CN101754763B - 掺合入生物可降解纳米微粒中的金属络合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗癌症的化合物，该化合物含有具有预定特征的金属络合物，且其可掺合入聚合物纳米微粒或其他递送系统以递送该金属络合物使其作用于肿瘤细胞。其中，金属络合物用于治疗癌症，所述金属络合物为银(I)盐、银(I)大环金属络合物、银(I)N-杂环卡宾或其混合物。本发明还提供了一种银(I)大环金属络合物和一种银(I)N-杂环卡宾以及治疗哺乳动物中的癌细胞的方法，该方法包括例如通过将材料掺合入生物可降解的聚合物纳米微粒中而给予有效量的银(I)金属盐的步骤。

Description

掺合入生物可降解纳米微粒中的金属络合物及其用途

技术领域

本发明涉及金属络合物，其可用于治疗癌症。在一实例中，本发明涉及银金属络合物，其掺合入(incorporated within)诸如纳米微粒的生物可降解材料中，且用于治疗癌症。

背景技术

长期以来，金属银一直由于其抗菌性而被使用。这种应用早于对其机理的科学或医学认识。例如：古希腊人和古罗马人使用银币以维持水的纯净。现在，NASA仍出于同一目的而在航天飞机上使用银。1800年前，就已将硝酸银用于各种医疗状况的治疗。目前，1％的硝酸银溶液仍被广泛用于接生后的婴儿，用以防止淋病性眼炎。至少从19世纪后期开始，已经开始以各种不同的形式将银用于治疗和预防众多与细菌相关的疾病。

其他治疗，诸如将银箔用于手术后伤口以防止发生感染的医疗实践在欧洲一直延续至20世纪80年代，并且仍然将硝酸银用作局部抗菌剂。20世纪60年代成功研制出了如下式1所示的用于烧伤治疗的银络合物-磺胺嘧啶银。其商品名为1％

乳膏，该络合物一直是预防二三级烧伤感染的最有效的治疗手段之一。磺胺嘧啶银对于多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌具有良好的抗菌效果。一般认为，银在表面伤口区域的缓释效应在治疗过程中发挥主要作用。对手术创伤的大鼠研究结果表明硝酸银和磺胺嘧啶银在有助于伤口愈合方面都有效果。尽管还不明白其完整的作用机理，但是通过使用这些普通银抗菌剂可以减轻伤口的炎症和减少肉芽的形成。

近年来，对将生物可降解聚合物用于药物递送系统领域的兴趣开始增长。大部分这类研究包括生物可降解纳米微粒聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及乳酸-乙醇酸的共聚物(PLGA)，因为这些生物可降解纳米微粒已经FDA批准。自20世纪70年代起，PGA已在生物可降解缝合材料中使用。

最新研究已开始探索将市面上的抗癌药物装载于PLGA纳米微粒中用于药物递送，所述抗癌药物如紫杉醇(IUPAC名称：(2aR-(2a-α，4-β，4a-β，6-β，9-α(α-R*，β-S*)，11-α，12-α，12a-α，2b-α))-苯丙酸β-(苯甲酰基氨基)-α-羟基-，6，12b-双(乙酰氧基)-12-(苯甲酰基氧基)-2a，3，4，4a，5，6，9，10，11，12，12a，12b-十二氢-4，11-二羟基-4a，8，13，13-四甲基-5-氧代-7，11-亚甲基-1H-芳癸并(3，4)苯并(1，2-b)氧杂环丁(oxet)-9-基酯)。此类药物的一个缺点在于其疏水性会导致该类药物在体内吸收缓慢。但是，将紫杉醇装载于PLGA即可提高疗效。这主要是因为在该制备的纳米微粒中亲水性有所增加。

另一应用于生物医学的现有药物递送系统是带有氨基酸酯侧链的聚氨磷腈类。此类化合物最终可分解为包括磷酸盐和氨在内的生物友好型产物。迄今为止，两种所使用的主要聚氨磷腈类为聚(二(甘氨酸乙酯)磷腈)(PEGP)和聚(二(丙氨酸乙酯)磷腈)(PEAP)。

发明内容

一般而言，本发明的一个方面在于提供一种治疗癌症的化合物，该化合物含有具有预定特征的金属络合物，且其可掺合入聚合物纳米微粒或其他递送系统以递送该金属络合物使其作用于肿瘤细胞。

本发明的另一方面在于提供一种治疗癌症的金属络合物，其中该金属络合物是银(I)盐、银(I)大环金属络合物、银(I)N-杂环卡宾或其混合物。

根据本发明的另一方面，该银(I)大环金属络合物为：

其中，每一个R均独立地选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸、肽，或者不存在(null)，其中X₁、X₂和X₃独立地为硫或者氮，且当X₁、X₂或X₃为硫时，R不存在，其中，包含有(comprised of)碳、R_1-3和X_1-3的大环配体代表L，其中Y选自NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf、SO₄、Cl、Br和I，或可代表L，当Y代表L时，相反的阴离子则选自NO₃ ^-、OAc^-、SCN^-、BF₄ ^-、OTf^-、SO₄ ^-、Cl^-、Br^-和I^-。

根据本发明的另一方面，银(I)N-杂环卡宾为：

其中，R₁和R₂选自卤素、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸，R₃和R₄选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，X选自NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf、SO₄、Cl、Br和I。

根据本发明的另一方面，银(I)N-杂环卡宾为：

其中，R₁和R₂选自卤素、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸，R₃和R₄选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，X选自NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf、SO₄、Cl、Br和I。

根据本发明的另一方面，该银(I)N-杂环卡宾为：

其中，R_1-4可选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，X选自NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf、SO₄、Cl、Br和I。

根据本发明的另一方面，一种用于治疗哺乳动物中的癌细胞的方法，其包括步骤：

给予有效量的掺合入生物可降解聚合物纳米微粒的银(I)金属盐。

根据本发明的另一方面，一种用于治疗哺乳动物中的癌细胞的方法，其包括步骤：

给予有效量的大环银(I)络合物，该大环络合物包含：

其中，每一个R均独立选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，或不存在，X₁、X₂和X₃独立地是硫或氮，且当X₁、X₂或X₃为硫时，R不存在，其中，包含有碳、R_1-3和X_1-3的大环配体代表L，其中，Y选自NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf、SO₄、Cl、Br和I，或可代表L，且当Y代表L时，相反的阴离子则选自NO₃ ^-、OAc^-、SCN^-、BF₄ ^-、OTf^-、SO₄ ^-、Cl^-、Br^-和I^-。

根据本发明的另一方面，一种用于治疗哺乳动物中的癌细胞的方法，其包括步骤：

给予有效量的N-杂环银(I)络合物，该N-杂环络合物包含：

其中，R₁和R₂选自卤素、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸，R₃和R₄选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，X选自NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf、SO₄、Cl、Br和I。

根据本发明的另一方面，一种用于治疗哺乳动物中的癌细胞的方法，其包括步骤：

给予有效量的N-杂环银(I)络合物，该N-杂环络合物包含：

其中，R₁和R₂选自卤素、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基和羧酸，R₃和R₄选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，X选自NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf、SO₄、Cl、Br和I。

根据本发明的另一方面，一种用于治疗哺乳动物中的癌细胞的方法，其包括步骤：

给予有效量的N-杂环银(I)络合物，该N-杂环络合物包含：

其中，R_1-4可选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，X选自NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf、SO₄、Cl、Br和I。

根据本发明的另一方面，一种用于治疗哺乳动物中的癌细胞的方法，其包括步骤：

给予有效量的N-杂环银(I)络合物，该N-杂环络合物包含：

其中，R_1-4可选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽，X选自NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf、SO₄、Cl、Br和I。

附图说明

图1表示化合物治疗卵巢癌细胞系NuTu-19的活性图；

图2表示比较了式23、顺铂和卡铂对A375黑色素瘤的抗增殖效果的表；

图3表示测量了不同浓度的式23、顺铂和卡铂对A375黑色素瘤的控制生长百分比的图；

图4表示比较了式23、顺铂和卡铂对ACHN肾癌的抗增殖效果的表；

图5表示测量了不同浓度的式23、顺铂和卡铂对ACHN肾癌的控制生长百分比的图；

图6表示比较了式23、顺铂和卡铂对HT1376结肠癌的抗增殖效果的表；以及

图7表示测量了不同浓度的式23、顺铂和卡铂对HT1376结肠癌的控制生长百分比的图。

发明详述

将包括金属络合物在内的金属化合物与生物可降解纳米微粒联合用于例如癌症的治疗是本发明所提出的一个实例。也可以考虑或开发其它递送系统。在一实例中，本发明包括但不限于作为简单盐的银(I)金属络合物、银(I)大环金属络合物和银(I)N-杂环卡宾(NHCs)，它们掺合入生物可降解纳米微粒用于治疗癌症。

纳米微粒的大小通常为10nm至1000nm不等。与微米粒子相比，这些亚微米大小的粒子具有某些明显优势。与微球体不同，包括纳米球在内的纳米微粒可通过系统循环或透过粘膜直接靶向于组织。该靶向之所以成为可能，是因为这些纳米微粒能够被个体细胞所吞噬。也已经发现，静脉注射的纳米微粒是由单核巨噬细胞系统的细胞所吞噬，并且主要在Kuppfer细胞中。这类纳米微粒可快速地从血液中清除并通常聚集在肝、脾和血髓(blood marrow)。

如果是纳米微粒型递送系统，则根据装置的制造方法而将治疗剂溶解、封装、包埋或化学偶联于纳米微粒骨架(matrix)。通常将药物均匀地物理掺合并分散在纳米球骨架中。在这种聚合物装置中形成的药物通过经聚合物骨架扩散、聚合物骨架的腐蚀或通过扩散和聚合物腐蚀机理的联合作用而进行释放。在本发明的一种实施方案中，使用了包括聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及乳酸-乙醇酸的共聚物(PLGA)的生物可降解聚合物纳米微粒。

在历史上，人们主要研究纳米微粒用于递送简单的药物分子。但是，近年来，鉴于纳米微粒在药物控释方面的应用、作为基因治疗中的DNA载体、靶向特定器官和组织的能力以及封装和通过经口给药途径递送肽、蛋白和基因的能力，纳米微粒作为潜在的药物递送装置而受到了相当大的关注。

在传统上用于制备纳米微粒的方法大体上可分为两类：(1)分散预先形成的聚合物以及(2)单体聚合，但是，上述每种方法的都有着几种不同的变化以试图优化产品配方。用于制备纳米微粒的第一种方法的最常见的一些变化包括(a)溶剂蒸发法，(b)自乳化/溶剂扩散法和盐析/乳化-扩散法。这些变化中所遵循的共同主题是试图以可控的方式移除有机溶剂，从而使聚合物粒子沉淀。根据药物的相对亲水性和溶解性，将药物溶解于含有聚合物的有机相中或内部水相中，从而进行药物的封装。如果是通过单体聚合而制备的聚合物纳米微粒，则与单体相比，聚合物在聚合介质中的溶解性通常较低，这将导致聚合物沉淀同时分子量增加。通过改变机械搅拌速度、所使用的表面活性剂和/或稳定剂的类型和浓度、聚合介质的pH值等参数可实现对粒度的控制。可将药物在聚合过程中或聚合后封装于纳米微粒中。

纳米微粒的一个基团包括聚磷腈类[PR₂N]_n。聚磷腈类是多功能聚合物，这是由于能够通过简单地取代母体[PCI₂N]_n聚合物中的氯化物而用各种各样的R基团将其官能化。根据取代基的选择，聚磷腈可在水稳定性至水敏感性之间变化。总的来说，大多数经P-N键结合至磷腈骨架上的R基团是水敏感性的，而那些通过P-O键结合至磷腈骨架的R基团是水稳定性的。后一个一般规则的例外情况为，带有葡萄糖基、乙醇酸酯和乳酸酯取代基的磷腈类是水敏感性的，即使这些取代基是经由P-O键结合至磷腈骨架上。当[PR₂N]_n聚合物与水反应时，生成NH₃、H₃PO₄(或磷酸盐)和R-H。因为NH₃和H₃PO₄具有生物相容性，所以水蚀性(erodible)[PR₂N]_n聚合物是否具有生物相容性则取决于RH的性质。因此，带有葡萄糖基、乙醇酸酯和乳酸酯取代基的磷腈类具有生物相容性。其他产生水蚀性磷腈类的生物相容性取代基包括咪唑基、甘油基以及氨基酸酯、缩酚肽。由于带有多种生物相容性的R基团，[PR₂N]_n的水解需要数天至几个月。通过使用两个或者甚至三个不同的取代基(其一般形式为[PR₂N]_x[PRR’N]_y[PR’₂N]_z)合成磷腈并改变这两种取代基的相对量(x、y和z)，即可调整其水敏感性。磷腈类还具有其他潜在的有用特性。可将其制成纳米纤维，并且根据R基团的不同，一些磷腈类还具有细胞粘附的特性。

在本发明的这一实例中，可用于治疗癌症的化合物包含掺合入生物可降解纳米聚合物中的银(I)盐，所述生物可降解纳米聚合物包括PLA、PGA和PLGA，所述盐通常用式1或者式2表示：

其中X表示NO₃、OAc、SCN、BF₄、OTf或SO₄，其中Y表示Li、Na或K且X表示Cl、Br或I。

用于螯合式1表示的银盐的大环配体的代表为但不限于式3-6：

其中，每一个R可独立变化，并且其可以为氢原子、烷基(例如但不限于甲基)、醚(例如但不限于甲基乙基醚)、醇(例如但不限于乙醇)、羧酸(例如但不限于乙酸)、芳基(例如但不限于苯)、氨基酸(例如但不限于丝氨酸或苏氨酸)、或肽(例如但不限于促黄体生成素(luetinizing hormone))。可以修饰这些R基团以增加络合物的总体溶解性。

用于结合银(I)的N-杂环卡宾的代表为但不限于式7-8：

其中，R_1-2可独立或非独立地表示卤素、质子、烷基、醚、醇、硝基、氰基或羧酸，其中R_3-4可独立或非独立地表示氢原子、烷基(例如但不限于甲基)、醚(例如但不限于甲基乙基醚)、醇(例如但不限于乙醇)、羧酸(例如但不限于乙酸)、芳基(例如但不限于苯)、氨基酸(例如但不限于丝氨酸或苏氨酸)、或肽(例如但不限于促黄体生成素)，其中X表示NO₃、OAc、SCN、BF4、OTf、SO₄、PF₆、BPh₄、Cl、Br和I。可修饰这些R基团以改变溶解性。

其中R_1-4可独立变化且可为氢原子、烷基(例如但不限于甲基)、醚(例如但不限于甲基乙基醚)、醇(例如但不限于乙醇)、羧酸(例如但不限于乙酸)、芳基(例如但不限于苯)、氨基酸(例如但不限于丝氨酸或苏氨酸)、或肽(例如但不限于促黄体生成素)，其中X可表示NO₃、OAc、SCN、BF4、OTf、SO₄、PF₆、BPh₄、Cl、Br和I。可修饰这些R基团以改变溶解性。

由于纳米微粒的制备需要使用大量的水并联合使用少量的有机溶剂，因而应该理解，在一些纳米微粒的情况下，掺合入纳米微粒的银(I)金属络合物将形成在混合物的有机部分中，而在另一些纳米微粒的情况下，其将形成于纳米微粒的疏水核中。因此，所选的银(I)金属络合物需要是疏水性的。根据这种理解，制备出带有疏水取代基且如式9-13所示的银(I)N-杂环卡宾。如式14和15所示的银(I)N-杂环卡宾为另外一些实例，其中R₁-R₄表示相同或不同的疏水烷基和芳基取代基。式16-21则为疏水银(I)N-杂环卡宾的另外一些实例。

在一实例中，已经进行了式23所表示的银(I)络合物对卵巢癌细胞系NuTu-19的初步抗癌活性测试。选择银络合物23的原因是由于其总体的稳定性。在72小时的测试期间内，该银(I)-NHC表现出了抗癌活性。

如图1所示，其显示了MTT数据，该数据是在测试式23对卵巢癌细胞系NuTu-19的抗癌活性时获得的。特别地，还将式23的抗癌活性与确定具有抗癌活性的顺铂和先前已专利的硫醚(thiaether)-RhCl₃进行了比较。

以每孔5000个细胞将细胞接种到了96孔培养板中。所有测试一式三份进行。接种后，细胞孵育过夜，而后添加了50μM的溶于完全细胞培养基的式23、顺铂和硫醚-RhCl₃的溶液。将细胞培养了72小时，接着，添加了溶于磷酸盐缓冲液(PBS)的MTT并再次培养了4小时。然后，添加十二烷基硫酸钠：0.01M HCI(SDS)溶液，细胞孵育过夜。SDS溶液的添加是用于溶解蓝色甲臜(formazan)晶体，该晶体是通过活细胞还原MTT而形成的。然后，即可在微板读数仪上读出其吸光度值。因此，吸光度值越高，细胞群落中存在的活细胞则越多。图1中的图表显示出在孵育72小时后，50μM的式23杀死所有细胞。

如图2-7所示，通过与已知市售的包括顺铂和卡铂的化疗药物对比，对式23进行了进一步的研究。如图2和图3所示，研究了式23、顺铂和卡铂对生长了96个小时的A375黑色素瘤的抗增殖效果。计算了在包括0.5μm、1.0μm、2.5μm、5.0μm、10μm、15μm、20μm和25μm的不同浓度下的控制生长百分比和百分比平均值的标准差(SEM)。关于控制生长百分比，可以看出，与顺铂和卡铂相比，式23对A375黑色素瘤显示出了最佳的生长控制效果。

如图4和图5所示，研究了式23、顺铂和卡铂对生长了96个小时的ACHN肾癌的抗增殖效果。计算了在包括0.5μm、1.0μm、2.5μm、5.0μm、10μm、15μm、20μm和25μm的不同浓度下的控制生长百分比和百分比的平均值标准差(SEM)。关于控制生长百分比，可以看出，式23对A375黑色素瘤的生长控制效果与卡铂相当且优于顺铂。

如图6和图7所示，研究了式23、顺铂和卡铂对生长了96个小时的HT1376结肠癌的抗增殖效果。计算了在包括0.5μm、1.0μm、2.5μm、5.0μm、10μm、15μm、20μm和25μm的不同浓度下的控制生长百分比和百分比的平均值标准差(SEM)。关于控制生长百分比，可以看出，式23对HT1376结肠癌的生长控制效果与卡铂和顺铂相当。

术语有效量定义了进行适当治疗所需的剂量。根据所使用的银(I)金属络合物和患者的生理特征，以及所治疗的癌症细胞性质和位置的不同，该剂量可有所调整。给药方式也可根据所治疗的癌症细胞性质和位置以及其它特征的不同而不同。

另外的银(I)金属络合物则是由如式24-27所示的4，5-二氢咪唑衍生物所制备。

如式27所示，功能基团R用来改变络合物的溶解性。在一实施方式中，该R基团是醇。合适的醇包括乙醇和丙醇。式26中，n的值为1至200。已经发现，式24-27在有光并且室温的条件下在水中几乎立即分解。还发现，式24-27在生理学量的氯化钠中显示出较差的稳定性。式23-26的分解可产生活性银和咪唑阳离子。式24和式26经由尾静脉注射在大鼠内产生强烈毒性。

治疗方法可为但不限于静脉注射、腹腔注射、吸入或口服。如果使用了注射法，药物可溶解于合适的溶剂中。通常选择生理盐水作为溶剂。该溶液的氯化钠在水中的含量能够在0.5至1.0％的范围内变化，这是因为在该浓度范围的盐水因与血浆等渗而具有生物学意义。另一合适的溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。其它在生物学上可接受的溶剂也可使用。吸入法需要雾化该药物，从而使药物如同气雾剂一样被吸入。口服法包括摄取该药物，且药物的剂型为丸剂、胶囊、囊片或片剂。

将银(I)金属络合物配制为纳米微粒递送系统可赋予多种临床优势。首先，这种配制可促使母体银(I)金属络合物和活性银阳离子缓慢地沥滤(leaching)，从而提供活性药物的长效递送。这种缓释效果使用药间隔延长，患者依从性增强。并且，这些粒子可被肺泡巨噬细胞吞噬且被递送至系统循环。以前的研究已表明，粒度范围在1-5μm的聚合粒子可被巨噬细胞吞噬，随后则从肺表面迁移到淋巴系统。由于淋巴系统与免疫系统紧密地连接成一个整体，与传统的全身性递送相比，将银(I)金属络合物靶向于巨噬细胞则可提供更多的益处。如果以这种方式靶向于免疫系统，那么，减少剂量即成为可能，而(此较少的剂量)产生与较高剂量的口服或全身型抗菌剂一样的临床效果，并且可以消除潜在的与剂量相关的副作用。

在一实例中，本发明的银(I)金属络合物可用于识别肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原以将治疗性的和细胞毒性的药剂剂递送至癌组织和细胞，同时尽量减少细胞毒素剂接触到非癌性、健康的组织和细胞。抗体，例如可识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的单克隆抗体，可与例如链霉亲和素(strepravidin)络合并被引入患者体内。抗体识别肿瘤相关抗原且与之相关联，因而将链霉亲和素定位于肿瘤组织中。然后，结合有生物素的银(I)金属络合物被引入患者体内。链霉亲和素结合生物素并将银(I)金属络合物定位于肿瘤组织上。

基于以上公开的内容，很明显，如本文所述将包括银金属络合物的金属化合物与生物可降解纳米微粒联合用于癌症的治疗可以实现上文中所设定的目标。因此，应当理解，任何明显的变化形式均落在本发明所要求的范围内，在不脱离本文所公开和说明的发明精神的前提下，可以确定具体组成元素的选择。

Claims (4)

1.银(I)金属络合物，所述银(I)金属络合物含有掺合入聚合物纳米微粒的下式的银(I)N-杂环卡宾：

其中，R₁和R₂选自卤素，其中R₃和R₄选自质子、烷基、醚、醇、羧酸、芳基、氨基酸和肽。

2.根据权利要求1所述的银(I)金属络合物，其特征在于，所述聚合物纳米微粒选自聚乙醇酸、聚乳酸以及乳酸-乙醇酸的共聚物。

3.根据权利要求1或2所述的银(I)金属络合物，其特征在于，所述聚合物纳米微粒是生物可降解的。

4.有效量的权利要求1-3中任一项的银(I)金属络合物在制备用于治疗哺乳动物中的癌细胞的药物中的用途。

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