
    132. MECP2 Methyl-CpG-Bindungsprotein 2 (Rett-Syndrom)
    133. COMT Catechin-O-methyltransferase
    134. TERT Telomerasereverstranskripase
    135. PKD Polyzystische Nierenerkrankung (autosomaldominant)
    136. F7 Koagulationsfaktor VII (Serumprothrombin-Umwandlungsbeschleuniger)
    137. PMP22 Peripheres Myelinprotein 22
    138. F5 Koagulationsfaktor V (Proaccelerin, labiler Faktor)
    139. PPARA Proliferativer aktivierter Peroxisomrezeptor, alpha.
    140. GCK Glukokinase (Hexokinase 4, Typ-II-Diabetes Mellitus bei Jugendlichen)
    141. MUC1 Mucin 1, Transmembran
    142. SPP1 Abgesondertes Phosphoprotein 1 (Osteopontin, Knochensialoprotein I, frühe T-Lymphozytenaktivierung 1)
    143. RAF1 Viraler Onkogenhomolog 1 der murinen v-raf-1-Leukämie
    144. IGF1R Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1-Rezeptor
    145. IL4R Interleukin-4-Rezeptor
    146. DCC In kolorektalem Karzinom deletiert
    147. PML Promyeolozytische Leukämie
    148. PDGFRB Plättchenderivierter Wachstumsfaktorrezeptor, Beta-Polypeptid
    149. AGTR1 Angiotensinrezeptor 1
    150. UBE3A Ubiquitinproteinligase E3A (mit menschlichem Papillomavirus E6 verbundenes Protein, Angelman-Syndrom)
    151. CREBBP CREB-Bindungsprotein (Rubinstein-Taybi-Syndrom)
    152. CYP1B1 Zytochrom P450, Subfamilie I (durch Dioxin induzierbar), Polypeptid 1 (Glaukom 3, primär infantil)
    153. AKT2 Viraler Onkogenhomolog des murinen v-akt-Thymoms
    154. PLAT Plasminogenaktivator, Gewebe
    155. CHRNA7 Cholinergischer Rezeptor, nikotinisch, alpha-Polypeptid 7
    156. TIMP1 Gewebeinhibitor der Metalloproteinase 1 (Erythroid potenzierende Aktivität, Collagenaseinhibitor)
    157. NFKB1 Kernfaktor von kappa-Leichtpolypeptidgenenhancer in B-Zellen 1 (p105)
    158. STAT3 Signalumwandler und -aktivator der Transkription 3 (Akutphasenreaktionsfaktor)
    159. CDC42 Zellteilungszyklus 42 (GTP-Bindungsprotein, 25 kD)
    160. VDR Vitamin D-(1,25-Dihydroxyvitamin D3-)Rezeptor
    161. NTRK1 Neurotrophe Tyrosinkinase, Rezeptor, Typ 1
    162. VIM Vimentin
    163. TGFBR2 Umwandlungswachstumsfaktor, beta-Rezeptor II (70–80 kD)
    164. DHFR Dihydrofolatreduktase
    165. PTCH Patched Homolog (Drosophila)
    166. CYP2A6 Zytochrom P450, Subfamilie IIA (durch Phenobarbital induzierbar), Polypeptid 6
    167. HSPCA 90 kD-Wärmeschockprotein 1, alpha
    168. E2F1 E2F-Transkriptionsfaktor 1
    169. CACNA1A Calciumkanal, spannungsabhängig, P/Q-Typ, alpha-1A-Subeinheit
    170. LCK Lymphozytenspezifische Proteintyrosinkinase
    171. LGALS3 Lectin, Galactosid bindend, löslich, 3 (Galectin 3)
    172. RARA Retinsäurerezeptor, alpha
    173. PDZK1 PDZ-Domäne enthaltend 1
    174. ALDH2 Aldehyddehydrogenase 2-Familie (mitochondrial)
    175. PAX3 Gepaartes Box-Gen 3 (Waardenburg-Syndrom 1)
    176. FGF2 Fibroblastwachstumfaktor 2 (basisch)
    177. GJB1 Nexusprotein, beta 1, 32 kD (Connexin 32, Charcot-Marie-Tooth-Neuropathie, X-verbunden)
    178. LMNA Lamin A/C
    179. CAPN3 Calpain 3, (p94)
    180. ADPRT ADP-Ribosyltransferase (NAD+, Poly(ADP-ribose)polymerase)
    181. TUBE Tubulin, Beta-Polypeptid
    182. ABCA1 ATP-Bindungskassette, Subfamilie A (ABC1), Mitglied 1
    183. IL1RN Interleukin 1-Rezeptorantagonist
    184. CTGF Bindungsgewebewachstumsfaktor
    185. GSTT1 Glutathion-S-transferase-theta 1
    186. DRD4 Dopaminrezeptor D4
    187. HTR2A 5-Hydroxytryptamin-(Serotonin-)Rezeptor 2A
    188. FHIT Fragiles Histidintriadengen
    189. ETV6 ets-variantes Gen 6 (TEL-Onkogen)
    190. PDGFB Plättchenderiviertes Wachstumsfaktor-beta-polypeptid (Virus-(v-sis-)Onkogenhomolog des Simiansarkoms)
    191. PPP3R1 Proteinphosphatase 3 (früher 2B), Regulations-Untereinheit B (19 kD), Alpha-Isoform (Calcineurin B, Typ I)
    192. TIMP3 Gewebeinhibitor von Metalloproteinase 3 (Sorsby-Fundus-Dystrophie, pseudoentzündlich)
    193. COL1A2 Kollagen, Typ I, alpha 2
    194. ITGB3 Integrin, beta 3 (Plättchenglykoprotein IIIa, Antigen CD61)
    195. COL3A1 Kollagen, Typ III, alpha 1 (Ehlers-Danlos-Syndrom Typ IV, autosomal-dominant)
    196. ESR2 Östrogenrezeptor 2 (ER beta)
    197. B2M Beta-2-Mikroglobulin
    198. SDF1 Von Stromazellen derivierter Faktor 1
    199. F9 Koagulationsfaktor IX (plasmathromboplastische Komponente, Christmas-Krankheit, Hämophilie B)
    200. MAPK14 Mitogenaktivierte Proteinkinase 14
    201. BAK1 BCL2-Antagonist/Killer 1
    202. ITGB1 Integrin, beta 1 (Fibronektinrezeptor, Beta-Polypeptid, Antigen CD29 umfasst MDF2, MSK12)
    203. ACTG1 Actin, Gamma 1
    204. KDR Kinaseinsertionsdomänenrezeptor (Typ III-Rezeptor-Tyrosinkinase)
    205. SCTR Secretinrezeptor
    206. LEPR Leptinrezeptor
    207. SP1 Sp1-Transkriptionsfaktor
    208. CDKN1C Cyclinabhängiger Kinaseinhibitor 1C (p57, Kip2)
    209. MYCN Mit v-myc-Myelocytomatosevirus verwandtes Onkogen, von Neuroblastom deriviert (Vögel)
    210. IiIL 12B Interleukin 12B (natürlicher Killerzellenstimulationsfaktor 2, zytotoxischer Lymphozytreifungs-faktor 2, p40)
    211. IGF2R Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 2-Rezeptor
    212. FLT1 Fms-verwandte Tyrosinkinase 1 (Vaskularendothelwachstumsfaktor/Vaskulardurchlässigkeitsfaktor-rezeptor
    213. CD36 CD36-Antigen (Kollagen-Typ I-Rezeptor, Thrombospondinrezeptor)
    214. FRD Friedreich-Ataxie
    215. COL2A1 Kollagen, Typ II, alpha 1 (primäre Osteoarthritis, Dysplasia spondyloepiphysaria, kongenitale)
    216. GSN Gelsolin (Amyloidose, Finnischer Typ)
    217. CYP2E Zytochrom P450, Subfamilie IIE (ethanolinduzierbar)
    218. APAF1 Die apoptotische Protease aktivierender Faktor
    219. ANK1 Ankyrin 1, erythrozytisch
    220. SLC6A3 Trägerfamilie 6 für gelöste Substanz (Neurotransmittertransporter, Dopamin), Mitglied 3
    221. CASP7 Caspase 7, mit Apoptose verbundene Cysteinprotease
    222. MYH7 Myosin, schweres Polypeptid 7, Herzmuskel, beta
    223. JUNG Jun B-Proto-Onkogen
    224. GHR Wachstumshormonrezeptor
    225. IRS1 Insulinrezeptorsubstrat 1
    226. CASP10 Caspase 10, mit Apoptose verbundene Cysteinprotease
    227. BDNF Vom Gehirn derivierter neurotroper Faktor
    228. ATP7A ATPase, Cu++ transportierend, Alpha-Polypeptid (Menkes-Syndrom)
    229. TCF1 Lebertranskriptionsfaktor 1; LF-B1, Leberkernfaktor (HNF1), Albuminproximalfaktor
    230. HGF Hepatozytwachstumsfaktor (Hepapoietin A; Streufaktor)
    231. CYP17 Zytochrom P450, Subfamilie XVII (Steroid-17-alpha-hydroxylase), Nebennierenhyperplasie
    232. PTPN1 Proteintyrosinphosphatase, Nichtrezeptor vom Typ 1
    233. ADRB3 Adrenerger B eta-3-Rezeptor
    234. TNFSF6 Tumornekrosefaktor-(Liganden-)Superfamilie, Mitglied 6
    235. ERCC5 Exzisionsreparatur-Kreuzkomplementier-Nagetier-reparatur-defizienz, Komplementationsgruppe G (Xerodermapigmentosum, Komplementationsgruppe G (Cockayne-Syndrom)
    236. VCAM1 Vaskularzelladhäsionsmolekül 1
    237. TF Transferrin
    238. ACE Angiotensin I konvertierendes Enzym (Peptidyldipeptidase A) 1
    239. LRP1 Mit Lipoprotein verbundenes Protein 1 niederer Dichte (Alpha-2-makroglobulinrezeptor)
    240. CDK5 Cyclinabhängige Kinase 5
    241. ACACA Acetyl-Coenzym A-Carboxylase-alpha
    242. TNFRSF1B Tumornekrosefaktorrezeptor-Superfamilie, Mitglied 1B
    243. NOTCH3 Notch-Homolog 3 (Drosophila)
    244. ERBB3 Virusonkogenhomolog 3 der v-erb-B2-Erythroblastleukämie (Vögel)
    245. CSK c-src-Tyrosinkinase
    246. SCN5A Natriumkanal-alpha-Polypeptid, spannungsgeschaltet, Typ V (langes (elektrokardiografisches) QT-Syndrom 3)
    247. BCL6 B-Zellen-CLII-Lymphom 6 (Zinkfingerprotein 51)
    248. FYN Mit SRC, FGR, YES verwandtes FYN-Onkogen
    249. CTSK Cathepsin K (Pycnodysostose)
    250. SPARC Abgesondertes Protein, sauer, cysteinreich (Osteonektin)
    251. NFKB2 Kernfaktor von kappa-Leichtpolypeptidgenenhancer in B-Zellen 2 (p49/p100)
    252. SCYA5 Kleines induzierbares Cytokin A5 (RANTES)
    253. BMP4 Knochenmorphogenes Protein 4
    254. ATP2A2 ATPase, Ca++ transportierend, Herzmuskel, langsames Zucken 2
    255. NR3C1 Kernrezeptorsubfamilie 3, Gruppe C, Mitglied 1
    256. THBS1 Thrombospondin 1
    257. CETP Cholesterylestertransferprotein, Plasma
    258. PTPRC Proteintyrosinphosphatase, Rezeptortyp, C
    259. NME1 Nichtmetastatische Zellen 1, Protein (NM23A) exprimiert in
    260. TGFB1 Transformierender Wachstumsfaktor, beta-induziert, 68 kD
    261. SREBF1 Sterolregulationselement-Bindungstranskriptionsfaktor 1
    262. MMP14 Matrixmetalloproteinase 14 (membraninsertiert)
    263. KCNQ1 Spannungsgeschaltete KQT-ähnliche Kaliumkanalsubfamilie, Mitglied 1
    264. TUBA1 Tubulin, alpha 1 (Testis-spezifisch)
    265. SELE Selectin E (Endotheladhäsions-molekül 1)
    266. ATRX Alpha-Thalassemie/Geistesschwächensyndrom, X-verbunden (RAD54 Homolog, S. cerevisiae)
    267. IL2RG Interleukin 2-Rezeptor, gamma (starker kombinierter Immunmangel)
    268. IGFBP3 Insulinähnliches Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 3
    269. JAK3 Janus-Kinase 3 (eine Proteintyrosinkinase, Leukozyt)
    270. CSF1R Kolonie stimulierender Faktor 1-Rezeptor, früher McDonough-Katzensarkomvirus-(v-fms-)Onkogenhomolog
    271. SHC1 SHC (Src-Homologie-2-Domäne enthaltend) transformierendes Protein 1
    272. CASP4 Caspase 4, mit Apoptose verbundene Cysteinprotease
    273. PLA2G2A Phospholipase A2, Gruppe IIA (Plättchen, Gelenkschmiere)
    274. CDXCR4 Chemokin (C-X-C-Motiv), Rezeptor 4 (Fusin)
    275. CDKN2B Cyclinabhängiger Kinaseinhibitor 2B (p15, hemmt CDK4)
    276. ARHA Ras-Homolog-Genfamilie, Mitglied A
    277. SHH Sonic-Hedgehog-Homolog (Drosophila)
    278. RARB Retinsäurerezeptor, beta
    279. MME Membranmetalloendopeptidase (neutrale Endopeptidase, Enkephalinase, CALLA, CD10)
    280. CA2 Carbonsäureanhydrase II
    281. PRKDC Proteinkinase, DNA-aktiviert, katalytisches Polypeptid
    282. HIF1A Hypoxia-induzierbarer Faktor 1, alpha-Subeinheit (basischer Helixschleifen-Helix-Transkriptionsfaktor)
    283. PRKCA Proteinkinase C, alpha
    284. CASP2 Caspase 2, mit Apoptose verbundene Cysteinprotease (neuronenvorläufer-zellen-exprimiert, entwicklungsmäßig herunterreguliert 2)
    285. DMBT1 In bösartigen Gehirntumoren deletiert 1
    286. TGFB2 Transformierender Wachstumsfaktor, beta 2
    287. TSC2 Tuberöse Sklerose 2
    288. PSAP Prosaposin (variante Gaucher-Krankheit und variante metachromatische Leukodystrophie)
    289. XPC Xeroderma pigmentosum, Komplementationsgruppe C
    290. THRA Schilddrüsenhormonrezeptor, alpha-(Erythroblastleukämievirus-(v-erb-a-)Onkogenhomolog, Vögel)
    291. ERCC2 Exzisionsreparatur-Kreuzkomplementier-Nagetier-Reparatur-Defizienz, Komplementationsgruppe 2 (Xeroderma pigmentosum D)
    292. MAPK1 Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1
    293. ATP6B1 ATPase, H+ transportierend, lysosomal (vakuoläre Protonenpumpe), Beta-Polypeptid, 56/58 kD, Isoform 1 (Tubuläre Nierenazidose mit Gehörlosigkeit)
    294. BAG1 BCL2-assoziiertes Athanogen
    295. ACHE Acetylcholinesterase (Blutgruppe YT)
    296. EGF Epidermalwachstumsfaktor (Beta-Urogastron)
    297. DUSP1 Doppelspezifizitätsphosphatase 1
    298. CASP6 Caspase 6, mit Apoptose verbundene Cysteinprotease
    299. THRB Schilddrüsenhormonrezeptor, Beta-(Erythroblastleukämievirus-(v-erb-a)-Onkogenhomolog 2, Vögel)
    300. BAD BCL2-Antagonist des Zelltods
    301. STAT6 Signalumwandler und -aktivator der Transkription 6, durch Interleukin 4 induziert
    302. ELN Elastin (supravalvuläre Aortastenose, Williams-Beuren-Syndrom)
    303. MAOA Monoaminoxidase A
    304. F8 Koagulationsfaktor VII, Prokoagulanzkomponente (Hämophilie A)
    305. ENG Endoglin (Osler-Rendu-Weber-Syndrom 1)
    306. HSPB1 27 kD Wärmeschockprotein 1
    307. HMGCR 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase
    308. PIM1 pim-1-Onkogen
    309. PON1 Paraoxonase 1
    310. AHR Arylkohlenwasserstoffrezeptor
    311. ITGB2 Integrin, beta 2 (Antigen CD18 (p95), mit der Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen 1, Makrophagenantigen 1-(mac-1-)beta-Subeinheit)
    312. PTGS1 Prostaglandin-Endoperoxidsynthase 1 (Prostaglandin G/H-Synthase und Cyclooxygenase)
    313. PLCG1 Phospholipase C, gamma 1 (früher Subtyp 148)
    314. APOC3 Apolipoprotein C-III
    315. NRG1 Neuregulin 1
    316. DC14 CD14-Antigen
    317. IRF1 Interferonregulationsfaktor 1
    318. ALPL Alkalische Phosphatase, Leber/Knochen/Nieren
    319. ALDOA Aldolase A, Fructose-Bisphosphat
    320. XPA Xeroderma pigmentosum, Komplementationsgruppe A
    321. PDGFRA Plättchenderivierter Wachstumsfaktorrezeptor, alpha-Polypeptid
    322. IL5 Interleukin 5 (koloniestimulierender Faktor, Eosinophil)
    323. BMP2 Knochenmorphogenes Protein 2
    324. GSK3A Glykogensynthasekinase 3 alpha
    325. STK11 Serin/Threoninkinase 11 (Peutz-Jeghers-Syndrom)
    326. GSK3B Glykogensynthasekinase 3, beta
    327. CRYBB1 Kristallin, beta B1
    328. STAT5A Signalumwandler und -aktivator der Transkription 5A
    329. SCA1 Spinozerebelläre Ataxie 1 (olivopontozerebelläre Ataxie 1, autosomal-dominant, Ataxin 1)
    330. RXRA Retinoid-X-Rezeptor, alpha
    331. NFKBIA Kernfaktor von kappa-Leichtpolypeptidgenenhancer in B-Zelleninhibitor, alpha
    332. MMP13 Matrixmetalloproteinase 13 (Collagenase 3)
    333. TSHR Schilddrüsenstimulierender Hormonrezeptor
    334. MT2A Metallothionein 2A
    335. TSSC3 Tumorunterdrückender subtransferabler Kandidat 3
    336. RHO Rhodopsin (Opsin 2, Stäbchenpigment) (Retinitis pigmentosa 4, autosomaldominant)
    337. GADD45A Wachstumsstillstand und DNA-Schäden induzierbar, alpha
    338. LCAT Lecithincholesterinacyftransferase
    339. GSR Glutathionreduktase
    340. TOP2A Topoisomerase (DNA) II alpha (170 kD)
    341. GPX1 Glutathionperoxidase 1
    342. FLT3 fms-verbundene Tyrosinkinase 3
    343. CEBPB CCAAT/Enhancerbindungsprotein (C/EBP), beta
    344. TPM1 Tropomyosin 1 (alpha)
    345. ABCA4 ATP-Bindungskassette, Subfamilie A (ABC1), Mitglied 4
    346. KCNH2 Spannungsgeschaltete Kaliumkanalsubfamilie H (eag-verwandt), Mitglied 2
    347. HNF4A Hepatozytkernfaktor 4, alpha
    348. DPYD Dihydropyrimidindehydrogenase
    349. MADH2 MAD, Mothers against decapentaplegic homolog 2 (Drosophila)
    350. AFP Alpha-Fetoprotein
    351. TIMP2 Gewebeinhibitor der Metalloproteinase 2
    352. ITK IL2-induzierbare T-Zellenkinase
    353. ABL2 Virusonkogenhomolog 2 der murinen v-abl-Abelsonleukämie (arg, Abelson-verwandtes Gen)
    354. SCYA4 Kleines induzierbares Cytokin A4
    355. GCGR Glukagonrezeptor
    356. TCF3 Transkriptionsfaktor 3 (E2A-Immunglobulinenhancer-Bindungsfaktoren E12/E47)
    357. MYB Virusonkogenhomolog der v-myb-Myeloblastose (Vögel)
    358. LTA Lymphotoxin alpha (TNF-Superfamilie, Mitglied 1)
    359. LIF Leukämiehemmungsfaktor (cholinergischer Differentiations-faktor)
    360. CYBB Zytochrom b-245, beta-Polypeptid (chronische granulomatöse Krankheit)
    361. CTSL Cathepsin L
    362. BCL2A1 BCL2-verbundenes Protein A1
    363. TFRC Transferrinrezeptor (p90, CD71)
    364. RALGDS Ral-Guanin-Nukleotiddissoziationsstimulator
    365. CYP2C8 Zytochrom P350, Unterfamilie IIC (Mephenytoin-4-hydroxylase), Polypeptid 8
    366. CD38 CD38-Antigen (p45)
    367. PRKCZ Proteinkinase C, zeta
    368. LAMR1 Lamininrezeptor 1 (67 kD, Ribosomalprotein SA)
    369. IL12A Interleukin 12A (natürlicher Killerzellenstimulationsfaktor 1, cytotoxischer Lymphozytreifungs-faktor 1, p35)
    370. FGA Fibrinogen, A alpha-Polypeptid
    371. EEF1A1 Eukaryotischer Translationsverlängerungsfaktor 1 alpha 1
    372. CYP21A2 Zytochrom P450, Subfamilie XXIA (Steroid-21-hydroxylase, kongenitale Nebennierenrindenhyperplasie), Polypeptid 2
    373. CSF2 Kolonie-stimulierender Faktor 2 (Granulozytmakrophag)
    374. TNFRSF5 Tumornekrosefaktorrezeptoren-Superfamilie, Mitglied 5
    375. MBP Basisches Myelinprotein
    376. PTK2 PTK2-Proteintyrosinkinase 2
    377. KLK3 Kallikrein 3 (prostataspezifisches Antigen)
    378. GALT Galactose-1-phosphaturidylyltransferase
    379. APEX APEX-Nuklease (multifunktionelles DNA-Reparaturenzym)
    380. EPHB2 EphB2
    381. BIK BCL2-Wechselwirkungskiller (Apoptose induzierend)
    382. SLC2A1 Trägerfamilie für gelöste Substanz 2 (ermöglichter Glukosetransporter), Mitglied 1
    383. IL2RA Interleukin 2-Rezeptor, alpha
    384. IFNGR2 Interferon-gamma-Rezeptor 2 (Interferon-gamma-Umwandler 1)
    385. AXL AXL-Rezeptortyrosinkinase
    386. ADRB1 Adrenerger Beta-1-Rezeptor
    387. RAD51 RAD51-Homolog (RecA-Homolog, E. coli) (S. cerevisiae)
    388. GJA1 Nexusprotein, alpha 1, 43 kD (Connexin 43)
    389. EWSR1 Ewing-Sarkom-Bruchgrenzenregion 1
    390. CCR2 Chemokin-(C-C-Motiv)Rezeptor 2
    391. RELA Virusonkogenhomolog A der v-rel-Reticuloendotheliose, Kernfaktor von kappa-Leichtpolypeptidgenenhancer in B-Zellen 3, p65 (Vögel)
    392. CTNNA1 Catenin (mit Cadherin assoziiertes Protein), alpha 1 (102 kD)
    393. MY07A Myosin VIIA (Usher-Syndrom 1B (autosomal-rezessiv, ernsthaft))
    394. F3 Koagulationsfaktor III (Thromboplastin, Gewebefaktor)
    395. EPHX1 Epoxidhydrolase 1, mikrosomal (xenobiotisch)
    396. CRK Virus-CT10-Onkogenhomolog des v-crk-Sarkoms (Vögel)
    397. ENO1 Enolase 1, (alpha)
    398. TGFBR1 Transformierender Wachstumsfaktor, beta-Rezeptor I (Activin-A-Rezeptor, der Kinase vom Typ II ähnlich, 53 kD)
    399. RAC1 Mit ras verbundenes C3-Botulinumtoxinsubstrat 1 (rho-Familie, kleines GTP-Bindungsprotein Rac1)
    400. ANPEP Alanyl-(Membran-)Aminopeptidase (Aminopeptidase N, Aminopeptidase M, mikrosomale Aminopeptidase, CD13, p150)
  • Ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren können zum Erfassen von Infektionskrankheiten verwendet werden. Einige Infektionskrankheiten sind lebensbedrohend und können in Kombination mit anderen Infektionen auftreten. So kann, je früher sie erfasst und charakterisiert werden können, umso früher eine geeignete Therapie bestimmt werden, was für den Patienten besser ist. Ein Kit und/oder ein Verfahren, wie oben offenbart, kann zum Erfassen dieser infektiösen Agentien verwendet werden. Komponenten, die je nach Kit und/oder Verfahren erfasst werden können, sind diejenigen, die Teil des infektiösen Agents bilden und/oder durch das infektiöse Agents erzeugt werden. Viren in erkrankten Individuen, die dem Kit und/oder Verfahren gemäß erfassbar sind, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, HCV, HIV, HBV, HTLV, HPV (vergleiche auch Onkologie). Bakterien in erkrankten Individuen, die dem Kit und/oder Verfahren gemäß erfassbar sind, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Mykobakterien, Syphilis, Staphylococcus aureus (Screenen von MRSA).
  • Ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren können zum Erfassen neurodegenerativer Krankheiten verwendet werden. Komponenten, die erfasst werden können, sind diejenigen, die in degenerativen Krankheiten involviert sind und umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Beta-Amyloide (Alzheimer-Krankheit), hTAU, Phospho-TAU und APOE.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren können zum Erfassen von mit Prionen verbundenen Krankheiten verwendet werden. Krankheiten, die mit Prionen verbunden sind, umfassen die Kreutzfeld-Jacob-Krankheit und BSE.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren können zum Erfassen von Krankheiten benutzt werden, die mit der Autoimmunität verbunden sind. Komponenten, die erfasst werden können, sind diejenigen, die bei der Autoimmunität involviert sind und umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ANA, Jo-1, Myeloperoxidase, RNP, Scl-70, Sm, SS-A.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren können zum Erfassen von Krankheiten, die mit Allergie verbunden sind, benutzt werden. Komponenten, die erfasst werden können, sind diejenigen, die bei einer Allergie involviert sind und umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, IgE, IgG-Subklassen und zirkulierende Antikörper.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren können auf dem Gebiet der Genomik zum Erfassen der Anfälligkeit für eine Krankheit, der Möglichkeit des Übertragens des Zustands an Nachkommen, Einzelnukleotidpolymorphismen usw. angewendet werden. Beispiele von Gebieten, auf denen ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren geeignet sind, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, das HLA-Typieren, den p53-Polymorphismus (SNP), der mit der Anfälligkeit für das Entwickeln eines Gebärmutterkarzinoms nach einer HPV 16-Infektion, verbunden ist, hohen Blutdruck, das Erfassen von Polymorphismus mit Bezug auf die Anfälligkeit für Osteoporose, das Erfassen von Mutationen in Faktor V (Leiden), das Erfassen der genetischen Anfälligkeit für SIDS (Krippentod), Erbbedingtes: Vater schaftstests usw., das Erfassen von Mikrosatellitinstabilität, das Erfassen der Erfolgsrate der Therapie, die mit dem Aufgeben des Rauchens verbunden ist, das Erfassen von Störungen im Stoffwechsel von Lipiden, einschließlich Cholesterin (HDL, LDL, VLDL und ihren Rezeptoren) in Bezug auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Atheromathose, die Erfassung von Genomdefekten, die mit Fettleibigkeit verbunden sind, das Erfassen von Genomdefekten, die mit Diabetes verbunden sind, das Erfassen von Mutationen, die mit Arzneimittelresistenz (gegen HIV usw.) verbunden sind, das Screenen und das Erfassen von zystischer Fibrose (CFTR-Mutationen), das Erfassen von Mutationen im Mitochondriengenom, das mit einer Anzahl von Erkrankungen verbunden ist wie: neurogener Muskelschwäche, Retinitis pigmentosa, okulärer Myopathie usw.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren kann bzw. können auf mit der Umweltprüfung verbundenen Gebieten angewendet werden. Viele Anwendungen sind mit Wasser verbunden, wo es wichtig ist, eine Technologie zur Hand zu haben, die ausreichend empfindlich ist, um sehr geringe Mengen an Verschmutzungen oder unerwünschten Verbindungen auf annehmbar wirtschaftliche Weise zu erfassen. Beispiele von Umweltprüfung umfassen:
    • – das Überprüfen (Überwachen) von Hefeinfektionen in Schwimmbeckenwasser
    • – das Überwachen biologischer Verschmutzung im Allgemeinen
    • – biologische Verschmutzungen im Trinkwasser (Amöben, koliforme Bakterien usw.)
  • Außer dem Prüfen von Wasser kann die Umweltprüfung auf genetisch modifizierte Organismen hin einem erfindungsgemäßen Kit und/oder Verfahren gemäß durchgeführt werden. Genmodifizierte Organismen können bezüglich der Abwesenheit erfasst oder Proben gescreent werden. Das Nachprüfen bezüglich möglicher Modifikationen ist manchmal schwierig, jedoch ist eine empfindliche Technik, wie diejenige, die durch das vorliegende Verfahren bereitgestellt wird, für einen derartigen Zweck geeignet.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren kann bzw. können zum Erfassen der Infektion von Nahrungsmitteln angewendet werden. Die Kontrolle aller mit Nahrungsmitteln verbundener Orte und Gegenstände erfordert empfindliche Verfahren und der erfindungsgemäße Kit und/oder das erfindungsgemäße Verfahren bietet bzw. bieten die erforderliche Empfindlichkeit. Des Weiteren kann ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren durchgeführt und die Ergebnisse am Ort, an dem die Kontrolle stattfindet, erhalten werden, so dass die Notwendigkeit des Schickens von Proben an ein Labor entfällt. So können, falls erforderlich, Schritte sofort unternommen werden. Beispiele der Agentien, die erfasst werden können, umfassen Listeria, Salmonella, Prionen (für BSE). Moleküle, die erfasst werden können, sind diejenigen, die Teil des Agens bilden und/oder durch das Agens erzeugt werden.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit und/oder ein erfindungsgemäßes Verfahren kann bzw. können in biochemischen Standarderfassungsprotokollen angewendet werden. Alle bestehenden Typen von Blottechniken erlauben eine Verbesserung der Empfindlichkeit unter Anwendung des hier offenbarten Verfahrens ohne Radioisotope oder die Chemilumineszenzerfassung wie fotografische Platten oder Phosphorscreenen zu erfordern. Es ist auch möglich, das Verfahren in Kombination mit der Image-Analyse zu verwenden. Beispiele von Blotprotokollen, bei denen das erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden kann, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Western Blot, Northern Blot, Southern Blot, Vakuumblot, Kontaktblot, Umkehrlinienblot und damit verbundene Techniken, Dotblot, Mikroarrays, Makroarrays.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines Verfahrens oder eines Kits, wie hier beschrieben, für die quantitative und/oder qualitative Erfassung von Komponenten in einer Probe. Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung des Kits wie hier beschrieben für die Bilderkennung von Komponenten in einem System durch Magnetresonanz.
  • Färben von Mikroskopieobjektträgern
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Färben von Abschnitten von Zellen und/oder Geweben, die für das Sichtbarmachen unter Anwendung von Mikroskopie geeignet sind. Die Mikroskopietypen können irgendwelche sein und umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Lichtmikroskopie, Tunnelelektronenmikroskopie, Scan-Elektronenmikroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie.
  • Einer Ausgestaltung der Erfindung, nämlich einem Verfahren für das Färben von Komponenten in Zell- und/oder Gewebeabschnitten, gemäß, umfasst das Färben, das für das Sichtbarmachen mit Hilfe von Mikroskopie geeignet ist, die folgenden Schritte:
    • A) Inkubieren des Abschnitts mit einer oder mehreren biotinylierten Sonden, die gegen die Komponenten gerichtet sind,
    • B) Inkubieren des Abschnitts mit Streptavidin-Metallteilchen-Komplex,
    • C) Inkubieren des Abschnitts mit Konjugat umfassend:
    • – ein oder mehrere Biotine,
    • – ein oder mehrere Polymere und
    • – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind und
    • D) wahlweise Inkubieren des Abschnitts durch Metallenhancementreagens.
  • Biotinylierte Sonden, der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex, das Konjugat und die Arten von Metallteilchen sind oben schon beschrieben worden. Das Einführen anderer Schritte in das Verfahren, wie beispielsweise Waschschritte, ist dem geschulten Fachmann, der auf dem Gebiet der Immunhistochemie praktiziert, eventuell bekannt. Bevorzugt wird eine Wäsche nach jedem Schritt durchgeführt. Beispiele von Waschpuffern sind oben beschrieben worden. Das „Metallenhancementreagens" von Schritt D) ist ebenfalls oben beschrieben worden.
  • Ein Kit für das Färben von Abschnitten von Zellen und/oder Geweben, der zum Sichtbarmachen unter Anwendung von Mikroskopie geeignet ist, kann eines oder mehrere der Folgenden umfassen:
    • – einen Streptavidin-Metallteilchen-Komplex
    • – ein Konjugat
    • – eine biotinylierte Sonde
    • – ein Metallenhancementreagens
    • – Reagentien für die Biotinylierung
  • Ein Kit zum Färben von Abschnitten erlaubt es einem geschulten Fachmann, einen oder mehrere Schritte des hier offenbarten Verfahrens auf geeignete Weise durchzuführen. Der Kit kann es erlauben, ein erfindungsgemäßes Verfahren durchzuführen, ohne die Notwendigkeit, die Konzentrationen von Reagentien zu messen oder zu bestimmen, wodurch ein schnelles und reproduzierbares Färben von Abschnitten möglich gemacht wird.
  • Ein Kit für das Färben von Abschnitten ermöglicht es einer geschulten Person, ein oder mehrere der hier offenbarten Verfahren durchzuführen. Der Kit kann ein oder mehrere zusätzliche Gefäße umfassen, in denen Reagentien vorliegen, was es der geschulten Person ermöglicht, das vollständige Verfahren durchzuführen. Alternativ kann der Kit eine Mindestanzahl von Gefäßen, wie beispielsweise nur den Streptavidin-Metallteilchen-Komplex, umfassen, was es einer geschulten Person ermöglicht, das hier offenbarte Verfahren durchzuführen.
  • Der Kit kann Anwendungsanweisungen enthalten. Die Anweisungen beschreiben ein erfindungsgemäßes Verfahren, wie hier offenbart.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Färben von Abschnitten von Zellen kann ebenso gut an irgendeiner Zelle oder irgendeinem Gewebe bei Anwendungen der Fließzytometrie und der in situ-Hybridisierung durchgeführt werden, wobei die Sichtbarmachung von Zellen und Geweben notwendig ist. Aufgrund der Empfindlichkeit des Verfahrens, wie hier offenbart, können Zielantigene. (Proteine und andere Substanzen) in Geweben und Zellen mit Antikörpern sichtbar gemacht werden und unter Anwendung der in situ-Hybridisierung können sie durch Anwendung von Nukleinsäuresonden sichtbar gemacht werden.
  • BEISPIELE
  • Abschnitt 1: Materialien und Verfahren
  • Oligonukleotide
    Figure 00740001
  • Die oben erwähnten Oligonukleotide sind vom Anthraxlethalfaktorgenom derivatisiert.
  • Mit Nylon oder Nitrocellulose beschichtete Objektträger
  • Beschichtete Objektträger, wie beispielsweise mit Nytran beschichtete Objektträger, mit Nitrocellulose beschichtete Objektträger wurden von Schleicher und Schuell erworben und mit DNA-Abfangnukleotiden unter Anwendung einer MICROCAST-Mikroarrayvorrichtung gedruckt.
  • Modifizierte DNA-Oligonukleotide wurden durch Eurogentec (Belgien) kundenspezifisch hergestellt und in verschiedenen Konzentrationen in Druckpuffer (6 × SSC) gelöst.
  • Die Mikroarrays wurden durch Drucken verschiedener Oligonukleotidkonzentrationen im Bereich von 0,001 μm bis 20 μm auf den beschichtete Glasobjektträger hergestellt. Die negativen Kontrollen bestanden aus Druckpuffer ohne DNA-Oligonukleotide und Druckpuffer mit einem DNA-Oligonukleotid, das zu einer nichtverwandten Sequenz in der gleichen Konzentration wie das Abfangoligonukleotid, das von Interesse ist, komplementär war. Nach dem Trocknen für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Objektträger 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt. Die mit DNA bedruckten, mit Nytran beschichteten Objektträger wurden mit Hilfe von UV-Strahlung den vorher beschriebenen Protokollen gemäß vernetzt.
  • Die Objektträger wurden staubfrei bei 4°C bis zur weiteren Analyse gelagert.
  • Mit Silan beschichtete Objektträger
  • Mit Silan beschichtete Objektträger wurden von Schleicher und Schuell erworben und mit DNA-Oligonukleotiden unter Anwendung einer MICROCAST-Mikroarrayvorrichtung bedruckt.
  • DNA-Oligonukleotide wurden von Eurogentec (Belgien) kundenspezifisch hergestellt und in verschiedenen Konzentrationen in Druckpuffer gelöst. Mit Silan beschichtete Objektträger und modifizierte Oligonukleotide wurden den vorher beschriebenen Protokollen gemäß aktiviert.
  • Mikroarrays wurden durch Drucken verschiedener Oligonukleotidkonzentrationen im Bereich von 0,001 μm bis 20 μm auf die aktivierten, mit Silan beschichteten Glasobjektträger hergestellt. Nach 30 Minuten langem Trocknen bei Raumtemperatur wurden die bedruckten Objektträger staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Klassische Glasobjektträger
  • Klassische mikroskopische Glasobjektträger wurden mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt vom Eintauchen in eine 10%-ige NaOH-Lösung bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung für 30 Minuten. Nach mehreren Waschvorgängen unter fließendem Leitungswasser wurden die Objektträger mehrere Male mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen. Daraufhin wurden die Objektträger bei 80°C getrocknet.
  • Modifizierte Oligonukleotide wurden aktiviert und mit Aminosilan den vorher beschriebenen Protokollen gemäß gekoppelt (Kumar et al. Silanized nucleic acids: a general platform for DNA immobilization (Silanisierte Nukleinsäuren: eine allgemeine Plattform für die DNA-Immobilisierung). Nucleic acids res 2000; 28: Seite 71). Die silanisierte Oligonukleotide wurden in Druckpuffer (50% DMSO) gelöst und wie oben beschrieben gedruckt.
  • Bedrucken der Mikroarrays
  • Mikroarrays wurden mit jeder Konzentration von Abfangoligonukleotiden und den oben beschriebenen geeigneten negativen Kontrollen insgesamt sechsmal bedruckt.
  • Abschnitt 2: Versuche zum Vergleichen der Erfassungsverfahren unter Anwendung von Gold- und Enzymsichtbarmachungen in Kombination mit der Polymeramplifizierung und anderen Technologien
  • Teil 1 – Sichtbarmachungsversuche gelabelter Oligonukleotide in den oben beschriebenen Feststoffassays
  • Versuch 1 – Teil 1: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide mit Hilfe von Streptavidin
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal mit Hilfe biotinylierter Sonden getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), das mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin/alkalischer Phosphatase (Konzentration 1/1000 in PBS/Proteinpuffer) (Roche Deutschland) 60 Minuten inkubiert, gefolgt vom dreimaligen Waschen mit PBS/Proteinpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die alkalische Phosphatasereaktion wurde durch Inkubieren der Objektträger mit Naphtholsubstrat in geeignetem Puffer (Dako, Dänemark) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur entwickelt.
  • Versuch 2 – Teil 1: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von mit Goldteilchen gelabeltem Streptavin
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialpuffer (PBS, pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin/Gold 0,8 nm (Konzentration 1/50 in Waschpuffer) oder 6 nm (Konzentration 1/20 in Waschpuffer) (Sigma, USA) 120 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechsmaligem Waschen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal fünf Minuten lang mit PBS, gefolgt von destilliertem Wasser, gespült. Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement (Sigma USA) 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 3 – Teil 1: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von mit Goldteilchen gelabelten monoklonalen Antikörpern
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), das mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minutenlang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS, pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit monoklonalem Antikörper/Gold 0,8 nm (Konzentration 1/50 in Waschpuffer), 6 nm (Konzentration 1/20 in Waschpuffer) oder 30 nm 120 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal fünf Minuten lang mit PBS, gefolgt von destilliertem Wasser, gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 4 – Teil 1: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von mit Goldteilchen gelabelten polyklonalen Antikörpern
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), das mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS, pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit monoklonalem Antikörper/Gold 0,8 nm (Konzentration 1/50 in Waschpuffer), 6 nm (Konzentration 1/20 in Waschpuffer) 120 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal fünf Minuten lang mit PBS, gefolgt von destilliertem Wasser, gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 5 – Teil 1: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von biotinylierten monoklonalen und polyklonalen Streptavidin-Gold-Antikörpern gefolgt von mit Gold gelabeltem Streptavidin
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), das mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS, pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit biotinyliertem monoklonalem oder biotinyliertem polyklonalem Antikörper, der mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Versuch 6 – Teil 1: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von mit Gold gelabeltem Streptavidin gefolgt von biotinyliertem Albumin und Goldteilchen
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialpuffer (PBS, pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Albumin, das mit zahlreichen Biotinmolekülen beschichtet und mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer gefolgt von destilliertem Wasser.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 7 – Teil 1: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von supermagnetischen Teilchen von 200 nm, die mit Streptavidin gefolgt von biotinyliertem Albumin und Goldteilchen beschichtet worden sind
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialpuffer (PBS, pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Nanoteilchen von 200 nm, die mit Streptavidin beschichtet waren, inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Albumin, das mit zahlreichen Biotinmolekülen beschichtet und mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer gefolgt von destilliertem Wasser.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 8 – Teil 1: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von Teilchen von 200 nm, die mit Streptavidin, gefolgt von Polymer und Goldteilchen beschichtet worden sind
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), das mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialpuffer (PBS, pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Nanoteilchen von 200 nm, die mit Streptavidin beschichtet waren, inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Dextranpolymer oder Poly-L-Lysinpolymer, das mit zahlreichen Biotinmolekülen beschichtet und mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer gefolgt von destilliertem Wasser.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Teil 2: Hybridisierungsversuche an gelabelten Oligonukleotiden, die an den oben beschriebenen festen Assays angebracht sind
  • Versuch 2.1 – Teil 2: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von Streptavidin
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft, einschließlich ausreichender positiver und negativer Kontrollen. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden mit Hybridisierungsmischung, die mit beschallter Heringssperma-DNA (150 μg/5 ml Hybridisierungsmischung) ergänzt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
  • Der Hybridisierungsassay wurde unter Anwendung von Target-DNA, die aus gelabeltem Oligonukleotid in einer Konzentration von 250 ng/ml Hybridisierungsmischung bestand, durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin/alkalischer Phosphatase (Konzentration 1/1000 in PBS/Proteinpuffer) 60 Minuten lang inkubiert, gefolgt von drei Waschvorgängen mit PBS/Proteinpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die alkalische Phosphatasereaktion wurde durch Inkubieren der Objektträger mit Naptholsubstrat in geeignetem Puffer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur entwickelt.
  • Versuch 2.2 – Teil 2: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von Streptavidin, das mit Goldteilchen gelabelt war
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden mit Hybridisierungsmischung, die mit beschallter Heringssperma-DNA (150 μg/5 ml Hybridisierungsmischung) ergänzt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
  • Der Hybridisierungsassay wurde unter Anwendung von Target-DNA, die aus gelabeltem Oligonukleotid in einer Konzentration von 250 ng/ml Hybridisierungsmischung bestand, durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), das mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt worden war) 5 Minuten lang gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin/Gold von 0,8 nm (Konzentration 1/50 in Waschpuffer) oder 6 nm (Konzentration 1/20 in Waschpuffer) 120 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal im Laufe von fünf Minuten mit PBS, gefolgt von destilliertem Wasser gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 3 – Teil 2: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung monoklonaler Antikörper, die mit Goldteilchen gelabelt sind
  • Mikroarrays wurden wie vorher beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden mit Hybridisierungsmischung, die mit beschallter Heringssperma-DNA (150 μg/5 ml Hybridisierungsmischung) ergänzt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
  • Der Hybridisierungsassay wurde unter Anwendung von Target-DNA, die aus gelabeltem Oligonukleotid in einer Konzentration von 250 ng/ml Hybridisierungsmischung bestand, durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), das mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit monoklonalem Antikörper/Gold 0,8 nm (Konzentration 1/50 in Waschpuffer) oder 6 nm (Konzentration 1/20 in Waschpuffer) oder 30 nm 120 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal im Laufe von fünf Minuten mit PBS, gefolgt von destilliertem Wasser gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 4 – Teil 2: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung polyklonaler Antikörper, die mit Goldteilchen gelabelt sind
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden mit Hybridisierungsmischung, die mit beschallter Heringssperma-DNA (150 μg/5 ml Hybridisierungsmischung) ergänzt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
  • Der Hybridisierungsassay wurde unter Anwendung von Target-DNA, die aus gelabeltem Oligonukleotid in einer Konzentration von 250 ng/ml Hybridisierungsmischung bestand, durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit monoklonalem Antikörper/Gold 0,8 nm (Konzentration 1/50 in Waschpuffer) oder 6 nm (Konzentration 1/20 in Waschpuffer) 120 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal im Laufe von fünf Minuten mit PBS, gefolgt von destilliertem Wasser gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 5 – Teil 2: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von biotinylierten monoklonalen und polyklonalen Streptavidin-Gold-Antikörpern, gefolgt von Streptavidin, das mit Goldteilchen gelabelt ist
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert. Die Objektträger wurden mit Hybridisierungsmischung, die mit beschallter Heringssperma-DNA (150 μg/5 ml Hybridisierungsmischung) ergänzt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
  • Der Hybridisierungsassay wurde unter Anwendung von Target-DNA, die aus gelabeltem Oligonukleotid in einer Konzentration von 250 ng/ml Hybridisierungsmischung bestand, durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit biotinyliertem monoklonalem oder biotinyliertem polyklonalem Antikörper, der mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Sreptavidin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Versuch 6 – Teil 2: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von mit Gold gelabeltem Streptavidin gefolgt von biotinyliertem Albumin und Goldteilchen
  • Die Objektträger wurden mit Hybridisierungsmischung, die mit beschallter Heringssperma-DNA (150 μg/5 ml Hybridisierungsmischung) ergänzt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
  • Der Hybridisierungsassay wurde unter Anwendung von Target-DNA, die aus gelabeltem Oligonukleotid in einer Konzentration von 250 ng/ml Hybridisierungsmischung bestand, durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Albumin, das mit zahlreichen Biotinmolekülen beschichtet und mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer gefolgt von destilliertem Wasser.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 7 – Teil 2: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von supermagnetischen Teilchen von 200 nm, die mit Streptavidin, gefolgt von biotinyliertem Albumin und Goldteilchen beschichtet worden sind
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert. Die Objektträger wurden mit Hybridisierungsmischung, die mit beschallter Heringssperma-DNA (150 μg/5 ml Hybridisierungsmischung) ergänzt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
  • Der Hybridisierungsassay wurde unter Anwendung von Target-DNA, die aus gelabeltem Oligonukleotid in einer Konzentration von 250 ng/ml Hybridisierungsmischung bestand, durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), das mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt worden war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit 200 nm Nanoteilchen, die mit Streptavidin beschichtet waren, inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Albumin, das mit zahlreichen Biotinmolekülen beschichtet und mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer gefolgt von destilliertem Wasser.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Versuch 8 – Teil 2: Sichtbarmachung gelabelter Oligonukleotide unter Anwendung von Teilchen von 200 nm, die mit Streptavidin, gefolgt von Polymer und Goldteilchen beschichtet worden waren
  • Mikroarrays wurden wie oben beschrieben bedruckt. Alle Konzentrationen im Bereich vom 0,001 μm bis 20 μm wurden sechsmal getupft. Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden mit Hybridisierungsmischung, die mit beschallter Heringssperma-DNA (150 μg/5 ml Hybridisierungsmischung) ergänzt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
  • Der Hybridisierungsassay wurde unter Anwendung von Target-DNA, die aus gelabeltem Oligonukleotid in einer Konzentration von 250 ng/ml Hybridisierungsmischung bestand, durchgeführt. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt worden war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Nanoteilchen von 200 nm, die mit Streptavidin beschichtet waren, inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Dextranpolymer oder Poly-L-Lysinpolymer, das mit zahlreichen Biotinmolekülen beschichtet und mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer gefolgt von destilliertem Wasser.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Ergebnisse von Versuchen ohne Signalamplifizierung:
  • Versuch 1 – Sichtbarmachung mit Streptavidin-Enzym
  • Die Hybridisierung wurde je nach dem verwendeten Enzym und Substrat als dunkelrote oder dunkelbraune Flecken sichtbar gemacht. Die Flecken waren ohne weiteres gegen den weißen Hintergrund des Objektträgers erkennbar. Es lag keine Hintergrundverfärbung vor. Das Sichtbarmachen wurde durch eine getüpfelte molekulare Sondenkonzentration im Bereich von 0,2 mM bis 0,02 mM erreicht.
  • Versuch 2 – Sichtbarmachung mit Streptavidin-Gold von 0,8 nm und 6 nm
  • Die Hybridisierung wurde je nach dem verwendeten Metallenhancement als tiefschwarz-graue Flecken sichtbar gemacht. Die Flecken waren ohne weiteres gegen den weißen Hintergrund des Objektträgers erkennbar. Es lag keine Hintergrundverfärbung vor. Das Sichtbarmachen wurde durch eine getüpfelte molekulare Sondenkonzentration im Bereich von 0,2 mM bis 0,02 mM erreicht.
  • Versuch 3 – Sichtbarmachung mit monoklonalen Mausantikörpern mit Gold von 0,8 nm und 6 nm
  • Die Hybridisierung wurde je nach dem verwendeten Metallenhancement als tiefschwarze Flecken sichtbar gemacht. Die Flecken waren ohne weiteres gegen den weißen Hintergrund des Objektträgers erkennbar. Es lag keine Hintergrundverfärbung vor. Das Sichtbarmachen wurde durch eine getüpfelte molekulare Sondenkonzentration im Bereich von 0,2 mM bis 0,002 mM erreicht. Jedoch war das Signal bei Gold von 6 nm im Vergleich mit Gold von 0,8 nm stärker und schärfer als beim Streptavidin-Gold-Verfahren. Im Vergleich mit polyklonalen Antikörpern war das Signal etwas schärfer.
  • Versuch 3 – Sichtbarmachung mit monoklonalen Mausantikörpern mit Gold von 30 nm
  • Die Hybridisierung wurde schwach als hellrosa Flecken nur in der höchsten Fleckenkonzentration von 0,2 mM sichtbar gemacht. Das Metallenhancement ergab keine signifikante Signalverstärkung. Die Hintergrundverfleckung war beträchtlich.
  • Versuch 4 – Sichtbarmachung mit polyklonalen Ziegenantikörpern mit Gold von 0,8 nm und 6 nm
  • Die Hybridisierung wurde je nach dem verwendeten Metallenhancement als tiefschwarze Flecken sichtbar gemacht. Die Flecken waren ohne weiteres gegen den weißen Hintergrund des Objektträgers erkennbar. Es lag keine Hintergrundverfärbung vor. Das Sichtbarmachen wurde durch eine getüpfelte molekulare Sondenkonzentration im Bereich von 0,2 mM bis 0,002 mM erreicht. Jedoch war das Signal bei Gold von 6 nm im Vergleich mit Gold von 0,8 nm stärker und schärfer als beim Streptavidin-Gold-Verfahren.
  • Ergebnisse der Versuche mit Signalamplifizierung:
  • Versuch 5 – Sichtbarmachung mit Streptavidin/mit Gold biotinylierten monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, gefolgt von Streptavidin, das mit Gold gelabelt war
  • Die Hybridisierung wurde als tiefschwarze Flecken sichtbar gemacht. Die Flecken waren ohne weiteres gegen den weißen Hintergrund des Objektträgers erkennbar. Die Hintergrundverfleckung war leicht. Das Sichtbarmachen wurde durch eine getüpfelte molekulare Sondenkonzentration im Bereich von 0,1 mM bis 0,0001 mM erreicht.
  • Versuch 6 – Sichtbarmachung von mit Gold gelabeltem Streptavidin (Gold von 0,8 nm, 6 nm und 30 nm), gefolgt vom biotinylierten Albumin und Goldteilchen von 0,6, 6 nm und 30 nm
  • Die Hybridisierung wurde je nach dem verwendeten Metallenhancement als tiefschwarze Flecken sichtbar gemacht. Die Flecken waren ohne weiteres gegen den weißen Hintergrund des Objektträgers erkennbar. Die Hintergrundfleckenbildung war sehr gering. Das Sichtbarmachen wurde durch eine getüpfelte molekulare Sondenkonzentration im Bereich von 0,1 mM bis 0,0001 mM erreicht. Jedoch war das Signal bei Gold von 0,8 nm im Vergleich mit Gold von 6 nm stärker und schärfer als beim Streptavidin-Enzym-Verfahren. Die Goldteilchen von 30 nm ergaben eine leicht rosa Reaktion, die mit dem nackten Auge kaum erfassbar war.
  • Versuch 7 – Sichtbarmachung mit superparamagnetischen Teilchen 200 nm-Streptavidin/Gold-Albumin/Gold/Biotin
  • Die Hybridisierung wurde als tiefgraue bis schwarzbraune Flecken sichtbar gemacht. Die Flecken waren ohne weiteres gegen den weißen Hintergrund des Objektträgers erkennbar. Die Hintergrundfleckenbildung war gering bis mittelmäßig. Das Sichtbarmachen wurde durch eine getüpfelte molekulare Sondenkonzentration im Bereich von 0,2 mM bis 0,0002 mM erreicht.
  • Versuch 8 – Sichtbarmachung mit Streptavidin Gold von 0,8 nm und -Polymer/Gold von 6 nm
  • Die Hybridisierung wurde je nach dem verwendeten Metallenhancement als tiefschwarze Flecken sichtbar gemacht. Die Flecken waren ohne weiteres gegen den weißen Hintergrund des Objektträgers erkennbar. Eine Hintergrundfleckenbildung lag nicht vor. Das Sichtbarmachen wurde durch eine getüpfelte molekulare Sondenkonzentration im Bereich von 0,2 mM bis 0,0002 mM erreicht. Jedoch war das Signal bei Gold von 6 nm im Vergleich mit Gold von 0,8 nm stärker und schärfer als beim Streptavidin-Gold-Verfahren.
  • Abschnitt 3: Erfassen und Subtypieren von HPV-DNA
  • Mikroarrays wurden wie vorher beschrieben unter Anwendung spezifischer Oligonukleotide, die HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 52 und HPV 58 erfassen, bedruckt. Die Oligonukleotide wurden in Druckpuffer gelöst, was zu einer Endkonzentration von 10 μm führte und wurden sechsmal fleckenförmig aufgetragen, einschließlich ausreichender positiver und negativer Kontrollen, unter Anwendung einer manuellen Arrayvorrichtung.
  • Dies resultiert in einem Mikroarray mit 7 Reihen, wobei jede Reihe aus sechs identischen Flecken besteht, was die sieben oben beschriebenen HPV-Typen darstellt. Die negativen Kontrollen bestanden aus Druckpuffer ohne DNA und eine zweite negative Kontrolle bestand aus einem Oligonukleotid, das für ein nicht verwandtes Gensegment kodiert und wurden als zwei Reihen gedruckt, die aus sechs Flecken bestanden, wobei eine Reihe aus Druckpuffer ohne DNA und eine andere Reihe aus nicht verwandtem DNA-Oligonukleotid bestand.
  • Die positive Kontrolle bestand aus einer äquimolaren Mischung der oben beschriebenen HPV-Typ-spezifischen Oligonukleotide, die in einer Reihe gedruckt waren, die aus sechs identischen Flecken bestand.
  • Nach dem Drucken wurden die Mikroarrays bei Raumtemperatur 15 Minuten lang an der Luft getrocknet.
  • Die Mikroarrays wurden 30 Minuten lang bei 80°C gebrannt und bis zur Verwendung staubfrei bei 4°C gelagert.
  • Die Objektträger wurden mit Hybrimix Hybridisierungspuffer (Sigma, USA), der mit beschallter Heringssperma-DNA (150 μg/5 ml Hybridisierungsmischung) (Sigma, USA) ergänzt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
  • Hybridisierung mit PCR-gelabeltem Amplifikationsprodukt
  • Der Hybridisierungsassay wurde unter Anwendung von durch PCR amplifizierter HPV-DNA durchgeführt.
  • Während der PCR-Reaktion wurde das Amplifikationsprodukt mit Hilfe eines mit Biotin gelabelten Primers gelabelt. In einem anderen Versuch wurde die PCR mit zwei ungelabelten Primern durchgeführt.
  • Zehn Mikroliter des PCR-Amplifikationsprodukts wurden mit 10 μl Denaturierungslösung (NAOH/EDTA) denaturiert. Die denaturierte DNA-Lösung wurde 2 ml Hybridisierungsmischung hinzugegeben. Die Mikroarrays wurden mit einem Deckgläschen bedeckt und über Nacht bei 37°C in einer feuchten Kammer hybridisiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC, das mit 0,1% SDS ergänzt war, bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4, das mit 3% Protein ergänzt war) gewaschen.
  • Die Hybridisierung des mit Biotin gelabelten PCR-Produkts wurde unter Anwendung eines der oben beschriebenen Verfahren enthüllt.
  • Sichtbarmachung mit Streptavidin-alkalischer Phosphatase
  • Es wurden Objektträger mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden mit Streptavidin/alkalischer Phosphatase (Konzentration 1/1000 in PBS/Proteinpuffer) 60 Minuten lang inkubiert, gefolgt von drei Waschvorgängen mit PBS/Proteinpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die alkalische Phosphatasereaktion wurde durch Inkubieren der Objektträger mit Naptholsubstrat in geeignetem Puffer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur entwickelt.
  • Sichtbarmachung mit Streptavidin-Gold
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin/Gold von 0,8 nm (Konzentration 1/50 in Waschpuffer) oder 6 nm (Konzentration 1/20 in Waschpuffer) 120 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal fünf Minuten lang mit PBS gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Sichtbarmachung mit mono- oder polyklonalem Antibiotin-Antikörper
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), das mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit monoklonalem oder polyklonalem Antikörper/Gold von 0,8 nm (Konzentration 1/50 in Waschpuffer) oder 6 nm (Konzentration 1/20 in Waschpuffer) 120 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal fünf Minuten lang mit PBS gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Sichtbarmachung unter Anwendung von Streptavidin-Gold gefolgt von der Signalamplifizierung mit der Technologie von biotinyliertem Polymer
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Dextranpolymer oder Poly-L-Lysinpolymer, das mit zahlreichen Biotinmolekülen beschichtet war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer.
  • Die Objektträger wurden mit monoklonalem oder polyklonalem Antibiotin-Antikörper oder Streptavidin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 60 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal fünf Minuten lang mit PBS gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Hybridisierung mit ungelabeltem PCR-Amplifikationsprodukt, Sichtbarmachung unter Anwendung eines Einlagerungsmittels, Signalamplifizierung mit Polymertechnologie und Gold
  • Es wurde ein Hybridisierungsassay unter Anwendung von mit PCR amplifizierter HPV-DNA durchgeführt.
  • In diesem Teil des Versuchs wurde die PCR mit zwei ungelabelten Primern durchgeführt.
  • Zehn Mikroliter des PCR-Amplifikationsprodukts wurden mit 10 μl denaturierter Lösung (NAOH/EDTA) denaturiert. Die denaturierte DNA-Lösung wurde 2 ml Hybridisierungsmischung hinzugegeben. Die Mikroarrays wurden mit einem Deckgläschen bedeckt und über Nacht bei 37°C in einer feuchten Kammer hybridisiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit 2 × SSC, das mit 0,1% SDS ergänzt war, bei Raumtemperatur gewaschen.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war) gewaschen.
  • Die Hybridisierung des ungelabelten PCR-Produkts mit seinem Abfangoligonukleotid am Mikroarray wurde unter Anwendung eines Einlagerungsmittels, Typ DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid), das mit Streptavidin gekoppelt war, enthüllt.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit Dapi oder Doxorubicin, das mit Streptavidin konjugiert war, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 60 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit biotinyliertem Albumin/Gold oder Poly-L-Lysinpolymer, das mit Biotinmolekülen beschichtet war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 60 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal fünf Minuten lang mit PBS gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Die hybridisierten Mikroarrays wiesen Bereiche mit sehr scharfen schwarzen oder rot gefärbten Flecken in einigen Bereichen, je nach dem verwendeten Substrat, auf. Andere Bereiche zeigten keinerlei Signal auf. Es lagen keinerlei Hintergrundsignale vor. Die Hybridisierung wurde als leicht erkennbare helle tiefrot gefärbte Flecken bei Verwendung der Alkaliphosphatasetechnik zum Sichtbarmachen oder als tiefgraue bis schwarze Flecken bei Anwendung der Goldmetallenhancementtechnologie enthüllt. Die Ergebnisse waren mit dem nackten Auge leicht zu beurteilen. Die besten Ergebnisse wurden mit mit Gold gelabelten Antikörpern, die bei einer Polymeramplifikationstechnik und einem Streptavidin-Gold-Albuminverfahren verwendet wurden, erhalten.
  • Die negativen Kontrollen wiesen keinerlei Zeichen von Positivität auf. Die positive Kontrolle war stark positiv. Bei einem Versuch wurde das Vorliegen von HPV 16 aufgezeigt und bei einem anderen Versuch wurde das Vorliegen von HPV 18 hervorgehoben. Eine Kreuzhybridisierung mit anderen molekularen Sonden wurde nicht beobachtet. Proben ohne HPV DNA gaben kein Signal am Mikroarray ab.
  • Abschnitt 4: Anwendung von Immunhistochemie: Sichtbarmachung von monoklonalen in situ-Antikörpern unter Anwendung von mit Gold gelabelten monoklonalen und polyklonalen Antikörpern bei einer durch Polymer verbesserten Amplifikationstechnik.
  • Abschnitte von 5 μm wurden aus in Paraffin eingebettetem, mit Formalin fixiertem Gewebe von Lungenplattenepithelkarzinom ausgeschnitten und an mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern befestigt, bei 55°C über Nacht getrocknet und staubfrei bei Raumtemperatur gelagert. Die Abschnitte wurden durch zwei Spülungen mit Xylolersatz entparaffinisiert, gefolgt vom erneuten Hydratisieren in abnehmender Reihenfolge von Alkoholen bis herunter zu entionisiertem Wasser. Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4) gewaschen und mit monoklonalem Anti-ema-(Epithel-Membran-Antigen-)Mausantikörper (Dakopatts, Dänemark), den Anweisungen des Herstellers gemäß inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit PBS (pH-Wert 7,4), der mit 3% Protein ergänzt war, gewaschen.
  • Die Objektträger wurden mit der gleichen PBS/Proteinpufferlösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger wurden zweimal mit Spezialwaschpuffer (PBS pH-Wert 7,4, der mit 0,2% Protein ergänzt war) 5 Minuten lang gewaschen und mit dem gleichen Waschpuffer inkubiert.
  • Die Objektträger wurden mit biotinyliertem monoklonalem oder polyklonalem Antimaus-Antikörper, der mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 60 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden mit Streptavidinpolymer (Dextran oder Poly-L-Lysin), das mit Goldteilchen beschichtet war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer.
  • Wahlweise wurden die Objektträger mit biotinyliertem Albumin, das mit Goldteilchen im Bereich von 0,8 nm bis 40 nm gelabelt war, 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von sechs Waschvorgängen mit Waschpuffer bei Raumtemperatur.
  • Die Objektträger wurden dreimal fünf Minuten lang mit PBS, gefolgt von destilliertem Wasser gespült.
  • Die Goldteilchen wurden durch Metallenhancement 15 Minuten lang sichtbar gemacht.
  • Die Ergebnisse zeigten eine klare und scharfe Färbung mit ausgezeichnetem Kontrast.

Claims (48)

  1. Verfahren für die quantitative und/oder qualitative Erfassung von einer oder mehreren Komponenten in einer Probe, wobei jede Komponente dazu fähig ist, sich an eine Sonde zu binden, umfassend Schritte in folgender Reihenfolge: (a) Aufbringen einer oder mehrerer Proben auf einen festen Träger, (b) Kontaktieren des festen Trägers mit einer oder mehreren biotingelabelten Sonden, (c) Kontaktieren des festen Trägers mit einem Streptavidin-Metallteilchen-Komplex, (d) Kontaktieren des festen Trägers mit Konjugat umfassend: – ein oder mehrere Biotine, – ein oder mehrere Polymere und – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind, (e) wahlweises Kontaktieren des festen Trägers mit Metallenhancementreagens und (f) Lesen des festen Trägers zum quantitativen und/oder qualitativen Erfassen der Komponente.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt (a) durch: (a) Aufbringen einer oder mehrerer Sonden auf den festen Träger ersetzt wird und der Schritt (b) durch: (b) Kontaktieren des festen Trägers mit biotingelabelter Probe ersetzt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei dem Schritt (a) Folgendes vorausgeht: (aO) Aufbringen einer oder mehrerer Sonden auf den festen Träger.
  4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der feste Träger mit vorher aufgebrachter Sonde beliefert und Schritt (a) des Anspruchs 2 oder Schritt (aO) des Anspruchs 3 nicht durch den Anwender durchgeführt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Lesen des Schritts (f) die Verwendung einer Farbtafel umfasst.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Lesen des Schritts (f) eine Verwendung eines Geräts umfasst, das für das Erfassen von Änderungen der Leitfähigkeit und/oder des Stroms über den festen Träger geeignet ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Lesen des Schritts (f) eine Verwendung eines Geräts umfasst, das für das Erfassen von Änderungen im Magnetfeld auf dem festen Träger geeignet ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Lesen des Schritts (f) eine Verwendung eines Geräts umfasst, das für das Erfassen von Änderungen in der Oberflächenplasmonresonanz auf dem festen Träger geeignet ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Metallenhancementreagens des Schritts (e) ein Silberenhancementreagens ist.
  10. Kit für die quantitative und/oder qualitative Erfassung von einer oder mehreren Komponenten in einer Probe, wobei jede Komponente dazu fähig ist, sich an eine Sonde zu binden, umfassend: – Streptavidin-Metallteilchen-Komplex, – einen festen Träger und – Konjugat umfassend: – Biotin, – Polymer und – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind.
  11. Kit nach Anspruch 10, des Weiteren umfassend: – eine oder mehrere Sonden.
  12. Kit nach Anspruch 11, wobei die Sonden biotinyliert sind.
  13. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der feste Träger mit einer oder mehreren Sonden vorbeladen ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Polymer eines Konjugats ein biologisch inertes Polymer ist, das dazu fähig ist, sich an ein oder mehrere Metallteilchen zu binden.
  15. Verfahren oder Kit nach Anspruch 14, wobei ein Polymer eines von Albumin oder Dextran ist.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 14 oder 15 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Konjugat ein oder mehrere Teilchen von Gold, Silber, Eisen, Nickel, Gadolin, Blei, Uran, Cäsium, Platin, Rhodium, Technetium, Tellur, Selen, Silicium, Silicium, Kupfer, Zinn, Rhenium, Europium, Aluminium, Germanium, Chrom, Cadmium, Niob, Titan, Magnesium, Mangan, Molybdän, Antimon, Americium, Lithium und/oder Wolfram umfasst.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 14 oder 15 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Konjugat ein oder mehrere Goldteilchen umfasst.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 14 oder 15 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Konjugat ein oder mehrere Silberteilchen umfasst
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 14 bis 18 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 18, wobei die Metallteilchen des Konjugats einen Durchmesser zwischen 0,6 und 40 nm aufweisen.
  20. Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 10 bis 19 bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und 14 bis 19.
  21. Kit für das Verbessern der Bilderkennung einer oder mehrerer Komponenten in einem System durch Magnetresonanzbilderkennung, wobei jede Komponente dazu fähig ist, sich an eine Sonde zu binden, umfassend – eine oder mehrere biotingelabelte Sonden, – Streptavidin-Metallteilchen-Komplex und – Konjugat umfassend: – Biotin, – Polymer und – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 14 bis 19 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19 und 21, wobei die Sonde ein Antikörper, eine Nucleinsäure, eine Peptidnucleinsäure, ein Polypeptid oder Peptidligand ist.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 14 bis 19 und 22 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 und 22, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex ein oder mehrere Teilchen von Gold, Silber, Eisen, Nickel, Gadolin, Blei, Uran, Cäsium, Platin, Palladium, Rhodium, Technetium, Tellur, Selen, Silicium (Silicium), Kupfer, Zinn, Rheniun, Europium, Aluminium, Germanium, Chrom, Cadmium, Niob, Titan, Magnesium, Mangan, Molybdän, Antimon, Americium, Lithium und/oder Wolfram umfasst.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21, 23, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex in oder mehrere Goldteilchen umfasst.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 23, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex ein oder mehrere Silberteilchen umfasst
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 25, oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 25, wobei die Metallteilchen des Streptavidin-Metallteilchen-Komplexes einen Durchmesser zwischen 0,6 und 40 nm aufweisen.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 26, oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 26, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex Streptavidin und/oder Avidin umfasst.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 27, oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 27, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex und/oder das Konjugat ein oder mehrere superparamagnetische Teilchen umfasst.
  29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 28 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19 und 21 bis 28, wobei der Streptavidin-Metallteilchen-Komplex ein oder mehrere superparamagnetische Teilchen umfasst und wobei die Schritte (d) und (e) nicht durchgeführt werden.
  30. Verfahren oder Kit nach Anspruch 28 oder 29, wobei die superparamagnetischen Teilchen Eisenoxid umfassen.
  31. Verfahren oder Kit nach Anspruch 30, wobei der Eisenoxidgehalt eines superparamagnetischen Teilchens zwischen 30 und 80% liegt.
  32. Verfahren oder Kit nach einem der Ansprüche 28 bis 31, wobei die superparamagnetischen Teilchen einen Durchmesser zwischen 50 und 400 nm aufweisen.
  33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 32 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 32, wobei mindestens eine Sonde dazu fähig ist, sich an menschliches Papillomvirus zu binden.
  34. Verfahren oder Kit nach Anspruch 33, wobei die Sonde dazu fähig ist, sich an Beschichtungspolypeptid des menschlichen Papillomvirus zu binden.
  35. Verfahren oder Kit nach den Ansprüchen 33 oder 34 für die Erfassung, Diagnose und/oder Überwachung des Fortschreitens einer Infektion durch ein menschliches Papillomvirus (HPV).
  36. Kit nach den Ansprüchen 33 oder 34, wobei mindestens eine Sonde dazu fähig ist, sich an ein Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 52 und HPV 58 zu binden.
  37. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 32, oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 32, wobei die Sonde dazu fähig ist, sich an eine in Tabelle 1 aufgelistete Komponente zu binden.
  38. Verfahren oder Kit nach Anspruch 37 für die Erfassung, Diagnose und/oder Überwachung des Fortschreitens einer oder mehrerer oder der Anfälligkeit für eine oder mehrere der Krankheitszustände beim Menschen, wie in Tabelle 1 aufgelistet, durch Erfassen eines Polypeptids und/oder einer Nucleinsäure, das bzw. die einer Komponente darin entspricht.
  39. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 32 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 32, wobei mindestens eine Sonde dazu fähig ist, sich an eines von HCV, HIV, HBV, HTLV, Mykobakterien oder Staphylococcus aureus zu binden.
  40. Verfahren oder Kit nach Anspruch 39 für die Erfassung, Diagnose und/oder Überwachung des Fortschreitens von Infektionen, die durch eines oder mehrere von HCV, HIV, HBV, HTLV, Mykobakterien oder Staphylococcus aureus hervorgerufen werden.
  41. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 32 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 32, wobei mindestens eine Sonde dazu fähig ist, sich an eines oder mehrere von Beta-Amyloiden, hTAU, PhosphoTAU und APOE zu binden.
  42. Verfahren oder Kit nach Anspruch 41 zur Verwendung für die Erfassung, Diagnose und/oder Überwachung des Fortschreitens neurodegenerativer Krankheiten.
  43. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 32 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 32, wobei mindestens eine Sonde dazu fähig ist, sich an eines oder mehrere von ANA, Jo-1, Myeloperoxidase, RNP, Scl-70, Sm, SS-A, IgE, IgG-Subklassen und zirkulierenden Antikörpern zu binden.
  44. Verfahren oder Kit nach Anspruch 43 zur Verwendung für die Erfassung, Diagnose und/oder Überwachung des Fortschreitens maligner Krankheiten, Autoimmun- oder mit Allergie verbundener Krankheiten.
  45. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 32 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 32, wobei mindestens eine Sonde dazu fähig ist, sich an Trinkwasser verschmutzende Mikroorganismen zu binden.
  46. Verfahren oder Kit nach Anspruch 45 für die Umweltprüfung von Wasser auf Bakterien.
  47. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 15 bis 19 und 22 bis 32 oder Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 19, 21 bis 32 zur Verwendung für die Umweltprüfung von Nahrungsmittelbestandteilen auf genmodifizierte Komponenten, Listeria und Salmonella hin.
  48. Verfahren für das Färben von Komponenten in Zell- und/oder Gewebeabschnitten, wobei das Färben für das Sichtbarmachen mit Hilfe von Mikroskopie geeignet ist, umfassend die folgenden Schritte: A) Inkubieren des Abschnitts mit einer oder mehreren biotinylierten Sonden, die gegen die Komponenten gerichtet sind, B) Inkubieren des Abschnitts mit Streptavidin-Metallteilchen-Komplex, C) Inkubieren des Abschnitts mit Konjugat umfassend: – ein oder mehrere Biotine, – ein oder mehrere Polymere und – Metallteilchen, die an das Polymer gebunden sind und D) wahlweise Inkubieren des Abschnitts mit Metallenhancementreagens.
DE602004012330T 2004-04-29 2004-04-29 Verfahren und kit zum nachweis von bestandteilen in einer probe Expired - Lifetime DE602004012330T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2004/004547 WO2005111619A1 (en) 2004-04-29 2004-04-29 Method and kit for detecting components in a sample

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE602004012330D1 DE602004012330D1 (de) 2008-04-17
DE602004012330T2 true DE602004012330T2 (de) 2009-03-19

Family

ID=34957443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE602004012330T Expired - Lifetime DE602004012330T2 (de) 2004-04-29 2004-04-29 Verfahren und kit zum nachweis von bestandteilen in einer probe

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8227380B2 (de)
EP (1) EP1740951B1 (de)
JP (1) JP4511592B2 (de)
AT (1) ATE388404T1 (de)
DE (1) DE602004012330T2 (de)
WO (1) WO2005111619A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010038718B4 (de) * 2010-07-30 2016-02-25 Carl Zeiss Ag Messvorrichtung und Verfahren zum Bestimmen eines eine elektrische Eigenschaft einer Dünnschicht auf einem Träger beschreibenden ersten Parameters
US9383306B2 (en) 2014-11-26 2016-07-05 Universität Stuttgart Apparatus and a method for spectroscopic ellipsometry, in particular infrared spectroscopic ellipsometry

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050026165A1 (en) * 2001-05-31 2005-02-03 Cindy Orser Detection of conformationally altered proteins and prions
WO2005066613A1 (en) 2003-12-31 2005-07-21 President And Fellows Of Harvard College Assay device and method
US20100003704A1 (en) * 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
CN101754763B (zh) * 2007-05-31 2013-03-13 阿克伦大学 掺合入生物可降解纳米微粒中的金属络合物及其用途
US20120087914A1 (en) * 2008-03-27 2012-04-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Inhibition of trim62 activity reduces cancer cell proliferation
KR101504783B1 (ko) * 2010-04-05 2015-03-23 한국전자통신연구원 자기저항 센서를 이용한 알츠하이머병의 진단방법 및 알츠하이머병 진단용 자기비드―다중단백질 복합체
SG10201505769PA (en) 2010-07-27 2015-09-29 Genomic Health Inc Method for using gene expression to determine prognosis of prostate cancer
EP2594334A1 (de) 2011-11-21 2013-05-22 Drive O2 Probenfläschchen zur digitalen holographischen Analyse einer flüssigen Zellprobe
US9688979B2 (en) * 2013-06-11 2017-06-27 Biocartis Nv Biomolecule drying process for long-term storage
CN105259344A (zh) * 2015-11-16 2016-01-20 北京中航赛维生物科技有限公司 一种使用磁微粒化学发光定量检测抗Scl-70抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法
GB2552461B (en) * 2016-07-14 2022-06-15 Rightangled Ltd Method and assay kit to detect an analyte
EP3724637B1 (de) * 2017-12-15 2021-11-24 Politecnico di Milano Optomagnetische sensorvorrichtung und molekulares erkennungssystem
CN110132892B (zh) * 2019-04-26 2021-08-31 南京师范大学 一种热晕效应测量非线性折射率的方法
CN110749488B (zh) * 2019-12-05 2022-05-10 国网山东省电力公司电力科学研究院 土壤处理方法和检测土壤重金属的方法
KR102545843B1 (ko) * 2021-02-24 2023-06-20 주식회사 세바바이오텍 알러지, 아토피 및 가려움 개선용 기능성 소재의 스크리닝 방법
US20240125798A1 (en) * 2021-02-24 2024-04-18 Shebah Biotech Inc. Method for screening functional material palliative of allergy, atopy, and itchiness

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9028038D0 (en) * 1990-12-24 1991-02-13 Nycomed Pharma As Test method and reagent kit therefor
JPH04323560A (ja) * 1991-04-22 1992-11-12 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> レーザ磁気免疫測定に用いられる磁性微粒子標識材料並びに検体調整方法
US6924094B1 (en) * 1996-02-08 2005-08-02 Affymetrix, Inc. Chip-based species identification and phenotypic characterization of microorganisms
IL124322A (en) * 1998-05-04 2002-05-23 Technion Res & Dev Foundation Detection of an entity in a sample
US20030203394A1 (en) * 1998-05-04 2003-10-30 Yoav Eichen Detection of a target in a sample
JP2001249131A (ja) * 2000-03-07 2001-09-14 Mitsubishi Chemicals Corp 標識微粒子およびその製造方法
FR2810739B1 (fr) 2000-06-26 2007-01-26 Centre Nat Rech Scient Immunodosage electrochimiques a l'aide de marqueurs metalliques colloidaux
US7169618B2 (en) * 2000-06-28 2007-01-30 Skold Technology Magnetic particles and methods of producing coated magnetic particles
US6905816B2 (en) * 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
US8183060B2 (en) * 2001-09-19 2012-05-22 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. Luminescent polymer and use thereof in bioassay
AU2003232477A1 (en) * 2002-04-16 2003-10-27 Dot Diagnostics B.V. Human papilloma virus detection with dna microarray
US7176036B2 (en) * 2002-09-20 2007-02-13 Arrowhead Center, Inc. Electroactive microspheres and methods
US7442339B2 (en) * 2004-03-31 2008-10-28 Intel Corporation Microfluidic apparatus, Raman spectroscopy systems, and methods for performing molecular reactions

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010038718B4 (de) * 2010-07-30 2016-02-25 Carl Zeiss Ag Messvorrichtung und Verfahren zum Bestimmen eines eine elektrische Eigenschaft einer Dünnschicht auf einem Träger beschreibenden ersten Parameters
US9383306B2 (en) 2014-11-26 2016-07-05 Universität Stuttgart Apparatus and a method for spectroscopic ellipsometry, in particular infrared spectroscopic ellipsometry

Also Published As

Publication number Publication date
EP1740951A1 (de) 2007-01-10
US8227380B2 (en) 2012-07-24
JP4511592B2 (ja) 2010-07-28
WO2005111619A1 (en) 2005-11-24
US20080269064A1 (en) 2008-10-30
JP2007534948A (ja) 2007-11-29
ATE388404T1 (de) 2008-03-15
DE602004012330D1 (de) 2008-04-17
EP1740951B1 (de) 2008-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE602004012330T2 (de) Verfahren und kit zum nachweis von bestandteilen in einer probe
DE69516152T2 (de) Zusammensetzungen und verfahren zur anewndung in nachweis von analyten
DE69233703T2 (de) Verfahren und Vorrichtung für verbesserte Lumineszenztests
DE69010506T2 (de) Bestimmungsverfahren für biologische zielkomplexe auf der oberfläche eines biosensors.
JP4222756B2 (ja) 固相生体分子分析調製同定システム用コロイド組成物
JP5777269B2 (ja) 元素分析によって実施される遺伝子発現アッセイ
EP1658497B1 (de) Verfahren und kit zum quantitativen und/oder qualitativen nachweis von komponenten in einer probe
DE69731306T2 (de) Verfahren und kit zur bestimmung eines analyts mittels massenbestimmung
DE69326685T2 (de) Amplifikation von test reporters durch nukleinsäure replikation
KR19980081571A (ko) 다중 분석물을 동시 검출하기 위한 장치
WO2015117236A1 (en) Ultra-sensitive detection of extremely low level biological analytes using electrochemical signal amplification and biosensor
EP1969337A2 (de) Multiplex-testverfahren unter verwendung magnetischer und nichtmagnetischer partikel
CN105247366A (zh) 测试设备
EP1332365B1 (de) Verfahren und testkit zum nachweis von analyten in einer probe
US20030032029A1 (en) Three dimensional apparatus and method for integrating sample preparation and multiplex assays
EP0664452B1 (de) Biotinsilan-Verbindungen und diese Verbindungen enthaltende Bindematrix
AU8903998A (en) Electrochemical reporter system for detecting analytical immunoassay and mol ecular biology procedures
DE69709804T2 (de) Nachweis von nukleotidsequenzen durch signalamplifizierung
US20210003576A1 (en) Immunological composition for diagnosis of lung cancer by using autoantibody-antigen complex, diagnosis method for lung cancer by using same, and lung cancer diagnosis kit comprising same
JP2001502881A (ja) 高分子ペプチドプローブ及びその使用
DE60208946T2 (de) Reaktiver Träger zur Bestimmung von DNA Fragmenten
WO2008140620A2 (en) Ultra sensitive biomolecule detection using double stranded dna co-loaded gold nanoparticles and co-immobilized capture molecules
CA2353920A1 (en) Test system for detecting different markers, and production and use thereof
WO2024045220A1 (zh) 一种基于上转换发光的原位取样和靶标检测的生物传感平台
DE60308176T2 (de) Vorrichtung zur Präsentation von Polypeptiden, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendungen

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition