CN103849630B - 一种重组人细小病毒b19蛋白及其应用 - Google Patents
一种重组人细小病毒b19蛋白及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种人细小病毒B19重组蛋白，还提供了该重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。采用本发明提供的人细小病毒B19蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人细小病毒B19感染临床诊断的需要。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种人细小病毒B19蛋白及其应用。
背景技术
1975年Cossat等人从1个无症状健康供血员血清标本中发现直径为20-25nm球形病毒颗粒，编定为B19病毒。经基因和生化分析，该病毒属细小病毒属，称人细小病毒B19（HumanParvovirusB19，以下简称B19病毒）。B19病毒是目前细小病毒家族中除人博卡病毒（HBoV）和新型细小病毒PARV4（Humanparvovirus4）以外唯一可以引起人类疾病的病毒。它可能是多种疾病的致病因子，感染儿童可引起传染性红斑，感染成人可引起多发性关节病综合征，而对一些有免疫病和血液病的患者，B19感染可以引起严重的疾病，如慢性红细胞贫血，再生障碍性贫血危象。
1986年，Shade等首次发表了B19病毒近全长的基因组核昔酸序列。B19病毒是一种直径约为20～25nm的无包膜单链线状DNA病毒，B19病毒基因组全长5.6Kb，其两端均有发夹结构，各由383个碱基组成，非结构蛋白NS1编码区基因组左半侧，且相互重叠，VP2基因位于VP1基因内。B19病毒感染细胞后，共产生9种mRNA，其中5种与特异性蛋白有关。两种编码较大的结构蛋白VP1（85×103），两种编码较小的结构蛋白VP2(55×103)，另一种则编码非结构蛋白NS1(77×103)。病毒衣壳的95%由VP2蛋白组成，VP1仅占5%。VP1除N端增加的227个氨基酸外，其余部分均与VP2相同。病毒的大部分中和抗原位于VPl独特区和VP1-VP2连接区，机体感染该病毒后的中和性抗体主要针对该部位产生。
序列同源性分析及DNA杂交结果表明，虽然细小病毒属的多数成员间核昔酸序列同源性很高，但是B19病毒与其它细小病毒的基因组序列同源性却很低。经多年研究，认为不同来源的B19病毒毒株之间的基因变异比丙型肝炎等具有显著异性源有高度可变性的病毒小得多，但是该病毒仍具有多个明显不同的基因型。
由于细小病毒B19致病的广泛性和复杂性，目前，国际上对该病毒的研究比较活跃。如人类免疫缺陷病毒(艾滋病病毒)、丙型肝炎病毒和幽门螺杆菌一样，B19亦被认为是当代医学史上新发现的与人类疾病密切相关的重要致病因子。
目前血清学检测包括B19抗体和抗原的检测。其中，抗体检测是目前临床诊断及流行病学调查B19感染的主要方法。检测B19病毒抗体起初是采用血源抗原，但该抗原来源困难，难丁普及和推广。目前应用重组技术表达B19病毒结构蛋白制备的基因工程抗原，已应用于B19抗体检测，并在不断改进和完善。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组人细小病毒B19蛋白，本发明的另一目的是提供该重组人细小病毒B19蛋白在制备检测试剂盒中的应用。
本发明提供了一种编码人细小病毒B19蛋白的重组DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的人细小病毒B19蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
本发明还提供了一种人细小病毒B19蛋白的表达载体pET-21a-B19，它是将SEQIDNO.1所示所述的重组DNA序列插入到质粒pET-21a上得到的重组质粒，其质粒图谱如附图2所示。将表达载体pET-21a-B19导入大肠杆菌中，得到表达人细小病毒B19蛋白的工程菌株，该菌株于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.8893。
本发明利用SEQIDNO.1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备人细小病毒B19蛋白可以通过如下步骤实现：
1）获得具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；
2）将该核苷酸序列导入质粒，优选pET-21a质粒；
3）将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21（DE3）菌株中；
4）在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；
5）回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。
上述步骤4）的培养条件为：37℃培养3小时后（转速200r/min），加入诱导剂（终浓度为1mmol/mL），37℃诱导表达5小时（转速200r/min）。
本发明提供的检测人细小病毒B19感染的试剂盒，其组分中的抗原是本发明的重组人细小病毒B19病毒蛋白。用于标记人细小病毒B19蛋白的标记物选自胶体金、辣根过氧化物酶（HRP）。
本发明所述的采用胶体金标记抗原的试剂盒中，抗人IgM抗体划线包被浓度为1.0mg/ml，抗人IgM抗体划线量为1.0μl/cm，B19抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫，抗原胶体金结合物喷点量为60μL/cm2，小鼠IgG胶体金结合物喷点量为14μL/cm2，羊抗鼠IgG抗体包被量为1.0μl/cm，包被浓度为1.0mg/ml。
以下将更详细的描述本发明的技术方案：
本发明公开了一种编码人细小病毒B19蛋白的如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，利用该核苷酸序列制备人细小病毒B19蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQIDNO.2所示氨基酸序列的人细小病毒B19蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测人细小病毒病毒感染的应用。
SEQIDNO.1所示核苷酸序列可以通过全基因合成的方法制备，根据抗原表位筛选结果，选取了抗原反应较强的9个表位集中的多肽区域，构建融合抗原多肽表达重组序列。设计PCR引物P1-P18。引物P1和P2用于扩增是片段P1P2，P3和P4用于扩增片段P3P4，P5和P6用于扩增片段P5P6，P7和P8用于扩增片段P7P8，P9和P10用于扩增片段P9P10，P11和P12用于扩增片段P11P12，P13和P14用于扩增片段P1314，P15和P16用于扩增片段P1516，P17和P18用于扩增片段P17P18，引物P1和P18分别带有BamHI和XhoI的酶切位点，并分别对应于片段1的5’末端和片段9的3’末端。
引物序列如下：
P1:ATAGGATCCAACCCGCTGGAGAACCCATCATCT
P2:CAGCTCTTCATCACCACTACTCCCAGGCTTGTGTAAGTCTTC
P3:GGGAGTAGTGGTGATGAAGAGCTGTTAAAGAATATTAAG
P4:CTCTGAGGCGTTGTAGCCACTACTACCTTGAAAGCCAGTTTCATTCT
P5:GAAACTGGCTTTCAAGGTAGTAGTGGCTACAACGCCTCAGAGAAATACC
P6:GGAATTAAGAACTGTCTGGAACTCCACATGCTCTTGACAGGATTAC
P7:CATGTGGAGTTCCAGACAGTTCTTAATTCCATATG
P8:CTACTGCCAACCTTCGCCTCCTTTCCACTGGC
P9:GAGGCGAAGGTTGGCAGTAGTGAAATTGCTGTTAAGGATG
P10:GACCATGAATACAAGTACCCAGGAATTTCTGGAGAC
P11:GTACCCAGGAATTTCTGGAGACAGCAAGAAG
P12:GGAAACTTATAACTACTACCATAGAATGCTGATTCTTCACTTG
P13:CTATGGTAGTAGTTATAAGTTTCCTCCAGTGCCG
P14:CGCGGGCCACTACTGCCCTTTAAGAACTTGAAACTGTC
P15:GTTCTTAAAGGGCAGTAGTGGCCCGCGTAAGGCTACGGGAC
P16:CTGTCGGGTCATATACTCCAGGTTGAGGATTCCACCGTCC
P17:CCTCAACCTGGAGTATATGACCCGACAGCTACAGATGCAAAG
P18:
TACTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGCCCACTGCTCTTGGCTGTCCACAATTCTTC
引物P1和P2用于扩增是片段P1P2，P3和P4用于扩增片段P3P4，P5和P6用于扩增片段P5P6，P7和P8用于扩增片段P7P8，P9和P10用于扩增片段P9P10，P11和P12用于扩增片段P11P12，P13和P14用于扩增片段P1314，P15和P16用于扩增片段P1516，P17和P18用于扩增片段P17P18。
以第一轮PCR扩增得到的P1P2和P3P4为模板，加入引物P1和P4，扩增P1P4片段；以P5P6和P7P8为模板，加入引物P5和P8，扩增P5P8片段；以P9P10和P11P12为模板，加入引物P9和P12，扩增P9P12片段；以P13P14和P15P16为模板，加入引物P13和P16，扩增P13P16片段。
以第二轮PCR扩增得到的P5P8和P9P12为模板，加入引物P5和P12，扩增P5P12片段；以P13P16和P17P18为模板，加入引物P13和P18，扩增P13P18片段。
以第三轮PCR扩增得到的P5P12为模板，以P1P4和P13P18引物，扩增P1P18片段。
本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。
本发明的一个实施方案涉及应用如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列制备人细小病毒B19蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码人细小病毒B19蛋白的如SEQIDNO.1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。
编码本发明蛋白的核酸与pET-21a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。
在本发明的一个实施方案中，如图2所示，制备含有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-21a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21（DE3），经IPTG诱导培养后，收集菌体，获得大肠埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-21a-B19（CGMCCNo.8893）。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。
本发明的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化的人细小病毒B19蛋白，该蛋白具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列。
本发明的一个实施方案涉及包含本发明人细小病毒B19蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测人细小病毒感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的诊断人细小病毒感染。任何生物学样品，只要它们含有人细小病毒B19抗体，就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。
本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成人细小病毒B19感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断细小病毒B19感染。本发明试剂盒可包括其它多个容器，其中可分别含有检测所用的标准品，抗体或经过标记的抗体、酶，底物或缓冲液等。在该试剂盒中，还包括标签和包装插页用以提供试剂盒的使用说明。还可包括符合需要的其它材料，如微量滴定板等。
在用于人细小病毒B19感染检测的试剂盒中，本发明的人细小病毒B19蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。
与上述标记物结合的方法是已知的。当标记物为酶时，其底物和显色剂可用于测定其活性。当使用过辣根过氧化物酶时，以3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺作为底物溶液，并使用TMB显色系统。当使用过氧化物酶时，以H2O2作为底物溶液，并以邻苯二胺、4-氨基氨替比林等作为显色剂。当使用碱性磷酸酶时，可用邻硝基苯磷酸、对硝基苯磷酸等作为底物。
采用本发明提供的重组人细小病毒B19蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人细小病毒B19感染临床诊断的需要。本发明提供的B19蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在B19疫苗研制领域具有实际应用价值。
本发明涉及的表达人细小病毒B19蛋白的工程菌株是大肠埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-21a-B19，已于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.8893。
附图说明
图1PCR扩增产物的凝胶电泳图；其中M表示Marker，1表示扩增产物。
图2表达质粒pET-21a-B19的构建流程图；
图3是诱导后菌体12％SDS－PAGE电泳图，其中M表示Marker，1-8泳道表示菌体表达情况及纯化各阶段情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1人单纯疱疹病毒蛋白的制备
1.1人单纯疱疹病毒蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆
通过计算机分析人细小病毒B19的全部氨基酸序列筛选出人细小病毒B19的型特异性蛋白VP1和VP2的优势抗原表位。
根据抗原表位筛选结果，选取了抗原反应较强的9个表位集中的多肽区域，中间用-SSG-连接臂进行见列，构建融合抗原多肽表达重组序列。设计PCR引物P1-P18。引物P1和P2用于扩增是片段P1P2，P3和P4用于扩增片段P3P4，P5和P6用于扩增片段P5P6，P7和P8用于扩增片段P7P8，P9和P10用于扩增片段P9P10，P11和P12用于扩增片段P11P12，P13和P14用于扩增片段P1314，P15和P16用于扩增片段P1516，P17和P18用于扩增片段P17P18，引物P1和P18分别带有BamHI和XhoI的酶切位点，并分别对应于片段1的5’末端和片段9的3’末端。
引物序列如下：
P1:ATAGGATCCAACCCGCTGGAGAACCCATCATCT
P2:CAGCTCTTCATCACCACTACTCCCAGGCTTGTGTAAGTCTTC
P3:GGGAGTAGTGGTGATGAAGAGCTGTTAAAGAATATTAAG
P4:CTCTGAGGCGTTGTAGCCACTACTACCTTGAAAGCCAGTTTCATTCT
P5:GAAACTGGCTTTCAAGGTAGTAGTGGCTACAACGCCTCAGAGAAATACC
P6:GGAATTAAGAACTGTCTGGAACTCCACATGCTCTTGACAGGATTAC
P7:CATGTGGAGTTCCAGACAGTTCTTAATTCCATATG
P8:CTACTGCCAACCTTCGCCTCCTTTCCACTGGC
P9:GAGGCGAAGGTTGGCAGTAGTGAAATTGCTGTTAAGGATG
P10:GACCATGAATACAAGTACCCAGGAATTTCTGGAGAC
P11:GTACCCAGGAATTTCTGGAGACAGCAAGAAG
P12:GGAAACTTATAACTACTACCATAGAATGCTGATTCTTCACTTG
P13:CTATGGTAGTAGTTATAAGTTTCCTCCAGTGCCG
P14:CGCGGGCCACTACTGCCCTTTAAGAACTTGAAACTGTC
P15:GTTCTTAAAGGGCAGTAGTGGCCCGCGTAAGGCTACGGGAC
P16:CTGTCGGGTCATATACTCCAGGTTGAGGATTCCACCGTCC
P17:CCTCAACCTGGAGTATATGACCCGACAGCTACAGATGCAAAG
P18:
TACTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGCCCACTGCTCTTGGCTGTCCACAATTCTTC
以上引物由（华美生物技术有限公司）合成。
引物P1和P2用于扩增是片段P1P2，P3和P4用于扩增片段P3P4，P5和P6用于扩增片段P5P6，P7和P8用于扩增片段P7P8，P9和P10用于扩增片段P9P10，P11和P12用于扩增片段P11P12，P13和P14用于扩增片段P1314，P15和P16用于扩增片段P1516，P17和P18用于扩增片段P17P18。
以第一轮PCR扩增得到的P1P2和P3P4为模板，加入引物P1和P4，扩增P1P4片段；以P5P6和P7P8为模板，加入引物P5和P8，扩增P5P8片段；以P9P10和P11P12为模板，加入引物P9和P12，扩增P9P12片段；以P13P14和P15P16为模板，加入引物P13和P16，扩增P13P16片段。
以第二轮PCR扩增得到的P5P8和P9P12为模板，加入引物P5和P12，扩增P5P12片段；以P13P16和P17P18为模板，加入引物P13和P18，扩增P13P18片段。
以第三轮PCR扩增得到的P5P12为模板，以P1P4和P13P18引物，扩增P1P18片段。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒(购自六合通-北京TAKARA公司，产品名称：TAKARAMiniBESTPlasmidpurification)回收目的DNA，操作按产品说明书进行。
1.2表达载体pET-21a-B19的构建及鉴定
pET-21a载体（购自华美生物技术有限公司）与PCR扩增产物B19目的DNA片段（P1P18）经BamHI和XhoI双酶切，产物纯化（采用TAKARAMiniBESTPlasmidpurification试剂盒，购自六合通-北京TAKARA公司）后经T4DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态（购自华美生物技术有限公司），涂布于含氨苄霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶BamHI和XhoI双酶切、鉴定，其中有3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-21a-B19。
1.3表达人细小病毒B19型蛋白的工程菌的构建
将表达质粒pET-21a-B19用化学转化法（(美)J.萨姆布鲁克(JosephSambrook),(美)D.W.拉塞尔(DavidW.Russell)著,黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社,2002.）转入大肠埃希氏菌BL21（DE3）菌株（购自华美生物技术有限公司），涂布于含氨苄霉素的LB平板上37℃倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含氨苄霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导后的菌体用12％SDS－PAGE分析（同上文献），结果如附图3所示，确定表达人细小病毒B19蛋白的菌株即为所需的工程菌株大肠埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-21a-B19（CGMCCNo.8893），用甘油冷冻保存。
1.4重组人细小病毒B19型蛋白的表达制备及纯化
诱导培养已构建的表达人细小病毒B19型蛋白的大肠埃希氏菌EscherichiacoliYNTpET-21a-B19（CGMCCNo.8893），用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1:10（W/V）加入菌体裂解液（50mmpH8.0Tris-Cl,50mmNaCl,50%甘油），加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌（冰浴，功率200W，超声3秒，间隔5秒，超声80次）、组氨酸亲和柱（300ml200mm的NiCl2过柱，流速5ml/min；500mlPBS缓冲液洗注，流速10ml/min；超声离心后的上清液用200mlPBS稀释后上样，流速3ml/min；500mlPBS缓冲液洗注，流速5ml/min；用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的PBS缓冲液洗脱，紫外检测仪280nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS－PAGE电泳检测纯化组分）得到纯化的重组蛋白。
1.5重组蛋白Western-blot验证
为验证重组B19型蛋白质与抗HPV血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为：10份兔抗HPV抗体阳性血清（购自北京百安天地医药科技有限公司）和30份人抗HPV抗体阳性血清（经ELISA法检测证实）。阴性血清为：10份对照正常兔血清和30份人抗HPV抗体阴性血清（经ELISA法检测证实）。结果如表1。
表1重组蛋白Western-blot验证结果
结果显示，用HPV病毒培养物免疫兔子所得的10份兔抗HPV抗体阳性血清和30份人抗HPV抗体阳性血清全部与表达抗原产生阳性反应，10份对照正常兔血清和30份人抗HPV抗体阴性血清与表达抗原均产生阴性反应。结果提示重组目的基因获得表达，重组B19蛋白质与全病毒蛋白质有明显的交叉反应性，并具有很强的特异性，具有实际应用意义。
实施例2人细小病毒B19型IgM抗体胶体金检测试剂盒的制备和性能检定
2.1人细小病毒B19型IgM抗体胶体金检测试剂盒的制备
将以上制得的重组B19蛋白用作试剂盒标记抗原，用胶体金法测定B19IgM抗体。该试剂盒的研制和使用如下：
（1）试剂盒原理
本发明根据免疫捕获法原理，用抗人IgM抗体包被硝酸纤维素膜，胶体金标记基因工程重组细小病毒B19抗原为示踪物。使用时加入待检血清，如样品中含有抗B19特异性IgM抗体，则可与膜表面的抗人IgM抗体结合形成复合物，该复合物与胶体金标记的B19抗原结合而呈现紫红色条带。
（2）试剂盒性能优化
以阳性和阴性质控品（收集多家医院经临床验证的细小病毒B19IgM抗体阳性、阴性血清，用DemeditecDiagnosticsGmbH提供的人细小病毒B19IgM抗体酶联试剂盒进行复检筛选，得到的细小病毒B19IgM阳性、阴性血清建立为阳性和阴性质控品）为测试样品，采用方阵滴定确定最佳抗人IgM和B19抗原胶体金（B19-Ag.G）结合物的工作浓度，结果如表2，由结果得出，抗人IgM抗体划线包被浓度为1.0mg/ml、B19-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫。
表2最佳抗人IgM和B19-Ag.G结合物工作浓度的选择
－：阴性反应（无检测线）；±：可疑阳性（检测线隐约可见）；＋：阳性反应（出现检测线）；＋＋：较强阳性反应（检测线清晰）；＋＋＋强阳性反应（检测线颜色深）（以下解释同）
在已确定抗人IgM抗体划线包被浓度为1.0mg/ml、B19-Ag.G复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫的基础上，以阳性和阴性质控品（来源和标准同上）为测试样品，滴定选择最佳抗人IgM抗体划线量（喷金量为60μL/cm2）为1.0μl/cm。结果见表3。表3表明，划线量低于1.0μl/cm时，阳性时质控品P1可能导致假阴性结果，高于1.25μl/cm阴性质控品N9可能导致假阳性结果。
表3最佳抗人IgM抗体划线量的确定
－：阴性反应；±：可疑阳性；＋：阳性反应；＋＋：较强阳性反应；＋＋＋强阳性反应
在已确定抗人IgM抗体划线浓度为1.0mg/ml，划线量为1.0μl/cm和细小病毒B19型抗原胶体金复合物喷点浓度为浓缩原液到稀释一倍之间的基础上，以内部质控阳性和阴性质控品（来源和标准同上）为测试样品，采用方阵滴定选择最佳胶体金结合物喷点量为60μL/cm2。结果见表4。
表4最佳抗原胶体金复合物喷点量的确定
－：阴性反应；±：可疑阳性；＋：阳性反应；＋＋：较强阳性反应；＋＋＋强阳性反应
根据测试结果，抗原胶体金复合物的包被量在低于50.0μL/cm2时有漏检现象，高于70.0μL/cm2时本底高且有非特异性反应，包被时有跑漏现象。所以最终选定最佳抗原胶体金喷点包被量为60.0μL/cm2。
用已确定的抗人IgM抗体包被浓度和包被量划线包被硝酸纤维素膜，羊抗鼠IgG用常规浓度和包被量划线包被硝酸纤维素膜，用HPVB19-Ag金复合物浓缩原液以60.0μL/cm2包被量和小鼠IgG以10.0μL/cm2、12.0μL/cm2、14.0μL/cm2、16.0μL/cm2、18.0μL/cm2包被量分别混合，用包被后的5种载金垫和已包被的硝酸纤维素膜组合后对内控品（P1、P5、P9、N1、N5、N9）进行检测，最终选出合适的小鼠IgG金复合物包被量。
表5小鼠IgG胶体金复合物最佳包被量的确定
－：阴性反应；±：可疑阳性；＋：阳性反应；＋＋：较强阳性反应；＋＋＋强阳性反应
根据结果，B19-Ag.Au复合物以60.0μL/cm2、小鼠IgG.Au复合物以14.0μL/cm2包被时，检测结果理想，且检测内控品P5时，质控线C和检测线T更均一。
将羊抗鼠IgG抗体以2.5mg/mL、2.0mg/mL、1.5mg/mL、
1.0mg/mL、0.75mg/mL共5个浓度划线包被硝酸纤维素膜作为质控线，用小鼠IgG金标复合物以14.0μL/cm2包被载金垫，分别和上述5个浓度的质控线配比制作层析条，用随机血清进行检测，根据质控线的颜色深浅、清晰度和质控线之间比较来选择合适的抗体包被浓度。
实验结果见表6：
表6不同浓度质控线反应结果
±：质控线隐约可见；＋：出现质控线；＋＋：质控线清晰；＋＋＋：质控线清晰粗大且颜色重
以上结果显示，羊抗鼠IgG抗体与小鼠IgG胶体金复合物有较好的反应性。羊抗鼠IgG以1.0-2.0mg/mL浓度包被基本上能够较好地显示质控效果。为控制生产成本，因而选择1.0mg/mL浓度作为质控线包被浓度，包被量为1.0μL/cm。
（3）试剂盒的制备
1）取1.0g的HAuCl4.H2O溶解于100ml纯化水中，配成1%氯金酸溶液；取1ml的1%氯金酸溶液入100ml沸水中，加入1.5ml、1%的柠檬酸三钠，继续煮沸30min，合成胶体金；取6ml合成的胶体金溶液，在400-700nm处进行扫描检验；取合成的约30nm胶体金400ml，用0.1MK2CO3调pH至6.8，量取3mg/ml1.33mlB19抗原用pH8.2的20mMTris-Cl稀释至40ml，边搅拌边加入胶体金溶液，继续搅拌10min，量取1%BSA40ml，边搅拌边加入前述溶液，继续搅拌10min，3000r/min4℃离心10min，去沉淀，上清重新平衡后，12000r/min4℃离心45min，去上清，重复2次；用内部质控血清对胶体金复合物进行检验，检验合格后，按前述浓度喷点包被抗原胶体金复合物，然后在37℃、相对湿度30%以下通风干燥16-22小时（过夜）后切割。
2）预切割NC膜，粘贴背板，按前面确定的浓度和划线量包被抗人IgM抗体和羊抗鼠IgG抗体划线包被于NC膜上，在37℃、相对湿度30%以下的条件下干燥1.0小时。
3）撕掉包被检测线和质控线的NC膜（带背板）检测线端的纸膜，将抗原胶体金结合物垫粘贴在NC膜的质控线端，交叉约1mm，压实，将裁好的载样垫粘贴在抗原胶体金结合物垫的下端，压实，将裁好的吸水垫粘贴在NC膜的质控线端，将贴好的检测板两端裁切去掉1cm，用切条机切成4mm宽。抽取18条，用内部质控血清检测半成品检测卡。
4）将每个检测卡单独封装，每个独立包装为1人份，20人份封装成1盒。抽样检验。
各缓冲液配方如下：
1）抗人IgM抗体包被缓冲液配方：20mMTris-Cl缓冲液（pH8.2）见表7。
表7
2）羊抗鼠IgG抗体包被缓冲液配方：20mMTris-Cl缓冲液（pH8.2）见表8。
表8
3）抗原胶体金复合物包被缓冲液配方：20mMTBS缓冲液（pH8.2）见表9。
表9
（4）试剂盒使用操作方法：
1）打开检测卡的铝箔袋包装，取出检测卡。
2）将检测卡倾斜成加样孔端低于另一端不少于1.0cm。
3）取100μl待检血清加入到圆形样品孔中，室温（15℃～30℃）放置25分钟观察并记录结果。
4）检验结果判定：
阳性：判读窗口出现两条紫红色线条带。
阴性：判读窗口仅质控线位置出现一条紫红色线条带。
无效：判读窗口质控线位置无紫红色线条带。
2.2试剂盒性能检测实验
（1）特异性（准确性）测定：按前述实验确定的胶体金测定方法，检测几种其他血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试剂盒检测15份阴性血清（临床已确定），符合率为100％；检测30份类风湿因子阳性血清标本、30份腺病毒IgM阳性血清标本、30份腮腺炎病毒IgM阳性血清标本等，无一阳性，表明类风湿因子等基本不会造成试剂盒的假阳性，特异性很好。
（2）灵敏度测定：按前述实验确定的胶体金测定方法，检测本试剂盒的灵敏性。使用本发明试剂盒检测15份阳性血清（临床已确定），符合率为100％。
（3）与国内外同类产品的比较试验：本发明试剂盒与DemeditecDiagnosticsGmbH公司试剂盒检测160份血清样本的比较实验结果如表10。
表10与DDG人细小病毒病毒B19IgM抗体试剂盒的比较测试结果
检测总符合率：（38+117）/260=96.9%，初步表明本试剂盒达到进口试剂盒的标准。
Claims (9)
1.一种编码人细小病毒B19蛋白核酸，如SEQIDNO.1所示。
2.一种人细小病毒B19蛋白，其特征在于它由权利要求1所述的核酸编码，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.包含权利要求1所述核酸的人细小病毒B19蛋白的表达载体，其特征在于它是将权利要求1所述的核酸插入到质粒pET-21a上得到的重组pET-21a-B19质粒。
4.一种重组人细小病毒B19蛋白的制备方法，其特征在于应用权利要求3的重组DNA构建表达载体，并在该载体所适合的原核宿主细胞中表达权利要求2所述重组DNA编码的重组人细小病毒B19蛋白，包括以下步骤：
1）获得SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；
2）将该核苷酸序列导入质粒；
3）将该质粒导入原核宿主细胞；
4）培养所述宿主细胞；
5）回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。
5.根据权利要求2所述的人细小病毒B19蛋白在制备检测人细小病毒B19感染的试剂盒中的应用。
6.一种表达人细小病毒B19蛋白的工程菌株，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体pET-21a-B19，宿主菌为大肠杆菌，所述工程菌株的保藏编号为CGMCCNo.8893，该菌株于2014年03月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
7.一种检测人细小病毒B19感染的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的抗原是权利要求2所述的人细小病毒B19蛋白。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于用于标记人细小病毒B19蛋白的标记物为胶体金或辣根过氧化物酶。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于抗人IgM抗体划线包被浓度为1.0mg/ml，抗人IgM抗体划线量为1.0μl/cm，人细小病毒B19抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫，所述抗原胶体金结合物喷点量为60μL/cm2，小鼠IgG胶体金结合物喷点量为14μL/cm2，羊抗鼠IgG抗体包被量为1.0μl/cm，包被浓度为1.0mg/ml。
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