FI82071B - Av nukleosiditrifosfat beroende 1-metylhydantoinas och dess anvaendning. - Google Patents
Av nukleosiditrifosfat beroende 1-metylhydantoinas och dess anvaendning. Download PDFInfo
- Publication number
- FI82071B FI82071B FI850732A FI850732A FI82071B FI 82071 B FI82071 B FI 82071B FI 850732 A FI850732 A FI 850732A FI 850732 A FI850732 A FI 850732A FI 82071 B FI82071 B FI 82071B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- mmol
- methylhydantoin
- sarcosine
- atp
- dsm
- Prior art date
Links
- RHYBFKMFHLPQPH-UHFFFAOYSA-N N-methylhydantoin Chemical compound CN1CC(=O)NC1=O RHYBFKMFHLPQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 106
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 56
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 claims abstract description 28
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 22
- -1 nucleoside triphosphate Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 108010060059 Sarcosine Oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000008118 Sarcosine oxidase Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108010079870 Sarcosine Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000013000 Sarcosine dehydrogenase Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 11
- SREKYKXYSQMOIB-UHFFFAOYSA-N N-carbamoylsarcosine Chemical compound NC(=O)N(C)CC(O)=O SREKYKXYSQMOIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 claims description 9
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 claims description 9
- 239000006046 creatine Substances 0.000 claims description 9
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 claims description 8
- 108010092286 N-carbamoylsarcosine amidohydrolase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 8
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 7
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 108010058207 Anistreplase Proteins 0.000 claims description 6
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 claims description 6
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 claims description 6
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000007357 dehydrogenase reaction Methods 0.000 claims description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000011572 manganese Substances 0.000 claims description 5
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 claims description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 3
- 229960004279 formaldehyde Drugs 0.000 claims 2
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 claims 2
- 229960001983 magnesium aspartate Drugs 0.000 claims 2
- RXMQCXCANMAVIO-CEOVSRFSSA-L magnesium;(2s)-2-amino-4-hydroxy-4-oxobutanoate Chemical compound [H+].[H+].[Mg+2].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC([O-])=O.[O-]C(=O)[C@@H](N)CC([O-])=O RXMQCXCANMAVIO-CEOVSRFSSA-L 0.000 claims 2
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims 1
- 239000012928 buffer substance Substances 0.000 claims 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 claims 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims 1
- KBMLJKBBKGNETC-UHFFFAOYSA-N magnesium manganese Chemical compound [Mg].[Mn] KBMLJKBBKGNETC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229940091250 magnesium supplement Drugs 0.000 claims 1
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims 1
- 108010029444 creatinine deiminase Proteins 0.000 abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 18
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 13
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 13
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 13
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 10
- 229940091173 hydantoin Drugs 0.000 description 9
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N hydantoin Chemical compound O=C1CNC(=O)N1 WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 5
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 5
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 5
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 5
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 5
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VMAQYKGITHDWKL-UHFFFAOYSA-N 5-methylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound CC1NC(=O)NC1=O VMAQYKGITHDWKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 4
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006154 MacConkey agar Substances 0.000 description 4
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 4
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 4
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- XUCIJNAGGSZNQT-JHSLDZJXSA-N (R)-amygdalin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H](C#N)C=2C=CC=CC=2)O1 XUCIJNAGGSZNQT-JHSLDZJXSA-N 0.000 description 3
- YDBHVMTTYXWHLI-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tribromo-3-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=C(Br)C=C(Br)C(O)=C1Br YDBHVMTTYXWHLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000940556 Arthrobacter sp N-carbamoylsarcosine amidase Proteins 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 3
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 3
- 229940089837 amygdalin Drugs 0.000 description 3
- YZLOSXFCSIDECK-UHFFFAOYSA-N amygdalin Natural products OCC1OC(OCC2OC(O)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1OC(C#N)c3ccccc3 YZLOSXFCSIDECK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- YGHHWSRCTPQFFC-UHFFFAOYSA-N eucalyptosin A Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(OC(C#N)C=2C=CC=CC=2)OC(CO)C(O)C1O YGHHWSRCTPQFFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 3
- 150000001469 hydantoins Chemical class 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 3
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YIROYDNZEPTFOL-UHFFFAOYSA-N 5,5-Dimethylhydantoin Chemical compound CC1(C)NC(=O)NC1=O YIROYDNZEPTFOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 108010066906 Creatininase Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 125000000089 arabinosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO1)* 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N beta-melibiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- INHCSSUBVCNVSK-UHFFFAOYSA-L lithium sulfate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S([O-])(=O)=O INHCSSUBVCNVSK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 2
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- 238000006395 oxidase reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N pyridoxamine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CN)=C1O NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical group CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTYZJYSZOUXZEO-UHFFFAOYSA-N 3,4,5-tribromo-2-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(Br)=C(Br)C(Br)=C1O VTYZJYSZOUXZEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 102000003736 ATP Synthetase Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108010024957 Ascorbate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100036238 Dihydropyrimidinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 101710132589 Peroxidase 2 Proteins 0.000 description 1
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N carbamoyl phosphate Chemical compound NC(=O)OP(O)(O)=O FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 108091022884 dihydropyrimidinase Proteins 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940005740 hexametaphosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- YBVAXJOZZAJCLA-UHFFFAOYSA-N nitric acid nitrous acid Chemical compound ON=O.O[N+]([O-])=O YBVAXJOZZAJCLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229960005222 phenazone Drugs 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000008151 pyridoxamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011699 pyridoxamine Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Lubricants (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
1 82071
Nukleosiditrifosfaatista riippuvainen 1-metyylihydantoinaasi ja sen käyttäminen
Analyyttisessä kemiassa, erikoisesti kliinis-kemiallisessa diagnostiikassa, on jatkuvasti olemassa yhä kasvava entsy-maattisten menetelmien tarve, joilla voidaan analyyttisesti määrätä luonnon aineita, biologisia aineenvaihduntatuotteita ja niistä johdettuja yhdisteitä. Syinä ovat entsyymi-katalyyttisten reaktioiden erittäin korkea spesifisyys, niiden nopea ja tarkasti määrätty kulku ilman häviötä lievissä reaktio-olosuhteissa - tavallisesti välillä 15-40°C vettä sisältävässä väliaineessa neutraalilla pH-alueella -sekä mahdollisuus suorittaa ne yksinkertaisella ja herkällä tavalla, erikoisesti fotometrisillä mittausmenetelmillä joko suoraan tai niihin kytkettyjen indikaattoreiden avulla kvantitatiivisesti.
1-metyylihydantoiinia varten ei tähän asti ole tunnettu mitään entsyymikatalyyttistä reaktiomenetelmää, niin että tämä yhdiste olisi voitu analysoida entsymaattisesti joko suoraan tai epäsuoraan. Tällainen menetelmä olisi kuitenkin erikoisen arvokas mm. kreatiniinin määräystä varten, joka on kliinis-diagnostisesti tärkeä seerumin ja uriinin osa, joka voidaan muuttaa erään jo kauan tunnetun entsyymireak-tion mukaan kreatiniini-iminohydrolaasin avulla (E.C. 3.5.4.21) 1-metyylihydantoiiniksi ja ammoniakiksi.
Kreatiinin entsymaattista määritystä varten seerumista tai uriinista tunnetaan tosin jo useita menetelmiä (Wahlefeld, A.W., G. Holz ja H.U. Bergmeyer, teoksessa H.U. Bergmeyer; Methoden der enzymatischen Analyse, 3.painos, osa II, Verlag Chemie, Weinheim 1974, sivut 1834-1838; Fossati, P., L. Prenzipe, ja G. Berti, Clinical Chemistry (1983) 29, 1494-1496; Tanganelli, E., L. Prenzipe, D. Bassi, S. Cambiagni, ja E. Murador, Clinical Chemistry (1983) 28, 1461-1464); niillä kaikilla on kuitenkin se varjopuoli, että reaktiosek-venssin väliasteina on joko kreatiini (Wahlefeld et ai.; 2 82071
Fossati et ai.) tai ammoniakki (Tanganelli et ai.) eli aineita, joita on jo alunperin vaihtelevia ja kreatiniiniin nähden selvästi suurempia konsentraatioita analysoitavassa seerumi- tai uriininäytteessä. Tässä tarvitaan siis krea-tiniinin määrityksessä kahden erillisen tai peräkkäin seu-raavan reaktioliuoksen erotusmittauksia: ensimmäisessä määritetään ensiksi vapaa kreatiini tai ammoniakki, ja toisessa lisätään joko kreatiniiniamidohydrolaasia (E.C. 3.5.2.10) tai kreatiniini-iminohydrolaasia (- kreatiniini-deiminaasi), jolloin saadaan vielä kreatiniinistä muodostuneen kreatiinin tai ammoniakin osuus selville ("näyte/ver-rokkimenetelmä" tai "E1/E2-menetelmä"). Tällaiset menetelmät ovat käsinsuorituksen kannalta suhteellisen hankalia ja niitä on myös vain rajoitetusti mahdollista sovittaa automaattisiin analyysisysteemeihin, erikoisesti silloin, jos reaktioiden täydelliseen kulkuun tarvitaan pitempiä inku-bointiaikoja. Tosin voidaan periaatteessa sopivien reaktio-olosuhteiden valinnan ansiosta suorittaa kreatiniinimääritys tunnettujen entsymaattisten menetelmien avulla verrokkiar-vojen mittauksia kiertäen ns. kineettisessä "fixed-time"-menetelmässä; tämä tosin vaatii mittausajankohtien hyvin tarkkaa noudattamista määrätyissä lämpötilaolosuhteissa, mikä onnistuu riittävän tarkasti vain analyysiautomaateissa ja tekee käsinsuorituksen siten lähes mahdottomaksi.
Päinvastoin kuin kreatiini tai ammoniakki ei 1-metyylihydan-toiini ("N-metyylihydantoiini", "NMH") ole mikään seerumin tai uriinin luonnollinen aineosa; kreatiniinin määritystapa, jossa on välituotteena 1-metyylihydantoiini, tarjoaa siten sen huomattavan edun, että verrokkiarvomittaus voidaan jättää pois sillä edellytyksellä, että itse 1-metyylihydan-toiinin entsymaattista reaktiota voidaan käyttää indikaat-torireaktiona, tai että mahdollisesti sen perään liitetyt indikaattorireaktiot eivät tapahdu seerumissa tai uriinissa merkitsevissä konsentraatioissa luonnostaan esiintyvien aineiden kanssa.
Il 3 82071
Sen vuoksi on olemassa aineen ja menetelmän tarve, joiden avulla voidaan entsymaattisesti analysoida 1-metyylihydan-toiini siten, että sen kvantitatiivinen, etupäässä fotometrinen määritys on mahdollista ilman muiden seerumin tai uriinin aineosien samanaikaista lukemista.
Tehtävä voidaan ratkaista keksinnön mukaisesti erään uuden, tähän asti tuntemattoman entsyymin keksimisen kautta, joka pystyy hydrolysoimaan 1-metyylihydantoiinin kun mukana on ainakin jotakin nukleosiditrifosfaattia, etupäässä adeno-siini-5’-trifosfaattia (ATP), moniarvoista metalli-ionia, etupäässä Mg2+ tai Mn3+, samoin kuin joissakin tapauksissa ammoniumsuolaa.
Kirjallisuudessa on tosin selostettu jo hydantoiinien erilaisia entsymaattisia hydrolyysejä "hydantoinaasin" avulla (hydropyrimidiini-hydrolaasi, E.C.3.5.2.2. ) eri lähteistä, mutta vaikutus on voitu tähän asti osoittaa vain ei-sub-stituoidun hydantoiinin suhteen (Wallac, D.P. ja S. Griso-lia, J. Biol. Chem. (1957) 226, 227-188) tai 5-asennossa substituoitujen hydantoiinien suhteen (DAS 26 31 048; DAS 28 11 303; Olivieri, R., E. Fascetti, L. Angelini ja L. Degen, Biotechnology and Bioengineering (1981) 23, 2173-2183). Sen lisäksi ei millään kyseisistä entsyymeistä ole osoitettu kofaktori-riippuvaisuutta; Wallacin et ai. selostama entsyymi ei myöskään tarvitse hydantoiinin hydrolyy-sissä esimerkiksi kaksiarvoisten metalli-ionien lisäystä, Olivierin et ai. tutkimuksessa jopa osoitetaan, että hydantoiinin hydrolyysissä tapahtuu selvää ehkäisyä ammonium-kloridin läsnäollessa (0,1 moolia/1), kun taas keksinnön mukaisen entsyymin vaikutuksessa tapahtuu jopa selvästi nousua ammoniumsuolojen lisäyksen ansiosta.
Keksinnön mukaisen entsyymin esiintyminen, eristäminen ja ominaisuudet samoin kuin käyttäminen 1-metyylihydantoiinin tai kreatiniinin määrittämiseen on selostettu lähemmin seu-raavassa. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
4 82071
Keksinnön mukainen uusi entsyymi 1-metyylihydantoinaasi näyttää esiintyvän levinneenä mikro-organismeihin. Siten on voitu löytää sitä lajien Brevibacterium, Moraxella, Micrococcus ja Arthrobacter mikro-organismeista. Esimerkkinä näiden lajien kannoista, joissa todettiin keksinnön mukaista entsyymiä sellainen pitoisuus, että kannatti sitä valmistaa, ovat Arthrobacter spec. DSM 2563, DSM 2564, Moraxella spec. DSM 2562, Micrococcus spec. DSM 2565 tai Brevibacterium spec. DSM 2843. Seuraavassa on esitetty mikro-organismikan-tojen kuvaus:
Moraxella-kanta BMTU 2193 / DSM 2562 gram-reaktio : liikkuvuus : itiönmuodostus : katalaasi : oksidaasi : + aerobi kasvu : + anaerobi kasvu : OF-O / OF-F : -/- denitrifikaatio : nitraatti->nitriitti : + substraatin käyttö sitraatti : + glukoosi : malaatti : + fruktoosi : + mannoosi : + maltoosi : L-seriini : kasvu 37°C:ssa : 41°C:ssa : kasvumuoto : kokkisauva leveys pm : 0,8-1,0 pituus pm : 1,0-2,0
II
5 82071
Arthrobacter-kanta BMTU 2194 / DSM 2563 gram-reaktio : + liikkuvuus : + itiönmuodostus : katalaasi : + oksidaasi : aerobi kasvu : + anaerobi kasvu : (+) OF-O / OF-F : +/- denitrifikaatio : nitraatti->nitriitti : + ureaasi : kasvu lämpötilassa 20-25-30°C : erittäin hyvä 37 °C : hyvä 42°C : heikko sitraatinkäyttö : + tryptofaanidesaminaasi (TDA) : + ei haponmuodostusta seuraavilla : glukoosi,mannoo- si,inositoli,sorbitoli,ramnoosi,sakkaroosi,meli-bioosi,amygdaliini,arabinoosi kasvumuoto : pleomorfisia sauvoja pesäkkeenkuvaus standardil/Merck : kellert.,sileäreunainen,kiil tävä, kupera veriagar : kuten yllä (hemolyysi neg.) brolasiiniagar : kuten yllä
MacConkey-agar : ei kasvua
Pseudom. selektiivinen agar : ei kasvua
Arthrobacter-kanta BMTU 2195 / DSM 2564 gram-reaktio : + itiönmuodostus : katalaasi : + 6 82071 oksidaasi : aerobi kasvu : + anaerobi kasvu : kasvu lämpötilassa 4°C : heikko 20-25°C : erittäin hyvä 30°C : hyvä 37/42 °C : OF-O / OF-F : +/- nitraatti->nitriitti : ureaasi : sitraatinkäyttö : + tryptofaanidesaminaasi (TDA) : haponmuodostus glukoosi : mannoosi : inositoli : sorbitoli : ramnoosi : (+) sakkaroosi : melibioosi : amygdaliini : arabinoosi : kasvumuoto : pleomorfisiä sauvoja pes äkkeenkuvaus standardiI/Merck : kellert.,sileäreunainen,kiil tävä ,kupera veriagar : kuten yllä (hemolyysi neg.) brolasiiniagar : vihertävä, muuten kuten yllä
MacConkey-agar : ei kasvua
Pseudom. selektiivinen agar : ei kasvua
Micrococcus-kanta BMTU 2255 / DSM 2565 gram-reaktio : + 7 82071 liikkuvuus : itiönmuodostus : katalaasi : + oksidaasi : aerobi kasvu : + anaerobi kasvu : denitrifikaatio : nitraattianitriitti : kaseiinihydrolyysi : + kasvu lämpötilassa 10°C : heikko 28°C : hyvä 42 eC : 5 ja 10% NaCl : + haponmuodostus sakkaroosi,glukoosi,fruktoosi : + maltoosi,ksyloosi,mannoosi,inositoli,sorboosi : heik ko + laktoosi,trehaloosi,arabinoosi : -kasvumuoto : kokkeja pesäkkeenkuvaus standardiI/Merck : valk.,sileäreunainen,kiil tävä,kupera veriagar : kuten yllä brolasiiniagar : likaisen kelt. muuten kuten yllä
MacConkey-agar : ei kasvua
Pseudom. selektiivinen agar : ei kasvua
Brevibacterium-kanta BMTU 2253 / DSM 2843 gram-reaktio : + liikkuvuus : - (10°C:ssa +) itiönmuodostus : katalaasi : + oksidaasi : aerobi kasvu : + 8 82071 anaerobi kasvu : OF-O / OF-F : -/+ denitrifikaatio : nitraatti->nitriitti : + ureaasi : + arginiini-dehydr. : kaseiinihydrolyysi : kasvu lämpötilassa 10 ja 28°C : + 42°C : 5 ja 10% NaCl : + haponmuodostus negatiivinen: glukoosi,mannoosi,inosi-toli,sorbitoli,ramnoosi,sakkaroosi,melibioosi, amygdaliini,arabinoosi kasvumuoto : kokkisauvoja pesäkkeenkuvaus standardil/Merck : kellert.,sileäreunainen,kiil tävä, kupera veriagar : kuten yllä (ei hemolyysiä) brolasiiniagar : kuten yllä
MacConkey-agar : ei kasvua
Pseudom. selektiivinen agar : ei kasvua
Keksinnön mukaista entsyymiä valmistetaan sen vuoksi mieluimmin siten, että viljellään edellä esitettyjä mikro-organismeja ja eristetään entsyymi biomassasta ja/tai viljelyn väliaineesta.
Uudesta entsyymistä todettiin seuraavat ominaisuudet: 1. Moolipaino a) SDS-gradienttigeelielektroforeesi Mr = 125000
2. pH-optimi: pH = 7,8 aktiivisuus %:ssa, 25°C
ti 9 82071 pH 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 TES-puskuri 5 76 100 100 95 69 150 mmol/1 TRIS-puskuri 1 26 60 52 38 19 150 mmol/1 3. Spesifisyys:
Suhteellinen aktiivisuus %:ssa (ADP/pyruvaattikinaasi/ laktaatti-dehydrogenaasi) a) substraatti (kulloinkin 0,1 mmoolia/1 loppu-konsentraatio reaktioseoksessa)
Substraatin spesifisyyden määräämiseksi meneteltiin seuraavasti: 1. Perusreagenssi
Komponentit Konsentraatio
Kaliumfosfaatti (pH 8,0) 75 mmoolia/1 NADH 0,25 mmoolia/1 ATP 1,30 mmoolia/1
Fosfoenolipyruvaatti 0,42 mmoolia/1
MgCl2 2,00 mmoolia/1
Pyruvaattikinaasi 4 U/ml
Laktaattidehydrogenaasi 10 U/ml 2. 1-metyylihydantoinaasl (15 U/ml 50-prosenttisessa glyseriinissä, 20 mmoolia/1 Tris * HCl-puskuri, pH 8,0) 3. Hydantoiiniliuokset
Hydantoiinin (1-metyylihydantoiini, hydantoiini, 5-metyylihydantoiini, sekä 5,5-dimetyylihydantoiini) konsentraatio: kulloinkin 0,6 mmoolia/1 H2O
4. Testien suorittaminen
Aallonpituus 365 nm; T * 25eC, d = 1 cm; testivolyymi 1,21 ml 10 82071
Astioihin pipetoidaan Näyte Reaktioseoksen verrokkiarvo
Perusreagenssi (1) 1,00 ml 1,00 ml Näyte (3) 0,20 ml
Vesi 0,20 ml sekoitetaan, sen jälkeen lisätään 1-metyylihydan- 0,01 ml 0,01 ml toinaasia (2) 2 min kuluttua 1-metyylihydantoinaasin lisäämisestä mitataan näytteen (ΔΕρ) ja reaktioseoksen verrokkiarvon ( AErl) erotus, ΔΕ. ΔΕ = ΔΕρ - AErl 5. Lasketaan suhteellinen reaktionopeus eri hydantoii- neista saaduista ΛE/min-arvoista 1-metyylihydantoiinin ΔΕ/min-arvoon verrattuna, joka = 100 %
Saatiin seuraavat tulokset: % 1-metyylihydantoiini H 100 /"\
0 = c c = O
N--CHo ch3 5-metyylihydantoiini H 14 0 0 = C C = 0
/H
HN-C
ch3
Hydantoiini H 13 0./N. o HN-CH2
II
11 82071 t 5,5-dimetyylihydantoiini H 0 /% 0 - C C « 0 /ch3
HN-C
ch3 b) Nukleotidit
Suhteellinen aktiivisuus %:ssa (ATP = 100) määrät täessä karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasi + sarkosiinioksidaasin suhteen
Nukleotidi (4 mmoolia/1) % ATP 100 ADP 1 AMP 0 GTP 7 CTP 1,5 TTP o UTP o PPi 0
Karb-fosfaatti 0
Na-tripolyfosfaatti 0
Na-heksametafosfaatti 0 4. Riippuvuus metalli-ioneista
Suhteellinen aktiivisuus %:ssa (5 mmoolia/1 magnesium-kloridia = 100) mmoolia/1 aine % 0 MgCl2 17 1 83 5 -"- 100 10 -"- 98 5 MnCl2 60 5 ZnCl2 24 5. Aktivoivat aineet i2 82071
Erikoisesti NH+4. Suhteellinen aktiivisuus'%:ssa (30 mmoolia/1 AS = 100) aktivoiva aine mmoolia/1 %
Ei (NH4)2S04:ää 0 44 30 100 10 95 NH4C1 30 91 NH4-asetaatti 30 98
Li2S04 30 40
Na2S04 30 39 K2S04 30 59
NaCl 30 41
NaHC03 30 40 6. Inhiboivat aineet Erikoisesti EDTA, NaF.
NaF: 1 x 10"2 moolia/1 inhiboi 100-prosenttisesti EDTAn aiheuttama suhteellinen inhibointi mmoolia/1 aktiivisuus 0 100 5 100 10 42 50 2 * Kun mukana reaktioseoksessa on 7,5 mM Mg++ 7. Michaelis-vakiot Κπ,ΑΤΡ (TES 0,15 moolia/1, pH 7,8; sarkosiinin suhteen); 0,8 mmoolia/1 Km 1-metyylihydantoiini (0,15 moolia/1 TES, pH 7,8 ADP:n suhteen); 0,02 mmoolia/1 8. Stabiilisuus a) Stabiilisuus lämpötilan suhteen: 50-prosenttisessa glyseriinissä; 20 mmoolia/1 TRIS, pH 8,0 (2 U/ml) 30 min jäännösaktiivisuus %:ssa 25°C 100 50°C 94 60°C 70 70°C 0 i3 82071 b) pH-stabiilisuus 20-prosenttisessa glyseriinissä, 10 nunoolla/1 TRIS, 0,2 U/ml, +4*C, 3 päivää pimeässä säilytettynä (lähtöarvo = 100 %) pH jäännösaktiivisuus %:ssa 6,3 8 6,5 20 7.0 61 8.0 72 9.0 86
Keksinnön mukaista entsyymiä voidaan saada mikro-organismeista, jotka sisältävät sellaisen määrän 1-metyylihydan-toinaasia, että valmistus on kannattavaa, ennestään tunnettujen menetelmien mukaan, joiden avulla puhdistetaan entsyymejä. Tarkoituksenmukaisesti mikro-organismi liuotetaan ja entsyymi saostetaan lisäämällä polyetyleeni-imiiniä.
Täten saadaan entsyymivalmistetta, joka on käyttökelpoista analyyttisiin tarkoituksiin. Mikäli halutaan lisäpuhdistus, käytetään edullisesti ammoniumsulfaattifraktiointia, kuumen-nusvaihetta samoin kuin kromatografiaa.
Mikro-organismien liuottaminen voi tapahtua tunnettujen kemiallisten tai fysikaalisten menetelmien mukaan, esimerkiksi kemiallisesti lysotsyymin avulla tai fysikaalisesti ultraäänen, korkeapainesuspensiossa hajottamisen avulla ym. Liuottamismenetelmä ei ole ratkaiseva. Erikoisen hyvin soveltuvat kuitenkin menetelmät, joissa solumembraanit liukenevat suureksi osaksi.
Kuumennusvaihe tapahtuu tarkoituksenmukaisesti 50°C:ssa pH-alueella, jossa entsyymin stabiilisuus on hyvä.
Kromatografista puhdistamista varten ovat osoittautuneet erikoisen hyviksi fenyylisefaroosi ja DEAE-ryhmiä sisältävät heikosti emäksiset anioninvaihtajat. Eräässä suositussa puhdistusmenetelmässä tapahtuu lysotsyymiliuotus 20-prosenttisessa glyseriinissä, saostus lisäämällä liukenevaa poly- i4 82071 etyleeni-imiiniä, sakan talteenotto, sen ammoniumsulfaat-tifraktiointi, käsittelyvaihe kuumuuden avulla 50eC:ssa ja pH-arvolla 8, kromatografia fenyylisefaroosin päältä, jota seuraa kromatografia DEAE-Sephacel® :n päältä ja tämän jälkeen molekyyliseulafraktiointi, tarkoituksenmukaisesti Sephacyl® S 200:n päältä. Tällä tavoin saadaan puhdasta entsyymivalmistetta, jonka ominaisaktiivisuus on 2,1 U/mg proteiinia, josta entsyymin ominaisuudet voidaan määrätä.
Entsyymin valmistamista varten viljellään mikro-organismeja tarkoituksenmukaisesti ravinneliuoksessa, joka sisältää 1-metyylihydantoiinia hiili- ja typpilähteenä vitamiinien ja hivenaiheiden ohella.
Keksinnön kohteena on vielä 1-metyylihydantoinaasin käyttäminen kreatiniinin määrittämiseen vettä sisältävästä puskuroidusta liuoksesta muuttamalla kreatiniini kreatiniini-deiminaasin E.C. 3.5.4.21 avulla 1-metyylihydantoiiniksi, hydrolysoimalla jälkimmäinen 1-metyylihydantoinaasin kanssa niin, että läsnä on ylimäärä nukleosiditrifosfaattia ja jotakin moniarvoista metalli-ionia, ja a) 1-metyylihydantoiinista muodostuneen hydrolyysituotteen määrittäminen N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasin avulla, jolloin muodostuu sarkosiinia, ja sarkosiinin osoittaminen sarkosiinioksidaasin tai sarkosiinidehydrogenaasin avulla, tai b) samanaikaisesti muodostuneen nukleosididifosfaatin määrittäminen.
Syntyvä hydrolyysituote käyttäytyy reaktionopeuden ja mit-taussignaalikorkeuden suhteen jälkeen liitetyssä indikaatto-rireaktiossa N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasin kanssa käytännöllisesti katsoen aivan kuin N-karbamoyylisarkosii-ni, joka on lisätty reaktioseokseen 1-metyylihydantoiinin asemesta määrältään ekvimolaarisena. (ks. myös kuvioita 2 ja 3).
is 82071
Puskuroidun vesiliuoksen pH-arvo on tarkoituksenmukaisesti välillä 7,0 - 9,0, etupäässä välillä pH 7,3, ja pH 8,5, erikoisesti välillä pH 7,5 ja pH 8,2. pH-arvon säätelemiseen soveltuvat aineet, jotka ovat mainitulla pH-alueella riittävän puskurikapasiteetin omaavia, kuten esimerkiksi fosfaatti, Tris, trietanoliamiini ja TES. Parhaana pidetään erikoisesti TES-puskuria. Puskurin konsentraatio on tavallisesti välillä 10-500 mmoolia/1, etupäässä välillä 50-200 mmoolia/1, aivan erikoisen edullisesti välillä 75-125 mmoolia/1.
Nukleosiditrifosfaattina tulevat kyseeseen ATP tai GTP; etupäässä ATP. Konsentraatioalue on tarkoituksenmukaisesti 0,05-50 mmoolia/1, etupäässä välillä 0,5-20 mmoolia/1, erikoisen edullisesti välillä 1-10 mmoolia/1.
Moniarvoisina metalli-ioneina käytetään etupäässä kaksiarvoisia metalli-ioneja; erikoisen suosittuja ovat Mg- ja Mn-ionit, erikoisesti Mg-ionit vesiliukoisten suolojensa kuten MgCl2 tai MgS04 muodossa tai myös Mg-aspartaattina. Metalli-ionien konsentraatio on tällöin tarkoituksenmukaisesti välillä 0,1-50 mmoolia/1, etupäässä välillä 0,5-20 mmoolia/1, erikoisen edullisesti välillä 1-10 mmoolia/1.
Millilitraa kohti reaktioseosta käytetään tavallisesti 0,01-10 U 1-metyylihydantoinaasia, erikoisesti 0,05-2 U, edullisimmin 0,1-1 U.
1-metyylihydantoinaasin vaikutuksen vahvistamisessa ovat ammoniumsuolalisäykset osoittautuneet edullisiksi; konsent-raatiot ovat tällöin edullisesti välillä 0,1-100 mmoolia/1, etupäässä 1-30 mmoolia/1, erikoisesti välillä 5-10 mmoolia/1.
Kreatiniini-iminohydrolaasia käytetään tarkoituksenmukaisesti 0,1-20 U/ml, etupäässä 0,05-15 U/ml, erikoisesti 1-10 U/ml.
N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasia varten ovat vaiku-tuskonsentraatiot 0,1-20 U/ml edullisia, etupäässä 0,5-10 i6 82071 U/ml, erikoisesti 1-5 U/ml. Tässä suhteessa ovat tavallisesti DE-A-3248145:n ilmoittamat määrät analogisia.
Sarkosiinioksidaasille on edullinen alue 1-20 U/ml, etupäässä 2-10 U/ml, erikoisesti 4-8 U/ml. Sama pätee vaihtoehtoisesti käytettävän sarkosiinidehydrogenaasin suhteen.
Sarkosiinin osoittaminen sarkosiinioksidaasin tai sarkosiinidehydrogenaasin kanssa on tunnettua ja tässä ilmoitetut ja asiantuntijoiden tietämät olosuhteet soveltuvat myös keksinnön piirissä. Sama pätee muodostuneen nukleosididifos-faatin, siis ADP:n tai GDP:n osoittamiseen. Myös tässä voidaan käyttää tunnettuja menetelmiä tai reagensseja.
Muodostuneen sarkosiinin osoittamisen suhteen pidetään parhaana tunnetun sarkosiinioksidaasireaktion käyttämistä. Sarkosiinin hapettamisen kulkua voidaan seurata joko elekt-rokemiallisesti C>2:n kulutuksen perusteella tai H2C>2:n muodostumisen perusteella reaktioväliaineessa, tai mieluimmin entsymaattisesti Η2θ2:η tai formaldehydin muodostumisen perusteella. Erikoisen edullisesti tapahtuu H2(>2:n määrääminen fotometrisesti, nimittäin peroksidaasikatalysoidun värireaktion perusteella, jossa 2,4,6-tribromi-3-hydroksi-bentsoehappo liittyy oksidoivasti 4-aminoantipyriiniin. Peroksidaasivaikutus on tällöin 0,05-20 U/ml, etupäässä 0,2-10 U/ml, erikoisesti 0,5-5 U/ml. Tribromihydroksibent-soehappoa lisätään konsentraatioissa 1-25 mmooolia/1, etupäässä 2-20 mmoolia/1, erikoisesti 5-10 mmoolia/1. 4-amino-antipyriinin konsentraatiot 0,1-2 mmoolia/1, etupäässä 0,2-1,5 mmoolia/1, erikoisesti 0,5-1 mmoolia/1 ovat osoittautuneet edullisiksi. Mutta myös muita tunnettuja systeemejä Η2θ2:η tai vaihtoehtoisesti formaldehydin osoittamiseen voidaan käyttää.
Koska 1-metyylihydantoinaasi muuttaa nukleosiditrifosfaatin stökiometrisesti nukleosididifosfaatiksi, voi kreatiniinin määrittäminen perustua 1-metyylihydantoiinista muodostuneen reaktiotuotteen määrittämisen asemesta myös samanaikaisesti
II
17 82071 muodostuneen nukleosididifosfaatin määrittämiseen, siis erikoisesti ADP:n määrittämiseen, ADP:n määrittämiseen soveltuvia menetelmiä tunnetaan, erikoisesti teoksesta H.U. Bergmeyer; "Methoden der enzymatischen Analyse" 3. painos, 1974, sivut 2128 ff ja 2178 gg. Yksityiskohtainen selostus on sen vuoksi tässä kohdassa tarpeeton.
Keksinnön kohteena on vielä reagenssi, jonka avulla voidaan määrittää kreatiniini, ja se on tunnettu siitä, että se sisältää 1-metyy1ihydantoinaasia.
Tämä reagenssi sisältää etupäässä kreatiniinideiminaasia, 1-metyylihydantoinaasia, ATP:tä tai GTP:tä, kaksiarvoisia metalli-ioneja, N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasia, sarkosiinioksidaasia tai sarkosiinidehydrogenaasia ja pus-kuriainetta pH 7,0-9,0.
Reagenssi sisältää vielä systeemin, jonka avulla voidaan määrittää H2O2 tai formaldehydi, tai väriä synnyttävän elektroniakseptorisysteemin, kuten esimerkiksi tetratsolium-suolaa, jonka avulla voidaan suoraan tehdä näkyväksi sarko-siinidehydrogeenaasireaktio. Nämä systeemit ovat tunnettuja esimerkiksi teoksesta H.U. Bergmeyer, "Methoden der enzymatischen Analyse", Verlag Chemie, Weinheim.
Mainittujen aineosien ohella voi reaktioseos sisältää vielä apuaineita kuten säilytysaineita, esimerkiksi natriumatsidia, pintajännitystä alentavia aineita ja lipaaseja, jotka kirkastavat triglyseridien samentaman näytteen, samoin kuin kalium-ferrosyanidia ja askorbaattioksidaasia bilirubiinin tai askor-biinihapon näytteessä aiheuttamien Η2θ2:η osoittamisreaktioin häiriöiden poistamiseen. Kun reaktioseosta käytetään ainoastaan 1-metyylihydantoiinin määräämiseen, voidaan kreatiniini-imino-hydrolaasi jättää myös kokonaan pois.
Keksinnön mukaiset reagenssit sisältävät kaksiarvoisina metalli-ioneina tarkoituksenmukaisesti erikoisesti magnesium- tai mangaani-ioneja, kuten on jo edellä esitetty.
ib 82071
Mainitut reaktiokomponentit voivat myös olla huokoisiin kantaja-aineisiin impregnoituina, jolloin on mahdollista määrittää kreatiniini tai 1-metyylihydantoiini kvantitatiivisesti tai kvalitatiivisesti ns. testiliuskojen avulla.
Eräässä erikoisen hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa sisältää keksinnön mukainen reagenssi kreatiniinideiminaasia, 1-metyylihydantoinaasia, ATP:tä tai GTP:tä, kaksiarvoisia metalli-ioneja, erikoisesti Mg++_ tai Mn++-ioneja, systeemin ADP:n tai GDP:n määrittämistä varten, ja puskuriainetta pH 7,0-9,0.
Puskuriaineena pidetään tässä tapauksessa parhaana kalium-fosfaattipuskuria; puskuriaineen, kreatiniinideiminaasin, 1-metyylihydantoinaasin, ATP:n Mg++- tai Mn++-ionien sekä mahdollisen ammoniumsuolan konsentraatiot ovat analogisia edellä ilmoitettujen kanssa.
ADP;n osoittaminen tapahtuu etupäässä yhdistetyn pyruvaatti-kinaasi/laktaatti-dehydrogenaasireaktion avulla fosfoenoli-pyruvaatin ja NADH:n läsnäollessa, jolloin muodostunut ADP-määrä saadaan selville NADH;n käytön perusteella laktaatti-dehydrogenaasireaktiossa fotometrisesti. Tämä menetelmä on asiantuntijan tiedossa, eikä sitä ole tarpeen selostaa lähemmin tässä kohdassa.
Kun reaktioseosta käytetään ainoastaan 1-metyylihydantoiinin määrittämiseen, voidaan kreatiniini-iminohydrolaasi jättää myös pois.
Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä edelleen piirustusten kanssa. Näistä esittää: kuvio 1 graafisesti esimerkin 5 mukaan saatujen ekstinktio-arvojen riippuvaisuutta käytetystä 1-metyylihydantoiini-määrästä, kuvio 2 kuten kuvio 1 käytettäessä N-karbamoyylisarkosiinia 1-metyylihydantoiinin asemesta esimerkissä 6, kuvio 3 graafisesti esimerkkien 5 ja 6 tulosten vertailua, is 82071 kuvio 4 kuvion 1 mukaan esimerkin 7 suhteen, kuvio 5 graafisesti ADP:n muodostumista stökiometrisesti, kuvio 6 kuvion 1 mukaan esimerkin 8 suhteen.
Seuraavia lyhennyksiä ja synonyymejä tullaan käyttämään seuraavassa: AS: ammoniumsulfaatti
Karb-fosfaatti: karbamyylifosfaatti CSH-aasi: N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasi
Kreatiniinideiminaasi: kreatiini-iminohydrolaasi 1-metyylihydantoinaasi, NMH-aasi: 1-metyylihydantoiinihydro- laasi, N-metyylihydantoiini, NMH: 1-metyylihydantoiini OD = optinen tiheys PABS: para-aminobentsoehappo PP^: pyrofosfaatti TES: 2-{[tris-(hydroksimetyyli)metyyli]}-aminoetaanisul-fonihappo TRIS: tris-(hydroksimetyyli)aminometaani.
Esimerkki 1 A) Lähtökannan viljely
Arthrobacter species DSM 2563 (eristetty ruokamullasta) pidetään 3 viikkoa päälle ympättynä vinoagarissa, jonka koostumus on seuraava: litraa kohti: 7 g Na2HP04 1 2H20-3 g KH2P04 0,5 g NaCl- 0,5 g MgS04 1 7H20—10 g N-metyylihydantoiinia (NHM) 1 ml hivenaineliuosta 1 -0,1 ml hivenaineliuosta 2 -
«1· JU JL
1 ml vitamiiniliuosta -20 g agaria pH 7,5
Hivenaineliuos 1 100 mg MnCl2 1 4H20-100 mg FeCl3 1 6H20- 100 mg CaCl2 1 2H20 liuotetaan 100 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja steriloidaan.
1 ml tätä liuosta 1 litraan ravinneliuosta.
20 8 2 0 71 «j* ’fc
Hivenaineliuos 2 ; 1 mg CuCl2 * 2H2O-1 mg Z11CI2-1 mg (ΝΗ4>2Μοθ4- 1 mg C0CI2 * 6H2O liuotetaan 1000 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja steriloidaan.
1 ml tätä liuosta 1 litraan ravinneliuosta.
*** Vitamiiniliuos 0,1 mg biotiinia-0,1 mg pyridoksolia-0,1 mg pyrid- oksamiinia * HC1-0,1 mg PABS-1,0 mg riboflavii- nia-1,0 mg nikotiiniamidia-1,0 mg foolihappoa- 10,0 mg tiamiinia * HC1 liuotetaan 100 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja suodatetaan steriilisti.
1 ml tätä liuosta 1 litraan ravinneliuosta.
10 ml nestemäistä, edellä selostettua ravinneliuosta siir-rostetaan yhdellä silmukalla täynnä vinosta agarista saatua ainetta ja ravistellaan 100 ml:n Erlenmeyer-astiassa 20-24 h 28°C:ssa. Tämän jälkeen siirretään tämä 10 ml (= 1. esi-viljely) 1000 ml:aan samaa ravinneliuosta ja viljellään edelleen lämpötilassa 28°C 24 h ajan aina 200 ml/1 1 litran Erlenmeyerissa (OD 1:20 = 0,425). Tämä toinen esiviljely siirrostetaan edelleen 1-prosenttiseksi 100 litraan samaa ravinneliuosta käymislaitteeseen ja annetaan käydä 18 h 28°C:ssa.
Kasvun lopussa (myöhäinen Log-vaihe) tapahtuu maksimaalinen entsyymisynteesi. Edellä selostetusta seoksesta saadaan tuotokseksi 1180 g kosteaa massaa, jossa on 100 U/l NMH-aasia (1-metyylihydantoinaasi) ja 160 U/l CSH-aasia (N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasi).
B) Entsyymin eristäminen ja puhdistaminen 280 g:sta kosteaa Arthrobacter-massaa (= 20 litraa viljelyä) eristettiin 500 U NMH-aasia:
II
2i 82071
Vaihe Volyymi Yksi- U/mg pro- Tuotos- imi) köitä teiinia %
Lysotsyymiliuotus 20- prosenttisessa gly- 1400 1600 0,06 100 seriinissä
Polyetyleeni-imiinisaos- tuksella saatu sakka 430 1586 - 99
Ammoniumsulfaatti- fraktiointi=sakka 120 1181 0,40 73
Yläpuolella olevan osan kuumennus 50°C:een 90 934 0,67 58 pH-arvolla 8
Fenyylisefaroosikro- matografia-eluaatti 60 830 1,20 52 haihdutuksen jälkeen DEAE-Sephacel-kroma- tografia 8 553 1,40 35
Molekyyliseulafrak- tiointi 10 492 2,20 30,7
Sephacryl S 200
Lopullinen valmiste:
Datat: 22,3 U/ml 10,5 mg/ml 2,1 U/mg proteiinia 50 % glyseriiniä 50 mmoolia/1 TRIS, pH = 8,3.
Aktiivisuuden määrittäminen tapahtui seuraavasti: 1. Värireagenssi**
Komponentit Konsentraatio TES * KOH-puskuri (pH 7,8) 162 mmoolia/1 4-aminoantipyriini 0,81 mmoolia/1 2,4,6-tribromi-3-hydroksibentsoe- 8,1 mmoolia/1 happo
MgCl2 8,1 mmoolia/1 ATP 4,3 mmoolia/1 (NH4)2S04 32 mmoolia/1 CSH-aasi 1,1 U/ml
Sarkosiinioksidaasi 6,5 U/ml
Peroksidaasi 2,7 U/ml 22 82071 2. 1-metyylihydantoiiniliuos 10 mmoolia/1 3. Määrityksen suorittaminen
Aallonpituus 546 nm; T = 25 °C; kerroksen paksuus 1 cm; testivolyymi 2,03 ml; muodostuneen väriaineen ekstink-tiokerroin = 13 cm^/pmooli.
Pipetoidaan maljaan Värireagenssi (1) 1,88 ml Näyte 0,05 ml
Sekoitetaan, odotetaan kunnes näytteessä mahdollisesti oleva sarkosiini ja N-karbamoyylisarkosiini ovat reagoineet loppuun asti, sen jälkeen aloitetaan.
1-metyylihydantoiinin (2) kanssa 0,10 ml sekoitetaan, seurataan ekstinktion nousua ja luetaan ΔE/min lineaarisesta alueesta.
*(Näytemateriaali): raakauutteen määrittämistä varten käytetään huippukieroksilla sentrifugoidun, ultraäänen avulla liuotetun mikro-organismin päällä oleva osa 20-prosenttises-sa glyseriinissä, joka sisältää Tris * HC1 (pH 8,0), 20 mmoolia/1 sekä 0,1 % Triton X-100.
** Tutkimusta varten kohdan 2 mukaan, sivu 9, 5b mukaan, sivu 11 sekä 4, 5 ja 6 mukaan, sivut 11 ja 12, muutettiin vuorottain vastaavia aineen konsentraatioita tai lisättyjen aineiden laatua.
4. Laskeminen ΔΕ/min x 2,03 (tarvittaessa x U/ml näyte = -------------- näytteen laimennus) 13 x 0,1
Huomautus: ΔΕ/min ei saa olla suurempi kuin 0,06; muussa tapauksessa on näyte laimennettava. Lag-vaihe on 5 min.
Il 23 82071
Esimerkki 2
Moraxella spec. DSM 2562 (eristetty navettanäytteestä) pidettiin vinossa agarissa kuten esimerkissä 1 on selostettu ja viljeltiin samassa ravinneliuoksessa kuin Arthrobacter species.
Esiviljely 20 ml NMH-ravinnetta/100 ml Erlenmeyer-astia siirrostetaan vinoagarista ja ravistellaan 21 h ajan 28°C:ssa (OD 1:20 = 0,430).
Pääviljely 8 ml tätä esiviljelyä siirrostetaan edelleen 400 ml:aan NMH-ravinnetta/2 litran Erlenmeyer-astiassa ja viljellään 43 h ravistellen 28°C:ssa. Ultraäänen avulla liuotetuista biomassoista mitattiin seuraavat vaikutukset:
Viljelyn kesto- OD 1:20 NMH-aasi aika tunneissa U/l 24 0,415 41 28 0,495 72 39 0,730 57
Esimerkki 3
Brevibacterium species, DSM 2843:a (eristetty navettanäyt-teestä, joka on erilainen kuin esimerkissä 2) viljellään kuten Moraxellaa esimerkissä 2.
Esiviljely 21 h/28eC, OD 1:20 * 0,690 Pääviljely
Viljelyn kesto- OD 1:20 NMH-aasi aika tunneissa U/l 15 0,440 26 24 0,550 80 39 0,670 59 43 0,750 46 24 8 2 0 71
Esimerkki 4
Micrococcus spec. DSM 2565:tä (eristetty multanäytteestä) viljellään kuten Moraxellaa esimerkissä 2.
Esiviljely 21 h/28°C, OD 1:20 = 0,620.
Pääviljely
Viljelyn kesto- OD 1:20 NMH-aasi aika tunneissa U/l 24 0,690 53 27,5 0,800 83
Esimerkki 5 1. Entsymaattinen väritesti, jonka avulla voidaan määrittää 1-metyylihydantoiini (1-metyylihydantoinaasi/N-karba-moyyli-sarkosiini-amidohydrolaasi/sarkosiinioksidaasireaktio peroksidaasi/4-aminoantipyriini/2,4,6-tribromi-5-hydroksi-bentsoehappo-väri-indikaattorisysteemin kanssa) 1.1 Reagenssi:
Komponentit Konsentraatio reagenssissa TES · KOH (pH 7,8) 100 mmoolia/1
MgCl2 5 mmoolia/1 ATP 5 mmoolia/1 NH4CI 10 mmoolia/1 4-aminoantipyriini 0,5 mmoolia/1 2,4,6-tribromi-3- hydroksibentsoehappo 5 mmoolia/1 1-metyylihydantoinaasi 0,15 U/ml N-karbamoyylisarkosii-niamidohydrolaasi 2 U/ml
Sarkosiinioksidaasi 5 U/ml
Peroksidaasi 2 U/ml 1.2 Määrityksen suorittaminen:
Aallonpituus: 546 nm
Kerroksen paksuus: 10 mm, lämpötila: 25eC
11 25 82071
Mittaus reagenssin verrokkiarvoon vertaamalla. Pipetoidaan maljaan: Näytteen Reagenssin ver-arvo (P) rokkiarvo (RL)
Reagenssi 1.1 2,00 ml 2,00 ml Näyte ) 0,10 ml -
Vesi - 0,10 ml
Sekoitetaan, inkuboidaan 10 min ja tämän jälkeen mitataan P:n ekstinktio RL:n suhteen (ΔΕ).
*) 1-metyylihydantoiinin vesiliuoksia, 87,7-1754 pmoolia/l.
ΔΕ:η riippuvaisuus näytteessä kulloinkin olevasta 1-metyyli-hydantoiinin konsentraatiosta on esitetty kuviossa 1.
Esimerkki 6 N-karbamoyylisarkosiinin määrittäminen reagenssilla 1.1 esimerkistä 5.
Määritys suoritetaan analogisesti kohdan 1.2 kanssa esimerkistä 5, paitsi että 1-metyylihydantoiinin vesiliuosten asemesta testiin otetaan vastaavat näytteet, joissa on ekvimolaariset konsentraatiot (87,7-1754 pmoolia/l) N-kar-bamoyylisarkosiinia.
Mitattujen ekstinktioarvojen riippuvuus N-karbamoyylisarkosiinin konsentraatiosta on esitetty kuviossa 2.
Esimerkin 5 ja esimerkin 6 mukaan mitattujen ekstinktioarvojen vertailu osoittaa, että 1-metyylihydantoiini- ja N-karbamoyyli-sarkosiininäytteistä, joissa on ekvimolaariset konsentraatiot, mitataan identtiset värisignaalikorkeudet (kuvio 3).
Esimerkki 7
Entsymaattinen UV-testi 1-metyylihydantoiinin määrittämisek- 26 82071 si (1-metyylihydantoinaasi/pyruvaattikinaasi/laktaatti-dehydrogenaasireaktio) 7.1 Reagenssit 7.1.1 Reagenssi I:
Komponentit Konsentraatio reagenssissa
Kaliumfosfaatti (pH 8,0) 75 mmoolia/1 NADH 0,25 mmoolia/1 ATP 1,30 mmoolia/1
Fosfoenolipyruvaatti 0,42 mmoolia/1
MgCl2 2,00 mmoolia/1
Pyruvaattikinaasi 4 U/ml
Laktaattidehydrogenaasi 10 U/ml 7.1.2 1-metyylihydantoinaasi (15 U/ml 50-prosent-tisessa glyseriinissä pH 8,0)
7.2 Määritysten suorittaminen Aallonpituus: 365 nm Kerroksen paksuus: 10 mm Lämpötila: 25°C
Mittaus reaktioseoksen verrokkiarvoon vertaamalla Maljoihin pipetoidaan: Näyte Reaktioseos-verrokkiarvo (P) (RL)
Reagenssi I 1,00 ml 1,00 ml Näyte ) 0,20 ml -
Vesi - 0,20 ml
Inkuboidaan 4 min, mitataan lähtöekstinktiot näytteestä (Ei p) ja RL:stä (E^ RL). Sitten sekoitetaan joukkoon: NMH-aasia 0,01 ml 0,01 ml 5-10 min kuluttua mitataan ekstinktiot P:stä (E2 p) ja
φ JL JL
RL:stä <E2>RL). E - (E1>p - E2p) - (E1(RL - E2>rl) ) **) 1-metyylihydantoiinin vesiliuokset, 8,7-877 pmoolia/l
II
27 8 2071 \ ' Huomautus: jos 1-metyylihydantoinaasivalmiste sisältää vielä merkittäviä määriä ATP-aasia tai NADH-oksidaasia, mikä näkyy selvänä NADH-vähenemisenä reaktioseosverrokkiar-voliuoksessa 1-metyylihydantoinaasiliuoksen lisäämisen jälkeen, on %2,Ρ Ja E2,RL luettava kulloinkin tarkasti yhtä pitkien aikojen kuluttua NMH-aasin lisäämisestä (esimerkiksi 6.00 min kuluttua).
Riippuvaisuus mitattujen ekstinktioerojen (ΔΕ) ja kulloinkin näytteessä olevien 1-metyylihydantoiinin konsentraatioiden välillä on esitetty kuviossa 4; kun lasketaan 1-metyylihydantoiinin hydrolyysissä syntynyt ADP-määrä NADH:n molaa-risen ekstinktiokertoimen avulla aallonpituudella 365 nm, saadaan selville, että ATP:n kulutuksen tai ADP:n muodostumisen ja 1-metyylihydantoiinin hydrolyysin stökiometrinen suhde on 1:1 (kuvio 5).
Esimerkki 8
Entsymaattinen väritesti kreatiniinin määrittämiseksi 8.1 Reagenssi:
Vastaa reagenssia 1.1 esimerkissä 5, johon lisätään krea-tiniini-iminohydrolaasia, 2 U/ml (loppukonsentraatio).
8.2 Määrityksen suorittaminen:
Vastaa kohtaa 1.2 esimerkissä 5, mutta näytteenä käytetään kreatiniinin vesiliuoksia, 87,7 - 1754 pmoolia/l ja inku-bointiaika P:lle ja RL:lie pitenee 20 minuuttiin.
AE:n riippuvuus kreatiniinin konsentraatiosta näytteessä on esitetty kuviossa 6.
Jos reagenssista 8.1 jätetään pois kreatiniini-imino-hydrolaasi, ei havaita mitään värireaktiota, samoin jos testiliuoksessa 8.2 käytetään näytteenä kreatiniiniliuosten asemesta kreatiiniliuosta, 884 pmoolia/l.
Claims (22)
- 28 82071 1. 1-metyylihydantoinaasi, tunnettu siitä, että se hydrolysoi 1-metyylihydantoiinin nukleosiditrifosfaatin ja moniarvoisen metalli-ionin läsnäollessa, että sen molekyylipaino on noin 125 000 (SDS-gradienttigeelielektroforeesi), pH-optimi pH-arvossa 7,8 Km 1-metyylihydantoiinin suhteen 0,02 mmoolia/1 ja Km ATP:n suhteen 0,8 mmoolia/1, ja että sitä voidaan saada viljelemällä Arthrobacter spec. DSM 2563, DSM 2564, Moraxella spec. DSM 2562, Micrococcus spec. DSM 2565 tai Brevibacterium spec. DSM 2843, ja eristämällä entsyymi.
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen 1-metyylihydantoinaasi, tunnettu siitä, että mikro-organismi liuotetaan, entsyymi seostetaan polyetyleeni-imiinin kanssa ja mahdollisesti rikastetaan ammoniumsulfaattifraktioinnin, kuumennusvaiheen ja kromatografian avulla.
- 3. Användning av enzymet enligt patentkrav 1 för bestämn-ing av kratinin, kännetecknad av att kreatinin överförs med kreatinin-deiminas E.C. 3.5.4.21 i 1-metylhydantoin, det sistnämda hydrolyseras med 1-metylhydantoinas i närvaro av nukleosidtrifosfat och en flervärd metalljon och a) den av 1-metylhydantoin bildade hydrolysprodukten bestäms med N-karbamoylsarkosinamidohydrolas under bildning av sarkosin och sarkosin pävisas med sarkosinoxidas eller sarkosindehydrogenas eller b) det samtidigt bildade nuklesiddifosfatet bestäms.3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen entsyymin käyttäminen kreatiniinin määrittämiseen, tunnettu siitä, että muutetaan kreatiniini kreatiniinideiminaasin E.C. 3.5.4.21 avulla 1-metyylihydantoiiniksi, hydrolysoidaan jälkimmäinen 1-me-tyylihydantoinaasin kanssa nukleosiditrifosfaatin ja moniarvoisen metalli-ionin läsnäollessa ja a) määritetään 1-metyylihydantoiinista muodostunut hydro-lyysituote N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasin avulla, jolloin muodostuu sarkosiinia ja osoitetaan sarkosiini sarkosiinioksidaasin tai sarkosiinidehydrogenaasin avulla, tai b) määritetään samanaikaisesti muodostunut nukleosididifos-faatti.
- 4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att bestämningen genomföres i en buffrad vattenhaltig lösning vid ett pH-värde av mellan 7,0 och 9,0.4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tapahtuu puskuroidussa vesiliuoksessa pH-arvolla 7,0-9,0.
- 5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att man omsätter vid ett pH-värde av mellan 7,3 och 8,5.5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktion annetaan tapahtua pH-arvolla 7,3-8,5. 29 8 2 0 71
- 6. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-5, kännetecknat av att omsättningen genomföres vid en buffertkoncen-tration av mellan 10 och 500 mmol/1. 32 820716. Jonkin patenttivaatimuksista 3-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan puskurikonsen-traatiolla 10-50 mmoolia/1.
- 7. Förfarande enligt patentkrav 6, kännetecknat av att man justerar buffertkoncentrationen tili mellan 50 och 200 mmol/1.7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskurikonsentraatio säädetään välille 50-200 mmoolia/1.
- 8. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-7, kännetecknat av att man säsom nukleosidtrifosfat använder ATP.8. Patenttivaatimusten 3-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään nukleosiditrifosfaattina ATP:tä.
- 9. Förfarande enligt patentkrav 8, kännetecknat av att man använder 0,05-50 mmol/1 ATP.9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 0,05-50 mmoolia/1 ATP:tä.
- 10. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-9, kännetecknat av att man använder säsom flervärda metalljoner magnesium- eller manganjoner.10. Jonkin patenttivaatimuksista 3-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään moniarvoisina metalli-ioneina magnesium- tai mangaani-ioneja.
- 11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av att man tillsätter magnesiumjonerna i form av magnesiumklorid, magnesiumsulfat eller magnesiumaspartat.11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että magnesiumionit lisätään magnesiumkloridin, magnesiumsulfaatin tai magnesiumaspartaatin muodossa.
- 12. Förfarande enligt patentkrav 10 eller 11, kännetecknat av att man tillsätter 0,1-50 mmol/1 av tvävärda metalljoner.12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 0,1-50 mmoolia/1 kaksiarvoisia metalli-ioneja.
- 13. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-12, kännetecknat av att man tillsätter 0,01-10 U/ml 1-metylhydan-toinas.13. Jokin patenttivaatimuksista 3-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 0,01-10 U/ml 1-metyylihydan-toinaasia.
- 14. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-13, kännetecknat av att man tillsätter 0,1-100 mmol/1 av ett ammo-niumsalt.14. Jonkin patenttivaatimuksista 3-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 0,1-100 mmoolia/1 jotakin ammoniumsuolaa.
- 15. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-14, kännetecknat av att man tillsätter 0,1-20 U/ml av N-kar-bamoylsarkosin-amidohydrolas.15. Jonkin patenttivaatimuksista 3-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 0,1-20 U/ml N-karbamoyyli-sarkosiiniamidohydrolaasia. 30 82071
- 16. Förfarande enligt patentkrav 15, kännetecknat av att man tillsätter 1-20 U/ml sarkosinoxidas eller sarkosin-dehydrogenas. Il 33 8207116. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 1-20 U/ml sarkosiinioksidaasia tai sarkosiinidehydrogenaasia.
- 17. Reagens för bestämning av kreatinin, kännetecknat av att det Innehäller 1-metylhydantoinas enllgt patentkrav 1.17. Reagenssi, jonka avulla voidaan määrätä kreatiniini, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista 1-metyylihydantoinaasia.
- 18. Reagens enllgt patentkrav 17, kännetecknat av att det innehäller kreatinindeiminas, 1-metylhydantoinas, ATP eller GTP, tvävärda metalljoner, N-karbamoylsarkosinamldohydrolas, sarkosinoxidas eller sarkoslndehydrogenas och buffert-substans av pH 7,0-9,0.18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää kreatiniinideiminaasia, 1-metyylihydantoinaasia, ATP:tä tai GTP:tä, kaksiarvoisia metalli-ioneja, N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasia, sarkosiinioksidaasia tai sarkosiinidehydrogenaasia ja puskuriainetta, pH 7,0-9,0.
- 19. Reagens enllgt patentkrav 18, kännetecknat av att det innehäller ett system för bestämning av H2O2 eller av form-aldehyd eller ett färggivande elektronacceptorsystem för direkt äskädliggörande av sarkosindehydrogenasreaktionen.19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää systeemin Η2θ2:η tai formaldehydin määräämistä varten tai värilliseksi tulevan elektronien akseptorisysteemin sarkosiinidehydrogenaasireaktion tekemiseksi suoraan näkyväksi.
- 20. Reagens enllgt patentkrav 17, kännetecknat av att det innehäller kreatinindeiminas, 1-metylhydantoinas, ATP eller GTP, tvävärda metalljoner, ett system för bestämning av ADP eller GDP och buffertsubstans av pH 7,0-9,0.20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää kreatiniinideiminaasia, 1-metyylihydantoinaasia, ATP:tä tai GTP:tä, kaksiarvoisia metalli-ioneja, systeemin, jonka avulla voidaan määrätä ADP tai GDP ja puskuriainetta pH 7,0-9,0.
- 21. Reagens enllgt patentkrav 18-20, kännetecknat av att det innehäller Mg- eller Mn-joner.21. Patenttivaatimusten 18-20 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää Mg- tai Mn-ioneja.22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että ADP:n määrittämistä varten oleva systeemi muodostuu pyruvaattikinaasista, laktaattidehydrogenaasista, fosfonoenolipyruvaatista ja NADH:sta. 31 82071 1. 1-metylhydantoinas, kännetecknat av att det hydroly-serar 1-metylhydantoin i närvaro av ett nukleosidtrifos-fat och en flervärd metalljon, att det uppvisar en molekyl-vlkt av 125 000 (SDS-gradlentgelelektrofores), ett pH-op-timum av pH 7,8, ett Km gentemot 1-metalhydantoln av 0,02 mmol/1 och ett Km gentemot ATP av 0,8 mmol/1, och är er-hällbar genom odling av Arthrobacter art DSM 2563, DSM 2564, Moraxella art DSM 2562, Micrococcus art DSM 2565 eller Brevibacterlum art DSM 2843 och isolering av enzymet. 2. 1-metylhydantoinas enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man uppsluter mikroorganismen, fäller ut enzymet med polyetylenimln och eventuellt anrlkar detta genom ammo-niumsulfatfraktionering, upphettnlngssteg och kromatografi.
- 22. Reagens enllgt patentkrav 20, kännetecknat av att sys-temet för bestämning av ADP bestär av pyruvatkinas, laktat-dehydrogenas, fosfonoenolpyruvat och NADH.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843406770 DE3406770A1 (de) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | Nucleosidtriphosphat-abhaengige 1-methylhydantoinase und ihre verwendung |
| DE3406770 | 1984-02-24 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI850732A0 FI850732A0 (fi) | 1985-02-22 |
| FI850732L FI850732L (fi) | 1985-08-25 |
| FI82071B true FI82071B (fi) | 1990-09-28 |
| FI82071C FI82071C (fi) | 1991-01-10 |
Family
ID=6228749
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI850732A FI82071C (fi) | 1984-02-24 | 1985-02-22 | Av nukleosiditrifosfat beroende 1-metylhydantoinas och dess anvaendning. |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4816393A (fi) |
| EP (1) | EP0154269B1 (fi) |
| JP (1) | JPS60203190A (fi) |
| AT (1) | ATE50789T1 (fi) |
| AU (1) | AU555270B2 (fi) |
| CA (1) | CA1261288A (fi) |
| CZ (1) | CZ277729B6 (fi) |
| DD (1) | DD241919A5 (fi) |
| DE (2) | DE3406770A1 (fi) |
| DK (1) | DK77185A (fi) |
| ES (1) | ES540654A0 (fi) |
| FI (1) | FI82071C (fi) |
| HU (1) | HU194303B (fi) |
| IE (1) | IE58353B1 (fi) |
| ZA (1) | ZA851352B (fi) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4021571A1 (de) * | 1990-07-06 | 1992-01-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | N-methylhydantoinase, kloniert |
| DE4029844A1 (de) * | 1990-09-20 | 1992-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Carbamoylsarcosinhydrolase, kloniert |
| DE4103220A1 (de) * | 1991-02-02 | 1992-08-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur stabilisierung von 1-methylhydantoinase, verwendung einer stabilisierten 1-methylhydantoinase zur bestimmung eines analyten, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignete mittel |
| US6524837B1 (en) | 1999-03-29 | 2003-02-25 | California Institute Of Technology | Hydantoinase variants with improved properties and their use for the production of amino acids |
| JP2005523726A (ja) * | 2002-05-01 | 2005-08-11 | ポリマー テクノロジー システムズ インコーポレーテッド | 体液中のクレアチニン濃度測定用テストストリップ、及び測定方法 |
| US7002670B2 (en) * | 2002-06-12 | 2006-02-21 | Baxter International Inc. | Optical sensor and method for measuring concentration of a chemical constituent using its intrinsic optical absorbance |
| WO2009014722A1 (en) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | Richmond Chemical Corporation | A method for detecting biofuel producing microbes |
| CN108882895A (zh) * | 2016-03-31 | 2018-11-23 | 聚合物工艺系统有限公司 | 用于肌酸酐电化学测定的系统和方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122255C3 (de) * | 1971-05-05 | 1987-01-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Creatinin |
| US4087329A (en) * | 1975-08-28 | 1978-05-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Creatinine desimidase and its method of production |
| US4134793A (en) * | 1975-08-28 | 1979-01-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Creatinine desimidase in the quantitative determination of creatinine |
| US4215197A (en) * | 1978-08-04 | 1980-07-29 | Miles Laboratories, Inc. | Test means and method for creatinine determination |
| IT1137075B (it) * | 1981-05-28 | 1986-09-03 | Chemical Lab S R L | Procedimento per la determinazione della creattinina (creatininio) in liquidi biologici, e reattivo per la sua attuazione |
| DE3248145A1 (de) * | 1982-12-27 | 1984-06-28 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagenz zur bestimmung von n-carbamoylsarcosin und hierfuer geeignetes neues enzym |
-
1984
- 1984-02-24 DE DE19843406770 patent/DE3406770A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-02-11 IE IE33185A patent/IE58353B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-02-19 AU AU38954/85A patent/AU555270B2/en not_active Ceased
- 1985-02-20 DK DK77185A patent/DK77185A/da unknown
- 1985-02-20 CZ CS851216A patent/CZ277729B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1985-02-22 EP EP85101988A patent/EP0154269B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-22 CA CA000474964A patent/CA1261288A/en not_active Expired
- 1985-02-22 ZA ZA851352A patent/ZA851352B/xx unknown
- 1985-02-22 AT AT85101988T patent/ATE50789T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-02-22 ES ES540654A patent/ES540654A0/es active Granted
- 1985-02-22 DD DD85273484A patent/DD241919A5/de unknown
- 1985-02-22 DE DE8585101988T patent/DE3576358D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-22 HU HU85676A patent/HU194303B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-02-22 FI FI850732A patent/FI82071C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-02-25 JP JP60034717A patent/JPS60203190A/ja active Granted
- 1985-02-25 US US06/704,712 patent/US4816393A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60203190A (ja) | 1985-10-14 |
| CA1261288A (en) | 1989-09-26 |
| IE850331L (en) | 1985-08-24 |
| CS121685A3 (en) | 1992-06-17 |
| FI82071C (fi) | 1991-01-10 |
| ZA851352B (en) | 1985-10-30 |
| ES8602114A1 (es) | 1985-12-01 |
| ES540654A0 (es) | 1985-12-01 |
| DD241919A5 (de) | 1987-01-07 |
| EP0154269B1 (de) | 1990-03-07 |
| FI850732A0 (fi) | 1985-02-22 |
| DE3576358D1 (de) | 1990-04-12 |
| CZ277729B6 (en) | 1993-04-14 |
| HUT37456A (en) | 1985-12-28 |
| FI850732L (fi) | 1985-08-25 |
| US4816393A (en) | 1989-03-28 |
| JPH0373276B2 (fi) | 1991-11-21 |
| AU555270B2 (en) | 1986-09-18 |
| DK77185D0 (da) | 1985-02-20 |
| DE3406770A1 (de) | 1985-08-29 |
| ATE50789T1 (de) | 1990-03-15 |
| EP0154269A2 (de) | 1985-09-11 |
| DK77185A (da) | 1985-08-25 |
| EP0154269A3 (en) | 1987-04-22 |
| IE58353B1 (en) | 1993-09-08 |
| HU194303B (en) | 1988-01-28 |
| AU3895485A (en) | 1985-08-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0646846A (ja) | フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法 | |
| JP2923222B2 (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法 | |
| US4614714A (en) | Use of novel L-glutamic acid oxidase | |
| Tsuru et al. | Creatinine decomposing enzymes in Pseudomonas putida | |
| EP0116307B1 (en) | Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase | |
| FI82071B (fi) | Av nukleosiditrifosfat beroende 1-metylhydantoinas och dess anvaendning. | |
| SE445928B (sv) | Odling av aerococcus viridans ifo-12219 eller ifo-12317 och isolering av pyruvatoxidas derur | |
| KINOSHITA et al. | A fluorophotometric determination of serum creatinine and creatine using a creatinineamidohydrolase-creatineamidinohydrolase-sarcosine oxidase-peroxidase system and diacetyldichlorofluorescin | |
| WO1997024456A1 (fr) | Procede de dosage d'echantillon vital | |
| US5821061A (en) | Method and reagent for detecting a ligand in a sample | |
| US4596772A (en) | Reagent for assaying cholinesterase | |
| KR890004091B1 (ko) | 과산화 수소를 형성하는 살코신 산화효소 및 그 제법 | |
| JP2003169696A (ja) | 生体成分の測定方法およびそれに用いる試薬組成物 | |
| EP0029765B1 (en) | Creatinine iminohydrolase free from urease activity, methods of preparation and use, and assay compositions and analytical elements containing same | |
| JPH11243950A (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法 | |
| EP0097949B1 (en) | L-glutamic acid oxidase, its production, and its use | |
| EP0266905B1 (en) | Reagents for assay of gamma-glutamyl-transpeptidase | |
| EP0101653A2 (en) | Leucine dehydrogenase and a process for production thereof | |
| JP2001252095A (ja) | 微量成分の測定法及びそれに用いる組成物 | |
| Haarasilta et al. | Pyruvate holo-and apocarboxylase content of biotin-deficient baker's yeast and the characteristics of the holoenzyme formation in permeabilized cells | |
| JPH04252200A (ja) | Ｎａｄｈキナーゼを用いる高感度定量法 | |
| JPH0272873A (ja) | ヌクレオシドオキシダーゼ及びこれを利用した分析法 | |
| WO1998042863A1 (en) | Highly sensitive method for assaying chiro-inositol and compositions for the assay | |
| Killick | A continuous coupled polarographic assay for trehalase | |
| JP2004105057A (ja) | Ｌ−システインの測定方法及び測定用試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |