JPWO2010082665A1 - メバロン酸、3−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムaおよびコエンザイムaの測定方法ならびに測定試薬 - Google Patents
メバロン酸、3−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムaおよびコエンザイムaの測定方法ならびに測定試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2010082665A1 JPWO2010082665A1 JP2010546677A JP2010546677A JPWO2010082665A1 JP WO2010082665 A1 JPWO2010082665 A1 JP WO2010082665A1 JP 2010546677 A JP2010546677 A JP 2010546677A JP 2010546677 A JP2010546677 A JP 2010546677A JP WO2010082665 A1 JPWO2010082665 A1 JP WO2010082665A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- hmgr
- reagent
- enzyme
- mva
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/008—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions for determining co-enzymes or co-factors, e.g. NAD, ATP
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
本明細書中ではD,L-メバロン酸またはD,L-MVAとの表記はD体、L体が混合したラセミのメバロン酸を表し、単にメバロン酸またはMVAとの表記はD-メバロン酸またはR-メバロン酸を表す。
同様に、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAにも2つの光学異性体がありそれぞれD/L表記法ではD-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA,L-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA、R/S表記法ではR-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA,S-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと表記される。生体内で代謝される(ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼの基質となることができる)のはD-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA(S-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと表記することもある)であり、L-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA(R-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと表記することもある)は生体内では代謝されない。
本明細書中ではD,L-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはD,L-HMGCoAとの表記はD体、L体が混合したラセミの3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを表し、単に3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはHMGCoAとの表記はD-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはS-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを表す。
および反応式6:
の組み合わせによる反応(特許文献1、特許文献3、特許文献4、非特許文献7、非特許文献8);測定対象がグルタミン酸もしくはα-ケトグルタル酸またはアンモニアであり、これらに対するグルタミン酸デヒドロゲナーゼを用いた、反応式7:
および反応式8:
の組み合わせによる反応(特許文献2);あるいは測定対象がD-グリセロアルデヒド-3-リン酸、無機リン、または1,3-ジホスホグリセリン酸であり、これらに対しD-グリセロアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼを用いた反応式9:
および反応式10:
の組み合わせによる反応(特許文献5)等が知られていた。そして、特許文献2においては、塩化アンモニウム測定の下限値として40μM、L-グルタミン酸測定の下限値として40μM、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの代わりにロイシンデヒドロゲナーゼを用い、反応式7および反応式8においてグルタミン酸をロイシンに、α-ケトグルタル酸を2-オキソイソカプロエイトに変更した酵素サイクリング反応におけるL-ロイシンの測定の下限値として4μMが報告されていた。特許文献4においては、リン酸測定の下限値として10μM、3-ホスホグリセリン酸キナーゼを用いて3-ホスホグリセリン酸を1,3-ジホスホグリセリン酸に変換した後に測定した下限値として0.2μMが報告されていた。
および反応式12:
で示されるように、1分子のメバロン酸と2分子の水素受容体、または1分子のHMGCoAと2分子の水素供与体との間で行われる、水素授受に関する2段階の反応である。上記反応式11および反応式12は、Genome Biol. 2004;5(11):248およびProtein Sci. 2000 Jun;9(6):12
26-34において、以下の反応式13:
および反応式14:
で示されるように水素授受に関しての2段階反応を含む3段階の反応で構成されていることが示唆されている。
および反応式16:
の組み合わせによる、水素授受に関して単段階反応となるような酵素サイクリング反応をコエンザイムAの非存在下で行うことで、1段階の反応で1分子のT-NAD(P)Hが生成することから、3段階の反応で2分子のT-NAD(P)Hを生成することに比べて、T-NAD(P)Hの生成効率が高くなり、メバロン酸を高感度に測定することが考えられる。また、HMGCoAについて、HMGRを用いて反応式13および反応式14のメバジルコエンザイムAとHMGCoAとの反応の部分のみ、すなわち以下の反応式17:
および反応式18:
の組み合わせによる、水素授受に関して単段階反応となるような酵素サイクリング反応をコエンザイムAの非存在下で行うことで、同様にHMGCoAを高感度に測定することが考えられる。しかし、予想に反して、上記反応式15および反応式16の組み合わせによる酵素サイクリング反応は、MVAが低濃度の場合、例えば反応液中で45nM以下(D,L-MVAである場合は90nM以下)、9nM以下(D,L-MVAである場合は18nM以下)の場合には進行せず、メバロン酸の高感度な測定はできないことが判明した。また、上記反応式17および反応式18の組み合わせによる酵素サイクリング反応も同様に、HMGCoAが低濃度の場合、例えば反応液中で9nM以下(D,L-HMGCoAである場合は18nM以下)の場合には進行せず、HMGCoAの高感度な測定はできないことが判明した。
および反応式20:
の組み合わせによる、水素授受に関しての2段階反応を含む3段階の反応で構成される酵素サイクリング反応は、多段階反応であることから酵素サイクリング反応が進まない、またはこれまでに報告されている単段階反応で構成される酵素サイクリング反応に比べて反応効率が非常に悪いと考えられていたが、驚くべきことに、この酵素サイクリング反応は効率よく進行し、被検液中のメバロン酸またはHMGCoAを、これまでになく超高感度に測定できることを本発明者は見出した。
被検液中の測定対象物質である、メバロン酸および/または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAの濃度の測定方法であって、以下の工程(p)および(q):(p)メバロン酸および/または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有する被検液に、水素受容体X、水素供与体YおよびコエンザイムAの存在下、反応式1:
の反応を触媒する酵素および反応式2:
の反応を触媒する酵素を作用させる工程;および(q)生成する還元型水素受容体Xの量または生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程;を含み、ここで、前記水素供与体Yと前記還元型水素受容体Xとは同一でない、前記の測定方法。
被検液中の測定対象物質である、コエンザイムAの濃度の測定方法であって、以下の工程(p’)および(q’):(p’)コエンザイムAを含有する被検液に、水素受容体Xと水素供与体Yとメバロン酸の存在下、反応式1:
を触媒する酵素および反応式2:
を触媒する酵素を作用させる工程;および(q’)生成する還元型水素受容体Xの量または生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程;を含み、ここで、前記水素供与体Yと前記還元型水素受容体Xとは同一でない、前記の測定方法。
前記測定対象物質の濃度が30nMより小さく、前記生成する還元型水素受容体Xまたは生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程が、比色分析により行われる、前記の測定方法。
前記水素受容体Xが酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類である、前記の測定方法。
前記水素供与体Yが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類である、前記の測定方法。
前記酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記の測定方法。
前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、前記の測定方法。
前記測定対象物質の濃度が100nMより小さく、前記水素受容体Xが、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、前記水素供与体Yが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、前記生成する還元型水素受容体Xまたは生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程が、比色分析により行われる、前記の測定方法。
前記反応式1を触媒する酵素が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼである、前記の測定方法。
前記反応式2を触媒する酵素が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼである、前記のいずれかに記載の測定方法。
前記ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼが、Pseudomonas属、Variovorax属、Delftia属、Comamonas属またはArchaeoglobus属由来である、前記の測定方法。
前記反応式1および/または反応式2を触媒する酵素が:(i)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質;または(ii)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および/または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1および/または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質;である、前記の測定方法。
前記被検液が、メバロン酸および3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有し、測定対象物質が3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAであり、前記工程(p)に先立って以下の工程(o):(o)前記被検液からメバロン酸を除く工程;をさらに含む、前記の測定方法。
前記工程(o)が、酵素反応、好ましくはメバロン酸キナーゼによる酵素反応により行われる、前記の測定方法。
前記工程(o)が、メバロン酸キナーゼによる酵素反応により行われ、その後、分離操作を行うことなく工程(p)を行うことを特徴とする、前記の測定方法。
前記メバロン酸キナーゼが:(i)配列番号5の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質;または(ii)配列番号5の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および/または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式21の反応を触媒する活性を有するタンパク質;である、前記の測定方法。
前記被検液が、メバロン酸および3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有し、測定対象物質がメバロン酸であり、前記工程(p)に先立って以下の工程(o’):(o’)前記被検液から3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを除く工程;をさらに含む、前記の測定方法。
前記工程(o’)が、酵素反応により行われる、前記の測定方法。
前記酵素反応が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼによる酵素反応である、前記の測定方法。
前記工程(o’)が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼによる酵素反応により行われ、その後、分離操作を行うことなく工程(p)を行うことを特徴とする、前記の測定方法。
前記ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼが:(i)配列番号7のアミノ酸配列を有するタンパク質;または(ii)配列番号7のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および/または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式22の反応を触媒する活性を有するタンパク質;である、前記の測定方法。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸および/または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬。
前記試薬中にメバロン酸が実質的に混在しないことを特徴とする、前記の測定用試薬。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸および/または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬の製造方法であって、混在するメバロン酸を、メバロン酸キナーゼを用いて除去する工程を含む、前記の製造方法。
前記試薬中に3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAが実質的に混在しないことを特徴とする、前記の測定用試薬。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸および/または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬の製造方法であって、混在する3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼを用いて除去する工程を含む、前記の製造方法。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、メバロン酸、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、コエンザイムA測定用試薬。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、コエンザイムA、リン酸供与体、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸測定用試薬。
菌株Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)又は、16SrDNAの配列が配列番号8と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。
菌株Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)又は、16SrDNAの配列が配列番号9と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。
菌株Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)又は、16SrDNAの配列が配列番号10と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。
菌株Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)又は、16SrDNAの配列が配列番号11と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。
以下の(A)〜(C)のいずれかに記載のタンパク質:(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質;(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および/または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質;および(C)配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質。
サンプル中のメバロン酸量を正確に測定するメバロン酸標準測定法であって、少なくとも以下の(i)〜(iv)の工程;
(i)サンプル中のメバロン酸にATP存在下、メバロン酸キナーゼを作用させメバロン酸とATPをメバロン酸リン酸とADPに変換する工程;
(ii)(i)で生じたADPにグルコース存在下でADP依存ヘキソキナーゼを作用させグルコース-6-リン酸とAMPに変換する工程;
(iii)(ii)で生じたグルコース-6-リン酸を酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)存在下、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、6-ホスホグルコノラクトンと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)に変換する工程;および
(iv)(iii)で生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を吸光度により測定する工程、を含む、前記の標準測定法。
サンプル中のメバロン酸量を正確に測定するメバロン酸標準測定法であって、少なくとも以下の(i),(ii)の工程;
(i)サンプル中のメバロン酸に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)、コエンザイムA存在下、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼを作用させ3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)に変換する工程;および
(ii)(i)で生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を吸光度により測定する工程;を含む、前記の標準測定法。
前記の標準測定法により正確なメバロン酸量が値付けされたメバロン酸標準物質。
および反応式2:
の組み合わせによる酵素サイクリング反応を用いた、被検液中の測定対象の測定方法に関する。
被検液が尿である場合はその濃淡の指標として尿中の物質の濃度、例えばクレアチニン濃度を測定し、尿中のMVA濃度、HMGCoA濃度、またはCoA濃度をクレアチニン濃度で除した値を指標として使うこともできる。
記載のようにATPのようなリン酸供与体およびマグネシイムイオンまたはマンガンイオンの存在下、MVAを、反応式1に関与しないメバロン酸リン酸に変換することができる。該酵素の例として、例えばメバロン酸キナーゼ(EC2.7.1.36:以下、MVKともいう)が挙げられる。酵素反応によってMVAを除く工程において、反応液のpH、緩衝液、塩濃度等を最適になるように変化させることができる。また、必要に応じ、反応式21の生成物であるメバロン酸リン酸をさらにリン酸化するホスホメバロン酸キナーゼ(EC2.7.4.2)の添加、ADPを除去する目的でのホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼの添加、またはグルコースとADP依存ヘキソキナーゼの添加を行うことができる。
に記載のように、HMGCoAをアセト酢酸とアセチルコエンザイムAに変換する方法;
酵素として例えばハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAハイドロラーゼ(EC3.1.2.5)を用い、以下の反応式23:
に記載のように、HMGCoAを3-ハイドロキシメチルグルタリル酸とコエンザイムAに変換する方法;
酵素として例えばハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAシンセターゼ(EC2.3.3.10)を用い、以下の反応式24:
に記載のように、HMGCoAをアセチルコエンザイムAとアセトアセチルコエンザイムAに変換する方法などが挙げられる。酵素反応によってHMGCoAを除く工程において、反応液のpH、緩衝液、塩濃度等を最適になるように変化させることができる。また、必要に応じ、生成物にさらに作用する酵素(例えば、反応式22の生成物であるアセト酢酸を二酸化炭素と酢酸に分解するアセト酢酸脱炭酸酵素(EC4.1.1.4))添加を行うことができる。
異なった実験室で物質Aの量を測定するようになると、同じ被検液中の物質Aの量が実験室aで測定した値と実験室bで測定した値で誤差が出てくる。この誤差は測定試薬およびその測定手順、測定装置、キャリブレーター、測定者などが異なるために生じるのであるが、実験室間の誤差をできるだけ小さくすることが医療の現場の臨床検査室などで求められている。この実験室間の誤差をできるだけ小さくするためには、物質Aの標準物質と物質Aの標準測定法を定めて、それを基に日常に用いられるキャリブレーター中に存在する物質Aの量を値付けて日常の測定法で測定するという物質A測定のトレーサビリティ(Clin Chem. 2009 Jun;55(6):1067-75)が確立できればよい。
ここで、MVA測定のトレーサビリティを確立しようとすると、まず標準物質と標準測定法を定めなければならない。一般に試薬として販売されているMVAおよびD,L-MVA(例えば東京化成工業株式会社の製品コードM1374:D-Mevalonolactoneやシグマ社の製品番号M4667:(±)-Mevalonolactone (DL-Mevalonic acid lactone))はその正確な純度は不明であるし、その純度測定法も滴定などの特異性が低い方法か、GCなど標準物質が存在しないと絶対量を測定できない方法か、光学異性体の含量比率のみを測定する偏光分析やNMRによる方法(J Lipid Res. 1982 May;23(4):645-52)か、MVKにピルビン酸キナンーゼと乳酸デヒドロゲナーゼを共役させてNADHの減少で測定する(Methods Enzymol. 1969;15:393-454)という後述するように精度が不十分であると考えられる方法しか知られておらず、適切な標準物質と標準測定法と呼べるものはなかった。そこで標準測定法の候補として、本発明者は酵素の特異性を利用したNAD(P)Hが増加する反応系において、NAD(P)Hの吸光係数を基にMVAの正確な量を測定する方法を二つ考案した。
一つの方法は、MVKを用いた反応式21:
ADP依存ヘキソキナーゼ(ADP特異グルコキナーゼ(EC2.7.1.47)ともいう)を用いた反応式25:
グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.49)を用いた反応式26:
6-ホスホグルコノラクトナーゼ(EC3.1.1.31)を用いた反応式27:
を組み合わせる方法であって、MVA(D-MVA)をNAD(P)Hにすべて変換することができNAD(P)Hの吸光係数を用いて正確なMVA(D-MVA)量を測定することができる。ここで反応式27はpHを調節する(例えば8.0以上、好ましくは8.5以上、より好ましくは9.0以上)と酵素を介在せずとも反応式27が進行するので6-ホスホグルコノラクトナーゼ(EC3.3.3.31)を用いなくてもよい場合がある。また、反応式25においてグルコースの代わりにADP依存ヘキソキナーゼが作用する基質を用い、その生成物に対応するデヒドロゲナーゼを用いて反応式26に対応する反応を行うことも可能である。
もう一つの方法はHMGRを用いた反応式11:
による方法であり、好ましくはHMGLを用いた反応式22:
を組み合わせる方法であって、MVA(D-MVA)をNAD(P)Hにすべて変換することができNAD(P)Hの吸光係数を用いて正確なMVA(D-MVA)量を測定することができる。ここで反応式22はハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAハイドロラーゼ(EC3.1.2.5)を用いた反応式23:
に、またはハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAシンセターゼ(EC2.3.3.10)を用いた反応式24:
に置き換えることも可能である。
水溶液中のMVAは分子内のヒドロキシ基とカルボキシル基が脱水縮合したラクトンとラクトンが加水分解されたヒドロキシカルボン酸の平衡状態にあると考えられるが、反応に関与する基質と生成物の構造の観点からMVKやHMGRはラクトンでなくヒドロキシカルボン酸のMVAに作用していると考えられる。MVKによるMVAからメバロン酸リン酸への反応およびHMGRによるMVAからHMGcoAへの反応の至適pHが高pH領域にあることの要因のひとつとして、高pH領域でラクトンが加水分解され平衡がヒドロキシカルボン酸に偏っていることが挙げられる。よって、MVAをMVKまたはHMGRを用いた酵素反応で正確に測定しようとする場合には、平衡をヒドロキシカルボン酸に偏らせることが重要であり、そのためにはMVAのラクトンを加水分解するラクトナーゼを添加することも考えられるが、簡便性の点からはその反応pHが高pH領域であること(試薬または反応液のpHが8.5以上、好ましくは9.0以上、より好ましくは9.5以上、さらに好ましくは10.0以上であること)が望ましい。一方、デヒドロゲナーゼ等によるNAD(P)Hが生成する反応の至適pHは酵素や基質など反応に関与する成分の安定性が保てる範囲において高pH領域にあり、NAD(P)が生成する反応の至適pHは酵素や基質など反応に関与する成分の安定性が保てる範囲において低pH領域にあることが一般に知られており、デヒドロゲナーゼによるNAD(P)Hの増加を測定する場合には高pH領域、NAD(P)Hの減少を測定する場合には低pH領域であることが望ましい。しかし、上述したMVKにピルビン酸キナンーゼと乳酸デヒドロゲナーゼを共役させてNADHの減少で測定する方法ではMVKによる反応においては高pH領域が望ましく、乳酸デヒドロゲナーゼによる反応では低pH領域が望ましいという矛盾したpH設定の問題があり(Methods Enzymol. 1969;15:393-454において、pHは7.3-7.4に設定されている)、それに加えて吸光度の問題から反応系に添加できるNADH量に限りがあり、高いブランク反応等の問題もあり、正確なMVA量を測定するには不十分な反応系である。また、MVAをMVKまたはHMGRを用いた酵素反応で正確に測定しようとする場合には、平衡をヒドロキシカルボン酸に偏らせるために、その反応pHは高pH領域であること、例えば試薬または反応液のpHが8.5以上、好ましくは9.0以上、より好ましくは9.5以上、さらに好ましくは10.0以上であることが重要であることは先に述べたが、そのような高pH領域において補酵素(例えばCoA)の安定性の観点、またMVK、HMGRおよびそれらと共役させて用いる酵素の安定性と反応性の観点から、安定かつ十分に反応が進行するとは考えもしないものであった。しかし、驚くべきことに本発明者は上記のMVKまたはHMGRを用いたNAD(P)Hが増加する反応系において、安定かつ十分に反応が進行することを発見し、NAD(P)Hの吸光係数を基にMVAの正確な量を短時間(例えば30分以内、15分以内、10分以内)の反応で精度よく測定する方法を発見したのである。
これらの方法により、正確なMVA量が値付けされた標準物質を提供することができ、MVA測定のトレーサビレティを確立することができる。
HMGCoAの場合においてはHMGRでHMGCoAからMVAとCoAを生成させ、その生成させたMVAを上記のMVK、ADP依存ヘキソキナーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼを用いた反応式を組み合わせる方法により、MVAと同様に、正確なHMGCoA量が値付けされた標準物質を提供することができ、HMGCoA測定のトレーサビレティを確立することができる。
また、このようなMVA、CoAまたはHMGCoAの標準物質には酸、塩基、金属イオン、糖類、アルコール類、アミノ酸類、タンパク質、塩類、緩衝成分、界面活性剤、キレート剤、血液成分などその他有機化合物の添加物を保存安定性など性能向上のために適宜加えてもよく、その形態は溶液、凍結品、凍結乾燥品であってもよい。
以下の実施例の表、図においても本明細書中と同様にD,L-メバロン酸またはD,L-MVAと表記した場合はD体、L体が混合したラセミのメバロン酸を表し、単にメバロン酸またはMVAと表記した場合はD-メバロン酸またはR-メバロン酸を表す。
また、以下の実施例の表、図においても本明細書中と同様にD,L-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはD,L-HMGCoAと表記した場合はD体、L体が混合した3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを表し、単に3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはHMGCoAと表記した場合はD-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAまたはS-3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを表す。
さらに実施例においては、特に断りがない限りD,L-MVAはシグマ社製M4667を、D,L-HMGCoAはシグマ社製H6132を用いた。そして実施例において記載したMVA濃度(つまりD-MVA濃度)およびHMGCoA(つまりD-HMGCoA濃度)は、それぞれD,L-MVA、D,L-HMGCoAの1/2として換算して表記した。
測定に自動分析機7170S(日立製)を用いる場合には明記した測定波長を主波長として、660nmを副波長として測定した。同様に、測定に自動分析機BM9020(日本電子製)を用いる場合には明記した測定波長を主波長として、658nmを副波長として測定した。
Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)の同定
土壌から分離したPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)は、以下の表1に示す特徴および16SrDNAの配列(配列番号8)から、Pseudomonas migulaeに近縁なPseudomonas sp.と同定し、平成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
500mL容量の三角フラスコに培地Aを167mL入れたもの3本を用意し、それぞれに1コロニーの約1/3を植菌してこの三角フラスコ中で、28℃で約18時間、Pseudomonas sp.1-MV(FERM BP-11063)を振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離(8krpm、20min)して集菌し、菌体を30mLの10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に懸濁して超音波破砕により菌体を可溶化した。可溶化した液を遠心分離(15krpm、50min)して粗酵素液を得た。
試薬B 0.45mLを試験管に入れ、37℃で5分間予備加温した後、0.05mLの酵素液を添加し、37℃で5分間反応させた。反応終了後、0.1N HClを1mL添加して反応を停止させ、波長550nmにおける吸光度(Aa)を測定した。また、ブランクとして酵素液の代わりに酵素希釈液(10mMトリス塩酸緩衝液(pH9)、0.1% Tween80)を用いて同様な操作を行い、吸光度(Ab)を測定した。これらの吸光度差(Aa-Ab)より、酵素液1mL当たりの酵素活性1Uは、U/mL=0.316X(Aa-Ab)と計算される。ただし、酵素活性1Uは37℃で1分間に1マイクロモルのNADHを生成させる酵素量とし、酵素液は適宜酵素希釈液で希釈して測定するものとする。
Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)の同定
土壌から分離したVariovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)は、以下の表2に示す特徴および16SrDNAの配列(配列番号9)から、Variovorax属に属するVariovorax sp.と同定し、平成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
上記Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)から、培地Aを培地Bに変更した以外は実施例1と同様の手法により精製して、10Uの精製したHMGRを得た。
Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)の同定
土壌から分離したDelftia sp.12-MV(FERM BP-11065)は、以下の表3に示す特徴および16SrDNAの配列(配列番号10)から、Delftia acidovoransに近縁なDelftia sp.と同定し、平成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
上記Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)から、実施例1と同様の手法により精製して、60Uの精製したHMGRを得た。
Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)の同定
土壌から分離したComamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)は、以下の表4に示す特徴および16SrDNAの配列(配列番号11)から、Comamonas testosteroniに近縁なComamonas sp.と同定し、平成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
培地Aを培地Cに変更した以外は実施例1と同様の手法により、上記Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)から、27Uの精製したHMGRを得た。
実施例1のPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)の染色体DNAを鋳型にして、配列番号14および配列番号15記載の配列を有するプライマーを用いてPCRを行い、HMGR遺伝子(配列番号12)を含むDNA断片を得た。得られたDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpHSG398のマルチクローニングサイトのHindIII部位からEcoI部位をPOPプロモーター配列を含むDNA断片(配列番号 24)で置換したプラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-HMGRpsを、大腸菌W3110株に導入して、HMGR生産遺伝子組換菌を得た。この菌を、酵母エキス3%、ソルビトール4.5%、アンチフォーム028 0.1%、クロラムフェニコール30μg/ml含有培地1.6L中で、培養中のpHの下限が7.2になるようコントロールしながら30℃で2日培養した。培養液から遠心分離で菌体を得た後、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、5mM EDTAで菌体を懸濁した。その後、リゾチームを添加して37℃で30分処理して菌体を破砕し、遠心分離で不溶物を除いて粗酵素液を得た。
Pseudomonas mevaloniiのHMGR遺伝子(配列番号13)の5’側にXbaI部位を3'側にSacI部位を連結したDNA断片を化学合成した。このDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-HMGRpmを、大腸菌W3110株に導入してHMGR生産遺伝子組換菌を得た。この菌を、酵母エキス3%、ソルビトール0.3%、クロラムフェニコール30μg/ml、pH7.5の培地160mLに植菌し、37℃で1日培養した。培養液1mLあたり約0.2U/mLのHMGR活性が確認された。
Archaeoglobus flugidus (NBRC100126)の染色体DNAを鋳型にして、配列番号16および配列番号17記載の配列を有するプライマーを用いてPCRを行い、HMGR遺伝子を含むDNA断片を得た。得られたDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-HMGRafを、大腸菌W3110株に導入してHMGR生産遺伝子組換菌を得た。
Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)の染色体DNAを鋳型にして、配列番号18および配列番号19記載の配列のプライマーを用いてPCRを行いMVK遺伝子の前半部分のDNA断片を、配列番号20および配列番号21記載の配列のプライマーを用いてPCRを行いMVK遺伝子の後半部分のDNA断片を、それぞれ得た。得られたこれらの前半部分と後半部分のDNA断片を鋳型にして、配列番号18および配列番号21記載の配列のプライマーを用いてPCRを行い、MVK遺伝子の全長を含むDNA断片を得た。なお、得られたDNA断片中のMVK遺伝子は、配列番号5記載の配列において819番目のAがTに置換したものであるが、翻訳されるアミノ酸配列に変化はない。得られたMVK遺伝子の全長を含むDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-MVKを、大腸菌W3110株に導入してMVK生産遺伝子組換菌を得た。
試薬C 0.5mLを試験管に入れ、37℃で5分間予備加温した後、0.01mLの酵素液を添加して37℃で5分間反応させた。反応終了後、0.1N HClを1mL添加して反応を停止させ、波長550nmにおける吸光度(Aa)を測定した。また、ブランクとして試薬Cbを用いて同様な操作を行い、吸光度(Ab)を測定した。これらの吸光度差(Aa-Ab)より、酵素液1mLあたりの酵素活性1Uは、U/mL=1.589X(Aa-Ab)と計算される。ただし、酵素活性1Uは37℃で1分間に1マイクロモルのNADHを生成させる酵素量とし、酵素液は適宜酵素希釈液(10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、0.1%BSA)で希釈して測定するものとする。
Pseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)の染色体DNAを鋳型にして、配列番号22および配列番号23記載の配列のプライマーを用いてPCRを行い、HMGL遺伝子を含むDNA断片を得た。得られたDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-HMGLを、大腸菌W3110株に導入してHMGL生産遺伝子組換菌を得た。
試薬D1 0.070mLと酵素液0.006mLをセルに入れ、37℃で5分間保温した後、0.020mLの試薬D2を添加して37℃で5分間反応させ、試薬D2添加後の波長340nmにおける吸光度が直線的に減少する部分から1分間あたりの吸光度速度(Aa)を測定した。また、ブランクとして酵素液の代わりに酵素希釈液(10mMトリス塩酸緩衝液(pH9))を用いて同様な操作を行い、1分間あたりの吸光度減少速度(Ab)を測定した。これらの吸光度減少速度差(Aa-Ab)より、酵素液1mL当たりの酵素活性1Uは、U/mL=2.54X(Aa-Ab)と計算される。ただし、酵素活性1Uは37℃で1分間に1マイクロモルのNADHを減少させる酵素量とし、酵素液は適宜酵素希釈液で希釈して測定するものとする。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。
15μLのサンプル溶液(蒸留水、10nM、50nM、100nMのMVAおよび10nM、50nM、100nMのHMGCoA)に、37℃で135μLの第1測定試薬として試薬E1〜E5のいずれかを加え、5分後に15μLの第2測定試薬として試薬E11またはE12を加えてから、37℃5分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。結果を表5に示す。CoA存在下ではサンプル溶液中のMVA、HMGCoAともに少なくとも10〜100nMの範囲で定量できることがわかる。CoA非存在下では酵素サイクリング反応が起きていないことから、反応式15と反応式16で構成される酵素サイクリング反応は起きていないこと、また反応式17と反応式18で構成される酵素サイクリング反応も起きていないことがわかる。CoA存在下でもHMGL存在下ではサンプルがMVAであっても酵素サイクリング反応が起きていないことからも、反応式15と反応式16で構成される酵素サイクリング反応は起きておらず、起きている酵素サイクリング反応は反応式19と反応式20で構成されている多段階反応での酵素サイクリング法であることがわかる。CoA存在下でもMVK存在下ではサンプルがHMGCoAであっても酵素サイクリング反応が起きていないことからも、反応式17と反応式18で構成される酵素サイクリング反応は起きておらず、起きている酵素サイクリング反応は反応式19と反応式20で構成されている多段階反応での酵素サイクリング法であることがわかる。また、第1測定試薬として試薬E3を用いるとE2を用いるときと比べてサンプルが蒸留水のときの吸光度値が上昇し、E4を用いると上昇したものがもとに戻ることから、ATP中にMVAが混在していることが示唆される。
20μLのサンプル溶液(0nM、0.25nM、0.5nM、1nM、2.5nM、5nM、10nM、25nMまたは50nMになるよう、MVAを蒸留水または管理血清コンセーラN(日水製薬製)に溶解したもの)に180μLの試薬F1を加え、37℃で5分放置した。次に20μLの試薬F2を加えた後17分間の波長405nmの吸光度変化を測定した。なお、測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて4重測定で行った。結果を表6および表7に示す。MVAの測定限界が表6では0.5nM、表7では0.25nMまであることがわかる。
用いた酵素サイクリング法によるCoAの測定
15μLのサンプル溶液(蒸留水、100nM、1000nMのCoA)に試薬G1を135μL加えて5分間保温後、15μLのMVA溶液(0mM、0.0005mM、0.005mM、0.05mM)を加え、26分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。この結果を表8に示す。
同様に、15μLのサンプル溶液(蒸留水、10nM、20nM、50nM、100nM、200nMのCoA)に試薬G1を135μL加えて5分間保温後、15μLのMVA溶液(0.5mM、2.5mM、5mM)を加え、5分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。この結果を表9に示す。
さらに、同様にサンプル溶液(蒸留水、5nM、10nM、20nM、50nM、100nMのCoA)に試薬G2を135μL加えて5分間保温後、15μLのMVA溶液(2.5mM)を加え、5分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を4重測定した。この結果を表10に示す。
CoAの最小検出限界濃度が少なくとも50nM以下であることがわかる。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。
100μLのサンプル溶液(蒸留水、250nMのMVAまたは750nMのHMGCoA)に、100μLの試薬H1または試薬H2を加えて37℃で5分間保温後、1)分画分子量10000の膜で限外ろ過してMVKを除いた、または2)100mMのEDTA溶液を1μL添加してMVKの反応を止めた。次に、1)または2)のサンプル20μLに180μLの試薬F1を加え、37℃で5分放置した。20μLの試薬F2を加えた後5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、膜ろ過後またはEDTA添加後の測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表11に示す。MVKで処理することでMVAがサンプルから除かれていることがわかる。MVKで処理することはHMGCoAの測定に影響を及ぼさないことがわかる。
16μLのサンプル溶液(蒸留水、10nMのMVA、50nMのMVA、100nMのMVA、10nMのHMGCoA、50nMのHMGCoA、100nMのHMGCoA)に37℃で試薬J1(+)またはJ1(-)を80μL加えて1.7分間保温後、24μLの試薬J2を加えて更に3.3分間保温し、その後、40μLの試薬J3を加えて更に3.8分間保温した。次に16μLの試薬J4を加えた後、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。この結果を表12に示す。サンプル中のMVAはMVK処理により1.7分間でほぼ99%除去されたことがわかる。また、サンプル中のHMGCoAの測定値はMVK処理により影響を受けないこともわかる。さらに、試薬J1(+)中に混在していたMVAがMVK処理により除去されたこともわかる。
16μLのサンプル溶液(表13に記載のMVA、HMGCoA濃度の水溶液)に37℃で試薬K1(+)またはK1(-)を80μL加えて1.7分間保温後、24μLの試薬K2を加えて更に3.3分間保温し、40μLの試薬K3を加えて更に3.8分間保温した。その後、16μLの試薬K4(+)またはK1(-)を加え、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。測定に用いた試薬の組合せとその結果を表13に示す。
同様に、サンプル溶液を管理血清に表14記載のMVA、HMGCoA濃度になるように添加して作製したもので、上記測定を行った結果を表14に示す。
サンプル中に存在する50nMまでのMVAは1%未満にまで除去されていることがわかる。また、MVKによる処理はHMGCoAの測定には影響を与えないことがわかる。
表15記載のサンプル溶液1〜6各70μLに、70μLの試薬L1または試薬L2を加えて37℃で5分間保温後、分画分子量10000の膜で限外ろ過してHMGLを除いた。次にろ過済みのサンプル20μLに180μLの試薬F1を加え、37℃で5分放置し、20μLの試薬F2を加えた後、5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、膜ろ過後の測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表16に示す。HMGLで処理することでHMGCoAがサンプルから除かれていることがわかる。また、HMGLで処理することはMVAの測定に影響を及ぼさないことがわかる。
16μLのサンプル溶液(表17に記載のMVA、HMGCoA濃度の水溶液)に37℃で試薬M1(+)またはM1(-)を80μL加えて1.7分間保温後、24μLの試薬M2を加えて更に3.3分間保温し、その後、40μLの試薬M3を加えて更に3.8分間保温し、更にその後16μLの試薬M4を加えた後、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。測定に用いた試薬の組合せとその結果を表17に示す。
同様に、管理血清コンセーラN(日水製薬製)に表18および表19記載のMVA濃度、HMGCoA濃度になるようにこれらを添加して作製したものをサンプル溶液とし、上記測定を行った結果を、それぞれ表18および表19に示す。
サンプル中に存在する、250nMまでのHMGCoAは4%未満にまで、100nMまでのHMGCoAは1%未満にまで、除去されていることがわかる。また、HMGLによる処理はMVAの測定には影響を与えないことがわかる。
試薬N1にATPを1mM、塩化マグネシウムを1mMになるように添加した試薬N2、および試薬N2にMVKを0.3U/mLになるように添加した試薬N3を、それぞれ10mL作製し、37℃で20分間放置した後、それぞれに0.5MのEDTAを0.1mL添加して試薬N2EおよびN3Eを作製した。
試薬N1中に混在するMVAをMVKで消去することで、ブランクの吸光度が70.85から13.92に低下し、MVA50nM測定時の感度は121.27(192.12-70.85で計算)から135.02(148.94-13.92で計算)へと若干の向上を示した。また、試薬N2E中に混在するMVAをMVKで消去することで、ブランクの吸光度が96.01から13.92に低下し、MVA50nM測定時の感度は130.47(226.48-96.01で計算)と、135.02(148.94-13.92で計算)とほぼ同等であった。CoA、T-NAD、NADH、ATPなどに混在する可能性があるMVAおよび試薬製造工程で混入する可能性があるMVAを、MVK処理で処理前の17.3%以下または12.8%以下に低減させることができ、ブランク反応時の吸光度が低い、高感度および高精度な測定に好ましい試薬が得られた。
試薬N1にATPを1mM、塩化マグネシウムを1mMになるように添加した試薬N4、および試薬N4にMVKを0.4U/mLになるように添加した試薬N5を、それぞれ2mL作製し、37℃で20分間放置した後、分画分子量10000の膜で限外ろ過して試薬N4Fおよび試薬N5Fを作製した。
試薬N4F中に混在するMVAをMVKで消去することで、ブランクの吸光度が58.57から10.41に低下し、MVA50nM測定時の感度は70.47(129.04-58.57で計算)および76.37(86.78-10.41で計算)および76.37とほぼ同等であった。CoA、T-NAD、NADH、ATPなどに混在する可能性があるMVA、および試薬製造工程で混入する可能性があるMVAを、MVK処理で9.1%以下に低減させることができ、実施例18と同様、ブランク反応時の吸光度が低い、高感度および高精度な測定に好ましい試薬が得られた。
試薬N1、試薬N1にHMGLを0.5U/mLになるように添加した試薬N6、試薬N1にHMGCoAを125nMになるように添加した試薬N7、試薬N7にHMGLを0.5U/mLになるように添加した試薬N8を、それぞれ2mL作製し、37℃で20分間放置した後に、分画分子量10000の膜で限外ろ過して試薬N1F、試薬N6F、試薬N7F、試薬N8Fを作製した。
試薬N7F中に混在するHMGCoAをHMGLで消去することでブランクの吸光度が305.99から3.81に低下し、MVA100nM測定時の感度は50.71(356.70-305.99で計算)から67.41(71.22-3.81で計算)へと向上した。仮に試薬製造工程でHMGCoAが混入した場合においても、125nMのHMGCoAであればHMGL処理で完全に除去することができ、ブランク反応時の吸光度が低い、高感度および高精度な測定に好ましい試薬が得られた。
15μLのサンプル溶液(蒸留水または表23記載のMVA溶液またはHMGCoA溶液)に、37℃で135μLの実施例18記載の試薬N3Eを加え、5分後に15μLの10mM Tris-HCl(pH7.5)に溶解した12U/mLのHMGR溶液を加え、26分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。結果を表23ならびに図1および図2に示す。MVAおよびHMGCoAを精度よく測定できたことがわかる。
10μLのHMGR溶液(実施例1記載の方法で製造した3.3U/mLのHMGR溶液または実施例1記載の方法に加え実施例5記載と同様にHydroxyapatiteカラムクロマトグラフィーを行って製造した3.3U/mLのHMGR溶液)に37℃で180μLの試薬P1(+)または試薬P1(-)を加え、5分後に20μLの試薬P2を加え、5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表24に示す。酵素サイクリング反応が起き、MVAを測定できることがわかる。また、Hydroxyapatiteカラムクロマトグラフィーを行った精製純度が高いHMGR溶液を用いた場合、ブランクが低く抑えられ、測定感度も高いことがわかる。
10μLのHMGR溶液(実施例2記載の方法で製造した6.3U/mL、3.2U/mLまたは1.6U/mLののHMGR溶液)に、37℃で180μLの試薬P1(+)または試薬P1(-)を加え、5分後に20μLの試薬P2を加え、5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表25に示す。酵素サイクリング反応が起き、MVAを測定できること、HMGR量が増えると測定感度が高くなることがわかる。
10μLのHMGR溶液(実施例3記載の方法で製造した12.0U/mLのHMGR溶液または実施例4記載の方法で製造した5.4U/mLのHMGR溶液)に、37℃で180μLの試薬P1(+)または試薬P1(-)を加え、5分後に20μLの試薬P2を加え、5分間の波長405nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行った。結果を表26に示す。酵素サイクリング反応が起き、MVAを測定できることがわかる。
<熱安定性>
各HMGRを10mMTris-HCl(pH7.5)、0.05%BSAで約0.4U/mlに希釈する。この酵素液を各温度で10分処理した後の残存活性(%)を測定した。結果を表27に示す。
<pH安定性>
各HMGRをそれぞれのpHの20mM 緩衝液、0.05%BSAで約0.4U/mlに希釈する。この酵素液をHMGR-Vは72.5℃、HMGR-Dは60℃、HMGR-Cは65℃、HMGR-Pは65℃、HMGR-Aは80℃で10分処理した後の残存活性(%)を測定した。緩衝液は、pH4.0-6.0:酢酸-酢酸ナトリウム、pH6.0-7.5:リン酸カリウム、pH7.0-10.0:Tris-HCl、pH9.5-11.0:CAPSを使用した。結果を図3から図7に示す。HMGR-VはpH6.0-8.0、HMGR-DはpH5.5-8.5、HMGR-CはpH4.0、pH6.0-10.0、pH11.0、HMGR-PはpH4.5-8.5、HMGR-AはpH4.0、pH6.0-11.0で安定である。
<至適pH>
各HMGRを10mMTris-HCl(pH7.5)、0.05%BSAで約0.4U/mlに希釈する。この酵素液を試薬Bの50mMTris-HCl(pH8.5)を50mMの各pHの緩衝液に変更して0.05%BSAを含む反応液でHMGRの活性を測定した。各pHでの相対活性(%)を図8から図12に示す。なお、緩衝液は、pH6.0-7.5:リン酸カリウム、pH7.0-10.0:Tris-HCl、pH9.5-11.0:CAPSを使用した。すべてのHMGRにおいてpH9.0-10.5において活性が一番高くなるが、HMGR-VはpH7.5-10.0、HMGR-DはpH8.5-10.0、HMGR-CはpH7.0-10.0、HMGR-PはpH7.0-10.0、HMGR-AはpH7.0-10.5に至適pHがある。
<Km値:MVA>
試薬BのMVAの濃度を0.005mMから5mMになるように変化させて、各HMGRのKm値を測定した。HMGR-Vは0.36mM、HMGR-Dは0.18mM、HMGR-Cは0.66mM、HMGR-Pは0.47mM、HMGR-Aは0.25mMであった。
<Km値:CoA>
試薬Bに0.5%になるようにBSAを加えて、CoAの濃度を0.01mMから5mMになるように変化させて、各HMGRのKm値を測定した。HMGR-Vは0.066mM、HMGR-Dは0.038mM、HMGR-Cは0.073mM、HMGR-Pは0.097mM、HMGR-Aは0.035mMであった。
<Km値:NAD>
試薬Bに0.5%になるようにBSAを加えて、CoAの濃度を0.5mMにして、NADの濃度を0.005mMから5mMになるように変化させて、各HMGRのKm値を測定した。HMGR-Vは0.19mM、HMGR-Dは0.08mM、HMGR-Cは0.26mM、HMGR-Pは0.29mM、HMGR-Aは0.17mMであった。
<分子量:ゲル濾過>
TSKgel G3000SWxL(東ソー製)を用いて移動相として50mMPi-K(pH7.5)、0.2M硫酸ナトリウム、0.05%アジ化ナトリウムでのゲル濾過により、各HMGR分子量を測定した。HMGR-Vは330000、HMGR-Dは260000、HMGR-Cは270000、HMGR-Pは280000、HMGR-Aは410000であった。
<分子量:SDS-PAGE>
SDS-PAGEにより、各HMGR分子量を測定した。HMGR-Vは42000、HMGR-Dは42000、HMGR-Cは42000、HMGR-Pは45000、HMGR-Aは40000であった。
<アミノ酸配列>
HMGR-VのN末端アミノ酸配列は配列番号25に示した。ただし、1番目はMetまたはValである。HMGR-DのN末端アミノ酸配列は配列番号26に示した。ただし、1番目はMet、ValまたはThr、24番目はAspまたはAlaである。HMGR-CのN末端アミノ酸配列は配列番号27に示した。ただし、1番目はMet、AlaまたはThr、23番目はThrまたはLeu、35番目はLeuまたはGluである。
5μLのサンプル液(蒸留水、50nM MVA(100nM D,L-MVA)、血漿1、血漿2、血清1、血清2)に150μLの試薬Q1Aまたは試薬Q1Bを加え、37℃で5分放置した後、50μLの試薬Q2を加えた後1分後から4分間の波長405nm(副波長660nm)の吸光度変化を測定した。結果を表28に示す。MVKで消去後の測定値を用いた計算値はサンプル中に存在するHMGcoAによる反応または非特異反応によるブランクを差し引いたものでより正確なD-MVA濃度である。なお、測定は自動分析機7170S(日立製)を用いて行い、血漿および血清サンプルはコージンバイオから購入したものを使用した(血漿1:正常ヒト血漿・プール クエン酸Na 、血漿2:1正常ヒト血漿・プール ヘパリン、血清1:正常ヒト血清・プール、血清2:正常ヒト血清・個体別)。
7.5μLのサンプル液(蒸留水、50nM MVA(100nM D,L-MVA)、蒸留水で200倍に希釈した尿1(希釈尿1)、蒸留水で200倍に希釈した尿2(希釈尿2))に120μLの試薬R1を加え、37℃で5分放置した後、30μLの試薬R2を加えた後10分間の波長410nmの吸光度変化を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。尿1および尿2は同一人物の同一日の4:00および17:00の尿であり、その尿中クレアチニン値をクレアチニン測定試薬(LタイプワコーCRE・M:和光純薬製)を用いて測定した。結果を表29と表30に示す。クレアチニンで補正した値は尿の濃淡の影響が軽減された指標となる。
16μLのサンプル液(蒸留水、MVA液、表33のsample1-12)に37℃で試薬K1(+)またはK1(-)を80μL加えて、1.7分間保温後、24μLの試薬K2を加えて更に3.3分間保温し、40μLの試薬K3を加えて更に3.8分間保温した。その後16μLの試薬K1(+)またはK1(-)を加え、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。測定に用いた試薬の組み合わせと測定値を表31、表32に示す。測定値MVA[nM]は蒸留水とD-MVA100nM(D,L-MVAとして200nM)で検量線を作成して計算した。試薬K1(+)、K2、K3、K4(+)、試薬K1(-)、K2、K3、K4(-)の組み合わせとで蒸留水を測定したときの吸光度[mABS]に差があるのは実施例19にも記載したように試薬中に混在するMVAによるものであると推定される。sample1-12の調製法は表33に示す。なお、表33中のsample番号と表31および表32のサンプル番号は対応している。
D,L-Mevalonic acid lactone(シグマM4667)を正確に秤量して0.5M溶液を作製し、その溶液を正確に希釈することで0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mMのD,L-MVA液を作製した。D-Mevalonic acid lactone(東京化成M1347)を正確に秤量して0.5M溶液を作製し、その溶液を正確に希釈することで0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mMのD-MVA液を作製した。
二種類のNADH水溶液A、Bを作製し、ダブルモノクロメーターの分光光度計(島津UV-2550)で340nm、1cmの吸光度を測定すると1.0915と2.683であった。
自動分析機BM9020(日本電子製)の測定波長340nm、副波長658nmでの精度を確認するために、25μLのNADH水溶液AまたはNADH水溶液Bに37℃で75μLの蒸留水を加えて吸光度Aaを測定し、さらに8.8分後に75μLの蒸留水を加えて吸光度Abを測定した。水溶液Aの吸光度Aaは0.23602、吸光度Abは0.13452で、NADH水溶液Bの吸光度Aaは0.59107、Abは0.33786であった。それぞれの場合でBM9020の装置係数を求めると、0.86(=0.23602/(1.0915x25/(25+75)))、0.86(=0.13425/(1.0915x25/(25+75+75)))、0.88(=0.59107/(2.683x25/(25+75)))、0.88(=0.33786/(2.683x25/(25+75+75)))となり、平均すると0.87になる。
MVKは大腸菌で発現させたSaccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来を使用した。
25μLの蒸留水、D,L-MVA液またはD-MVA液に、37℃で75μLの試薬S1を加え、8.8分後に75μLの試薬S2を加え、測定波長340nmのS2添加前の吸光度A1[ABS]、S2添加6分後の吸光度A2[ABS]を自動分析機BM9020(日本電子製)で測定した。サンプルが蒸留水、0.5mM D,L-MVA、0.5mM D-MVAのときの反応タイムコースを図13に示す。
これらの結果とNADHのモル吸光係数6.3x1000[l/(mol・cm)]から、
生成したNADH(nmol)=(A2x175-A1x100)/(6.3x0.87)
であり、サンプルが蒸留水であるブランク反応との差がD-MVAから生成したNADH量である。これにより、D,L-MVA液またはD-MVA液に含まれるD-MVA量を測定した。この結果を表34に示す。平均するとD,L-Mevalonic acid lactone(シグマM4667)のD-MVA含量は0.50、D-Mevalonic acid lactone(東京化成M1347)のD-MVA含量は0.88となる。このように、標準測定法を定めることで、正確なMVA量を測定できるようになり、MVA標準品を作成することができることがわかる。
各濃度のD-MVA液は実施例25で作製したものを使用した。
自動分析機BM9020(日本電子製)の装置係数は実施例25で測定した0.87を使用した。
HMGRは大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来、HMGLは大腸菌で発現させたPseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来を使用した。
25μLの蒸留水、D,L-MVA液またはD-MVA液に、37℃で75μLの試薬T1を加え、1.8分後に75μLの試薬T2を加え、測定波長340nmのT2添加前の吸光度A1[ABS]、T2添加13分後の吸光度A2[ABS]を自動分析機BM9020(日本電子製)で測定した。サンプルが蒸留水、0.5mM D,L-MVA、0.5mM D-MVAのときの反応タイムコースを図14に示す。
これらの結果とNADHのモル吸光係数6.3x1000 [l/(mol・cm)]から、
生成したNADH(nmol)=(A2x175-A1x100)/(6.3x0.87)
であり、サンプルが蒸留水であるブランク反応との差がD-MVAから生成したNADH量である。これにより、D,L-MVA液またはD-MVA液に含まれるD-MVA量を測定した。この結果を表35に示す。平均するとD,L-Mevalonic acid lactone(シグマM4667)のD-MVA含量は0.50、D-Mevalonic acid lactone(東京化成M1347)のD-MVA含量は0.90となる。このように、標準測定法を定めることで、正確なMVA量を測定できるようになり、MVA標準品を作成することができることがわかる。
上記実施例において用いた培地を以下に記載する。
培地A
A1に、A2を3%、A3を0.5%添加して作製した。
B1に、B2を3%、B3を0.5%添加して作製した。
C1に、C2を3%、C3を0.5%添加して作製した。
上記実施例において用いた試薬の組成を以下に記載する。
配列番号2は、Pseudomonas mevalonii由来のHMGRのアミノ酸配列である。
配列番号3は、Archaeoglobus flugidus (NBRC100126)由来のHMGRのアミノ酸配列である。
配列番号4は、POPプロモーターの塩基配列である。
配列番号5は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)のMVK遺伝子の塩基配列である。
配列番号6は、Pseudomonas mevalonii由来のHMGLのアミノ酸配列である。
配列番号7は、Pseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来のHMGLのアミノ酸配列である。
配列番号8は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号9は、Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号10は、Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号11は、Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号12は、Pseudomonas sp.1-MV (NBRC-11063)由来のHMGR遺伝子の塩基配列である。
配列番号13は、Pseudomonas mevalonii由来のHMGR遺伝子の塩基配列である。
配列番号14は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGR増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号15は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGR増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号16は、Archaeoglobus flugidus (NBRC100126)由来のHMGR増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号17は、Archaeoglobus flugidus (NBRC100126)由来のHMGR増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号18は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK前半増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号19は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK前半増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号20は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK後半増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号21は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK後半増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号22は、Pseudomonas putida KT2440由来のHMGL増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号23は、Pseudomonas putida KT2440由来のHMGL増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号24は、POPプロモーターにクローニング部位が連結した塩基配列である。
配列番号25は、Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)由来のHMGRのN末端アミノ酸配列である。
配列番号26は、Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)由来のHMGRのN末端アミノ酸配列である。
配列番号27は、Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)由来のHMGRのN末端アミノ酸配列である。
異なった実験室で物質Aの量を測定するようになると、同じ被検液中の物質Aの量が実験室aで測定した値と実験室bで測定した値で誤差が出てくる。この誤差は測定試薬およびその測定手順、測定装置、キャリブレーター、測定者などが異なるために生じるのであるが、実験室間の誤差をできるだけ小さくすることが医療の現場の臨床検査室などで求められている。この実験室間の誤差をできるだけ小さくするためには、物質Aの標準物質と物質Aの標準測定法を定めて、それを基に日常に用いられるキャリブレーター中に存在する物質Aの量を値付けて日常の測定法で測定するという物質A測定のトレーサビリティ(Clin Chem. 2009 Jun;55(6):1067-75)が確立できればよい。
ここで、MVA測定のトレーサビリティを確立しようとすると、まず標準物質と標準測定法を定めなければならない。一般に試薬として販売されているMVAおよびD,L-MVA(例えば東京化成工業株式会社の製品コードM1374:D-Mevalonolactoneやシグマ社の製品番号M4667:(±)-Mevalonolactone(DL-Mevalonic acid lactone))はその正確な純度は不明であるし、その純度測定法も滴定などの特異性が低い方法か、GCなど標準物質が存在しないと絶対量を測定できない方法か、光学異性体の含量比率のみを測定する偏光分析やNMRによる方法(J Lipid Res. 1982 May;23(4):645-52)か、MVKにピルビン酸キナーゼと乳酸デヒドロゲナーゼを共役させてNADHの減少で測定する(Methods Enzymol. 1969;15:393-454)という後述するように精度が不十分であると考えられる方法しか知られておらず、適切な標準物質と標準測定法と呼べるものはなかった。そこで標準測定法の候補として、本発明者は酵素の特異性を利用したNAD(P)Hが増加する反応系において、NAD(P)Hの吸光係数を基にMVAの正確な量を測定する方法を二つ考案した。
一つの方法は、MVKを用いた反応式21:
ADP依存ヘキソキナーゼ(ADP特異グルコキナーゼ(EC2.7.1.47)ともいう)を用いた反応式25:
グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.49)を用いた反応式26:
6-ホスホグルコノラクトナーゼ(EC3.1.1.31)を用いた反応式27:
を組み合わせる方法であって、MVA(D-MVA)をNAD(P)Hにすべて変換することができNAD(P)Hの吸光係数を用いて正確なMVA(D-MVA)量を測定することができる。ここで反応式27はpHを調節する(例えば8.0以上、好ましくは8.5以上、より好ましくは9.0以上)と酵素を介在せずとも反応式27が進行するので6-ホスホグルコノラクトナーゼ(EC3.3.3.31)を用いなくてもよい場合がある。また、反応式25においてグルコースの代わりにADP依存ヘキソキナーゼが作用する基質を用い、その生成物に対応するデヒドロゲナーゼを用いて反応式26に対応する反応を行うことも可能である。
もう一つの方法はHMGRを用いた反応式11:
による方法であり、好ましくはHMGLを用いた反応式22:
を組み合わせる方法であって、MVA(D-MVA)をNAD(P)Hにすべて変換することができNAD(P)Hの吸光係数を用いて正確なMVA(D-MVA)量を測定することができる。ここで反応式22はハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAハイドロラーゼ(EC3.1.2.5)を用いた反応式23:
に、またはハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAシンセターゼ(EC2.3.3.10)を用いた反応式24:
に置き換えることも可能である。
水溶液中のMVAは分子内のヒドロキシ基とカルボキシル基が脱水縮合したラクトンとラクトンが加水分解されたヒドロキシカルボン酸の平衡状態にあると考えられるが、反応に関与する基質と生成物の構造の観点からMVKやHMGRはラクトンでなくヒドロキシカルボン酸のMVAに作用していると考えられる。MVKによるMVAからメバロン酸リン酸への反応およびHMGRによるMVAからHMGcoAへの反応の至適pHが高pH領域にあることの要因のひとつとして、高pH領域でラクトンが加水分解され平衡がヒドロキシカルボン酸に偏っていることが挙げられる。よって、MVAをMVKまたはHMGRを用いた酵素反応で正確に測定しようとする場合には、平衡をヒドロキシカルボン酸に偏らせることが重要であり、そのためにはMVAのラクトンを加水分解するラクトナーゼを添加することも考えられるが、簡便性の点からはその反応pHが高pH領域であること(試薬または反応液のpHが8.5以上、好ましくは9.0以上、より好ましくは9.5以上、さらに好ましくは10.0以上であること)が望ましい。一方、デヒドロゲナーゼ等によるNAD(P)Hが生成する反応の至適pHは酵素や基質など反応に関与する成分の安定性が保てる範囲において高pH領域にあり、NAD(P)が生成する反応の至適pHは酵素や基質など反応に関与する成分の安定性が保てる範囲において低pH領域にあることが一般に知られており、デヒドロゲナーゼによるNAD(P)Hの増加を測定する場合には高pH領域、NAD(P)Hの減少を測定する場合には低pH領域であることが望ましい。しかし、上述したMVKにピルビン酸キナンーゼと乳酸デヒドロゲナーゼを共役させてNADHの減少で測定する方法ではMVKによる反応においては高pH領域が望ましく、乳酸デヒドロゲナーゼによる反応では低pH領域が望ましいという矛盾したpH設定の問題があり(Methods Enzymol. 1969;15:393-454において、pHは7.3-7.4に設定されている)、それに加えて吸光度の問題から反応系に添加できるNADH量に限りがあり、高いブランク反応等の問題もあり、正確なMVA量を測定するには不十分な反応系である。また、MVAをMVKまたはHMGRを用いた酵素反応で正確に測定しようとする場合には、平衡をヒドロキシカルボン酸に偏らせるために、その反応pHは高pH領域であること、例えば試薬または反応液のpHが8.5以上、好ましくは9.0以上、より好ましくは9.5以上、さらに好ましくは10.0以上であることが重要であることは先に述べたが、そのような高pH領域において補酵素(例えばCoA)の安定性の観点、またMVK、HMGRおよびそれらと共役させて用いる酵素の安定性と反応性の観点から、安定かつ十分に反応が進行するとは考えもしないものであった。しかし、驚くべきことに本発明者は上記のMVKまたはHMGRを用いたNAD(P)Hが増加する反応系において、安定かつ十分に反応が進行することを発見し、NAD(P)Hの吸光係数を基にMVAの正確な量を短時間(例えば30分以内、15分以内、10分以内)の反応で精度よく測定する方法を発見したのである。
これらの方法により、正確なMVA量が値付けされた標準物質を提供することができ、MVA測定のトレーサビレティを確立することができる。
Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)の同定
土壌から分離したPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)は、以下の表1に示す特徴およ
び16SrDNAの配列(配列番号8)から、Pseudomonas migulaeに近縁なPseudomonas sp.と同定
し、平成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人
産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)の同定
土壌から分離したVariovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)は、以下の表2に示す特徴およ
び16SrDNAの配列(配列番号9)から、Variovorax属に属するVariovorax sp.と同定し、平成
20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人産業技術
総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)の同定
土壌から分離したDelftia sp.12-MV(FERM BP-11065)は、以下の表3に示す特徴および16
SrDNAの配列(配列番号10)から、Delftia acidovoransに近縁なDelftia sp.と同定し、平
成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法人産業技
術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)の同定
土壌から分離したComamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)は、以下の表4に示す特徴およ
び16SrDNAの配列(配列番号11)から、Comamonas testosteroniに近縁なComamonas sp.と同
定し、平成20年11月13日に日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6所在の独立行政法
人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
Archaeoglobus fulgidus(NBRC100126)の染色体DNAを鋳型にして、配列番号16および配列番号17記載の配列を有するプライマーを用いてPCRを行い、HMGR遺伝子を含むDNA断片を得た。得られたDNA断片をXbaIとSacIで切断したものと、プラスミドpPOW1を同じくXbaIとSacIで切断したものとを連結して得たプラスミドpPOW1-HMGRafを、大腸菌W3110株に導入してHMGR生産遺伝子組換菌を得た。
16μLのサンプル溶液(表13に記載のMVA、HMGCoA濃度の水溶液)に37℃で試薬K1(+)またはK1(-)を80μL加えて1.7分間保温後、24μLの試薬K2を加えて更に3.3分間保温し、40μLの試薬K3を加えて更に3.8分間保温した。その後、16μLの試薬K4(+)またはK4(-)を加え、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。測定に用いた試薬の組合せとその結果を表13に示す。
同様に、サンプル溶液を管理血清に表14記載のMVA、HMGCoA濃度になるように添加して作製したもので、上記測定を行った結果を表14に示す。
サンプル中に存在する50nMまでのMVAは1%未満にまで除去されていることがわかる。また、MVKによる処理はHMGCoAの測定には影響を与えないことがわかる。
試薬N4F中に混在するMVAをMVKで消去することで、ブランクの吸光度が58.57から10.41に低下し、MVA50nM測定時の感度は70.47(129.04-58.57で計算)および76.37(86.78-10.41で計算)とほぼ同等であった。CoA、T-NAD、NADH、ATPなどに混在する可能性があるMVA、および試薬製造工程で混入する可能性があるMVAを、MVK処理で9.1%以下に低減させることができ、実施例18と同様、ブランク反応時の吸光度が低い、高感度および高精度な測定に好ましい試薬が得られた。
15μLのサンプル溶液(蒸留水または表23記載のMVA溶液またはHMGCoA溶液)に、37℃で135μLの実施例18記載の試薬N3Eを加え、5分後に15μLの10mM Tris-HCl(pH7.5)に溶解した12U/mLのHMGR溶液を加え、26分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。結果を表23ならびに図1および図2に示す。MVAおよびHMGCoAを精度よく測定できたことがわかる。
<熱安定性>
各HMGRを10mMTris-HCl(pH7.5)、0.05%BSAで約0.4U/mlに希釈する。この酵素液を各温度で10分処理した後の残存活性(%)を測定した。結果を表27に示す。
<pH安定性>
各HMGRをそれぞれのpHの20mM 緩衝液、0.05%BSAで約0.4U/mlに希釈する。この酵素液をHMGR-Vは72.5℃、HMGR-Dは60℃、HMGR-Cは65℃、HMGR-Pは65℃、HMGR-Aは80℃で10分処理した後の残存活性(%)を測定した。緩衝液は、pH4.0-6.0:酢酸-酢酸ナトリウム、pH6.0-7.5:リン酸カリウム、pH7.0-10.0:Tris-HCl、pH9.5-11.0:CAPSを使用した。結果を図3から図7に示す。HMGR-VはpH6.0-8.0、HMGR-DはpH5.5-8.5、HMGR-CはpH4.0、pH6.0-10.0、pH11.0、HMGR-PはpH4.5-8.5、HMGR-AはpH4.0、pH6.0-11.0で安定である。
<至適pH>
各HMGRを10mMTris-HCl(pH7.5)、0.05%BSAで約0.4U/mlに希釈する。この酵素液を試薬Bの50mMTris-HCl(pH8.5)を50mMの各pHの緩衝液に変更して0.05%BSAを含む反応液でHMGRの活性を測定した。各pHでの相対活性(%)を図8から図12に示す。なお、緩衝液は、pH6.0-7.5:リン酸カリウム、pH7.0-10.0:Tris-HCl、pH9.5-11.0:CAPSを使用した。すべてのHMGRにおいてpH9.0-10.5において活性が一番高くなるが、HMGR-VはpH7.5-10.0、HMGR-DはpH8.5-10.0、HMGR-CはpH7.0-10.0、HMGR-PはpH7.0-10.0、HMGR-AはpH7.0-10.5に至適pHがある。
<Km値:MVA>
試薬BのMVAの濃度を0.005mMから5mMになるように変化させて、各HMGRのKm値を測定した。HMGR-Vは0.36mM、HMGR-Dは0.18mM、HMGR-Cは0.66mM、HMGR-Pは0.47mM、HMGR-Aは0.25mMであった。
<Km値:CoA>
試薬Bに0.5%になるようにBSAを加えて、CoAの濃度を0.01mMから5mMになるように変化させて、各HMGRのKm値を測定した。HMGR-Vは0.066mM、HMGR-Dは0.038mM、HMGR-Cは0.073mM、HMGR-Pは0.097mM、HMGR-Aは0.035mMであった。
<Km値:NAD>
試薬Bに0.5%になるようにBSAを加えて、CoAの濃度を0.5mMにして、NADの濃度を0.005mMから5mMになるように変化させて、各HMGRのKm値を測定した。HMGR-Vは0.19mM、HMGR-Dは0.08mM、HMGR-Cは0.26mM、HMGR-Pは0.29mM、HMGR-Aは0.17mMであった。
<分子量:ゲル濾過>
TSKgel G3000SWxL(東ソー製)を用いて移動相として50mMPi-K(pH7.5)、0.2M硫酸ナトリウム、0.05%アジ化ナトリウムでのゲル濾過により、各HMGR分子量を測定した。HMGR-Vは330000、HMGR-Dは260000、HMGR-Cは270000、HMGR-Pは280000、HMGR-Aは410000であった。
<分子量:SDS-PAGE>
SDS-PAGEにより、各HMGR分子量を測定した。HMGR-Vは42000、HMGR-Dは42000、HMGR-Cは42000、HMGR-Pは45000、HMGR-Aは40000であった。
<アミノ酸配列>
HMGR-VのN末端アミノ酸配列は配列番号25に示した。ただし、1番目はMetまたはValである。HMGR-DのN末端アミノ酸配列は配列番号26に示した。ただし、1番目はMet、ValまたはThr、24番目はAspまたはAlaである。HMGR-CのN末端アミノ酸配列は配列番号27に示した。ただし、1番目はMet、AlaまたはThr、23番目はThrまたはLeu、35番目はLeuまたはGluである。
16μLのサンプル液(蒸留水、MVA液、表33のsample1-12)に37℃で試薬K1(+)またはK1(-)を80μL加えて、1.7分間保温後、24μLの試薬K2を加えて更に3.3分間保温し、40μLの試薬K3を加えて更に3.8分間保温した。その後16μLの試薬K4(+)またはK4(-)を加え、22.0分間の波長410nmの吸光度変化[mABS]を測定した。なお、測定は自動分析機BM9020(日本電子製)を用いて行った。測定に用いた試薬の組み合わせと測定値を表31、表32に示す。測定値MVA[nM]は蒸留水とD-MVA100nM(D,L-MVAとして200nM)で検量線を作成して計算した。試薬K1(+)、K2、K3、K4(+)、試薬K1(-)、K2、K3、K4(-)の組み合わせとで蒸留水を測定したときの吸光度[mABS]に差があるのは実施例19にも記載したように試薬中に混在するMVAによるものであると推定される。sample1-12の調製法は表33に示す。なお、表33中のsample番号と表31および表32のサンプル番号は対応している。
各濃度のD-MVA液は実施例29で作製したものを使用した。
自動分析機BM9020(日本電子製)の装置係数は実施例29で測定した0.87を使用した。
HMGRは大腸菌で発現させたPseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来、HMGLは大腸菌で発現させたPseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来を使用した。
25μLの蒸留水、D,L-MVA液またはD-MVA液に、37℃で75μLの試薬T1を加え、5分後に75μLの試薬T2を加え、測定波長340nmのT2添加前の吸光度A1[ABS]、T2添加13分後の吸光度A2[ABS]を自動分析機BM9020(日本電子製)で測定した。サンプルが蒸留水、0.5mM D,L-MVA、0.5mM D-MVAのときの反応タイムコースを図14に示す。
これらの結果とNADHのモル吸光係数6.3x1000 [l/(mol・cm)]から、
生成したNADH(nmol)=(A2x175-A1x100)/(6.3x0.87)
であり、サンプルが蒸留水であるブランク反応との差がD-MVAから生成したNADH量である。これにより、D,L-MVA液またはD-MVA液に含まれるD-MVA量を測定した。この結果を表35に示す。平均するとD,L-Mevalonic acid lactone(シグマM4667)のD-MVA含量は0.50、D-Mevalonic acid lactone(東京化成M1347)のD-MVA含量は0.90となる。このように、標準測定法を定めることで、正確なMVA量を測定できるようになり、MVA標準品を作成することができることがわかる。
配列番号2は、Pseudomonas mevalonii由来のHMGRのアミノ酸配列である。
配列番号3は、Archaeoglobus fulgidus (NBRC100126)由来のHMGRのアミノ酸配列である。
配列番号4は、POPプロモーターの塩基配列である。
配列番号5は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)のMVK遺伝子の塩基配列である。
配列番号6は、Pseudomonas mevalonii由来のHMGLのアミノ酸配列である。
配列番号7は、Pseudomonas putida KT2440 (ATCC47054)由来のHMGLのアミノ酸配列である。
配列番号8は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号9は、Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号10は、Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号11は、Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)の16SrDNAの塩基配列である。
配列番号12は、Pseudomonas sp.1-MV (NBRC-11063)由来のHMGR遺伝子の塩基配列である。
配列番号13は、Pseudomonas mevalonii由来のHMGR遺伝子の塩基配列である。
配列番号14は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGR増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号15は、Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)由来のHMGR増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号16は、Archaeoglobus fulgidus (NBRC100126)由来のHMGR増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号17は、Archaeoglobus fulgidus (NBRC100126)由来のHMGR増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号18は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK前半増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号19は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK前半増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号20は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK後半増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号21は、Saccharomyces cerevisiae (NBRC1136)由来のMVK後半増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号22は、Pseudomonas putida KT2440由来のHMGL増幅用プライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号23は、Pseudomonas putida KT2440由来のHMGL増幅用プライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号24は、POPプロモーターにクローニング部位が連結した塩基配列である。
配列番号25は、Variovoraxsp.5-MV (FERM BP-11064)由来のHMGRのN末端アミノ酸配列である。
配列番号26は、Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)由来のHMGRのN末端アミノ酸配列である。
配列番号27は、Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)由来のHMGRのN末端アミノ酸配列である。
Claims (36)
- 被検液中の測定対象物質である、メバロン酸および/または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAの濃度の測定方法であって、以下の工程(p)および(q):
(p)メバロン酸および/または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有する被検液に、水素受容体X、水素供与体YおよびコエンザイムAの存在下、反応式1:
の反応を触媒する酵素および反応式2:
の反応を触媒する酵素を作用させる工程;および
(q)生成する還元型水素受容体Xの量または生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程;
を含み、ここで、前記水素供与体Yと前記還元型水素受容体Xとは同一でない、前記の測定方法。 - 被検液中の測定対象物質である、コエンザイムAの濃度の測定方法であって、以下の工程(p’)および(q’):
(p’)コエンザイムAを含有する被検液に、水素受容体Xと水素供与体Yとメバロン酸の存在下、反応式1:
を触媒する酵素および反応式2:
を触媒する酵素を作用させる工程;および
(q’)生成する還元型水素受容体Xの量または生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程;
を含み、ここで、前記水素供与体Yと前記還元型水素受容体Xとは同一でない、前記の測定方法。 - 前記測定対象物質の濃度が30nMより小さく、
前記生成する還元型水素受容体Xまたは生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程が、比色分析により行われる、請求項1または2記載の測定方法。 - 前記水素受容体Xが酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の測定方法。
- 前記水素供与体Yが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類である、請求項1〜4のいずれかに記載の測定方法。
- 前記酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび酸化型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項4または5記載の測定方法。
- 前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項5または6記載の測定方法。
- 前記測定対象物質の濃度が100nMより小さく、
前記水素受容体Xが、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、
前記水素供与体Yが、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸であり、
前記生成する還元型水素受容体Xまたは生成する酸化型水素供与体Yの量または減少する水素受容体Xの量または減少する水素供与体Yの量を測定する工程が、比色分析により行われる、請求項1または2記載の測定方法。 - 前記反応式1を触媒する酵素が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼである、請求項1〜8のいずれかに記載の測定方法。
- 前記反応式2を触媒する酵素が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼである、請求項1〜9のいずれかに記載の測定方法。
- 前記ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼが、Pseudomonas属、Variovorax属、Delftia属、Comamonas属またはArchaeoglobus属由来である、請求項9または10記載の測定方法。
- 前記反応式1および/または反応式2を触媒する酵素が:
(i)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質;または
(ii)配列番号1〜3のいずれかで示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および/または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1および/または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質;
である、請求項1〜8のいずれかに記載の測定方法。 - 前記被検液が、メバロン酸および3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有し、測定対象物質が3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAであり、前記工程(p)に先立って以下の工程(o):
(o)前記被検液からメバロン酸を除く工程;
をさらに含む、請求項1および3〜12のいずれかに記載の測定方法。 - 前記工程(o)が、酵素反応により行われる、請求項13記載の測定方法。
- 前記酵素反応が、メバロン酸キナーゼによる酵素反応である、請求項14記載の測定方法。
- 前記工程(o)が、メバロン酸キナーゼによる酵素反応により行われ、その後、分離操作を行うことなく工程(p)を行うことを特徴とする、請求項13記載の測定方法。
- 前記メバロン酸キナーゼが:
(i)配列番号5の塩基配列でコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質;または
(ii)配列番号5の塩基配列でコードされるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および/または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式21の反応を触媒する活性を有するタンパク質;
である、請求項16記載の測定方法。
- 前記被検液が、メバロン酸および3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを含有し、測定対象物質がメバロン酸であり、前記工程(p)に先立って以下の工程(o’):
(o’)前記被検液から3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAを除く工程;
をさらに含む、請求項1および3〜12のいずれかに記載の測定方法。 - 前記工程(o’)が、酵素反応により行われる、請求項18記載の測定方法。
- 前記酵素反応が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼによる酵素反応である、請求項19記載の測定方法。
- 前記工程(o’)が、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼによる酵素反応により行われ、その後、分離操作を行うことなく工程(p)を行うことを特徴とする、請求項18記載の測定方法。
- 前記ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼが:
(i)配列番号7のアミノ酸配列を有するタンパク質;または
(ii)配列番号7のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および/または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式22の反応を触媒する活性を有するタンパク質;
である、請求項21記載の測定方法。
- ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸および/または3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬。
- 前記試薬中にメバロン酸が実質的に混在しないことを特徴とする、請求項23記載の測定用試薬。
- 前記試薬中に3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAが実質的に混在しないことを特徴とする、請求項23または24記載の測定用試薬。
- ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、メバロン酸、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、コエンザイムA測定用試薬。
- ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、コエンザイムA、リン酸供与体、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムA測定用試薬。
- ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼ、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAリアーゼ、コエンザイムA、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を含有することを特徴とする、メバロン酸測定用試薬。
- 菌株Pseudomonas sp.1-MV (FERM BP-11063)又は、16SrDNAの配列が配列番号8と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1:
または反応式2:
の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。 - 菌株Variovorax sp.5-MV (FERM BP-11064)又は、16SrDNAの配列が配列番号9と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1:
または反応式2:
の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。 - 菌株Delftia sp.12-MV (FERM BP-11065)又は、16SrDNAの配列が配列番号10と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1:
または反応式2:
の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。 - 菌株Comamonas sp.25-MV (FERM BP-11066)又は、16SrDNAの配列が配列番号11と97%以上の相同性を有し、かつ反応式1:
または反応式2:
の反応を触媒する活性を有するタンパク質生産能を有するその変異体。 - 以下の(A)〜(C)のいずれかに記載のタンパク質:
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質;
(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、付加、および/または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1:
または反応式2:
の反応を触媒する活性を有するタンパク質;および
(C)配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、反応式1または反応式2の反応を触媒する活性を有するタンパク質。 - サンプル中のメバロン酸量を正確に測定するメバロン酸標準測定法であって、少なくとも以下の(i)〜(iv)の工程;
(i)サンプル中のメバロン酸にATP存在下、メバロン酸キナーゼを作用させメバロン酸とATPをメバロン酸リン酸とADPに変換する工程;
(ii)(i)で生じたADPにグルコース存在下でADP依存ヘキソキナーゼを作用させグルコース-6-リン酸とAMPに変換する工程;
(iii)(ii)で生じたグルコース-6-リン酸を酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)存在下、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを作用させ、6-ホスホグルコノラクトンと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)に変換する工程;および
(iv)(iii)で生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を吸光度により測定する工程;
を含む、前記の標準測定法。 - サンプル中のメバロン酸量を正確に測定するメバロン酸標準測定法であって、少なくとも以下の(i),(ii)の工程;
(i)サンプル中のメバロン酸に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)、コエンザイムA存在下、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAレダクターゼを作用させ3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムAと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)に変換する工程;
(ii)(i)で生じた還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)を吸光度により測定する工程;
を含む、前記の標準測定法。 - 請求項34または請求項35の標準測定法により正確なメバロン酸量が値付けされたメバロン酸標準物質。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010546677A JP5524865B2 (ja) | 2009-01-19 | 2010-01-19 | メバロン酸、3−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムaおよびコエンザイムaの測定方法ならびに測定試薬 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009009177 | 2009-01-19 | ||
JP2009009177 | 2009-01-19 | ||
PCT/JP2010/050565 WO2010082665A1 (ja) | 2009-01-19 | 2010-01-19 | メバロン酸、3-ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムaおよびコエンザイムaの測定方法ならびに測定試薬 |
JP2010546677A JP5524865B2 (ja) | 2009-01-19 | 2010-01-19 | メバロン酸、3−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムaおよびコエンザイムaの測定方法ならびに測定試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2010082665A1 true JPWO2010082665A1 (ja) | 2012-07-05 |
JP5524865B2 JP5524865B2 (ja) | 2014-06-18 |
Family
ID=42339915
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010546677A Active JP5524865B2 (ja) | 2009-01-19 | 2010-01-19 | メバロン酸、3−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムaおよびコエンザイムaの測定方法ならびに測定試薬 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20120040387A1 (ja) |
EP (1) | EP2380989B1 (ja) |
JP (1) | JP5524865B2 (ja) |
ES (1) | ES2543010T3 (ja) |
WO (1) | WO2010082665A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120040387A1 (en) | 2009-01-19 | 2012-02-16 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method and reagent for measuring mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl coenzyme a, and coenzyme a |
US9034593B2 (en) | 2010-11-22 | 2015-05-19 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Vaginal indicator to detect biomarkers of good health |
CN102621238A (zh) * | 2011-02-01 | 2012-08-01 | 北京北大维信生物科技有限公司 | 一种测定HMG-CoA还原酶抑制剂浓度的方法 |
JP5778617B2 (ja) * | 2011-04-25 | 2015-09-16 | アークレイ株式会社 | 分析システム、分析方法及び分析プログラム |
US20130164830A1 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Combination Assay Device and Method for Detecting Compounds in Vaginal Fluid |
JP5914019B2 (ja) * | 2012-02-03 | 2016-05-11 | 旭化成ファーマ株式会社 | 酵素サイクリング反応によるメバロン酸の測定方法およびその校正試料 |
JP2014124165A (ja) * | 2012-12-27 | 2014-07-07 | Bl:Kk | タンパク質および核酸の高感度測定法、キット並びに酵素組成物 |
EP3199639B1 (en) * | 2014-09-26 | 2020-12-30 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Novel measurement method using kinase, and composition |
WO2017088031A1 (en) * | 2015-11-27 | 2017-06-01 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Photostable compounds, absorbing compounds and uses thereof |
WO2019118984A2 (en) | 2017-12-15 | 2019-06-20 | Solarea Bio, Inc. | Microbial compositions and methods for treating type 2 diabetes, obesity, and metabolic syndrome |
US11980647B2 (en) | 2018-09-05 | 2024-05-14 | Solarea Bio, Inc. | Methods and compositions for treating musculoskeletal diseases, treating inflammation, and managing symptoms of menopause |
WO2023092150A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Solarea Bio, Inc. | Methods and compositions for treating musculoskeletal diseases, treating inflammation, and managing symptoms of menopause |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2579506B2 (ja) | 1987-12-01 | 1997-02-05 | 旭化成工業株式会社 | 新規なプロモーター |
JPH0673479B2 (ja) | 1989-12-01 | 1994-09-21 | 旭化成工業株式会社 | 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 |
JPH0673477B2 (ja) | 1990-10-24 | 1994-09-21 | 旭化成工業株式会社 | D―3―ヒドロキシ酪酸またはアセト酢酸の高感度定量法および定量用組成物 |
JP3034969B2 (ja) | 1991-03-01 | 2000-04-17 | 旭化成工業株式会社 | アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物 |
JP3081016B2 (ja) * | 1991-03-05 | 2000-08-28 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 結晶性チオニコチンアミド−アデニンジヌクレオ チド燐酸カリウム塩及びその製造法 |
JP3036708B2 (ja) | 1991-05-14 | 2000-04-24 | 旭化成工業株式会社 | D−グルコース−6−リン酸の高感度定量法および定量用組成物 |
JP3034987B2 (ja) | 1991-05-29 | 2000-04-17 | 旭化成工業株式会社 | D−グリセロアルデヒド−3−リン酸、無機リン、または1,3−ジホスホグリセリン酸の高感度定量法および定量用組成物 |
US5633143A (en) | 1991-12-12 | 1997-05-27 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for the quantitative determination of D-3-hydroxybutyric acid and acetoacetic acid, and analytical reagent therefor |
JPH06273417A (ja) * | 1993-01-20 | 1994-09-30 | Ono Pharmaceut Co Ltd | メバロン酸に対する抗体、および該抗体を用いるメバロン酸の定量法 |
EP0608117A3 (en) | 1993-01-20 | 1996-01-17 | Ono Pharmaceutical Co | Antibodies for mevalonic acid and methods for determination of mevalonic acid. |
JPH07159400A (ja) * | 1993-12-10 | 1995-06-23 | S R L:Kk | メバロン酸の測定方法 |
JPH09281045A (ja) | 1996-04-10 | 1997-10-31 | Kdk Corp | メバロン酸の光学的測定方法 |
US5801006A (en) * | 1997-02-04 | 1998-09-01 | Specialty Assays, Inc. | Use of NADPH and NADH analogs in the measurement of enzyme activities and metabolites |
JP2827002B2 (ja) | 1997-03-05 | 1998-11-18 | 旭化成工業株式会社 | アシルカルニチンの測定法 |
US6867012B2 (en) * | 2000-12-05 | 2005-03-15 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Determination method of biological component and reagent kit used therefor |
US20070275432A1 (en) * | 2004-02-26 | 2007-11-29 | Theraptosis S.A. | Means for a Quantitative Detection of Cytochrome C |
JP4655539B2 (ja) * | 2004-08-06 | 2011-03-23 | 味の素株式会社 | アシラーゼを用いたβアミノ酸の製造方法 |
JP2007306821A (ja) * | 2006-05-16 | 2007-11-29 | Asahi Kasei Pharma Kk | リパーゼ活性測定用組成物および活性測定法 |
JP4716041B2 (ja) | 2007-06-26 | 2011-07-06 | 理化工業株式会社 | デジタル制御装置およびこれを用いる制御用pid定数算出方法 |
JP5458487B2 (ja) * | 2007-11-22 | 2014-04-02 | 日東紡績株式会社 | リン酸の測定方法 |
US20120040387A1 (en) | 2009-01-19 | 2012-02-16 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method and reagent for measuring mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl coenzyme a, and coenzyme a |
-
2009
- 2009-01-19 US US13/144,710 patent/US20120040387A1/en active Granted
-
2010
- 2010-01-19 EP EP10731334.8A patent/EP2380989B1/en active Active
- 2010-01-19 JP JP2010546677A patent/JP5524865B2/ja active Active
- 2010-01-19 WO PCT/JP2010/050565 patent/WO2010082665A1/ja active Application Filing
- 2010-01-19 US US13/144,710 patent/US9458491B2/en active Active
- 2010-01-19 ES ES10731334.8T patent/ES2543010T3/es active Active
-
2016
- 2016-08-11 US US15/234,286 patent/US10975411B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9458491B2 (en) | 2016-10-04 |
ES2543010T3 (es) | 2015-08-13 |
EP2380989B1 (en) | 2015-07-01 |
EP2380989A1 (en) | 2011-10-26 |
WO2010082665A1 (ja) | 2010-07-22 |
JP5524865B2 (ja) | 2014-06-18 |
US10975411B2 (en) | 2021-04-13 |
EP2380989A4 (en) | 2013-02-13 |
US20170037443A1 (en) | 2017-02-09 |
US20120040387A1 (en) | 2012-02-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5524865B2 (ja) | メバロン酸、3−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムaおよびコエンザイムaの測定方法ならびに測定試薬 | |
JP5927771B2 (ja) | ヘモグロビンA1cの測定方法 | |
KR101916491B1 (ko) | 생체 시료 중의 l-트립토판 분석 방법 및 그것에 이용하는 키트 | |
US7476525B2 (en) | Modified pyrroloquinoline quinone (PQQ) dependent glucose dehydrogenase with superior substrate specificity and stability | |
US8785147B2 (en) | L-threonine analysis method and L-threonine dehydrogenase | |
Kotb | Characterization of a thermostable uricase isolated from Bacillus firmus DWD-33 and its application for uric acid quantification in human serum | |
JP5043081B2 (ja) | 生体試料中のl−リジンの定量法 | |
Rintala et al. | The ORF YNL274c (GOR1) codes for glyoxylate reductase in Saccharomyces cerevisiae | |
US8105766B2 (en) | Method of measuring pyrophosphate | |
JP6127496B2 (ja) | ジアホラーゼ | |
JP4816103B2 (ja) | グリセロールキナーゼ改変体 | |
SU1431690A3 (ru) | Способ определени глутамат-пируват- и глутамат-оксалоацетаттрансаминазы | |
JP4228047B2 (ja) | L−システインの測定方法及び測定用試薬 | |
US11773379B2 (en) | Enzymes and reagents for measurement of short chain fatty acids | |
JP4288334B2 (ja) | ホモシステインの測定方法及び測定用試薬 | |
JP2014097050A (ja) | ジアホラーゼ | |
JP2001252095A (ja) | 微量成分の測定法及びそれに用いる組成物 | |
JPS5915637B2 (ja) | ピルビン酸オキシダ−ゼを用いる分析用キツトおよび分析法 | |
JP5089058B2 (ja) | 試料中の銅イオン濃度測定用酵素 | |
JP2002112766A (ja) | ビリルビンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130627 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130820 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140328 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140410 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5524865 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |