ES2543010T3

ES2543010T3 - Método y reactivo para determinar ácido mevalónico, 3-hidroximetilglutaril-coenzima A y coenzima A

Info

Publication number: ES2543010T3
Application number: ES10731334.8T
Authority: ES
Inventors: Takeshi Matsuoka
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Current assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2010-01-19
Publication date: 2015-08-13
Anticipated expiration: 2030-01-19
Also published as: US20120040387A1; US20170037443A1; EP2380989A4; JP5524865B2; EP2380989A1; EP2380989B1; US9458491B2; JPWO2010082665A1; WO2010082665A1; US10975411B2

Abstract

Un método para medir una concentración de un analito en una solución de ensayo, en donde el analito es ácido mevalónico y/o 3-hidroximetilglutaril-coenzima A, que comprende las siguientes etapas (p) y (q): (p) una etapa que permite que una enzima que cataliza una reacción representada por la ecuación química 1: Ácido mevalónico + Coenzima A + 2 Aceptor de hidrógeno X → 3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + 2 Aceptor de hidrógeno reducido X (Ecuación química 1) y una enzima que cataliza una reacción representada por la ecuación química 2: Ácido mevalónico + Coenzima A + 2 Donador de hidrógeno oxidado Y → 3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + 2 Donador de hidrógeno Y (Ecuación química 2) actúen en la solución de ensayo que contiene ácido mevalónico y/o 3-hidroximetilglutaril-coenzima A en presencia de un aceptor de hidrógeno X, un donador de hidrógeno Y y coenzima A; y (q) una etapa de medición de una cantidad de: un aceptor de hidrógeno reducido X que se produce; o un donador de hidrógeno oxidado Y que se produce; o un aceptor de hidrógeno X que disminuye; o un donador de hidrógeno Y que disminuye, en donde el donador de hidrógeno Y y el aceptor de hidrógeno reducido X no son el mismo.

Description

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reacción inversa de la reacción representada por la ecuación química 11. Por lo tanto, se pueden usar todas las HMGR previamente descritas, tales como las HMGR presentes en mamíferos tales como seres humanos, ratones y ratas, levaduras, arqueas, eubacterias, y similares, en el método de medición de la presente invención. Además, como con el método de medición en el ejemplo 1 descrito más adelante, la actividad de la HMGR se puede determinar usando el reactivo de medición A. Puesto que la presencia o ausencia de la HMGR en un extracto de un tejido, una célula o similar se pueden confirmar fácilmente por esta medición, se puede descubrir una HMGR nueva, y la HMGR nueva se puede usar como la HMGR de la presente invención. Como HMGR nuevas, los autores de la invención descubrieron HMGR obtenidas de los géneros de Pseudomonas, Variovorax, Delftia, Comamonas, y Archaeoglobus, más específicamente, HMGR obtenidas de Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063), Variovorax sp. 5-MV (FERM BP-11064), Delftia sp. 12-MV (FERM BP-11065), y Comamonas sp. 25-MV (FERM BP-11066).

Específicamente, la presente invención proporciona las cebas bacterianas mencionadas antes, Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063), Variovorax sp. 5-MV (FERM BP-11064), Delftia sp. 12-MV (FERM BP-11065), y Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066) y mutantes de estas cepas bacterianas cuyas secuencias de ADNr 16S tienen una homología de 95% o mayor, preferiblemente 97% o mayor, más preferiblemente 98% o mayor, además preferiblemente 98,5% o mayor, en particular preferiblemente 98,7% o mayor, que la de cualquiera de estas cepas bacterianas y que tienen una capacidad para producir una proteína que tiene una actividad de catálisis de la reacción de la ecuación química 1 o 2. Se sabe en general que las cepas bacterianas que tienen una secuencia de ADNr 16S de 97% o mayor, en particular, 98,7% o mayor homología, es muy probable que pertenezcan a la misma especie (Microbiology Today 2006; 33: 152-155).

Además, como enzima que cataliza las reacciones representadas por las ecuaciones químicas 1 y 2, también se puede usar una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos (si la HGMR tiene una dominio de transmembrana, preferiblemente una secuencia de aminoácidos que excluye una secuencia para la parte del dominio de transmembrana) que tiene una homología de 60% o mayor, preferiblemente 75% o mayor, más preferiblemente 90% o mayor, con la de un HMGR conocida (por ejemplo, HMGR mostrada en la tabla 1 de Genome Biol. 2004; 5(11): 248) y que cataliza las reacciones representadas por las ecuaciones químicas 1 y 2. Por ejemplo, las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 3 tienen actividad de HMGR y por lo tanto, se pueden usar estas proteínas. Además, también se pueden usar enzimas que catalizan las reacciones representadas por las ecuaciones químicas 1 y 2 que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye eliminación, adición y/o sustitución de uno o varios (por ejemplo de 1 a 9, más preferiblemente de 1 a 5) aminoácidos en una secuencia de aminoácidos obtenida por modificación de una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos de HMGR, o cualquiera de dichas secuencias de aminoácidos con la que se fusiona otra proteína o péptido para mejorar características tales como reactividad, estabilidad, productividad, y eficacia de purificación. También se pueden usar enzimas que catalizan las reacciones representadas por las ecuaciones químicas 1 y 2 que se obtienen por modificación química de HMGR con PEG o similares, o polimerización de HMGR para mejorar las características tales como reactividad y estabilidad. Cuando un inhibidor de la HMGR humana, tal como un fármaco de estatina, está contenido en una solución de ensayo, se puede usar HMGR que no es inhibida por el inhibidor o es inhibida en una cantidad mínima (por ejemplo, la HMGR que no deriva de seres humanos, HMGR alterada, HMGR modificada o similares), o se puede usar una concentración alta de HMGR de modo que la reacción no es afectada por el inhibidor. Por ejemplo, se puede usar la HMGR derivada de Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063), porque está HMGR no es inhibida por la mevastatina o mevinolina.

Cuando la HMGR se usa como una enzima que cataliza las reacciones representadas por las ecuaciones químicas 1 y 2, la HMGR se puede producir de acuerdo con técnicas conocidas para los expertos en la técnica como se describe más adelante. Por ejemplo, se cultivan levaduras, arqueas, eubacterias y similares que producen HMGR para acumular HMGR en las células o para secretar HMGR en el caldo de cultivo, y después la HMGR se puede purificar de acuerdo con un método de purificación de enzimas. Las levaduras, hongos, arqueas, eubacterias y similares que producen HMGR se pueden cultivar en un medio adecuado para aumentar la cantidad de HMGR producida (un medio en el que se añaden extractos de levadura, fuentes de nitrógeno tales como cloruro amónico, fuentes de carbono tales como glucosa, sales y similares, en combinación, y si es necesario se añaden aditivos que pueden aumentar la producción de HMGR, tales como ácido mevalónico) en condiciones de cultivo adecuadas (se establecen el pH adecuado, temperatura, cantidad de oxígeno disuelto, y tiempo de cultivo). Los organismos genéticamente modificados que producen HMGR de forma eficaz, se pueden preparar preparando un fragmento en el que el gen de la HMGR se coloca en la dirección 3’ de un promotor adecuado, conectando el fragmento a un plásmido de replicación autónoma, e introduciendo el plásmido en una bacteria tal como Escherichia coli, una levadura, un hongo, una célula de insecto, una célula de mamífero, y similares, o incorporando el fragmento en el ADN cromosómico de una bacteria tal como Escherichia coli, una levadura, un hongo, una célula de insecto o una célula de mamífero. Los genes y promotores de la HMGR se pueden obtener por clonación genómica de ADN o ADNc de organismos que tienen estos genes y promotores, usando métodos conocidos o sintetizando químicamente estos genes y promotores basándose en información de secuencia. Por ejemplo, la HMGR se puede expresar en una Escherichia coli recombinante preparando un fragmento en el que el gen de la HMGR está unido en la dirección 3’ de promotores inducibles, tales como el promotor lac, promotor trp, promotor PL, y promotor T7, o promotores no inducibles, tales como promotor de piruvato oxidasa (en lo sucesivo denominado también promotor POP; véase la SEQ ID NO: 4 y bibliografía de patente 6), incorporando el fragmento en plásmidos multicopia de replicación autónoma, tales como pUC18 y pHSG396, e introduciendo plásmidos en Escherichia coli. Para purificar el HMGR

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la medición la suma de las concentraciones de ambas sustancias, pero no se puede obtener la concentración de MVA o HMG-CoA solo. Por consiguiente, cuando están presentes el MVA y la HMG-CoA en una solución de ensayo, y se va a medir la concentración de HMG-CoA sola, es conveniente que: 1) se preparen dos muestras, es decir, una muestra de la que se ha separado la HMG-CoA en la solución de ensayo y una muestra de la que no se ha separado la HMG-CoA, y se permite que actúe una enzima que cataliza las reacciones representada por las ecuaciones químicas 1 y 2 en ambas muestras, y la concentración de HMG-CoA en la solución de ensayo se calcula a partir de la diferencia entre estas mediciones; o 2) la etapa de separar el MVA de la solución de ensayo se lleve a cabo antes de la etapa de permitir que actúe una enzima que cataliza las reacciones representada por las ecuaciones químicas 1 y 2, en la solución de ensayo. El aparatado 1) anterior se puede llevar a cabo preparando una muestra obtenida separando la HMG-CoA de la solución de ensayo mediante la etapa de separación de la HMG-CoA de una solución de ensayo descrita más adelante. La etapa de separar el MVA de la solución de ensayo del apartado 2) anterior no está particularmente limitada siempre que el MVA se pueda separar sin separar la HMG-CoA, que es el analito. Por ejemplo, se puede usar un método de tratamiento de una solución de ensayo con un adsorbente específico para el MVA o una membrana selectiva para el MVA, un método de conversión del MVA en una sustancia que no está implicada en la reacción representada por la ecuación química 1, y similares. Los ejemplos del método de conversión del MVA en una sustancia que no está implicada en la reacción representada por la ecuación química 1, incluye métodos que usan una reacción enzimática. Por ejemplo, como se muestra en la siguiente ecuación química 21:

Esquema 27

Ácido mevalónico + ATP → Fosfato de ácido mevalónico + ADP (Ecuación química 21)

el MVA se convierte en fosfato de ácido mevalónico, que no está implicado en la reacción representada por la ecuación química 1, usando una enzima en presencia de un donador de fosfato tal como el ATP y un ion magnesio o un ion manganeso. Los ejemplos de la enzima incluyen la mevalonato quinasa (EC2.7.1.36: en lo sucesivo denominada MVK). En la etapa de separar el MVA mediante una reacción enzimática se pueden optimizar el pH, tampón, concentración de sales y similares de la mezcla de reacción. Además, se pueden añadir fosfomevalonato quinasa (EC2.7.4.2), que fosforila más el fosfato del ácido mevalónico producido por la ecuación química 21, fosfoenolpiruvato y piruvato quinasa para separar el ADP, o glucosa y hexoquinasa dependiente de ADP, según sea necesario.

Cuando se lleva a cabo la etapa de separar el MVA en una solución de ensayo usando una reacción enzimática (por ejemplo, MVK) como se ha descrito antes, y la solución de ensayo se somete como está a una reacción cíclica enzimática representada por una combinación de las ecuaciones químicas 1 y 2, la enzima mencionada antes (por ejemplo MVK) actúa sobre el MVA que se convierte en HMG-CoA por la ecuación química 2. Por lo tanto, después de la etapa de separar el MVA de la solución de ensayo usando una reacción enzimática es deseable separar la enzima usada o terminar la reacción de la enzima. Por ejemplo, la enzima se puede separar por ultrafiltración usando una membrana. Cuando la enzima es MVK, por ejemplo, la MVK se puede separar sin separar la HMG-CoA por ultrafiltración usando una membrana que tiene un corte de exclusión de peso molecular de 5000 a 30.000. Además, para terminar la reacción de la enzima, se pueden usar métodos para inactivar la enzima requerida sin degradar la HMG-CoA, tales como tratamiento con calor, tratamiento con ácido, tratamiento con álcali y la adición de una sustancia que inactiva la enzima, métodos de añadir una sustancia que inhibe la actividad de una enzima prevista (por ejemplo, MVK) pero no inhibe la actividad de una enzima que cataliza las reacciones de las ecuaciones químicas 1 y 2 (por ejemplo, HMGR) a la mezcla de reacción, y similares. Los ejemplos de una sustancia que inhibe una reacción de la MVK, pero no inhibe una reacción cíclica enzimática de la HMGR, incluyen agentes quelantes que forman un quelato con un ion magnesio (por ejemplo, EDTA, EGTA y NTA). De los métodos mencionados antes de separación de una enzima o métodos de terminación de la reacción de la enzima, son preferidos los métodos que usan tratamiento con álcali y los métodos de adición de un agente quelante, porque no se requiere un procedimiento de aislamiento, y se pueden llevar a cabo una serie de procedimientos en el mismo recipiente de reacción usando un analizador automático. La expresión “procedimiento de aislamiento” usado en la presente memoria, se refiere a un procedimiento de cromatografía en columna, un procedimiento de filtración con membrana, un procedimiento de aislamiento por adsorción, un procedimiento de aislamiento por extracción, un procedimiento de aislamiento por precipitación, y similares, que se llevan a cabo durante una serie de etapas de medición de la HMG-CoA en una solución de ensayo.

La enzima que se puede usar en la etapa de separación del MVA no está limitada siempre que la enzima pueda convertir el MVA en una sustancia que no está implicada en la reacción representada por la ecuación química 1. Por ejemplo, se puede usar una enzima que cataliza la reacción representada por la ecuación química 21. Los ejemplos específicos de dichas enzimas incluyen MVK derivadas de mamíferos tales como seres humanos, ratones y ratas, de eucariotas tales como levaduras y de procariotas tales como Enterococcus faecalis. Además las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de homología de 60% o mayor, preferiblemente 75% o mayor, más preferiblemente 90% o mayor con las secuencias de aminoácidos de las MVK y que pueden separar el MVA por una reacción enzimática, también se pueden seleccionar y usar adecuadamente como las enzimas, teniendo en cuenta la estabilidad, reactividad, productividad y similares, de estas enzimas. Por ejemplo, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 derivada de Saccharomyces cerevisiae (Curr. Genet. 1991 Jan; 19[1]: 9-14) es una enzima que cataliza la reacción representada

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reacción del blanco disminuye, y mejora la relación S/N, y por lo tanto, se mejora la sensibilidad de la medición.

Cuando están presentes tanto el MVA como la HMG-CoA en una solución de ensayo en el método de medición de acuerdo con la presente invención, y solo se va a medir la concentración de MVA: 1) se preparen dos muestras, es decir, una muestra obtenida separando el MVA de la solución de ensayo y una muestra de la que no se ha separado el MVA, y se permite que actúe una enzima que cataliza las reacciones representada por las ecuaciones químicas 1 y 2 en ambas muestras, y la concentración de MVA en la solución de ensayo se calcula a partir de la diferencia entre las cantidades medidas de estas muestras; o 2) es conveniente llevar a cabo la etapa de separar la HMG-CoA de la solución de ensayo antes de la etapa de permitir que actúe una enzima que cataliza las reacciones representada por las ecuaciones químicas 1 y 2, en la solución de ensayo. En el aparatado 1) anterior, una muestra obtenida separando el MVA de la solución de ensayo se puede preparar usando la etapa de separación de MVA descrita antes de la solución de ensayo. La etapa de separar la HMG-CoA de la solución de ensayo para el apartado 2) anterior no está particularmente limitada siempre que la HMG-CoA se pueda separar sin separar el MVA, que es el analito, y los ejemplos de los mismos incluyen métodos de tratamiento de una solución de ensayo con un adsorbente específico para la HMG-CoA o una membrana selectiva para la HMG-CoA y métodos de conversión de la HMG-CoA en una sustancia que no está implicada en la reacción representada por la ecuación química 2. Los ejemplos de los métodos de conversión de la HMG-CoA en una sustancia que no está implicada en la reacción representada por la ecuación química 2, incluye métodos que usan una reacción enzimática. Los ejemplos de métodos que usan una reacción enzimática incluyen, un método de conversión de la HMG-CoA en ácido acetoacético y acetil-coenzima A usando una enzima tal como la hidroximetilglutaril-coenzima A liasa (EC4.1.3.4: en lo sucesivo denominada HMGL), como se muestra en la siguiente ecuación química 22:

Esquema 28

3-Hidroximetilglutaril-coenzima A → ácido acetoacético + acetil-coenzima A (Ecuación química 22)

un método de conversión de la HMG-CoA en ácido 3-hidroximetilglutárico y coenzima A usando una enzima tal como la hidroximetilglutaril-coenzima A hidrolasa (EC3.1.2.5), como se muestra en la siguiente ecuación química 23:

Esquema 29

3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + H2O → ácido 3-hidroximetilglutárico + coenzima A (Ecuación química 23);

y un método de conversión de la HMG-CoA en acetil-coenzima A y acetoacetil-coenzima A usando una enzima tal como la hidroximetilglutaril-coenzima A sintasa (EC2.3.3.10), como se muestra en la siguiente ecuación química 24:

Esquema 30

3-Hidroximetilglutaril-coenzima A + coenzima A → acetoacetil-coenzima A + acetil-coenzima A + H2O (Ecuación química 24).

En la etapa de separar la HMG-CoA por una reacción enzimática, se pueden optimizar el pH, tampón, concentración de sales, y similares de la mezcla de reacción. Además, se puede añadir si es necesario una enzima que actúa además en un producto (por ejemplo, ácido acetoacético descarboxilasa (EC4.1.1.4), que degrada el ácido acetoacético producido por la ecuación química 22, en dióxido de carbono y ácido acético).

Cuando se lleva a cabo la etapa de separar la HMG-CoA de una solución de ensayo usando una reacción enzimática (por ejemplo, HMGL) como se ha descrito antes, y la solución de ensayo se somete como está a una reacción cíclica enzimática representada por una combinación de las ecuaciones químicas 1 y 2, la enzima mencionada antes (por ejemplo HMGL) actúa sobre la HMG-CoA que se convierte en MVA por la ecuación química

1. Por lo tanto, después de la etapa de separar la HMG-CoA de la solución de ensayo usando una reacción enzimática, es deseable separar la enzima usada o terminar la reacción de la enzima. Por ejemplo, la enzima se puede separar por ultrafiltración usando una membrana. Cuando la enzima es HMGL, por ejemplo, la HMGL se puede separar por ultrafiltración usando una membrana que tiene un corte de exclusión de peso molecular de 5000 a 30.000, sin separar el MVA. Además, para terminar la reacción de la enzima, se pueden usar métodos para inactivar una enzima prevista sin degradar el MVA, tales como tratamiento con calor, tratamiento con ácido, tratamiento con álcali y la adición de una sustancia que inactiva la enzima, métodos de añadir una sustancia que inhibe la actividad de una enzima prevista (por ejemplo, HMGL) pero no inhibe la actividad de una enzima que cataliza las reacciones representadas por las ecuaciones químicas 1 y 2 (por ejemplo, HMGR) a la mezcla de reacción, y similares. De los métodos mencionados antes de separación de la enzima o de terminación de la reacción de la enzima, se prefiere el método por tratamiento con álcali, porque no se requiere un procedimiento de aislamiento, y se pueden llevar a cabo una serie de procedimientos en el mismo recipiente de reacción usando un analizador automático. La expresión “procedimiento de aislamiento” usado en la presente memoria, se refiere a un procedimiento de cromatografía en columna, un procedimiento de filtración con membrana, un procedimiento de aislamiento por adsorción, un procedimiento de aislamiento por extracción, un procedimiento de aislamiento por precipitación, y similares, durante una serie de etapas de medición del MVA en una solución de ensayo.

La enzima que se puede usar en la etapa de separar la HMG-CoA no está limitada siempre que la enzima pueda

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convertir la HMG-CoA en una sustancia que no está implicada en la reacción representada por la ecuación química

2. Por ejemplo, se pueden usar las enzimas mencionadas antes que catalizan las reacciones representadas por las ecuaciones químicas 22 a 24. Los ejemplos específicos de dichas enzimas incluyen HMGL obtenida de mamíferos, tales como seres humanos, ratones y ratas, y de procariotas tales como Pseudomonas mevalonii. Además las proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de homología de 60% o mayor, preferiblemente 75% o mayor, más preferiblemente 90% o mayor con las secuencias de aminoácidos de estas HMGL y que puedan separar la HMG-CoA por una reacción enzimática, también se pueden seleccionar y usar adecuadamente como las enzimas, teniendo en cuenta la estabilidad, reactividad, productividad y similares, de estas enzimas. Por ejemplo, los autores de la invención encontraron que una proteína derivada de Pseudomonas putida KT2440 (ATCC47054) que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, que tiene una homología de 60% con la HMGL derivada de Pseudomonas mevalonii que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (J Bacteriol. 1989 Dec; 171(12): 6468-72), es una enzima que cataliza la reacción representada por la ecuación química 22. Por lo tanto, se puede usar esta enzima. Además, también se puede usar una enzima que pueda separar la HMG-CoA por una reacción enzimática, y que se obtenga por modificación de una secuencia de nucleótidos o una secuencia de aminoácidos de la HMGL para incluir eliminación, adición y/o sustitución en la secuencia de aminoácidos, para así mejorar características tales como la reactividad, estabilidad, productividad y eficacia de la purificación. También se pueden usar enzimas que pueden separar la HMG-CoA por una reacción enzimática, en la que la HMGL es modificada químicamente con PEG o similar, o se polimeriza para mejorar características tales como la reactividad y estabilidad.

Las enzimas que se pueden usar en la etapa de separar la HMG-CoA, se pueden producir de acuerdo con técnicas conocidas para los expertos en la técnica, como se ha descrito antes sobre la producción de HMGR. Por ejemplo, la HMGL se produce por cultivo de levaduras, arqueas, eubacterias y similares, que producen HMGL para acumular HMGL en las células o secretar la HMGL en el caldo de cultivo, y después la HMGL se puede purificar de acuerdo con métodos comunes de purificación de enzimas.

Cuando se usa una reacción enzimática en la etapa de separar la HMG-CoA de una solución de ensayo, se pueden seleccionar adecuadamente como componentes ácidos, álcalis, componentes de tampones, sales, tensioactivos, agentes quelantes, iones metálicos, sacáridos, aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, colorantes, alcoholes, polioles, disolventes orgánicos, conservantes y similares, y añadir en cantidades adecuadas a la mezcla de reacción además de una enzima, de modo que la HMG-CoA debe ser separada de forma adecuada por la enzima y se pueden evitar influencias de impurezas derivadas de materias primas que constituyen la solución de ensayo y la mezcla de reacción.

Cuando se usa una reacción enzimática en la etapa de separar el MVA de una solución de ensayo, las condiciones de reacción se pueden ajustar de forma adecuada. Por ejemplo, se puede usar como temperatura de reacción de 20ºC a 55ºC, preferiblemente de 25ºC a 45ºC, más preferiblemente de 30ºC a 40ºC, se puede usar como tiempo de reacción de 0,5 min a 24 horas, preferiblemente de 1 min a 30 min, más preferiblemente de 1 min a 5 min, y se puede usar como pH un pH de 6,0 a 11,0, preferiblemente pH de 7,5 a 11,0, más preferiblemente pH de 8,5 a 10,5. Además, la concentración de un componente de tampón en el volumen total de la mezcla de reacción puede ser de 0,1 a 500 mM, preferiblemente de 1 a 100 mM, más preferiblemente de 3 a 50 mM, por ejemplo, cuando se usa el tampón de Tris, tampón de Hepes, tampón de fosfato, tampón de carbonato, tampón de glicina, tampón de CAPS o tampón de CAPSO. La concentración de HMGL puede ser de 0,01 a 1000 U/ml, preferiblemente de 0,1 a 10 U/ml. Aquí, una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de una enzima necesaria para disminuir 1 micromol de NADH por minuto a 37ºC, en presencia de HMG-CoA, NADH, y 3-hidroxibutirato deshidrogenasa.

Cuando la reacción enzimática se termina por tratamiento con álcali después de usar una reacción enzimática en la etapa de separar la HMG-CoA de una solución de ensayo, por ejemplo, se añade NaOH a la mezcla de reacción en una concentración de 0,01 a 0,5 M, preferiblemente de 0,02 a 0,2 M para ajustar el pH a un nivel mayor y de esta forma inactivar la enzima. Después de 0,1 a 10 minutos, preferiblemente de 0,5 a 5 min, se añade a la mezcla de reacción un tampón tal como glicina, en una concentración de 0,01 a 0,5 M, preferiblemente de 0,02 a 0,2 M, y se añade a la mezcla de reacción un ácido tal como ácido cítrico en una concentración de 0,005 a 0,1 M, preferiblemente de 0,01 a 0,05 M, para ajustar el pH, de modo que pueda reaccionar la enzima que cataliza las reacciones representadas por las ecuaciones químicas 1 y 2. Después, se deja que actúe la enzima que cataliza las reacciones representadas por las ecuaciones químicas 1 y 2, y se puede medir la concentración de MVA.

Cuando la HMG-CoA está contenida en un reactivo de medición para medir el MVA y/o HMG-CoA, se puede usar la técnica mencionada antes para separar la HMG-CoA y obtener un reactivo de medición que no contiene sustancialmente HMG-CoA. Cuando se usa, por ejemplo HMGL en la técnica mencionada antes: se puede usar una técnica de llevar a cabo una reacción enzimática que usa de 1 a 100 días, preferiblemente de 1 a 30 días como tiempo de reacción, de 2ºC a 20ºC como la temperatura de la reacción, y de 0,0001 a 1 U/ml como la concentración de HMGL; o una técnica de llevar a cabo una reacción enzimática que usa de 1 min a 3 h como tiempo de reacción, de 25ºC a 40ºC como la temperatura de reacción, y de 0,001 a 10 U/ml como la concentración de HMGL (por ejemplo, véase el ejemplo 20 descrito más adelante). Cuando el reactivo de medición así obtenido se usa para medir el MVA y/o HMG-CoA, la reacción del blanco disminuye, y mejora la relación S/N, y por lo tanto, mejora la sensibilidad de la medición.

La presente invención también proporciona reactivos de medición para medir el MVA, HMG-CoA o CoA. En la

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adecuadamente en dos teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo. Por ejemplo, el reactivo consiste en: un reactivo que contiene al menos HMGR, CoA y T-NAD; y un reactivo que contiene al menos NADH. Cuando el reactivo consiste en 3 reactivos, los 4 componentes mencionados antes se dividen en tres. Por ejemplo, el reactivo puede consistir en: un reactivo que contiene al menos HMGR y T-NAD; un reactivo que contiene al menos CoA; y un reactivo que contiene al menos NADH. Cuando el reactivo consiste en 4 reactivos, los 4 componentes mencionados antes se dividen en cuatro. Por ejemplo, el reactivo puede consistir en: un reactivo que contiene al menos HMGR; un reactivo que contiene al menos T-NAD; un reactivo que contiene al menos CoA; y un reactivo que contiene al menos NADH.

Por ejemplo, cuando tanto el MVA como la HMG-CoA están presentes en una solución de ensayo, un reactivo para medir la concentración solo de HMG-CoA puede consistir en 2 a 4 reactivos. Cuando el reactivo consiste en 2 reactivos, 4 componentes de HMGR, CoA, NADH y T-NAD se dividen adecuadamente en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 21 catalizada por la MVK; y un segundo reactivo que contiene al menos un componente para terminar la reacción catalizada por la MVK; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares, de modo que una reacción cíclica enzimática empieza cuando se añade el segundo reactivo. Por ejemplo, el reactivo puede ser compuesto, de modo que el primer reactivo debe contener MVK, ATP y cloruro de magnesio, y el segundo reactivo debe contener EDTA, HMGR, CoA, NADH y T-NAD. Cuando el reactivo consiste en 3 reactivos, 4 componentes de HMGR, CoA, NADH y T-NAD se pueden dividir en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial que permite que avance la reacción representada por la ecuación química 21 catalizada por la MVK; y un segundo reactivo que contiene al menos un componente para terminar la reacción catalizada por la MVK; y un tercer reactivo que contiene un componente que permite que empiece una reacción cíclica enzimática después de la adición del tercer reactivo; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares. Alternativamente, cuando el reactivo consiste en 3 reactivos, 4 componentes se pueden dividir adecuadamente en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 21 catalizada por la MVK; y un tercer reactivo que contiene al menos un componente para terminar la reacción catalizada por la MVK y un componente que permite que empiece una reacción cíclica enzimática después de la adición del tercer reactivo; y un segundo reactivo que contiene otros componentes; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares. Cuando el reactivo consiste en 4 reactivos, 4 componentes de HMGR, CoA, NADH y T-NAD se pueden dividir en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 21 catalizada por la MVK; un segundo reactivo que contiene al menos un componente para terminar la reacción catalizada por la MVK; un cuarto reactivo que contiene un componente que permite que empiece una reacción cíclica enzimática después de la adición del cuarto reactivo; y un tercer reactivo que contiene otros componentes; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares. Alternativamente, cuando el reactivo consiste en 4 reactivos, los 4 componentes se pueden dividir en un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 21 catalizada por la MVK; un tercer reactivo que contiene al menos un componente para terminar la reacción catalizada por la MVK; un cuarto reactivo que contiene un componente que permite que empiece una reacción cíclica enzimática después de la adición del cuarto reactivo; y un segundo reactivo que contiene otros componentes; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares. Alternativamente, cuando el reactivo consiste en 4 reactivos, los 4 componentes se pueden dividir en un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 21 catalizada por la MVK; un cuarto reactivo que contiene al menos un componente para terminar la reacción catalizada por la MVK; y un componente para permitir que empiece una reacción cíclica enzimática después de la adición del cuarto reactivo; y un segundo reactivo y un tercer reactivo que contienen otros componentes; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares.

Por ejemplo, cuanto están presentes tanto el MVA como la HMG-CoA en una solución de ensayo, un reactivo para medir la concentración de solo el MVA puede consistir en 2 a 4 reactivos. Cuando el reactivo consiste en 2 reactivos, 4 componentes de HMGR, CoA, NADH y T-NAD se dividen adecuadamente en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 22 catalizada por la HMGL; y un segundo reactivo que contiene al menos un componente para inactivar la HMGL y un componente para permitir que empiece la reacción cíclica enzimática después de la adición del segundo reactivo; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares. Cuando el reactivo consiste en 3 reactivos, 4 componentes de HMGR, CoA, NADH y T-NAD se pueden dividir en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 22 catalizada por la HMGL; un segundo reactivo que contiene al menos un componente para inactivar la HMGL; y un tercer reactivo que contiene un componente para permitir que empiece la reacción cíclica enzimática después de la adición del tercer reactivo; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares. Alternativamente, cuando el reactivo consiste en 3 reactivos, 4 componentes se pueden dividir en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 22 catalizada por la HMGL; un tercer reactivo que contiene al menos un componente para inactivar la HMGL y un componente que permite que empiece una reacción cíclica enzimática después de la adición del tercer reactivo; y un segundo reactivo que contiene otros componentes; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares. Cuando el reactivo consiste en 4 reactivos, 4 componentes de HMGR, CoA, NADH y T-NAD se pueden dividir en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 22 catalizada por la HMGL; un segundo reactivo que contiene al menos un componente para inactivar la HMGL; un cuarto reactivo que

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contiene un componente que permite que empiece una reacción cíclica enzimática después de la adición del cuarto reactivo; y un tercer reactivo que contiene otros componentes; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares. Por ejemplo, cuando el reactivo consiste en 4 reactivos, el reactivo puede consistir en; un primer reactivo que contiene HMGL; un segundo reactivo que contiene hidróxido sódico; un tercer reactivo que contiene componentes de tampones, ácidos, HMGR, CoA y T-NAD; y un cuarto reactivo que contiene NADH. Alternativamente, cuando el reactivo consiste en 4 reactivos, los 4 componentes se pueden dividir en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 22 catalizada por la HMGL; un tercer reactivo que contiene al menos un componente para inactivar la HMGL; un cuarto reactivo que contiene un componente que permite que empiece una reacción cíclica enzimática después de la adición del cuarto reactivo; y un segundo reactivo que contiene otros componentes; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares. Alternativamente, cuando el reactivo consiste en 4 reactivos, los 4 componentes se pueden dividir en: un primer reactivo que contiene al menos un componente esencial para permitir que avance la reacción representada por la ecuación química 22 catalizada por la HMGL; un cuarto reactivo que contiene al menos un componente para inactivar la HMGL y un componente para permitir que empiece una reacción cíclica enzimática después de la adición del cuarto reactivo; y un segundo reactivo y un tercer reactivo que contienen otros componentes; teniendo en cuenta la estabilidad del reactivo y similares.

En general, cuando la cantidad de una sustancia A presente en una solución de ensayo se mide usando un reactivo de medición, convirtiendo la cantidad en la intensidad de una señal tal como absorbancia, la cantidad de luminiscencia o la cantidad de electricidad, es necesaria una curva de calibración obtenida usando una solución de ensayo que contiene una cantidad conocida de la sustancia A (denominada “calibrador”). La curva de calibración representa la relación entre la intensidad de la señal y la concentración de la sustancia A. Por lo tanto, en un laboratorio habitual, una cantidad desconocida de una sustancia A en una solución de ensayo se mide no solo usando los reactivos de medición sino también un calibrador.

Cuando la cantidad de una sustancia A se mide en diferentes laboratorios, puede haber una diferencia entre las cantidades de la sustancia A en una solución de ensayo medida en un “laboratorio a” y las cantidades medidas en un “laboratorio b”. Esta diferencia se produce debido a las diferencias en los reactivos de medición y los propios procedimientos de medición, aparatos de medición, calibradores, medidores, y similares. Es necesario minimizar estas diferencias entre laboratorios en laboratorios clínicos y similares, en la práctica médica. Para minimizar estas diferencias entre laboratorios es suficiente establecer la trazabilidad de la medición de una sustancia A, es decir, establecer un material de referencia de la sustancia A y método estándar para medir la sustancia A, asignar el valor de la concentración de la sustancia A presente en un calibrador usado habitualmente basado en el material de referencia y el método estándar para medir la sustancia por un método de medición rutinario (Clin Chem. 2009 Jun; 55(6): 1067-75).

Aquí, para establecer la trazabilidad de la medición del MVA, es necesario establecer primero un material de referencia y un método de medición estándar. En relación con esto, no se conoce la pureza exacta del MVA y D,L-MVA (por ejemplo, D-Mevalonolactona [Código de producto M1374] de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd y (±)-Mevalonolactona [lactona del ácido DL-mevalónico] [Número de producto M4667] de Sigma) comercializados como reactivos generales. Como métodos de medición de su pureza, solo se conocen métodos con especificidad baja, tales como valoración, métodos que no pueden medir cantidades absolutas sin un material de referencia, tales como cromatografía de gases (GC), métodos que usan polarimetría o RMN que mide solo la relación de contenido de isómeros ópticos (J. Lipid Res., mayo 1982; 23 (4): 645-52), y un método de medición de la disminución de NADH por acoplamiento de la piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa a MVK (Methods Enzymol. 1969; 15: 393-454), que parece que tiene una precisión inadecuada como se describe más adelante. Por lo tanto, no ha habido un material de referencia o método de medición estándar adecuados. Por consiguiente, como candidato de método de medición estándar, los autores de la invención han desarrollado dos métodos para medir una cantidad precisa de MVA basada en el coeficiente de absorbancia del NAD(P)H en un sistema de reacción en el que aumenta el NAD(P)H, usando la especificidad enzimática.

Un método es un método que usa las reacciones representadas por la ecuación química 21 usando MVK:

Esquema 31

Ecuación química 25 usando hexoquinasa dependiente de ADP (glucoquinasa específica de ADP [EC2.7.1.47]):

Esquema 32

Glucosa + ADP → Glucosa-6-fosfato + AMP (Ecuación química 25)

Ecuación química 26 usando glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (EC1.1.1.49):

Esquema 33

Glucosa-6-fosfato + NAD(P) → 6-Fosfogluconolactona + NAD(P)H (Ecuación química 26)

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Internacionales del Instituto Nacional de Ciencia Industrial y Tecnología (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón 13 de noviembre, 2008.

Tabla 1

Temperatura de cultivo (°C): 30

forma de varilla (0,6-0,7 x 0,9-1,2 µm)

Tinción Gram: -

Formación de esporas: -

Movilidad: +

Morfología de la colonia: Medio Tiempo de cultivo Diámetro Color Forma Elevación Borde Textura de la superficie Transparencia Consistencia nutriente agar 48 h 1,0-2,0 mm Amarillo claro Redonda Convexa Entero Lisa Opaca Mantecosa

Ensayo de temperatura de crecimiento: 4 +

(°C): 37 +

41: -

45: -

Reacción de catalasa: +

Reacción de oxidasa: +

Producción de ácido y/o gas a partir de glucosa: -/-

Ensayo de Oxidación/Fermentación (O/F): -/-

Lecitinasa: -

Producción de pigmento fluorescente en medio King B: +

Ensayos bioquímicos: Reducción de nitrato -

Producción de indol: -

Acidificación de glucosa: -

Arginina dihidrolasa: +

Ureasa: -

Hidrólisis de esculina: -

Hidrólisis de gelatina: -

β-Galactosidasa: -

Citocromo oxidasa: +

Ensayos de asimilación: Glucosa +

L-Arabinosa: +

D-Manosa: +

D-Manitol: +

N-Acetil-D-glucosamina: -

Maltosa: -

Gluconato de potasio: +

Ácido n-cáprico: +

Ácido adípico: -

Ácido dl-málico: +

Citrato sódico: +

Acetato de fenilo: +

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Producción de HMGR derivado de Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063)

Se prepararon 3 matraces Erlenmeyer que contenía cada uno 167 ml de medio A, y se inoculó aproximadamente una tercera parte de una colonia de Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063) en cada uno de los matraces. Las bacterias se cultivaron en estos matraces Erlenmeyer a 28ºC durante aproximadamente 18 h con agitación. Después

10 del cultivo, el caldo de cultivo se centrifugó (8 krpm, 20 min) para recoger las bacterias, y las células bacterianas se suspendieron en 30 ml de tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 7,5), se alteraron por ultrasonidos y se solubilizaron. Después de la solubilización, la solución se centrifugó (15 krpm, 50 min) para obtener una solución de enzima bruta.

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La solución de enzima bruta obtenida se adsorbió en una columna de DEAE Sepharose FF (14,5 x 90 mm) equilibrada con tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 7,5) y eluida con NaCl con un gradiente de 0 → 0,5 M para recoger una fracción que tiene actividad de HMGR. Se añadió sulfato amónico a la fracción obtenida al 13% y la fracción se adsorbió en columna de Phenyl Sepharose FF (14,5 x 90 mm) equilibrada con sulfato amónico al 12% y tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 7,5) y se eluyó con gradientes de sulfato amónico al 12% y etilenglicol al 0% → sulfato amónico al 0% y etilenglicol al 20%, para recoger una fracción que tenía actividad de HMGR. La fracción obtenida se dializó frente a tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 7,5), se adsorbió en una columna Blue Sepharose CL6B (14,5 x 90 mm) equilibrada con el tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 7,5), y se eluyó con gradientes de NaCl 0 M y etilenglicol al 0% → NaCl 1 M y etilenglicol al 20%, para recoger una fracción que tiene actividad de HMGR. La fracción se dializó frente a tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 7,5), después se sometió a ultrafiltración con una membrana que tenía un corte de exclusión de peso molecular de 10.000 para concentrar la fracción para obtener 17 U de HMGR purificada.

Método para medir la actividad de la HMGR

Se vertieron 0,45 ml de reactivo B en un tubo de ensayo y se calentó preliminarmente a 37ºC durante 5 min, se añadieron 0,05 ml de una solución de enzima y la mezcla se hizo reaccionar a 37ºC durante 5 min. Tras completarse la reacción, se añadió 1 ml de HCl 0,1 N para terminar la reacción, y se midió la absorbancia (Aa) a una longitud de onda de 550 nm. Se llevó a cabo después el mismo procedimiento usando un tampón de dilución de enzima (tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 9,0), Tween 80 al 0,1%) como blanco en lugar de una solución de enzima, y se midió la absorbancia (Ab). A partir de la diferencia entre estas absorbancias (Aa -Ab), 1 U de actividad enzimática por mililitro de la solución de enzima se calcula como U/ml = 0,316 x (Aa -Ab). Debe indicarse que una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para producir un micromol de NADH a 37ºC por minuto, y la solución de enzima se diluyó con el tampón de dilución de enzima, según fuera necesario.

Ejemplo 2. Producción de HMGR derivado de Variovorax sp. 5-MV (FERM BP-11064)

Identificación de Variovorax sp. 5-MV (FERM BP-11064)

Variovorax sp. 5-MV (FERM BP-11064) aislado del suelo se identificó como una especie Variovorax sp. perteneciente al género de Variovorax basándose en las características mostradas en la siguiente tabla 2 y la secuencia de ADNr 16S (SEQ ID NO: 9) y depositada en el Depósito de Organismos de Patentes Internacionales del Instituto Nacional de Ciencia Industrial y Tecnología de Tsukuba en Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón 13 de noviembre, 2008.

Tabla 2

Temperatura de cultivo (°C): 30

forma de varilla (0,6-0,7 x 1,5-2,0 µm)

Tinción Gram: -

Formación de esporas: -

Movilidad: +

Morfología de la colonia: Medio Tiempo de cultivo Diámetro Color Forma Elevación Borde Textura de la superficie Transparencia Consistencia nutriente agar 48 h 1,0-2,0 mm Amarillo Redonda Convexa Entero Lisa Opaca Viscosa

Ensayo de temperatura de crecimiento (°C): 37 45 + -

Reacción de catalasa Reacción de oxidasa Producción de ácido y/o gas a partir de glucosa Ensayo de Oxidación/Fermentación (O/F) Crecimiento anaerobio: + --/-/-

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Ensayos bioquímicos: Reducción de nitrato -

Producción de indol: -

Acidificación de glucosa: -

Arginina dihidrolasa: -

Ureasa: -

Hidrólisis de esculina: -

Hidrólisis de gelatina: -

β-Galactosidasa: -

Citocromo oxidasa: -

Ensayos de asimilación: Glucosa +

L-Arabinosa: +

D-Manosa: +

D-Manitol: +

N-Acetil-D-glucosamina: +

Maltosa: -

Gluconato de potasio: +

Ácido n-cáprico: +

Ácido adípico: -

Ácido dl-málico: +

Citrato sódico: -

Acetato de fenilo: -

Producción de HMGR derivada de Variovorax sp. 5-MV (FERM BP-11064)

Se obtuvieron 10 U de HMGR purificada a partir de la Variovorax sp. 5-MV (FERM BP-11064) descrita antes, por la misma técnica descrita en el ejemplo 1, excepto que el medio A se sustituyó por medio B.

5 Ejemplo 3. Producción de HMGR derivada de Delftia sp. 12-MV (FERM BP-11065)

Identificación de Delftia sp. 12-MV (FERM BP-11065)

Delftia sp. 12-MV (FERM BP-11065) aislado del suelo se identificó como una Delftia sp. estrechamente relacionada con Delftia acidovorans basándose en las características mostradas en la siguiente tabla 3 y la secuencia de ADNr 16S (SEQ ID NO: 10) y depositada en el Depósito de Organismos de Patentes Internacionales del Instituto Nacional

10 de Ciencia Industrial y Tecnología de Tsukuba en Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón 13 de noviembre, 2008.

Tabla 3

Temperatura de cultivo (°C): 30

forma de varilla (0,5-0,6 x 0,9-1,0 µm)

Tinción Gram: -

Formación de esporas: -

Movilidad: +

Morfología de la colonia: Medio Tiempo de cultivo Diámetro Color Forma Elevación Borde Textura de la superficie Transparencia Consistencia nutriente agar 48 h 3,0-4,0 mm Amarillo claro Redonda Convexa Rizoide Lisa Opaca Mantecosa

Ensayo de temperatura de crecimiento (°C): 37 45 + -

Reacción de catalasa Reacción de oxidasa Producción de ácido y/o gas a partir de glucosa Ensayo de Oxidación/Fermentación (O/F): + + -/-/

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17-07-2015

Ensayos bioquímicos: Reducción de nitrato +

Producción de indol: -

Acidificación de glucosa: -

Arginina dihidrolasa: -

Ureasa: -

Hidrólisis de esculina: -

Hidrólisis de gelatina: -

β-Galactosidasa: -

Citocromo oxidasa: +

Ensayos de asimilación: Glucosa -

L-Arabinosa: -

D-Manosa: -

D-Manitol: +

N-Acetil-D-glucosamina: -

Maltosa: -

Gluconato de potasio: +

Ácido n-cáprico: +

Ácido adípico: +

Ácido dl-málico: -

Citrato sódico: -

Acetato de fenilo: +

Producción de HMGR derivada de Delftia sp. 12-MV (FERM BP-11065)

Se obtuvieron 60 U de HMGR purificada a partir de la Delftia sp. 12-MV (FERM BP-11065) descrita antes, por la misma técnica descrita en el ejemplo 1.

5 Ejemplo 4. Producción de HMGR derivada de Comamonas sp. 25-MV (FERM BP-11066)

Identificación de Comamonas sp. 25-MV (FERM BP-11066)

Comamonas sp. 25-MV (FERM BP-11066) aislado del suelo se identificó como una Comamonas sp, estrechamente relacionada con Comamonas testosteroni basándose en las características mostradas en la siguiente tabla 4 y la secuencia de ADNr 16S (SEQ ID NO: 11) y depositada en el Depósito de Organismos de Patentes Internacionales

10 del Instituto Nacional de Ciencia Industrial y Tecnología de Tsukuba en Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón 13 de noviembre, 2008.

Tabla 4

Temperatura de cultivo (°C): 30

forma de varilla (0,6-0,7 x 0,9-1,0 µm)

Tinción Gram: -

Formación de esporas: -

Movilidad: +

Morfología de la colonia: Medio Tiempo de cultivo Diámetro Color Forma Elevación Borde Textura de la superficie Transparencia Consistencia nutriente agar 48 h 3,0-4,0 mm Amarillo claro Redonda Convexa Entero Lisa Opaca Mantecosa

Ensayo de temperatura de crecimiento: 4 -

(°C): 37 +

42: + w

45: -

Reacción de catalasa: +

Reacción de oxidasa: +

Producción de ácido y/o gas a partir de glucosa: -/-

Ensayo de Oxidación/Fermentación (O/F): -/-

Actividad de lipasa: -

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Ensayos bioquímicos: Reducción de nitrato +

Producción de indol: -

Acidificación de glucosa: -

Arginina dihidrolasa: -

Ureasa: -

Hidrólisis de esculina: -

Hidrólisis de gelatina: -

β-Galactosidasa: -

Citocromo oxidasa: +

Ensayos de asimilación: Glucosa -

L-Arabinosa: -

D-Manosa: -

D-Manitol: -

N-Acetil-D-glucosamina: -

Maltosa: -

Gluconato de potasio: +

Ácido n-cáprico: -

Ácido adípico: +

Ácido dl-málico: +

Citrato sódico: -

Acetato de fenilo: -

Producción de HMGR derivada de Comamonas sp. 25-MV (FERM BP-11066)

Se obtuvieron 27 U de HMGR purificada a partir de la Comamonas sp. 25-MV (FERM BP-11066) descrita antes, por la misma técnica descrita en el ejemplo 1, excepto que el medio A se sustituyó por medio C

Ejemplo 5. Expresión en Escherichia coli y purificación de HMGR derivada de Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP11063)

Se llevó a cabo la PCR usando ADN cromosómico de Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063) del ejemplo 1, como un molde y cebadores que tenían las secuencias de SEQ ID NO: 14 y 15, para obtener un fragmento de ADN que incluye el gen de HMGR (SEQ ID NO: 12). Un fragmento obtenido por digestión del fragmento de ADN obtenido con XbaI y SacI, se ligó con un fragmento obtenido por digestión de forma similar del plásmido pPOW1 con XbaI y SacI, en donde el plásmido pPOW1 se obtuvo por sustitución de la región del sitio HindIII al sitio EcoI en el sitio de multiclonación del plásmido pHSG398 con un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 24) que incluía una secuencia de promotor POP. El plásmido pPOW1-HMGRps obtenido, se introdujo en la cepa de Escherichia coli W3110 para obtener bacterias recombinantes productoras de HMGR. Estas bacterias se cultivaron en 1,6 litros de un medio que contenía extracto de levadura al 3%, sorbitol al 4,5%, antiespumante 028 al 0,1%, y cloranfenicol 30 µg/ml a 30ºC durante dos días, mientras se controlaba el pH del cultivo de modo que el pH más bajo debería ser 7,2. Después de obtener las células bacterianas del caldo de cultivo por centrifugación, las células bacterianas se suspendieron en tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 7,5) y EDTA 5 mM. Después, se añadió lisozima, y la suspensión se trató a 37ºC durante 30 min para alterar las células bacterianas y se centrifugó para separar las materias insolubles para obtener una solución de enzima bruta.

La solución de enzima bruta obtenida se adsorbió en una columna Q Sepharose Big Beads (45,5 x 510 mm) equilibrada con tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 8,5) y eluida con tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 8,5), NaCl 0,1 M y Tween 80 al 0,1% para recoger una fracción que tiene actividad de HMGR. Se añadió sulfato amónico a la fracción obtenida al 37,5%, el precipitado se recogió por centrifugación y después se disolvió en tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 8,5) y la solución se dializó frente a tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 8,5) y glicerol al 5%. La solución dializada que contenía HMGR se adsorbió en una columna DEAE Sepharose FF (22,5 x 210 mm) equilibrada con tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 8,5) y glicerol al 5% y eluida con NaCl con un gradiente de 0 → 0,25 M para recoger una fracción que tenía actividad de HMGR. Se añadió sulfato amónico a la fracción obtenida al 20%, y la fracción se adsorbió en la columna Phenyl Sepharose FF (22,5 x 410 mm) equilibrada con sulfato amónico al 20%, tampón de hidrocloruro de Tris 10 mM (pH 7,5), y glicerol al 5%, y se eluyó con gradientes de sulfato amónico al 20% y Tween 80 al 0% → sulfato amónico al 0% y Tween 80 al 0,1% para recoger una fracción que tenía actividad de HMGR. La fracción obtenida se dializó frente a tampón de hidrocloruro de bis-Tris 10 mM (pH 6,0) y glicerol al 5%, después se adsorbió en una columna Blue Sepharose CL6B (45,5 x 310 mm) equilibrada con tampón de hidrocloruro de bis-Tris 10 mM (pH 6,0) y glicerol al 5%, y se eluyó con un gradiente de NaCl 0 M y Tween 80 al 0% → NaCl 2,5 M y Tween 80 al 0,1% para recoger una fracción que tenía actividad de HMGR. La fracción obtenida se dializó frente a tampón de hidrocloruro de bis-Tris 10 mM (pH 6,0) y glicerol al 5%, después se adsorbió en una columna de hidroxiapatito (25,5 x 210 mm) equilibrada con tampón de hidrocloruro de bis-Tris 10 mM (pH 6,0), glicerol al 5%, y Tween 80 al 0,1%, y se eluyó con un gradiente de tampón

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Medio C El medio C se preparó añadiendo 3% de C2 y 0,5% de C3 a C1 Tabla 38

C1

0,7% 1 mg/ml 2 mg/ml 2 mg/l 2 mg/l 2 mg/l 0,1 mg/l 1 mg/l 0,1 mg/l: Extracto de levadura tiamina riboflavina ácido nicotónico pantotenato de calcio piridoxina HCl biotina ácido p-aminobenzoico ácido fólico

(Ajustado a pH 9 y después tratado en autoclave)

C2

128 g/l 30 g/l 5 g/l 10 g/l: Na2HPO4-7H2O KH2PO4 NaCl NH4Cl

(Ajustado a pH 9 y después tratado en autoclave)

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Ejemplo de preparación 2. Reactivos Las composiciones de los reactivos usados en los ejemplos mencionados antes se muestran a continuación. Tabla 39

10 Reactivo A

50 mM Tris-HCl (pH 8,5) 0,005% cloruro de nitroazul de tetrazolio 0,2 mM coenzima A 0,1% triton X-100 1 mM NAD 1 mM NADP

Diaforasa (Fabricado por Toyobo Co., Ltd.)

5 U/ml 5 mM ácido D,L-mevalónico

Tabla 40 Reactivo B

Diaforasa (Fabricado por Toyobo Co., Ltd.)

5 U/ml 5 mM ácido D,L-mevalónico

E10731334

17-07-2015

Tabla 41 Reactivo C

50 mM 0,005% 5 mM 1 mM 1 mM 1 mM 5 U/ml 5 U/ml 5 U/ml 2 mM: Tris-HCl (pH 7,5) cloruro de nitroazul de tetrazolio Glucosa MgCl2 NAD ATP Hexoquinasa dependiente de ADP (ADP-HKP fabricado por Asahi Kasei Phama Corporation) Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.) Diaforasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.) ácido D,L-mevalónico

Tabla 42 Reactivo Cb

50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 0,005% cloruro de nitroazul de tetrazolio 5 mM Glucosa 1 mM MgCl2 1 mM NAD 1 mM ATP

Hexoquinasa dependiente de ADP (ADP-HKP fabricado por Asahi Kasei Phama Corporation)

5 U/ml 5 U/ml Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.)

Diaforasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.)

5 U/ml

Tabla 43 Reactivo D1

25 mM Tris-HCl (pH 9) 0,25 mM NAD

3-Hidroxibutirato deshidrogenasa (3-HBDH II: fabricada por Asahi Kasei Pharma Corporation)

6,25 U/ml

10 Tabla 44 Reactivo D2

0,75 mM D,L-HMG-CoA

Tabla 45 Reactivo E1

15: 50 mM 1 mM 0,2 mM Tabla 46 Glicina-NaOH (pH 10,0) T-NAD NADH

Reactivo E2 50 mM 1 mM 0,2 mM 1 mM: Glicina-NaOH (pH 10,0) T-NAD NADH CoA

Tabla 47 Reactivo E3

50 mM: Glicina-NaOH (pH 10,0)

1 mM: T-NAD

0,2 mM: NADH

1 mM: CoA

1 mM: ATP

1 mM: MgCl2

E10731334

17-07-2015

Tabla 48 Reactivo E4

50 mM: Glicina-NaOH (pH 10,0)

1 mM: T-NAD

0,2 mM: NADH

1 mM: CoA

1 mM: ATP

1 mM: MgCl2

1 U/ml: MVK

5: Tabla 49

Reactivo E5 50 mM 1 mM 0,2 mM 1 mM 1 U/ml: Glicina-NaOH (pH 10,0) T-NAD NADH CoA HMGL

Tabla 50 Reactivo E11

10: 10 mM 400 U/ml Tris-HCl (pH 8,0) HMGR

Tabla 51

Reactivo E12 10 mM: Tris-HCl (pH 8,0)

Tabla 52

15: Reactivo F1 50 mM 1 mM 57 U/ml Glicina-NaOH (pH 10,0) T-NAD HMGR

Tabla 53 Reactivo F2

50 mM Glicina-NaOH (pH 10,0) 0,2 mM NADH

20: Tabla 54

Reactivo G1 50 mM 1 mM 0,2 mM 32 U/ml: Glicina-NaOH (pH 10,0) T-NAD NADH HMGR

Tabla 55 Reactivo G2

50 mM: Glicina-NaOH (pH 10,0)

1 mM: T-NAD

0,2 mM: NADH

63 U/ml: HMGR

E10731334

17-07-2015

Tabla 56 Reactivo H1

20 mM: Glicina-NaOH (pH 9,0)

2 mM: ATP

2 mM: MgCl2

5: Tabla 57

Reactivo H2 20 mM 2 mM 2 mM 2 U/ml: Glicina-NaOH (pH 9,0) ATP MgCl2 MVK

Tabla 58 Reactivo J1(+)

20 mM Glicina-NaOH (pH 10,5) 2 mM ATP 2 mM MgCl2 2 U/ml MVK

Tabla 59 Reactivo J1(-)

20 mM Glicina-NaOH (pH 10,5) 2 mM ATP 2 mM MgCl2

Tabla 60 15 Reactivo J2

0,222 M NaOH

Tabla 61 Reactivo J3

200 mM Glicina-NaOH 44,5 mM Ácido cítrico 4 mM CoA 4 mM T-NAD 160 U/ml HMGR pH 5,7

20: Tabla 62

Reactivo J4 50 mM 1,8 mM: Glicina-NaOH (pH 10,0) NADH

Tabla 63 Reactivo K1(+)

25: 20 mM 2 mM 2 mM 2 U/ml Glicina-NaOH (pH 10,5) ATP MgCl2 MVK

48

E10731334

17-07-2015

Tabla 64 Reactivo K1(-)

20 mM: Glicina-NaOH (pH 10,5)

2 mM: ATP

2 mM: MgCl2

Tabla 65 Reactivo K2

200 mM Glicina-NaOH (pH 10,0)

Tabla 66 Reactivo K3

50 mM: Glicina-NaOH (pH 10,0)

4 mM: CoA

4 mM: T-NAD

50 U/ml: HMGR

10 Tabla 67 Reactivo K4(+)

50 mM Glicina-NaOH (pH 10,0) 50 mM EDTA 1,8 mM NADH

Tabla 68 Reactivo K4(-)

15: 50 mM 50 mM 1,8 mM 10 U/ml Glicina-NaOH (pH 10,0) EDTA NADH MVK

Tabla 69

Reactivo L1 20 mM 11 U/ml: Tris-HCl (pH 9,0) HMGL

Tabla 70 20 Reactivo L2

20 mM Tris-HCl (pH 9,0)

Tabla 71 Reactivo M1(+)

10 mM Tris-HCl (pH 9,0) 0,4 U/ml HMGL

25 Tabla 72 Reactivo M(-)

10 mM Tris-HCl (pH 9,0)

E10731334

17-07-2015

Tabla 73 Reactivo M2

0,222 M NaOH

Tabla 74

5: Reactivo M3 200 mM 44,5 mM 4 mM 4 mM 50 U/ml pH 5,7 Glicina-NaOH Ácido cítrico CoA T-NAD HMGR

Tabla 75 Reactivo M4

50 mM Glicina-NaOH (pH 10,0) 1,8 mM NADH

10: Tabla 76

Reactivo N1 50 mM 1 mM 0,2 mM 1 mM: Glicina-NaOH (pH 10,0) T-NAD NADH CoA

Tabla 77 Reactivo P1(+)

50 mM Tris-HCl (pH 8,5) 1 mM T-NAD 1 mM CoA 0,01 mM MVA

Tabla 78 Reactivo P1(-)

50 mM Tris-HCl (pH 8,5) 1 mM T-NAD 1 mM CoA

Tabla 79

20: Reactivo P2 50 mM 2 mM Tris-HCl (pH 8,5) NADH

Tabla 80 Reactivo Q1A

50 mM 0,18 mM 30 mM 0,7 mM 0,7 mM 0,07% 0,05% p H 9,4: Glicina-NaOH NADH NaHCO3 MgCl2 ATP Tween80 NaN3

E10731334

17-07-2015

Tabla 81 Reactivo Q1A

50 mM 0,18 mM 30 mM 0,7 mM 0,7 mM 0,07% 0,05% 0,8 U/ml pH 9,4: Glicina-NaOH NADH NaHCO3 MgCl2 ATP Tween80 NaN3 MVK

Tabla 82 Reactivo Q2

100 mM 6 mM 2,4 mM 30 mM 67 U/ml 0,02% pH 6,0: HEPES EDTA CoA T-NAD HMGR ProClin300

Tabla 83 Reactivo R1

100 mM 1,84 mM 1,23 mM 20 U/ml: Glicina-NaOH (pH 9,5) T-NAD CoA HMGR

Tabla 84 Reactivo R2

989 mM 1,13 mM: Glicina-NaOH (pH 9,5) NADH

Tabla 85 15 Reactivo S1

10 mM 5 mM 1 mM 1 mM 1 mM 0,5 U/ml 10 U/ml: Glicina-NaOH (pH 10,5) Glucosa MgCl2 NAD ATP MVK Hexoquinasa dependiente de ADP (ADP-HKP II: fabricado por Asahi Kasei Pharma Corporation)

Tabla 86 5

imagen34

10

15

20

25

30

35

E10731334

17-07-2015

Tabla 87 Reactivo T1

50 mM 2 mM 2 mM 5 U/ml: Glicina-NaOH (pH 10,5) NAD CoA HMGL

Tabla 88 Reactivo T2

imagen35

Esta solicitud se basa en la solicitud de patente japonesa nº 2009-009177 presentada el 19 de enero, 2009, y su contenido se incorpora en la presente memoria por referencia en esta solicitud.

Aplicabilidad industrial De acuerdo con la presente invención, el MVA y/o HMG-CoA en una muestra biológica que es un indicador de la cantidad de colesterol sintetizado en el cuerpo o CoA en una muestra biológica que es un indicador del metabolismo de lípidos en el cuerpo, se pueden medir de forma conveniente con sensibilidad ultra alta y precisión alta. La medición mencionada antes se puede llevar a cabo para muchas muestras, usando un analizador automático para fines generales. Por lo tanto, muchas muestras se pueden medir con precisión en ensayos clínicos rutinarios y similares, y por lo tanto, la presente invención tiene aplicabilidad industrial en el diagnóstico de afecciones patológicas y similares.

Texto libre para la lista de secuencias SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de HMGR derivada de Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063). SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de HMGR derivada de Pseudomonas mevalonii. SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de HMGR derivada de Archaeoglobus fulgidus (NBRC100126). SEQ ID NO: 4 es la secuencia de nucleótidos del promotor POP. SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos del gen de MVK de Saccharomyces cerevisiae (NBRCl136). SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de HMGL derivada de Pseudomonas mevalonii. SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos de HMGL derivada de Pseudomonas putida KT2440 (ATCC47054). SEQ ID NO: 8 es la secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063). SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de Variovorax sp. 5-MV (FERM BP-11064). SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de Delftia sp. 12-MV (FERM BP-11065). SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótidos de ADNr 16S de Comamonas sp. 25-MV (FERM BP-11066). SEQ ID NO: 12 es la secuencia de nucleótidos del gen de HMGR derivada de Pseudomonas sp. 1-MV (NBRC

11063). SEQ ID NO: 13 es la secuencia de nucleótidos del gen de HMGR derivada de Pseudomonas mevalonii. SEQ ID NO: 14 es la secuencia de nucleótidos de un cebador directo para la amplificación de HMGR derivada de

Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063).

SEQ ID NO: 15 es la secuencia de nucleótidos de un cebador inverso para la amplificación de HMGR derivada de Pseudomonas sp. 1-MV (FERM BP-11063). SEQ ID NO: 16 es la secuencia de nucleótidos de un cebador directo para la amplificación de HMGR derivada de

Archaeoglobus fulgidus (NBRC100126). SEQ ID NO: 17 es la secuencia de nucleótidos de un cebador inverso para la amplificación de HMGR derivada de Archaeoglobus fulgidus (NBRC100126).

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Claims

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