JPH0673479B2 - 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 - Google Patents
胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物Info
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- JPH0673479B2 JPH0673479B2 JP2309412A JP30941290A JPH0673479B2 JP H0673479 B2 JPH0673479 B2 JP H0673479B2 JP 2309412 A JP2309412 A JP 2309412A JP 30941290 A JP30941290 A JP 30941290A JP H0673479 B2 JPH0673479 B2 JP H0673479B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は胆汁酸、特に生体試料中の３α−ヒドロキシ胆
汁酸の高感度定量法及び３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用
組成物に関する。
汁酸の高感度定量法及び３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用
組成物に関する。
血清等の生体試料中の胆汁酸を測定することは、肝機能
検査として、あるいは黄疸、胆石症の成立機序の解明な
どのため重要である。
検査として、あるいは黄疸、胆石症の成立機序の解明な
どのため重要である。
従来、コール酸、デオキシコール酸やケノデオキシコー
ル酸などを含む３α−ヒドロキシ胆汁酸、７α−ヒドロ
キシ胆汁酸や12α−ヒドロキシ胆汁酸などの胆汁酸の測
定法としては種々の方法が報告されているが、近年臨床
検査には、一般に、３α−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼ及び１つの補酵素としてニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド類（以下NAD類という）またはニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以
下NADP類という）を反応させて、３α−ヒドロキシ胆汁
酸量に比例して生成する還元型NAD類（以下NADH類とい
う）又は還元型NADP類（以下NADPH類という）を測定す
る方法（特公昭59−13197号）が使用されている。しか
しながら、この方法はビリルビンの影響を受け易いため
に予め胆汁酸の分離が必要である、多量の検体が必要で
ある、また感度が低いという欠点があった。そのため高
感度発色剤を使用する工夫もなされているが〔第33回日
本臨床病理学会総会抄録、123頁（1986）及び第34回同
抄録、124頁（1987）〕、これも本質的な解決とはなっ
ていない。
ル酸などを含む３α−ヒドロキシ胆汁酸、７α−ヒドロ
キシ胆汁酸や12α−ヒドロキシ胆汁酸などの胆汁酸の測
定法としては種々の方法が報告されているが、近年臨床
検査には、一般に、３α−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼ及び１つの補酵素としてニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド類（以下NAD類という）またはニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート類（以
下NADP類という）を反応させて、３α−ヒドロキシ胆汁
酸量に比例して生成する還元型NAD類（以下NADH類とい
う）又は還元型NADP類（以下NADPH類という）を測定す
る方法（特公昭59−13197号）が使用されている。しか
しながら、この方法はビリルビンの影響を受け易いため
に予め胆汁酸の分離が必要である、多量の検体が必要で
ある、また感度が低いという欠点があった。そのため高
感度発色剤を使用する工夫もなされているが〔第33回日
本臨床病理学会総会抄録、123頁（1986）及び第34回同
抄録、124頁（1987）〕、これも本質的な解決とはなっ
ていない。
また、他の方法として、生成した３−オキソステロイド
を更に３−オキソ−△４−ステロイドデヒドロゲナーゼ
の作用により３−△４−ステロイドとし、ホルマザン色
素を従来の２倍量生成させるキットも市販されている
が、これも感度がたかだか２倍になったにすぎない。
を更に３−オキソ−△４−ステロイドデヒドロゲナーゼ
の作用により３−△４−ステロイドとし、ホルマザン色
素を従来の２倍量生成させるキットも市販されている
が、これも感度がたかだか２倍になったにすぎない。
更にまた、胆汁酸の量に比例して生成されるNADH又はNA
DPHを酵素サイクリング反応を利用して高感度に測定す
る方法が報告されている（特公昭63−36758号）。しか
し、この方法も、NADH又はNADPHを酵素サイクリング反
応によって増幅させるためには、残存している過剰のNA
D又はNADPをアルカリ加温処理によって分解除去しなけ
ればならないため操作が煩雑であり、臨床検査のような
多検体を処理する場合には不利なるを免れなかった。
DPHを酵素サイクリング反応を利用して高感度に測定す
る方法が報告されている（特公昭63−36758号）。しか
し、この方法も、NADH又はNADPHを酵素サイクリング反
応によって増幅させるためには、残存している過剰のNA
D又はNADPをアルカリ加温処理によって分解除去しなけ
ればならないため操作が煩雑であり、臨床検査のような
多検体を処理する場合には不利なるを免れなかった。
従って、例えば血中胆汁酸の低下をきたす疾患に吸収不
良症候群があるが、このような正常値以下の濃度を正確
に測定することは現在の酵素法では困難である。
良症候群があるが、このような正常値以下の濃度を正確
に測定することは現在の酵素法では困難である。
また、大部分の胆汁酸は、３α位に水酸基を有するが、
胆汁酸の種類により、３α位のほかに７α位、12α位に
水酸基を有するため、３α−ヒドロキシ胆汁酸の測定に
は３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α
−HSD）を用いるものであるが、７α−ヒドロキシ胆汁
酸や12α−ヒドロキシ胆汁酸の測定には７α−HSD、12
α−HSDを用いてそれぞれ検体中の胆汁酸を測定すれ
ば、ガスクロマトグラフィーなどの機器を用いなくて
も、個々の胆汁酸レベルを測定することが理論上可能で
ある。実際、３α−HSDによる胆汁酸の測定に加え、12
α−ヒドロキシ胆汁酸を同時に測定することは、肝実質
障害の程度、推移の把握に利用しうる可能性がある、と
の報告もあり（医学のあゆみ、vo1.143,No.10,775−776
（1987））、このような面からも胆汁酸定量の高感度化
が望まれている。
胆汁酸の種類により、３α位のほかに７α位、12α位に
水酸基を有するため、３α−ヒドロキシ胆汁酸の測定に
は３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α
−HSD）を用いるものであるが、７α−ヒドロキシ胆汁
酸や12α−ヒドロキシ胆汁酸の測定には７α−HSD、12
α−HSDを用いてそれぞれ検体中の胆汁酸を測定すれ
ば、ガスクロマトグラフィーなどの機器を用いなくて
も、個々の胆汁酸レベルを測定することが理論上可能で
ある。実際、３α−HSDによる胆汁酸の測定に加え、12
α−ヒドロキシ胆汁酸を同時に測定することは、肝実質
障害の程度、推移の把握に利用しうる可能性がある、と
の報告もあり（医学のあゆみ、vo1.143,No.10,775−776
（1987））、このような面からも胆汁酸定量の高感度化
が望まれている。
そこで、本発明者らは先に胆汁酸を基質としてオキソ胆
汁酸を生成する可逆反応において、特定の微生物由来の
ステロイドデヒドロゲナーゼを使用し、NAD類（又はNAD
P類）を補酵素として胆汁酸からオキソ胆汁酸を生成さ
せる反応系となし、かつ当該補酵素と異なる少量のNADP
H類（又はNADH類）を共存させて、胆汁酸とオキシ胆汁
酸の間の可逆的サイクリング反応を行えば、NADH類（又
はNADPH類）の生成量が時間経過と共に直線的に増加
し、しかもその増加速度が胆汁酸の量と比例することを
見出し、先に出願した（特願平１−98443号）。
汁酸を生成する可逆反応において、特定の微生物由来の
ステロイドデヒドロゲナーゼを使用し、NAD類（又はNAD
P類）を補酵素として胆汁酸からオキソ胆汁酸を生成さ
せる反応系となし、かつ当該補酵素と異なる少量のNADP
H類（又はNADH類）を共存させて、胆汁酸とオキシ胆汁
酸の間の可逆的サイクリング反応を行えば、NADH類（又
はNADPH類）の生成量が時間経過と共に直線的に増加
し、しかもその増加速度が胆汁酸の量と比例することを
見出し、先に出願した（特願平１−98443号）。
しかしながら、この方法も生成するNADPHとNADHの極大
吸収波長がどちらも340nmと同じであるため、胆汁酸の
量と比例して生成した還元型のみを測定する際に誤差を
生じるという問題があった。
吸収波長がどちらも340nmと同じであるため、胆汁酸の
量と比例して生成した還元型のみを測定する際に誤差を
生じるという問題があった。
一方、NAD及びNADPのアナログであるチオニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（以下チオNADという）及び
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（以下チオNADPという）は還元型の極大吸収波長が40
0nm付近にあり、NAD及びNADPの還元型の極大吸収波長と
は異なることが知られている。
ドアデニンジヌクレオチド（以下チオNADという）及び
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（以下チオNADPという）は還元型の極大吸収波長が40
0nm付近にあり、NAD及びNADPの還元型の極大吸収波長と
は異なることが知られている。
斯かる実情において、本発明者らは更に研究を進めた結
果、３α−HSDを用いて先の酵素サイクリング反応を実
施するに当り、２種類の補酵素の１つにチオNADP類又は
チオNAD類を使用して、どちらか一方の補酵素の変化量
のみを定量すれば、特に３α−ヒドロキシステロイド又
はオキソステロイドを高感度に定量できることを見出
し、更にこの方法によれば３α−ヒドロキシ胆汁酸定量
を正確に行うことができることを見出し、本発明を完成
した。
果、３α−HSDを用いて先の酵素サイクリング反応を実
施するに当り、２種類の補酵素の１つにチオNADP類又は
チオNAD類を使用して、どちらか一方の補酵素の変化量
のみを定量すれば、特に３α−ヒドロキシステロイド又
はオキソステロイドを高感度に定量できることを見出
し、更にこの方法によれば３α−ヒドロキシ胆汁酸定量
を正確に行うことができることを見出し、本発明を完成
した。
すなわち、本発明は被検体に、 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
α−ヒドロキシステロイドヒドロゲナーゼ、 A1、 B1、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式（Ｉ） （式中、A1はチオNADP類、チオNA類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
示す） で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によ
って変化するA2又はB1の量を測定することを特徴とする
３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法、並びに上記
、及びを含有することを特徴とする３α−ヒドロ
キシ胆汁酸定量用組成物を提供するものである。
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
α−ヒドロキシステロイドヒドロゲナーゼ、 A1、 B1、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式（Ｉ） （式中、A1はチオNADP類、チオNA類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
示す） で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によ
って変化するA2又はB1の量を測定することを特徴とする
３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法、並びに上記
、及びを含有することを特徴とする３α−ヒドロ
キシ胆汁酸定量用組成物を提供するものである。
本発明において、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼとしては上記要件を具備するものであれば何れ
のものでも使用できるが、その具体例は、NAD類及びチ
オNAD類を補酵素とするものとしては、シュードモナス
テストステロニ（Pseudomonas testosteroni、J.B.
C.,227,37−52（1957））、バシルス スファエリカス
（Bacillus sphaericus;特開昭54−157894号公報）由来
の３α−ヒドロキシステロイドヒドロゲナーゼ（３α−
HSD）（EC 1.1.1.50）等が挙げられる。また、NAD類、N
ADP類、チオNAD類及びチオNADP類を共に補酵素するもの
としては、ラット肝、前立腺（J.Steroid Biochem.,8,4
1−46（1977））、シュードモナス sp.B−0831（Pseud
omonas sp.B−0831、東洋醸造カタログNO.T−27）由来
の３α−HSDが挙げられる。
ゲナーゼとしては上記要件を具備するものであれば何れ
のものでも使用できるが、その具体例は、NAD類及びチ
オNAD類を補酵素とするものとしては、シュードモナス
テストステロニ（Pseudomonas testosteroni、J.B.
C.,227,37−52（1957））、バシルス スファエリカス
（Bacillus sphaericus;特開昭54−157894号公報）由来
の３α−ヒドロキシステロイドヒドロゲナーゼ（３α−
HSD）（EC 1.1.1.50）等が挙げられる。また、NAD類、N
ADP類、チオNAD類及びチオNADP類を共に補酵素するもの
としては、ラット肝、前立腺（J.Steroid Biochem.,8,4
1−46（1977））、シュードモナス sp.B−0831（Pseud
omonas sp.B−0831、東洋醸造カタログNO.T−27）由来
の３α−HSDが挙げられる。
また、A1及びB2はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はN
AD類を示すが、このうちNADP類又はNAD類としては例え
ば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（NADP）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド
ホスフェート（アセチルNADP）及びニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチドホスフェート（デアミノNAD
P）；及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NA
D）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセ
チルNAD）及びニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチド（デアミノNAD）が挙げられる。
AD類を示すが、このうちNADP類又はNAD類としては例え
ば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト（NADP）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド
ホスフェート（アセチルNADP）及びニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチドホスフェート（デアミノNAD
P）；及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NA
D）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセ
チルNAD）及びニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレ
オチド（デアミノNAD）が挙げられる。
本発明においてはA1及びB2のいずれか一方がチオNAD類
又はチオNADP類であることが必要である。
又はチオNADP類であることが必要である。
また、チオNADP類又はチオNAD類としては、例えばチオ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
（チオNADP）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドホスフェート及びチオニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンアミドヒ
ポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
（チオNADP）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチドホスフェート及びチオニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンアミドヒ
ポキサンチンジヌクレオチドが挙げられる。
また、定量に用いる３α−ヒドロキシステロイドデヒド
ロゲナーゼがNAD類のみを補酵素とする場合は、チオNAD
類と上述のNAD類より、また用いる３α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼがNAD類及びNADP類を共に補
酵素とする場合は、チオNAD類及びチオNADP類と上述のN
AD類及びNADP類より適宜選択して用いればよい。
ロゲナーゼがNAD類のみを補酵素とする場合は、チオNAD
類と上述のNAD類より、また用いる３α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼがNAD類及びNADP類を共に補
酵素とする場合は、チオNAD類及びチオNADP類と上述のN
AD類及びNADP類より適宜選択して用いればよい。
A1及びB1の量は被検体中の胆汁酸の量に比較して過剰量
であり、また３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼのA1及びB1それぞれに対するKm値に比較しても過剰
量であることが必要であり、特に３α−ヒドロキシ胆汁
酸量の20〜10000倍モルが好ましい。
であり、また３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼのA1及びB1それぞれに対するKm値に比較しても過剰
量であることが必要であり、特に３α−ヒドロキシ胆汁
酸量の20〜10000倍モルが好ましい。
本発明の３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用組成物において
は、A1及びB1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mMが
好ましく、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼの濃度は0.05〜100U/ml、特に１〜50U/mlが好ましい
が、その量は被検体の種類等により適宜決定することが
でき、これ以上の量を用いることもできる。
は、A1及びB1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mMが
好ましく、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナー
ゼの濃度は0.05〜100U/ml、特に１〜50U/mlが好ましい
が、その量は被検体の種類等により適宜決定することが
でき、これ以上の量を用いることもできる。
また、本発明定量法は３α−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼがNAD類及びNADP類を共に補酵素とする場
合において、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もしくは
NADP類との組み合わせ、またはチオNADP類とNAD類もし
くはNADP類との組み合わせを選んだときは、更に被検体
に成分の３α−ヒドロキシ胆汁酸及びA1に作用せず、
B2→B1の反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該
第２のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることによ
り、後記反応式（II）の如く、B1とB2との間にB1の再生
のための反応系を付与せしめることにより３α−ヒドロ
キシ胆汁酸のサイクリング反応も形成し得る。この場
合、定量の際には反応により生成したA2の量を測定す
る。
ドロゲナーゼがNAD類及びNADP類を共に補酵素とする場
合において、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もしくは
NADP類との組み合わせ、またはチオNADP類とNAD類もし
くはNADP類との組み合わせを選んだときは、更に被検体
に成分の３α−ヒドロキシ胆汁酸及びA1に作用せず、
B2→B1の反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該
第２のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめることによ
り、後記反応式（II）の如く、B1とB2との間にB1の再生
のための反応系を付与せしめることにより３α−ヒドロ
キシ胆汁酸のサイクリング反応も形成し得る。この場
合、定量の際には反応により生成したA2の量を測定す
る。
（式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1還元型生成物を示し、B1はA1がチオNADP
類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD類
を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類又
は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を示
し、B2→B1はB2を補酵素としてB1を生成する酵素反応を
示す） すなわち、第２のデヒドロゲナーゼはB1の再生の為に補
助的に添加するものであり、これによってB1の使用量を
少なくすることが可能となり、特にB1が高価な場合には
有効である。また、B1の代わりにB2あるいはB1とB2の混
合物を用いて反応を行ってもよい。この場合、B1又は／
及びB2の使用量は特に限定されるものではないが、一般
的にはA1の1/10モル以下が好ましい。
を示し、A2はA1還元型生成物を示し、B1はA1がチオNADP
類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD類
を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類又
は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を示
し、B2→B1はB2を補酵素としてB1を生成する酵素反応を
示す） すなわち、第２のデヒドロゲナーゼはB1の再生の為に補
助的に添加するものであり、これによってB1の使用量を
少なくすることが可能となり、特にB1が高価な場合には
有効である。また、B1の代わりにB2あるいはB1とB2の混
合物を用いて反応を行ってもよい。この場合、B1又は／
及びB2の使用量は特に限定されるものではないが、一般
的にはA1の1/10モル以下が好ましい。
この成分を用いる３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用組成
物において、A1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mM
が好ましく、B2又は／及びB1の濃度は0.05〜5000μＭ、
特に５〜500μＭが好ましく、３α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼの濃度は0.05〜100U/ml、特に１
〜50U/mlが好ましく、第２のデヒドロゲナーゼはB2に対
するKm値（mM単位）の20倍量（U/ml単位）以上になるよ
うに調整すればよく、例えば１〜100U/mlが好ましく、
また第２のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.
05〜20mMが好ましい。これらの量は被検体の種類等によ
り適宜決定することができ、これ以上の量を用いること
もできる。
物において、A1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mM
が好ましく、B2又は／及びB1の濃度は0.05〜5000μＭ、
特に５〜500μＭが好ましく、３α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼの濃度は0.05〜100U/ml、特に１
〜50U/mlが好ましく、第２のデヒドロゲナーゼはB2に対
するKm値（mM単位）の20倍量（U/ml単位）以上になるよ
うに調整すればよく、例えば１〜100U/mlが好ましく、
また第２のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.
05〜20mMが好ましい。これらの量は被検体の種類等によ
り適宜決定することができ、これ以上の量を用いること
もできる。
第２のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例え
ば、B2がNAD類またはチオNAD類のときは、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とエタノール、グリセロ
ールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.6）（E.Coli由来）と
グリセロール、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（EC 1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロ
ール−３−リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.
1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、
グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.
1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.Coli由来）とＤ−
グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、B2がNADP類または
チオNADP類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（酵母由来）とグルコース−
６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.
1.42）（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸、グリオ
キシル酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.17）（Pseudomon
as oxalaticus由来）とCoAとグリオキシル酸、ホスホグ
ルコン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.44）（ラット
肝、ビール酵母、E.Coli由来）と６−ホスホ−Ｄ−グル
コン酸、グルセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ
（EC 1.2.1.13）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロア
ルデヒド−３−リン酸とリン酸、ベンズアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.2.1.7）（Pseudomonas fluorescen
s由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。
ば、B2がNAD類またはチオNAD類のときは、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とエタノール、グリセロ
ールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.6）（E.Coli由来）と
グリセロール、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（EC 1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）とＬ−グリセロ
ール−３−リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.
1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とＬ−リンゴ酸、
グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.
1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母、E.Coli由来）とＤ−
グリセロアルデヒドリン酸とリン酸、B2がNADP類または
チオNADP類のときは、グルコース−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（酵母由来）とグルコース−
６−リン酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.
1.42）（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸、グリオ
キシル酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.17）（Pseudomon
as oxalaticus由来）とCoAとグリオキシル酸、ホスホグ
ルコン酸デヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.44）（ラット
肝、ビール酵母、E.Coli由来）と６−ホスホ−Ｄ−グル
コン酸、グルセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ
（EC 1.2.1.13）（植物葉緑体由来）とＤ−グリセロア
ルデヒド−３−リン酸とリン酸、ベンズアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.2.1.7）（Pseudomonas fluorescen
s由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。
更にまた、本発明定量法は３α−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼがNAD類及びNADP類を共に補酵素とす
る場合において、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もし
くはNADP類との組み合わせ、またはチオNADP類とNAD類
もしくはNADP類との組み合わせを選んだときは、更に被
検体に成分の３α−ヒドロキシ胆汁酸及びB1に作用せ
ず、A2→A1の反応を形成する第３のデヒドロゲナーゼ及
び該第３のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめること
により、後記反応式（III）の如く、A1とA2との間にA1
の再生のための反応系を付与せしめることにより３α−
ヒドロキシ胆汁酸のサイクリング反応を形成し得る。こ
の場合、定量の際にはB1の消費量を測定する。
デヒドロゲナーゼがNAD類及びNADP類を共に補酵素とす
る場合において、２つの補酵素にチオNAD類とNAD類もし
くはNADP類との組み合わせ、またはチオNADP類とNAD類
もしくはNADP類との組み合わせを選んだときは、更に被
検体に成分の３α−ヒドロキシ胆汁酸及びB1に作用せ
ず、A2→A1の反応を形成する第３のデヒドロゲナーゼ及
び該第３のデヒドロゲナーゼの基質を作用せしめること
により、後記反応式（III）の如く、A1とA2との間にA1
の再生のための反応系を付与せしめることにより３α−
ヒドロキシ胆汁酸のサイクリング反応を形成し得る。こ
の場合、定量の際にはB1の消費量を測定する。
（式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
示し、A2→A1はA2を補酵素としてA1を生成する酵素反応
を示す） すなわち、第３のデヒドロゲナーゼはA1の再生の為に補
助的に添加するものであり、これによってA1の使用量を
少なくすることが可能となり、特にA1が高価な場合には
有効である。また、A1の代わりにA2あるいはA1とA2の混
合物を用いて反応を行ってもよい。この場合、A1又は／
及びA2の使用量は特に限定されるものではないが、一般
的にはB1の1/10以下が好ましい。
を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
示し、A2→A1はA2を補酵素としてA1を生成する酵素反応
を示す） すなわち、第３のデヒドロゲナーゼはA1の再生の為に補
助的に添加するものであり、これによってA1の使用量を
少なくすることが可能となり、特にA1が高価な場合には
有効である。また、A1の代わりにA2あるいはA1とA2の混
合物を用いて反応を行ってもよい。この場合、A1又は／
及びA2の使用量は特に限定されるものではないが、一般
的にはB1の1/10以下が好ましい。
この成分を用いる３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用組成
物において、B1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mM
が好ましく、A2又は／及びA1の濃度は0.05〜5000μＭ、
特に５〜500μＭが好ましく、３α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼの濃度は0.05〜100U/ml、特に１
〜50U/mlが好ましく、第３のデヒロゲナーゼはA2に対す
るKm値（mM単位）の20倍量（U/ml単位）以上になるよう
に調整すればよく、例えば１〜100U/mlが好ましく、ま
た第３のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.05
〜20mMが好ましい。これらの量は被検体の種類等により
適宜決定することができ、これ以上の量を用いることも
できる。
物において、B1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mM
が好ましく、A2又は／及びA1の濃度は0.05〜5000μＭ、
特に５〜500μＭが好ましく、３α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼの濃度は0.05〜100U/ml、特に１
〜50U/mlが好ましく、第３のデヒロゲナーゼはA2に対す
るKm値（mM単位）の20倍量（U/ml単位）以上になるよう
に調整すればよく、例えば１〜100U/mlが好ましく、ま
た第３のデヒドロゲナーゼの基質は過剰量、例えば0.05
〜20mMが好ましい。これらの量は被検体の種類等により
適宜決定することができ、これ以上の量を用いることも
できる。
第３のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例え
ば、A1がNAD類又はチオNAD類のときは、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とアセトアルデヒド、グイ
セロールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.6）（E.Coli由
来）とジヒドロキシアセトン、グリセロール−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ（ED 1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）
とジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デイドロゲナ
ーゼ（EC 1.1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とオ
キザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナー
ゼ（EC1.1.1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母E.Coli由
来）と1,3−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、A1がNADP類
またはチオNADP類のときは、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（酵母由来）とグリコ
ノラクトン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.13）（植物葉緑体由来）
と、1,3−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げられ
る。
ば、A1がNAD類又はチオNAD類のときは、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ（EC 1.1.1.1）とアセトアルデヒド、グイ
セロールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.6）（E.Coli由
来）とジヒドロキシアセトン、グリセロール−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ（ED 1.1.1.8）（ウサギ筋肉由来）
とジヒドロキシアセトンリン酸、リンゴ酸デイドロゲナ
ーゼ（EC 1.1.1.37）（ブタ心筋、ウシ心筋由来）とオ
キザロ酢酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナー
ゼ（EC1.1.1.12）（ウサギ骨格筋、肝、酵母E.Coli由
来）と1,3−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸、A1がNADP類
またはチオNADP類のときは、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.49）（酵母由来）とグリコ
ノラクトン−６−リン酸、グリセロアルデヒドリン酸デ
ヒドロゲナーゼ（EC 1.2.1.13）（植物葉緑体由来）
と、1,3−ジホスホ−Ｄ−グリセリン酸等が挙げられ
る。
本発明の３α−ヒドロキシ胆汁酸定量用組成物の調製に
あたって、使用できる３α−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼに関しては、例えば補酵素としてNAD類
（好ましくはNAD）、チオNAD類（好ましくはチオNA
D）、あるいはNADP類（好ましくはNADP）、チオNADP類
（好ましくはチオNADP）を用いて、基質となるコール酸
等の３α−ヒドロキシ胆汁酸に対する反応性を有するも
のであればよく、これら補酵素と基質を用いることによ
り確認できるものである。
あたって、使用できる３α−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼに関しては、例えば補酵素としてNAD類
（好ましくはNAD）、チオNAD類（好ましくはチオNA
D）、あるいはNADP類（好ましくはNADP）、チオNADP類
（好ましくはチオNADP）を用いて、基質となるコール酸
等の３α−ヒドロキシ胆汁酸に対する反応性を有するも
のであればよく、これら補酵素と基質を用いることによ
り確認できるものである。
反応液組成については、使用する３α−ヒドロキシステ
ロイドデヒドロゲナーゼの各補酵素間の相対活性等を考
慮して２種の補酵素を適宜選択し、その後正反応／逆反
応の至適pHの間のpH条件を適宜調整して、正反応／逆反
応の反応速度比が１に近づくようにpH条件を設定すれば
よい。例えば、３α−HSD（Pseudomonas sp.B−0831,東
洋醸造カタログNo.T−27）についてみれば、コール酸を
基質にし、補酵素にチトNADを用いた場合のNADを用いた
場合に対する相対活性は40％程度であり、また、正反応
の至適pHは9.5付近で、逆反応の至適pHは5.5付近であ
る。また、これらの酵素は単独でも、適宜２種以上を組
合せて用いてもよい。
ロイドデヒドロゲナーゼの各補酵素間の相対活性等を考
慮して２種の補酵素を適宜選択し、その後正反応／逆反
応の至適pHの間のpH条件を適宜調整して、正反応／逆反
応の反応速度比が１に近づくようにpH条件を設定すれば
よい。例えば、３α−HSD（Pseudomonas sp.B−0831,東
洋醸造カタログNo.T−27）についてみれば、コール酸を
基質にし、補酵素にチトNADを用いた場合のNADを用いた
場合に対する相対活性は40％程度であり、また、正反応
の至適pHは9.5付近で、逆反応の至適pHは5.5付近であ
る。また、これらの酵素は単独でも、適宜２種以上を組
合せて用いてもよい。
斯くして、調製された本発明の３α−ヒドロキシ胆汁酸
定量用組成物によって被検体中の３α−ヒドロキシ胆汁
酸量を測定するには、上記成分〜、〜、あるい
は〜及びを含有する組成物に被検体0.001〜0.5ml
を加え、約37℃の温度にて反応させ、反応開始一定時間
後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分
後の１分間又は３分後と８分後の５分間における生成さ
れたA2の量又は消費されたB1の量を、それぞれの吸収波
長に基づく吸光度の変化によって測定すればよい。例え
ばA2がチオNADH、B1かNADHの場合、A2の生成を400nmの
吸光度の増加により測定するか、あるいはB1の消費を34
0nmの吸光度の減少により測定し、既知濃度の３α−ヒ
ドロキシ胆汁酸を用いて測定したときの値と比較すれ
ば、被検液中の３α−ヒドロキシ胆汁酸量をリアルタイ
ムで算出することができる。
定量用組成物によって被検体中の３α−ヒドロキシ胆汁
酸量を測定するには、上記成分〜、〜、あるい
は〜及びを含有する組成物に被検体0.001〜0.5ml
を加え、約37℃の温度にて反応させ、反応開始一定時間
後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分
後の１分間又は３分後と８分後の５分間における生成さ
れたA2の量又は消費されたB1の量を、それぞれの吸収波
長に基づく吸光度の変化によって測定すればよい。例え
ばA2がチオNADH、B1かNADHの場合、A2の生成を400nmの
吸光度の増加により測定するか、あるいはB1の消費を34
0nmの吸光度の減少により測定し、既知濃度の３α−ヒ
ドロキシ胆汁酸を用いて測定したときの値と比較すれ
ば、被検液中の３α−ヒドロキシ胆汁酸量をリアルタイ
ムで算出することができる。
また、本発明定量法は、被検液中の３α−ヒドロキシ胆
汁酸そのものを酵素サイクリング反応に導くものであ
り、被検液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検
液のブランク測定を省略することができ、レイトアッセ
イによる簡便な測定を成し得る。更にまた、３α−ヒド
ロキシ胆汁酸測定用酵素を用いる本発明の高感度定量法
は、その３α−HSDの代りに、７α−HSDを用いて7a−ヒ
ドロキシ胆汁酸、12α−HSDを用いて12α−ヒドロキシ
胆汁酸を定量する場合に比較して、単位酵素量当たりの
感度がより良好に定量し得るものである。
汁酸そのものを酵素サイクリング反応に導くものであ
り、被検液中の共存物質の影響を受けにくいため、被検
液のブランク測定を省略することができ、レイトアッセ
イによる簡便な測定を成し得る。更にまた、３α−ヒド
ロキシ胆汁酸測定用酵素を用いる本発明の高感度定量法
は、その３α−HSDの代りに、７α−HSDを用いて7a−ヒ
ドロキシ胆汁酸、12α−HSDを用いて12α−ヒドロキシ
胆汁酸を定量する場合に比較して、単位酵素量当たりの
感度がより良好に定量し得るものである。
尚、本発明においてはA2又はB1の測定に当り、吸光度測
定の代りに他の公知酵素測定法を使用して定量を行うこ
ともできる。
定の代りに他の公知酵素測定法を使用して定量を行うこ
ともできる。
叙上の如く、本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵素
を用いるため測定誤差が生じず、また、酵素的サイクリ
ング反応を組合せることによって感度を増大させること
ができるため、少量の検体で迅速かつ正確に被検体中の
３α−ヒドロキシ胆汁酸を特に高感度にて定量すること
ができる。
を用いるため測定誤差が生じず、また、酵素的サイクリ
ング反応を組合せることによって感度を増大させること
ができるため、少量の検体で迅速かつ正確に被検体中の
３α−ヒドロキシ胆汁酸を特に高感度にて定量すること
ができる。
〔実施例〕 次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれによって何ら限定されるものではない。
明はこれによって何ら限定されるものではない。
尚、単位酵素濃度当たりのサイクリング率（Kc）は次に
示す式により計算した。
示す式により計算した。
Kc:単位酵素濃度当たりのサイクリング率（サイクル／
分・u/ml） A:吸光度（mAbs） V:反応全液量（ml） e:反応液中での酵素濃度（u/ml） x:被検体量（nmol） tj反応時間（分） ε：分子吸光係数（cm2/μmol）（チオNADの場合11.9） 実施例１ ＜試薬＞ 40mM リン酸バッファー（pH8.0） 1mM チオNAD 0.2mM NADH 0.1％ トリトンＸ−100 5U/ml 3α−HSD（Pseudomonas testosteroni由来 シグ
マ社製） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、10、20、40、6
0、80、100μＭのコール酸溶液をそれぞれ10μｌ添加
し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と３
分目の400nmにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
分・u/ml） A:吸光度（mAbs） V:反応全液量（ml） e:反応液中での酵素濃度（u/ml） x:被検体量（nmol） tj反応時間（分） ε：分子吸光係数（cm2/μmol）（チオNADの場合11.9） 実施例１ ＜試薬＞ 40mM リン酸バッファー（pH8.0） 1mM チオNAD 0.2mM NADH 0.1％ トリトンＸ−100 5U/ml 3α−HSD（Pseudomonas testosteroni由来 シグ
マ社製） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、10、20、40、6
0、80、100μＭのコール酸溶液をそれぞれ10μｌ添加
し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目と３
分目の400nmにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
この図１からKc＝1.11（サイクル／分・u/ml）であり、
高感度測定をなし得たものと判断し得た。
高感度測定をなし得たものと判断し得た。
実施例２ ＜試薬＞ 40mM トリス−HCl（pH8.5） 1mM チオNAD 2mM NADPH 9U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.東洋醸造カタログNo.
T−27由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、10、20、30、4
0、50μＭのコール酸溶液をそれぞれ50μｌ添加し、37
℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と４分目の
400nmにおける吸光度を読み取り、その差を求めた。そ
の結果を図３に示す。図３から明らかなように、コール
酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
T−27由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、10、20、30、4
0、50μＭのコール酸溶液をそれぞれ50μｌ添加し、37
℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と４分目の
400nmにおける吸光度を読み取り、その差を求めた。そ
の結果を図３に示す。図３から明らかなように、コール
酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。
この図３からKc＝0.54（サイクル／分・u/ml）であり良
好な高感度測定を示すものであった。
好な高感度測定を示すものであった。
実施例３ ＜試薬＞ 40mM トリス−HCl（pH8.0） 1mM チオNAD 0.2mM NADH 0.2％ トリトンＸ−100 2mM オキサミン酸 10U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.東洋醸造カタログN
o.T−27由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlを石英キュベットにとり、５段階に希釈し
た血清それぞれ100μｌを添加し、37℃にて反応を開始
させた。反応開始後３分目と４分目の400nmにおける吸
光度を読み取り、その差を求めた。その結果を図４に示
す。
o.T−27由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlを石英キュベットにとり、５段階に希釈し
た血清それぞれ100μｌを添加し、37℃にて反応を開始
させた。反応開始後３分目と４分目の400nmにおける吸
光度を読み取り、その差を求めた。その結果を図４に示
す。
実施例４ ＜試薬＞ 40mM トリス−HCl（pH8.0） 1mM チオNAD 0.2mM NADH 0.2％ トリトンＸ−100 2mM オキサミン酸 3.5U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.東洋醸造カタログN
o.T−27由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、プール血清に10、2
0、50μＭになるようにコール酸を加えた被検体50μｌ
を添加し、実施例３と同様の操作を行った。結果は表１
の如くであり、回収率は97.8〜104.0％であった。
o.T−27由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、プール血清に10、2
0、50μＭになるようにコール酸を加えた被検体50μｌ
を添加し、実施例３と同様の操作を行った。結果は表１
の如くであり、回収率は97.8〜104.0％であった。
実施例５ ＜試薬１＞ 20mM PIPES緩衝液（pH6.5） 3mM チオNAD 0.02％ トリトンＸ−100 ＜試薬２＞ 200mM トリス−HCl（pH8.5） 1.5mM NADH 9U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.B−831） ＜操作＞ 日立7510自動分析機を用い以下の手順により測定を実施
した。試薬１を260μｌに５、10、15、20、25、30、3
5、40、45、50μmol/のコール酸溶液各々３μｌを混
合し37℃、５分間加温する。その後試薬２を130μｌ添
加し、添加後の１分目と３分目の405nmにおける吸光度
を読み取り、１分間当たりの吸光度変化量に換算した。
結果を図５に示した。図５から明らかなように、コール
酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し、Kc＝
1.69（サイクル／分・u/ml）となった。
した。試薬１を260μｌに５、10、15、20、25、30、3
5、40、45、50μmol/のコール酸溶液各々３μｌを混
合し37℃、５分間加温する。その後試薬２を130μｌ添
加し、添加後の１分目と３分目の405nmにおける吸光度
を読み取り、１分間当たりの吸光度変化量に換算した。
結果を図５に示した。図５から明らかなように、コール
酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し、Kc＝
1.69（サイクル／分・u/ml）となった。
実施例６ ＜試薬＞ 40mM グリシン−NaOH（pH10.0） 5mM NADP 50μM チオNAD 0.4M エタノール 30U/ml アルコールデヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵
母社製） 10U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.B−0831東洋醸造カ
タログNo.T−27由来） 0.2％ トリトンＸ−100 ＜操作＞ 上記試薬1mlを石英キュベットにとり、０、0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5mMのコール酸溶液をそれぞれ10μｌ添加
し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と４
分目の340nmにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図６に示す。図６から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
母社製） 10U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.B−0831東洋醸造カ
タログNo.T−27由来） 0.2％ トリトンＸ−100 ＜操作＞ 上記試薬1mlを石英キュベットにとり、０、0.1、0.2、
0.3、0.4、0.5mMのコール酸溶液をそれぞれ10μｌ添加
し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と４
分目の340nmにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図６に示す。図６から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
実施例７ ＜試薬＞ 40mM PIPES−NaOH（pH7.0） 0.25mM NADPH 0.25mM チオNAD 5mM ジヒドロキシアセトリン酸 10U/ml グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ベーリンガー社製；ウサギ筋肉由来） 20U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.B−0831東洋醸造カ
タログNo.T−27由来） 0.2％ トリトンＸ−100 ＜操作＞ 上記試薬1mlを石英キュベットにとり、０、10、20、3
0、40、50μＭのコール酸溶液をそれぞれ50μｌ添加
し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と４
分目の340nmにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図７に示す。図７から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
（ベーリンガー社製；ウサギ筋肉由来） 20U/ml 3α−HSD（Pseudomonas sp.B−0831東洋醸造カ
タログNo.T−27由来） 0.2％ トリトンＸ−100 ＜操作＞ 上記試薬1mlを石英キュベットにとり、０、10、20、3
0、40、50μＭのコール酸溶液をそれぞれ50μｌ添加
し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と４
分目の340nmにおける吸光度を読み取り、その差を求め
た。その結果を図７に示す。図７から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化量は良好な直線性を示し
た。
参考例１ ＜試薬＞ 40mM リン酸バッファー（pH7.0） 1mM チオNAD 1mM NADH 0.1％ トリトンＸ−100 20U/ml 7α−HSD（Pseudomonas sp.東洋醸造カタログN
o.T−28由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、100、200、300、
400、500μＭのケノデオキシコール酸溶液をそれぞれ10
μｌ添加し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後２
分目と３分目の400nmにおける吸光度を読み取り、その
差を求めた。その結果を図２に示す。図２から明らかな
ように、ケノデオキシコール酸量に対する吸光度変化量
は良好な直線性を示した。この図２からKc＝0.15（サイ
クル／分・u/ml）であると判断し得た。
o.T−28由来） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、100、200、300、
400、500μＭのケノデオキシコール酸溶液をそれぞれ10
μｌ添加し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後２
分目と３分目の400nmにおける吸光度を読み取り、その
差を求めた。その結果を図２に示す。図２から明らかな
ように、ケノデオキシコール酸量に対する吸光度変化量
は良好な直線性を示した。この図２からKc＝0.15（サイ
クル／分・u/ml）であると判断し得た。
図１は実施例１における、コール酸量に対する400nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図２は参考例１における、ケノデオキシコール酸量に対
する400nmにおける吸光度変化量の結果を示す図面であ
る。 図３は実施例２における、コール酸量に対する400nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図４は実施例３における、血清量に対する400nmにおけ
る吸光度変化量の結果を示す図面である。 図５は実施例５における、コール酸量に対する400nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図６は実施例６における、コール酸量に対する340nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図７は実施例７における、コール酸量に対する340nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図２は参考例１における、ケノデオキシコール酸量に対
する400nmにおける吸光度変化量の結果を示す図面であ
る。 図３は実施例２における、コール酸量に対する400nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図４は実施例３における、血清量に対する400nmにおけ
る吸光度変化量の結果を示す図面である。 図５は実施例５における、コール酸量に対する400nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図６は実施例６における、コール酸量に対する340nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。 図７は実施例７における、コール酸量に対する340nmに
おける吸光度変化量の結果を示す図面である。
Claims (8)
- 【請求項１】被検体に、 チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ート類（以下チオNADP類という）及びチオニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド類（以下チオNAD類という）
からなる群より選ばれる１つと、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェート類（以下NADP類という）
及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下NA
D類という）からなる群より選ばれる１つとを補酵素と
し、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基質として３
−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３α−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1、 B1、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
示す） で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によ
って変化するA2又はB1の量を測定することを特徴とする
３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。 - 【請求項２】被検体に、 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1、 B1又は／及びB2、 ３α−ヒドロキシ胆汁酸及びA1に作用せず、B2→B1の
反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該第２のデ
ヒドロゲナーゼの基質、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
示し、B2→B1はB2を補酵素としてB1を生成する酵素反応
を示す）で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該
反応によって生成されるA2の量を測定することを特徴と
する３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。 - 【請求項３】被検体に、 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1又は／及びA2、 B1、 ３α−ヒドロキシ胆汁酸及びB1に作用せず、A2→A1の
反応を形成す る第３のデヒドロゲナーゼ及び該第３のデヒドロゲナー
ゼの基質、 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、A1はチオNADP類、チオNAD類、NADP類又はNAD類
を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1がチオNA
DP類又はチオNAD類のときは還元型NADP類又は還元型NAD
類を、A1がNADP類又はNAD類のときは還元型チオNADP類
又は還元型チオNAD類を示し、B2はB1の酸化型生成物を
示し、A2→A1はA2を補酵素としてA1を生成する酵素反応
を示す）で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該
反応によって消費されるB1の量を測定することを特徴と
する３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。 - 【請求項４】NAD（Ｐ）類が、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェート（NADP）、アセチルピリジ
ンアデニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルNAD
P）およびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチ
ドホスフェート（デアミノNADP）からなる群より選ばれ
るNADP類、又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NAD）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド
（アセチルNAD）およびニコチンアミドヒポキサンチン
ジヌクレオチド（デアミノNAD）からなる群より選ばれ
るNAD類である請求項１〜３のいずれかの項記載の３α
−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。 - 【請求項５】チオNAD（Ｐ）類が、チオNAD、チオニコチ
ンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群より
選ばれるチオNAD類、又はチオNADP、チオニコチンアミ
ドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェートからなる
群より選ばれるチオNADP類である請求項１〜３のいずれ
かの項記載の３α−ヒドロキシ胆汁酸の高感度定量法。 - 【請求項６】次の成分〜 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1、 B1、 を含有することを特徴とする３α−ヒドロキシ胆汁酸定
量用組成物。 - 【請求項７】次の成分〜 チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1、 B1又は／及びB2 ３α−ヒドロキシ胆汁酸及びA1に作用せず、B2→B1の
反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び該第２のデ
ヒドロゲナーゼの基質、 を含有することを特徴とする３α−ヒドロキシ胆汁酸定
量用組成物。 - 【請求項８】次の成分〜及び チオNADP類及びチオNAD類からなる群より選ばれる１
つと、NADP類及びNAD類からなる群より選ばれる１つと
を補酵素とし、少なくとも３α−ヒドロキシ胆汁酸を基
質として３−オキソ胆汁酸を生成する可逆反応をなす３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、 A1又は／及びA2、 B1、 ３α−ヒドロキシ胆汁酸及びB1に作用せず、A2→A1の
反応を形成する第３のデヒドロゲナーゼ及び該第３のデ
ヒドロゲナーゼの基質、 を含有することを特徴とする３α−ヒドロキシ胆汁酸定
量用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2309412A JPH0673479B2 (ja) | 1989-12-01 | 1990-11-15 | 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-313202 | 1989-12-01 | ||
| JP31320289 | 1989-12-01 | ||
| JP2309412A JPH0673479B2 (ja) | 1989-12-01 | 1990-11-15 | 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03224498A JPH03224498A (ja) | 1991-10-03 |
| JPH0673479B2 true JPH0673479B2 (ja) | 1994-09-21 |
Family
ID=26565947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2309412A Expired - Fee Related JPH0673479B2 (ja) | 1989-12-01 | 1990-11-15 | 胆汁酸の高感度定量法および定量用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0673479B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3864191B2 (ja) * | 1994-09-13 | 2006-12-27 | アークレイ株式会社 | 硫酸抱合型胆汁酸測定一体型多層分析用具 |
| US20120040387A1 (en) | 2009-01-19 | 2012-02-16 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method and reagent for measuring mevalonic acid, 3-hydroxymethylglutaryl coenzyme a, and coenzyme a |
| EP3199639B1 (en) | 2014-09-26 | 2020-12-30 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Novel measurement method using kinase, and composition |
-
1990
- 1990-11-15 JP JP2309412A patent/JPH0673479B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03224498A (ja) | 1991-10-03 |
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