JP2022500677A - ジカウイルスイムノアッセイの方法および試薬 - Google Patents

Abstract

本明細書では、対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカＩｇＭ抗体を検出する、および／または対象のジカウイルス感染症を診断するためのイムノアッセイ法および試薬が開示される。また、本開示の方法を実施するためのアルゴリズムも開示される。本開示のイムノアッセイ法、試薬、およびアルゴリズムを用いれば、ヒト対象において、抗ジカウイルス抗体の効率的で信頼できる定性的検出を行い、ジカウイルス感染症の推定陽性結果を迅速に判定することができる。
【選択図】図１

Description

本明細書では、ヒト対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体を検出する方法、および対象のジカウイルス感染症を診断する方法が開示される。

ジカウイルスは、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）に属する一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス（非特許文献１）である。フラビウイルス科には、近縁のデングウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、および黄熱病ウイルスが含まれる（非特許文献２）。ジカウイルスは、１９４７年にウガンダのジカ森のアカゲザルから初めて単離された（Ｍｕｓｓｏら、２０１６年）。ヒトのジカウイルス感染症は１９５４年にナイジェリアで初めて報告され、そのエピデミックは２００７年に西太平洋のヤップ島で初めて報告され、その後にフランス領ポリネシアで２０１３年および２０１４年に報告された。アメリカ大陸におけるジカウイルスのアウトブレイクは２０１５年３月にブラジルで初めて発生し、２０１６年３月までには複数の国々および領土に広がった（非特許文献３）。

ジカウイルス感染症は主に、感染した蚊（ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ））に刺されることによって伝染する。しかしながら、妊娠中の母体から胎児への伝染、および感染したパートナーとの性的接触による伝染が報告されている（同上参照）。輸血による伝染の可能性も記録されている（Ｍｕｓｓｏら、２０１６年）。ジカウイルス感染者の大部分は軽度の症状を呈するか、または無症候性である（症状を現さない）（非特許文献４）。一般的な症状としては、発熱、発疹、関節痛、および目の充血が挙げられ、これらの症状は最長１週間にわたって観察される場合がある（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２０１６年）。妊娠中の女性のジカウイルス感染症は、胎児の小頭症を引き起こす場合があり、公衆衛生上の大きな問題となっている。ジカウイルス感染症と、一過性の麻痺を引き起こし得る神経学的疾患であるギランバレー症候群との関連も報告されている（Ｍｕｓｓｏら、２０１６年；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２０１６年）。

ジカウイルス感染症においては、症状の発現後１週間にわたってウイルス血症が予想され、ジカウイルス特異的ＩｇＭ抗体が症状の発現から最初の１週間で発生することが報告されており、最長１２週間にわたって持続すると予想されている（Ｒａｂｅら、２０１６年）。ジカウイルス特異的ＩｇＭ抗体の検出は、ジカウイルス感染が疑われる患者の診断および適切な臨床的管理のために使用されている（同上参照）。

２０１５年から２０１６年にアメリカ大陸でジカウイルス感染症のアウトブレイクが起こったことにより、ジカウイルスに最近感染した個体の適切な臨床的管理を行うために、これらの個体においてジカウイルス特異的ＩｇＭ抗体を検出するための診断試験を早急に開発する必要が生じた。

ヒト対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカＩｇＭ抗体を検出するためのイムノアッセイが開発されてきたが、利用可能なイムノアッセイには、次のような様々な欠点がある：１）正常ドナーおよび妊娠中の女性の血清／血漿との非特異的反応性があり、そのため、ジカ非エンデミック集団（ｎｏｎ−ｅｎｄｅｍｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）における特異性が低いこと；２）ヒト対象由来のサンプル中のジカＩｇＧ抗体と交差反応性があり、その結果、ジカエンデミック集団における特異性が低いこと；３）同じアッセイで最大３つの異なる抗原を用いて単一サンプルを試験する必要があり、結果を得るまでの時間およびコストが増加すること；および／または４）各サンプルを少なくとも２つの異なるアッセイで試験する必要があり、やはり結果を得るまでの時間およびコストが増加すること。したがって、対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体を確実かつ効率的に検出するためのイムノアッセイ法および試薬が依然として必要とされている。

Ｍｕｓｓｏ Ｄ、Ｇｕｂｌｅｒ ＤＪ．Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．２０１６年７月；２９（３）：４８７〜５２４頁 Ｒａｂｅ ＩＢ、Ｓｔａｐｌｅｓ ＪＥ、Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ Ｊら、Ｉｎｔｅｒｉｍ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔｓ．ＭＭＷＲ．２０１６年；６５（２１）：５４３〜５４６頁 Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＬＲ、Ｊａｍｉｅｓｏｎ ＤＪ、Ｐｏｗｅｒｓ ＡＭ、Ｈｏｎｅｉｎ ＭＡ．Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１６年；３７４（１６）：１５５２〜１５６３頁 Ｚｉｋａ：Ｔｈｅ ｂａｓｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｈｏｗ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｉｔ．ＣＤＣ’ｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｚｉｋａ．Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎウェブサイト、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ＿ｃｄｃ＿ｇｏｖ／ｚｉｋａ／ｐｄｆｓ／ｆｓ−ｚｉｋａ−ｂａｓｉｃｓ＿ｐｄｆ．、２０１７年６月２７日公開、アクセス日：２０１６年８月１２日

本明細書では、ヒト対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体を検出する方法であって、該方法は、第１のイムノアッセイと、場合により第２のイムノアッセイとを含み、第１のイムノアッセイは：ａ）生物学的サンプルを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、標識ジカウイルス抗原、および抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体と共にインキュベートする工程であって、生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体Ｉが形成され、該複合体Ｉは、（ｉ）抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、（ｉｉ）標識ジカウイルス抗原、ならびに（ｉｉｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体を含む工程；ならびにｂ）複合体Ｉを検出する工程であって、複合体Ｉの存在は、生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在を示す工程を含み、複合体Ｉが検出された場合：ｃ）生物学的サンプルを、抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、および標識ジカウイルス抗原と共にインキュベートする工程であって、生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体ＩＩが形成され、該複合体ＩＩは、（ｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、（ｉｉ）抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、および（ｉｉｉ）標識ジカウイルス抗原を含む工程；ならびにｄ）複合体ＩＩを検出する工程であって、複合体ＩＩの存在は、生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在を示す工程を含む、第２のイムノアッセイを実行する方法が開示される。

また、対象におけるジカウイルスに対する抗体を検出する方法であって、該方法は：
ａ）対象由来の生物学的サンプルを：
抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、
抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、および
標識ジカウイルス抗原と共にインキュベートする工程であって、
生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体Ｉが形成され、該複合体Ｉは、（ｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、（ｉｉ）抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、ならびに（ｉｉｉ）標識ジカウイルス抗原を含む工程；
ｂ）複合体Ｉを検出する工程、ならびに
ｂ_ｉ）複合体Ｉが検出されない場合、対象はジカウイルス抗体陰性であると判定する工程；または
ｂ_ｉｉ）複合体Ｉが検出された場合、対象は抗ジカウイルス抗体陽性であると判定する工程
を含む、第１のイムノアッセイを実行する工程を含む方法も開示される。

本開示の方法は：
ｃ）生物学的サンプルを：
抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、および
標識ジカウイルス抗原と共にインキュベートする工程であって、
生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体ＩＩが形成され、該複合体ＩＩは、（ｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、（ｉｉ）抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、および（ｉｉｉ）標識ジカウイルス抗原を含む工程；
ｄ）複合体ＩＩを検出する工程、ならびに
ｄ_ｉ）複合体ＩＩが検出されない場合、ヒト対象は抗ジカウイルスＩｇＭ抗体陰性であると判定する工程
を含む、第２のイムノアッセイを実行する工程をさらに含み得る。

本開示の方法は：
ｄ_ｉｉ）複合体ＩＩが検出された場合、工程ｃ）およびｄ）を少なくとも二連で繰り返す工程、ならびに
ｅ）複合体ＩＩが３回中少なくとも２回の反復試験で同等に検出された場合、ヒト対象は抗ジカウイルスＩｇＭ抗体陽性であると判定する工程
をさらに含み得る。

また、キットであって：固体支持体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、および標識ジカウイルス抗原を含むキットも開示される。キットは、第１のイムノアッセイ用の試薬と、第２のイムノアッセイ用の試薬とを含んでいてよく、第１のイムノアッセイ用の試薬は：固体支持体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、および標識ジカウイルス抗原を含み；第２のイムノアッセイ用の試薬は：固体支持体、抗ヒトＩｇＭ抗体、および標識ジカウイルス抗原を含む。キットは、第１および第２のイムノアッセイの実行に関するインストラクションをさらに含んでいてもよく、インストラクションは、ヒト対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカウイルス抗体の有無を判定するために第１のイムノアッセイを実行するようにユーザに指示し、インストラクションは、第１のイムノアッセイにおいて生物学的サンプルが抗ジカウイルス抗体陽性であると判定された場合にのみ、第２のイムノアッセイを実行するようにユーザにさらに指示する。

また本明細書では、本開示の方法を実行するためのアルゴリズム、ならびに本開示の方法およびアルゴリズムを使用して対象のジカウイルス感染症を診断する方法も開示される。

発明の概要、および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと理解が深まる。本開示の方法およびキットを解説する目的で、これら方法およびキットの例示的な実施形態を図面に示す；しかしながら、これら方法およびキットは、開示される具体的な実施形態に限定されるものではない。

対象由来の所与の生物学的サンプルについて、ジカウイルス抗体陰性（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｚｉｋａ Ｖｉｒｕｓ）または推定ジカ陽性（Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ Ｚｉｋａ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の結果を判定する、「ジカ試験（Ｚｉｋａ Ｔｅｓｔ）」アルゴリズムの一実施形態の概略図である。

本開示の方法およびキットは、以下の詳細な説明を、本開示の一部をなす添付の図面と関連付けて参照することによって、より容易に理解することができる。本開示の方法およびキットは、本明細書に記載されるおよび／または示される具体的な方法およびキットに限定されないこと、また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例として説明することを目的とするものに過ぎず、特許請求される方法およびキットを限定する意図はないことを理解されたい。

別段明記しない限り、考えられる機構または作用様式または改善理由に関する説明はいずれも、解説を意図するものに過ぎず、本開示の方法およびキットは、そのような提案されるいずれの機構または作用様式または改善理由の正確性にも不正確性にも制約されないものとする。

本文書全体を通して、記載事項は、抗体を検出する方法およびジカウイルス感染症を診断する方法に関するものである。本開示が、抗体を検出する方法に関連する構成または実施形態を記載する、またはその特許権を請求する場合、そのような構成または実施形態は、ジカウイルス感染症を診断する方法にも等しく適用される。同様に、本開示が、ジカウイルス感染症を診断する方法に関連する構成または実施形態を記載する、またはその特許権を請求する場合、そのような構成または実施形態は、抗体を検出する方法にも等しく適用される。

数値の範囲が本明細書において詳述または設定されている場合、この範囲には、その両端点ならびに範囲内の個々の整数および分数のすべてが含まれ、また、これらの端点ならびに範囲内の整数および分数の様々な組み合わせが形成し得る規定範囲内の大きな数値群の部分群のすべてにより形成される、規定範囲内のより狭い範囲の各々も、これらの狭い範囲の各々が明示的に詳述されているのと同じ程度に含まれる。数値の範囲が規定の値よりも大きいと本明細書に記載される場合、それでもこの範囲は有限であり、その上限は、本明細書に記載される発明の文脈において使用可能である値に限られる。数値の範囲が規定の値よりも小さいと本明細書に記載される場合、それでもこの範囲の下限は、ゼロ以外の値に限られる。本発明の範囲が、範囲を定義する際に詳述される具体的な値に限定されるという意図はない。すべての範囲は包括的であり、組み合わせることができる。

値が「約」という先行詞の使用により近似値として表される場合、特定の値は別の実施形態を形成すると理解されるものとする。特定の数値への言及には、文脈上明らかに別異に解される場合を除き、少なくともその特定の値が含まれる。

本開示の方法およびキットの特定の構成は、明確にするために別々の実施形態の文脈において本明細書に記載されるものであるが、単一の実施形態において組み合わせて提供される場合もあることを理解されたい。反対に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において記載されている本開示の方法およびキットの様々な構成は、別々に、または任意の部分的組み合わせにおいて提供される場合もある。

本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は複数形を含む。

記載事項の諸態様に関する様々な用語が、本明細書および特許請求の範囲の随所で使用される。そのような用語には、別段の記載がない限り、それらの通常の意味が与えられる。他の具体的に定義された用語は、本明細書において提供される定義と一致するかたちで解釈されるものとする。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語に包含される例を含むことが意図される；同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語に包含される例を含むことが意図される。

本明細書では、ヒト対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体を検出する、および／またはヒト対象のジカウイルス感染症を診断するためのイムノアッセイおよび方法が開示される。

本明細書に開示される方法は、生物学的サンプルを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、標識ジカウイルス抗原、および抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体と共にインキュベートする工程を含み得る。生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体Ｉが形成され、該複合体Ｉは、（ｉ）抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、（ｉｉ）標識ジカウイルス抗原、ならびに（ｉｉｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体を含む。本方法は、複合体Ｉを検出する工程であって、複合体Ｉの存在は、生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在を示す工程をさらに含み得る。複合体Ｉが検出された場合、本方法は、生物学的サンプルを、抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、および標識ジカウイルス抗原と共にインキュベートする工程を含む、第２のイムノアッセイを実行する工程をさらに含み得る。生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体ＩＩが形成され、該複合体ＩＩは、（ｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、（ｉｉ）抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、および（ｉｉｉ）標識ジカウイルス抗原を含む。本方法は、複合体ＩＩを検出する工程であって、複合体ＩＩの存在は、生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在を示す工程をさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、ジカウイルス抗原は、ジカウイルスＮＳ１抗原、またはその免疫原性断片である。ジカウイルスＮＳ１抗原またはその免疫原性断片は、組換え型であってもよい。

いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域に免疫特異的に結合し得る。例えば、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体である。すなわち、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、ヒトＩｇＧ Ｆｃに対するヤギ抗体であってもよい。

理論に束縛されることを望むものではないが、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、インキュベーション反応において固体支持体と結合する、または別様に連結することができると予測される。例えば、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃは、固体支持体に非共有結合することができる。したがって、いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、固体支持体に間接的に結合している。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、複合体Ｉの成分である。

抗ヒトＩｇＭ抗体は、固体支持体に直接的に結合していても間接的に結合していてもよい。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＭ抗体はビオチン化され、固体支持体はストレプトアビジンを含む。したがって、抗ヒトＩｇＭ抗体は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固体支持体に間接的に結合していてもよい。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、固体支持体に間接的に結合している。さらに、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体はビオチン化され、それにより、ストレプトアビジンを含む固体支持体に間接的に結合していてもよい。

生物学的サンプルは、血清または血漿であってもよく、例えばＥＤＴＡまたはヘパリンなどの抗凝固薬をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、ヒト由来である。生物学的サンプルは、ジカウイルス感染症の症状の発現またはジカウイルスへの曝露のリスクから少なくとも８日後のヒト対象から取得される。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の正確な検出を確実にするために、ジカウイルス感染症の症状の発現またはジカウイルスへの曝露のリスクから少なくとも８日後のヒト対象から取得しなければならない。

第１のイムノアッセイである「ジカＡｂ」アッセイ（“Ｚｉｋａ Ａｂ”ａｓｓａｙ）では、抗ヒトＩｇＭ抗体および固体支持体が、トリシン、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ ２０、ＥＤＴＡ二ナトリウム、防腐剤、スルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン、および抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を含む緩衝液中に存在し得る。第２のイムノアッセイである「ジカＭ」アッセイ（“Ｚｉｋａ Ｍ”ａｓｓａｙ）では、ＩｇＭ抗体および固体支持体が、トリシン、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ ２０、ＥＤＴＡ二ナトリウム、防腐剤、スルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミンを含むが抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を含まない緩衝液中に存在し得る。

本明細書に開示される方法は、生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体のレベルを判定する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体のレベルは、検出される複合体Ｉまたは複合体ＩＩのレベルに正比例する。シグナルを検出する工程は、本明細書で使用される場合、標識のシグナルを測定し、該シグナルを、抗ジカウイルス抗体陰性であることが分かっているヒト由来の生物学的サンプルの対照シグナルと比較することを含み得る。

ジカＭアッセイにおいて複合体ＩＩが検出された場合、本方法は、ジカＭアッセイの工程を少なくとも二連で繰り返す工程、および、複合体ＩＩが３回中少なくとも２回の反復試験で同等に検出された場合、ヒト対象は抗ジカウイルスＩｇＭ抗体陽性であると判定する工程をさらに含み得る。

また本明細書では、対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体を検出する本開示の方法を含む、対象のジカウイルス感染症を診断する方法も開示される。

さらに、生物学的サンプル中のジカウイルス特異的ＩｇＭ抗体を検出するためのアルゴリズム（図１）が開示される。本明細書に開示されるアルゴリズムは、本明細書に開示される方法の効率および信頼性が高まるように、対象におけるジカウイルスに対する抗体を検出する工程において、ユーザまたは自動システムを誘導することができる。例えば、アルゴリズムを使用すると、特定のサンプルが、例えば抗ジカウイルスＩｇＭ抗体陰性であると判定するために、このサンプルに必要とされるアッセイの数を低減させることができる。いくつかの実施形態では、アルゴリズムは、生物学的サンプル中のジカウイルスに対する抗体を検出する方法においてユーザまたは自動システムを誘導するためのインストラクションセットを含む。アルゴリズムの一例は、対象におけるジカウイルスに対する抗体を検出する方法を実行するようにユーザまたはシステムに命令してもよく、この方法は：
ａ）対象由来の生物学的サンプルを：
抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、
抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、および
標識ジカウイルス抗原と共にインキュベートする工程であって、
生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体Ｉが形成され、該複合体Ｉは、（ｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、（ｉｉ）抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、ならびに（ｉｉｉ）標識ジカウイルス抗原を含む工程；
ｂ）複合体Ｉを検出する工程、ならびに
ｂ_ｉ）複合体Ｉが検出されない場合、対象はジカウイルス抗体陰性であると判定する工程；または
ｂ_ｉｉ）複合体Ｉが検出された場合、対象は抗ジカウイルス抗体陽性であると判定する工程
を含む、第１のイムノアッセイを実行する工程を含む。

アルゴリズムは、工程ｂ_ｉで複合体Ｉが検出されない場合にアッセイを終了するようにユーザまたはシステムにさらに命令し、それにより、生物学的サンプル中の抗ジカウイルス抗体を検出するのに必要なアッセイの数、試薬の量、および時間を低減させることができる。しかしながら、工程ｂ）で多義的な（すなわち、「反応性」の）結果が得られた場合、アルゴリズムは：
ｃ）生物学的サンプルを：
抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、および
標識ジカウイルス抗原と共にインキュベートする工程であって、
生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体ＩＩが形成され、該複合体ＩＩは、（ｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、（ｉｉ）抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、および（ｉｉｉ）標識ジカウイルス抗原を含む工程；
ｄ）複合体ＩＩを検出する工程、ならびに
ｄ_ｉ）複合体ＩＩが検出されない場合、ヒト対象は抗ジカウイルスＩｇＭ抗体陰性であると判定する工程
を含む、第２のイムノアッセイを実行するようにユーザまたはシステムに命令してもよい。

アルゴリズムは、工程ｄ）で複合体ＩＩが検出されない場合にアッセイを終了するようにユーザまたはシステムに命令してもよい。そうでなければ、アルゴリズムは：
ｄ_ｉｉ）複合体ＩＩが検出された場合、工程ｃ）およびｄ）を少なくとも二連で繰り返す工程、ならびに
ｅ）複合体ＩＩが３回中少なくとも２回の反復試験で同等に検出された場合、ヒト対象は抗ジカウイルスＩｇＭ抗体陽性であると判定する工程
を含む、さらなる方法工程に進むことができる。

本明細書に開示される方法および該方法を実施するためのアルゴリズムのいくつかの実施形態では、抗ジカウイルス抗体を有することが分かっている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、標識ジカウイルス抗原、および抗ヒトＩｇＭ抗体が結合している固体支持体と共にインキュベートする。抗ジカウイルス抗体が存在しなければ、標識ジカウイルス抗原が固体支持体と結合する、または別様に相互作用することはない。したがって、生物学的サンプル中に抗ジカウイルス抗体が存在しなければ、標識ジカウイルス抗原は溶液中に残り、固体支持体の単離は、標識抗原の単離をもたらさない。一方、抗ジカウイルス抗体が生物学的サンプル中に存在する場合、抗ジカウイルス抗体は、固体支持体に結合した抗ヒトＩｇＭ抗体と、標識ジカウイルス抗原とに同時に結合し、それにより、標識抗原と固体支持体とが結合し、その結果、固体支持体／標識抗原複合体が形成される。インキュベーションを行う順序は、本明細書に記載するものと異なっていてもよいことを理解されたい。さらに、ここに記載するイムノアッセイの代替的な実施形態では、標識される反応成分と、固体支持体に結合する反応成分とを、再構成してもよい。例えば、抗ジカウイルス抗体を有することが分かっている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、未標識のジカウイルス抗原が結合している固体支持体と共にインキュベートし、その後、標識された抗ヒトＩｇＭ抗体とのインキュベーションを行ってもよい。他の実施形態では、抗ジカウイルス抗体を有することが分かっている、または有することが疑われる生物学的サンプルを、未標識の抗ヒトＩｇＭ抗体が結合している固体支持体および標識ジカウイルス抗原と共に同時にインキュベートしてもよいし、あるいは、未標識のジカウイルス抗原が結合している固体支持体および抗ヒトＩｇＭ抗体と共に同時にインキュベートしてもよい。

抗ジカウイルス抗体を有することが分かっている、または有することが疑われる生物学的サンプルは、反応混合物中で、反応が平衡に達することなく部分的反応を起こすのに十分な時間にわたって、例えば約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、または約２０分未満にわたってインキュベートすることができる。標識ジカウイルス抗原を加え、生物学的サンプルと共に、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、または約２０分未満にわたってインキュベートしてもよい。抗ヒトＩｇＭ抗体が結合している固体支持体を、生物学的サンプルと標識ジカウイルス抗原の混合物に加え、反応が平衡に達することなく部分的反応を起こすのに十分な時間にわたって、例えば約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、または約２０分未満にわたってインキュベートしてもよい。いくつかの実施形態では、インキュベートする工程は、合計約１０分〜約２０分、約２０分〜約３０分、約３０分〜約４０分、約４０分〜約５０分、または約５０分〜約１時間にわたって実行される。その後の検出は、約５分未満、約１０分未満、約１５分未満、または約２０分未満で実行することができる。アッセイまたはそのいずれかの工程もしくは複数の工程に必要な時間は、生物学的サンプル中の抗ジカウイルス抗体のレベル、および生物学的サンプル中の抗ジカウイルス抗体に対する抗ヒトＩｇＭ抗体の親和性といった、いくつかの要因に基づいて異なり得ることを理解されたい。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルを反応混合物と共にインキュベートする工程は、反応が平衡に達するのに十分な時間、例えば約１時間またはそれ以上のオーダーで実行してもよい。したがって、本開示の方法は、任意の好適な時間にわたって実行することができる。

抗ヒトＩｇＭ抗体は、固体支持体に直接的に結合していても間接的に結合していてもよい。抗ヒトＩｇＭ抗体を固体支持体に直接的に結合させるのに好適な技術としては、例えば、共有結合、吸着、非共有相互作用、またはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＭ抗体を、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）化学により、または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）ＮＨＳ化学により、固体支持体に直接的に結合させることができる。抗ヒトＩｇＭ抗体を固体支持体に間接的に結合させるのに好適な技術としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、リンカー、またはこれらの組み合わせによる結合が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＭ抗体は、ストレプトアビジンおよびビオチンによって固体支持体に間接的に結合していてもよい。例えば、抗ヒトＩｇＭ抗体はビオチン化することができ、固体支持体はストレプトアビジンを含むことができる。本開示のイムノアッセイの代替的な実施形態において、固体支持体に結合したいずれの反応成分にも、同じ化学を適用できることを理解されたい。

例示的な固体支持体としては、カラムマトリックス材料、培養プレート、チューブ、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズ／粒子、熱で殺してホルマリン固定した（または他の化学的に固定した）原核細胞もしくは真核細胞、顕微鏡スライド、ＡＣＬＡＲ（登録商標）フィルム、もしくは任意の他の光学的に透明なポリマー、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。固体支持体は、全体的または部分的に、プラスチック、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、ガラス、繊維ガラス、ラテックス、またはこれらの組み合わせから構成されたものであり得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、磁性ビーズ／粒子を含む。いくつかの実施形態では、磁性ビーズ／粒子は、常磁性粒子（ＰＭＰ）である。いくつかの実施形態では、磁性ビーズ／粒子は、ラテックス磁性粒子（ＬＭＰ）である。

標識は、検出可能なシグナルを生み出すのに有用であることが当業者に公知である任意の好適な標識であってよい。好適な検出可能な標識としては、酵素コンジュゲート（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼ）、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）またはその類似体である。好適なＡＥ類似体としては：ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、Ｎ−スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＮＳＰ−ＤＭＡＥ）、高量子収率アクリジニウムエステル（ＨＱＹＡＥ、アクリジニウム、９−［［４−［［［６−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−６−オキソヘキシル］アミノ］カルボニル］−２，６−ジメチルフェノキシ］カルボニル］−２，７−ビス（３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサノナデカ−１−イルオキシ）−１０−（３−スルホプロピル）−，内塩）、双性イオンアクリジニウムエステル（ＺＡＥ、アクリジニウム、９−［［４−［［［３−［［３−［［５−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，５−ジオキソペンチル］アミノ］プロピル］メチル（３−スルホプロピル）アンモニオ］プロピル］アミノ］カルボニル］−２，６−ジメチルフェノキシ］カルボニル］−１０−（３−スルホプロピル）−，ビス（内塩））、Ｎ−スルホプロピル−２−イソプロポキシジメチルアクリジニウムエステル（Ｉｓｏ−Ｄｉ−ＺＡＥ）、トリスルホプロピルアクリジニウムエステル（ＴＳＰ−ＡＥ）、またはヘキサ（エチレン）グリコールリンカーを有するＮ−スルホプロピルジメチルアクリジニウムエステル（ＨＥＧ−ＧＬＵ−ＡＥ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、標識ジカウイルス抗原は、ジカＮＳ１：ＮＳＰ−ＤＭＡＥ−ＮＨＳを含む。

抗ヒトＩｇＭ抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭアイソタイプ、または単一ドメイン形式、例えばラクダ科動物由来の単一ドメイン抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＭ抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＭ抗体は、市販の抗ヒトＩｇＭ抗体である。ヒトＩｇＭ抗体に特異的なアプタマーを使用することもできる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるイムノアッセイは、次の臨床的要件のうちの１つまたはそれ以上を満たす：
ａ．≧９０％の陽性および陰性一致率；
ｂ．併行精度０．８０−２．００指数：≦１２．０％および＞２．００指数：≦８．０％；
ｃ．同時再現性０．８０−２．００指数：≦１５．０％および＞２．００指数：≦１０．０％；
ｄ．校正周期≧７日；
ｅ．オンボード安定性≧１４日；
ｆ．一貫した標準化および性能を維持することができる制御システム。
ｇ．干渉および室間再現精度

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるイムノアッセイは、上記臨床的要件ａ．〜ｆ．のすべてを満たす。

いくつかの実施形態では、本開示のイムノアッセイは、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＤＣ）によるジカウイルスの臨床的基準（例えば、ジカウイルス感染症に関連する臨床徴候および症状の既往）および／またはＣＤＣによるジカウイルスの疫学的基準（例えば、ジカ伝染が活発な地理的領域における居住歴、もしくは旅行時にジカ伝染が活発であった地理的領域への旅行歴、またはジカウイルス試験の対象となり得る他の疫学的基準）を満たす個体から収集された血清および血漿（各々同患者の血清検体と併せて収集された、ＥＤＴＡカリウムまたはヘパリンリチウム）検体について、ジカウイルスに対するＩｇＭ抗体の推定的な定性的検出を行う、ｉｎ ｖｉｔｒｏの診断的使用を目的とする。いくつかの実施形態では、症候性患者またはエンデミックな地域からの帰着者の検体は、それぞれ、症状の発現または曝露のリスクから８日が経過するまでは収集されない。

本開示のイムノアッセイのいくつかの実施形態では、第１のイムノアッセイである「ジカＡｂ」アッセイ、および任意選択の第２のイムノアッセイである「ジカＭ」アッセイは、２パス（２−ｐａｓｓ）イムノアッセイ形式であってもよい。ジカＡｂアッセイは、２パス形式を使用した抗体捕捉イムノアッセイとすることができる。第１のパスでは、患者サンプルを、例えばキュベット内で、固体支持体に結合した抗ヒトＩｇＭ抗体と共にインキュベートすることができる。インキュベーション中、固体支持体に結合した抗ヒトＩｇＭ抗体は、患者サンプルからの抗体に結合する。捕捉された抗体は、洗浄および再懸濁される。第２のパスでは、固体支持体に捕捉された患者の抗ジカウイルス抗体を、任意の好適な化学発光試薬または他の標識試薬で標識されたジカウイルスＮＳ１抗原と共にインキュベートすることができる。標識されたＮＳ１抗原は、インキュベーション中、固体支持体の患者のジカウイルス抗体に結合する。ＮＳ１／固体支持体複合体は、洗浄し、例えば、化学発光による検出に供してもよい。

ジカＭアッセイは、２パス形式を使用したＩｇＭ捕捉イムノアッセイとすることができる。第１のパスでは、抗ヒトＩｇＭ抗体および患者サンプルでコーティングされた固体支持体をキュベット内でインキュベートして、患者サンプルからの抗ジカウイルスＩｇＭ抗体を固体支持体に結合させることができる。捕捉された抗ジカウイルスＩｇＭ抗体は、洗浄および再懸濁される。第２のパスでは、固体支持体に捕捉された抗ジカウイルスＩｇＭ抗体を、標識ＮＳ１と共にインキュベートして、固体支持体に捕捉され固定化された抗ジカウイルスＩｇＭ抗体に、ＮＳ１抗原を結合させることができる。ＮＳ１／固体支持体複合体は、洗浄し、例えば、化学発光による検出に供してもよい。

本開示の方法は、手作業で実行してもよいし、自動化してもよい。例えば、本開示の方法は、ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）イムノアッセイシステムまたはＡＴＥＬＬＩＣＡ（商標）システムを使用して実行することができる。例えば、システムを自動化して、ジカＡｂアッセイとジカＭアッセイの両方で次の動作を実行することができる：
１．サンプルをキュベットに分注する。
２．抗ヒトＩｇＭ抗体が結合している固体支持体を含む緩衝液を分注し、例えば１８．２５分間３７℃でインキュベートする。
３．固体支持体を分離／単離し、吸引し、キュベットを洗浄試薬で洗浄する。
４．化学発光標識ＮＳ１抗原を含む緩衝液を分注し、例えば１８分間３７℃でインキュベートする。
５．固体支持体を分離／単離し、吸引し、キュベットを洗浄試薬で洗浄する。
６．化学発光試薬を分注して、化学発光反応を開始する。
７．ユーザが選択したオプションに従って結果を報告する。

特定の実施形態では、本開示のイムノアッセイを適用して、ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）イムノアッセイシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＡＧ）で使用してもよく、かつ／または、ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）イムノアッセイシステムを自動化して、上記の動作を実行してもよい。

いくつかの実施形態では、患者サンプル中に存在する抗ジカウイルス抗体（すなわち、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体もしくは抗ジカウイルスＩｇＭ抗体）または抗ジカウイルスＩｇＭ抗体のレベルと、システムにより検出される相対発光量（ＲＬＵ）との間に、直接的関係が存在する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるイムノアッセイでは、次の原材料をジカＡｂアッセイおよび／またはジカＭアッセイに用いる：

ジカウイルスＮＳ１組換え抗原：本開示のイムノアッセイでは、ジカウイルスＮＳ１組換え抗原、例えばＭｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅによるものを使用することができる。ジカウイルスＮＳ１組換え抗原は、昆虫細胞で発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。

抗ヒトＩｇＭ抗体：抗ヒトＩｇＭ抗体は、ヒトＩｇＭに対するモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、ビオチンコンジュゲートであってもよい。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体をＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンで標識することにより、これを生成することができる。

ＳＥＲＡ−ＭＡＧ磁性ストレプトアビジン微粒子（ＭＧ−ＳＡ）：ＳＥＲＡ−ＭＡＧ磁性ストレプトアビジン微粒子（ＭＧ−ＳＡ）という微粒子（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を固体支持体として使用して、抗ヒトＩｇＭ抗体でコーティングされた固体支持体を含むウェットケーク（ｗｅｔｃａｋｅ）を準備することができる。

ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗血清（Ｇｏａｔ Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）：ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗血清（「ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ」）、例えばＮｉｔｔｏｂｏまたはＭｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによるものを、ジカＡｂアッセイに用いることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるイムノアッセイは、次の試薬配合例を含む。

抗ジカウイルス抗体を検出するのに好適な生物学的サンプルとしては、抗ジカウイルス抗体を含むか、または含むことが疑われる、対象由来の任意の生物学的サンプルが挙げられ、限定されるものではないが、血清または血漿などである。

本明細書に開示されるイムノアッセイは、ジカウイルス抗原を用いる。いくつかの実施形態では、ジカウイルス抗原は、ジカウイルスＮＳ１抗原である。いくつかの実施形態では、ジカウイルス抗原は、組換えジカウイルスＮＳ１抗原である。ジカウイルス抗原は、異種細胞、例えば昆虫細胞で発現させることができる。いくつかの実施形態では、ジカ抗原は、エピトープタグをさらに含む。エピトープタグは、ジカウイルス抗原のＮ末端にあってもＣ末端にあってもよい。エピトープタグは、限定されるものではないが、６−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、またはキチン結合タンパク質などの当業者に公知の任意の好適なタグであってよい。いくつかの実施形態では、ジカウイルス抗原は、Ｃ末端に６−ヒスチジンタグを含む。

本明細書ではさらに、キットが開示される。キットは、固体支持体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、および標識ジカウイルス抗原を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、第１のイムノアッセイ用の試薬と、第２のイムノアッセイ用の試薬とを含んでいてよく、第１のイムノアッセイ用の試薬は：固体支持体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、および標識ジカウイルス抗原を含み；第２のイムノアッセイ用の試薬は：固体支持体、抗ヒトＩｇＭ抗体、および標識ジカウイルス抗原を含む。キットは、第１および第２のイムノアッセイの実行に関するインストラクションをさらに含んでいてもよい。インストラクションは、ヒト対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカウイルス抗体の有無を判定するために第１のイムノアッセイを実行するようにユーザまたはシステムに指示し得る。インストラクションは、第１のイムノアッセイにおいて生物学的サンプルが抗ジカウイルス抗体陽性であると判定された場合にのみ、第２のイムノアッセイを実行するようにユーザまたはシステムにさらに指示し得る。

本明細書に開示されるキットのいずれかに好適な固体支持体および標識としては、上記の方法について開示されている固体支持体および標識が挙げられる。

以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態のうちのいくつかをさらに説明するために提供される。実施例は、本開示の実施形態を解説することを目的としており、限定を目的とするものではない。

高特異性かつ高効率の抗ジカＩｇＭ抗体イムノアッセイの開発
抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体が反応緩衝液中に存在する「ジカＡｂ」アッセイを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いない別の「ジカＭ」アッセイと併せて準備した。ジカＡｂアッセイとジカＭアッセイの両方を使用し、ジカ試験アルゴリズムを開発した（図１）。ジカ試験アルゴリズムによって、各生物学的サンプルが、まずジカＡｂアッセイ（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を含む）によって試験され、抗ジカＩｇＭ抗体もしくは抗ジカＩｇＧ抗体のいずれか、または抗ジカＩｇＭ抗体および抗ジカＩｇＧ抗体が検出される反応性サンプルのみが、その後ジカＭアッセイで試験される。

ジカＡｂアッセイでは非エンデミック集団において高い特異性が得られ、ジカ特異的なＩｇＧ抗体とＩｇＭ抗体の両方が検出できるので、このアッセイでは、ジカ特異的抗体を含む生物学的サンプル（すなわち、個体）が同定される。その後これらのサンプルを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いずジカ特異的ＩｇＭ抗体のみを検出するジカＭアッセイで試験することで、抗ジカＩｇＭ抗体を含むサンプル（すなわち、個体）が同定される。これらの個体は、ジカウイルスに最近感染したものと推定される。

ジカ試験アルゴリズムはジカＡｂアッセイによる試験を１回しか必要とせず、試験される集団の大半はジカ感染症陰性であると予想されるため、サンプルの大半は、ジカＡｂアッセイのみで試験されることになる。したがって、ジカ試験アルゴリズムは、個体の最近のジカ感染症をアッセイする際に高い特異性および感度を得るための単純な解決策を提供する。

材料
ジカＡｂイムノアッセイ（表８）およびジカＭアッセイ（表９）について、試薬の配合を最終決定した。

結果
固体支持体緩衝液にヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを入れないことにより、ＩｇＧ検出の問題が解決された。このことは、ＩｇＭ遮断実験（表１０）およびジカＩｇＧヒト化モノクローナル抗体希釈試験（表１１）によって示された。

ＩｇＭ遮断試験
ウェットケーク（抗ヒトＩｇＭ抗体でコーティングされたＳＥＲＡ−ＭＡＧ磁性ストレプトアビジン微粒子（ＭＧ−ＳＡ）（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．））を、非特異的ヒトＩｇＭ（Ｉ８２６０、Ｓｉｇｍａ）で前処理することにより、遮断実験（表１０）を実行した。ジカ陽性採血パネル数個から得たサンプルを２種の配合で試験した。一方の配合はヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを含み（表８参照）、もう一方の配合はヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを含まないものであり（表９参照）、ウェットケークは、ＩｇＭ遮断薬と共にインキュベートしたものか、そうでないものであった。反応性は相対発光量（ＲＬＵ）を測定することによって分析し、抑制率は次のように計算した：
抑制％＝［（IgM遮断なし−バックグラウンド）−（IgM遮断あり−バックグラウンド）］
（IgM遮断なし−バックグラウンド）

ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを含む配合を使用した場合は、非特異的ヒトＩｇＭとのインキュベーションにより、３９％の平均抑制率しか得られなかった。ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを含まない配合を使用した場合は、非特異的ヒトＩｇＭとのインキュベーションにより、１０３％の抑制がもたらされた。これにより、ジカＩｇＧを有することが疑われるサンプルにおいて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃなしの配合（表１０）では、ヒトＩｇＭでの遮断により、反応性が完全に消失し得ることが示された。したがって、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃなしのアッセイ配合物は、ヒト抗ジカＩｇＧに結合しない。

ジカＩｇＧヒト化モノクローナル抗体希釈試験
ジカＡｂアッセイ（ヤギ抗ヒトＦｃあり）およびジカＭアッセイ（ヤギ抗ヒトＦｃなし）のジカ特異的ＩｇＧに対する交差反応性を、ジカＮＳ１に特異的なモノクローナル抗体ＩｇＧを使用してさらに評価した。モノクローナル抗体（ＺＫＡ３５）は、ＨＵＭＡＢＳ ＢｉｏＭｅｄから取得した。ＺＫＡ３５の段階希釈物（０．００１μｇ／ｍｌ〜１．０μｇ／ｍｌ）を、ジカＡｂアッセイおよびジカＭアッセイ、ならびにプロトタイプのジカ総合アッセイ（Ｚｉｋａ Ｔｏｔａｌ ａｓｓａｙ）（抗ジカウイルスＩｇＭ抗体と抗ジカウイルスＩｇＧ抗体の両方を検出するように設計されたもの）で試験した。

各ＺＫＡ３５ ＩｇＧ希釈物の、それぞれのジカウイルスアッセイでの反応性は、シグナル（ＲＬＵ）／カットオフ（Ｓ／Ｃｏ）として計算した。正常集団およびジカＰＣＲ陽性個体群から得たサンプルの反応性に基づいて、４２５００、７００００、および３５０００のカットオフを、それぞれ、ジカＭアッセイ、ジカＡｂアッセイ、およびジカ総合アッセイに使用した。≧１．０のＳ／Ｃｏを、ＺＫＡ３５ ＩｇＧとの反応性ありとみなした。

ジカＩｇＧ抗体とジカＩｇＭ抗体の両方を検出するジカ総合アッセイは、ＺＫＡ３５ ＩｇＧ ０．０６３μｇ／ｍＬ〜１．０μｇ／ｍＬを含む希釈物との反応性があった（表１１）。ジカＡｂアッセイは、ＺＫＡ３５ ＩｇＧ ０．１２５μｇ／ｍＬ〜１．０μｇ／ｍＬを含む希釈物との反応性があり、最も高いＺＫＡ３５ ＩｇＧ濃度において、ジカ総合アッセイと比較しておよそ１０倍低い反応性を示した。ジカＭアッセイでは、試験したＺＫＡ３５ ＩｇＧ希釈物のいずれにも反応性がなかった（表１１）。これらの結果は、ジカＡｂアッセイではいくらかのジカＩｇＧ交差反応性がみられるものの、ジカＭアッセイは、１μｇ／ｍＬの濃度までジカ特異的ＩｇＧと交差反応しないことを示す。

標準化
ジカＡｂアッセイおよびジカＭアッセイのカットオフ指数は、米国本土の試験により推定されたジカウイルス陰性の正常ドナーサンプル（妊娠中の女性を含む）、ジカウイルスＰＣＲ陽性連続採血、およびデング／ウエストナイルウイルス陽性交差反応性サンプル（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｐａｎｅｌ）に基づいて設定した。ジカＡｂおよびジカＭのスタンダードの初期値は、初期開発中のカットオフに基づいて、上述の集団を小ロットのスタンダードで試験することによって決定した。次いで、第２のより大きなロットのスタンダードを作り、以前の小ロットから値を割り当てた。これらのより大きなロット（ジカＡｂスタンダードロット番号１６ＫＬ２４０およびジカＭスタンダードロット番号１７ＣＬ０５９）を、標準化のためのアンカースタンダード（Ａｎｃｈｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）とした。ゴールドスタンダードは、アンカースタンダードまでトレース可能である。ジカＡｂおよびジカＭの両方にマスター曲線を割り当て、キャリブレータ値は、内部ゴールドスタンダードまでトレース可能であった。ジカＡｂおよびジカＭのゴールドスタンダードを使用して、試薬性能の評価および確認、ならびに新しいロットのスタンダード、キャリブレータ、対照、および医療判断プール（ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｃｉｓｉｏｎ ｐｏｏｌ）のプロセス内試験および値の割り当てを行った。

ジカＡｂアッセイでは、脱線維素および透析を行ったヒト血漿と配合した６レベルのスタンダードを使用する。ジカＭアッセイでも、脱線維素および透析を行ったヒト血漿と配合した６レベルのスタンダードを使用する。ジカＡｂおよびジカＭのスタンダードは、ジカＩｇＭ抗体陽性プールを、それぞれジカＡｂおよびジカＭの陰性血漿プールに添加することによって作った。ジカＡｂおよびジカＭスタンダードレベルＳ０２〜Ｓ０６には、ジカＭ陽性プールが添加されている。最も低いジカＡｂおよびジカＭスタンダードレベルのＳ０１は、非添加のジカＡｂおよびジカＭ陰性ヒト血漿プールである。

ジカＡｂアッセイおよびジカＭアッセイでは、脱線維素および透析を行ったヒト血漿と配合した２レベルのキャリブレータを使用する。ジカＡｂおよびジカＭの高キャリブレータ（カットオフを超えるもの）は、ジカＩｇＭ抗体陽性プールを、それぞれジカＡｂおよびジカＭの陰性血漿プールに添加することによって準備した。ジカＡｂおよびジカＭの低キャリブレータ（カットオフ未満のもの）は、非添加のジカＡｂおよびジカＭ陰性ヒト血漿プールである。

ジカ試験のジカＡｂアッセイおよびジカＭアッセイでは、４ＰＬ重み付き曲線当てはめアルゴリズムに基づく２点校正曲線の当てはめを使用する。

ジカＡｂアッセイおよびジカＭアッセイはいずれも、脱線維素と透析を行ったヒト血漿と配合した２レベルの対照を使用する。ジカＡｂおよびジカＭの陽性対照は、ジカＩｇＭ抗体陽性プールを、それぞれジカＡｂおよびジカｇＭの陰性血漿プールに添加することによって準備した。ジカＡｂとジカＩｇＭの陰性対照はいずれも、非添加のジカＡｂおよびジカＭ陰性ヒト血漿プールである。

ジカＡｂアッセイおよびジカＭアッセイは各々、脱線維素および透析を行ったヒト血漿と配合した１レベルの医療判断プール（ＭＤＰ）を有する。ジカＡｂおよびジカＭの医療判断プールは、ジカＭ抗体陽性プールを、それぞれジカＡｂおよびジカＭの陰性血漿プールに添加することによって準備した。

当業者には、数多くの変更および改変が本発明の好ましい実施形態および例示された実施形態に行われること、また、かかる変更および改変が本発明の主旨から逸脱することなく行われることが理解されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の主旨および範囲に含まれる等価の変化形態のすべてを対象とすることが意図される。

Claims (36)

1. ヒト対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体を検出する方法であって、該方法は、第１のイムノアッセイと、場合により第２のイムノアッセイとを含み、第１のイムノアッセイは：
   ａ）生物学的サンプルを、
   抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、
   標識ジカウイルス抗原、および
   抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体と共にインキュベートする工程であって、
   生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体Ｉが形成され、該複合体Ｉは、（ｉ）抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、（ｉｉ）標識ジカウイルス抗原、ならびに（ｉｉｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体を含む工程；ならびに
   ｂ）複合体Ｉを検出する工程であって、複合体Ｉの存在は、生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在を示す工程を含み、
   複合体Ｉが検出された場合：
   ｃ）生物学的サンプルを、
   抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、および
   標識ジカウイルス抗原と共にインキュベートする工程であって、
   生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体ＩＩが形成され、該複合体ＩＩは、（ｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、（ｉｉ）抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、および（ｉｉｉ）標識ジカウイルス抗原を含む工程；ならびに
   ｄ）複合体ＩＩを検出する工程であって、複合体ＩＩの存在は、生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在を示す工程
   を含む、第２のイムノアッセイを実行する、前記方法。
2. 標識は、酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
3. 標識は、アクリジニウムエステル（ＡＥ）またはその類似体を含む、請求項２に記載の方法。
4. ＡＥまたはその類似体は、ＤＭＡＥ、ＮＳＰ−ＤＭＡＥ、ＨＱＹＡＥ、ＺＡＥ、Ｉｓｏ−Ｄｉ−ＺＡＥ、ＴＳＰ−ＡＥ、またはＨＥＧ−ＧＬＵ−ＡＥである、請求項３に記載の方法。
5. ジカウイルス抗原は、ジカウイルスＮＳ１抗原、またはその免疫原性断片である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. ジカウイルスＮＳ１抗原またはその免疫原性断片は、組換え型である、請求項５に記載の方法。
7. 抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 抗ヒトＩｇＭ抗体は、固体支持体に間接的に結合している、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 抗ヒトＩｇＭ抗体はビオチン化され、固体支持体はストレプトアビジンを含む、請求項９に記載の方法。
11. 抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体は、固体支持体に間接的に結合している、請求項１に記載の方法。
12. 抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体はビオチン化され、固体支持体はストレプトアビジンを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 生物学的サンプルは、血清または血漿である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 生物学的サンプルは、抗凝固薬をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. 抗凝固薬は、ＥＤＴＡまたはヘパリンを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 生物学的サンプルは、ジカウイルス感染症の症状の発現またはジカウイルスへの曝露のリスクから少なくとも８日後の対象から取得される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 第１のイムノアッセイにおいて、抗ヒトＩｇＭ抗体および固体支持体は、トリシン、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ ２０、ＥＤＴＡ二ナトリウム、防腐剤、スルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミン、および抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を含む緩衝液中に存在し、第２のイムノアッセイにおいて、ＩｇＭ抗体および固体支持体は、トリシン、塩化ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ ２０、ＥＤＴＡ二ナトリウム、防腐剤、スルフヒドリル修飾ウシ血清アルブミンを含むが抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を含まない緩衝液中に存在する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 固体支持体は、カラムマトリックス材料、培養プレート、チューブ、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 固体支持体は、常磁性粒子（ＰＭＰ）またはラテックス磁性粒子（ＬＭＰ）を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. ジカウイルス抗原はエピトープタグを含み、該エピトープタグは、６−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、またはキチン結合タンパク質である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体のレベルを判定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
22. 生物学的サンプル中の抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体のレベルは、検出される複合体Ｉまたは複合体ＩＩのレベルに正比例する、請求項２１に記載の方法。
23. 検出する工程は、標識のシグナルを測定し、該シグナルを、抗ジカウイルス抗体陰性であることが分かっているヒト由来の生物学的サンプルの対照シグナルと比較することを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 複合体ＩＩが検出された場合、第２のイムノアッセイを実行する工程は、工程ｃ）およびｄ）を少なくとも二連で繰り返す工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
25. 複合体ＩＩが３回中少なくとも２回の反復試験で同等に検出された場合、ヒト対象は抗ジカウイルスＩｇＭ抗体陽性であると判定する工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. ヒト対象におけるジカウイルスに対する抗体を検出する方法であって、該方法は：
    ａ）対象由来の生物学的サンプルを：
    抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、
    抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、および
    標識ジカウイルス抗原と共にインキュベートする工程であって、
    生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体Ｉが形成され、該複合体Ｉは、（ｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、（ｉｉ）抗ジカウイルスＩｇＧ抗体、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、または抗ジカウイルスＩｇＧ抗体および抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、ならびに（ｉｉｉ）標識ジカウイルス抗原を含む工程；
    ｂ）複合体Ｉを検出する工程、ならびに
    ｂ_ｉ）複合体Ｉが検出されない場合、対象はジカウイルス抗体陰性であると判定する工程；または
    ｂ_ｉｉ）複合体Ｉが検出された場合、対象は抗ジカウイルス抗体陽性であると判定する工程
    を含む、第１のイムノアッセイを実行する工程を含む、前記方法。
27. ｃ）生物学的サンプルを：
    抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、および
    標識ジカウイルス抗原と共にインキュベートする工程であって、
    生物学的サンプル中、抗ジカウイルスＩｇＭ抗体の存在下で、複合体ＩＩが形成され、該複合体ＩＩは、（ｉ）抗ヒトＩｇＭ抗体を含む固体支持体、（ｉｉ）抗ジカウイルスＩｇＭ抗体、および（ｉｉｉ）標識ジカウイルス抗原を含む工程；
    ｄ）複合体ＩＩを検出する工程、ならびに
    ｄ_ｉ）複合体ＩＩが検出されない場合、ヒト対象は抗ジカウイルスＩｇＭ抗体陰性であると判定する工程
    を含む、第２のイムノアッセイを実行する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. ｄ_ｉｉ）複合体ＩＩが検出された場合、工程ｃ）およびｄ）を少なくとも二連で繰り返す工程、ならびに
    ｅ）複合体ＩＩが３回中少なくとも２回の反復試験で同等に検出された場合、ヒト対象は抗ジカウイルスＩｇＭ抗体陽性であると判定する工程
    をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 検出する工程は、標識のシグナルを測定し、該シグナルを、抗ジカウイルス抗体陰性であることが分かっているヒト由来の生物学的サンプルの対照シグナルと比較することを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
30. キットであって：
    固体支持体、
    抗ヒトＩｇＭ抗体、
    抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、および
    標識ジカウイルス抗原
    を含む前記キット。
31. 標識は、酵素コンジュゲート、蛍光プローブ、放射性同位元素、化学発光化合物、生物発光化合物、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３０に記載のキット。
32. 標識は、アクリジニウムエステル（ＡＥ）またはその類似体である、請求項３１に記載のキット。
33. 固体支持体は、カラムマトリックス材料、培養プレート、チューブ、皿、フラスコ、マイクロタイタープレート、ビーズ、微粒子、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のキット。
34. 固体支持体は、常磁性粒子（ＰＭＰ）またはラテックス磁性粒子（ＬＭＰ）である、請求項３３に記載のキット。
35. 第１のイムノアッセイ用の試薬と、第２のイムノアッセイ用の試薬とを含むキットであって、
    該第１のイムノアッセイ用の試薬は：
    固体支持体、
    抗ヒトＩｇＭ抗体、
    抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、および
    標識ジカウイルス抗原を含み；
    該第２のイムノアッセイ用の試薬は：
    固体支持体、
    抗ヒトＩｇＭ抗体、および
    標識ジカウイルス抗原
    を含む、前記キット。
36. 第１および第２のイムノアッセイの実行に関するインストラクションをさらに含むキットであって、インストラクションは、ヒト対象由来の生物学的サンプル中の抗ジカウイルス抗体の有無を判定するために第１のイムノアッセイを実行するようにユーザに指示し、インストラクションは、第１のイムノアッセイにおいて生物学的サンプルが抗ジカウイルス抗体陽性であると判定された場合にのみ、第２のイムノアッセイを実行するようにユーザにさらに指示する、請求項３５に記載のキット。

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