CN114848627A - 花旗松素在制备白斑综合症病毒抑制剂方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了花旗松素在制备白斑综合症病毒抑制剂方面的应用，并公开了花旗松素在制备预防和/或治疗对虾白斑综合症药物方面的应用、用于抑制对虾白斑综合症病毒的花旗松素制剂及其制备方法，特点是花旗松素制剂由以下原料及其质量百分比组成：花旗松素4～16％、乙醇4～8％、吐温‑20 2～4％、水溶性氮酮1～3％，其余为菜籽油，包括以下步骤:称取花旗松素、吐温‑20、水溶性氮酮、乙醇以及菜籽油备用；将花旗松素、乙醇和菜籽油混匀至花旗松素完全溶解，再加入吐温‑20和水溶性氮酮，混匀即得花旗松素制剂，优点是花旗松素毒性低、不易产生耐药性，能有效防治白斑综合症，该花旗松素制剂可以有效防治WSSV在幼虾体内的复制。

Description

花旗松素在制备白斑综合症病毒抑制剂方面的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种花旗松素在制备白斑综合症病毒抑制剂方面的应用。
背景技术
对虾养殖是我国水产养殖业的重要组成部分，近年来随着养殖规模的不断扩大、生态环境不断恶化、对虾集约化养殖和管理不善等众多因素诱发了大量疾病爆发。其中，对虾白斑综合症是由白斑综合症病毒（White spot syndrome virus, WSSV）引起的爆发性流行病，可通过水平和垂直传播感染中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）、日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）等几乎所有对虾类甲壳动物，发病速度快，致死率极高。对虾感染WSSV后甲壳内表面初现点状白斑，继而逐渐扩大至头胸部和全身，致使甲壳呈白色。自20世纪90年代以来WSSV在全球范围内不断爆发，造成了养殖对虾的大规模死亡，已成为全球对虾养殖业危害最大的一种病毒病。传统防治WSSV的方法以抗生素和化学合成药物为主，然而长期的不合理用药引发了耐药性、药物残留和环境污染等问题。因此，探寻新一代抗生素等化学合成药物的替代品迫在眉睫。
中草药具有资源丰富、安全性高、不易产生耐药性等优点，在水产养殖业抗菌、抗病毒、抗寄生虫等方面得到了越来越广泛的应用。作为天然中草药的一员，花旗松素（Taxifolin，C15H12O7）是从高寒带落叶松根部提取的生物类黄酮精华物质（属于维生素p），其结构式为：
Figure 666241DEST_PATH_IMAGE001
。花旗松素又名二氢槲皮素，紫杉叶素等，分子式为C15H12O7，分子量为304.252，无色针状结晶，熔点为240℃，易溶于乙醇、沸水，稍溶于冷水，几乎不溶于苯，成品为淡黄色粉末。研究表明，花旗松素具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎等药理学活性，目前尚无在抗WSSV中的研究与应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种本发明所要解决的技术问题是发明目的之一提供一种花旗松素在制备白斑综合症病毒抑制剂方面的应用；发明目的之二提供一种花旗松素在制备预防和/或治疗对虾白斑综合症药物方面的应用；发明目的之三提供一种用于抑制对虾白斑综合症病毒的花旗松素制剂及其制备方法，该花旗松素制剂可以有效防治WSSV在幼虾体内的复制。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
1、花旗松素在制备白斑综合症病毒抑制剂方面的应用。
2、花旗松素在制备预防和/或治疗对虾白斑综合症药物方面的应用。
3、一种用于抑制白斑综合症病毒的花旗松素制剂，由以下原料及其质量百分比组成：花旗松素4～16％、乙醇4～8％、吐温-20 2～4％、水溶性氮酮1～3％，其余部分为菜籽油。
优先的，所述的花旗松素制剂由以下原料及其质量百分比组成：花旗松素16.0 %、乙醇8.0 %、菜籽油71.0%、吐温-20 3.0%和水溶性氮酮2.0 %。
优先的，所述的花旗松素制剂由以下原料及其质量百分比组成：花旗松素16.0%、乙醇8.0 ％、菜籽油73.0％、吐温-20 2.0％和水溶性氮酮1.0％。
优先的，所述的花旗松素制剂由以下原料及其质量百分比组成：花旗松素16.0 %、乙醇8.0%、菜籽油69.0 %、吐温-20 4.0 %和水溶性氮酮3.0 %。
4、上述用于抑制白斑综合症病毒的花旗松素制剂的制备方法，包括以下步骤:称取花旗松素、吐温-20、水溶性氮酮、乙醇以及菜籽油备用；将花旗松素、乙醇和菜籽油混匀至花旗松素完全溶解，再加入吐温-20和水溶性氮酮，混匀即得花旗松素制剂。
5、上述用于抑制白斑综合症病毒的花旗松素制剂的应用，所述的花旗松素制剂在对虾养殖水中的添加浓度为200mg /L。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种花旗松素在制备白斑综合症病毒抑制剂和预防或治疗对虾白斑综合症药物方面的应用，花旗松素作为新型药剂的有效成分，毒性低、不易产生耐药性，能有效防治白斑综合症。并公开了花旗松素制剂，该花旗松素制剂作为一种新型渔药，天然无公害、不易使对虾产生耐药性，能有效防治对虾白斑综合症。该制剂成本低，使用方法简单，利于推广应用。
附图说明
图1 为花旗松素抗WSSV活性的影响；A为养殖水中添加花旗松素和WSSV共孵育幼虾对其存活率的影响，B为养殖水中添加花旗松素和WSSV共孵育幼虾对其体内病毒复制的影响；
图2为花旗松素对病虾体内WSSV复制的影响；
图3为经花旗松素预孵育不同时间幼虾对其染病后体内WSSV复制的影响；
图4为WSSV预孵育花旗松素不同时间后对健康幼虾攻毒的影响
图5为花旗松素对WSSV水平传播的影响；
图6为花旗松素连续换药与不换药对病虾存活率及其体内WSSV复制的影响，A为病虾死亡率指标和B为幼体内WSSV拷贝数指标。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
为阐明本发明的实质，以南美白对虾幼虾为实验对象进行花旗松素抗WSSV活性检测及其制剂的药理实验来证明其在抗WSSV爆发中的用途。
具体实施例一
花旗松素防治WSSV活性分析
1、实验材料：花旗松素（纯度98.0％）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，二甲基亚砜（DMSO）购自西安化学试剂厂，WSSV和南美白对虾幼虾由浙江省海洋水产养殖研究所清江基地提供。花旗松素母液配制：称取花旗松素用DMSO充分溶解，配成终浓度为100mmol/L的花旗松素母液于4℃保存备用。
2、WSSV拷贝数检测：使用海洋动物组织基因组DNA快速提取试剂盒（天根）提取幼虾DNA，超微量分光光度计检测DNA浓度（终浓度为30 ng/μL）和纯度后进行qPCR实验。qPCR引物信息为VP28141（VP28-F: 5'-AAACCTCCGCATTCCTGTGA-3', VP28-R: 5'-TCCGCATCTTCTTCCTTCAT-3'），qPCR反应体系和反应程序如表1和2所示。根据pMD19T-VP28141标准品所做的标准曲线对qPCR结果进行换算得病毒拷贝数。
表1 qPCR反应体系
Figure 176857DEST_PATH_IMAGE002
。
表2 qPCR反应程序
Figure 691015DEST_PATH_IMAGE003
。
3、养殖水中添加WSSV浓度确定
实验在12孔板进行，每孔健康、活力强、规格均一的幼虾7尾，养殖水4 mL。养殖水中WSSV浓度设置分别为：1.6×104、1.6×105、1.6×106、1.6×107和1.6×108 copies/μL，实验设3个重复，每24 h记录幼虾存活状况，选择72 h时幼虾存活率为0%的WSSV浓度作为后续实验使用浓度。当养殖水中WSSV浓度为1.6×106 copies/μL时，幼虾死亡率在72 h为100%。因此，上述浓度可用于后续实验。
4、花旗松素毒性分析
实验在12孔板进行，每孔幼虾7尾，养殖水4 mL。实验设置处理组为养殖水中花旗松素浓度分别为1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L三组，对照组为养殖水中DMSO质量浓度为0.02%。实验设3个重复，每24 h记录健康幼虾存活情况。根据72h后幼虾存活情况可知，养殖水中花旗松素的添加浓度为100 μmol/L时无晶体析出且对幼虾存活没有影响。
5、花旗松素防治WSSV活性分析
实验条件：实验在12孔板进行，每孔幼虾7尾，养殖水4 mL，除特别指明采用病虾外，其余实验均采用健康幼虾。
病虾制备方法：将健康幼虾置于含WSSV浓度为1.6×106 copies/μL的养殖水中孵育24 h得到。
（1）花旗松素抗WSSV活性检测
实验设WSSV（1.6×106 copies/μL）+花旗松素（100 μmol/L）组：采用的养殖水中含1.6×106 copies/μL的WSSV和100 μmol/L的花旗松素；WSSV+DMSO组：采用的养殖水中含1.6×106 copies/μL的WSSV和质量浓度0.02%的DMSO；实验设3个重复，每隔24 h取幼虾检测WSSV拷贝数，此外每12 h记录幼虾死亡数目。
由图1养殖水中添加花旗松素（100 μmol/L）和WSSV（1.6×106 copies/μL）共孵育幼虾对其存活率（图1A，图中对照组是是养殖水体中不添加其他物质的空白对照）和体内病毒复制（图1B）的影响可知，养殖水中添加花旗松素可以提高幼虾的存活率，当孵育时间为72 h时WSSV+DMSO组幼虾存活率为0%而WSSV+花旗松素组幼虾存活率在50%以上。实验还发现，WSSV+DMSO组幼虾体内病毒拷贝数在不同时间分别为WSSV+花旗松素组幼虾体内病毒拷贝数的5.8、6.7和7.2倍，表明花旗松素与WSSV共孵育幼虾不同时间均可以抑制其体内WSSV复制水平，且该抑制作用随孵育时间延长不断增强，说明花旗松素具有抗WSSV的活性作用。
（2）花旗松素对病虾的治疗作用
实验设WSSV+DMSO组：每孔包含病虾7尾和只含DMSO（0.02%）的养殖水4 mL ；WSSV+花旗松素组：每孔包含病虾7尾和只含花旗松素（100 μmol/L）的养殖水4 mL。实验设3个重复，在感染WSSV 24 h和48 h后检测病毒拷贝数。
图2为花旗松素对病虾体内WSSV复制的影响，结果显示养殖水中添加花旗松素孵育病虾24 h和48 h时均可显著抑制其体内WSSV的复制，说明花旗松素具有治疗感染WSSV病虾的作用。
（3）花旗松素对健康幼虾感染WSSV的预防作用
实验设WSSV+DMSO组：健康幼虾在只含DMSO（0.02%）的养殖水中分别预孵育2、4、6和8 h后将原养殖水吸弃，新养殖水冲洗3次后更换只含WSSV（1.6×106 copies/μL）的养殖水继续培养72 h后检测病毒拷贝数。WSSV+花旗松素组：健康幼虾在只含花旗松素（100 μmol/L）的养殖水中分别预孵育2、4、6和8 h后将原养殖水吸弃，新养殖水冲洗3次后更换只含WSSV（1.6×106 copies/μL）的养殖水继续培养72 h后检测病毒拷贝数。实验设计3个重复，实验结束后检测WSSV拷贝数。
图3为花旗松素预孵育幼虾不同时间对其染病后体内WSSV复制的影响。结果显示，花旗松素预孵育幼虾不同时间均可以显著抑制其染病后体内WSSV的复制，其中当预孵育时间为8 h时WSSV+DMSO组幼虾体内病毒拷贝数为WSSV+花旗松素组幼虾体内病毒拷贝数的2.7倍，抑制作用最强，说明花旗松素对幼虾感染WSSV具有预防作用。
（4）花旗松素对降低WSSV感染幼虾的作用
实验设WSSV+DMSO组：将花旗松素和WSSV分别添加于养殖水中使养殖水中花旗松素浓度为100 μmol/L，WSSV浓度为8×107 copies/μL，分别预孵育1、3和6 h后将养殖水稀释50倍（此时花旗松素浓度为2μmol/L远低于能有效抑制WSSV复制的浓度，WSSV浓度为1.6×106 copies/μL），采用稀释后的养殖水加入孔板中对健康幼虾攻毒72 h检测病毒拷贝数。WSSV+花旗松素组：将DMSO和WSSV分别添加于养殖水中使养殖水中DMSO浓度为0.02%，WSSV浓度为8×107 copies/μL，分别预孵育1、3和6 h后将养殖水稀释50倍（此时WSSV浓度为1.6×106 copies/μL），采用稀释后的养殖水加入孔板中对健康幼虾攻毒72 h检测病毒拷贝数。实验设3个重复，攻毒后72 h取样检测WSSV拷贝数。
由图4用花旗松素与WSSV预孵育不同时间后对幼虾进行攻毒发现WSSV+DMSO组幼虾体内病毒拷贝数分别为WSSV+花旗松素组幼虾体内病毒拷贝数的1.4、1.4和1.7倍。结果表明花旗松素预孵育WSSV对其在幼虾体内复制均有抑制作用，且当预孵育时间为6 h时该抑制作用最佳，说明花旗松素能降低WSSV对幼虾的感染力。
6、花旗松素对WSSV水平传播影响
病虾制备方法：将健康、活力强、规格均一的幼虾置于含WSSV浓度为1.6×106copies/μL的养殖水中孵育24 h得到。
实验设WSSV+DMSO组：20尾病虾、20尾健康幼虾、只含有质量浓度0.02% DMSO的养殖水500 mL；WSSV+花旗松素组：20尾病虾、20尾健康幼虾、只含100 μmol/L花旗松素的养殖水500 mL。实验期间病虾与健康幼虾用纱网隔开，保证病虾与健康幼虾间无接触，实验设3个重复，周期为72 h，实验结束后取健康幼虾检测病毒拷贝数。
由图5花旗松素对WSSV水平传播的影响结果可知，养殖水中添加花旗松素组幼虾体内病毒拷贝数与不添加花旗松素组幼虾体内病毒拷贝数的比为1：1.4，结果显示养殖水中添加花旗松素可以显著抑制WSSV在幼虾间的水平传播。综上，花旗松素对病虾体内WSSV的复制和水平传播均有抑制作用。
7、更换含花旗松素的养殖水对幼虾WSSV的影响
实验在12孔板进行，设置养殖水4mL/孔，幼虾7尾/孔，将健康幼虾置于含WSSV浓度为1.6×106 copies/μL的养殖水中孵育24 h得病虾。实验设3个平行，每24 h记录幼虾存活情况并取样检测WSSV拷贝数。
WSSV+DMSO不换药组：病虾+只含DMSO（0.02%）的养殖水，在实验期间不更换养殖水；WSSV+花旗松素不换药组：病虾+只含花旗松素（100 μmol/L）的养殖水，在实验期间不更换养殖水； WSSV+DMSO换药组：病虾+只含DMSO（0.02%）的养殖水，在实验期间每24 h更换只含DMSO（0.02%）的养殖水；WSSV+花旗松素换药组：病虾+只含花旗松素（100 μmol/L）的养殖水，在实验期间每24 h更换只含花旗松素（100 μmol/L）的养殖水。
由图6不换药治疗对病虾死亡率（A）和体内WSSV复制水平（B）的影响可知，WSSV+DMSO不连续换药组病虾在72 h存活率为0%，而WSSV+花旗松素不连续换药组病虾存活率在120 h时为0%。结果还显示，该组病虾在120 h时体内WSSV复制水平远低于WSSV+DMSO组病虾在120 h时体内病毒复制水平。
由图6花旗松素连续换药治疗对病虾死亡率（A）和体内WSSV复制（B）的影响可知，连续更换只含花旗松素养殖水的病虾较连续更换只含DMSO养殖水的病虾有更高的存活率，其中连续更换只含DMSO养殖水幼虾存活率在96 h时为0%，而连续更换只含花旗松素养殖水的幼虾存活率在120 h时仍在50%左右。结果还发现，WSSV+花旗松素不连续换药组病虾在120 h时体内病毒拷贝数为连续更换只含花旗松素养殖水组病虾体内病毒拷贝数的2.2倍，表明花旗松素连续换药治疗可以有效抑制病虾体内WSSV的复制。综上所述，更换含花旗松素的养殖水可以有效抑制WSSV在病虾体内的复制并对其具有治疗作用。
具体实施例二
花旗松素、南美白对虾幼虾和白斑综合症病毒（WSSV）来源同上具体实施例一。
1、花旗松素制剂的溶剂选择
通过观察比较花旗松素在菜籽油、花生油、乙醇、乙酸和DMSO溶剂中的溶解度，发现花旗松素在菜子油和乙醇中无分层沉淀，溶解效果较好。
然后将菜子油和乙醇按不同比例组合，设置以下8组试验确定溶解度高且安全的溶剂配比。
实验组1：称取花旗松素16.0 g、乙醇8.0 g、菜籽油69.0 g混匀至花旗松素完全溶解，然后加入表面活性剂吐温-20 4.0 g和透皮剂水溶性氮酮3.0 g，混合均匀得花旗松素抗WSSV制剂。
实验组2：称取花旗松素14.0 g，乙醇6.0 g、菜籽油76.0 g、吐温-20 3.0 g和水溶性氮酮1.0 g，充分混匀得花旗松素制剂，其余同实验组1。
实验组3：称取花旗松素12.0 g，乙醇5.0 g、菜籽油77.0 g、吐温-20 3.0 g和水溶性氮酮3.0 g，充分混匀得花旗松素制剂，其余同实验组1。
实验组4：称取花旗松素8.0 g，乙醇4.0 g、菜籽油82.0 g、吐温-20 3.0 g和水溶性氮酮3.0 g，充分混匀得花旗松素制剂，其余同实验组1。
实验组5：称取花旗松素10.0 g，乙醇7.0 g、菜籽油76.0 g、吐温-20 4.0 g和水溶性氮酮3.0 g，充分混匀得花旗松素制剂，其余同实验组1。
实验组6：称取花旗松素4.0 g，乙醇5.0 g、菜籽油86.0 g、吐温-20 3.0 g和水溶性氮酮2.0 g，充分混匀得花旗松素制剂，其余同实验组1。
实验组7：称取花旗松素6.0 g，乙醇6.0 g、菜籽油84.0 g、吐温-20 2.0 g和水溶性氮酮2.0 g，充分混匀得花旗松素制剂，其余同实验组1。实验结果如下表3所示，
表3 花旗松素制剂的不同溶剂配比结果
Figure 430432DEST_PATH_IMAGE004
由表1可知，花旗松素在由乙醇和菜籽油（质量比例范围为1:8-1:20）组成的溶剂中实验组1中溶解度最高，其溶解度超过16 g。
2、花旗松素制剂辅料防治WSSV活性
本试验通过比较下列组合来确定花旗松素制剂中其他物质(溶剂、吐温-20和水溶性氮酮)对花旗松素抗WSSV活性的影响。取健康幼虾随机置于1.5 L烧杯中（1 L养殖水/烧杯，15幼虾/烧杯），养殖水中添加下述组合（总质量为0.2 g）和WSSV（浓度为1.6×106copies/μL）共孵育72 h后检测幼虾体内WSSV拷贝数。制剂中菜籽油、吐温-20和水溶性氮酮对WSSV活性影响实验方案如下：
实验组1：花旗松素16.0 g、乙醇8.0 g、菜籽油76.0 g；。
实验组2：花旗松素16.0 g、乙醇8.0 g、菜籽油71.0 g、吐温-20 3.0 g和水溶性氮2.0 g。
实验组3：花旗松素16.0 g、乙醇8.0 g、菜籽油73.0 g、吐温-20 2.0 g和水溶性氮1.0 g。
实验组4：花旗松素16.0 g、乙醇8.0 g、菜籽油69.0 g、吐温-20 4.0 g和水溶性氮3.0 g。
实验组5：乙醇8.0 g、菜籽油92.0 g。实验结果如下表4所示，
表4花旗松素制剂的不同配方对幼虾体内WSSV抑制结果
Figure 979225DEST_PATH_IMAGE005
由表4可知，实验组5没有显著防治WSSV的活性，实验组2和实验组3防治WSSV的活性最佳，实验组1和实验组4次之。上述结果表明透皮剂水溶性氮酮和表面活性剂吐温-20在花旗松素制剂中质量占比总和小于或等于7%时可以提高其抗病毒活性。
3、花旗松素制剂不同浓度防治WSSV效果
取健康幼虾随机置于1.5 L烧杯中（1 L养殖水/烧杯，15幼虾/烧杯），实验设置添加花旗松素制剂（花旗松素16.0 g、乙醇8.0 g、菜籽油73.0 g、吐温-20 2.0 g和水溶性氮1.0 g）浓度分别为0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L的五组养殖水，每组养殖水中均添加WSSV使其浓度为1.6×106 copies/μL，孵育幼虾共72 h后检测幼虾体内WSSV拷贝数并记录幼虾死亡情况。实验设3个重复，结果如下表5所示，
表5 花旗松素制剂抗WSSV活性
Figure 536108DEST_PATH_IMAGE006
由表5可知，养殖水中添加不同剂量的花旗松素制剂均可抑制幼虾体内WSSV的复制且提高其存活率。当花旗松素制剂的添加量为200 mg/L时，对幼虾体内WSSV复制的抑制率为94%，此时幼虾存活率高达67%。综上，花旗松素制剂可以有效防治WSSV在幼虾体内的复制。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 花旗松素在制备白斑综合症病毒抑制剂方面的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> VP28-F（5'-AAACCTCCGCATTCCTGTGA-3'）
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> VP28-R（5'-TCCGCATCTTCTTCCTTCAT-3'）
<400> 2

Claims (8)

1.花旗松素在制备白斑综合症病毒抑制剂方面的应用。
2.花旗松素在制备预防和/或治疗对虾白斑综合症药物方面的应用。
3.一种用于抑制白斑综合症病毒的花旗松素制剂，其特征在于由以下原料及其质量百分比组成：花旗松素4～16％、乙醇4～8％、吐温-20 2～4％、水溶性氮酮1～3％，其余部分为菜籽油。
4.根据权利要求3所述的一种用于抑制白斑综合症病毒的花旗松素制剂，其特征在于由以下原料及其质量百分比组成：花旗松素16.0 %、乙醇8.0 %、菜籽油71.0%、吐温-203.0%和水溶性氮酮2.0 %。
5.根据权利要求3所述的一种用于抑制白斑综合症病毒的花旗松素制剂，其特征在于由以下原料及其质量百分比组成：花旗松素16.0%、乙醇8.0 ％、菜籽油73.0％、吐温-202.0％和水溶性氮酮1.0％。
6.根据权利要求3所述的一种用于抑制白斑综合症病毒的花旗松素制剂，其特征在于由以下原料及其质量百分比组成：花旗松素16.0 %、乙醇8.0%、菜籽油69.0 %、吐温-20 4.0%和水溶性氮酮3.0 %。
7.一种根据权利要求3-6中任一项所述的用于抑制白斑综合症病毒的花旗松素制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤:称取花旗松素、吐温-20、水溶性氮酮、乙醇以及菜籽油备用；将花旗松素、乙醇和菜籽油混匀至花旗松素完全溶解，再加入吐温-20和水溶性氮酮，混匀即得花旗松素制剂。
8.一种根据权利要求3-6中任一项所述的用于抑制白斑综合症病毒的花旗松素制剂的应用，其特征在于：所述的花旗松素制剂在对虾养殖水中的添加浓度为200 mg/L。
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XU ZHANG等: "Taxifolin Inhibits WSSV Infection and Transmission by Increasing the Innate Immune Response in Litopenaeus vannamei" *

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