FI82071B

FI82071B - Av nukleosiditrifosfat beroende 1-metylhydantoinas och dess anvaendning.

Info

Publication number: FI82071B
Application number: FI850732A
Authority: FI
Inventors: Joachim Siedel; Joachim Ziegenhorn; Rolf Deeg; Albert Roeder; Hans Moellering; Helmgard Gauhl
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1984-02-24
Filing date: 1985-02-22
Publication date: 1990-09-28
Also published as: EP0154269A3; CA1261288A; ATE50789T1; FI82071C; HUT37456A; AU3895485A; JPH0373276B2; JPS60203190A; EP0154269B1; DK77185D0; CZ277729B6; ZA851352B; DE3406770A1; DE3576358D1; DD241919A5; DK77185A; IE58353B1; FI850732L; HU194303B; CS121685A3

Description

1 82071

Nukleosiditrifosfaatista riippuvainen 1-metyylihydantoinaasi ja sen käyttäminen

Analyyttisessä kemiassa, erikoisesti kliinis-kemiallisessa diagnostiikassa, on jatkuvasti olemassa yhä kasvava entsy-maattisten menetelmien tarve, joilla voidaan analyyttisesti määrätä luonnon aineita, biologisia aineenvaihduntatuotteita ja niistä johdettuja yhdisteitä. Syinä ovat entsyymi-katalyyttisten reaktioiden erittäin korkea spesifisyys, niiden nopea ja tarkasti määrätty kulku ilman häviötä lievissä reaktio-olosuhteissa - tavallisesti välillä 15-40°C vettä sisältävässä väliaineessa neutraalilla pH-alueella -sekä mahdollisuus suorittaa ne yksinkertaisella ja herkällä tavalla, erikoisesti fotometrisillä mittausmenetelmillä joko suoraan tai niihin kytkettyjen indikaattoreiden avulla kvantitatiivisesti.

1-metyylihydantoiinia varten ei tähän asti ole tunnettu mitään entsyymikatalyyttistä reaktiomenetelmää, niin että tämä yhdiste olisi voitu analysoida entsymaattisesti joko suoraan tai epäsuoraan. Tällainen menetelmä olisi kuitenkin erikoisen arvokas mm. kreatiniinin määräystä varten, joka on kliinis-diagnostisesti tärkeä seerumin ja uriinin osa, joka voidaan muuttaa erään jo kauan tunnetun entsyymireak-tion mukaan kreatiniini-iminohydrolaasin avulla (E.C. 3.5.4.21) 1-metyylihydantoiiniksi ja ammoniakiksi.

Kreatiinin entsymaattista määritystä varten seerumista tai uriinista tunnetaan tosin jo useita menetelmiä (Wahlefeld, A.W., G. Holz ja H.U. Bergmeyer, teoksessa H.U. Bergmeyer; Methoden der enzymatischen Analyse, 3.painos, osa II, Verlag Chemie, Weinheim 1974, sivut 1834-1838; Fossati, P., L. Prenzipe, ja G. Berti, Clinical Chemistry (1983) 29, 1494-1496; Tanganelli, E., L. Prenzipe, D. Bassi, S. Cambiagni, ja E. Murador, Clinical Chemistry (1983) 28, 1461-1464); niillä kaikilla on kuitenkin se varjopuoli, että reaktiosek-venssin väliasteina on joko kreatiini (Wahlefeld et ai.; 2 82071

Fossati et ai.) tai ammoniakki (Tanganelli et ai.) eli aineita, joita on jo alunperin vaihtelevia ja kreatiniiniin nähden selvästi suurempia konsentraatioita analysoitavassa seerumi- tai uriininäytteessä. Tässä tarvitaan siis krea-tiniinin määrityksessä kahden erillisen tai peräkkäin seu-raavan reaktioliuoksen erotusmittauksia: ensimmäisessä määritetään ensiksi vapaa kreatiini tai ammoniakki, ja toisessa lisätään joko kreatiniiniamidohydrolaasia (E.C. 3.5.2.10) tai kreatiniini-iminohydrolaasia (- kreatiniini-deiminaasi), jolloin saadaan vielä kreatiniinistä muodostuneen kreatiinin tai ammoniakin osuus selville ("näyte/ver-rokkimenetelmä" tai "E1/E2-menetelmä"). Tällaiset menetelmät ovat käsinsuorituksen kannalta suhteellisen hankalia ja niitä on myös vain rajoitetusti mahdollista sovittaa automaattisiin analyysisysteemeihin, erikoisesti silloin, jos reaktioiden täydelliseen kulkuun tarvitaan pitempiä inku-bointiaikoja. Tosin voidaan periaatteessa sopivien reaktio-olosuhteiden valinnan ansiosta suorittaa kreatiniinimääritys tunnettujen entsymaattisten menetelmien avulla verrokkiar-vojen mittauksia kiertäen ns. kineettisessä "fixed-time"-menetelmässä; tämä tosin vaatii mittausajankohtien hyvin tarkkaa noudattamista määrätyissä lämpötilaolosuhteissa, mikä onnistuu riittävän tarkasti vain analyysiautomaateissa ja tekee käsinsuorituksen siten lähes mahdottomaksi.

Päinvastoin kuin kreatiini tai ammoniakki ei 1-metyylihydan-toiini ("N-metyylihydantoiini", "NMH") ole mikään seerumin tai uriinin luonnollinen aineosa; kreatiniinin määritystapa, jossa on välituotteena 1-metyylihydantoiini, tarjoaa siten sen huomattavan edun, että verrokkiarvomittaus voidaan jättää pois sillä edellytyksellä, että itse 1-metyylihydan-toiinin entsymaattista reaktiota voidaan käyttää indikaat-torireaktiona, tai että mahdollisesti sen perään liitetyt indikaattorireaktiot eivät tapahdu seerumissa tai uriinissa merkitsevissä konsentraatioissa luonnostaan esiintyvien aineiden kanssa.

Il 3 82071

Sen vuoksi on olemassa aineen ja menetelmän tarve, joiden avulla voidaan entsymaattisesti analysoida 1-metyylihydan-toiini siten, että sen kvantitatiivinen, etupäässä fotometrinen määritys on mahdollista ilman muiden seerumin tai uriinin aineosien samanaikaista lukemista.

Tehtävä voidaan ratkaista keksinnön mukaisesti erään uuden, tähän asti tuntemattoman entsyymin keksimisen kautta, joka pystyy hydrolysoimaan 1-metyylihydantoiinin kun mukana on ainakin jotakin nukleosiditrifosfaattia, etupäässä adeno-siini-5’-trifosfaattia (ATP), moniarvoista metalli-ionia, etupäässä Mg2+ tai Mn3+, samoin kuin joissakin tapauksissa ammoniumsuolaa.

Kirjallisuudessa on tosin selostettu jo hydantoiinien erilaisia entsymaattisia hydrolyysejä "hydantoinaasin" avulla (hydropyrimidiini-hydrolaasi, E.C.3.5.2.2. ) eri lähteistä, mutta vaikutus on voitu tähän asti osoittaa vain ei-sub-stituoidun hydantoiinin suhteen (Wallac, D.P. ja S. Griso-lia, J. Biol. Chem. (1957) 226, 227-188) tai 5-asennossa substituoitujen hydantoiinien suhteen (DAS 26 31 048; DAS 28 11 303; Olivieri, R., E. Fascetti, L. Angelini ja L. Degen, Biotechnology and Bioengineering (1981) 23, 2173-2183). Sen lisäksi ei millään kyseisistä entsyymeistä ole osoitettu kofaktori-riippuvaisuutta; Wallacin et ai. selostama entsyymi ei myöskään tarvitse hydantoiinin hydrolyy-sissä esimerkiksi kaksiarvoisten metalli-ionien lisäystä, Olivierin et ai. tutkimuksessa jopa osoitetaan, että hydantoiinin hydrolyysissä tapahtuu selvää ehkäisyä ammonium-kloridin läsnäollessa (0,1 moolia/1), kun taas keksinnön mukaisen entsyymin vaikutuksessa tapahtuu jopa selvästi nousua ammoniumsuolojen lisäyksen ansiosta.

Keksinnön mukaisen entsyymin esiintyminen, eristäminen ja ominaisuudet samoin kuin käyttäminen 1-metyylihydantoiinin tai kreatiniinin määrittämiseen on selostettu lähemmin seu-raavassa. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

4 82071

Keksinnön mukainen uusi entsyymi 1-metyylihydantoinaasi näyttää esiintyvän levinneenä mikro-organismeihin. Siten on voitu löytää sitä lajien Brevibacterium, Moraxella, Micrococcus ja Arthrobacter mikro-organismeista. Esimerkkinä näiden lajien kannoista, joissa todettiin keksinnön mukaista entsyymiä sellainen pitoisuus, että kannatti sitä valmistaa, ovat Arthrobacter spec. DSM 2563, DSM 2564, Moraxella spec. DSM 2562, Micrococcus spec. DSM 2565 tai Brevibacterium spec. DSM 2843. Seuraavassa on esitetty mikro-organismikan-tojen kuvaus:

Moraxella-kanta BMTU 2193 / DSM 2562 gram-reaktio : liikkuvuus : itiönmuodostus : katalaasi : oksidaasi : + aerobi kasvu : + anaerobi kasvu : OF-O / OF-F : -/- denitrifikaatio : nitraatti->nitriitti : + substraatin käyttö sitraatti : + glukoosi : malaatti : + fruktoosi : + mannoosi : + maltoosi : L-seriini : kasvu 37°C:ssa : 41°C:ssa : kasvumuoto : kokkisauva leveys pm : 0,8-1,0 pituus pm : 1,0-2,0

II

5 82071

Arthrobacter-kanta BMTU 2194 / DSM 2563 gram-reaktio : + liikkuvuus : + itiönmuodostus : katalaasi : + oksidaasi : aerobi kasvu : + anaerobi kasvu : (+) OF-O / OF-F : +/- denitrifikaatio : nitraatti->nitriitti : + ureaasi : kasvu lämpötilassa 20-25-30°C : erittäin hyvä 37 °C : hyvä 42°C : heikko sitraatinkäyttö : + tryptofaanidesaminaasi (TDA) : + ei haponmuodostusta seuraavilla : glukoosi,mannoo- si,inositoli,sorbitoli,ramnoosi,sakkaroosi,meli-bioosi,amygdaliini,arabinoosi kasvumuoto : pleomorfisia sauvoja pesäkkeenkuvaus standardil/Merck : kellert.,sileäreunainen,kiil tävä, kupera veriagar : kuten yllä (hemolyysi neg.) brolasiiniagar : kuten yllä

MacConkey-agar : ei kasvua

Pseudom. selektiivinen agar : ei kasvua

Arthrobacter-kanta BMTU 2195 / DSM 2564 gram-reaktio : + itiönmuodostus : katalaasi : + 6 82071 oksidaasi : aerobi kasvu : + anaerobi kasvu : kasvu lämpötilassa 4°C : heikko 20-25°C : erittäin hyvä 30°C : hyvä 37/42 °C : OF-O / OF-F : +/- nitraatti->nitriitti : ureaasi : sitraatinkäyttö : + tryptofaanidesaminaasi (TDA) : haponmuodostus glukoosi : mannoosi : inositoli : sorbitoli : ramnoosi : (+) sakkaroosi : melibioosi : amygdaliini : arabinoosi : kasvumuoto : pleomorfisiä sauvoja pes äkkeenkuvaus standardiI/Merck : kellert.,sileäreunainen,kiil tävä ,kupera veriagar : kuten yllä (hemolyysi neg.) brolasiiniagar : vihertävä, muuten kuten yllä

MacConkey-agar : ei kasvua

Pseudom. selektiivinen agar : ei kasvua

Micrococcus-kanta BMTU 2255 / DSM 2565 gram-reaktio : + 7 82071 liikkuvuus : itiönmuodostus : katalaasi : + oksidaasi : aerobi kasvu : + anaerobi kasvu : denitrifikaatio : nitraattianitriitti : kaseiinihydrolyysi : + kasvu lämpötilassa 10°C : heikko 28°C : hyvä 42 eC : 5 ja 10% NaCl : + haponmuodostus sakkaroosi,glukoosi,fruktoosi : + maltoosi,ksyloosi,mannoosi,inositoli,sorboosi : heik ko + laktoosi,trehaloosi,arabinoosi : -kasvumuoto : kokkeja pesäkkeenkuvaus standardiI/Merck : valk.,sileäreunainen,kiil tävä,kupera veriagar : kuten yllä brolasiiniagar : likaisen kelt. muuten kuten yllä

MacConkey-agar : ei kasvua

Pseudom. selektiivinen agar : ei kasvua

Brevibacterium-kanta BMTU 2253 / DSM 2843 gram-reaktio : + liikkuvuus : - (10°C:ssa +) itiönmuodostus : katalaasi : + oksidaasi : aerobi kasvu : + 8 82071 anaerobi kasvu : OF-O / OF-F : -/+ denitrifikaatio : nitraatti->nitriitti : + ureaasi : + arginiini-dehydr. : kaseiinihydrolyysi : kasvu lämpötilassa 10 ja 28°C : + 42°C : 5 ja 10% NaCl : + haponmuodostus negatiivinen: glukoosi,mannoosi,inosi-toli,sorbitoli,ramnoosi,sakkaroosi,melibioosi, amygdaliini,arabinoosi kasvumuoto : kokkisauvoja pesäkkeenkuvaus standardil/Merck : kellert.,sileäreunainen,kiil tävä, kupera veriagar : kuten yllä (ei hemolyysiä) brolasiiniagar : kuten yllä

MacConkey-agar : ei kasvua

Pseudom. selektiivinen agar : ei kasvua

Keksinnön mukaista entsyymiä valmistetaan sen vuoksi mieluimmin siten, että viljellään edellä esitettyjä mikro-organismeja ja eristetään entsyymi biomassasta ja/tai viljelyn väliaineesta.

Uudesta entsyymistä todettiin seuraavat ominaisuudet: 1. Moolipaino a) SDS-gradienttigeelielektroforeesi Mr = 125000

2. pH-optimi: pH = 7,8 aktiivisuus %:ssa, 25°C

ti 9 82071 pH 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 TES-puskuri 5 76 100 100 95 69 150 mmol/1 TRIS-puskuri 1 26 60 52 38 19 150 mmol/1 3. Spesifisyys:

Suhteellinen aktiivisuus %:ssa (ADP/pyruvaattikinaasi/ laktaatti-dehydrogenaasi) a) substraatti (kulloinkin 0,1 mmoolia/1 loppu-konsentraatio reaktioseoksessa)

Substraatin spesifisyyden määräämiseksi meneteltiin seuraavasti: 1. Perusreagenssi

Komponentit Konsentraatio

Kaliumfosfaatti (pH 8,0) 75 mmoolia/1 NADH 0,25 mmoolia/1 ATP 1,30 mmoolia/1

Fosfoenolipyruvaatti 0,42 mmoolia/1

MgCl2 2,00 mmoolia/1

Pyruvaattikinaasi 4 U/ml

Laktaattidehydrogenaasi 10 U/ml 2. 1-metyylihydantoinaasl (15 U/ml 50-prosenttisessa glyseriinissä, 20 mmoolia/1 Tris * HCl-puskuri, pH 8,0) 3. Hydantoiiniliuokset

Hydantoiinin (1-metyylihydantoiini, hydantoiini, 5-metyylihydantoiini, sekä 5,5-dimetyylihydantoiini) konsentraatio: kulloinkin 0,6 mmoolia/1 H2O

4. Testien suorittaminen

Aallonpituus 365 nm; T * 25eC, d = 1 cm; testivolyymi 1,21 ml 10 82071

Astioihin pipetoidaan Näyte Reaktioseoksen verrokkiarvo

Perusreagenssi (1) 1,00 ml 1,00 ml Näyte (3) 0,20 ml

Vesi 0,20 ml sekoitetaan, sen jälkeen lisätään 1-metyylihydan- 0,01 ml 0,01 ml toinaasia (2) 2 min kuluttua 1-metyylihydantoinaasin lisäämisestä mitataan näytteen (ΔΕρ) ja reaktioseoksen verrokkiarvon ( AErl) erotus, ΔΕ. ΔΕ = ΔΕρ - AErl 5. Lasketaan suhteellinen reaktionopeus eri hydantoii- neista saaduista ΛE/min-arvoista 1-metyylihydantoiinin ΔΕ/min-arvoon verrattuna, joka = 100 %

Saatiin seuraavat tulokset: % 1-metyylihydantoiini H 100 /"\

0 = c c = O

N--CHo ch3 5-metyylihydantoiini H 14 0 0 = C C = 0

/H

HN-C

ch3

Hydantoiini H 13 0./N. o HN-CH2

II

11 82071 t 5,5-dimetyylihydantoiini H 0 /% 0 - C C « 0 /ch3

HN-C

ch3 b) Nukleotidit

Suhteellinen aktiivisuus %:ssa (ATP = 100) määrät täessä karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasi + sarkosiinioksidaasin suhteen

Nukleotidi (4 mmoolia/1) % ATP 100 ADP 1 AMP 0 GTP 7 CTP 1,5 TTP o UTP o PPi 0

Karb-fosfaatti 0

Na-tripolyfosfaatti 0

Na-heksametafosfaatti 0 4. Riippuvuus metalli-ioneista

Suhteellinen aktiivisuus %:ssa (5 mmoolia/1 magnesium-kloridia = 100) mmoolia/1 aine % 0 MgCl2 17 1 83 5 -"- 100 10 -"- 98 5 MnCl2 60 5 ZnCl2 24 5. Aktivoivat aineet i2 82071

Erikoisesti NH+4. Suhteellinen aktiivisuus'%:ssa (30 mmoolia/1 AS = 100) aktivoiva aine mmoolia/1 %

Ei (NH4)2S04:ää 0 44 30 100 10 95 NH4C1 30 91 NH4-asetaatti 30 98

Li2S04 30 40

Na2S04 30 39 K2S04 30 59

NaCl 30 41

NaHC03 30 40 6. Inhiboivat aineet Erikoisesti EDTA, NaF.

NaF: 1 x 10"2 moolia/1 inhiboi 100-prosenttisesti EDTAn aiheuttama suhteellinen inhibointi mmoolia/1 aktiivisuus 0 100 5 100 10 42 50 2 * Kun mukana reaktioseoksessa on 7,5 mM Mg++ 7. Michaelis-vakiot Κπ,ΑΤΡ (TES 0,15 moolia/1, pH 7,8; sarkosiinin suhteen); 0,8 mmoolia/1 Km 1-metyylihydantoiini (0,15 moolia/1 TES, pH 7,8 ADP:n suhteen); 0,02 mmoolia/1 8. Stabiilisuus a) Stabiilisuus lämpötilan suhteen: 50-prosenttisessa glyseriinissä; 20 mmoolia/1 TRIS, pH 8,0 (2 U/ml) 30 min jäännösaktiivisuus %:ssa 25°C 100 50°C 94 60°C 70 70°C 0 i3 82071 b) pH-stabiilisuus 20-prosenttisessa glyseriinissä, 10 nunoolla/1 TRIS, 0,2 U/ml, +4*C, 3 päivää pimeässä säilytettynä (lähtöarvo = 100 %) pH jäännösaktiivisuus %:ssa 6,3 8 6,5 20 7.0 61 8.0 72 9.0 86

Keksinnön mukaista entsyymiä voidaan saada mikro-organismeista, jotka sisältävät sellaisen määrän 1-metyylihydan-toinaasia, että valmistus on kannattavaa, ennestään tunnettujen menetelmien mukaan, joiden avulla puhdistetaan entsyymejä. Tarkoituksenmukaisesti mikro-organismi liuotetaan ja entsyymi saostetaan lisäämällä polyetyleeni-imiiniä.

Täten saadaan entsyymivalmistetta, joka on käyttökelpoista analyyttisiin tarkoituksiin. Mikäli halutaan lisäpuhdistus, käytetään edullisesti ammoniumsulfaattifraktiointia, kuumen-nusvaihetta samoin kuin kromatografiaa.

Mikro-organismien liuottaminen voi tapahtua tunnettujen kemiallisten tai fysikaalisten menetelmien mukaan, esimerkiksi kemiallisesti lysotsyymin avulla tai fysikaalisesti ultraäänen, korkeapainesuspensiossa hajottamisen avulla ym. Liuottamismenetelmä ei ole ratkaiseva. Erikoisen hyvin soveltuvat kuitenkin menetelmät, joissa solumembraanit liukenevat suureksi osaksi.

Kuumennusvaihe tapahtuu tarkoituksenmukaisesti 50°C:ssa pH-alueella, jossa entsyymin stabiilisuus on hyvä.

Kromatografista puhdistamista varten ovat osoittautuneet erikoisen hyviksi fenyylisefaroosi ja DEAE-ryhmiä sisältävät heikosti emäksiset anioninvaihtajat. Eräässä suositussa puhdistusmenetelmässä tapahtuu lysotsyymiliuotus 20-prosenttisessa glyseriinissä, saostus lisäämällä liukenevaa poly- i4 82071 etyleeni-imiiniä, sakan talteenotto, sen ammoniumsulfaat-tifraktiointi, käsittelyvaihe kuumuuden avulla 50eC:ssa ja pH-arvolla 8, kromatografia fenyylisefaroosin päältä, jota seuraa kromatografia DEAE-Sephacel® :n päältä ja tämän jälkeen molekyyliseulafraktiointi, tarkoituksenmukaisesti Sephacyl® S 200:n päältä. Tällä tavoin saadaan puhdasta entsyymivalmistetta, jonka ominaisaktiivisuus on 2,1 U/mg proteiinia, josta entsyymin ominaisuudet voidaan määrätä.

Entsyymin valmistamista varten viljellään mikro-organismeja tarkoituksenmukaisesti ravinneliuoksessa, joka sisältää 1-metyylihydantoiinia hiili- ja typpilähteenä vitamiinien ja hivenaiheiden ohella.

Keksinnön kohteena on vielä 1-metyylihydantoinaasin käyttäminen kreatiniinin määrittämiseen vettä sisältävästä puskuroidusta liuoksesta muuttamalla kreatiniini kreatiniini-deiminaasin E.C. 3.5.4.21 avulla 1-metyylihydantoiiniksi, hydrolysoimalla jälkimmäinen 1-metyylihydantoinaasin kanssa niin, että läsnä on ylimäärä nukleosiditrifosfaattia ja jotakin moniarvoista metalli-ionia, ja a) 1-metyylihydantoiinista muodostuneen hydrolyysituotteen määrittäminen N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasin avulla, jolloin muodostuu sarkosiinia, ja sarkosiinin osoittaminen sarkosiinioksidaasin tai sarkosiinidehydrogenaasin avulla, tai b) samanaikaisesti muodostuneen nukleosididifosfaatin määrittäminen.

Syntyvä hydrolyysituote käyttäytyy reaktionopeuden ja mit-taussignaalikorkeuden suhteen jälkeen liitetyssä indikaatto-rireaktiossa N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasin kanssa käytännöllisesti katsoen aivan kuin N-karbamoyylisarkosii-ni, joka on lisätty reaktioseokseen 1-metyylihydantoiinin asemesta määrältään ekvimolaarisena. (ks. myös kuvioita 2 ja 3).

is 82071

Puskuroidun vesiliuoksen pH-arvo on tarkoituksenmukaisesti välillä 7,0 - 9,0, etupäässä välillä pH 7,3, ja pH 8,5, erikoisesti välillä pH 7,5 ja pH 8,2. pH-arvon säätelemiseen soveltuvat aineet, jotka ovat mainitulla pH-alueella riittävän puskurikapasiteetin omaavia, kuten esimerkiksi fosfaatti, Tris, trietanoliamiini ja TES. Parhaana pidetään erikoisesti TES-puskuria. Puskurin konsentraatio on tavallisesti välillä 10-500 mmoolia/1, etupäässä välillä 50-200 mmoolia/1, aivan erikoisen edullisesti välillä 75-125 mmoolia/1.

Nukleosiditrifosfaattina tulevat kyseeseen ATP tai GTP; etupäässä ATP. Konsentraatioalue on tarkoituksenmukaisesti 0,05-50 mmoolia/1, etupäässä välillä 0,5-20 mmoolia/1, erikoisen edullisesti välillä 1-10 mmoolia/1.

Moniarvoisina metalli-ioneina käytetään etupäässä kaksiarvoisia metalli-ioneja; erikoisen suosittuja ovat Mg- ja Mn-ionit, erikoisesti Mg-ionit vesiliukoisten suolojensa kuten MgCl2 tai MgS04 muodossa tai myös Mg-aspartaattina. Metalli-ionien konsentraatio on tällöin tarkoituksenmukaisesti välillä 0,1-50 mmoolia/1, etupäässä välillä 0,5-20 mmoolia/1, erikoisen edullisesti välillä 1-10 mmoolia/1.

Millilitraa kohti reaktioseosta käytetään tavallisesti 0,01-10 U 1-metyylihydantoinaasia, erikoisesti 0,05-2 U, edullisimmin 0,1-1 U.

1-metyylihydantoinaasin vaikutuksen vahvistamisessa ovat ammoniumsuolalisäykset osoittautuneet edullisiksi; konsent-raatiot ovat tällöin edullisesti välillä 0,1-100 mmoolia/1, etupäässä 1-30 mmoolia/1, erikoisesti välillä 5-10 mmoolia/1.

Kreatiniini-iminohydrolaasia käytetään tarkoituksenmukaisesti 0,1-20 U/ml, etupäässä 0,05-15 U/ml, erikoisesti 1-10 U/ml.

N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasia varten ovat vaiku-tuskonsentraatiot 0,1-20 U/ml edullisia, etupäässä 0,5-10 i6 82071 U/ml, erikoisesti 1-5 U/ml. Tässä suhteessa ovat tavallisesti DE-A-3248145:n ilmoittamat määrät analogisia.

Sarkosiinioksidaasille on edullinen alue 1-20 U/ml, etupäässä 2-10 U/ml, erikoisesti 4-8 U/ml. Sama pätee vaihtoehtoisesti käytettävän sarkosiinidehydrogenaasin suhteen.

Sarkosiinin osoittaminen sarkosiinioksidaasin tai sarkosiinidehydrogenaasin kanssa on tunnettua ja tässä ilmoitetut ja asiantuntijoiden tietämät olosuhteet soveltuvat myös keksinnön piirissä. Sama pätee muodostuneen nukleosididifos-faatin, siis ADP:n tai GDP:n osoittamiseen. Myös tässä voidaan käyttää tunnettuja menetelmiä tai reagensseja.

Muodostuneen sarkosiinin osoittamisen suhteen pidetään parhaana tunnetun sarkosiinioksidaasireaktion käyttämistä. Sarkosiinin hapettamisen kulkua voidaan seurata joko elekt-rokemiallisesti C>2:n kulutuksen perusteella tai H2C>2:n muodostumisen perusteella reaktioväliaineessa, tai mieluimmin entsymaattisesti Η2θ2:η tai formaldehydin muodostumisen perusteella. Erikoisen edullisesti tapahtuu H2(>2:n määrääminen fotometrisesti, nimittäin peroksidaasikatalysoidun värireaktion perusteella, jossa 2,4,6-tribromi-3-hydroksi-bentsoehappo liittyy oksidoivasti 4-aminoantipyriiniin. Peroksidaasivaikutus on tällöin 0,05-20 U/ml, etupäässä 0,2-10 U/ml, erikoisesti 0,5-5 U/ml. Tribromihydroksibent-soehappoa lisätään konsentraatioissa 1-25 mmooolia/1, etupäässä 2-20 mmoolia/1, erikoisesti 5-10 mmoolia/1. 4-amino-antipyriinin konsentraatiot 0,1-2 mmoolia/1, etupäässä 0,2-1,5 mmoolia/1, erikoisesti 0,5-1 mmoolia/1 ovat osoittautuneet edullisiksi. Mutta myös muita tunnettuja systeemejä Η2θ2:η tai vaihtoehtoisesti formaldehydin osoittamiseen voidaan käyttää.

Koska 1-metyylihydantoinaasi muuttaa nukleosiditrifosfaatin stökiometrisesti nukleosididifosfaatiksi, voi kreatiniinin määrittäminen perustua 1-metyylihydantoiinista muodostuneen reaktiotuotteen määrittämisen asemesta myös samanaikaisesti

II

17 82071 muodostuneen nukleosididifosfaatin määrittämiseen, siis erikoisesti ADP:n määrittämiseen, ADP:n määrittämiseen soveltuvia menetelmiä tunnetaan, erikoisesti teoksesta H.U. Bergmeyer; "Methoden der enzymatischen Analyse" 3. painos, 1974, sivut 2128 ff ja 2178 gg. Yksityiskohtainen selostus on sen vuoksi tässä kohdassa tarpeeton.

Keksinnön kohteena on vielä reagenssi, jonka avulla voidaan määrittää kreatiniini, ja se on tunnettu siitä, että se sisältää 1-metyy1ihydantoinaasia.

Tämä reagenssi sisältää etupäässä kreatiniinideiminaasia, 1-metyylihydantoinaasia, ATP:tä tai GTP:tä, kaksiarvoisia metalli-ioneja, N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasia, sarkosiinioksidaasia tai sarkosiinidehydrogenaasia ja pus-kuriainetta pH 7,0-9,0.

Reagenssi sisältää vielä systeemin, jonka avulla voidaan määrittää H2O2 tai formaldehydi, tai väriä synnyttävän elektroniakseptorisysteemin, kuten esimerkiksi tetratsolium-suolaa, jonka avulla voidaan suoraan tehdä näkyväksi sarko-siinidehydrogeenaasireaktio. Nämä systeemit ovat tunnettuja esimerkiksi teoksesta H.U. Bergmeyer, "Methoden der enzymatischen Analyse", Verlag Chemie, Weinheim.

Mainittujen aineosien ohella voi reaktioseos sisältää vielä apuaineita kuten säilytysaineita, esimerkiksi natriumatsidia, pintajännitystä alentavia aineita ja lipaaseja, jotka kirkastavat triglyseridien samentaman näytteen, samoin kuin kalium-ferrosyanidia ja askorbaattioksidaasia bilirubiinin tai askor-biinihapon näytteessä aiheuttamien Η2θ2:η osoittamisreaktioin häiriöiden poistamiseen. Kun reaktioseosta käytetään ainoastaan 1-metyylihydantoiinin määräämiseen, voidaan kreatiniini-imino-hydrolaasi jättää myös kokonaan pois.

Keksinnön mukaiset reagenssit sisältävät kaksiarvoisina metalli-ioneina tarkoituksenmukaisesti erikoisesti magnesium- tai mangaani-ioneja, kuten on jo edellä esitetty.

ib 82071

Mainitut reaktiokomponentit voivat myös olla huokoisiin kantaja-aineisiin impregnoituina, jolloin on mahdollista määrittää kreatiniini tai 1-metyylihydantoiini kvantitatiivisesti tai kvalitatiivisesti ns. testiliuskojen avulla.

Eräässä erikoisen hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa sisältää keksinnön mukainen reagenssi kreatiniinideiminaasia, 1-metyylihydantoinaasia, ATP:tä tai GTP:tä, kaksiarvoisia metalli-ioneja, erikoisesti Mg++_ tai Mn++-ioneja, systeemin ADP:n tai GDP:n määrittämistä varten, ja puskuriainetta pH 7,0-9,0.

Puskuriaineena pidetään tässä tapauksessa parhaana kalium-fosfaattipuskuria; puskuriaineen, kreatiniinideiminaasin, 1-metyylihydantoinaasin, ATP:n Mg++- tai Mn++-ionien sekä mahdollisen ammoniumsuolan konsentraatiot ovat analogisia edellä ilmoitettujen kanssa.

ADP;n osoittaminen tapahtuu etupäässä yhdistetyn pyruvaatti-kinaasi/laktaatti-dehydrogenaasireaktion avulla fosfoenoli-pyruvaatin ja NADH:n läsnäollessa, jolloin muodostunut ADP-määrä saadaan selville NADH;n käytön perusteella laktaatti-dehydrogenaasireaktiossa fotometrisesti. Tämä menetelmä on asiantuntijan tiedossa, eikä sitä ole tarpeen selostaa lähemmin tässä kohdassa.

Kun reaktioseosta käytetään ainoastaan 1-metyylihydantoiinin määrittämiseen, voidaan kreatiniini-iminohydrolaasi jättää myös pois.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä edelleen piirustusten kanssa. Näistä esittää: kuvio 1 graafisesti esimerkin 5 mukaan saatujen ekstinktio-arvojen riippuvaisuutta käytetystä 1-metyylihydantoiini-määrästä, kuvio 2 kuten kuvio 1 käytettäessä N-karbamoyylisarkosiinia 1-metyylihydantoiinin asemesta esimerkissä 6, kuvio 3 graafisesti esimerkkien 5 ja 6 tulosten vertailua, is 82071 kuvio 4 kuvion 1 mukaan esimerkin 7 suhteen, kuvio 5 graafisesti ADP:n muodostumista stökiometrisesti, kuvio 6 kuvion 1 mukaan esimerkin 8 suhteen.

Seuraavia lyhennyksiä ja synonyymejä tullaan käyttämään seuraavassa: AS: ammoniumsulfaatti

Karb-fosfaatti: karbamyylifosfaatti CSH-aasi: N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasi

Kreatiniinideiminaasi: kreatiini-iminohydrolaasi 1-metyylihydantoinaasi, NMH-aasi: 1-metyylihydantoiinihydro- laasi, N-metyylihydantoiini, NMH: 1-metyylihydantoiini OD = optinen tiheys PABS: para-aminobentsoehappo PP^: pyrofosfaatti TES: 2-{[tris-(hydroksimetyyli)metyyli]}-aminoetaanisul-fonihappo TRIS: tris-(hydroksimetyyli)aminometaani.

Esimerkki 1 A) Lähtökannan viljely

Arthrobacter species DSM 2563 (eristetty ruokamullasta) pidetään 3 viikkoa päälle ympättynä vinoagarissa, jonka koostumus on seuraava: litraa kohti: 7 g Na2HP04 1 2H20-3 g KH2P04 0,5 g NaCl- 0,5 g MgS04 1 7H20—10 g N-metyylihydantoiinia (NHM) 1 ml hivenaineliuosta 1 -0,1 ml hivenaineliuosta 2 -

«1· JU JL

1 ml vitamiiniliuosta -20 g agaria pH 7,5

Hivenaineliuos 1 100 mg MnCl2 1 4H20-100 mg FeCl3 1 6H20- 100 mg CaCl2 1 2H20 liuotetaan 100 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja steriloidaan.

1 ml tätä liuosta 1 litraan ravinneliuosta.

20 8 2 0 71 «j* ’fc

Hivenaineliuos 2 ; 1 mg CuCl2 * 2H2O-1 mg Z11CI2-1 mg (ΝΗ4>2Μοθ4- 1 mg C0CI2 * 6H2O liuotetaan 1000 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja steriloidaan.

1 ml tätä liuosta 1 litraan ravinneliuosta.

*** Vitamiiniliuos 0,1 mg biotiinia-0,1 mg pyridoksolia-0,1 mg pyrid- oksamiinia * HC1-0,1 mg PABS-1,0 mg riboflavii- nia-1,0 mg nikotiiniamidia-1,0 mg foolihappoa- 10,0 mg tiamiinia * HC1 liuotetaan 100 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja suodatetaan steriilisti.

1 ml tätä liuosta 1 litraan ravinneliuosta.

10 ml nestemäistä, edellä selostettua ravinneliuosta siir-rostetaan yhdellä silmukalla täynnä vinosta agarista saatua ainetta ja ravistellaan 100 ml:n Erlenmeyer-astiassa 20-24 h 28°C:ssa. Tämän jälkeen siirretään tämä 10 ml (= 1. esi-viljely) 1000 ml:aan samaa ravinneliuosta ja viljellään edelleen lämpötilassa 28°C 24 h ajan aina 200 ml/1 1 litran Erlenmeyerissa (OD 1:20 = 0,425). Tämä toinen esiviljely siirrostetaan edelleen 1-prosenttiseksi 100 litraan samaa ravinneliuosta käymislaitteeseen ja annetaan käydä 18 h 28°C:ssa.

Kasvun lopussa (myöhäinen Log-vaihe) tapahtuu maksimaalinen entsyymisynteesi. Edellä selostetusta seoksesta saadaan tuotokseksi 1180 g kosteaa massaa, jossa on 100 U/l NMH-aasia (1-metyylihydantoinaasi) ja 160 U/l CSH-aasia (N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasi).

B) Entsyymin eristäminen ja puhdistaminen 280 g:sta kosteaa Arthrobacter-massaa (= 20 litraa viljelyä) eristettiin 500 U NMH-aasia:

II

2i 82071

Vaihe Volyymi Yksi- U/mg pro- Tuotos- imi) köitä teiinia %

Lysotsyymiliuotus 20- prosenttisessa gly- 1400 1600 0,06 100 seriinissä

Polyetyleeni-imiinisaos- tuksella saatu sakka 430 1586 - 99

Ammoniumsulfaatti- fraktiointi=sakka 120 1181 0,40 73

Yläpuolella olevan osan kuumennus 50°C:een 90 934 0,67 58 pH-arvolla 8

Fenyylisefaroosikro- matografia-eluaatti 60 830 1,20 52 haihdutuksen jälkeen DEAE-Sephacel-kroma- tografia 8 553 1,40 35

Molekyyliseulafrak- tiointi 10 492 2,20 30,7

Sephacryl S 200

Lopullinen valmiste:

Datat: 22,3 U/ml 10,5 mg/ml 2,1 U/mg proteiinia 50 % glyseriiniä 50 mmoolia/1 TRIS, pH = 8,3.

Aktiivisuuden määrittäminen tapahtui seuraavasti: 1. Värireagenssi**

Komponentit Konsentraatio TES * KOH-puskuri (pH 7,8) 162 mmoolia/1 4-aminoantipyriini 0,81 mmoolia/1 2,4,6-tribromi-3-hydroksibentsoe- 8,1 mmoolia/1 happo

MgCl2 8,1 mmoolia/1 ATP 4,3 mmoolia/1 (NH4)2S04 32 mmoolia/1 CSH-aasi 1,1 U/ml

Sarkosiinioksidaasi 6,5 U/ml

Peroksidaasi 2,7 U/ml 22 82071 2. 1-metyylihydantoiiniliuos 10 mmoolia/1 3. Määrityksen suorittaminen

Aallonpituus 546 nm; T = 25 °C; kerroksen paksuus 1 cm; testivolyymi 2,03 ml; muodostuneen väriaineen ekstink-tiokerroin = 13 cm^/pmooli.

Pipetoidaan maljaan Värireagenssi (1) 1,88 ml Näyte 0,05 ml

Sekoitetaan, odotetaan kunnes näytteessä mahdollisesti oleva sarkosiini ja N-karbamoyylisarkosiini ovat reagoineet loppuun asti, sen jälkeen aloitetaan.

1-metyylihydantoiinin (2) kanssa 0,10 ml sekoitetaan, seurataan ekstinktion nousua ja luetaan ΔE/min lineaarisesta alueesta.

*(Näytemateriaali): raakauutteen määrittämistä varten käytetään huippukieroksilla sentrifugoidun, ultraäänen avulla liuotetun mikro-organismin päällä oleva osa 20-prosenttises-sa glyseriinissä, joka sisältää Tris * HC1 (pH 8,0), 20 mmoolia/1 sekä 0,1 % Triton X-100.

** Tutkimusta varten kohdan 2 mukaan, sivu 9, 5b mukaan, sivu 11 sekä 4, 5 ja 6 mukaan, sivut 11 ja 12, muutettiin vuorottain vastaavia aineen konsentraatioita tai lisättyjen aineiden laatua.

4. Laskeminen ΔΕ/min x 2,03 (tarvittaessa x U/ml näyte = -------------- näytteen laimennus) 13 x 0,1

Huomautus: ΔΕ/min ei saa olla suurempi kuin 0,06; muussa tapauksessa on näyte laimennettava. Lag-vaihe on 5 min.

Il 23 82071

Esimerkki 2

Moraxella spec. DSM 2562 (eristetty navettanäytteestä) pidettiin vinossa agarissa kuten esimerkissä 1 on selostettu ja viljeltiin samassa ravinneliuoksessa kuin Arthrobacter species.

Esiviljely 20 ml NMH-ravinnetta/100 ml Erlenmeyer-astia siirrostetaan vinoagarista ja ravistellaan 21 h ajan 28°C:ssa (OD 1:20 = 0,430).

Pääviljely 8 ml tätä esiviljelyä siirrostetaan edelleen 400 ml:aan NMH-ravinnetta/2 litran Erlenmeyer-astiassa ja viljellään 43 h ravistellen 28°C:ssa. Ultraäänen avulla liuotetuista biomassoista mitattiin seuraavat vaikutukset:

Viljelyn kesto- OD 1:20 NMH-aasi aika tunneissa U/l 24 0,415 41 28 0,495 72 39 0,730 57

Esimerkki 3

Brevibacterium species, DSM 2843:a (eristetty navettanäyt-teestä, joka on erilainen kuin esimerkissä 2) viljellään kuten Moraxellaa esimerkissä 2.

Esiviljely 21 h/28eC, OD 1:20 * 0,690 Pääviljely

Viljelyn kesto- OD 1:20 NMH-aasi aika tunneissa U/l 15 0,440 26 24 0,550 80 39 0,670 59 43 0,750 46 24 8 2 0 71

Esimerkki 4

Micrococcus spec. DSM 2565:tä (eristetty multanäytteestä) viljellään kuten Moraxellaa esimerkissä 2.

Esiviljely 21 h/28°C, OD 1:20 = 0,620.

Pääviljely

Viljelyn kesto- OD 1:20 NMH-aasi aika tunneissa U/l 24 0,690 53 27,5 0,800 83

Esimerkki 5 1. Entsymaattinen väritesti, jonka avulla voidaan määrittää 1-metyylihydantoiini (1-metyylihydantoinaasi/N-karba-moyyli-sarkosiini-amidohydrolaasi/sarkosiinioksidaasireaktio peroksidaasi/4-aminoantipyriini/2,4,6-tribromi-5-hydroksi-bentsoehappo-väri-indikaattorisysteemin kanssa) 1.1 Reagenssi:

Komponentit Konsentraatio reagenssissa TES · KOH (pH 7,8) 100 mmoolia/1

MgCl2 5 mmoolia/1 ATP 5 mmoolia/1 NH4CI 10 mmoolia/1 4-aminoantipyriini 0,5 mmoolia/1 2,4,6-tribromi-3- hydroksibentsoehappo 5 mmoolia/1 1-metyylihydantoinaasi 0,15 U/ml N-karbamoyylisarkosii-niamidohydrolaasi 2 U/ml

Sarkosiinioksidaasi 5 U/ml

Peroksidaasi 2 U/ml 1.2 Määrityksen suorittaminen:

Aallonpituus: 546 nm

Kerroksen paksuus: 10 mm, lämpötila: 25eC

11 25 82071

Mittaus reagenssin verrokkiarvoon vertaamalla. Pipetoidaan maljaan: Näytteen Reagenssin ver-arvo (P) rokkiarvo (RL)

Reagenssi 1.1 2,00 ml 2,00 ml Näyte ) 0,10 ml -

Vesi - 0,10 ml

Sekoitetaan, inkuboidaan 10 min ja tämän jälkeen mitataan P:n ekstinktio RL:n suhteen (ΔΕ).

*) 1-metyylihydantoiinin vesiliuoksia, 87,7-1754 pmoolia/l.

ΔΕ:η riippuvaisuus näytteessä kulloinkin olevasta 1-metyyli-hydantoiinin konsentraatiosta on esitetty kuviossa 1.

Esimerkki 6 N-karbamoyylisarkosiinin määrittäminen reagenssilla 1.1 esimerkistä 5.

Määritys suoritetaan analogisesti kohdan 1.2 kanssa esimerkistä 5, paitsi että 1-metyylihydantoiinin vesiliuosten asemesta testiin otetaan vastaavat näytteet, joissa on ekvimolaariset konsentraatiot (87,7-1754 pmoolia/l) N-kar-bamoyylisarkosiinia.

Mitattujen ekstinktioarvojen riippuvuus N-karbamoyylisarkosiinin konsentraatiosta on esitetty kuviossa 2.

Esimerkin 5 ja esimerkin 6 mukaan mitattujen ekstinktioarvojen vertailu osoittaa, että 1-metyylihydantoiini- ja N-karbamoyyli-sarkosiininäytteistä, joissa on ekvimolaariset konsentraatiot, mitataan identtiset värisignaalikorkeudet (kuvio 3).

Esimerkki 7

Entsymaattinen UV-testi 1-metyylihydantoiinin määrittämisek- 26 82071 si (1-metyylihydantoinaasi/pyruvaattikinaasi/laktaatti-dehydrogenaasireaktio) 7.1 Reagenssit 7.1.1 Reagenssi I:

Komponentit Konsentraatio reagenssissa

Kaliumfosfaatti (pH 8,0) 75 mmoolia/1 NADH 0,25 mmoolia/1 ATP 1,30 mmoolia/1

Fosfoenolipyruvaatti 0,42 mmoolia/1

MgCl2 2,00 mmoolia/1

Pyruvaattikinaasi 4 U/ml

Laktaattidehydrogenaasi 10 U/ml 7.1.2 1-metyylihydantoinaasi (15 U/ml 50-prosent-tisessa glyseriinissä pH 8,0)

7.2 Määritysten suorittaminen Aallonpituus: 365 nm Kerroksen paksuus: 10 mm Lämpötila: 25°C

Mittaus reaktioseoksen verrokkiarvoon vertaamalla Maljoihin pipetoidaan: Näyte Reaktioseos-verrokkiarvo (P) (RL)

Reagenssi I 1,00 ml 1,00 ml Näyte ) 0,20 ml -

Vesi - 0,20 ml

Inkuboidaan 4 min, mitataan lähtöekstinktiot näytteestä (Ei p) ja RL:stä (E^ RL). Sitten sekoitetaan joukkoon: NMH-aasia 0,01 ml 0,01 ml 5-10 min kuluttua mitataan ekstinktiot P:stä (E2 p) ja

φ JL JL

RL:stä <E2>RL). E - (E1>p - E2p) - (E1(RL - E2>rl) ) **) 1-metyylihydantoiinin vesiliuokset, 8,7-877 pmoolia/l

II

27 8 2071 \ ' Huomautus: jos 1-metyylihydantoinaasivalmiste sisältää vielä merkittäviä määriä ATP-aasia tai NADH-oksidaasia, mikä näkyy selvänä NADH-vähenemisenä reaktioseosverrokkiar-voliuoksessa 1-metyylihydantoinaasiliuoksen lisäämisen jälkeen, on %2,Ρ Ja E2,RL luettava kulloinkin tarkasti yhtä pitkien aikojen kuluttua NMH-aasin lisäämisestä (esimerkiksi 6.00 min kuluttua).

Riippuvaisuus mitattujen ekstinktioerojen (ΔΕ) ja kulloinkin näytteessä olevien 1-metyylihydantoiinin konsentraatioiden välillä on esitetty kuviossa 4; kun lasketaan 1-metyylihydantoiinin hydrolyysissä syntynyt ADP-määrä NADH:n molaa-risen ekstinktiokertoimen avulla aallonpituudella 365 nm, saadaan selville, että ATP:n kulutuksen tai ADP:n muodostumisen ja 1-metyylihydantoiinin hydrolyysin stökiometrinen suhde on 1:1 (kuvio 5).

Esimerkki 8

Entsymaattinen väritesti kreatiniinin määrittämiseksi 8.1 Reagenssi:

Vastaa reagenssia 1.1 esimerkissä 5, johon lisätään krea-tiniini-iminohydrolaasia, 2 U/ml (loppukonsentraatio).

8.2 Määrityksen suorittaminen:

Vastaa kohtaa 1.2 esimerkissä 5, mutta näytteenä käytetään kreatiniinin vesiliuoksia, 87,7 - 1754 pmoolia/l ja inku-bointiaika P:lle ja RL:lie pitenee 20 minuuttiin.

AE:n riippuvuus kreatiniinin konsentraatiosta näytteessä on esitetty kuviossa 6.

Jos reagenssista 8.1 jätetään pois kreatiniini-imino-hydrolaasi, ei havaita mitään värireaktiota, samoin jos testiliuoksessa 8.2 käytetään näytteenä kreatiniiniliuosten asemesta kreatiiniliuosta, 884 pmoolia/l.

Claims

28 82071 1. 1-metyylihydantoinaasi, tunnettu siitä, että se hydrolysoi 1-metyylihydantoiinin nukleosiditrifosfaatin ja moniarvoisen metalli-ionin läsnäollessa, että sen molekyylipaino on noin 125 000 (SDS-gradienttigeelielektroforeesi), pH-optimi pH-arvossa 7,8 Km 1-metyylihydantoiinin suhteen 0,02 mmoolia/1 ja Km ATP:n suhteen 0,8 mmoolia/1, ja että sitä voidaan saada viljelemällä Arthrobacter spec. DSM 2563, DSM 2564, Moraxella spec. DSM 2562, Micrococcus spec. DSM 2565 tai Brevibacterium spec. DSM 2843, ja eristämällä entsyymi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen 1-metyylihydantoinaasi, tunnettu siitä, että mikro-organismi liuotetaan, entsyymi seostetaan polyetyleeni-imiinin kanssa ja mahdollisesti rikastetaan ammoniumsulfaattifraktioinnin, kuumennusvaiheen ja kromatografian avulla.
3. Användning av enzymet enligt patentkrav 1 för bestämn-ing av kratinin, kännetecknad av att kreatinin överförs med kreatinin-deiminas E.C. 3.5.4.21 i 1-metylhydantoin, det sistnämda hydrolyseras med 1-metylhydantoinas i närvaro av nukleosidtrifosfat och en flervärd metalljon och a) den av 1-metylhydantoin bildade hydrolysprodukten bestäms med N-karbamoylsarkosinamidohydrolas under bildning av sarkosin och sarkosin pävisas med sarkosinoxidas eller sarkosindehydrogenas eller b) det samtidigt bildade nuklesiddifosfatet bestäms.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen entsyymin käyttäminen kreatiniinin määrittämiseen, tunnettu siitä, että muutetaan kreatiniini kreatiniinideiminaasin E.C. 3.5.4.21 avulla 1-metyylihydantoiiniksi, hydrolysoidaan jälkimmäinen 1-me-tyylihydantoinaasin kanssa nukleosiditrifosfaatin ja moniarvoisen metalli-ionin läsnäollessa ja a) määritetään 1-metyylihydantoiinista muodostunut hydro-lyysituote N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasin avulla, jolloin muodostuu sarkosiinia ja osoitetaan sarkosiini sarkosiinioksidaasin tai sarkosiinidehydrogenaasin avulla, tai b) määritetään samanaikaisesti muodostunut nukleosididifos-faatti.
4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att bestämningen genomföres i en buffrad vattenhaltig lösning vid ett pH-värde av mellan 7,0 och 9,0.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tapahtuu puskuroidussa vesiliuoksessa pH-arvolla 7,0-9,0.
5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att man omsätter vid ett pH-värde av mellan 7,3 och 8,5.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktion annetaan tapahtua pH-arvolla 7,3-8,5. 29 8 2 0 71
6. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-5, kännetecknat av att omsättningen genomföres vid en buffertkoncen-tration av mellan 10 och 500 mmol/1. 32 82071

6. Jonkin patenttivaatimuksista 3-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktio suoritetaan puskurikonsen-traatiolla 10-50 mmoolia/1.
7. Förfarande enligt patentkrav 6, kännetecknat av att man justerar buffertkoncentrationen tili mellan 50 och 200 mmol/1.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskurikonsentraatio säädetään välille 50-200 mmoolia/1.
8. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-7, kännetecknat av att man säsom nukleosidtrifosfat använder ATP.

8. Patenttivaatimusten 3-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään nukleosiditrifosfaattina ATP:tä.
9. Förfarande enligt patentkrav 8, kännetecknat av att man använder 0,05-50 mmol/1 ATP.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 0,05-50 mmoolia/1 ATP:tä.
10. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-9, kännetecknat av att man använder säsom flervärda metalljoner magnesium- eller manganjoner.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 3-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään moniarvoisina metalli-ioneina magnesium- tai mangaani-ioneja.
11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av att man tillsätter magnesiumjonerna i form av magnesiumklorid, magnesiumsulfat eller magnesiumaspartat.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että magnesiumionit lisätään magnesiumkloridin, magnesiumsulfaatin tai magnesiumaspartaatin muodossa.
12. Förfarande enligt patentkrav 10 eller 11, kännetecknat av att man tillsätter 0,1-50 mmol/1 av tvävärda metalljoner.

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 0,1-50 mmoolia/1 kaksiarvoisia metalli-ioneja.
13. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-12, kännetecknat av att man tillsätter 0,01-10 U/ml 1-metylhydan-toinas.

13. Jokin patenttivaatimuksista 3-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 0,01-10 U/ml 1-metyylihydan-toinaasia.
14. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-13, kännetecknat av att man tillsätter 0,1-100 mmol/1 av ett ammo-niumsalt.

14. Jonkin patenttivaatimuksista 3-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 0,1-100 mmoolia/1 jotakin ammoniumsuolaa.
15. Förfarande enligt nägot av patentkraven 3-14, kännetecknat av att man tillsätter 0,1-20 U/ml av N-kar-bamoylsarkosin-amidohydrolas.

15. Jonkin patenttivaatimuksista 3-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 0,1-20 U/ml N-karbamoyyli-sarkosiiniamidohydrolaasia. 30 82071
16. Förfarande enligt patentkrav 15, kännetecknat av att man tillsätter 1-20 U/ml sarkosinoxidas eller sarkosin-dehydrogenas. Il 33 82071

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään 1-20 U/ml sarkosiinioksidaasia tai sarkosiinidehydrogenaasia.
17. Reagens för bestämning av kreatinin, kännetecknat av att det Innehäller 1-metylhydantoinas enllgt patentkrav 1.

17. Reagenssi, jonka avulla voidaan määrätä kreatiniini, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaista 1-metyylihydantoinaasia.
18. Reagens enllgt patentkrav 17, kännetecknat av att det innehäller kreatinindeiminas, 1-metylhydantoinas, ATP eller GTP, tvävärda metalljoner, N-karbamoylsarkosinamldohydrolas, sarkosinoxidas eller sarkoslndehydrogenas och buffert-substans av pH 7,0-9,0.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää kreatiniinideiminaasia, 1-metyylihydantoinaasia, ATP:tä tai GTP:tä, kaksiarvoisia metalli-ioneja, N-karbamoyylisarkosiiniamidohydrolaasia, sarkosiinioksidaasia tai sarkosiinidehydrogenaasia ja puskuriainetta, pH 7,0-9,0.
19. Reagens enllgt patentkrav 18, kännetecknat av att det innehäller ett system för bestämning av H2O2 eller av form-aldehyd eller ett färggivande elektronacceptorsystem för direkt äskädliggörande av sarkosindehydrogenasreaktionen.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää systeemin Η2θ2:η tai formaldehydin määräämistä varten tai värilliseksi tulevan elektronien akseptorisysteemin sarkosiinidehydrogenaasireaktion tekemiseksi suoraan näkyväksi.
20. Reagens enllgt patentkrav 17, kännetecknat av att det innehäller kreatinindeiminas, 1-metylhydantoinas, ATP eller GTP, tvävärda metalljoner, ett system för bestämning av ADP eller GDP och buffertsubstans av pH 7,0-9,0.

20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää kreatiniinideiminaasia, 1-metyylihydantoinaasia, ATP:tä tai GTP:tä, kaksiarvoisia metalli-ioneja, systeemin, jonka avulla voidaan määrätä ADP tai GDP ja puskuriainetta pH 7,0-9,0.
21. Reagens enllgt patentkrav 18-20, kännetecknat av att det innehäller Mg- eller Mn-joner.

21. Patenttivaatimusten 18-20 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää Mg- tai Mn-ioneja.

22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että ADP:n määrittämistä varten oleva systeemi muodostuu pyruvaattikinaasista, laktaattidehydrogenaasista, fosfonoenolipyruvaatista ja NADH:sta. 31 82071 1. 1-metylhydantoinas, kännetecknat av att det hydroly-serar 1-metylhydantoin i närvaro av ett nukleosidtrifos-fat och en flervärd metalljon, att det uppvisar en molekyl-vlkt av 125 000 (SDS-gradlentgelelektrofores), ett pH-op-timum av pH 7,8, ett Km gentemot 1-metalhydantoln av 0,02 mmol/1 och ett Km gentemot ATP av 0,8 mmol/1, och är er-hällbar genom odling av Arthrobacter art DSM 2563, DSM 2564, Moraxella art DSM 2562, Micrococcus art DSM 2565 eller Brevibacterlum art DSM 2843 och isolering av enzymet. 2. 1-metylhydantoinas enligt patentkrav 1, kännetecknat av att man uppsluter mikroorganismen, fäller ut enzymet med polyetylenimln och eventuellt anrlkar detta genom ammo-niumsulfatfraktionering, upphettnlngssteg och kromatografi.
22. Reagens enllgt patentkrav 20, kännetecknat av att sys-temet för bestämning av ADP bestär av pyruvatkinas, laktat-dehydrogenas, fosfonoenolpyruvat och NADH.