KR20180063313A - 면역검정에서의 간섭 감소를 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 단리된 샘플을, 그중 하나는 검출가능 표지를 지니는 복수의 결합 파트너와 함께 인큐베이션함으로써 상기 샘플에서 항원 또는 항체와 같은 분석물을 검출하기 위한 면역검정 방법에 관한 것이며, 이때 표지를 지니지 않으나 상기 검출가능 표지에 결합하는 표지-특이적 결합 파트너가 첨가된다. 상기 방법은 다양한 분석물에 대해 이용가능하며 병원균에 의한 감염으로 인해 샘플에 존재하는 IgG 및 IgM 클래스의 분석물 항체에 대해 특히 유용한 것으로 증명되어있다. 본 발명은 또한 그중 하나가 검출가능 표지를 지니는 적어도 2 개의 분석물-특이적 결합 파트너, 및 상기 검출가능 표지에 결합하나 자체가 검출가능 표지는 지니지 않는 표지-특이적 결합 파트너를 포함하는, 상기 방법에 유용한 시약 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 샘플에 존재하는 항-표지 항체에 의해 초래된 간섭을 제거하기 위한 시험관내 진단 시험에서의 검출가능 표지를 지니지 않는 표지-특이적 결합 파트너의 용도를 포함한다.

Description

면역검정에서의 간섭 감소를 위한 방법
본 발명은 분석물의 직접 또는 간접 검출에 사용되는 검출가능 표지에 결합하는 간섭 인자에 의해 초래되는 면역검정에서의 간섭 감소를 위한 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 분석물, 한 구현예에서 단리된 샘플에서의 항원 또는 항체를, 단리된 샘플을 그중 하나는 검출가능 표지를 지니는 복수의 결합 파트너와 함께 인큐베이션함으로써 검출하기 위한 면역검정 방법에 관한 것이며, 이때 표지를 지니지 않으나 상기 검출가능 표지에 결합하는 표지-특이적 결합 파트너가 첨가된다.
면역진단 검정에서의 간섭을 제거하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며 상세히 기재되어있다. 검토를 위해서는, 예를 들어 Park and Kricka (The Immunoassay Handbook Elsevier Ltd. 2013, Chapter 5.3, pages 403-415) 를 참조한다. 특히 고체상-기반 면역검정, 소위 이종 검정은 위양성 또는 위음성 검정 결과, 높은 백그라운드 신호, 검정 민감성 및 동역학 감소, 시약 안정성 부족 및 이들 시약의 사용 기간 단축을 초래할 수 있는 각종 간섭을 겪는다. 비-특이적 간섭은 종종 분석물의 존재와 관계없이 고체상 물질에 대한 검정 구성성분의 비특이적 결합에 의해 초래된다. 간섭의 또 다른 원천은 류마티스 인자, 항-IgM 항체 또는 항-동물-항체 (이종친화성 항체) 예컨대 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 의 존재이다.
간섭에 대한 또 다른 빈번한 원천은 면역검정에서 사용되는 신호-생성 구성성분이다. 공지된 신호-생성 화합물은 예를 들어 형광, 비색, 화학발광 또는 전기화학발광 원리를 기반으로 발광하는 효소 또는 표지이다. 특히 전기화학발광 화합물에 대해, 신호-생성 화합물에 대한 비-특이적 결합으로 인한 간섭이 선행 기술에 기재되어있다 (Ando et al. Intern Med 2007, 46(15): 1225-1229; Sapin et al., Clin Chem Lab Med 2007; 45(3):416-418).
신호-생성 구성성분 기반의 간섭을 방지하기 위해서, 상기 신호-생성 구성성분에 연결된 초과량의 운반체 단백질이 종종 면역검정 혼합물에 첨가된다. 그 결과 간섭 화합물 또는 인자가 자유 운반체 단백질에 부착된 상기 신호-생성 구성성분에 결합한다. 이러한 방안이 간섭을 제거하기에 충분하지 않은 경우, 또한 실제 신호-생성 구성성분과 구조적으로 유사하나 그 자체로는 어떠한 신호도 제공하지 않는 물질을 면역검정 혼합물에 첨가할 수 있다. 결과적으로, 샘플에 존재하는 간섭 인자가 정량적 방식으로 과다한 유사 화합물에 결합하며 실제 표적, 즉 신호-생성 화합물에 결합하지 않는다. 따라서 간섭이 억제될 수 있다. 이러한 절차는 예를 들어 US 특허 번호 5,888,745 및 이의 등가물 DE 195 19 973 에 기재되어있다. 이들 문헌에서, 분석물-특이적 결합 물질이 발광 신호를 제공할 수 있는 금속-함유 복합체에 부착되는, 분석물을 측정하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법에서, 제 1 의 금속-함유 복합체와 구조적으로 관련되나 분석물에 결합하지 않는 제 2 의 금속-함유 복합체가 조사할 샘플에 첨가된다. 이러한 제 2 의 금속-함유 복합체는 제 1 의 금속-함유 복합체의 신호 켄칭을 감소시키는 것을 돕는다.
그러나, 간섭을 제거하기 위한 방안이 이용가능함에도 불구하고, 면역검정은 간단히 신호-생성 화합물과 유사한 경쟁 화합물의 추가량을 검정 혼화물에 첨가함으로써 제거될 수 없는 간섭을 나타내는 경향이 있다.
따라서, 검출가능 신호의 방사를 기반으로 하는 면역검정의 특이성을 증가시키는데 있어서 해결할 문제점을 관찰할 수 있다.
문제를 일으킨 표지 자체에 결합하는 화합물을 면역검정에 첨가하는 경우, 간섭이 감소되었다. 표지 자체가 감추어지고 차폐될 수 있어, 차폐된 표지에 의해 검출가능 광 신호가 더이상 생성되지 않거나 단지 불충분한 검출가능 광 신호가 생성될 수 있다고 예측되었으므로, 이는 놀라운 것이었다.
발명의 개요
본 발명은 표지-특이적 결합 파트너를 첨가함으로써 신호-생성 화합물 또는 검출가능 표지, 특히 광-생성 표지 (결합 파트너에 부착됨) 가 그의 주변환경으로부터 감추어지고 차폐된다는 발견을 기반으로 한다.
본 발명은 분석물, 한 구현예에서 상기 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 단리된 샘플에서의 항원 또는 항체를, 상기 샘플을 그중 하나가 검출가능 표지를 지니는 복수의 결합 파트너와 함께 인큐베이션함으로써 검출하기 위한 면역검정 방법에 관한 것이며, 이때 표지를 지니지 않으나 상기 검출가능 표지에 결합하는 표지-특이적 결합 파트너가 첨가된다.
방법은 다양한 분석물에 대해 적용가능하며 병원균에 의한 감염으로 인해 샘플에 존재하는 IgG 및 IgM 클래스의 분석물 항체에 대해 특히 유용한 것으로 증명되어있다.
본 발명은 또한, 그중 적어도 하나는 분석물에 결합하고, 그중 하나는 검출가능 표지를 지니고, 그중 하나는 상기 검출가능한 표지에 결합하나 그 자체는 검출가능 표지를 지니지 않는 표지-특이적 결합 파트너인, 복수의 결합 파트너를 포함하는 상기 방법에 유용한 시약 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 샘플에 존재하는 항-표지 항체에 의해 초래된 간섭을 제거하기 위한 시험관내 진단 시험에서의 검출가능 표지를 지니지 않는 표지-특이적 결합 파트너의 용도를 포함한다.
도 1 은 실시예 2 및 3 에서 기재한 바와 같은 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii) IgM 면역검정의 결과를 나타낸다.
도 2 는 항-간섭 구성성분으로서 다양한 농도의 표지-특이적 결합 파트너를 사용한 톡소플라스마 IgM 면역검정의 결과를 나타낸다 (실시예 3 참조).
도 3 은 항-간섭 구성성분으로서 최적화된 농도의 표지-특이적 결합 파트너를 사용한 항-B 형 간염 코어 면역검정의 결과를 나타낸다. 세부사항에 대해서는 실시예 4 를 참조한다.
도 4 는 비-경쟁적 검정 원리의 도식적 도면을 나타낸다. 이 포맷에서 검출된 신호는 분석물의 양에 정비례하여, 즉 낮은 농도의 분석물은 낮은 측정 신호를 초래하는 한편, 높은 농도의 분석물은 증가한 신호를 초래한다. 분석물이 존재하지 않는 경우, 선결된 백그라운드 또는 컷 오프 값을 초과하는 신호는 검출될 수 없다.
a) 특이적 클래스의 항체, 한 구현예에서 IgM 항체 (μ 포획) 를 검출하기 위한 포맷; 제 1 결합 파트너는 검출가능 표지를 지니는 분석물-특이적 항원이다;
b) a) 에서와 같으나, 제 1 결합 파트너가, 제 1 결합 파트너에 결합하는 추가적인 표지된 결합 파트너를 첨가함으로써 간접적으로 표지된다;
c) 항체를 검출하기 위한 이중-항원 샌드위치 포맷 (DAGS); 제 1 및 제 2 결합 파트너 둘 모두가 분석물에 결합한다. 제 1 결합 파트너가 검출가능 표지 자체를 지니거나, b) 에서 나타낸 바와 같이 제 1 결합 파트너에 결합하고 표지를 지니는 추가적인 결합 파트너를 첨가함으로써 간접적으로 표지될 수도 있다.
도 5 (구현예 a)) 는 경쟁적 검정 포맷의 도식적 도면을 나타낸다. 경쟁적 포맷에서 검출된 신호와 분석물 존재 사이의 관계가 반전되어, 즉 구현예 a) 에 대해서는 분석물의 부재 하에 지정자 (specifier) 가 분석물-특이적 결합 파트너에 결합할 수 있고 측정가능한 신호를 제공한다. 한편, 분석물의 존재 하에 지정자의 분석물-특이적 결합 파트너에 대한 결합이, 분석물과의 경쟁으로 인해 억제된다. 또한 제 2 결합 파트너의 분석물-특이적 결합 파트너에 대한 결합은, 분석물이 존재하는 경우 감소한다. 그 결과, 무신호 또는 낮은 신호는 분석물이 조사한 샘플에 존재한다는 것을 보여준다.
도 6 은 본 발명에 따른 경쟁적 검정 포맷의 2 개 추가적 구현예 b) 및 c) 를 나타낸다. 또한, 검출된 신호와 분석물 존재 사이의 관계가 반전되어, 즉 분석물의 부재 하에 표지에 의해 방사된 검출가능 신호가 높으며, 즉 검출가능한 신호가 감소하는 분석물의 존재 하의 경우보다 더 높다.
b) 이 구현예에서 제 1 결합 파트너는 표지를 지니며 지정자가 사용되지 않는다. 제 2 결합 파트너는 표지된 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 분석물과 경쟁한다.
c) 이 구현예에서 제 1 결합 파트너는 표지를 지니지 않으나 고체상에 결합할 수 있다. 면역복합체의 고체상에 대한 부착을 위해 제 2 결합 파트너가 사용되지 않는다. 지정자는 표지를 지닌다. 분석물은 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 지정자와 경쟁한다.
구현예 b) 및 c) 둘 모두에서 제 3 결합 파트너가 첨가되어, 제 1 결합 파트너 (b)) 또는 지정자 (c)) 가 지니는 표지에 결합한다.
도 7 은 갑상선 호르몬 TSH 검출을 위한 면역검정 (비-경쟁적 샌드위치 포맷) 에서 표지-특이적 결합 파트너의 첨가에 의한 간섭 제거를 나타낸다. 세부사항은 실시예 5 에 기재되어있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 샘플을 그중 하나는 검출가능 표지를 지니는 복수의 결합 파트너와 인큐베이션함으로써 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 단리된 샘플에서 분석물을 검출하기 위한 면역검정 방법에 관한 것이며, 이때 표지 자체를 지니지 않으나 상기 검출가능 표지에 결합하는 표지-특이적 결합 파트너가 첨가된다. 면역검정은 아미노산으로 구성된 결합 파트너를 사용하여 생물학적 유체에 존재하는 생물학적 분자의 존재 및/또는 양을 검출하는 생화학 시험이며; 이들 결합 파트너는 항체 및/또는 항원에서 유래한다.
면역검정의 상이한 포맷 및 변형물이 당업계에 널리 공지되어있다 (예컨대 동종 및 이종 면역검정). 동종 면역검정에서 시약 및 샘플은 혼합되고 예를 들어 탁도계 방법에 의해 직접적으로 측정된다.
본 발명은 이종 면역검정에 관한 것이다. 이종 면역검정은 시약, 한 구현예에서 결합 파트너, 또 다른 구현예에서 검출가능 표지를 지니는 분석물-특이적 결합 파트너를 조사할 샘플에 첨가하는 여러 단계로 실행된다. 이들 검정은, 2 개 상 (액체상 및 고체상) 이 필요하므로 "이종" 으로 불린다. 분석물과 특이적 결합 파트너 - 면역복합체를 구성함 - 사이의 용액 중 면역반응 완료 전, 도중 또는 이후에, 상기 면역복합체는 고체상, 한 구현예에서 마이크로타이터 플레이트 라텍스 또는 폴리스티롤 비드에 부착된다. 이는 2 개의 "이종" 상 (액체상 및 고체상) 을 초래한다. 액체상 및 고체상 분리 후 분석물-특이적 결합 파트너에 부착된 표지로부터 방사된 신호가 고체상 또는 액체상 또는 둘 모두의 상에서 검출된다.
면역검정은 경쟁적 또는 비-경쟁적 포맷으로 실행될 수 있다. 경쟁적 포맷에서, 샘플에 함유된 분석물은, 종종 항체인 포획 화합물, 또는 항체가 존재하는 경우 예를 들어 혈청 샘플 중 시험할 병원성 작용제, 상기 병원성 작용제의 항원에 대한 결합을 위해 분석물과 유사하거나 동일한 표지된 결합 파트너와 경쟁한다.
본 발명의 한 구현예에서 면역검정 방법은 비-경쟁적 포맷을 취한다 (다양한 특이적 포맷의 설명에 대해서는 도 4 를 참조한다). 이러한 경우 분석물은 분석물과 분석물에 결합하는 화합물, 즉 분석물-특이적 결합 파트너를 접촉시킴으로써 검출된다. 이러한 분석물-특이적 결합 파트너는 검출가능 표지 자체를 지니거나, 검출가능 표지를 지니는 또 다른 결합 파트너의 표적이다. 용어 "검출가능 표지를 지님" 은 직접적으로 부착된 표지와, 분석물-특이적 결합 파트너에 결합하는 또 다른 표지된 결합 파트너를 첨가함으로써 간접적으로 부여되는 표지 모두를 포함한다 (설명을 위해서는 예를 들어 도 4b) 를 참조한다). 따라서, 비-경쟁적 면역검정에서, 분석물의 양은 분석물과, 표지를 지니는 검출자 화합물 사이에 형성되는 복합체의 양을 측정함으로써 측정된다. 널리 공지된 비-경쟁적 면역검정 포맷은 전통적 샌드위치 포맷 (2 개 분석물-특이적 항체 사이에 분석물 포획), 이중-항원 샌드위치 포맷 (분석물이 2 개 특이적 항원 사이에 포획된 항체임) 및 μ-포획 포맷 (IgM-항체가 인간-IgM 항체에 특이적인 항체에 의해 포획됨) 이다. 이러한 소위 μ-포획 포맷에서 통상 분석물 IgM-항체는 μ-포획 IgM 분석물에 결합하는 표지된 항원을 사용하여 검출된다.
보다 상세히, 비-경쟁적 포맷으로 실행되는 상기 면역검정 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 상기 샘플을
i. 분석물에 결합하며 검출가능 표지를 지니는 제 1 결합 파트너
ii. 고체상에 결합할 수 있으며 분석물에 결합하는 제 2 결합 파트너
iii. 상기 제 1 결합 파트너의 상기 검출가능 표지에 결합하는 제 3 결합 파트너 (상기 제 3 결합 파트너는 표지를 지니지 않음)
와 함께 인큐베이션하는 단계,
b. 상기 샘플을 상기 제 1, 제 2 및 제 3 결합 파트너와 혼화하여 면역반응 혼화물을 형성시키는 단계,
c. 상기 면역반응 혼화물을, 체액 샘플에 존재하는 경우 상기 분석물이 상기 제 1 및 제 2 결합 파트너와 면역반응하여 면역반응 생성물을 형성하게 하고; 상기 제 3 결합 파트너가 상기 제 1 결합 파트너의 상기 검출가능 표지와 면역반응하게 하기에 충분한 시간 동안 유지시키는 단계,
d. 임의의 상기 면역반응 생성물의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계.
비-경쟁적 포맷의 한 구현예를 도 4 에서 추가로 설명한다. 본 발명에 따라서, 복수의 결합 파트너를 적용하며, 그중 적어도 하나는 분석물-특이적 결합 파트너이다.
결합 파트너는 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 기반으로 하는 생물학적 분자이다. 용어 "아미노산으로 구성된" 은 결합 파트너의 주요 구성성분이 폴리펩티드를 형성하는 아미노산이라는 것을 의미한다. 이는 또한 하나 이상의 잔기가 당 모이어티 또는 지질 잔기에 의해 변형되는 아미노산으로 만들어진 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 주요 화합물로서 핵산 또는 탄수화물로 구성된 결합 파트너는 포함되지 않는다. 한 구현예에서, 결합 파트너는 당 잔기에 의한 변형을 포함한다. 한 구현예에서, 결합 파트너는 화학적 링커 분자를 포함함으로써 추가적 모이어티, 한 구현예에서 상기 결합 파트너를 고체상에 부착시키는데 사용되는 표지 또는 화합물을 부착시킨다. 이의 예는 예를 들어 폴리에틸렌글리콜 단위를 기반으로 하는 화학적 링커에 의해 결합 파트너에 부착될 수 있는 비오틴이다.
분석물-특이적 결합 파트너는 분석물에 결합하는 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 기반으로 하는 생물학적 분자이다. 결합 파트너에 대해 상기 상세히 나타낸 특성을 또한 분석물-특이적 결합 파트너에 적용한다. 분석물-특이적 결합 파트너는 제 1 결합 파트너로서 적용된다. 이러한 분석물 특이적 결합 파트너는 분석물에 결합하는 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은, 분석물이 항원인 경우 분석물 특이적 결합 파트너로서 특히 유용하다. 분석물이 항체인 경우, 통상 분석물 항체에 결합하는 항원이 분석물-특이적 결합 파트너로서 적용된다. 비-경쟁적 검정 포맷에서 제 1 결합 파트너 (분석물-특이적 결합 파트너) 는 표지를 지닌다.
설명을 위해, 톡소플라스마 곤디이에 대한 IgM 항체를 검출하기 위한 검정에서 항원 톡소 (Toxo) p30 항원을 샘플에 존재하는 톡소플라스마 곤디이 항체에 결합하는 분석물 특이적 결합 파트너로서 적용한다. 톡소 p30 항원은 검출가능 표지를 지닌다. 본 발명의 한 구현예는, 분석물이 톡소플라스마 곤디이에 대한 항체인 상기 기재한 비-경쟁적 포맷에 따른 면역검정 방법이다.
추가 설명을 위해, 분석물로서 호르몬, 한 구현예에서 당단백질 갑상선-자극 호르몬 (TSH) 을 검출하기 위한 면역검정에서, TSH-특이적 항체를, 조사할 샘플 중 항원 분석물 TSH 에 결합하는 분석물-특이적 결합 파트너로서 적용한다. 상기 TSH-특이적 항체는 검출가능 표지를 지닌다. 분석물은 고체상에 결합할 수 있는 제 2 TSH-특이적 항체와 샌드위치를 형성한다. 본 발명의 한 구현예는 분석물이 호르몬, 한 구현예에서 당단백질 호르몬, 또 다른 구현예에서 TSH 인, 비-경쟁적 포맷에 따른 면역검정 방법이다.
지정물 i., ii., 및 iii. 은 단지 설명적 용어이며 시간별 또는 단계별 순서가 개별적 결합 파트너의 면역반응 혼화물로의 첨가와 연관되는 방식으로 이해되어서는 안된다. 예를 들어, 제 3 결합 파트너 (단계 iii 참조) 는 마지막에 첨가될 필요는 없으나 처음으로 또한 첨가될 수 있거나, i., ii., 및 iii. 하에 열거된 모든 결합 파트너가 동시에 첨가될 수 있다.
제 1 및 제 2 의 결합 파트너의 분석물에 대한 결합 뿐 아니라 제 3 결합 파트너의 표지 (제 1 결합 파트너가 지님) 에 대한 결합은 고친화성으로의 배타적 결합으로서 또한 기재될 수 있는 특이적 방식으로 발생한다. 이는 제 1 결합 파트너가 분석물에 특이적으로 결합하고, 제 2 결합 파트너가 또한 분석물에 특이적으로 결합하고, 또한 제 3 결합 파트너가 제 1 결합 파트너에 부착된 표지에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 이는 예를 들어 분석물이 톡소플라스마 곤디이에 대한 IgM 분자인 한 구현예에서 제 1 결합 파트너가 분석물 IgM 에 의해 인지되고 이에 결합하는 항원, 한 구현예에서 톡소 p30 항원이라는 것을 의미한다. 이 구현예에서 고체상에 결합할 수 있는 제 2 결합 파트너는 IgM 항체의 Fc 부분 (μ-사슬) 에 대한 항체이다. 그 결과, 제 2 결합 파트너는 IgM-분자의 Fc-부분 및 제 1 결합 파트너 (톡소 p30 항원) (분석물 IgM 항체의 파라토프에 특이적으로 결합하는 표지를 지님) 에 특이적으로 결합한다.
용어 "특이적" 또는 "특이적(으로) 결합(하는)" 은 또한 다른 화합물, 통상 샘플에 존재하는 생체분자가 분석물, 결합 파트너 및 표지 (표적 분자로서 요약함) 에 유의하게 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 이는 다른 화학적 화합물의, 분석물, 결합 파트너 및 표지와의 상호작용에 포함되지 않는 표적 분자 부위에 대한 결합을 배제하지 않는다.
본 발명에 따라서 고체상에 결합할 수 있는 제 2 결합 파트너가 적용된다. 이러한 결합 파트너는 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 분석물 항체를 검출하는데 사용될 수 있는 소위 이중-항원 샌드위치 (DAGS) 포맷에서, 제 2 결합 파트너는 분석물 항체에 결합하는 항원이다. 이러한 항원은 예를 들어 항원과 비오틴을 접합시키고 이를 스트렙타비딘-코팅 고체상에 부착시킴으로써 고체상에 결합할 수 있다.
상기 설명한 바와 같이, μ-포획 포맷에 따른 검정에서는 추가적 결합 파트너 (제 2 결합 파트너) 로서 인간 IgM 에 결합하는 항체가 적용된다. 이러한 제 2 결합 파트너는 IgM 분석물의 파라토프에 반영된 그의 항원-특이성에 관계없이 IgM 분자에 결합한다 (이는 샘플 중 모든 IgM 분자에 결합함). 제 2 결합 파트너는 고체상에 결합할 수 있다. 생체분자의 고체상에 대한 결합 메커니즘은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 가장 용이한 방식은 플라스틱 표면, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 대한 단백질의 직접 코팅이다. 한 구현예에서 고체상에 대한 결합은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 일어나는데, 이때 제 2 결합 파트너가 비오틴 모이어티를 지니며 고체상이 스트렙타비딘으로 코팅된다.
본 발명에 따라서, 표지-특이적 결합 파트너는 제 3 결합 파트너로서, 분석할 샘플 및 복수의 결합 파트너를 함유하는 인큐베이션 혼화물에 첨가된다. 이러한 표지-특이적 결합 파트너는 결합 파트너 중 하나가 지니는 검출을 위해 적용된 표지에 결합하는 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 기반으로 하는 생물학적 분자이다. 상기 결합 파트너의 정의는 또한 표지-특이적 결합 파트너에 대해서도 적용된다. 비-경쟁적 포맷에서 표지는 통상 분석물-특이적 결합 파트너 중 하나에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 한 구현예에서 이는 제 1 결합 파트너에 부착된다. 경쟁적 검정 포맷의 한 구현예에서 (하기를 추가로 참조함) 표지는 인큐베이션 혼화물에 존재하는 다른 결합 파트너에 대한 결합을 위해 분석물과 경쟁하는 지정자에 부착된다.
바람직하게는, 상기 표지-특이적 결합 파트너는 표지에 결합하는 항체 또는 이의 단편이다. 표지-특이적 결합 파트너 자체가 표지를 지니지 않으며 표지를 제외한 다른 검정 구성성분과 상호작용하지 않거나 유의하게 상호작용하지 않는 것이 중요하다. 즉, 특이적 결합 파트너의 표지가, 그 자체가 또한 표지를 지니는 표지-특이적 결합 파트너 (예를 들어 디곡신/디곡시게닌 및 항-디곡신/디곡시게닌 항체) 에 의해 인지되는 방법을 기반으로 하는 당업계에 공지된 검출 컨셉은, 이들 컨셉이 항-표지 항체에서 발생하는 간섭을 감소시키는데 적용가능하지 않으므로 포함되지 않는다.
표지의 양과 비교하여 제 3 결합 파트너로서 작용하는 표지-특이적 결합 파트너의 양에 대한 정확한 화학량론은 중요하지 않아, 절대 최대 및 최소 농도 범위는 본 발명이 작용하는데 필수적이지 않다. 충족될 필요가 있는 유일한 농도는 검정 시약이 기능적으로 남아있게 하는 농도이다.
제 3 결합 파트너 (표지-특이적 결합 파트너) 의 몰 비율의 비교 및 계수를 위해, 표지를 감추는데 이용가능한 실제 결합 위치를 결정해야 한다. 이는 예를 들어, Fab 단편은 1 개의 파라토프를 가지며 따라서 1 개의 결합 위치로서 계수되는 반면, 예를 들어 완전 IgG 항체 또는 Fab2 단편은 2 개의 파라토프 (결합 위치) 를 가지며 따라서 2 개의 결합 위치로서 계수된다는 것을 의미한다.
특정 검정을 위해, 표지의 몰량과 비교하여 과량의 표지-특이적 결합 파트너 (= 제 3 결합 파트너) 를 제공하는 것이 유용할 수 있다. 다른 검정에서 상황은 반전될 수 있으며 표지-특이적 결합 파트너의 양과 비교하여 몰 초과량의 표지를 첨가하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 1:10 (표지-특이적 결합 파트너의 결합 위치 대 표지의 비율) 의 한 구현예에서 표지-특이적 결합 파트너의 결합 위치와 비교하여 차폐될 표지의 몰 초과량은 10 배이고, 이는 10 번째 표지마다 분자가 결합하고 표지-특이적 결합 파트너의 결합 위치에 의해 커버될 수 있다는 것을 의미한다. 또 다른 구현예에서, 상황은 예를 들어 10:1 로서 반전될 수 있어, 즉 표지-특이적 결합 파트너의 결합 위치는 10 배 과량으로 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서 표지-특이적 결합 파트너 결합 위치 대 표지의 몰 비율은 적어도 1:20, 또 다른 구현예에서 1:10, 또 다른 구현예에서 1:5, 또 다른 구현예에서 1:3, 또 다른 구현예에서 1:2, 또 다른 구현예에서 1:1.5, 또 다른 구현예에서 1:1, 또 다른 구현예에서 2:1, 또 다른 구현예에서 3:1, 또 다른 구현예에서 5:1, 또 다른 구현예에서 10:1, 또 다른 구현예에서 20:1, 또 다른 구현예에서 50:1, 또 다른 구현예에서 적어도 100:1 이다.
표지-특이적 결합 파트너가 면역검정 혼화물에 첨가되는 경우, 이는 표지에 결합하고, 그로써 샘플에 존재하는 간섭 화합물과의 상호작용으로부터 표지를 커버하고 차폐한다. 동일한 경우에, 그리고 그의 크기 및 3 차원 구조로 인해 표지-특이적 결합 파트너는 또한 간섭 샘플 화합물과의 상호작용으로부터 표지에 부착된 링커를 입체구조적으로 차폐하거나 차단할 수 있다. 그 결과, 또한 링커 서열에 대한 샘플 성분에 의한 비-특이적 결합에 의해 초래된 간섭이 방지될 수도 있다. 자체가 표지를 지니지 않는 표지-특이적 결합 파트너를 첨가함으로써, 간섭 구성성분, 즉 표지가 의도적으로 감추어지고 그로써 샘플에 존재할 수 있는 추가의 항-표지 구성성분의 표지에 대한 결합이 방지된다.
표지-특이적 결합 파트너가 첨가되지 않는 경우, 위양성 결과가 꽤 종종 관찰될 수 있다. 예를 들어 μ 포획 포맷을 기반으로 한 검정 포맷에서, 이들 간섭은 종종 비-특이적 IgM 클래스 항체의 존재에 의해 초래된다. μ-포획 포맷을 기반으로 한 검정 설계에서, 이들 간섭 항-표지-IgM 은 고체상에 포획된다. 항-표지-IgM 이 또한 표지된 특이적 화합물에 결합하므로, 실제 분석물이 샘플에 존재하지 않음에도 불구하고, 표지된 분석물-특이적 결합 파트너는 고체상에 결합한다. 그 결과, 위양성 신호가 관찰된다.
검출가능 표지는 또한 전문가에게 널리 공지되어있다. 본 발명의 한 구현예에 따라서, 검출가능 표지는 효소, 또는 광, 한 구현예에서 형광, 발광, 화학발광, 전기화학발광 또는 방사능을 방사하는 표지이다. 바람직한 구현예에서 표지는 전기화학발광 표지, 한 구현예에서 트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄(II)-복합체 (Ru(bpy)) 이다. 간섭이 자가항체를 유인하는 표지 분자 및 유사 간섭 분자의 3 차원 구조에 의해 초래되며 예를 들어 광 또는 방사능과 같은 상기 표지의 신호-방사 메커니즘에 의해서는 초래되지 않으므로, 모든 상기 언급한 표지가 본 발명에서 사용될 수 있다.
용어 검출가능 표지는, 표지를 분석물-특이적 결합 파트너와 연결시키는 상기 표지에 부착되는 링커 서열을 또한 포함한다. 통상 링커 서열은 1-100 개 천연 또는 합성 아미노산의 펩티드성 백본을 기반으로 한다.
또 다른 구현예에서 면역검정 방법은 하기 단계를 포함하는, 경쟁적 포맷으로 실행될 수 있다:
a. 상기 샘플을
i. 분석물에 결합하며 검출가능 표지를 지니지 않는 제 1 결합 파트너
ii. 제 1 결합 파트너에 결합하며 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 분석물과 경쟁하는 지정자 (상기 지정자는 검출가능 표지를 지님)
iii. 고체상에 결합할 수 있고 상기 제 1 결합 파트너에 결합하며 상기 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 상기 분석물 및 상기 지정자와 경쟁하는 제 2 결합 파트너
iv. 상기 지정자의 상기 검출가능 표지에 결합하는 제 3 결합 파트너 (상기 제 3 결합 파트너는 표지를 지니지 않음)
와 함께 인큐베이션하는 단계,
b. 상기 샘플을 상기 제 1, 제 2 및 제 3 결합 파트너 및 상기 지정자와 혼화하여 면역반응 혼화물을 형성시키는 단계,
c. 상기 면역반응 혼화물을, 상기 체액 샘플에 존재하는 경우 상기 분석물이 상기 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 상기 지정자 및 제 2 결합 파트너와 경쟁하게 하고, 상기 제 3 결합 파트너가 상기 지정자의 상기 검출가능 표지와 면역반응하여 그로써 면역반응 생성물을 형성하게 하기에 충분한 시간 동안 유지시키는 단계,
d. 임의의 상기 면역반응 생성물의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계.
경쟁적 면역검정 포맷의 한 구현예를 도 5 에 설명한다. 경쟁적 면역검정 포맷에서 간섭 문제점은 하기와 같이 설명될 수 있다: 본 발명에 따른 표지-특이적 결합 파트너가 존재하지 않는 경우, 표지에 대한 간섭 화합물의 결합은 측정된 신호의 감소를 초래한다. 경쟁적 포맷에서의 신호 해석을 위해서, 실제 분석물과의 경쟁이 또한 신호 감소를 초래하므로, 이는 감소된 신호가 (위)양성 결과로서 이해되고 해석될 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 간섭을 방지하기 위해서, 본 발명에 따른 표지-특이적 결합 파트너가 면역검정 혼화물에 첨가되어, 간섭 화합물에 대한 가능한 결합 위치가 이미 점유되고 차단된다. 그 결과, 전체 신호 범위가 감소된다. 그러나 놀랍게도, 진양성 샘플에 존재하는 분석물은 여전히 검정 화합물과 경쟁하여, 이러한 진양성 샘플이 여전히 믿을만하게 검출될 수 있다.
경쟁적 면역검정 포맷에서 사용한 복수의 결합 파트너의 특성은 일부 양태에 있어서 비-경쟁적 포맷에서 사용한 것들과 상이하다. 분석물에 결합하는 제 1 결합 파트너는 상기 경쟁적 포맷에서 표지를 지니지 않는다. 검출가능 표지는, 적용되는 지정자에 대신 부착된다. 지정자는 제 1 결합 파트너에 결합하며 통상 분석물과 구조적으로 유사하다. 따라서 상기 지정자는 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 분석물과 경쟁한다. 상기 비-경쟁적 포맷에 대해 기재된 제 2 결합 파트너의 특성에 상응하는 한에 있어서는, 제 2 결합 파트너는 고체상에 결합할 수 있다. 그러나, 경쟁적 포맷에서 제 2 결합 파트너는 제 1 결합 파트너에 결합하며 (분석물에는 결합하지 않음), 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 분석물 및 지정자와 경쟁한다.
표지 자체를 지니지 않으며 지정자의 표지에 결합하는 제 3 결합 파트너의 특성은 비-경쟁적 포맷에 대한 것들과 동일하다. 지정물 i., ii., iii. 및 iv. 는 단지 설명적 용어이며 시간별 또는 단계별 순서가 개별적 결합 파트너의 면역반응 혼화물로의 첨가와 연관되는 방식으로 이해되어서는 안된다. 예를 들어, 제 3 결합 파트너 (단계 iv 참조) 는 마지막에 첨가될 필요는 없으나 처음으로 또한 첨가될 수 있거나, i., ii., iii. 및 iv. 하에 열거된 모든 결합 파트너가 동시에 첨가될 수 있다.
경쟁적 면역검정의 예는 항-B 형 간염 코어 항체의 검출을 위한 검정이다 (실시예 4 참조).
또 다른 구현예에서 단리된 샘플 중의 분석물을 검출하기 위한 방법은 도 6 구현예 b) 에서 설명한 바와 같은 경쟁적 포맷으로 실행될 수 있으며, 이때 지정자가 첨가되지 않으며, (이 경우 존재하지 않는 지정자 대신) 제 1 결합 파트너가 표지를 지닌다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 단리된 샘플을
i. 분석물에 결합하며 검출가능 표지를 지니는 제 1 결합 파트너
ii. 고체상에 결합할 수 있고 상기 제 1 결합 파트너에 결합하며 상기 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 상기 분석물과 경쟁하는 제 2 결합 파트너
iii. 상기 제 1 결합 파트너의 상기 검출가능 표지에 결합하는 제 3 결합 파트너 (상기 제 3 결합 파트너는 표지를 지니지 않음)
와 함께 인큐베이션하는 단계,
b. 상기 샘플을 상기 제 1, 제 2 및 제 3 결합 파트너와 혼화하여 면역반응 혼화물을 형성시키는 단계,
c. 상기 면역반응 혼화물을, 상기 체액 샘플에 존재하는 경우 상기 분석물이 상기 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 상기 제 2 결합 파트너와 경쟁하게 하고, 상기 제 3 결합 파트너가 상기 제 1 결합 파트너의 상기 검출가능 표지와 면역반응하여 그로써 면역반응 생성물을 형성하게 하기에 충분한 시간 동안 유지시키는 단계,
d. 임의의 상기 면역반응 생성물의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계.
또 다른 구현예에서 방법은 도 6 구현예 c) 에서 설명한 바와 같은 경쟁적 포맷으로 실행될 수 있으며, 이때 제 2 결합 파트너가 첨가되지 않으며, (이 경우 존재하지 않는 제 2 결합 파트너 사용 대신) 제 1 결합 파트너가 고체상에 결합할 수 있다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 단리된 샘플을
i. 검출가능 표지를 지니지 않으며 고체상에 결합할 수 있는 분석물에 결합하는 제 1 결합 파트너
ii. 제 1 결합 파트너에 결합하며 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 분석물과 경쟁하는 지정자 (상기 지정자는 검출가능 표지를 지님)
iii. 상기 지정자의 상기 검출가능 표지에 결합하는 제 3 결합 파트너 (상기 제 3 결합 파트너는 표지를 지니지 않음)
와 함께 인큐베이션하는 단계,
b. 상기 샘플을 상기 제 1 및 제 2 결합 파트너 및 상기 지정자와 혼화하여 면역반응 혼화물을 형성시키는 단계,
c. 상기 면역반응 혼화물을, 상기 체액 샘플에 존재하는 경우 상기 분석물이 상기 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 상기 지정자와 경쟁하게 하고, 상기 제 3 결합 파트너가 상기 지정자의 상기 검출가능 표지와 면역반응하여 그로써 면역반응 생성물을 형성하게 하기에 충분한 시간 동안 유지시키는 단계,
d. 임의의 상기 면역반응 생성물의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계.
경쟁적 및 비-경쟁적 면역검정 둘 모두를 위한 분석물은 면역검정에 의해 검출되기에 충분히 큰 임의의 화학적 또는 생물학적 분자, 한 구현예에서 항원, 항체 및 호르몬일 수 있다. 일부 분석물은 감염, 염증, 패혈증, 대사, 심장 또는 종양학적 이벤트 또는 질환의 결과로서 샘플에 나타난다. 다른 분석물은 환자가 섭취하는 약물이며 이러한 약물의 농도는 모니터링할 필요가 있다 (예컨대 장기 이식 후 면역 억제를 위한 약물) (치료적 약물 모니터링). 일부 분석물, 대부분 호르몬은 생식력 체크로 측정한다.
또 다른 구현예에서 분석물은 효소, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 백신, 항체 등이다. 보다 특히, 분석물은 갑상선 호르몬, 한 구현예에서 트리요오도티로닌 (T3) 및 그의 프로호르몬 티록신 (T4), 갑상선-자극 호르몬 (TSH) 및 TSH 수용체 자가항체, 에리트로포이에틴, 인슐린, 소마토트로핀, 성장 호르몬 방출 인자, 성장 인자, 한 구현예에서 혈소판 유래 성장 인자, 상피 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α, 형질전환 성장 인자, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 II, 응혈 인자 VIII, 수퍼옥시드 디스무타아제 (superoxide dismutase), 인터페론, y-인터페론, 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 과립구 콜로니 자극 인자, 다수-혈통 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 자극 인자, 대식세포 콜로니 자극 인자, T 세포 성장 인자, 림포톡신 등일 수 있다. 한 구현예에서 분석물은 심장 마커, 한 구현예에서 트로포닌 T 및 I, NT-프로BNP, BNP 뿐 아니라 패혈증 마커이다.
한 구현예에서 분석물은 폴리펩티드, 한 구현예에서 단리된 샘플에 존재하는 항원 또는 항체이다. 한 구현예에서 분석물은 병원균이며 상기 병원균에 의한 감염으로 인해 존재하는 검출가능 단백질 및 항원이다. 분석물은 감염의 결과로서 검출가능한 면역 반응, 즉 항체, 특히 IgM 항체의 생성을 초래할 수 있는 임의의 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 병원균에서 유래할 수 있다. 예를 들어, 병원균은 하기로 이루어지는 군에서 선택된다:
i. 톡소플라스마 유기체, 한 구현예에서 톡소플라스마 곤디이,
ii. 간염 바이러스, 한 구현예에서 A 형 간염 바이러스 (HAV), B 형 간염 바이러스 (HBV) 및 C 형 간염 바이러스 (HCV);
iii. 헤르페스 바이러스, 한 구현예에서 인간 헤르페스 심플렉스 바이러스 (human herpes simplex virus) 1 및 2 (HHV1 및 HHV2), 바리셀라 조스터 바이러스 (varicella zoster virus) (HHV3), 엡스테인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus) (HHV4/EBV) 또는 인간 거대세포바이러스 (human cytomegalovirus) (HHV5) 및 인간 헤르페스 바이러스 6, 7 및 8;
iv. 루벨라 (rubella) 바이러스;
v. 레트로바이러스, 한 구현예에서 HIV 1 및 2 및 HTLV 1 및 2;
vi. 파라믹소바이러스, 한 구현예에서 홍역 바이러스 및 볼거리 바이러스;
vii. 보렐리아 (Borrelia) 유기체.
또 다른 구현예에서 분석물은 상기 열거한 임의의 병원균에 의한 감염의 결과로서 존재하는 IgM 또는 IgG 클래스의 항체이다. 분석물이 IgM 또는 IgG 항체인 경우, 분석물은 병원균의 고유한 구조적 또는 비-구조적 단백질, 한 구현예에서 캡시드/코어 항원 또는 외피 (envelope) 항원 또는 가용성 항원 (병원균 내 존재) 에서 유래하는 에피토프에 결합한다.
한 구현예에서 분석물은 톡소플라스마 곤디이, 거대세포바이러스 (CMV), 루벨라, A 형 간염 및 B 형 간염으로 이루어지는 군에서 선택되는 병원균으로의 감염에 대한 반응으로서 존재하는 IgM 클래스의 항체이다.
당업자에게 공지되어있는 모든 생물학적 액체가, 기재된 면역검정 방법에 대한 단리된 샘플로서 사용될 수 있다. 통상 사용되는 샘플은 체액 예컨대 전혈, 혈청 (blood sera), 혈장 (blood plasma), 소변 또는 타액이다. 샘플로서, 척추동물로부터 단리한 임의의 생물학적 액체를 사용할 수 있다. 한 구현예에서 샘플은 포유동물, 특히 인간으로부터 유래한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 그중 적어도 하나가 분석물에 결합하며 그중 하나가 검출가능 표지를 지니는 복수의 결합 파트너, 및 상기 검출가능 표지에 결합하나 검출가능 표지 자체는 지니지 않는 표지-특이적 결합 파트너를 포함하는, 면역검정에 의해 분석물을 검출하기 위한 시약 키트이다. 한 구현예에서 분석물-특이적 결합 파트너는 상기 표지를 지닌다. 본 발명의 추가적 주제는, 그중 하나가 고체상에 결합할 수 있는 항-인간 IgM 항체이고 그중 하나가 검출가능 표지를 지니는 톡소플라스마 곤디이 특이적 항원인 복수의 결합 파트너, 및 상기 검출가능 표지에 결합하나 검출가능 표지 자체는 지니지 않는 표지-특이적 결합 파트너를 포함하는, 톡소플라스마 곤디이에 대한 IgM 항체의 검출을 위한 시약 키트이다.
추가로, 상기 정의한 시약 키트는 대조군 및 표준 용액 뿐 아니라 당업자에 의해 사용되는 바와 같은 통상의 첨가제, 완충제, 염, 세제 등을 갖는 하나 이상의 용액 중 시약을, 사용을 위한 지시사항과 함께 포함한다.
본 발명의 추가 구현예는, 샘플에 존재하는 항-표지 항체에 의해 초래된 간섭을 제거하기 위한 시험관내 진단 시험에서의 검출가능 표지를 지니지 않는 표지-특이적 결합 파트너의 용도이다.
하기 실시예에서 본 발명을 설명한다.
실시예 1:
루테늄 표지에 대한 단일클론 항체의 생성
단일클론 항체를 생성하기 위한 일반적 절차는 당업계에 널리 공지되어있다. 사전-제형화된 융합 폴리펩티드 면역원을 실험 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 양 또는 햄스터에게, 상이한 투약량으로 복강내 투여한다. B-세포의 수집 전에 부스트 면역화 (boost immunization) 를 수행한다. B-세포 하이브리도마를 Koehler and Milstein (Koehler, G. and Milstein, C., Nature 256 (1975) 495-497) 의 방법에 따라 수득할 수 있다. 수득한 하이브리도마를 단일 클론 또는 세포로서 다중 웰 플레이트의 웰에 침적시킨다. 1 차 배양 상청액을 면역원에 대한 반응성에 대해 ELISA 에 의해 시험한다.
선행 기술에 기재된 절차에 따라 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin) 에 접합된 면역원 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 N-히드록시숙신이미드 (BPRu-KLH) 를 마우스에게 투여하여, 전기화학발광 표지 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 N-히드록시숙신이미드에 대한 특이성을 갖는 단일클론 마우스 항체를 생성하였다. 면역화로부터 수득한 세포를, 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 N-히드록시숙신이미드에 대한 그의 특이성에 대해 ELISA 를 사용하여 분석하였다.
8-12 주령 Balb/c 마우스 각각에 대해, 키홀 림펫 헤모시아닌에 접합된 면역원 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 N-히드록시-숙신이미드 100 ㎍ (BPRu-KLH) 으로 반복 복강내 면역화를 실시하였다. 마우스를 3 회, 즉 또한 초기 면역화 후 6 주 및 10 주 시점에서 면역화하였다. 완전 프로인트 (Freund) 아쥬반트를 사용하여 제 1 면역화를 수행하였고, 불완전 프로인트 아쥬반트를 사용하여 제 2 및 제 3 면역화를 수행하였다. 하기에서 기재된 바와 같이 ELISA 방법에 의해 12 주 후 마우스 혈청 역가를 시험하였다. 마이크로플레이트 판독기에서 ELISA 를 수행하였다. ELISA 플레이트를, 1 ㎖ 당 0.5 ㎍ 항원을 포함하는 용액을 적용하여, 키홀 림펫 헤모시아닌에 접합된 면역원 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 N-히드록시숙신이미드 (BPRu-KLH) 로 코팅하였다. 이후 자유 결합 위치를, 실온에서 1 시간 동안 PBS 중 1% RPLA 를 포함하는 용액을 적용하여, 블로킹하였다. 0.9% (w/v) 염화나트륨 및 0.05% (w/v) Tween 20 을 포함하는 용액으로 웰을 3 회 세척하였다. 마우스 혈청을 PBS 로 1:50 희석하고 샘플로서 사용하였다. 인큐베이션 시간은 실온에서 1 시간이었다. 0.9% (w/v) 염화나트륨 및 0.05% (w/v) Tween 20 을 포함하는 용액으로 웰을 3 회 세척하였다. 검출 항체로서, 퍼옥시다아제에 접합된 표적 항체의 불변 도메인에 대한 다중클론 항체를 사용하였다 (PAK<M-Fcγ>S-F(ab')2-POD). 검출 항체를 1% (w/v) RSA 를 포함하는 PBS 중 80 ng/㎖ 의 농도로 적용하였다. 인큐베이션 시간은 실온에서 1 시간이었다. 0.9% (w/v) 염화나트륨 및 0.05% (w/v) Tween 20 을 포함하는 용액으로 웰을 3 회 세척하였다. 그후, 웰을 실온에서 15 분 동안 ABTS 용액과 함께 인큐베이션하였다. 발색 강도를 광도계 측정하였다.
비장 세포 준비 및 골수종 세포주와의 융합 3 일 전에, 키홀 림펫 헤모시아닌에 접합된 면역원 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 N-히드록시숙신이미드 100 ㎍ (BPRu-KLH) 을 i.v. 주입하여, 최종 부스터 면역화 (booster immunization) 를 수행하였다.
하이브리도마의 ELISA 스크리닝
키홀 림펫 헤모시아닌에 접합된 면역원 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 N-히드록시숙신이미드 (BPRu-KLH) 및 블랭크 플레이트 각각에 대한 반응성에 대하여 1 차 배양 상청액을 ELISA 에 의해 시험하였다. ELISA 플레이트를 키홀 림펫 헤모시아닌에 접합된 면역원 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 N-히드록시숙신이미드 0.5　㎍/㎖ (BPRu-KLH) 로 코팅하였다. 그후, 자유 결합 위치를, 실온에서 1 시간 동안 PBS 중 1% RPLA 에 의해 블로킹하였다. 0.9% (w/v) 염화나트륨 및 0.05% (w/v) Tween 20 을 포함하는 용액으로 웰을 3 회 세척하였다. 미희석 하이브리도마 상청액을 샘플로서 사용하였다. 인큐베이션 시간은 실온에서 1 시간이었다. 0.9% (w/v) 염화나트륨 및 0.05% (w/v) Tween 20 을 포함하는 용액으로 웰을 3 회 세척하였다. 검출 항체로서, 퍼옥시다아제에 접합된 표적 항체의 불변 도메인에 대한 다중클론 항체를 사용하였다 (PAK<M-Fcγ>S-F(ab')2-POD). 검출 항체를, 1% (w/v) RSA 를 포함하는 PBS 중 80　ng/㎖ 의 농도로 적용하였다. 인큐베이션 시간은 실온에서 1 시간이었다. 0.9% (w/v) 염화나트륨 및 0.05% (w/v) Tween 20 을 포함하는 용액으로 웰을 3 회 세척하였다. 그후 웰을, 실온에서 15 분 동안 ABTS 용액과 함께 인큐베이션하였다. 발색 강도를 405 nm 에서 광도계 측정하였다. 참조 파장은 492 nm 였다. 키홀 림펫 헤모시아닌에 접합된 루테늄 (II) 트리스-바이피리딘 N-히드록시숙신이미드 (BPRu-KLH) 에 대한 결합시 ELISA 에서 신속하고 강한 색 형성을 나타내는 1 차 하이브리도마 상청액을 선택하였다. 이러한 절차를 사용하여, 실시예 3 및 4 에서 적용한 바와 같은 Mab<BPRu>M-1 IgG 를 확인하였다.
실시예 2:
톡소플라스마 곤디이에 대한 IgM 항체의 검출
톡소플라스마 곤디이에 대한 IgM 항체의 시험관내 정성적 측정을 위한 면역검정을, 자동화 Elecsys® 2010 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 에서 제조사의 지시사항에 따라 실행하였다. Elecsys® 는 Roche group 의 등록 상표이다.
Elecsys® 2010 에서 신호 검출은 전기화학발광을 기반으로 한다. 비오틴-접합체 (즉, 포획-항원) 를 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드의 표면에 고정시키는 한편, 검출-항원은 복합체화 루테늄 양이온 (산화환원 상태 2+ 와 3+ 사이를 전환함) 을 신호전달 모이어티로서 갖는다. 특이적 면역글로불린 분석물의 존재 하에, 발색성 루테늄 복합체가 고체상에 가교연결되고, 백금 전극에서 여기 후 620 nm 에서 발광한다. 신호 출력은 임의적 광 단위이다.
검정은, 항-T. 곤디이 IgM 항체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 루테닐화 T. 곤디이-특이적 재조합 항원 및 비오틴화 항-인간 IgM 마우스 단일클론 항체와 함께 인큐베이션하는, 소위 μ-포획 원리를 기반으로 한다. T. 곤디이-특이적 IgM 항체가 상기 샘플에 존재하는 경우, 항-IgM 은 이들 항체를 포획한다. 스트렙타비딘-코팅 고체상을 첨가하고 과량의 액체를 제거한 후, 루테늄 복합체 표지로부터 기원하는 전기화학발광 신호를 검출할 수 있었다.
상세히, 하기 단계를 실행하였고; 검정의 총 지속기간은 18 분이었다:
● 1 차 인큐베이션: 10 ㎕ 의 샘플을 Diluent Universal 을 사용하여 자동으로 1:20 사전희석하였다. 루테늄 복합체 (R1; Ru 복합체: 트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄(II)-복합체 (Ru(bpy))) 로 표지된 T. 곤디이-특이적 재조합 항원을 첨가하였다. 샘플에 존재하는 항-T. 곤디이 IgM 항체는 루테늄-표지된 T. 곤디이-특이적 재조합　항원과 반응하였다.
● 2 차 인큐베이션: 비오틴화 단일클론 h-IgM-특이적 항체 (R2) 및 스트렙타비딘-코팅 미세입자 (M) 를 첨가하였다. 복합체는 비오틴 및 스트렙타비딘의 상호작용을 통해 고체상에 결합하게 되었다.
● 반응 혼합물을 측정 셀에 흡입시켜, 미세입자를 전극 표면에 자성 포획시켰다. 미결합한 물질을 ProCell 로 제거하였다. 전극에 대한 전압 적용으로 화학발광 방사가 유도되어, 이를 광전자 증배관에 의해 측정하였다.
● 샘플의 반응 산물로부터 수득한 전기화학발광 신호와 교정에 의해 사전에 수득한 컷 오프 값의 신호를 비교하여, 소프트웨어에 의해 자동으로 결과를 측정하였다.
음성 교정자로서 항-톡소 IgM 에 대해 음성인 Cal1 인간 혈청을 사용하였다. 양성 교정자로서 인간 혈청 중 대략 130 U/㎖ (Roche 유닛) 로 Cal2 항-톡소 IgM (인간) 을 적용하였다.
실시예 3:
톡소플라스마 곤디이에 대한 IgM 항체에 대한 면역검정에서의 간섭 감소
시판 인간 혈청 샘플을 in.vent Diagnostica GmbH (Hennigsdorf/Berlin, Germany) 로부터 구입하고, 간섭 특성에 대해 스크리닝하였다. 이들 샘플을 인-하우스 (in-house) 위양성 샘플 뿐 아니라 톡소 IgM 및 IgG 진양성 샘플과 함께 시험하였다. 톡소 IgM 및 IgG 양성 샘플 중에서, 샘플의 2 개 하위군, 즉 높은 결합활성의 IgG 를 갖는 1 개 군 (후기 감염) 및 낮은 결합활성의 IgG 를 갖는 1 개 군 (초기 또는 1 차 감염) 을 또한 시험하였다. 모든 샘플을 상기 기재한 절차에 따라 Elecsys Toxo IgM (Roche Diagnostics GmbH Germany) 으로 시험하였다. 음성 대조군으로서 PC1 [항-톡소 항체가 없는 인간 혈청] 을 사용하였고; 양성 대조군으로서 PC2 [톡소-IgM 양성 인간 혈청] 를 사용하였다. 신호 대 컷 오프 비 (S/CO) < 0.8 은, 비-반응성 (음성) 인 것으로서 간주하였고; 신호 대 컷 오프 비 (S/CO) ≥ 0.8 < 1.0 은, 미측정된 것으로 분류하였고, 신호 대 컷 오프 비 (S/CO) ≥ 1.0 은, 반응성 (양성) 인 것으로서 분류하였다.
결과를 도 1 에 나타낸다. "C21" 에서 시작하여 "SN947 (16)" 까지의 간섭 샘플로서 분류된 간섭 혈청을 제거하기 위한 표지-특이적 결합 파트너의 부재 하에, 이들 샘플은 위양성으로서 나타난다. 표지에 결합하는 표지-특이적 결합 파트너 (Mab<BPRu>M-1 IgG) 를 첨가하는 경우, 실제 양성을 포함하는 모든 샘플에 대해 전체 신호가 감소한다. 그러나, 컷 오프 지수는 일정하게 남아있다. 실제 양성 샘플은 여전히 양성으로서 올바르게 검출된다. 흥미롭고 놀랍게도, 간섭 샘플에 대한 신호는 음성 교정 값으로 하강한다. 즉, 표지-특이적 결합 파트너가 첨가되는 경우, 위양성이 방지되어 더 높은 검정 특이성을 초래할 수 있다.
도 2 는 상이한 농도의 표지-특이적 결합 파트너에서의 간섭 제거 효과의 결과를 나타낸다. 시판 음성 샘플 및 인-하우스 샘플 (어떠한 T. 곤디이 항체도 함유하지 않음) 을 Elecsys 항-톡소 IgM 검정에서 양성 결과에 대해 시험하였다. 참조 컬럼은 시험한 8 개 샘플 모두가, 컷 오프 값을 초과하는 양성 신호를 제공한다는 것을 나타낸다 (이들 샘플이 톡소-IgM 항체를 함유한다는 것을 거짓으로 나타냄).
증가량 (0.25, 0.5 및 10 ㎍/㎖) 의 간섭-제거 화합물을 검정 혼합물 (R1), 즉 이러한 경우 재조합 톡소 항원에 부착된 신호-생성 루테늄 복합체에 결합하는 항-루테늄 복합체 단일클론 항체 Mab<BPRu>M-1 IgG 에 첨가하였다. 예상한 바와 같이, 상기 표지-특이적 결합 파트너를 첨가함으로써 절대 신호 강도가 켄칭된다. 그러나 놀랍게도, 충분한 항-표지-특이적 결합 파트너를 첨가하는 경우, 간섭이 억제되어 컷 오프 미만 및 컷 오프 지수 미만의 올바른 결과가 제공될 수 있다 (R1 중 10 ㎍/㎖ 열을 참조). 이 실시예에서 표지에 비한 표지 특이적 결합 파트너 (2 개 파라토프를 가짐) 의 몰 과량 또는 비율은 약 1:10 이며, 즉 표지가 약 10 배 과량으로 존재함으로써, 10 번째 표지마다 표지-특이적 결합 파트너에 의해 커버된다.
R1 중 1 ㎍/㎖ 의 농도 (더 작은 비율의 표지가 차폐되는 것을 의미함) 에서도, 간섭의 만족스러운 제거가 관찰될 수 있다 (데이터는 나타내지 않음). 즉, 표지에 결합하는 표지-특이적 결합 파트너의 첨가는, 분석물이 존재하는지 여부에 관계없이 간섭을 효과적으로 억제하여 위양성 검정 결과가 방지될 수 있다는 것을 나타내는 것을 의미하였다. 동시에, 양성 대조군 (행 PC1, 음성 대조군 및 PC2, 톡소-IgM 을 함유하는 양성 대조군) 은 여전히 올바른 음성 또는 양성 결과를 제공한다.
실시예 4
항-B 형 간염 코어 IgG 및 IgM 항체의 검출 (경쟁적 포맷)
B 형 간염 코어 항원에 대한 IgG 및 IgM 항체의 시험관내 정성적 측정을 위한 면역검정을, 자동화 Elecsys® 2010 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 에서 제조사의 지시사항에 따라 실행하였다. Elecsys® 는 Roche group 의 등록 상표이다. 분석기에서의 일반적 검출 원리는 실시예 1 에서 기재한 바와 유사한 방식으로 작동한다 (항-톡소 IgM).
상세히, 항-HBc 검정은, 분석물 (항-HBc 항체) 이 반응 혼합물에서 HBc 항원에 대한 결합을 위해 비오틴화 및 루테늄-표지된 항체와 경쟁하는 경쟁 원리에 따라 작동한다. 검정의 총 지속기간은 27 분이었다.
● 1 차 인큐베이션: 환원제 (RO) 로 40 ㎕ 의 샘플의 전처리를 실행하였다.
● 2 차 인큐베이션: HBcAg 재조합 항원 (R1) 첨가 후, 샘플에서 항-HBc 항체와 복합체가 형성되었다.
● 3 차 인큐베이션: 스트렙타비딘-코팅 미세입자 (M) 와 함께, HBcAg 에 대해 특이적인 비오틴화 항체 및 루테늄 복합체-표지 항체 (R2; Ru 복합체: 트리스(2,2'-바이피리딜)루테늄(II)-복합체 (Ru(bpy)) 첨가 후, HBc-항원 상 여전한 자유 결합 위치 (still-free binding site) 가 점유되었다. 전체 복합체는 비오틴 및 스트렙타비딘의 상호작용을 통해 고체상에 결합하였다.
● 반응 혼합물을 측정 셀에 흡입시켜, 미세입자를 전극 표면에 자성 포획시켰다. 미결합한 물질을 ProCell 로 제거하였다. 전극에 대한 전압 적용으로 화학발광 방사가 유도되어, 이를 광전자 증배관에 의해 측정하였다.
● 샘플의 반응 산물로부터 수득한 전기화학발광 신호와 교정에 의해 사전에 수득한 컷 오프 값의 신호를 비교하여, 소프트웨어에 의해 자동으로 결과를 측정하였다.
음성 교정자로서 Cal1 인간 혈청 (B 형 간염에 의해 감염되지 않음) 을 사용하였다. 양성 교정자로서 Cal2 항-HBc (인간) (인간 혈청 중 8 WHO IU/㎖ 초과) 를 사용하였다. WHO IU 는 WHO 국제 단위를 의미한다.
도 3 은 B 형 간염 코어 항원에 대한 항체의 검출을 위한 면역검정에서 표지-특이적 결합 파트너 첨가에 의한 간섭 제거를 보여준다. 이러한 검정을 경쟁적 포맷으로 수행하는데, 이는 높은 신호 및 > 1.0 의 신호 대 컷 오프 비가 비-반응성 (음성) 샘플을 나타내는 한편, 낮은 신호 및 ≤ 1.0 의 신호 대 컷 오프비가 반응성 (양성) 샘플을 나타낸다는 것을 의미한다.
샘플 SE-0064_18 (Trina A-HBc 음성 혈청) 은 신호 대 컷 오프 값 1.02 로, 컷 오프에 매우 가까운 신호를 제공한다. 표지-특이적 결합 파트너를 첨가하는 경우, 샘플은, 항-HBc 항체가 상기 샘플에 존재하지 않음을 나타내는 측정 결과 (S/CO = 1.80) 를 제공한다. 또한 이러한 경우 표지-특이적 결합 파트너의 첨가는 검정의 특이성 증가를 초래한다.
실시예 5
갑상선-자극 호르몬 검출 (TSH, 티로트로핀, 전통적 샌드위치 포맷)
TSH 의 시험관내 정량적 측정을 위한 면역검정을, 자동화 Elecsys® cobas 분석기 (Roche Diagnostics GmbH) 에서 제조사의 지시사항에 따라 실행하였다. Elecsys® 는 Roche group 의 등록 상표이다. 분석기에서의 일반적 검출 원리는 실시예 1 에서 기재한 바와 유사한 방식으로 작동한다 (항-톡소 IgM).
상세히, TSH 검정은, 반응하여 샌드위치 복합체가 형성되도록 하는, 루테늄 복합체 (R2) 로 표지된 단일클론 TSH-특이적 항체 및 비오틴화 단일클론 TSH-특이적 항체 (R1) 를 포함하는 시약 R1 을 사용하여 샌드위치 원리에 따라 작동한다. 1 차 인큐베이션 단계로서, 30 ㎕ 의 샘플을 두 항체 모두와 함께 9 분 동안 인큐베이션하였다. 제 2 단계에서, 스트렙타비딘-코팅 미세입자를 포함하는 시약 R2 를 첨가하고, 추가 9 분 동안 인큐베이션하였다. 이후 반응 혼합물을 측정 셀에 흡입시켜, 미세입자를 전극 표면에 자성 포획시켰다. 전극에 대한 전압 적용으로 화학발광 방사가 유도되어, 이를 광전자 증배관에 의해 측정하였다. 2-포인트 교정에 의해 기구 특이적으로 생성되는 교정 곡선을 통해 결과를 측정하였다.
각각의 샘플에 대해 2 개 분취액을 측정하였다. 1 개 분취액을 간섭-감소 결합 파트너 첨가 없이 표준 절차로 측정하였다 (미처리 참조물). 두 번째 분취액을 비교 분취액으로서 R1 및 R2 와 함께 인큐베이션하였으나, 두 번째 분취액에 대한 R2 시약 (루테닐화 항체) 은 표지-특이적 결합 파트너 (여기서: 20 ㎍/㎖ Mab<BPRu>M-1 IgG, 루테늄 복합체에 특이적으로 결합함), 루테늄 표지 복합체에 결합하는 마우스 단일클론 항체를 추가로 함유하였다.
도 7 에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 교정자에 대한 절대 카운트 (absolute count) (Cal1 낮은 TSH 농도, Cal2 높은 TSH 농도) 는 미처리 참조물과 비교하여, 항-간섭제를 적용하는 설정에 대해 감소한다. 그러나, Cal2 에 대한 신호 카운트가 50% 감소함에도 불구하고, 타당한 측정 범위가 여전히 이용가능하다. TSH 농도의 확실한 표적 범위를 제공하는 대조군 (1.25-1.79 μIU/㎖ 을 갖는 PCU_1 및 7.59-10.3 μIU/㎖ 을 갖는 PCU_2) 에 대해, 이들 표적 범위는 표지-특이적 결합 파트너의 첨가 후 완전히 충족된다.
다음 단계로서, 표지-특이적 결합 파트너 첨가 없이 간섭 샘플 1 ~ 4 를 측정하였는데, 이들 샘플은 특정 TSH 농도를 나타내는 것으로 보였다. 이들 샘플은 미처리 TSH 표준 검정에서 매우 높은 신호를 나타내었는데, 이들 환자의 병력에 따른 갑상선 호르몬 분석의 개별 의료 사진에 들어맞지 않았다. 그러나, 본 발명에 따른 표지-특이적 결합 파트너를 첨가했을 때, 간섭이 상당히 감소하여 4 개 샘플 중 3 개 샘플이 올바른 TSH 표적 범위에서 발견되었다. 예를 들어, 간섭 샘플 3 은 - 미처리 측정시 - 143,728 의 신호를 제공하였다. 표지-특이적 항체 첨가시, 상기 간섭이 완전히 감소하여 782 카운트를 초래하였는데, 이는 Cal1 교정자 신호에 매우 가까웠다 (100% 간섭 감소). 미처리 측정에서 매우 높았던 간섭 샘플 1, 2 및 4 의 TSH 농도는 표지-특이적 결합 파트너를 첨가함으로써 크게 감소하여, 각각 78%, 90% 및 69% 로 간섭 감소를 초래하였다.

Claims (11)

  1. 분석물을 함유하는 것으로 의심되는 단리된 샘플을, 그중 하나는 검출가능 표지를 지니는 복수의 결합 파트너와 함께 인큐베이션함으로써 상기 샘플에서 상기 분석물을 검출하기 위한 면역검정 방법으로서, 표지를 지니지 않으나 상기 검출가능 표지에 결합하는 표지-특이적 결합 파트너가 첨가되는, 면역검정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 면역검정 방법:
    a. 상기 샘플을
    i. 분석물에 결합하며 검출가능 표지를 지니는 제 1 결합 파트너
    ii. 고체상에 결합할 수 있으며 분석물에 결합하는 제 2 결합 파트너
    iii. 상기 제 1 결합 파트너의 상기 검출가능 표지에 결합하는 제 3 결합 파트너 (상기 제 3 결합 파트너는 표지를 지니지 않음)
    와 함께 인큐베이션하는 단계,
    b. 상기 샘플을 상기 제 1, 제 2 및 제 3 결합 파트너와 혼화하여 면역반응 혼화물을 형성시키는 단계,
    c. 상기 면역반응 혼화물을, 체액 샘플에 존재하는 경우 상기 분석물이 상기 제 1 및 제 2 결합 파트너와 면역반응하여 면역반응 생성물을 형성하게 하고; 상기 제 3 결합 파트너가 상기 제 1 결합 파트너의 상기 검출가능 표지와 면역반응하게 하기에 충분한 시간 동안 유지시키는 단계,
    d. 임의의 상기 면역반응 생성물의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계.
  3. 제 1 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 면역검정 방법:
    a. 상기 샘플을
    i. 분석물에 결합하며 검출가능 표지를 지니지 않는 제 1 결합 파트너
    ii. 제 1 결합 파트너에 결합하며 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 분석물과 경쟁하는 지정자 (specifier) (상기 지정자는 검출가능 표지를 지님)
    iii. 고체상에 결합할 수 있고 상기 제 1 결합 파트너에 결합하며 상기 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 상기 분석물 및 상기 지정자와 경쟁하는 제 2 결합 파트너
    iv. 상기 지정자의 상기 검출가능 표지에 결합하는 제 3 결합 파트너 (상기 제 3 결합 파트너는 표지를 지니지 않음)
    와 함께 인큐베이션하는 단계,
    b. 상기 샘플을 상기 제 1, 제 2 및 제 3 결합 파트너 및 상기 지정자와 혼화하여 면역반응 혼화물을 형성시키는 단계,
    c. 상기 면역반응 혼화물을, 체액 샘플에 존재하는 경우 상기 분석물이 상기 제 1 결합 파트너에 대한 결합을 위해 상기 지정자 및 제 2 결합 파트너와 경쟁하게 하고, 상기 제 3 결합 파트너가 상기 지정자의 상기 검출가능 표지와 면역반응하여 그로써 면역반응 생성물을 형성하게 하기에 충분한 시간 동안 유지시키는 단계,
    d. 임의의 상기 면역반응 생성물의 존재 및/또는 농도를 검출하는 단계.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석물이 감염, 염증, 패혈증, 대사, 심장 또는 종양학적 이벤트 또는 질환과 관련된 생물학적 또는 화학적 분자인 면역검정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 분석물이 호르몬, 항원 또는 항체인 면역검정 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 분석물이 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 병원균에 대한 항체인 면역검정 방법:
    a. 톡소플라스마 유기체, 한 구현예에서 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii),
    b. 간염 바이러스, 한 구현예에서 A 형 간염 바이러스 (HAV), B 형 간염 바이러스 (HBV) 및 C 형 간염 바이러스 (HCV);
    c. 헤르페스 바이러스, 한 구현예에서 인간 헤르페스 심플렉스 바이러스 (human herpes simplex virus) 1 및 2 (HHV1 및 HHV2), 바리셀라 조스터 바이러스 (varicella zoster virus) (HHV3), 엡스테인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus) (HHV4/EBV) 또는 인간 거대세포바이러스 (human cytomegalovirus) (HHV5) 및 인간 헤르페스 바이러스 6, 7 및 8;
    d. 루벨라 (rubella) 바이러스;
    e. 레트로바이러스, 한 구현예에서 HIV 1 및 2 및 HTLV 1 및 2;
    f. 파라믹소바이러스, 한 구현예에서 홍역 바이러스 및 볼거리 바이러스;
    g. 보렐리아 (Borrelia) 유기체.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 분석물이 IgM 클래스의 항체인 면역검정 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 분석물이 톡소플라스마 곤디이, 거대세포바이러스 (CMV), 루벨라, A 형 간염 및 B 형 간염으로 이루어지는 군에서 선택되는 병원균으로의 감염에 대한 반응으로서 존재하는 IgM 클래스의 항체인 면역검정 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출가능 표지가 효소, 방사능, 발광, 화학발광, 전기화학발광 표지인 면역검정 방법.
  10. 결합 파트너 중 적어도 하나가 분석물에 결합하고 결합 파트너 중 하나가 검출가능 표지를 지니고 결합 파트너 중 하나가 표지-특이적이며 상기 검출가능 표지에 결합하나 검출가능 표지는 지니지 않는 복수의 결합 파트너를 포함하는, 면역검정에 의해 분석물을 검출하기 위한 시약 키트.
  11. 샘플에 존재하는 항-표지 항체에 의해 초래된 간섭을 제거하기 위한 시험관내 진단 시험에서의 검출가능 표지를 지니지 않는 표지-특이적 결합 파트너의 용도.
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