KR20220016573A

KR20220016573A - 소변 내 전립선특이항원 측정용 바이오센서 및 이를 이용한 전립선특이항원의 측정방법

Info

Publication number: KR20220016573A
Application number: KR1020200096627A
Authority: KR
Inventors: 김수동; 이용운; 김남영; 인규리; 황철진
Original assignee: 주식회사 셀앤바이오
Priority date: 2020-08-03
Filing date: 2020-08-03
Publication date: 2022-02-10

Abstract

본 발명은 인간의 소변을 검체로 하여 전립선암을 진단할 수 있는 진단 키트 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 면역 크로마토그래피 (Immunochromatography)법을 사용하는 것과 임피던스 변화량 측정을 통해 전립선암 발생 여부를 진단할 수 있는 진단 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

소변 내 전립선특이항원 측정용 바이오센서 및 이를 이용한 전립선특이항원의 측정방법{Biosensor for measuring prostate specific antigen in urine and method for measuring prostate specific antigen using the same}

전립선암은 전 세계적으로 가장 흔한 비뇨기계 종양 중 하나로 미국에서는 남성 암발생률 위(98.2명/10만명), 국내에선 남성 암발생률 5위(30.3명/10만명)이다. 전립선암은 50세를 넘게 되면 급격히 증가하는 양상을 보이며, 최근 평균 수명의 연장으로 국내 노인 남성의 수가 증가하여 암 발병률도 증가하고 있다.

지난 10년간 국내에서 전립선암의 발병률은 3배 증가했고, WHO(세계보건기구)는 20년 후에 3배 증가할 것으로 예측되며, 전립선암은 조기에 진단하면 비교적 간단한 수술이나 방사선치료로 완치가 가능하지만, 병이 진행된 후에는 항호르몬치료나 항암치료가 필요하여 심한 경우는 사망에 이르게 된다.

일반적으로 전립선암의 진단을 위해서는 전립선을 직접 조영하거나 조직검사를 통한 진단이 이루어지고 있지만 초기에 전립선암의 발병 여부를 진단함에는 적절하지 않아 체외 진단법의 개발이 시급하다.

대표적인 간접진단 방법으로는 혈액에서의 PSA(prostate-specific antigen) 농도로 검진할 수 있으나 컷오프가 3-4 ng/㎖로 매우 낮기 때문에, 혈청 PSA 수준이 아주 높은 경우에는 효과적인 반면, 2-10 ng/㎖의 수준인 경우 진단이 어려워 비교적 높은 허위양성률을 보인다.

그러나 상기와 같이 종래의 혈액을 이용하는 ELISA형태의 진단키트는 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) Reader기 및 Automation 장비와 같은 특수장비 및 전문인력을 필요로 하기 때문에 가정에서는 적용할 수 없는 사용상의 제약을 갖고 있고, 검사 결과를 얻기까지 오랜 시간이 걸린다는 문제점이 있으며, 진단을 하려면 병원에 방문하여 전문 의료인의 도움을 받아야 하며, 채혈을 하고, 특수분석장비를 사용하여 전문 인력이 분석해야하는 복잡한 과정을 거쳐야하는 번거로움이 발생한다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해 좀 더 간편하고 빠르면서도 정확한 진단 방법이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 인간의 소변을 검체로 하여 면역 크로마토그래피 (Immunochromatography)법을 사용하여 전립선암을 진단할 수 있는 바이오 센서 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간의 소변을 검체로 하여 임피던스 변화량 측정을 통해 전립선암 발생 여부를 진단할 수 있는 바이오 센서 및 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오 센서를 포함하는 전립선암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오 센서를 이용한 전립선암 진단에 필요한 정보를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오 센서를 이용한 전립선암 억제제 또는 전립선암 치료제의 모니터링 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오 센서를 이용한 전립선암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 제안되는 본원의 진단키트는 인간의 초변을 검체로 하여 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단할 수 있다.

본원 발명자는 인간의 초변(야간 취침 후 아침에 기상하여 첫 배뇨되는 소변)을 검체로 하여 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 반응을 살피며 상기 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통한 전립선암 진단 가능성 여부를 확인하고자 수많은 시행오차법에 따른 실험 및 검측 결과, 인간의 초변 중 전립선-특이항원의 수치가 정상인은 40 ~ 75 ng/㎖임에 비하여, 전립선 질환 중 암환자 평균값은 9.1 ng/㎖ 이하로 나타내는 사실을 확인하였으며, 발명자 등은 다양한 실험 데이터 및 관련 문헌 조사결과를 통해 초변 중 PSA cut-off농도를 10 ng/㎖로 정하였고 이보다 적은 수치일 때 전립선암으로 판정하는 진단장치를 구현할 수 있음을 확인하여 완성된 발명이다.

본원에서 제공되는 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단하는 진단키트는, PSA 단일클론 항체를 흡착시킨 항체패드와 PSA 항체를 골드입자에 부착시키고 항체-골드 접합체를 함침시켜 건조한 항체-골드 접합패드(conjugate pad)와 검체의 흐름을 도와주는 샘플 패드와 흡수패드를 적층시킨 진단스트립; 및 검체 투입구와 결과표시창과 손잡이를 구비하며 상기 진단스트립을 내부에 내장시켜 조립되는 플라스틱 하우징을 포함하는 진단키트를 바이오리더기에 내삽시키는 수단으로 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단할 수 있다.

본 발명에서 진단 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인은 통상의 진단스트립의 재료로 이용되는 소재로, 예를 들어 나이트로 셀룰로우즈, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체류가 사용될 수 있으며, 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 검출 표지제, 용해제, 세정제가 포함되어 제공될 수 있다.

또한, 검출 표지제가 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제가 포함할 수 있는바 적합한 담체로는 가용성 담체, 예컨대 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS) 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따르는 진단용 항체는 스트립의 제조에 사용할 수 있는 통상의 상업적으로 이용 가능한 항체의 원료인 정제된 단일클론 anti-PSA, 토끼 anti-PSA, 산양 anti-쥐 IgG, 45nm금입자골드(colloidal Gold) 원료로 제공되는 것들을 사용 할 수 있는바, 바람직하게는 HB-10494, HB-9119, HB-11426, HB-8051, HB-8525, HB-8527(American Type CultureCollection, VA, USA) 및 anti-PSA Ab(cat no: MO-C40081C: C-PSA1,Abazyme,Needham, MA, USA)로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 항체를 사용할 수 있다.

45nm 금입자골드(colloidal Gold)는 상기 발명품의 적합한 발색 물질로 125I,131I,111In,99Tc14C,3H 등 방사선 물질이 포함되어 있다.

본 발명의 기술사상이 적용되는 전립선질환 및 전립선암 진단용 키트 및 진단방법은, 소변 중의 PSA는 키트 내의 PSA에 대한 항체와 항원-항체 반응을 통해 면역학적 복합체를 형성하게 되고, 형성된 면역학적 복합체는 면역분석법을 사용하여 검출할 수 있으며, 항원을 검출하거나 정량하는데 사용되는 수많은 면역분석법들이 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988, 556-612, Reiter RE., Gu Z., Watabe T., Thomas G., Prostate stem cell antigen : A cell surface marker overexpressed n prostate cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 1998. Feb 17;95(4):1735-40]을 참조 가능하다.

본 발명의 전립선암 진단용 키트는 면역크로마토그래피법 (immunochromatograpic assay)을 기초로 고안되어 현재 시판되고 있는 전립선암 진단용 키트의 원리가 그대로 적용될 수 있는바, 면역크로마토그래피법은 면역화학법(immunochemistry)과 크로마토그래피법(chromatogrphic assay)를 결합한 검사방법으로 항원에 대한 항체의 특이적인 면역반응성, 금입자(colloidal gold)의 발색특성 및 유동성 막(porous membrane)의 모세관현상에 의한 분자의 이동을 응용한 검사방법이다.

면역크로마토그래피법은 기존의 멀티-스텝(multi-step) 면역측정법에서 요구되는 검체 희석, 세정 및 효소 결합체와 기질의 반응을 통한 발색 과정을 하나로 통합하여 원-스텝(one-step)으로 신속하게 검사할 수 있는 편리성이 있으며 또한 특정한 장비를 사용하지 않고 검사결과를 판정할 수 있는 용이성 및 경제성, 검사결과 판독의 신속성 등에서 장점을 갖는다.

본 발명의 바람직한 일 적용예에서, PSA에 대한 항체가 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 인간의 소변 시료를 첨가하여 반응시키고, 효소-2차 항체 결합체를 반응시킨 후 상기 효소의 기질을 처리하여 흡광도를 측정하고, 상기 흡광도를 표준곡선과 비교하여 인간 소변 내에 존재하는 PSA를 정량 비교한 결과를 바탕으로 전립선질환과 전립선암을 진단할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 적용예에서, 효소와 기질로서 바이오틴과 스트렙트 아비딘 컨쥬게이트된 호스래디쉬퍼옥시다제를 사용할 수 있다.

본원에서 인간의 초변 중 전립선-특이항원의 양이 10ng/㎖이하인 경우에 전립선암으로 판정하는 전립선-특이항원의 항원, 항체 반응 전립선암 진단 키트를 이루기 위한 진단스트립의 제조방법은, 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 점적된 제1라인의 산양-anti 마우스 IgG 다중클론항체 점적부와 상기 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 점적된 제 2라인의 토끼-anti PSA단일클론항체 점적부가 각각 상기 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 5㎝/sec 내지 8㎝/sec로 움직임으로써 상기 항체들을 각각 0.5㎕/㎝ 내지 1.3㎕/㎝의 점적 농도로 제조하는 방법으로 적용될 수 있다.

또한 본원에서 제공되는 진단키트는 소변을 검체로 이용할 수 있을뿐 아니라 혈액을 시료로 면역크로마토그래피법을 적용하여 PSA(prostate specific antigen)의 특이적인 항원를 측정함으로써 전립선암, 전립선비대증, 전립선관련 악성종양 및 양성종양 등 전립선질환의 진단방법에도 적용될 수 있다.

본 발명은 면역크로마토드래피(Immunochromatography)법에 의해 소변 및 혈액에서의 PSA의 양을 반정량적으로 측정할 수 있는 진단키트로 제공될 수 있으며,또한, 본 발명의 정확한 진단을 위해서 체액성분에 대한 면역반응 측정 리더기를 이용해 정확하게 진단하는 방법으로 적용될 수 있다.

본 발명은 국내 및 해외 여러 나라의 전립선질환 및 전립선암 빈도가 증가하는 추세에 따라, 병원에서는 물론 가정에서 인간 소변을 검체로 진단 키트를 이용해 소변 중의 PSA 양 측정으로 일반 사용자가 자가진단으로 전립선암 여부를 신속하게 진단하는 것이 가능한 진단 키트를 제공하는 효과를 갖는다.

본원의 진단 키트는 병원을 가지 않고도 가정에서 쉽게 육안으로 전립선암 여부를 확인할 수 있고 1차 검진을 통해 이상을 발견하는 경우 병원에 찾아가 전립선암의 조기진단 확인이 가능하므로 치료의 가능성을 높이는 효과를 갖는다.

본 발명의 항원 항체 반응에 따른 임피던스 변화량 측정을 통한 PSA 검출 방법은 다음과 같다.

1단계로, 본 발명 장치에 PSA(Postate-specific antigen) 항체를 부착하여 기준 임피던스 값을 측정하고, 2단계로, 본 발명 장치에 PSA(Postate-specific antigen)가 포함 또는 포함하지 않은 시료를 첨가하여 임피던스 변화량을 측정한다.

이때, PSA(Postate-specific antigen)가 포함된 경우 에는 본 발명 장치의 표면에 선처리되어 있는 PSA 항체에 PSA가 부착하게 되고, 이로 인해 본 발명 장치의 임피던스가 증가하게 되며 이를 측정함으로써 시료 상 PSA의 유무를 확인 할 수 있다.

반면, PSA(Postate-specific antigen)가 포함되지 않은 경우에는 임피던스 변화는 없고, 초기 기준 임피던스 값만 측정된다.

즉, 본 발명의 키트를 사용하면 PSA농도(10~40 ng/㎖)에 따른 임피던스 변화량 측정이 가능하다.

또한, 본원의 진단 키트는 병원을 가지 않고도 가정에서 쉽게 육안으로 전립선암 여부를 확인할 수 있고 1차 검진을 통해 이상을 발견하는 경우 병원에 찾아가 전립선암의 조기진단 확인이 가능하므로 치료의 가능성을 높이는 효과를 갖는다.

본 발명은 기존 바이오센서와는 다르게 소변의 PSA를 정량적으로 측정할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 구성에 따르면 타일 형태로 구성된 센서에 다양한 종류의 항체를 부착한 후 프로브 패드를 통해 임피던스를 측정함으로써 다양한 종류의 항원을 동시에 빠르고 정확하게 검출 할 수 있다.

본 발명은 PSA농도(10~40 ng/㎖)에 따른 임피던스 변화량을 확인함으로써 기존 ELISA Kit 검증 대비 정량적인 측정이 가능하다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 전립선 질환 진단키트의 그림이다.
도 2는 전립선 질환을 진단하는 스트립 및 상부 케이스와 하부 케이스를 조립한 그림이다.
도 3은 본원에서 제공되는 진단키트(40)의 결합 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 본원의 진단키트(40)가 출원인 회사에서 개발되어 별도의 발명품으로 제공(특허출원 준비중)되는 리더기(Reader)를 통하여 소변을 검체로 하여 전립선 질환을 진단할 수 있는 적용예를 나타낸 것이다.
도 5는 본원의 진단키트를 이용하여 전립선암 환자와 정상인의 PSA를 검출하여 결과 값을 기준으로 10ng/㎖의 cut-off 수치를 정하게 된 실험결과의 도면을 나타낸 것이다.
도 6은 임피던스 기반 바이오 센서의 기본 구성을 나타낸 것이다.
도 7은 PSA 진단 프로세스의 개념을 나타낸 개념도이다.
도 8은 멀티 어레이 칩 구성의 개념을 나타낸 개념도이다.
도 9는 임피던스의 변화량을 확인하기 위한 휴대용 측정기를 나타낸 것이다.
도 10은 PSA 유무에 따른 임피던스 변화량을 나타낸 것이다.
도 11은 PSA 농도에 따른 임피던스 변화량을 나타낸 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

따라서, 몇몇 실시예에서, 잘 알려진 공정 단계들, 잘 알려진 구조 및 잘 알려진 기술들은 본 발명이 모호하게 해석되는 것을 피하기 위하여 구체적으로 설명되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 포함한다(comprises) 및/또는 포함하는(comprising)은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자 이외의 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 의미로 사용한다. 그리고, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

공간적으로 상대적인 용어인 "아래(below)", "아래(beneath)", "하부(lower)", "위(above)", "상부(upper)" 등은 도면에 도시되어 있는 바와 같이 하나의 소자 또는 구성 요소들과 다른 소자 또는 구성 요소들 과의 상관관계를 용이하게 기술하기 위해 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 도면에 도시되어 있는 방향에 더하여 사용시 또는 동작시 소자의 서로 다른 방향을 포함하는 용어로 이해되어야 한다.

또한, 본 명세서에서 기술하는 실시예들은 본 발명의 이상적인 예시도인 단면도 및/또는 개략도들을 참고하여 설명될 것이다. 따라서, 제조 기술 및/또는 허용 오차 등에 의해 예시도의 형태가 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예들은 도시된 특정 형태로 제한되는 것이 아니라 제조 공정에 따라 생성되는 형태의 변화도 포함하는 것이다. 또한 본 발명에 도시된 각 도면에 있어서 각 구성 요소들은 설명의 편의를 고려하여 다소 확대 또는 축소되어 도시된 것일 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

본 발명의 실시예들에 따른 바이오 센서는 바이오 시료에 포함되어 있는 바이오 분자(biomolecule)를 분석함으로써, 유전자 발현 분석(gene expression profiling), 유전자형 분석(genotyping), SNP(Single Nucleotide Polymorphism)와 같은 돌연 변이(mutation) 및 다형(polymorphism)의 검출, 단백질 및 펩티드 분석, 잠재적인 약의 스크리닝, 신약 개발과 제조 등을 하는데 이용된다. 바이오 센서는 분석하고자 하는 바이오 시료의 대상에 따라 그에 맞는 프로브(probe) 또는 리셉터들을 채용한다. 바이오 센서에 채용될 수 있는 프로브의 예는 DNA 프로브, 효소나 항체/항원, 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin) 등과 같은 단백질 프로브, 미생물 프로브, 신경세포 프로브 등을 포함한다. 칩 형태로 제조된 바이오 센서는 바이오칩으로도 지칭된다. 예를 들어, 각각 채용되는 프로브의 종류에 따라 DNA칩, 단백질칩, 세포칩, 뉴런칩 등으로도 지칭될 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시예들에 따른 바이오 센서는 프로브로서 올리고머 프로브를 포함할 수 있다. 상기 올리고머 프로브는 채용되는 프로브의 모노머 수가 올리고머 수준임을 암시한다. 여기서, 올리고머란, 공유 결합된 두개 이상의 모노머(monmer)로 이루어진 폴리머(polymer) 중 분자량이 대략 1000 이하의 것을 지칭하는 의미로 사용될 수 있다. 구체적으로 약 2-500개의 모노머, 바람직하기로는 5-30개의 모노머를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 올리고머 프로브의 의미가 상기 수치에 제한되는 것은 아니다.

올리고머 프로브를 구성하는 모노머는 분석 대상이 되는 바이오 시료의 종류에 따라 변형 가능하며, 예를 들면 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 아미노산, 펩티드 등일 수 있다.

뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 공지의 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함할 뿐만 아니라 메틸화된 퓨린 또는 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘 등을 포함할 수 있다. 또, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 종래의 리보스 및 디옥시리보스 당을 포함할 뿐만 아니라 하나 이상의 하이드록실기가 할로겐 원자 또는 지방족으로 치환되거나 에테르, 아민 등의 작용기가 결합한 변형된 당을 포함할 수 있다.

아미노산은 자연에서 발견되는 아미노산의 L-, D-, 및 비키랄성(nonchiral)형 아미노산뿐만 아니라 변형 아미노산(modified amino acid), 또는 아미노산 유사체(analog) 등일 수 있다.

펩티드란 아미노산의 카르복실기와 다른 아미노산의 아미노기 사이의 아미드 결합에 의해 생성된 화합물을 지칭한다.

특별히 다른 언급이 없는 한, 이하의 실시예들에서 예시적으로 상정되는 프로브는 DNA 프로브로서, 약 5-30개의 뉴클레오타이드의 모노머가 공유 결합된 올리고머 프로브이다. 그러나, 본 발명이 그에 제한되는 것은 아니며, 상술한 다양한 프로브들이 적용될 수 있음은 물론이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : PSA의 검출 방법

1-1. 인간의 소변 중의 PSA 검출 및 10 ng/㎖ cut-off 설정

정상인 10명과 전립선암 환자 10명의 소변을 각각 채취하고, 원심분리하여 침전물을 제거하였으며, 소변 시료 내 PSA를 Calbiotech, Inc (CBI) PSA ELISA Kit(Catalog No. PS067T)를 이용하여 다음과 같이 검출하였다.

1) PSA ELISA 키트를 사용 10분 전에 꺼내어 상온에 방치한다.

2) PSA ELISA 키트 내에 있는 플레이트에 anti-PSA 단일클론항체를 코팅하고, 각 웰에 시료를 피펫으로 50㎕ 씩 넣었다.

3) enzyme용액을 100㎕씩 피펫으로 각 웰에 결합시켰다.

4) 30초 동안, 부드럽게 플레이트를 섞어주어 반응시켜준다.

5) 플레이트 커버를 덮고 상온 18 내지 26에서 60분 정도 배양한다.

6) 플레이트 웰안에 있는 모든 액체를 제거하고, 1X로 희석한 세척액을 웰에 300㎕를 넣고 3번 세척한 후 흡수 타올을 이용 액채성분을 제거한다.

7) 모든 웰에 TMB기질을 100㎕씩 피펫을 이용해 추가한다.

8) 상온에서 15분 동안 배양한다.

9) 배양이 끝나면 모든 웰에 반응 정지액을 혼합하여 부드럽게 흔들어 준 후 15분 이내 450nm 파장에서 ELISA reader로 읽어주는 방법으로 표 3의 분석결과를 얻을 수 있었는바, 소변에서 정상인의 PSA평균 값은 40 내지 75 ng/㎖이고, 전립선 질환 중 암환자 평균값은 9.1ng/㎖ 이하인 경우 전립선암으로 진단할 수 있다는 근거로부터 소변 중 PSA cut-off농도를 10 ng/㎖로 정하여 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.(도 5 참조)

실시예 2 : 소변을 검체로 한 스트립의 제조

2-1. 면역크로마토그래피 전립선 질환 스트립의 제조

1) 콜로이드 골드 용액의 제조

콜로이드 골드용액을 제조하는 증류수 300㎖를 80 내지 90로 가열한 후 25% 내지 30%로 희석한 골드용액(HAuCl4 3H2O)을 1.5㎖ 내지 2.0㎖ 첨가하여 교반하였고, 6분 경과 후 0.1% 내지 0.5%의 ascorbic acid를 1.5㎖ 내지 2.5㎖를 혼합하였으며 5분 동안 추가로 교반하여 제조한 45nm 크기의 골드용액을 제조하여 사용하였다.

2) 항체( anti-PSA)-골드 접합체의 접합(Conjugate)패드 제조

항체를 콜로이당 금 입자 용액에 골드 ㎖ 당 항체 0.3~0.7ng을 가하여 폴리에스테르(100% Polyester:6613) 패드에 고르게 분무하여 건조해 접합(Conjugate) 패드를 제조하여 사용하였다.

3) 접합(Conjugate)패드

시험하고자하는 시료를 흡수하기 위한 부분으로서 접합(Conjugate)패드는 폴리에스테르(100% Polyester:6613)를 사용하며, 검체의 흐름을 도와주는 스트립 하부 샘플패드는 유리섬유(Glass microfiber: Millipore 8964)또는 면섬유(AP31 Cotton Linter: Millipore)패드를 사용하여 0.1~3.0% TritonX-100 계면활성제로 고르게 분무해 건조 후 사용하였다.

4) 흡수패드

면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 역할을 하도록 흡수패드(100% Cotton Linter:Millipore 222)는 면 섬유 패드를 사용하였다.

5) 나이트로샐룰로우즈 멤브레인과 PSA항체의 결합

본 발명의 소변으로부터의 PSA 검출용 진단스트립에서, 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 2개의 라인(1라인:Control, 2라인:Test)이 제공되며, 제 1라인은 산양-anti 마우스에 IgG 다중클론항체가 1.5 내지 1.7㎎/㎖ 의 농도로 점적되어 제공되며, 제 2라인은 토끼-anti PSA단일클론항체가 0.7 내지 1.0㎎/㎖의 점적 농도를 갖도록 제공 된다.

이들 항체의 희석 방법은 1X PBS에 항체 농도에 맞게 희석한 다음 수크로우스 당을 최종농도 0.5% 내지 10%가 되게 혼합해 사용하며, 또한 나이트로샐룰로우즈 멤브레인과 PSA항체의 결합에 있어서 분주기를 사용, 2개의 라인(1라인:Control, 2라인:Test)을 점적 시, 2개의 항체를 각각 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 1초당 5cm 내지 8cm로 움직이게 조작하여 항체를 cm 당 0.5㎕ 내지 1.3㎕가 되게 점적하여 제조할 수 있다.

6) 라미네이션

각각의 구성물을 이용하여 적층시켜 un-cut시트를 만들고 스트립 형태로 절단하고 이 스트립을 플라스틱 하우징에 넣고 뚜껑을 덮어 조립된 키트는 실리카겔과 드롭퍼를 알루미늄포에 밀봉하여 습기로부터 보호하고자 하였다.

2-2. 결과 판정법

샘플패드에 시료로써 80 내지 120㎕의 소변을 가하고 5 내지 10분 후 대조선C(control line)과 결과선T(test line)의 발색 유무 및 진하기를 대조해 관찰한다. 양성시료의 경우 대조선만 발색되어 적자색으로 표시되고, 음성시료의 경우 대조선과 결과선이 같이 적자색으로 발색된다.

따라서 본원의 진단키트를 이용하는 경우 사람의 초변을 검체로 활용하여 전립선 질환을 진단하는 결과 판정 방법은 진단키트의 샘플패드에 시료로 80 내지 120㎕의 소변을 가하고 5 내지 10분 후 대조선C(control line)와 결과선T(test line)의 발색 유무를 판단할 때 양성시료일 때는 대조선만 발색되어 적자색으로 표시되는 구성으로 제공되고, 음성시료일 때는 대조선과 결과선이 함께 적자색으로 발색되어 판정되는 극히 간단한 방법으로 진단키트의 판정결과를 얻을 수 있다.

실시예 3 : 본 발명에 따르는 진단 스트립 효능 확인시험

상기 실시예 2에서 제조한 본 발명에 따르는 진단 스트립의 효능을 시험하기 위해 전립선암 환자로 소변의 PSA 농도가 7ng/㎖이하인 전립선암 환자의 소변 검체 60개 그리고 정상인의 소변 검체 100개를 육안 확인, ELISA법, 그리고 정밀한 진단을 위해 자사가 개발한 리더기로 검사하였고 본 발명품으로 상기의 검사 방법과 판정기준에 따라 비교 시험을 하였다.

(1) 본 발명에 따르는 상기 실시예 2에서 제조된 진단 스트립을 구비하고 있는 장치를 이용하여 환자의 소변 중 PSA 농도가 7ng/㎖이하인 검체와 정상인의 검체를 이용하여 본 발명품으로 테스트한 결과를 나타난 검사결과는 표 1과 같았으며, 또한 표 1의 결과를 재 검증하기 위하여 PSA ELISA Kit(Catalog No. PS067T)를 사용하여 실험한 검사결과를 표 2로 나타내었다.

[표 1]

# 양성기준 : 소변 중 PSA 10ng/㎖ 이하

[표 2]

# 양성기준 : 소변 중 PSA 10ng/㎖ 이하

상기의 표 1의 결과와 표 2의 결과는 PSA 음성 및 양성 검체에서 동일한 결과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, 병원 및 임상병리기관에서 신뢰도가 높은 것으로 인식되어 일반적으로 적용되고 있는 정량 ELISA Kit 검증 결과와 비교했을 때 동일한 결과를 얻은 것으로부터 본 발명품의 테스트 결과를 신뢰할 수 있다고 판단된다.

따라서 본원 발명자 등은 상기의 실험결과로부터 PSA 단일클론 항체를 흡착시킨 항체패드 및 PSA 항체를 골드 입자에 부착시키고 항체-골드 접합체를 함침시켜 건조한 항체-골드 접합패드(conjugate pad)와, 검체의 흐름을 도와주는 샘플패드와 흡수패드를 적층시킨 스트립과, 검체 투입구와 결과표시창과 손잡이를 구비하며 상기 진단스트립을 내부에 조립하여 검사 결과를 관찰할 수 있도록 하는 플라스틱 하우징을 포함하여 이루어지는 본원의 진단키트를 이용하여 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 전립선암을 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.

도 1은 본원의 기술사상이 적용되어 전립선 질환 진단키트에 내장되는 스트립(10)을 나타낸 것으로, 스트립(10)은 나이트로셀룰로우즈 멤브레인(11)에 2개 라인을 갖고, 제 1라인은 산양-anti 마우스 IgG 다중클론항체가 1.5 내지 1.7㎎/㎖의 농도로 점적되어 대조선 Control기능을 갖도록 제공되고, 제 2라인은 결과선(test line)으로 토끼-anti PSA단일클론항체가 0.7 내지 1.0㎎/㎖의 농도로 점적 되어 건조 후 사용되는 구성으로 결과선 T(test line)의 발색 유무 및 농도 진하기를 대조해 관찰할 수 있도록 제공되며, 샘플패드(12)는 소변이 2~3방울 적가 되도록 제공되는 부위이며, 접합(Conjugate)패드(13)은 항체를 콜로이당 금 입자 용액에 골드 ㎖ 당 항체 0.3~0.7ng을 가하여 폴리에스테르(100% Polyester:6613) 패드에 고르게 분무하여 건조하여 제공되는 접합(Conjugate)패드를 나타낸 것이며, 흡수패드(14)는 면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고 분석물질을 포함한 시료용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 역할을 하도록 면 섬유로(100% Cotton Linter:Millipore 222)를 사용하여 도 1에 제시되는 스트립을 얻을 수 있음을 나타낸 것이다.

도 2는 상기 도 1에 제시된 스트립(10)을 하부케이스(20)와 상부케이스(30)에 수용하여 진단 키트(40)를 형성하는 분해사시도로 나타낸 것으로, 하부케이스(20)는 상부스트립홀더(21) 및 하부스트립홀더(22)와 측면으로 다수개의 지지구(23)를 가지며, 상단걸림턱(24) 및 하단걸림턱(25)을 갖는 구조로 제공되어 상단걸림턱(24)쪽에 도 1에 제시된 스트립(10)의 흡수패드(14)가 위치하고, 하단걸림턱(25)쪽에 도 1에 제시된 스트립(10)의 샘플패드(12)가 위치하여 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22)에 안정적으로 재치/내삽되도록 제공되고, 상부케이스(30)는 일단으로 손잡이부(31)를 갖고 중앙부에는 소변샘플 주입구(32) 및 스트립(10)의 대조선 Cline과 결과선 T- line이 표시되는 결과표시부(33)를 가지며 리더기에 진입방향표시부(34)를 갖는 구조를 갖도록 제공될 수 있는 실시양태를 나타낸 것이다.

도 3은 본원에서 제공되는 진단키트(40)의 결합 과정을 나타낸 것으로, 도 3a에서는 하부케이스(20)의 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22) 사이에 도 1에 제시된 스트립(10)이 먼저 재치하려는 과정도를 나타낸 것이고, 3b에서는 하부케이스(20)의 상단걸림턱(24)과 하단걸림턱(25)사이에서 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22)에 도 1에 제시된 스트립(10)이 먼저 재치하려는 과정도를 나타낸 것이, 3b에서는 하부케이스(20)의 상부스트립홀더(21)와 하부스트립홀더(22) 사이에 스트립(10)이 재치/내삽 된 후 상부케이스(30)가 덮어지려는 과정도를 나타낸 것이며, 도 3c에서는 하부케이스(20) 내부에 스트립(10)이 재치/내삽 된 후 상부케이스(30)가 덮여서 진단키트(40)로 제공된 상태를 나타낸 것이다.

도 4는 본원의 진단키트(40)가 출원인 회사에서 개발되어 별도의 발명품으로 제공(특허출원 준비중)되는 리더기(Reader)를 통하여 소변을 검체로 하여 전립선 질환을 진단할 수 있는 적용예를 나타낸 것으로, 리더기(50)의 외관은 데이터표시부(51) 및 전원 on/off 표시를 통하여 감사시작 및 종료여부를 확인표시부(52)를 가지며, 분석이 완료된 후 진단키트를 분출시키기 위한 분출보턴(53)을 갖고, 리더기(50)의 일 측부로는 분석용 진단키트삽입구(54)를 갖는 구성으로 제공되어서 사용자가 기상을 하여 진단키트(40)의 손잡이부(31)를 잡고 중앙부에 있는 소변샘플 주입구(32)에 소변을 묻혀 리더기(50)의 진단키트삽입구(54)에 진입방향표시부(34)의 화살표 방향으로 꽂아주는 단순한 동작에 의해 전립선 질환의 발병 또는 전립선암 진행여부를 확인할 수 있는 바, 이는 검체 중에 존재하는 PSA가 골드입자에 부착된 항체와 반응하면서 나이트로셀룰로우즈 멤브레인 위를 모세관현상에 의해서 진단이 전개되기 때문이다.

도 5는 본원의 진단키트를 이용하여 전립선암 환자와 정상인의 PSA를 검출하여 결과 값을 기준으로 10ng/㎖의 cut-off 수치를 정하게 된 실험결과의 도면을 나타낸 것으로, 상기의 실험결과로부터 본원에서 PSA 단일클론 항체를 흡착시킨 항체패드 및 PSA 항체를 골드입자에 부착시키고 항체-골드 접합체를 함침시켜 건조한 항체-골드 접합패드(conjugate pad)와, 검체의 흐름을 도와주는 샘플패드와 흡수패드를 적층시킨 진단스트립과, 검체 투입구와 결과표시창과 손잡이를 구비하며 상기 진단스트립을 내부에 조립하여 검사 결과를 관찰할 수 있도록 하는 플라스틱 하우징을 포함하여 이루어지는 진단장치를 이용하여 전립선-특이항원(prostate specific antigen, PSA)의 항원, 항체 반응에 따른 발색을 통해 사람의 초변을 검체로 활용하여 전립선 질환을 진단할 수 있는 기술사상의 발명이다.

10 : 스트립 11 : 나이트로셀룰로우즈 멤브레인
12 : 샘플패드 13 : 접합(Conjugate)패드
14 : 흡수패드 20 : 하부케이스
21 : 상부스트립홀더 22 : 하부스트립홀더
23 : 지지구 24 : 상단걸림턱
25 : 하단걸림턱 30 : 상부케이스
31 : 손잡이부 32 : 소변샘플 주입구
33 : 결과표시부 34 : 진입방향표시부
40 : 진단 키트 50 : 리더기
51 : 데이터표시부 52 : 확인표시부
53 : 분출보턴 54 : 진단키트삽입구

Claims

대상시료 내 전립선 특이 항원(Prostate-Specific Antigen, PSA)의 수준을 검출하여 전립선암 여부를 판별하는, 바이오 센서.
제1항에 있어서,
상기 바이오 센서는 인간의 소변을 검체로 하여 면역 크로마토그래피 (Immunochromatography)법을 사용하여 전립선암을 진단할 수 있는 것인, 바이오 센서.
제1항에 있어서,
상기 바이오 센서는 인간의 소변을 검체로 하여 임피던스 변화량 측정을 통해 전립선암 발생 여부를 진단할 수 있는, 바이오 센서
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 바이오 센서를 포함하는 전립선암 진단용 키트.
제4항의 전립선암 진단용 키트를 이용한 전립선암 진단에 필요한 정보 제공 방법.