HU194303B - Process for preparing nucleoside-triphosphate-dependent 1-methylhydantoinase and process and reagent for determining creatinine - Google Patents

Process for preparing nucleoside-triphosphate-dependent 1-methylhydantoinase and process and reagent for determining creatinine Download PDF

Info

Publication number
HU194303B
HU194303B HU85676A HU67685A HU194303B HU 194303 B HU194303 B HU 194303B HU 85676 A HU85676 A HU 85676A HU 67685 A HU67685 A HU 67685A HU 194303 B HU194303 B HU 194303B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sarcosine
mmol
creatinine
units
magnesium
Prior art date
Application number
HU85676A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT37456A (en
Inventor
Joachim Siedel
Rolf Deeg
Albert Roeder
Joachim Ziegenhorn
Hans Moellering
Helmgard Gauhl
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of HUT37456A publication Critical patent/HUT37456A/hu
Publication of HU194303B publication Critical patent/HU194303B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás nukleozid-trifoszfát-függő 1 -metfl-hidantionáz előállítására, valamint eljárás és reagens kreatinin meghatározására. '
Az analitikai kémiában, különösen a klinikai-kéndai diagnosztikában állandóan növekvő igény van természetes anyagok, biológiai anyagcseretermékek és ezekből levezethető vegyületek kimutatására szolgáló enzimes eljárásokra. Az alap az enzimkatalitíkus anyagátalakítások rendkívül nagy fajlagossága, ezek gyors, meghatározott és veszteségmentes lefutása enyhe reakciókörülmények között — rendszerint 15 és 40°C között vizes közegben és semleges pH-tartományban - valamint az a lehetőség, hogy ezeket egyszerű és érzékeny módon, különösen fotometriás mérési módszerekkel vagy közvetlenül vagy kapcsolt Indikátorreakciók segítségével kvantltatíve nyomonkövethetjük.
Az l-metQ-hjdantoínra eddig semmilyen enzimkatalitikus átalakítási eljárás nem volt ismert, amely ezt a vegyületet közvetlen vagy közvetett enzimes analízis számára hozzáférhetővé tette volna. Pedig egy ilyen eljárás többek között különösen értékes lenne a kreatininnek, egy klinikai-diagnosztikailag fontos szérum- és vizeletalkotórésznek a meghatározására, amely egy hosszú ideje ismert enzimreakcióban a kreatinin-iminohidráz (E. C. 3.5.4.21) segítségével 1-metil-hidantoinná és ammóniává alakítható át.
Kreatinin szérumban vagy vizeletben való enzimes meghatározására ugyan már több eljárás ismert [Wahlefeld, A. W., G. Holz und H. U. Bergmeyer, Methoden dér enzimatischen Analyse, 3, kiadás,
II. kötet, Verlag Chemie, Weinheim 1974, 18341838. old.; Fossati, P., L. Prencipe and G. Bertl, Clinical Chemistry 29, 1494-1496. (1983); Tanganelli, E., L. Prenzipe, D. Bassi, S. Cambiaghi and E. Murador, Clinical Chemistry 28, 1461-1464 (1983)] ezeknek azonban mind megvan az a hátrányuk, hogy a reakciösorozat közbenső termékeként vagy kreatinon (Wahlfeld et al.: Fossati et al.) vagy ammónián (Tanganelli et al.), vagyis olyan anyagokon át futnak le, amelyek kezdettől jelen vannak változó és a kreatininhoz képest jelentősen számításba jövő koncentrációkban az analizálandó szérumilletve vizeletmintában. A kreatinin-meghatározáshoz tehát két elkülönített vagy egymás után kapcsolt reakciószakasszal történő különbségmérésre van szükség: egyikre, amelyben először a szabad kreatinint illetve ammóniát határozzák meg, valamint egy másodikra, amelynek során vagy kreatinin-aminohidroláz (E. C. 3.5.2.10) vagy kreatinin-iminohidroláz (=krcatinin-dczimináz) hozzáadásával a kreatininből utólag keletkező kreatin-, illetve ammónia-mennyiséget határozzák meg („minta)vakérték-eljárás” vagy „Ej (E2-eljárás) . Ilyenfajta eljárások a manuális kivitelezés miatt viszonylag költségesek, és automatizált analízisrendszerekre is csak nagyón korlátozottan alkalmazhatók, főleg akkor, ha az átalakítási reakciók teljes lefutásához hosszabb inkubációs idők szükségesek. Noha lényegében a reakciókörülmények megfelelő kiválasztásával a kreatinin-meghatározás a vakérték mérés elkerülésére ismert enzimes módszerekkel az úgynevezett kinetikus „fixed-time” eljárással végrehajtható, ez azonban mindenesetre a mérési időpontok meghatározott hőmérsékleti feltételek közötti nagyon pontos betartását igényli, ami kielégítő pontossággal csak analizáló automatákba sikerül, a manuális kezelést viszont ez messzemenően kizárja.
A kreatinnal vagy ammóniával ellentétben $z
1-metil-hidantoin („N-metil-hldantoln , „NMH ) nem természetes alkotórésze a szérumnak vagy vizeletnek: egy 1-metfl-hldantoinon mint köztiterméken át menő kreatinin-meghatározási módszer úgy azt a jelentős előnyt nyújtaná, hogy ennél el lehetne tekinteni a vakérték-méréstől, feltéve hogy az 1-metflhidantoín enzimatikus átalakulása maga indikátorreakcióként alkalmazható, vagy adott esetben kapcsolt indikátorreakciók szintén nem szérumban vagy vizeletben természetes körülmények között jelentős koncentrációban előforduló anyagokon át futnak le.
Szükség van tehát 1-metíl-hidantoin enzimatíkus analízisére szolgáló olyan eszközre és eljárásra, amely lehetővé teszi kvantitatív, előnyösen fotometriás mérését más szérum- vagy vizelet-alkotórészek egyidejű együttmérése nélkül,
A feladatot a találmány szerint egy új, eddig nem ismert enzimmel oldottuk meg, amely 1-metil-hidantoint legalább egy nukleozid-trifoszfát, előnyösen adenozin-5 -trifoszfát (ATP), egy többértékű fémion, előnyösen magnézium(ÍI)- vagy mangán(II)-ion, valamint adott esetben valamilyen ammóniumsó jelenlétében hidrolizálni képes.
Az irodalomban ugyan már leírták hidantoinok különböző forrásokból származó „hidantornázok’ kai (hidropirimidin-hldroláz, E. C. 3.5.2.2.) végzett különféle enzimatikus hidrolíziseit, azonban hatást eddig csak szubsztituálatian hidantoinnal [Wallach, D. P. and S. Grisolia, J. Bioi. Chem. 226, 277—288 (1957)] illetve 5-helyzetben szubsztituált hidantoinokkkal [26 31 048. sz. és 28 11 303 sz. német szövetségi köztársaságbeli közzétételi iratok; Olivieri, R., E. Fascetti, L. Angelini and L. Degen; Biotechnology and Bioengineering 23, 2173-2183 (1981)] szemben mutattak ki. Ezenkívül az illető enzimek egyikének esetében sem mutattak ki kofaktor-függőséget; a Wallach és munkatársai által leírt enzim hidantoin hidrolíziséhez például nem is igényli többértékű fémionok hozzáadását, Olivieri és munkatársai munkájában viszont ammónium-klorid (0,1 mól/liter) jelenlétében a hidantoln-hídroláz jelentős gátlására utalnak, míg a találmány szerinti enzim aktivitása ammóniumsók hozzáadásával még jelentősen növelhető is.
A találmány szerinti enzim előfordulását, elkülönítését és tulajdonságait valamint 1-metfl-hJdantoÍn illetve kreatinin meghatározására való alkalmazását a következőkben részletesebben leírjuk.
A találmány szerinti új enzim, az 1-metil-hidantoináz mikroorganizmusokban széleskörűen előfordulónak látszik. Így például megtalálták a Brevibacterium, Moraxella, Micrococcus és Arthrobacter nemhez tartozó mikroorganizmusokban. Ezen nemekhez tartozó törzsekre, amelyekben a találmány szerinti enzim feldolgozásra érdemes mennyiségben megtalálható volt, példaként Arthrobacter spec. DSM 2563, DSM 2564, Moraxella spec. DSM 2562, Micrococcus spec. DSM 2565 vagy Brevibacterium spec. DSM 2843 említhető.
A találmány szerinti enzim előnyösen úgy nyerhető, hogy az előbb felsorolt mikroorganizmusok valamelyikét tenyésztjük, és az enzimet a biomasszából vagy/és a tápközegből különítjük el.
Az új enzim következő tulajdonságait határoztuk meg:
194 303
1. Molekulasúly;
SDS-gradiens gélelektroforézís. Ms
2. pH-Optimum: pH = 7,8.
Aktivitás %-ban 25°C-on.
125000.
pH x6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
TES-puffer
150 mmól/Hter
5 76 100 100 95 69 4,
T-RIS-puffer 10
150 mmól/Hter 1 26 60 52 38 19
3. Fajlagosság:
Relatív aktivitás %-ban (ADP)plruvát-kináz(laktát-dehldrogenázon át).
a) Szubsztrát (mindenkor 0,1 mmól/liter végkoncentráció a reakcióelegyben)
A szubsztrátfajlagosság meghatározása céljából a következőképp jártunk el:
1. Alapreagens komponensek koncentráció kálium-foszfát (pH 8,0) 75 mmól/liter
NADH 0,25 mmól/liter
ATP 1,30 mmól/liter foszfo-enol-piruvát 0,42 mmól/liter magnézium-klotid 2,00 mmól/liter plruvát-klnáz 4 egység/ml laktát-dehidrogenáz 10 egység/ml.
2. 1-Metil-hidantolnáz (15 egység/ml 50%-os glicerin, 20 mmól/liter TRIS . HC1 pufferben, pH 8,0).
3. Hidantoin oldatok
A hidantoin (1-metfl-hídantoin, hidantoin, 5-metfl-hldantoin valamint 5,5-dimetil-hidarttoin) koncentrációja : mindig 0,6 mmól/liter víz.
4. A vizsgálat kivitelezése
Hullámhossz 365 nm : T = 25eC : d = 1 cm : térfogat 1,21 ml.
A küvettákba pipettázandók
Reakcióelegy vakérték 1,00 ml 0,20 ml
Minta
1,00 ml 0,20 ml
Alapreagens (1)
Minta (3)
Víz összekeverni, azután hozzáadni
1-metil-hídantoi- 0,01 ml 0,01 ml náz (2)
A minta ΔΕ-értékét (ΔΕΜ) és a reakcióelegy — vakérték ΔΕ-értékét (ÁEy) az 1-metil-hldantolnáz hozzáadása után 2 percen belül mérni.
ΔΕ = ΔΕΜ-ΔΕν
5. A relatív reakciósebesség számítása a különböző hldantoinokkal meghatározott ΔΕ/percből ΔΕ/perc (l-metíl-hidantoin)= 100%-ra.
A következő eredményeket kaptuk;
1-metfl-hidantoin 100%,
5-metfl-hldantoin 14%, hidantoin 13%,
5,5-dlmetil-hidantoin 0%.
b) Nukleotidok.
Relatív aktivitás %-ban (ATP « 100) karbamoilszarkozin-amido-hidroláz * szarkozin-oxidázon át való meghatározáskor:
Nukleotid (4 mmól/liter) %
ATP 100
ADP 1
AMP 0
GTP 7
CTP 1,5
TTP 0
UTP 0
PPi 0
Karbamofl-foszfát 0
Nátrium-tripoHfoszfát 0
Nátrium-hexametafoszfát 0
Fémion-függőség
Relatív aktivitás %-ban (5 mmól/Hter magnézium-
klorld = 100).
mmól/Hter anyag %
0 magnézium-klotid 17
i 83
5 100
10 - „ - 98
5 mangán-klorid 60
5 cínk-klorid 24
Aktivátorok
Kifejezve NH«. Relatív aktivitás %-ban (30 mmól/
(Hter ammónium-szulfát = 100).
Aktivátor anyag mmól/Hter %
Semmi 0 44
Ammónium-szulfát 30 100
Ammónium-szulfát 10 95
Ammónlum-klorid 30 91
Ammónlum-acetát 30 98
Litium-szulfát 30 40
Nátrium-szulfát 30 39
KáHum-szulfát 30 59
Nátrium-klorid 30 41
Nátrium-hidrogén-karbonát 30 40
Inhibitorok
Kifejezve EDTA, NaF.
Nátrium-fluorid: 1 x 10’’ mól/Hter 100%-ra gátol.
EDTA-gátlás* mmól/Hter relatív
aktivitás %
0 100
5 100
10 42
2 * A reakcióelegyben 7,5 mmól magnézium(II)-ion jelenlétében.
7. MlchaeHs konstansok.
K_ATP (TES 0,15 mmól/Hter, pH 7,8 : szarkozinra); 0,8 mmól/liter;
K 1-metíl-hidantoin (0,15 mmól/Hter TES, pH 7,8, ADP-re) : 0,02 mmól/liter.
8. Stabilitás
a) hőstabflitás; 50%-os gHcerínben:
mmól/Hter TRIS, pH 8,0 (2 egység/ml).
perc maradék aktivitás %-ban
25°C 100
50°C .94
0
60eC
70C _
ΊΕ) pH-stabilitás.
20%-os glicerin, 10 mmól/Hter TRIS, 0,2 egység/ ml, + 4 C, 3 napig sötétben tárolva (kiindulás = 100%).
pH maradék aktivitás %-ban
6,3
6,5
7,0
8,0
9,0
194 303
A találmány szerinti enzim enzimek tisztítására önmagukban Ismert módszerekkel nyerhető ki olyan mikroorganizmusokból, amelyek feldolgozásra érdemes mennyiségben tartalmaznak 1-metfl-hldantoinázt. Célszerűen a mikroorganizmust feltárjuk, és az enzimet polietiléninrin hozzáadásával kicsapjuk. így olyan enziinmészítményt kapunk, amely már analitikai célokra alkalmazható. Amennyiben további tisztítás kívánatos, úgy célszerűen ammónjum-szulfátos frakcionálási, hőkezelés! műveletet, valamint kronratográfiát alkalmazunk.
A mikroorganizmus-feltárás ismert kémiai vagy fizikai módszerekkel történhet, például kémiailag lizozim segítségével vagy fizikailag ultrahanggal, dezintegrálással nagynyomású szuszpenzióban és hasonlókkal. A feltárási eljárás nem döntő. Különösen alkalmasak azonban az olyan módszerek, amelyek a sejtmembránt messzemenően feloldják.
A hőkezelési művelet célszerűen 50°C-on történik olyan pH tartományban, amelyben az enzim jó stabilitást mutat.
A kromatográfiás tisztításra különösen fenllSepharose és DEAE-csoportokat tartalmazó gyengén bázisos anioncserélők váltak be. Előnyös tisztítási eljárás a következő: lizozimos feltárás 20%-os glicerinben, lecsapás oldható polietilénimin hozzáadásával, a csapadék kinyerése, ammónium-szulfátos frakcionálás, hőkezelés 50°C-on és pH 8-on, kromatografálás fenfl-Sepharose-on, ezt követően kromatográfia DEAE-Sephacel -en és végül molekulaszűrős frakcionálás, célszerűen Sephacryr S 200-on. Ilymódon olyan tiszta enzimkészítményt kapunk, amelynek fajlagos aktivitása 2,1 egység/mg protein, és amelyen az enzim tulajdonságai meghatározhatók.
Az enzim kinyeréséhez használható mikroorganizmusokat célszerűen olyan táptalajon tenyésztjük, amely szén- és nitrogén-forrásként 1-metfl-hidantoint tartalmaz vitaminok és nyomelemek mellett.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás kreatlnin vizes, pufferolt oldatban való meghatározására a kreatininnek kreatjnin-dezjmináz E. C. 3.5.4.21-gyel 1-metfl-hidantionná való átalakításával. A találmány szerinti megoldást az jellemzi, hogy az 1-metfl-hldantoint l-metil-hidantoinázzal előnyösen feleslegben lévő nukleozid-trifoszfát és valamilyen többértékű fémion jelenlétében hidrolizáljuk, és
a) az 1-metil-hidantoinból keletkezett hidrolízisterméket N-karbamofl-szarkozln-amidohjdrolázzal reagáltatjuk, szarkozik képződése közben és a szarkozint szarkozin-oxidáz- vagy szarkozjn-dehidrogenáz segítségével kimutatjuk, vagy
b) az egyidejűleg képződött nukleozid-difoszfátot meghatározzuk.
A keletkező hidrolízistermék reakciósebesség és mérési jel nagysága szempontjából az N-k írbamoflszarkozin-amidohidrolázzal kapcsolt indikátorreakcióban gyakorlatilag pontosan úgy viselkedik, mint a reakcióelegyhez 1 -metil-hidantoin helyett ekvimoláris mennyiségben hozzáadott N-karbamofl-szarkozJn. (Lásd 2. és 3. ábrát is.)
A pufferolt vizes oldat pH-ja célszerűen 7,0 és 9,0 között, előnyösen 7,3 és 8,5 között, különösen 7,5 és 8,2 között van. A pH-érték beállítása céljából olyan anyagok jönnek számításba, amelyek az említett pH-tartományban kielégítő pufferkapacitással rendelkeznek, így például foszfátok, TRIS, trietanolamln vagy TES. Különösen előnyös a TES-puffer, A puffer koncentrációja rendesen 10 és 500 mmól/ között van, előnyösen 50 és 200 mmól/1 között, különösen 75 és 125 mmól/1 között van.
Nukleozld-trifoszfátként ATP vagy GTP jön számításban, előnyösen ATP. A koncentrációtartomány célszerűen 0,05 és 50 mmól/liter közé, előnyösen 0,5 és 20 mmól/liter közé, különösen előnyös 1 és 10 mmól/liter közé esik.
Többértékű fémionokként előnyösen kétvegyértékű fémionokat alkalmazunk, különösen előnyösen magnézium(II)- és mangán(II)-ionokat, főleg magnéáum(II)-ionokat vízoldható sóik formájában, például magnézium(n)-ionokat vízoldható sóik formájában, például magnézium(II)-kloridot vagy magnézlum(H)-szulfátot vagy magnézium(II)-aszpartátot is. A fémionok koncentrációja célszerűen 0,1 és 50 mmól/liter közé, előnyösen 0,5 és 20 mmól/liter közé, különösen előnyösen 1 és 10 mmól/liter közé esik.
A reakcióelegyhez milliliterenként rendesen 0,01 és 10 egység közötti, különösen 0,05 és 2 egység közötti, előnyösen 0,1-1 egység 1-metii-hidantoinázt adunk.
Az 1-metil-hidantoináz aktivitásnövelésére ammóniumsó-adalékok bizonyultak kedvezőnek: a koncentrációk 0,1 és 100 mmól/liter közöttiek, előnyösen 1 és 30 mmól/liter közöttiek, különösen 5 és 10 mmól/liter közöttiek.
A kreatinin-iminohidrolázt célszerűen 0,1-20 egység/ml, előnyösen 0,05-15 egység/ml, különösen 1 — 10 egység/ml mennyiségben használjuk.
Az N-karbamofl-szarkozin-amidohtdroláz esetében 0,1-20 egység/ml aktivitáskoncentrációk kedvezők, 0,5-10 egység/ml aktivitáskoncentrációk előnyösek, de leginkább az 1-5 egység/m] közötti koncentrációk. Általában a 3248145 sz. német szövetségi köztársaságbeli közzételi irat adatai megfelelők.
A szarkozin-oxidáz esetében a kedvező tartomány 1-20 egység/ml, előnyös a 2-10 egység/ml, különösen előnyös a 4-8 egység/ml. Ugyanez érvényes a hasonlóképp alkalmazható szarkozin-dehldrogenázra.
A szarkozin szarkozin-oxldázzal vagy szarkozindehidrogenázzal való kimutatása ismert, és az erre megadott és .a szakember által ismert körülmények a találmány keretén belül Is megfelelők. Ugyanez érvényes a keletkező nukleoizid-difoszfátok, tehát az ADP vagy GDP kimutatására Is. Erre Is alkalmazhatók az Ismert eljárások illetve reagensek.
A keletkezett szarkozin kimutatására az ismert szarkozin-oxjdáz-reakció alkalmazása különösen előnyös. A szarkozin-oxidáció lefutása vagy elektrokémiaflag az oxigén-felhasználáson vagy a reakcióelegyben keletkező hidrogén-peroxidon át követhető, vagy enzimatikusan a hidrogén-peroxid vagy formaldehid képződésen át. Különösen előnyös a hidrogénperoxid meghatározását fotometriásan végezni, mégpedig valamilyen peroxidáz-katalizált színreakcióban
2,4,6-tribróm-3-hidroxi-benzoesav 4-amino-antipirinnel való oxidatív kapcsolásán át. A peroxidáz-aktivitás Itt 0,05-20 egység/ml, előnyösen 0,2—10 egység/ ml, különösen 0,5-5 egység/ml. A tribróm-hídroxi-benzoesavat 1-25 mmól/liter, előnyösen 2—20 mmól/liter, különösen 5-10 mmól/liter koncentrációban alkalmazzuk. A 4-amino-antipirin esetében 0,1-2 mmól/liter előnyösen 0,2-1,5 mmól/liter, különösen 0,5-1 mmól/liter koncentráció bizonyult megfelelőnek. Más Ismert rendszerek is ugyanígy alkalmazhatók hidrogén-peroxid vagy más módszer szerint formaldehid kimutatására.
Mivel az l-metll-hidantolnáz nukleozid-trifoszfá-42
194 303 tót sztöchlometrikusan nukleozid-djfoszfáttá alakít át, a kreatin-meghatározás az 1-metil-hidantoinból keletkezett reakciótermék meghatározása helyett az egyidejűleg keletkezett nukleozid-djfoszfát, tehát különösen az ADP meghatározásán is alapulhat. Az ADP meghatározására Ismeretesek megfelelő eljárások, például H. U. Bergmeyer „Methoden dér enzymatischen Analyse,, c. művéből (3. kiadás, 1874. 2128. oldaltól és 2178. oldaltól). Részletezett leírás ezért ezen a helyen felesleges.
A találmány szerinti kreatinin meghatározására szolgáló reagens kreatinin-deziminázt, 1-metfl-hidantoinázt, ATP-t vagy GTP-t, kétvegyértékű fémionokat, N-karbamofl-szarkozin-amidohidrolázt, szarkozin-oxidázt vagy szarkozín-dehidrogenázt és pH = 7,0-9,0 közötti pufferanyagot tartalmaz.
A reagens tartalmaz ezenkívül előnyösen még hidrogén-peroxjd vagy formaldehid meghatározására szolgáló valamilyen rendszert is vagy valamilyen színképző elektronakceptor-rendszert, például valamilyen tetrazóliumsót a szarkozin-dehidrogenáz-reakció közvetlen láthatóvá tételére. Ezek a rendszerek ismertek, például H. U. ^ergmeyer „Methoden dér enzimatischen Analyse’ c. művéből (Verlag Chemie, Weinheim).
A reakcióelegy az említett alkotórészek mellett még tartósítószereket, például nátrium-azidot, detergenseket és a trigliceridektől zavaros minták átlátszóvá tételére lipázokat is tartalmazhat, valamint kálium-[hexaciano-ferrát(II)]t és aszkorbát-oxidázt a hldrogén-peroxid kimutatási reakciónak a mintában lévő bíllirubin vagy aszkorbinsav által okozott zavarásának elkerülésére. A reakcióelegynek csak 1-metfl-hidantoín meghatározására való alkalmazása esetén a kreatinin-iminohidroláz el is hagyható.
A találmány szerinti reagensek kétértékű fémionokként célszerűen különösen magnézium- vagy mangán-ionokat tartalmaznak, ahogy az előbbiekben már részletesen említettük.
Az említett reakcíókomponensek porózus hordozóanyagokra impregnálva is előfordulhatnak, és így például lehetővé tehetik kreatinin illetve 1-metilhidantoin kvantitatív vagy kvalitatív meghatározását úgynevezett tesztcsíkokkal.
Egy másik előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti reagens kreatinin-deziminázt, 1-metil-hidantoinázt, ATP-t vagy GTP-t, kétértékű fémionokat, különösen magnézium- vagy mangán-ionokat, ADP vagy GDP meghatározására szolgáló rendszert, és pH 7,0-9,0 közötti pufferanyagot tartalmaz.
Pufferanyagként ebben az esetben kálium-foszfát puffer az előnyös: a pufferanyag, kreatinindezimináz, 1-metü-hidantoináz, ATP, magnéziumvagy mangán(II)-ionok valamint adott esetben ammó iumsók koncentrációjára általában az előbb megadott adatok érvényesek.
Az ADP-kimutatás előnyösen a kapcsolt piruvátkjnáz/laktát-dehidrogenáz rendszer segítségével történik foszfo-enol-piruvát és NADH jelenlétében, amikor a keletkezett ADP-mennyiséget végül a laktátdehidrogenáz-reakcióban fogyó NADH-n át mérjük fotometriásan. Ez az eljárás is ismert a szakember által, és ezért ezen a helyen semmilyen közelebbi részletezése nem Indokolt.
A reakcióelegy egyedül 1-metfl-hldantoln meghatározására való alkalmazása esetében a kreatíninImJnQhidroláz el is hagyható.
A következő példák az ábrákkal együtt részletesebben szemléltetik a találmányt. Az ábrák a következők:
1. ábra: Az 5. példa szerint kapott extinkcióértékek grafikus ábrázolása az 1-metfl-hidantoin mennyiségének függvényében.
2. ábra: Az 1. ábrához hasonló ábrázolás a 6. példában 1-metfl-hidantoin helyett N-karbamofl-szarkozin alkalmazása esetén.
3. ábra: Az 5. és 6. példa eredményeit összehasonlító grafikus ábrázolása.
4. ábra: Az 1. ábrához hasonló grafikus diagram a
7. példa esetében.
5. ábra: A sztöchlometrikus ADP-képződés grafikus ábrázolása.
6. ábra: Az 1. ábrához hasonló grafikus diagram a
8. példa esetében. A leírás során a következő rövidítéseket és szinonim elnevezéseket használjuk:
AS: ammónlum-szulfát,
CSH-áz: N-karbamofl-szarkozin-amidohidroláz, Kreatinin-dezimináz = kreatinin-iminohidroláz, 1-Metfl-hidantoínáz, NMH-áz: 1-metíl-hldantoinhidroláz,
N-MetD-hidantoin, NMH: 1-metü-hÍdantoln,
OD: (optische Dichte) optikai sűrűség,
PABS: para-ámino-benzoesav,
PPi: pirofoszfát,
TES: 2- [trisz(hldroxi-metil)-metfl]-amjno -etán szulfonsav,
TRIS: [trisz(hidroxl-metfl)-amino]-metán.
1. példa
A) A kiindulási törzs tenyésztése.
Arthrobacter species DSM 2563-t (amelyet szántóföldből elkülönítettünk el) 3 hetenkénti átoltással a következő összetételű ferde agaron tartunk: Literenként:
g dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát, g kálium-dihidrogén-foszfát,
0,5 g nátrium-klorid,
0,5 g magnézium-szulfát-heptahidrát, g N-metil-hidantoín (NMH), ml 1. sz. nyomelemoldat,
0,1 ml 2. sz. nyomelemoldat, ml vitamlnoldat, g agar, pH 7,5.
1. sz. nyomelemoldat:
100 mg mangán(II)-klorid-tetrahldrát,
100 mg vas(III)-klorJd-hexahidrát,
100 mg kalcium(III)-klorid-dihidrát,
100 ml kétszer desztillált vízben oldva, és sterilizálva.
Az oldat 1 ml-ét adjuk 1 liter táptalajhoz.
2. sz. nyomelemoldat:
mg réz(II)-klorid-dihidrát, mg cink(II)-klorid, mg ammónium-[tetraoxo-molibdenát(VI)].
mg Kobalt(II)-klorid-hexahidrát,
1000 mg kétszer desztillált vízben oldva, és sterilizálva.
Az oldat 0,1 ml-ét adjuk 1 liter táptalajhoz.
Vitaminoldat:
0,1 mg biotin,
0,1 mg piridosamln-hidroklorid,
0,1 mg PABS,
1,0 mg ribotflavin,
194 303
1,0 mg nikotinamid,
1,0 mg fólsav,
10,0 mg tiamin-hldroklorid, oldva Ϊ00 ml kétszer desztillált vízben és sterilre szűrve.
Az oldatból 1 ml-t adunk 1 liter táptalajhoz.
ml folyékony, előbb leírt táptalajt beoltunk 1 kacsnyl ferda agárról vett anyaggal, és 100 ml-es Erlenmeyer lombikban 28°C-on 20—24 óra hosszat rázatjuk. Utána ezt a 10 ml-t (1. előtenyészet) 1000 ml ugyanilyen táptalajra visszük át, és 200 ml-es részletekre osztva 1 literes Erlenmeyer lombikokban 28°C-on további 24 óra hosszat rázatjuk. (OD 1 :20 = 0,425). Ezt a 2. előtenyészetet utána 100 liter ugyanilyen táptalajhoz oltjuk egy fermentorba, és 28*0-00 18 óra hosszat fermentáljuk.
A maximális enzimszintézis a növekedés végén (késői log-fázis) van. Az előbb leírt adagból 1180 g nedves masszát nyerünk, 100 egység/liter NMH-áz (1-metil-hidantoináz) és 160 egység/liter CSH-áz (N-karbamoil-szarkozin-amidohidroláz) aktivitással.
B) Az enzim izolálása és tisztítása.
280 g Arthrobacter nedves masszából (=20 liter tenyészet) 500 egység NMH-ázt izolálunk:
Művelet Tér- fogat (ml) Egy- ség egy- ség/mg pro- tein Kiter- melés %
Lizozimos feltárás 1400 1600 0,06 100
20%-os glicerinben
Polietilénimin-lecsapás 430 1586 — 99
csapadék
Ammónium-szulfátos
frakcionális = csapadék 120 1181 0,04 73
50°C-ra melegítés
pH 8-on, felüTúszó 90 934. 0,67 58
Fenfl-Sepharose kro-
tográfia eluátuma be-
párlás után 60 830 1,20 52
DEAE-Sephacel kro-
tográfia 8 553 1,40 35
Molekulaszűrős frakcio-
nálás, Sephacryl S200 10 492 2,20 30,7
Végső preparátum adatai:
22,3 egység/ml,
10,5 mg/ml,
2,1 egység/mg protein,
50%-os glicerin, mmól/liter TRIS, pH = 8,3.
Az aktivitás meghatározást a következőképpen vé gezzük:
1. Szlnreagens**
Komponensek TES : KOH puffer (pH 7,8)
4-amino-antipirln 2,4,6-t rlbróm-3-hldroxibenzoesav Magnézlum-klorid ATP
Ammónium-szulfát CSH-áz
Szarkozin-oxidáz
Peroxldáz 2,7 egység/liter
2. 1-Metll-hldantoln oldat 10 mmól/liter.
3. A meghatározás kivitelezése:
Hullámhossz 546 nm: T » 25°C, rétegvastagság 1 cm: térfogat 2,03 ml, a képződött színezék extinkció koefficiense = 13 cm’ /pmól,
Küvettába pipettáznl
Színreagens (1) 1,88 ml
Minta* 0,05 ml összekeverni, megvárni amíg adott esetben a mintában lévő szarkozjn és N-karbamoil-szarkozin elreagál, utána hozzáadni.
-Metil-hldantolnoldat(2) 0,10ml összekeverni, extlnkciónövekedést nyomonkövetni, és ΔΕ/perc értéket meghatározni a lineáris tartományból.
* (Mintaanyag: A nyersextraktum meghatározásához a 20 mmól/liter TRIS . HCl-t (pH 8,0) valamint 0,1% Triton Χ-100-at tartalmazó 20%-os glicerinben ultrahanggal feltárt mikroorganizmusok nagy fordulatszámon centrifugált felülúszóját használjuk.
** A pH-optimum 0ásd 5. oldal 2. pont), a szubsztrátspecifitás (lásd 8. oldal 3.b pont) valamint a fémionok, aktivátorok és inhibitorok (lásd 8. és
9. oldal 4., 5. és 6. pont) vizsgálata esetében értelemszerűen vagy a megfelelő anyagok koncentrációját vagy a hozzáadott anyagok fajtáját változtatjuk.
4. Számítás egység/ml minta ’ ^'íín?3 -«aottcetben ’ végzett mintahígítás)
Megjegyzés: ΔΕ/perc nem lehet nagyobb 0,06-nál: ellenkező esetben a mintát hígítani kell. Lag-fázis körülbelül 5 perc.
2. példa
Moraxella spec. DSM 2562-t (amelyet egy szarvasrnarhalstálló-mintából Izoláltunk) az 1. példában leírt összetételű ferde agaron tartunk, és ugyanabban a táptalajban tenyésztjük, mint az Arthrobacter speciest.
Előtenyészet:
ml NMH-táptalajt (amely azonos az 1. példa szerintivel) egy 100 ml-es Erlenmeyer lombikban ferde agárról beoltunk, és 28°C-on 21 óra hosszat rázatjuk. (OD 1 :20 = 0,430).
Főtenyészet:
Egy 2 literes Erlenmeyer lombikban lévő 400 ml az 1. példában megadottal azonos NMH-táptalajt beoltunk 8 ml előtenyészettel, és 28°C-on 43 óra
Koncentráció 162 mmól/liter
0,81 mmól/liter 55 feltárt biomasszában a következő aktivitásokat mér-
jük:
8,1 mmól/liter 8,1 mmól/liter 4,3 mmól/liter Tenyészldő (óra) OD 1 :20 NMH-áz egység/liter
32 mmól/liter 24 0,415 41
1,1 egység/liter 60 28 0,495 72
6,5 egység/liter 39 0,730 57
194 303
3. példa:
Brevlbacterium species DSM 2843-t (amelyet a 2. példában említettől eltérő istálló-mintából izoláltunk) tenyésztünk úgy, mint a Moraxellát a 2. példában.
Előtenyészet
21 óra 28 C-on, OD 1 :20 = 0,690.
Főtenyészet
TenyészldŐ OD 1 :20 NMH-áz
(óra) egység/liter
15 0,440 26
24 0,550 80
39 0,670 59
43 0,750 46
4. példa
Micrococcus spec. DSM 2565-t (amelyet egy földmintából izoláltunk) tenyésztünk úgy, mint a Moraxellát a 2. példában.
Előtenyészet óra 28°C-on, OD 1 : 20 = 0,620.
Főtenyészet rációid vizes oldatai.
A ΔΕ függését a hozzáadott mintában lévő 1-metil-hidantoin mindenkori koncentrációjának függvényében az 1. ábrán ábrázoljuk.
6. példa:
N-Karbamoll-szarkozin meghatározása az 5. példában szereplő 1,1 reagenssel.
A meghatározás kivitelezése az 5. példa 1.2 pontjában leírtak szerint történik, c$ak a vizes l-metfl-hidantoin oldatok helyett történik, csak a vizes l-metfl-hidantoin oldatok helyett ekvimoláris koncentrációjú (87,7-1754 jumól/llter) N-karbamoflszarkozln mintákat használunk a tesztben.
A mért extinkcióértékeknek az N-karbamoflszarkozin koncentrációjától való függését a 2. ábrán mutatjuk be.
Az 5. példa és a 6. példa szerint mért extinkcióértékek közötti összehasonlítás azt mutatja, hogy ekvimoláris koncentrációjú l-metfl-hidantoin és N-karbamoil-szarkozin minták esetében azonos mértékű elszíneződést mérünk (3. ábra).
Tenyészidő OD 1 :20 NMH-áz
(óra) egység/liter
24 0,690 53
27,5 0,800 83
5. példa
7. példa
Enzlmatikus ultraibolya teszt 1-metfl-hldantoín meghatározására. (l-Metfl-hidantoináz)piruvát-kináz-/laktát-dehidrogenáz-reakció).
1. Enzlmatikus színteszt 1-metfl-hidantoln meghatározására.
(1 -Metfl-hidantoináz)N-karbamofl-szarkozln-amldohldroláz)szarkozin-oxidáz reakció peroxidáz(4-amino-antipirin) 2,4,6-tribróm-5-hldroxl-benzoe_ sav színindikátor-rendszerrel).
1.1 Reagensek
Komponensek Koncentráció a reagensben
TES . KOH (pH 7,8) 100
Magnézium-klorid 5
ATP 5
Ammónium-klorid 10
4-Amino-antípirin
2,4,6-tribróm-3 -hidroxlbenzoesav
-Metfl-hidantolnáz N-karbamofl-szarkozin-amjdohidroláz 2
Szarkozin-oxldáz 5
Peroxldáz 2
1.2 A meghatározás kivitelezése: Hullámhossz: 546 nra. Rétegvastagság: 10 mm. Hőmérséklet: 25°C.
Mérés reagensértékkel szemben.
A küvettába pipettáznl:
mmól/llter mmól/liter mmól/llter mmól/liter 0,5 mmól/liter 40 mmól/llter 0,15 egység/ml
7.1 Reagensek:
7.1.1.1. reagens: Komponensek
Kálium-foszfát (pH 8,0)
NADH
ATP
Foszfoenol-plruvát
Magnézium(II)-klorld
Piruvát-kináz
Laktát-dehidrogenáz
Koncentráció a reagensben mmól/llter
0,25 mmól/llter 1,30 mmól/llter 0,42 mmól/liter 2,00 mmól/llter 4 egység/ml 10 egység/ml egység/ml egység/ml egység/mlg/inl
Reakcióelegy vakértékex (RV)
1,00 ml 0,20 ml a minta kiindulási
Minta (M) Reagensvakérték (RV)
1.1 reagens 2,00 ml 2,00 ml
Minta* 0,10 ml —
Víz - 0,10 ml
összekeverni, 10 percig inkubálnl, és utána az M extinkcióját megmérni RV-vel szemben (ΔΕ). 1-Metfl-hldantoin 87,7-1754 pmól/Uter koncent55
7.1.2. 1-Metfl-hldantoináz (15 egység/ml 50%-os glicerinben, pH 8,0).
7.2 A meghatározás kivitelezése:
Hullámhossz: 365 nm.
Rétegvastagság: 10 nm.
Hőmérséklet: 25°C.
Mérés reakcióelegy-vakértékkel szemben.
A küvettába pipettáznl:
Minta (M)
I. reagens 1,00 ml
Minta*· 0,20 ml
Víz nercig inkubálnl, mém extinkcióját (Ej ,M) és a reakcióelegy-vakpróba kiindulási extinkcióját (E, rV). Utána hozzákeverendő:
NMH-áz 0,01 ml 0,01 ml
További 5-10 perc múlva mérni a minta extinkcióját (E2 ,M) és a reakclóelegy-vakérték extínkcióját (E2 ,RV).
E - (E, ,M E, jvi) - (E2 ,RV · E2 ,RV)*** ** 87,7 - 877 pmól/liter koncentrációjú 1-metfl-72
194 303
-hldantoin oldatok.
··· Megjegyzés: Amennyiben az 1 -metil-hidantolnáz készítmény még számottevő mennyiségű ATP-ázt vagy NADH-oxjdázt tartalmaz, ami az l-metfl-hidantoináz oldat hozzáadása után jelentős NADH-fogyásban jelentkezik a reakdóelegy-vakérték elegyben, az E2>m és Ea EV értékeket pontosan egyenlő időközökben kell mérni az NMH-áz hozzákeverése után (például 6 perc múlva).
A mért extinkcjókülönbségek (ΔΕ) és a mintában lévő l-metü-hldantojn mindenkori koncentrációja közötti összefüggést a 4. ábrában ábrázoljuk: az 1-metil· -hldantoin hidrolízisekor keletkező ADP-mennyiségnek a NADH moláris extinkclós koefficiensein át 365 nm-nél való számításából az ATP-felhasználás illetve az ADP-képződés reakciósztöchiometriájára az l-metfl-hldantoin-hldrolizísre vonatkoztatva 1 : 1 adódik (lásd 5. ábra).
8. példa
Enzimatíkus színteszt kreatinin meghatározására.
8.1 Reagens:
Megfelel az 5. példában leírt 1.1 reagensnek 2 egység/ml (végkoncentráció) kreatinjn-iminohidroláz hozzáadásával.
8.2 A meghatározás kivitelezése:
Az 5. példa 1.2 pontjának megfelelően, azonban mintaként 87,7 -1754 pmól/llter koncentrációjú kreatinin oldatokat használunk, és a minta és reagensvakérték esetében az inkubációs időt 20 percre meghosszabbítjuk. A ΔΕ értéknek a mintában lévő kreatinin-koncentrációtól való függését a 6. ábrán mutatjuk be.
Amennyiben a 8.1 reagensből elhagyjuk a kreatínln-iminohjdrolázt, úgy semmilyen színreakciót nem észlelünk, úgyanígy ha a 8.2 tesztelegyben a kreatinin oldatok helyett 884 pmól/liter koncentrációjú kreatin oldatot használunk mintaként.

Claims (19)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás nukleozld-trifoszfát-függő 1-metil-hidantoináz, amelynek molekulasúlya körülbelül 125.000 (SDS gradlens-gélelektroforézis), pH-optímuma 7,8 pH-nál van, KM-értéke 1-metfl-hidantolnra 0,02 mmól/liter és ATP-re 0,8 mmól/liter, előállítására, azzal jellemezve, hogy Arthrobacter spec. DSM 2563-t, DSM 2564-t, Moraxella spec. 2562-t, Micrococcus spec. DSM 2565-t vagy Brevibacterium spec. DSM 2843-t tenyésztünk, és az enzimet Izoláljuk.
  2. 2. Az 1. Igénypont szerinti eljárás, azzal j el1 emezve, hogy az enzim izolálásához a mikroorganizmust feltárjuk, az enzimet polietilénlmlnnel lecsapjuk és adott esetben ammónium-szulfátos frak dónál ássál, hőkezeléssel és kromatográ fiával tisztítjuk.
  3. 3. Eljárás kreatinin meghatározására a kreatinin kreatinin-dezjmináz E. C. 3.5.4.21-gyel 1-metfl-hldantoinná való átalakításával, azzal jelleme zv e, hogy az 1 -metfl-hldantolnt 1-metfl-hjdantoínázzal nuldeozld-trifoszfát és valamilyen többértékű fémion jelenlétében és kívánt esetben valamilyen ammónlumsó jelenlétében hidrolizáljuk, és
    a) az 1-metll-hldantolnból keletkezett hldrollzlsterméket N-karbamofl-szarkozjn-amjdohjdrolázzal reagáltatjuk szarkozin képződése közben és a szarkozint szarkozin-oxidáz vagy szarkozin-dehidrogenáz segítségével meghatározzuk vagy
    b) az egyidejűleg keletkezett nukleozid-difoszfátót meghatározzzuk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a meghatározást valamilyen pufferolt vizes oldatban 7,0 és 9,0 közötti pH-értéken hajtjuk végre.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 7,3 és 8,5 közötti pH-értéken reagálta tünk.
  6. 6. A 3-5. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakdót 10 és 500 mmól/liter közötti pufferkoncentrádónál végezzük.
  7. 7. A 6. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 50 és 200 mmól/liter közötti pufferkoncentrációt állítunk be.
  8. 8. A 3-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nuldeozid-trifoszfátként ATP-t alkalmazunk.
  9. 9. A 8. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,05-50 mmól/liter ATP-t használunk.
  10. 10. A 3-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy többértékfl fémionokként magnézium- vagy mangánionokat alkalmazunk.
  11. 11. A 10. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a magnéziumionokat magnéziumÍII)-klorid, magnézium(II)-szulfát vagy magnéziumII)-aszpartát formájában alkalmazzuk.
  12. 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,1-50 mmól/Uter kétvegyértékű fémiont használunk.
  13. 13. A 3-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,01-10 egység/ml 1-metfl-hidantoinázt használunk.
  14. 14. 3-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,1-100 mmól/ liter ammónjumsót használunk.
  15. 15. A 3-14. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 0,1-20 egység/ ml N-karbamoil-szarkozin -amidohldrolázt használunk.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1-20 egység/ml szarkozinoxidázt vagy szarkozin-dehidrogenázt használunk.
  17. 17. Reagensek kreatinin meghatározására, azzal jellemezve, hogy
    0,1-20 egység/ml kreatinln-dezlmlnázt,
    0,01-10 egység/llter 1-metfl-hidantolnázt,
    0,05-50 mmól/liter ATP-t vagy GTP-t,
    0,1-50 mmól/liter kétvegyértékű fémionokat és
    10-500 mmól/liter 7,0-9,0 ρΗ-jú pufferanyagot, valamint
    a) 0,1-20 egység/ml N-karbamofl-szarkozin-amJdo-hldrolázt,
    1-20 egység/llter szarkozin-oxidázt vagy szarkozin-dehidrogenázt és adott esetben hldrogén-peroxld vagy formaldehid meghatározására szolgáló valamilyen rendszert vagy a szarkozin-hidrogénáz-reakdó közvetlen láthatóvá tételére szolgáló valamilyen színképző elektron-akceptor-rendszert tartalmaznak vagy
    194 303
    b) ADP vagy GDP kimutatására szolgáló valamilyen rendszert tartalmaznak.
  18. 18. A 17. Igénypont szerinti reagens, azzal jellemezve, hogy kétvegyértékő fémionokként magnézium- vagy mangán-ionokat tartalmaz.
  19. 19. A 17. Igénypont b) formája szerinti reagens, azzal jellemezve, hogy az ADP kimutatás sára szolgáló rendszer piruvát-klnázból, laktát-dehldg rogenázból, foszfoenol-plruvátból és NADH-ból áll,
    6 db rajz
HU85676A 1984-02-24 1985-02-22 Process for preparing nucleoside-triphosphate-dependent 1-methylhydantoinase and process and reagent for determining creatinine HU194303B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19843406770 DE3406770A1 (de) 1984-02-24 1984-02-24 Nucleosidtriphosphat-abhaengige 1-methylhydantoinase und ihre verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT37456A HUT37456A (en) 1985-12-28
HU194303B true HU194303B (en) 1988-01-28

Family

ID=6228749

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU85676A HU194303B (en) 1984-02-24 1985-02-22 Process for preparing nucleoside-triphosphate-dependent 1-methylhydantoinase and process and reagent for determining creatinine

Country Status (15)

Country Link
US (1) US4816393A (hu)
EP (1) EP0154269B1 (hu)
JP (1) JPS60203190A (hu)
AT (1) ATE50789T1 (hu)
AU (1) AU555270B2 (hu)
CA (1) CA1261288A (hu)
CZ (1) CZ277729B6 (hu)
DD (1) DD241919A5 (hu)
DE (2) DE3406770A1 (hu)
DK (1) DK77185A (hu)
ES (1) ES8602114A1 (hu)
FI (1) FI82071C (hu)
HU (1) HU194303B (hu)
IE (1) IE58353B1 (hu)
ZA (1) ZA851352B (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4021571A1 (de) * 1990-07-06 1992-01-16 Boehringer Mannheim Gmbh N-methylhydantoinase, kloniert
DE4029844A1 (de) * 1990-09-20 1992-03-26 Boehringer Mannheim Gmbh Carbamoylsarcosinhydrolase, kloniert
DE4103220A1 (de) * 1991-02-02 1992-08-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur stabilisierung von 1-methylhydantoinase, verwendung einer stabilisierten 1-methylhydantoinase zur bestimmung eines analyten, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignete mittel
US6524837B1 (en) 1999-03-29 2003-02-25 California Institute Of Technology Hydantoinase variants with improved properties and their use for the production of amino acids
US7083939B2 (en) * 2002-05-01 2006-08-01 Polymer Technology Systems, Inc. Method for determining concentration of creatinine in a bodily fluid
US7002670B2 (en) * 2002-06-12 2006-02-21 Baxter International Inc. Optical sensor and method for measuring concentration of a chemical constituent using its intrinsic optical absorbance
EP2179051A4 (en) * 2007-07-25 2010-09-22 Richmond Chemical Corp METHOD FOR DETECTING MICROBES PRODUCING BIOFUELS
WO2017173255A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 Polymer Technology Systems, Inc. Systems and methods for electrochemical creatinine assays

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2122294C3 (de) * 1971-05-05 1979-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase
US4087329A (en) * 1975-08-28 1978-05-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Creatinine desimidase and its method of production
US4134793A (en) * 1975-08-28 1979-01-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Creatinine desimidase in the quantitative determination of creatinine
US4215197A (en) * 1978-08-04 1980-07-29 Miles Laboratories, Inc. Test means and method for creatinine determination
IT1137075B (it) * 1981-05-28 1986-09-03 Chemical Lab S R L Procedimento per la determinazione della creattinina (creatininio) in liquidi biologici, e reattivo per la sua attuazione
DE3248145A1 (de) * 1982-12-27 1984-06-28 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagenz zur bestimmung von n-carbamoylsarcosin und hierfuer geeignetes neues enzym

Also Published As

Publication number Publication date
ES540654A0 (es) 1985-12-01
DD241919A5 (de) 1987-01-07
JPS60203190A (ja) 1985-10-14
HUT37456A (en) 1985-12-28
US4816393A (en) 1989-03-28
DK77185A (da) 1985-08-25
ATE50789T1 (de) 1990-03-15
CA1261288A (en) 1989-09-26
ZA851352B (en) 1985-10-30
EP0154269A3 (en) 1987-04-22
CZ277729B6 (en) 1993-04-14
IE850331L (en) 1985-08-24
AU3895485A (en) 1985-08-29
DE3576358D1 (de) 1990-04-12
FI850732L (fi) 1985-08-25
CS121685A3 (en) 1992-06-17
JPH0373276B2 (hu) 1991-11-21
FI850732A0 (fi) 1985-02-22
ES8602114A1 (es) 1985-12-01
AU555270B2 (en) 1986-09-18
EP0154269B1 (de) 1990-03-07
DE3406770A1 (de) 1985-08-29
DK77185D0 (da) 1985-02-20
EP0154269A2 (de) 1985-09-11
FI82071C (fi) 1991-01-10
IE58353B1 (en) 1993-09-08
FI82071B (fi) 1990-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2543010T3 (es) Método y reactivo para determinar ácido mevalónico, 3-hidroximetilglutaril-coenzima A y coenzima A
EP1213358A2 (en) Method and kit for the determination of a biological component
US4135980A (en) Choline oxidase
Schobert et al. Unusual C3 and C4 metabolism in the chemoautotroph Alcaligenes eutrophus
HU194303B (en) Process for preparing nucleoside-triphosphate-dependent 1-methylhydantoinase and process and reagent for determining creatinine
US4605615A (en) L-glutamic acid oxidase (H2 O2 -generating), its production and analytical method therefor
EP0089210B1 (en) Reagent for assaying cholinsterase
WO1997031103A1 (fr) Methode de determination du 1,5-anhydroglucitol
FR2545504A1 (fr) Procede de titrage utilisant la nad-synthetase et procede de production de l'enzyme
US5821061A (en) Method and reagent for detecting a ligand in a sample
JPH0284178A (ja) Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット
US8105766B2 (en) Method of measuring pyrophosphate
EP0274425B1 (en) Pyruvate oxidase, its preparation and use
KR890004091B1 (ko) 과산화 수소를 형성하는 살코신 산화효소 및 그 제법
EP0029765B1 (en) Creatinine iminohydrolase free from urease activity, methods of preparation and use, and assay compositions and analytical elements containing same
US4960701A (en) N-acetylmannosamine dehydrogenase, process for its production, method for quantitatively analyzing N-acetylmannosamine or sialic acid, and kit for the quantitative analysis
US4546077A (en) Leucine dehydrogenase and a process for production thereof
JPH0661278B2 (ja) ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物
JP2827002B2 (ja) アシルカルニチンの測定法
JP2602505B2 (ja) ピルベートオキシダーゼ分析用組成物および分析法
JP3012356B2 (ja) フルクトキナーゼの製造法
JPS5915637B2 (ja) ピルビン酸オキシダ−ゼを用いる分析用キツトおよび分析法
JPH0428353B2 (hu)
KR19980078036A (ko) 신규 고온성 바실러스 스테아로더모필러스 bcs-2 및 이로부터 생산되는 내열성 d-알라닌 아미노펩티다아제 및 l-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제
JPH0773514B2 (ja) アンモニアの定量法

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee