BR102016011318A2 - Sequence of nucleic acid, recombinant antigen, diagnostic kits, and uses of the same - Google Patents

Abstract

a presente invenção descreve um antígeno recombinante derivado da proteína não estrutural 1 do zikv (deltan-ns1) capaz de diferenciar, de forma específica, anticorpos gerados após a infecção pelo zikv e diferenciá-los de anticorpos gerados após infecção com o vírus dengue (denv) ou outros flavivírus. adicionalmente, a presente invenção descreve a montagem de kits de diagnóstico sorológico para a detecção do zikv em diferentes plataformas tecnológicas de aplicação, bem como seu uso no diagnóstico diferencial de indivíduos infectados pelo zikv.

Description

SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, ANTÍ6EN0 RECOMBINANTE, KITS DE DIAGNÓSTICO, E USOS DOS MESMOS

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se insere no campo da medicina, mais precisamente na área do diagnóstico sorológico de doenças, e descreve um antigeno recombinante derivado da proteína não estrutural 1 do ZIKV (ΔΝ-NSl) capaz de diferenciar, de forma específica, anticorpos gerados após a infecção pelo ZIKV e diferenciá-los de anticorpos gerados após infecção com o vírus dengue (DENV) ou outros flavivírus. Adicionalmente, a presente invenção descreve a montagem de kits de diagnóstico sorológico para a detecção do ZIKV em diferentes plataformas tecnológicas de aplicação, bem como seu uso no diagnóstico diferencial de indivíduos infectados pelo ZIKV.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO E ESTADO DA TÉCNICA

[002] Os flavivírus são um grupo de mais de 70 tipos de vírus de RNA envelopados que causam serias doenças em humanos e animais. A maioria deles são arbovírus, pois são transmitidos de mamífero-mamífero por vetores artrópodes (GUBLER, D.J., KUNO, G., AND MARKOFF, L. (2007). Flaviviruses. In Fields Virology, Fith Edition, D.M. Knipe and P.M. Howley, eds. (Philadelphia, PA: Lippincott, Williams, and Wikins), pp. 1153-1252). Diversos membros do gênero flavivírus, como o vírus dengue (DENV), vírus da febre amarela (YFV), vírus do Oeste do Nilo (WNV), vírus da encefalite Japonesa (JEV) e o vírus zika (ZIKV), são altamente patogênicos para humanos, e por isso constituem um problema de saúde pública em nível global (MACKENZIE, J.M., GUBLER, D.J., AND PETERSEN, L.R. (2004). Emerging flaviviruses: the spread and resurgence of Japanese encephalitis, West Nile and dengue viruses. Nat. Med, 10, S98-S109) . Todos esses vírus compartilham um alto grau de semelhança genética e estratégia de replicação, e ainda assim, causam um amplo espectro de sinais clínicos em humanos. O diagnóstico clínico de diferentes flavivírus não é confiável devido aos sintomas inespecíficos, de modo que o diagnóstico laboratorial é obrigatório para confirmar a etiologia da doença. Desse modo, o desenvolvimento de métodos de diagnósticos sensíveis e específicos contra cada tipo de infecção viral é de extrema importância.

[003] Nas infecções por flavivírus, o vírion pode ser encontrado no soro ou plasma, em geral de 2-7 dias após o início dos sintomas da doença. A duração da fase virêmica, bem como, a carga viral pode variar dependendo do vírus infectante. Geralmente, após 5-7 dias do início dos sintomas, há o início da resposta imune contra a infecção, com a produção máxima de anticorpos de imunoglobulinas do tipo M (IgM) após cerca de 15 dias do início dos sintomas. Estes anticorpos IgM pode durar desde meses (como no caso do DENV) a anos (como no caso de infecção pelo WNV) . O aparecimento de Imunoglobulinas do tipo G (IgG) ocorre após 8-10 dias a partir do início da febre, e pode ser detectada ao longo de praticamente toda a vida do indivíduo (GUBLER, D.J., KUNO, G., AND MARKOFF, L. (2007). Flaviviruses. In Fields Virology, Fith Edition, D.M. Knipe and P.M. Howley, eds. (Philadelphia, PA: Lippincott, Williams, and Wikins).

[004] As características particulares de cada flavivírus marcadamente podem influenciar os tipos de diagnósticos a serem aplicados na identificação de infecções por flavivírus. Em geral, muitos laboratórios escolheram testes sorológicos para o diagnóstico de infecções causadas por flavivírus, devido à sua precisão e a disponibilidade de testes comerciais com base em elevados padrões de qualidade. No entanto, a presença de reações sorológicas cruzadas entre os diferentes vírus, e o tempo necessário para a detecção dos anticorpos em algumas infecções, prejudicam a utilidade da sorologia como uma ferramenta de diagnóstico de infecções agudas de flavivírus (ALLWINN, R., DOERR, H.W., EMMERICH, P., SCHMITZ, H., REISER, W. (2002). Cross-reactity in flavivírus serology: new implications of na old finding? Med Microbiol Immunol. 190 (4) : 199-202) .

[005] O isolamento viral constitui o método "padrão ouro" para alcançar um diagnóstico confirmatório de flavivírus (CHAMBERS, T.J., AND MONATH, T.P. (2003) The Flaviviruses: Detection, Diagnosis, and Vaccine Development. Advances in Virus Research, Vol. 61 3-577). No entanto, os requisitos técnicos para manter a viabilidade viral após a amostragem e o tempo necessário para realizar o isolamento e chegar a um resultado (na maioria dos casos mais de 7 dias) torna o isolamento viral inadequado e ineficiente para o manejo clínico dos pacientes e para o controle da doença.

[006] A descoberta de marcadores de início da infecção para alguns flavivírus tornaram possível o desenvolvimento de testes rápidos para detecção, mesmo na fase aguda da doença (HOBSON-PETERS, J. (2012) Approaches for the Development of Rapid Serological Assays for Surveillance and Diagnosis of Infections Caused by Zoonotic Flaviviruses of the Japanese Encephalitis Virus Serocomplex. Journal of Biomedicine and Biotechnology. Article ID 379738, 15 pages. doi:10.1155/2012/379738). Nesse cenário, a proteína NS1 teve importante papel no desenvolvimento desses testes, principalmente no diagnóstico de infecção por DENV (YOUNG, P.R., HILDITCH, P.A., BLETCHLY, C., HALLORAN, W. (2000) An antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay reveals high leveis of the dengue virus protein NS1 in the sera of infected patients. J. Clin. Microbiol., 38, pp. 1053-1057).

[007] A proteína não estrutural 1 (NS1) é uma glicoproteína com aproximadamente 43-48 kDa, altamente conservada entre os flavivírus, visto a sua crucial importância na replicação viral. Em uma célula de mamífero infectada, a NS1 é expressa como monômeros que se associam formando dímeros no interior do retículo endoplasmático, de onde é subsequentemente transportada para a superfície da célula, onde pode permanecer como proteína associada à membrana, ou ser secretada para o meio extracelular na forma hexamérica (WINKLER, G., RANDOLPH, V.B., CLEAVES, G.R., RYAN, T.E., STOLLAR, V. (1988) Evidence that the mature form of the flavivirus nonstructural protein NS1 is a dimer. Virology, 1 (1988), pp. 187-196; FLAMAND, M., MEGRET, F., MATHIEU, M., LEPAULT, J., REY, F.A., DEUBEL, V. (1999) Dengue virus type 1 nonstructural glycoprotein NS1 is secreted from mammalian cells as a soluble hexamer in a glycosylation-dependent fashion. J. Virol., 70, pp. 6104-6110).

[008] Em infecções por DENV, essa proteína é encontrada no sangue de pacientes infectados em altos níveis desde o primeiro dia dos sintomas e a presença da proteína circulante se estende até nove dias após o início da febre, culminando no ponto inicial de detecção de IgG específica, o que marca o início da fase de convalescência da doença (YOUNG, P.R., HILDITCH, P.A., BLETCHLY, C., HALLORAN, W. (2000) An antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay reveals high leveis of the dengue virus protein NS1 in the sera of infected patients. J. Clin. Microbiol., 38, pp. 1053-1057).

[009] A descoberta do potencial uso da NS1 como marcador para a fase inicial da doença, levou ao desenvolvimento de uma grande quantidade de métodos diagnósticos usando essa proteína como analito (CHAIYARATANA, W. et al., (2009) Evaluation of dengue nonstructural protein 1 antigen strip for the rapid diagnosis of patients with dengue infection. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 64, pp. 83-84; LEMES, E.M., et al., (2005) Circulating human antibodies against dengue NS1 protein: potential of recombinant D2V-NS1 proteins in diagnostic tests. J. Clin. Virol., 32, pp. 305-312; FRY, S.R., et al., (2011) The diagnostic sensitivity of dengue rapid test assays is significantly enhanced by using a combined antigen and antibody testing approach. PLoS Neglect. Trop. Dis., 5, p. ell99; BLACKSELL, S.D., et al., (2012) Comparison of Seven commercial antigen and antibody enzyme-linked immunosorbent assays for detection of acute dengue infection. Clin. Vacc. Immunol., 19, pp. 804-810; MULLER, D.A., CORRIE, S.R., COFFEY, J., YOUNG, P.R., KENDALL, M.A., (2012) Surface modified microprojection arrays for the selective extraction of the dengue virus NS1 protein as a marker for disease. Anal. Chem., 84, pp. 3262-32 68) . Diversas formas de métodos baseados na NS1 foram desenvolvidas no decorrer dos anos, sendo os principais: a detecção de NS1 solúvel circulante por imunocromatografia ou ensaio Imuno-enzimático (ELISA) de captura de antigeno em diagnósticos rápidos, o que implicou em sensibilidade diminuída para alguns casos previamente reportados em epidemias de dengue do sorotipo 2 (HANG, V.T., et al., (2009) Diagnostic accuracy of NS1 ELISA and lateral flow rapid tests for dengue sensitivity, specificity and relationship to viraemia and antibody responses. PLoS Neglect. Trop. Dis., 3, p. e360; RAMIREZ, A.H., et al., (2009) Evaluation of dengue NS1 antigen detection tests with acute sera from patients infected with dengue virus in Venezuela. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 65, pp. 247-253; CHATERJI, S., et al., (2011) Evaluation of the NS1 Rapid Test and the WHO dengue classification schemes for use as bedside diagnosis of acute dengue fever in adults. Am. J. Trop. Med. Hyg., 84, pp. 224-228). Essa limitação, levou ao desenvolvimento de testes que além de detectarem a NS1, acoplavam no mesmo ensaio a detecção de IgM e IgG, de modo a aumentar a sensibilidade do teste (ZAINAH, S., et al., (2009) Performance of a commercial rapid dengue NS1 antigen immunochromato-graphy test with reference to dengue NS1 antigen-capture ELISA. J. Virol. Methods, 155, pp. 157-160) , sendo estes a segunda geração de diagnósticos de dengue baseados apenas em NS1.

[010] O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus pertencente ao gênero Flavivírus transmissível aos humanos por picadas de mosquitos do gênero Aedes, sendo identificado primeiramente em macacos Rhesus em Uganda em 1947 (FAYE, 0. FREIRE, C. C. M. IAMARINO, A. FAYE, 0. DE OLIVEIRA, J. V. C. DIALLO, Μ. ZANOTTO, P. Μ. A. SALL, A. A. (2014) Molecular Evolution of Zika Virus during Its Emergence in the 20th Century. PLoS Neglected Tropical Diseases, v. 8, η. 1, p. 3) . 0 quadro clinico associado à infecção pelo ZIKV em humanos pode variar entre assintomático e quadros com diferentes sintomas, como exantema, conjuntivite, dor de cabeça e febre (DUFFY, M. R., CHEN, T.-H., HANCOCK, W. T. (2009) Zika Virus Outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. New England Journal of Medicine, v. 360, n. 24, p. 2536-254). A infecção pelo virus também está associada a manifestações neurológicas como a Sindrome de Guillain-Barré (CAO-LORMEAU, V.M. et al., (2016) Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet, pii: S0140-6736(16)00562-6). Além disso, a possível correlação entre a infecção por ZIKV e a ocorrência de microcefalia realçam a importância desta arbovirose, motivo de preocupação mundial na atualidade, e o desenvolvimento de métodos para o monitoramento e o controle da infecção (MLAKAR, J., et al., (2016) Zika Virus Associated with Microcephaly. New England Journal of Medicine, p. 16021014010600). Outro problema grave em relação ao ZIKV é a quantidade pequena de ensaios sorológicos rápidos e específicos disponíveis no mercado visto que há alta similaridade estrutural e antigênica, com outros flavivírus, principalmente, com o vírus da dengue (DENV) e o vírus da febre amarela (YFV) (MyBiosource. (2016). Disponível em: http://www.mybiosource.com/images/tds/protocol others/MBSIO 9003.pdf; MyBiosource. (2016) Disponível em: http://www.mybiosource.com/images/tds/protocol others/MBSIO 9002.pdf; Biocan. (2016) Disponível em: http://www.zikatest.com/?p=39; 88. Euroimmun. (2016) Serological diagnosis of Zika vírus infections. Disponível em: https://www.euroimmun.com/index.php?eID=dumpFile&t=f&f=3013 &token=6cc0bb2eb 7cl0f484ae50ad91e69cd6424088529). Esta característica dificulta o desenvolvimento e a implantação de ensaios de sorodiagnóstico específicos para esta infecção devido à alta reatividade cruzada de anticorpos, sobretudo em áreas endêmicas onde esses vírus co-circulam, como no Brasil.

[011] A proteína NS1, como já mencionado acima, tem sido largamente aplicada no diagnóstico para dengue, seja pela sua detecção direta no soro dos pacientes infectados em fase aguda (forma secretada), ou de forma indireta para detecção de anticorpos IgG/IgM em ensaios de ELISA e/ou imunocromatográficos.

[012] Por exemplo, a publicação intitulada "Avaliação de kits comerciais para detecção de antígenos NSl-Degue", descreve uma análise comparativa de kits comerciais para a dengue, baseados na detecção da NS1 de DENV, porém não havendo associação com ZIKV, nem com o fragmento descrito na presente invenção.

[013] A publicação intitulada "One-step RT-PCR for detection of Zika virus" demonstrou o uso da técnica de RT-PCR para a detecção do material genético do ZIKV. Entretanto, não foi utilizada a plataforma de detecção por ELISA, como demonstrada na presente invenção, nem tampouco, o uso de proteína recombinante para a realização do teste.

[014] A publicação intitulada "Concurrent inalaria and arbovirus infections in Kedougou, southeastern Senegal" descreve um método usado para detecção de imunoglobulinas específicas usando um extrato de vírus Zica, produzido em cérebro de camundongo. Apesar de ser um método de soro diagnóstico, não foram utilizadas proteínas recombinantes ou sequências artificiais na elaboração do método, bem como, a NS1 não é o antígeno alvo para detecção de anticorpos.

[015] A publicação "Zika Virus: Diagnostics for an Emerging Pandemic Threat" faz uma revisão da literatura, mostrando o que há de disponível para o diagnóstico de ZIKV. Constata-se que há poucos kits diagnósticos disponíveis para o diagnóstico sorológico específico de ZIKA, e ainda não se sabe os valores de sensibilidade e especificidade diagnostica dos mesmos, de modo que há a preconização do uso do ensaio de PRNT como melhor método para discriminar entre anticorpos específicos e não-específicos. Percebe-se que não é mencionado e/ou sugerido a disponibilidade de kits que utilizem a sequência da NS1 para teste sorológico de detecção de infecção por ZIKV.

[016] Ao contrário dos testes moleculares, que detectam o genoma viral na corrente sanguínea, saliva, ou esperma, a presente invenção permite a detecção de anticorpos na corrente sanguínea de forma rápida, simples e pouco onerosa. Ao contrário dos ensaios voltados à detecção do vírus circulante, em geral limitados a alguns dias após a infecção, o ensaio sorológico permite detectar se as pessoas já foram expostas ao vírus, mesmo anos após a infecção. A proteína NS1 já é empregada como base para o diagnóstico em indivíduos infectados pelo vírus dengue (DENV). No entanto, todos os ensaios disponíveis não são específicos para o ZIKV em função da grande homologia de sequência entre as proteínas expressas pelos dois vírus, assim como outros flavivírus (vírus febre amarela (YFV), vírus do Oeste do Nilo (WNVj, vírus da encefalite japonesa (JEV) e alphavírus endêmicos como o vírus Chikungunya (CHIV)). A invenção apresenta a identificação de um antígeno recombinante capaz de diferenciar, de forma específica, anticorpos gerados após a infecção pelo ZIKV e diferenciá-los de anticorpos gerados após infecção com DENV e outros flavivírus.

[017] Apesar de haver reatividade cruzada entre as proteínas NS1 dos flavivírus (incluindo ZIKV, DENV e YFV) , a análise comparativa das sequências das proteínas expressas por esses flavivírus indica porções onde a similaridade entre os aminoácidos é menor. Portanto, a utilização de fragmentos da NS1, que apresentem menor taxa de identidade entre esses patógenos, pode ser uma alternativa ainda não explorada na utilização desta proteína para discriminação sorológica entre o ZIKV e outros flavivírus.

[018] Diante de todos os problemas técnicos relacionados ao desenvolvimento de um antígeno baseado em proteínas do ZIKV que seja suficientemente diferente dos outros flavivírus, a ponto de ser distinguindo sorologicamente de outros flavivírus, a presente invenção demonstra a identificação de regiões na sequência da NS1 de flavivírus que são passíveis de serem expressas e purificadas em modelo procariótico de expressão heteróloga, bem como seu funcionamento como marcador de diferenciação sorológica de infecção por ZIKV, o que permite seu uso como ferramenta de desenvolvimento de diagnósticos em diversas plataformas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[019] A presente invenção tem por objetivo prover um antigeno recombinante ΔΝ-NSl do ZIKV capaz de detectar anticorpos gerados após a infecção pelo virus e diferenciá-los de forma especifica de anticorpos gerados após infecção com DENV ou outros flavivirus.

[020] Além disso, tal antigeno recombinante serve de base para kits de diagnóstico que permitam detectar anticorpos específicos em indivíduos previamente infectados pelo ZIKV sem a interferência de reações cruzadas com anticorpos gerados em indivíduos infectados por um dos tipos do DENV, vacinados contra o YFV, ou expostos a qualquer outro flavivirus ou arbovírus que compartilhe homologia parcial com o ZIKV.

[021] Adicionalmente, a presente invenção tem por objetivo prover kits de diagnóstico sorológicos a partir de diferentes bases tecnológicas, como por exemplo, ELISA, imunoblot, imunofluorescência, luminex (beads), radioimunoensaio, cromatografia tangencial (deep-sticks), entre outros, preferencialmente ELISA, para a detecção e diferenciação de indivíduos infectados pelo ZIKV de outras infectadas por outros flavivirus, a partir do antigeno recombinante derivado da proteína NS1 do ZIKV ou formas dele derivadas, por métodos de modificação de sequência, deleções, e adições de sequências heterólogas.

[022] Ainda é um objetivo da presente invenção prover usos do antigeno recombinante ΔΝ-NSl ZIKV, para a manufatura de formulações e/ou vacinas, imunoprofilaxia, e terapias, combinadas ou não a outras alternativas farmacológicas e clinicas disponíveis, para prevenção e/ou tratamento de infecção pelo vírus e seus desdobramentos clínicos, como a síndrome neurodegenerativa observada em crianças nascidas de mães infectadas durante a gravidez. Tais vacinas e terapias são baseadas, total ou parcialmente, no antigeno recombinante ΔΝ-NSl ZIKV que possa gerar respostas e efeitos específicos para a prevenção da infecção pelo ZIKV ou tratamento de pessoas infectadas pelo mesmo.

[023] Constitui outro objetivo da presente invenção a combinação de outros antígenos do ZIKV, empregando diferentes sequências genéticas ou de aminoácidos do ZIKV que, combinados à sequência antigênica da ΔΝ-NSl do vírus possam resultar em aumento de especificidade e sensibilidade do ensaio, a partir de diferentes plataformas tecnológicas, assim como modificações na sequência genética que codifica para o antigeno ΔΝ-NSl descrito.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[024] A FIG. Ia mostra esquematicamente a análise de hidrofobicidade da sequência nativa da proteína não-estrutural 1 (NS1) do ZIKV;

[025] A FIG. lb mostra esquematicamente o alinhamento da sequência de aminoácidos da região com maiores regiões hidrossolúveis, tanto do ZIKV, quanto de representantes de DENV dos quatro sorotipos, bem como, a mesma região da NS1 do YFV;

[026] A FIG. 2a mostra esquematicamente a localização da região de interesse para o uso no modelamento de uma sequência nucleotidica otimizada para expressão em organismos procariotos;

[027] A FIG. 2b mostra o alinhamento entre a sequência original e a sequência recombinante sintetizada na presente invenção;

[028] A FIG. 3a mostra o cromatograma de eluição da proteína ΔΝ-NSl ZIKV durante o processo de purificação;

[029] A FIG. 3b mostra as canaletas de eluição, onde 1 corresponde à canaleta onde foi adicionada a amostra da proteína purificada, 2 corresponde a uma amostra do extrato bacteriano solúvel obtido após passagem pela coluna de cromatografia, e M corresponde ao marcador molecular;

[030] A FIG. 4 mostra ensaios de diagnóstico sorológico específico para o ZIKV que empregam o antígeno ΔΝ-NSl como base para o desenvolvimento de kits;

[031] A FIG. 5 mostra graficamente um ensaio de imunodetecção onde amostras padrão de soros de camundongos hiperimunes para um único arbovírus (DENV, YFV, CHIV ou ZIKV) foram testadas, sendo a proteína NS1 inteira de DENV2 utilizada como um controle;

[032] A FIG. 6 mostra ensaios de ELISA utilizando as proteínas ΔΝ-NSl ZIKV e NS1 (DENV2-NGC) com diferentes soros de humanos sabidamente positivos para DENV2 e obtidos anteriormente ao surto de ZIKV (negativos para ZIKV, aqui denominados: P01 - P07) ou um soro padrão de diagnóstico (negativo para ambos os vírus, aqui denominado: DSS) obtido comercialmente;

[033] A FIG. 7 mostra uma aplicação diagnostica dos ensaios de ELISA empregando a proteína ΔΝ-NSl ZIKV, utilizando diferentes amostras de soro humano (mulheres durante a gestação (1) e bebês com microcefalia (2)) suspeitos de infecção por ZIKV;

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[034] A presente invenção descreve um antígeno recombinante ΔΝ-NSl ZIKV capaz de diferenciar, de forma específica, anticorpos gerados após a infecção pelo ZIKV e diferenciá-los de anticorpos gerados após infecção com DENV e outros flavivírus.

[035] Conforme pode ser observado a partir da análise de hidrofobicidade da sequência nativa da proteína não-estrutural 1 (NS1) do ZIKV (FIG. Ia) , a região destacada pelo retângulo amarelo representa a região com maiores regiões hidrossolúveis. Na FIG. lb, é esquematizado o alinhamento da sequência de aminoácido dessa região tanto do ZIKV (SEQ. ID. 2) quanto de representantes de DENV dos quatro sorotipos, bem como, a mesma região da NS1 do YFV. Pelo fato de que essa região apresenta variedade nos tipos de aminoácidos presentes entre os três tipos de vírus, bem como se apresentou com melhor perfil hidrofílico, optou-se pelo uso dessa região para o desenho do antígeno recombinante.

[036] A partir da FIG. 2a, pode-se observar a localização da região de interesse para o uso no modelamento de uma sequência nucleotídica otimizada para expressão em organismos procariontes, de modo que, a sequência final desenhada apresentou-se 35% diferente da sequência nucleotídica original (FIG. 2b) , como é demonstrado no alinhamento feito entre a sequência original e a sequência recombinante que foi desenhada e sintetizada na presente invenção.

[037] A sequência foi sintetizada e clonada no vetor de expressão pET28a, usando os sítios de restrição BamHI a jusante e Xhol a montante do inserto nucleotídico. Após a obtenção do vetor contendo a sequência recombinante da região da NS1 de ZIKV acima descrita, com a adição de uma sequência que codifica 6 resíduos de histidina em tandem com o inserto clonada, bactérias foram transformadas com essa sequência de DNA, de modo que se obteve a linhagem E. coli ZIKV_dNSl que é capaz de expressar a referida proteína (SAMBROOK, J; RUSSEL, D. W (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ed., 2001). 0 cultivo dessa bactéria seguido de adição do indutor de expressão possibilitou a produção da proteína ΔΝ-NSl ZIKV na forma solúvel. Em seguida, a fração solúvel do extrato bacteriano da linhagem de E. coli contendo a proteína ΔΝ-NSl ZIKV foi utilizada para purificação por método de cromatografia de afinidade ao níquel.

[038] A FIG. 3a mostra o cromatograma de eluição da proteína ΔΝ-NSl ZIKV durante o processo de purificação. As frações eluídas da purificação da proteína ΔΝ-NSl ZIKV, foram dialisadas contra um tampão tris-NaCl (pH 8,0) e uma amostra do produto dialisado foi submetida à SDS-Page (15%) . Como pode ser observado na FIG. 3b na canaleta 1, onde foi adicionada a amostra da proteína purificada, é observável uma banda com aproximadamente 17,5 kDa que corresponde à proteína recombinante gerada nesse trabalho. A canaleta M corresponde ao marcador molecular e a canaleta 2 corresponde a uma amostra do extrato bacteriano solúvel obtido após passagem pela coluna de cromatografia.

Expressão do antigeno ΔΝ-NSl ZIKV em sistema de expressão heterólogo [039] O antigeno recombinante ΔΝ-NSl ZIKV foi expresso em sistema de expressão heterólogo com linhagem de Escherichia coli BL21DEIII RIL (SAMBROOK, J; RUSSEL, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ed., 2001). O mesmo resultado se aplica para outras linhagens de E. coli e outros microrganismos compatíveis com a expressão de antígenos recombinantes, como Bacillus subtilis, Saccharamyces cerevisae, Pichia pastoris, baculovírus, células de Drosophila, células de mamífero (linhagem CHO), entre outros. Para a presente invenção, foi desenvolvida uma sequência gênica não natural (gene sintético), baseada na sequência de ácidos nucleicos do ZIKV (SEQ. ID. I) no qual foi modificada na sua composição de bases em pelo menos 30% para melhor expressão no hospedeiro bacteriano (optimização de códons), inserção de sequências de reconhecimento por enzimas de restrição (BamHI e Xhol) e sequência genética à codificação de uma sequência de histidinas necessária para a purificação por cromatografia de afinidade da proteína recombinante. A linhagem recombinante foi descongelada à temperatura ambiente, variando entre 18 °C e 30 °C, preferencialmente 25°C, e inoculada em meio de cultura (por exemplo, o meio Luria-Bertani) contendo canamicina em concentrações variando entre 30 a 100 μg/ml, preferencialmente 50 μρ/ιηΐ, que permitam a seleção de bactérias contendo o vetor de expressão que transporta a informação genética para a codificação do antigeno. Nos ensaios realizados foram empregados vetores de expressão plasmidial da série pET (por exemplo, vetor pET28a).

[040] A amostra foi cultivada por período de 12-24h em temperaturas que podem variar de 18°C a 42°C sob agitação. Para expressão da proteína ΔΝ-NSl ZIKV, a cultura foi ampliada na proporção de 1/100 em volume final que pode variar de 4 a 400 litros de meio contendo antibiótico compatível para a seleção do vetor de expressão utilizado. A cultura foi mantida em temperaturas que podem variar de 18 °C a 42 °C sob agitação até uma determinada densidade ótica (600nm) que pode variar de 0,6 a 2,0 e, em seguida, foi adicionado indutor (como por exemplo, isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) para uma concentração final que pode variar de 0,1 M a 2M para indução da expressão da proteína de interesse). Após adição do indutor, a cultura foi incubada por 16 a 36 horas sob agitação e em temperaturas que podem variar de 18°C a 42 °C sob agitação.

Purificação do antigeno ΔΝ-NSl ZIKV

[041] As células recombinantes foram suspendidas em tampão de lise (Tris 0,1 M, NaCl 0,5 M, 10% glicerol e pH 8,5) e submetidas à lise por pressão hidrostática. O mesmo procedimento pode ser feito por lise mecânica, química (enzimas) ou física (congelamento e descongelamento). 0 extrato obtido foi clarificado por centrifugação e, em seguida, o sobrenadante foi filtrado em membrana com porosidade igual ou inferior a 0,25 mcm. A proteína recombinante foi purificada a partir do extrato por cromatografia de afinidade ao níquel, sendo o antigeno recombinante eluído com Imidazol em concentrações que podem variar entre 300 mM a 3 M, preferencialmente 700mM. Após diálise em membrana filtrante ou sistema de fluxo tangencial, 0 antigeno recombinante foi quantificado por método físico (espectrometria) ou químico (Bradford), entre outros.

Ensaios de ELISA

[042] Para os ensaios de ELISA microplacas de poliestireno Maxisorp (Nunc) foram sensibilizadas por 8 h a 24 h, preferencialmente por 18h, de 4°C a 37 °C, preferencialmente a 4°C, com a proteína ΔΝ-NSl-ZIKV ZIKV purificada (de 50 a 400ng/poço). As placas são lavadas três vezes com salina tamponada contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T). Após a lavagem, o bloqueio foi realizado adicionando-se solução de leite desnatado a 5% acrescida de albumina de soro bovino (BSA) a 1% em PBS-T durante 2 h a 37°C. Após novo ciclo de lavagem (3x) , amostras (50 a 200 μΐ) dos soros diluídos individuais foram adicionadas aos poços e incubadas à temperatura ambiente por períodos que podem variar de lh a 3 h, preferencialmente lhe 30min. Depois de um novo ciclo de lavagem (3x), foram adicionados aos poços, diluição que pode variar entre 1/3.000 a 1/10.000, em um volume total que pode variar entre 50 a 200 μΐ, preferencialmente 100 μΐ, do segundo anticorpo anti-IgG de camundongo ou humano conjugado à peroxidase. Após incubação de 90 min, as placas foram lavadas 3 vezes com PBST e a revelação foi realizada com 100 pL/poço da solução reveladora por 15 min, à temperatura ambiente sob abrigo da luz, e interrompida com 50 pL por poço de ácido sulfúrico a 1 Μ. A leitura da densidade óptica será realizada a 492 nm em leitor de placa (Multiscan MS-Labsystems).

[043] Os ensaios de ELISA foram realizados com o intuito de avaliar a capacidade discriminatória da proteína ΔΝ-NSl de ZIKV como antígeno de fase sólida. Conforme demonstrado na FIG. 4, o ensaio de ELISA é um teste imunoenzimático onde, o antígeno de interesse é adsorvido nos poços de uma placa de poliestireno, e após o bloqueio desses poços, são adicionados à amostra de soro que pode ou não ter anticorpos específicos para o antígeno que está imobilizado no poço. Se há anticorpos específicos que se ligam à proteína, eles permanecem ligados mesmo após a lavagem do poço com um tampão contendo detergente não-iônico, caso contrário, onde não há anticorpos específicos, esses anticorpos serão removidos pelo tampão. No final do ensaio é adicionado um anticorpo conjugado a uma enzima, que é capaz de reconhecer porções dos anticorpos que estarão ligados, de modo que após a lavagem do poço, há adição do substrato da enzima bem como uma substância cromógena, que produzirá cor numa intensidade maior ou menor, proporcional à quantidade de anticorpos específicos que estarão ligados à proteína que foi adsorvida ao poço no início do ensaio, o que caracterizará se a amostra é positiva ou negativa.

[044] Usando esse ensaio de imunodetecção, amostras padrão de soros de camundongos hiperimunes para um único arbovírus (DENV, YFV, CHIV ou ZIKV) foram testadas, sendo a proteína NS1 inteira de DENV2 utilizada como um controle. Como é possível observar na FIG. 5, não houve reatividade cruzada significativa entre os soros testados e proteína ΔΝ-NSl ZIKV, sendo esta última reconhecida somente pelo soro ZIKV-específico.

[045] Ensaios de ELISA utilizando as proteínas ΔΝ-NS1 ZIKV e NS1 (DENV2-NGC) foram realizados com diferentes soros de humanos sabidamente positivos para DENV2 e obtidos anteriormente ao surto de ZIKV (negativos para ZIKV, aqui denominados: P01 - P07) ou um soro padrão de diagnóstico (negativo para ambos os vírus, aqui denominado: DSS) obtido comercialmente. Como é possível observar na FIG. 6, não houve reconhecimento cruzado significativo entre os soros em relação à proteína ΔΝ-NSl ZIKV. A determinação do Cut Off contra o ZIKV foi feita a partir da média dos títulos obtidos contra a proteína NS1-ZIKV (227) somada à duas vezes o valor do desvio padrão (81) , assim como evidenciado na FIG. 6. Nota-se também que o soro padrão de diagnóstico não reagiu com nenhuma das proteínas testadas.

[046] Na FIG. 7 descreve-se a aplicação diagnostica dos ensaios de ELISA empregando a proteína ΔΝ-NSl ZIKV. Ensaios de ELISA foram realizados com diferentes amostras de soro humano suspeitos de infecção por ZIKV. As amostras são provenientes de mulheres que apresentaram sintomas característicos de infecção por ZIKV durante a gestação (amostras "1" de cada grupo) e tiveram filhos microcefálicos. Amostras de soro dos bebês com microcefalia também foram testadas nas mesmas condições (amostras "2" de cada grupo) . O Cut Off utilizado para determinação das amostras positivas foi de 390 (linha tracejada). Como é possível observar nas FIGs. 7 A-D, os soros de todas as mulheres reagiram positivamente para NS1-DENV2-NGC e ΔΝ-NSl-ZIKV, exceto o soro da paciente G8-1. As amostras oriundas dos bebês também se apresentaram positivas para NS1-DENV2-NGC, entretanto, nem todas foram positivas para ΔΝ-NSl-ZIKV. Essas observações demonstram que o teste é específico e sensível para detecção de anticorpos que demonstrem a infecção por ZIKV.

[047] Os kits diagnósticos aqui propostos baseiam-se no uso de uma plataforma onde se imobiliza o antígeno alvo (ΔΝ-NSl ou outros antígenos dele derivados), seja numa placa, numa matriz cromatográfica, acoplado a beads fluorescentes, ou mesmo a uma membrana. Assim, o teste consistirá na capacidade de anticorpos em reconhecer imunologicamente o antígeno imobilizado. O resultado de reconhecimento ou não, será dependente da plataforma utilizada. No caso do ELISA, demonstrado na figura 4, o antígeno proposto nesse trabalho é imobilizado numa placa de poliestireno. 0 material a ser testado, seja soro, plasma, urina, sêmen, líquido cefalorraquidiano, saliva e outros fluidos corporais, será adicionado ao sistema, de modo que, se houver anticorpos específicos contra o ZIKV, mesmo após a lavagem dessa placa com um tampão contendo detergente, o anticorpo permanecerá ligado ao antígeno. Em caso contrário, os anticorpos inespecíficos, como aqueles gerados após infecção por outros flavivírus, serão removidos pela lavagem. Na etapa de revelação, a reação será positiva apenas onde houver anticorpos específicos ligados ao antígeno gerando um sinal mensurável, desse modo estabelecendo um teste diagnóstico reprodutível e específico.

[048] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas visando aprimoramento do projeto sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Sequência de ácido nucleico isolada que codifica a proteína truncada ZIKV caracterizada pelo fato compreender a SEQ. ID. 1.

2. Sequência de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de possuir códons otimizados para expressão em E. Coli.

3. Sequência de ácido nucleico, de acordo a reivindicação 1 ou 2 caracterizada pelo fato de 6 resíduos de histidina serem adicionados nas posições de 5-10.

4. Sequência de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de um sítio de trombina ser adicionado nas posições de 13 a 18.

5. Antígeno recombinante caracterizado pelo fato de possuir a sequência de ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 compreendida pela SEQ. ID. 2.

6. Antígeno recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser derivado da proteína não estrutural 1 (NS1) do ZIKV ou forma dele derivadas.

7. Antígeno recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o fragmento da NS1 de ZIKV ter o acréscimo de seis resíduos de histidina.

8. Antígeno recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de ser expresso em um sistema de expressão heterólogo selecionado do grupo consistindo em linhagens de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharamyces cerevisae, Pichia pastoris, baculovírus, células de Drosophila, células de mamífero (linhagem CHO), entre outros, preferencialmente Escherichia coli.

9. Uso do antígeno recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de servir de base para kits de diagnóstico sorológicos capazes de diferenciar, de forma específica, anticorpos gerados após a infecção pelo ZIKV e diferenciá-los de anticorpos gerados após infecção com DENV e outros flavivírus.

10. Kits de diagnóstico caracterizados pelo fato de compreenderem o antígeno recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.

11. Kits de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizados pelo fato de utilizarem diferentes bases tecnológicas para avaliar a capacidade discriminatória do fragmento recombinante da NS1 de ZIKV como antígeno de fase sólida.

12. Kits de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizados pelo fato de as bases tecnológicas serem selecionadas do grupo consistindo em ELISA, imunoblot, imunofluorescência, luminex (beads), radioimunoensaio, entre outros, preferencialmente ELISA.

13. Uso dos kits de diagnóstico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizados pelo fato de serem para a detecção e diferenciação de indivíduos infectados pelo ZIKV de outros infectados por outros flavivírus, a partir do antígeno recombinante derivado da proteína NS1 do ZIKV, ou formas dele derivadas, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.