IT9048529A1 - Metodo di analisi quantitativa altamente sensibile di acidi biliari e composizione per la analisi quantitativa. - Google Patents

Metodo di analisi quantitativa altamente sensibile di acidi biliari e composizione per la analisi quantitativa. Download PDF

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Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "METODO DI ANALISI QUANTITATIVA ALTAMENTE SENSIBILE DI ACIDI BILIARI E COMPOSIZIONE PER LA ANALISI QUANTITATIVA"
FONDAMENTO DELL'INVENZIONE
Campo dell'invenzione
La presente invenzione ,si riferisce ad un metodo di analisi quantitativa altamente sensibile di acidi biliari, specialmente!di acidi biliari in campioni da corpi viventi.
Descrizione della tecnica fondamentale L'analisi degli acidi biliari nei campioni presi da corpi viventi, quali siero e similari, è importante per la diagnosi clinica delle funzioni epatiche così come per spiegare la causa di malattie quali itterizia, colelitiasi e similari.
Convenzionalmente sono stati riportati vari metodi per la analisi degli acidi biliari contenenti acido colico, acido deossicolico, acido chenodeossicolico e similari.. Uno dei metodi recentemente impiegati per la diagnosi clinica comprende l'impiego di deidrogenasi di 3-ctidrosteroide e, come coenzima, o nicotidammide adenina dinucleotide oppure suoi analoghi (qui di seguito collettivamente riportati come composti NAD), oppure composto di nicotinammide edenica dinucleotide fosfato qui di seguito collettivamente riportato come composto di NADP). Composti NAD ridotti (qui di -seguito riportati come composti NADH) oppure composti NADP ridotti (di seguito riportati come composti NADPH) prodotti in quantità proporzionale alla quantità Idi acidi biliari, vengono poi quantitativamente misurati (pubblicazione di brevetto giapponese n 13197/1984). Il metodo, tuttavia, è soggetto a venire influenzato dalla bilirubina, e così richiede la separazione di acidi biliari in anticipo. Questo comporta la richiesta di una grande quantità di campioni .per le analisi. Un altro svantaggio dell'attuale metodo sta nella sua bassa sensibilità. L'impiego di cromogeno altamente sensibile è stato proposto allo scopo di superare questo svantaggio [Proceeding of thè 33th of Annual Meeting of Japan Society of Clinical Pathology, 123 (1986); idem, thè 34th Annual Meeting, 124 (1987)]. Questo metodo, tuttavia, non fornisce una soluzione completa al problema.
Un altro metodo comprende il convertire 3-ossosteroide prodotto in 3-osso- Δ 4-steroide mediante l'azione di deidrogenasi di 3-osso- h4-steroide per produrre formazano in.una quantità due volte tanto quanto una quantità nel metodo convenzionale per la determinazione colorimetrica. Un equipaggiamento per effettuare questo metodo è disponibile commercialmente. Questo metodo, tuttavia, aumenta la sensibilità soltanto due volte tanto quanto quella ottenuta dal metodo convenzionale .
La pubblicazione di brevetto giapponese n° 36758/1988 illustra un metodo per la analisi di acidi biliari per mezzo di una reazione enzimatica di ciclizzazione dei composti NaDH oppure dei composti NADPH i quali vengono prodotti in una quantità proporzionata aliai quantità di acidi biliari. Allo scopo di aumentare la quantità dei composti NADH oppure dei composti NADPH mediante una reazione enzimatica dij ciclizzazione per ottenere una migliore sensibilità nella analisi, questo metodo richiede uno stadio di eliminazione dell'eccesso di composti NADjoppure di composti NADP mediante decomposizione con calore in un alcali. Dato che questo coinvolge una procedura complicata, il metodo è svantaggioso quando applicato a scopi di analisi clinica i quali richiedono analisi di un gran numero di campioni.
Cosi i metodi analitici enzimatici correntemente disponibili di acidi biliari non sono adattabili alla misura accurata di acidi biliari in campioni aventi un contenuto di acidi biliari al di sotto dell'intervallo normale,,ad esempio campioni di pazienti affetti da sindlrome di difetto di assorbimento, la quale coinvolge la diminuzione nel contenuto di acidi biliari nel:sangue.
Sebbene gli acidi biliari, per la massima parte, abbiano un gruppo idrossi in corrispondenza della posizione 3a, alcuni acidi biliari haiino gruppi idrossi in corrispondenza della posizione la e, oppure 12cs, in aggiunta alla posizione 3a. La analisi di tali acidi biliari è teoricamente possibile senza impiegare |gascromatograf ia o similare se il campione : viene analizzato impiegando, in aggiunta alla Jdeidrogenasi di 3aidrossisteroide (3a-HSD), 7ci-ASD e 12a-HSD. La misura degli acidi biliari 12ot-idrossi in aggiunta alla misura di acidi biliari totali mediante 3ct-HAS è riportata per essere possibilmente adattabile alla determinazione oppure alla analisi del livello e del progredire di malattie epatiche [Journal of Clinical and Experimental Medicine, voi. 143, 10 , 775-776 (1987)]. Questo è un altro,aspetto per cui è stato desiderato lo sviluppo di analisi quantitativa altamente sensibile degli acidi biliari .
In considerazione della presente situazione, gli attuali inventori hanno intrapreso estesi studi sulla azione reversibile in cui acidi ossobiliari vengono prodotti impiegando !acidi biliari come sostrato. Come conseguenza, gli inventori hanno scoperto che, nel sistema di reazione in cui acidi ossobiliari vengono prodotti da acidi biliari impiegando una deidrogenasi di steroide derivata da un microorganismo specifico e da composti NAD (oppure composti NADP ) come coenzima, se una piccola quantità di un altro coenzima, composti NADPH (oppure composti NADH)j, era presente per effettuare una reazione ; reversibile di ciclizzazione tra acido biliare acido ossobiliare, la quantità di composti NADH (oppure composti NADPH) prodotta aumentava linearmente nel tempo. Gli inventori hanno anche trovato che il regime di aumento era proporzionato al contenuto di acidi biliari in un campione, e hanno depositato una domanda di brevetto (domanda di brevetto giapponese n° 98443/1989).
Il metodo tuttavia aveva un problema di produrre un errore quando devono venire determinati soltanto i tipi ridotti prodotti in proporzione alla quantità di acidi biliari, dato che sia i composti NADH che'1i composti NADPH hanno un picco di assorbimento a 340 nm.
La forma ridotta di tioriicotinammide adenina dinucleotide oppure suoi analoghi (di seguito collettivamente riportati corneicomposti tio-NAD) e la forma ridotta di tionicotimammide adenina dinucleotide fosfato oppure suoi analoghi (collettivamente riportati come composti tio-NADP) sono note per avere un picco di assorbimento nelle vicinanze di 400 nm, che è differente da quello del tipo ridotto dei composti NAD e dei composti NADP.
In considerazione della presente situazione, gli attuali inventori hanno intrapreso ulteriori estesi studi e hanno trovato che l'idrossasteroide oppure 1 'ossiidrossisteroicle possono venire quantitativamente analizzati con elevata sensibilità se uno dei due coenzimi impiegato nella reazione enzimatica di ciclizzazione sopra menzionata viene sostituito mediante composti tio-NADP oppure composti tio-NAD e se sono determinate l'una e l'altra quantità dei i coenzimi. Questa scoperta ha inoltre portato allo sviluppo di un metodo per una determinazione accurata di acidi biliari .
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Di conseguenza uno scopo della presente invenzione è di fornire un metodo di analisi altamente sensibile di acidi biliari che comprende le operazioni di:
far reagire un campione contenente acido biliare con un reagente che comprende:
(1) una deidrogenasi di steroide la quale catalizza l'ossidazione reversibile di acidi biliari producendo acidi ossobiliari/ nella quale reazione (i) uno dei composti scelti tra composti tio-NADP e composti tio-NAD e (ii) uno dei composti scelti tra composti NADP e composti NAD, vengono impiegati come coenzimi,
(2) composto A^ (definitojin appresso), e (3) composto (definito in appresso) per effettuare la seguente reazione,
deidrogenasi·
di1steroide
Acido
biliare ■>acido .ossobiliare
in cui A^ è un composto tio-NADP, un composto tio-NAD, un composto NADP oppure un composto NAD, A2 ed un prodotto ridotto di Α^, :ed un composto NADP ridotto oppure un composto NAD!ridotto quando A·^ è un composto tio-NADP oppure un composto tio-NAD, oppure un composto tio-NADPj ridotto oppure un composto tio-NAD ridotto quando A^ è un composto NADP oppure un composto NAD, je B2 è un prodotto ossidato di B^,
misurare le variazioni nella quantità di A2 oppure B^ nella suddetta reazione.
Un altro scopo della presente invenzione è di fornire una composizione di reagente per la analisi di acidi biliari, che comprendé:
(1) una deidrogenasi di; steroide la quale catalizza la ossidazione reversibile di acidi biliari producendo acidi ossotiliari, nella quale reazione (i) uno dei composti !scelti tra composti tio-NADP e composti tio-NAD e (ii) uno dei composti scelti dai composti NADP e composti NAD, vengono impiegati come coenzimi,
(2) composto A·^ e
(3) composto .
Altri scopi, aspetti e vantaggi dell'invenzione diverranno in seguito più prontamente evidenti dalla descrizione che segue.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI
La figura 1“è un diagramma che mostra il risultato della prova del tasso di acido colico a 400 nm nell'esempio 1. !
La figura 2 mostra il risultato della prova del tasso della quantità di acido chenodeossicolico a 400 nm nell'esempio 2.
La figura 3 mostra il risultato della prova del taso di acido colico a 400 nm nell'esempio 3.
La figura 4 mostra il risultato della prova del tasso della quantità di siero a 400 nm nell'esempio 4.
la figura 5 mostra il risultato della prova del tasso di acido colico 400 nm nell'esempio 6.
La figura 6 mostra il risultato della prova del tasso di acido colico a 340 nm nell'esempio 7.
La figura 7 mostra il risultato della prova del tasso di acido colico a 340 nxn nell'esempio 8. DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLA INVENZIONE E REALIZZAZIONI PREFERITE
Qualsiasi deidrogenasi di steoride che soddisfi le esigenze di cui sopra può venire impiegata per lo scopo della presente invenzione. Esempi specifici di deidrogenasi di steroide utilizzando composti NAD e composti tio-NAD come coenzima sono deidrogenasi di 3a-idrossisteroide (3a-HSD) (EC 1.li 1.50), derivate da Pseudomonas testosteronii, [J.B.C., 227 37-52 (1957)] oppure Bacillus sphaericus (brevetto giapponese aperto al pubblico n° 157894/1979); 7c†HSD (EC 1.1.1.159) derivata da Bacteroides fragills (Biochim Biophys . Acta 384 12-21 (1975) oppure Pseudomomas sp. B-0831 (Toyo Jozo Co., Ltd. catalogo n° T-28); 12ot-HSD (EC 1.1.1.176) derivata da Bacillus Sphaericus (Toyo Jozo Co, Ltd. catalogo n° T-29), e similari. Dati come esempi di deidrogenasi di steroidi utilizzando composti NAD, composti NADP, composti tio-NAD e composti tio-NADP come coenzimi, sono 3a-HSD derivate da fegato, prostata di ratto [J. Steroid Biochem., J3, 41-46 (1977)], oppure Pseudomonas sp. B-0831 (Toyo Jozo Co. Ltd. catalogo n° T-27).
AJL e BJL rappresenta un composto tio-NADP, composto tio-NAD, composto NADP oppure composto NAD. Di questi, dati come esempi di composti NADP sono nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADP) e suoi analoghi quali acetilpiridina adenina dinucleotide fosfato (acetil NADP), nicotinammide ipoxantina dinucleotide fostato (deammino NADP), e similari per composti NADP; e nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), acetilpiridina adenina dinucleotide (Acetil NAD), nicotinammide ipoxantina dinculeotide (deammino NAD) e similari per composti NAD.
Dati come esempi di composti tio-NADP sono tionicotinammide adenina dinucleotide fosfato (tio-NADP) e suoi analoghi qualji tionicotinammide ipoxantina dinucleotide fosfato; e dei composti tio-NAPD sono tionicotinammide adenina dinucleotide (tio-NAD) e suoi analoghi quali tionicotinammide ipoxantina dinucleotide e similari.
Cioè nella presente invenzione o l'uno o l'altro di A^ e deve essere;.un composto tio-NADP oppure un composto tio-NAD.
Questi vengono scelti in dipendenza dalla deidrogenasi di steroide impiegata nell'analisi. Quando la deidrogenasi di steroide ha soltanto composti NAD come coenzima, adiesempio, può venire impiegato un composto tio~NAD|e uno dei composti NAD sopra menzionati. Quando la deidrogenasi di steroide reagisce sia coi composti NAD che con i composti NADP come coenzimi, può venire impiegata una combinazione idonea di un·composto tio-NADP e di un composto tio-NAD, e può venire impiegata una combinazione idonea scelta fra i composti NAD ed i composti NADP sopra menzionati.
Le quantità di A^ e sono in eccesso in relazione alla quantità di acidi biliari contenuti nel campione. E' anche essenziale che essi siano in eccesso in relazione al rispettivo valore Km della deidrogenasi di steroide perj e B]_. Quantità preferibili in modo particolare è 20 fino a 10.000 volte in moli di acidi biliarii
Nella composizione di reagente per la analisi degli acidi biliari della presente invenzione, concentrazioni del componente A-^ e possono essere 0,02 fino a 100 mM e preferibilmente 0,05 fino a 30 mM. Una concentrazione preferibile di deidrogenasi di steroide può essere 0,05 fino a 100 unità/ml e in modo particolarmente preferito 1 fino a 50 unità/ml. La quantità può venire regolata in dipendenza dal tipo del campione. La quantità che eccede l'intervallo di cui sopra è tollerabile. Nel caso in cui la deidrogenasi di steroide reagisce sia con i composti NAD che con i composti NADP come coenzimi, se la combinazione dei due coenzimi è un composto tio-NADje o un composto NAD oppure un composto NADP, oppure un composto tio-NADP e o un composto NAD oppure un composto NADP, è possibile fare reagire il campione con un secondo componente di deidrogenasi ;(4) il quale non reagisce con gli 'acidi biliari ma agisce in modo far progredire la reazione! B2 :>B e il sostrato per la seconda deidrogenasi. Questo assicura una reazione e B2 per la rigenerazione di come mostrato nello schema di reazione (II), fornendo così una reazione di ciclizzazione per acidi biliari. In questo esempio, la quantità di A2 formata dalla reazione viene misurata per la analisi
deidrogenasi di
L steroide
Acido .
bi 1 tare < acido ossobi.l iare
seconda deidrogenasi
(Π)
in cui A·^ è un composto tio-NAjDP, un composto tio~ NAD, un composto NADP oppure un composto NAD, A2 è un prodotto ridotto di A^, B^ è un composto ridotto di NADP oppure un composto ridotto di NAD quando A^ è un composto tio-NADP oppure un composto tio-NAD, oppure un composto ridotto jtiò-NADP oppure un composto ridotto tio-NAD quando A^ è un composto NADP oppure un composto NAD, .e B2 è un prodotto ossidato di B^, e B2 - >i B^ è una reazione enzimatica che produce B^ impiegando B2 come coenzima.
La seconda deidrogenasi viene addizionata allo scopo di rigenerare B^, riducendo così la quantità di da impiegare nella reazione. Questo è particolarmente efficace quando è un composto costoso. Al posto di è possibile impiegare B2 oppure un miscuglio di B^ e B^. In questo caso una quantità preferibile di B^ e, oppure B2 è generalmente 1/10 di mole, preferibilmente un centesimo oppure inferiore della quantità di A·^ sebbene la quantità non sia particolarmente limitata.
Nella composizione di reagente per la analisi degli acidi biliari impiegand† il componente (4), la concentrazione del componente A^ può essere 0,02 fino a 100 mM, e preferibilmente 0/05 fino a 30 mM, con la concentrazione del componente B» oppure che è 0,05 fino a 5000 μΜ|e preferibilmente 5 fino a 500 μΜ. Una concentrazione preferibile di deidrogenasi di steroide può essere 0,05 fino a 100 unità/ml, e in modo particolarmente preferibile 1 fino a 50 unità/ml. La quantità dèlia seconda deidrogenasi può venire regolata a 20 volte oppure più (unità: U/ml) del valore Km (unità:mM) per B2, ad esempio 1-100."U/ml, con la quantità del suo sostrato che è preferibilmente in eccesso, ad esempio 0,05 fino a 20 mM. Queiste quantità possono venire determinate in dipendenza dal tipo del campione. La quantità in eccesso dell'intervallo di cui sopra è tollerabile.
Dati come esempi della seconda deidrogenasi e dei loro sostrati sono, quando !B2 è un composto NAD oppure un composto tio-NAD, alcool deidrogenasi (EC 1.1. 1.1) ed etanolo, glicerolo deidrogenasi (EC 1.1. 1.6) derivata da E. Coli e >glicerolo, glicerol-3-fosfato deidrogenasi (EC 1.1.1.8) derivata da muscoli di coniglio e L-glicerol-3-fosfato, malato deidrogenasi (EC 1.1.1.37) derivata da cuore di maiale oppure di bovino ≥ acido L-malico, gliceraldeide fosfato deidrogenasi (EC 1.2.1.12) derivata da muscoli di coniglio/ fegato, lievito oppure E. Coli, D-gliceraldei.de fosfato e acido fosforico; e quando B2 è un composto NADP oppure un composto tio-NADP/ glucosip-S-fosfato deidrogenasi (EC 1.1.1.49) derivata da lievito e glucosio -6-fosfato, acido isocitrico | deidrogenasi (EC 1.1.1.42) derivata da cuore di maiale oppure lievito ed acido isocitrico, acido glicolico deidrogenasi, (EC 1.2.1.17) derivata da Pseudomonas oxalaticus, “CoA ed acido glicossilicof acido fosfogluconico deidrogenasi (EC 1.1.1.44) derivata da fegato di ratto, lievito di!birra oppure E. Coli e acido 6-fosfo-D-gluconico, gliceraldeide fosfatodeidrogenasi (EC 1.2.1.13) derivata da clorofilla vegetale, D-gliceraldeide-3-f osf ato e acido fosforico, benzaldeide deidrogenasi (EC 1.2.1.7) derivata da Pseudomonas fluore<'>scens e benzaldeide, e simile.
Inoltre, nel caso in cui la deidrogenasi di steroide reagisce e con i composti NAD e con i composti NADP come coenzimi, se la combinazione dei due enzimi è un composto tio-NAD e o un composto NAD oppure un composto NADP, oppure un composto tio-NADP e o un composto NAD o un composto NADP, è possibile far reagire il campione con (5) una terza deidrogenasi la quale non reagisce con acidi biliari ma agisce in modo che proceda la reazione A2 - > A^ e il sostrato per la terza deidrogenasi.
Questo assicura una reazione tra Aj ed A2 per la rigenerazione di A^ come mostrato nello schema di reazione (III), fornendo così una reazione di ciclizzazione per acidi biliari. In questo esempio, per la analisi viene misurata la quantità di formata dalla reazione.
Terza deidroqenasi a
de idrogenasi
di steroide
bil iare
■> acido ossobi 1 iare j
(ni)
in cui A^ è un composto tio-NADP., un composto tio -NAD, un composto NADP oppure uL composto NAD, A2 è
1
un prodotto ridotto di Α^, è un composto ridotto di NADP oppure un composto ridótto di NAD quando A^ è un composto ·tio-NADP oppure un composto tio-NAD, oppure un composto ridotto tio-NADP oppure un composto ridotto tio-NAD quando è un composto NADP oppure un composto NAD, le B2 è un prodotto ossidato di B^, e A2 - >A·^ è una reazione enzimatica che produce A^ impiegando A2 come coenzima .
La terza deidrogenasi viene addizionata allo scopo di rigenerare Aj_, riducendo cosi la quantità di A^ da impiegare nella reazione. Questo è particolarmente efficace quando A^ è un composto costoso. Al posto di A^ è possibile impiegare A2 oppure un miscuglio di A^ e A2. In questo esempio, una quantità preferibile di jA^ e, oppure A2 è generalmente più piccola jii 1/10 di mole, preferibilmente 1/100 di mole oppure inferiore, della quantità di , sebbene: la quantità non sia particolarmente limitata.
Nella analisi di acidi biliari della presente invenzione impiegando il componente (5), una concentrazione preferibile del componente B^ è 0,02 fino a 100 mM, e particolarmente 0,05 fino a 30 mM. La concentrazione di A2/ oppure A^ è 0,05 fino a 5000 μΜ, e preferibilmente 5!fino a 500 μΜ. La quantità di deidrogenasi di jsteroide può essere 0,05 fino a 100 U/ml, e preferibilmente 1 fino a 50 U/ml. La quantità della terza deidrogenasi (U/ml) è 20 volte o più del valore Km (unità: mM) per A2 e, ad esempio, 1 fino a 100 U/mli II sostrato per la terza deidrogenasi viene impiegato in una quantità di, ad esempio, 0,5 fino a j20 mM. La quantità specifica di questo componente1viene determinata in dipendenza dal tipo del campione e similari, e l'impiego dei componenti che eccedono i quantitativi sopra definiti è tollerabile.
Dati come esempi della terza deidrogenasi e dei loro sostrati sono, quando è un composto NAD oppure un composto tio-NAD, alcool deidrogenasi (EC 1 .1.1.1) a acetaldeide, glicerolo deidrogenasi (EC 1.1.1.6) derivata da E. Coli e diidrossiacetone, glicerolo-3-f osf ato deidrogénasi (EC 1.1.1.8) derivata da muscoli di coniglio e diidrossiacetonfosfato, malato deidrogenasi (EC 1.1.1.37) derivata dal cuore di maiale oppure di bovino e acido ossaloacetico , gliceraldeide fosfato deidrogenasi (EC 1.2.1.12) derivata da muscolo di coniglio, fegato, lievito, oppure E. Coli e 1,3-difosfo-D-glicerofosfato; e quando A^ è un composto NADP oppure un composto tio-NADP, glucosio-6-fosf atodeidrogenasi (EC 1.li.1.49) derivata da lievito e gluconolattone-6-fosfato, gliceraldeide fosfato deidrogenasi (EC 1.2.1.13) derivato da clorofilla vegetale e 1,3-difosfo-D-glicerofosfato, e similari.
Può venire impiegata qualsiasi deidrogenasi di steroide che è reattiva con un reagente di acido biliare quale acido colico cheiagisce come sostrato in presenza di un composto NAD (preferibilmente NAD), un composto tio-NAD (preferibilmente tio-NAD), un composto NADP (preferibilmente NADP ) oppure un composto tio-NADP (preferibilmente tio-NADP ) come coenzima. L'applicabilità di una idrogenasi di steroide al reagente della presente invenzione può venire confermata mediante 1'impiego di un tale coenzima e un jsostrato da venire impiegato .
La composizione della soluzione di reazione può venire determinata come !segue. Due tipi di coenzimi vengono dapprima scelti prendendo in considerazione la relativa attività della deidrogenasi disteroide e i coenzimi che sono da impiegare. Quindi il pH viene regolato tra i pH ottimali della reazione avanzata e della reazione inversa in modo tale che il rapporto del regime di reazione avanzata e del regime;di reazione inversa può essere vicino ad 1. Nel caso, ad esempio, in cui 3ct-ASD [derivata da Pseudomonas sp B-0831; Toyo Jozo Co., Ltd., catalogo n° Tj-27) viene impiegata insieme con acido colico come sostrato e con un composto tio-NAD come coenzima, la relativa attività è circa 40% in confronto con NAD come coenzima e il pH ottimale per Ile reazioni avanzata ed inversa sta nelle vicinanze di 9,5 e 5,5 rispettivamente. Gli enzimi possono venire impiegati sia singolarmente oppure in combinazione.
Per la determinazione di una quantità di acidi biliari in un campione impiegando il reagente preparato come descritto sopra e secondo il metodo della presente invenzione, 0,001 fino a 0,5 mi del campione vengono addizionati al reagente contenente i componenti di cui sopra (1) fino a (3), (1) fino a (4), oppure (1) fino a (3) é (5) e fatti reagire a circa 37°C. La quantità di A2 prodotta oppure la quantità di B·^ consumata dalla reazione viene poi determinata mediante la misura dell'assorbimento per il periodo di tempo prescritto, vari minuti fino a varie decine di minuti, a due tempi prescritti dopo la partenza [della reazione, ad esempio per un minuto tra 3 minuti e 4 minuti dopo la partenza della reazione, oppure 5 minuti tra 3 minuti e 8 minuti dopo la partenza della reazione.
Ad esempio quando À2 è tio-NÀDH e B^ è NADH, la quantità di A2 prodotta viene [determinata mediante la misura dell 'aumentato assorbimento a 400 nm oppure la quantità di B·^ viene jdeterminata mediante la misura del diminuito assorbimento a 340 nm. Una determinazione in tempo reale Ideila concentrazione di acido biliare in un campione è possibile confrontando il valore così ottenuto.con il valore ottenuto da un campione avente una concentrazione nota di acido biliare.
Dato che l'analisi qualitativa secondo la presente invenzione viene effettuata mediante la introduzione degli stessi acidi biliari nella reazione enzimatica di ciclizzazione, essa viene influenzata meno dagli altri cIomposti che esistono nel campione e consente di tralasciare la prova in bianco del campione. Il metodo fornisce così una prova di regime semplice e facile.
In aggiunta, questo metodo analitico assicura non soltanto la determinazione quantitativa degli acidi biliari totali mediante !3a-HSD, ma anche la determinazione quantitativa separata degli acidi biliari 7a-idrossi mediante j7a-HSD e gli acidi biliari 12ot-idrossi mediante I2ct-HSD.
Oltre all'analisi mecliante misure di assorbimento, la quantità di A2 oppure di B-L può venire anche determinata mediante altri metodi analitici enzimatici noti.
Come illustrato sopra, l'impiego nel metodo della presente invenzione dei coenzimi in forma ridotta con lunghezze d'onda di assorbimento differenti, riduce errori nella prova. Attraverso la combinazione con una reazione enzimatica di ciclizzazione la sensibilità può venire grandemente favorita. Il metodo assicura una pronta ed accurata determinazione degli acidi biliari impiegando una piccola quantità di campione,
Altri aspetti della invenzione saranno evidenti nel corso della descrizione che segue delle realizzazioni a titolo di esempio le quali sono date per la istruzione dell'invenzione e non sono intese ad essere limitative di essa.
ESEMPI
Esempio 1
"Reagente "
40 mi di tampone al fosfato (pH 8,0)
1 mM di tiO-NAD
0,2 mM di NADH
0/1 % di Triton X-100
5 U/ml di 3ot-HSD (derivata da Pseudomonas testosteronii, prodotta da Sigma Co.) "Procedura "
1 mi del reagente di cui sopra è stato addizionato a ciascuna di una serie di 7 cuvette di quarzo, e sono stati rispettivamente addizionati 10 μΐ di una soluzione di àcido colico alle concentrazioni di 0, 10, 20, 40, 60, 80 e ΙΟΟμιη, una concentrazione per ciascuna delle sette cuvette, e fatte reagire a 37°C. E' stato misurato l'assorbimento a 400 nm in corrispondenza di 2 e 3 minuti dopo la partenza della reazione e sono state determinate le differenze. I risultati sono mostrati nella figura 1, la quale dimostra buona linearità nelle variazioni di assorbimento in relazione alla quantità di acido colico.
Esempio 2
"Reagente"
40 mM di tampone al fosfato (pH 7,0)
1 mM di tio-NAD
1 mM di NADH
0,1 % di triton X-100
20 U/ml di 7ct-HSD (derivata da Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd. Catalogo n° T-28) "Procedura"
1 mi del reagente di |cui sopra è stata addizionata a ciascuna di una srerie di 6 cuvette di quarzo, e sono stati rispettivamente addizionati 10 μΐ di una soluzione di acido chenodeossicolico ad una concentrazione di 0, 100, 200, 300, 400 e 500 μπ\, una concentrazione per; ciascuna delle 6 cuvette, e fatte reagire a 37°<'>C. E' stato misurato l'assorbimento a 400 nm in corrispondenza di 2 e 3 minuti dopo la partenza della reazione e sono state determinate le differenze. I risultati sono mostrati nella figura 2, la quale dimostra buona linearità nelle variazioni |di assorbimento in relazione alla quantità di acido chenodeossicolico.
Esempio 3
"Reagente"
40 mM di tampone tris-HCl (pH 8,5)
1 mM di tio-NAD
2 mM di NADPH
9 U/ml di 3a-ASD (derivato da Pseudomomas sp., Toyo Jozo Co., Ltd., catalogo n<?>T-27)
"Procedura"
1 mi del reagente di ‘cui sopra è stato addizionato a ciascuno di una serie di 7 cuvette di quarzo, e rispettivamente sono!stati aggiuti 10 μΐ di una soluzione di acido coljico a concentrazioni di 0,10, 20 , 40, 60, 80 e 100 μπι, una concentrazione per ciascuna delle sette cuvette, e fatte reagire a 37°C. E' stato misurato l'assorbimento a 400 nm in corrispondenza di 3 e 4 minuti dopo la partenza della reazione e sono state determinate le differenze. ! I risultati sono mostrati nella figura 3, la quale dimostra buona linearità nelle variazioni di assorbimento in relazione alla quantità di acido colico.
Esempio 4
"Reagente<1>’
4 mM di tampone tris-HCl (pH 8,0)
1 mM di tio-NAD
0,2 mM di NADH
0,2 % di Triton X-100
2 mM di acido ossamicoj
10 U/ml di 3ot-HSD (derivata da Pseudomonas sp., Toyo Jozo Co., Ltd. catalogo n°T-27) "Procedura"
1 mi del reagente di cui sopra è stato addizionato a ciascuna di una serie di cinque cuvette di quarzo, e sono stati rispettivamente addizionati 100 μΐ di siero diluito a differenti concentrazioni, da 5/5 a 1/5; una concentrazione per ciascuna delle cinque cuvette e fatte reagire a 37°C. E' stato misurato l'assorbimento 400 nm in corrispondenza di 3 e 4 minuti dopo la partenza della reazione e sono stalte determinate le differenze. I risultati sono mostrati nella figura 4.
Esempio 5
"Reagente”
40 mM di tampone tris-HCl (pH 8,0)
1 mM di tio-NAD
0,2 mM di NADH
0,2 % di Triton X-100
2 mM di acido ossamico
3,5 U/ml di 3a-HSD (derivato da Pseudomonas sp. Toyo Jozo Co..Ltd., Catalogo n° T~27) "Procedura<11>
1 mi del reagente di cui sopra è stato addizionato a ciascuna di :una serie di tre provette, e sono stati addizionati 50 μΐ di campione di siero preparati aggiungendo acido colico alla concentrazione di 10 μΜ, 20 μΜ oppure 50 μΜ. Ciascuna miscela è stata poi lavorata nello stesso modo come, nell'esempio 4, I risultati vengono presentati nella tabella 1, la quale mostra che i tassi di recupero erano 97,8 fino a 104,0%.
TABELLA ΐ;
Acido coli Acido coli Diffe- Tasso di reco aggiunto co trovato ren!za cupero
(μΜ) (μΜ) 1 <%)
0 5,3 o ! -j 10 | 15,3 1 9,9 | 99,0 j 20 ! 26,1 ] 20;8 | 104,0 | | 50 154,2 | 48;9 | 97,8 |
1_ [_ |_ i _ _j Esempio 6
"Reagente"
50 mM di tampone al fosfato (pH 7,9)
2,5 mM di tio-NAD
0,35 mM di NADH
59 U/ml di 7ot-HSD (derivato da Pseudomonas sp. Toyo Jozo Co. Ltd. Catalogo n° T-28) "Procedura"
0,5 mi del reagente di cui sopra sono stati addizionati a ciascuna di una serie di 6 cuvette di quarzo, e sono stati rispettivamente addizionati 25μπι di una soluzione di acido colico alle concentrazioni di 0, 0,2, 0,4,,0,6, 0,8 ed 1,0 μΜ, una concentrazione per ciascuna delle sei cuvette, e fatte reagire a 30°C per 60 minuti. Al termine della reazione, mediante una addizione di 0,5 mi di dodecilsolfato di sodio (SDS), è stato misurato assorbimento a 400 nm. I risultati sono mostrati nella figura 5, la quale dimostra buona linearità nelle variazioni di assorbimento in relazione alla quantità di acido colico.
Esempio 7
"Reagente"
40 mM di tampone di glieina-NAOH (pH 10,0) 5 mM di NADP
50 μΜ di tio-NAD
0,4 M di etanolo
30 U/ml di alcool deidrogenasi (prodotta da Orientai Yeast Co., Ltd.
10 U/ml di 3ot-HSD (derivata da Pseudomonas sp. B-0831, Toyo Jozo Co., Ltd., catalogo n° T-27)
0,2 % di Triton X-100
"Procedura"
1 mi del reagente di \cui sopra è stata addizionata a ciascuna di una serie di 6 cuvette di quarzo, e sono stati rispettivamente addizionati 10 μΐ di una soluzione di acido colico alle concentrazioni di 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 μΜ, una concentrazione per ciascuna delle sei cuvette, e fatte reagire a 37°C. |E ' stato misurato l'assorbimento a 340 nm in corrispondenza di 3 e 4 minuti dopo la partenza della reazione e sono state determinate le differenze, ι I risultati sono mostrati nella figura 6, la quale dimostra buona linearità nelle variazioni Jdi assorbimento in relazione alla quantità di acido colico.
Esempio 8
"Reagente"
40 mM di tampone PIPES-NaOH (pH 7,0)
0 ,25mM di NADPH
0 ,ΟίδιηΜ di tio-NAD
5 mM di diidrossiacetone fosfato
10 U/ml di glicerol-3-fosfato deidrogenasi (derivata da muscoli,di coniglio e prodotta da Boehringer Co.)
20 U/ml di 3a-HSD (derivata da Pseudomonas sp B-0831, Toyo Jozo Co., Ltd. catalogo n° T-27) ;
0,2 % di Triton X-100
"Procedura"
1 mi del reagente di cui sopra è stato addizionato a ciascuna di una serie di sei cuvette di quarzo, e sono stati rispettivamente addizionati 50 μΐ di una soluzione di Iacido colico alle concentrazioni di 0, 10, 20, 30, 40 e 50 μΜ, una concentrazione per ciascuna dèlie sei cuvette, e fatte reagire a 37°C. E' stato misurato l'assorbimento a 340 nm in corrispondenza di 3 e 4 minuti dopo la partenza della reazione e sono state determinate le differenze, I risultati sono mostrate nella figura 7, la quale dimostra buona linearità nelle variazioni di assorbimento in relazione alla quantità di acido colico.
Ovviamente sono possibili numerose modifiche e variazioni della presente invenzione alla luce degli insegnamenti di cui sopra. Perciò è da intendere che nell'ambito ; del campo delle rivendicazioni annesse, la invenzione può venire esercita diversamente di come iqui specificatamente descritto.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo e analisi altamente sensibile di acidi biliari che comprende le operazioni di: far reagire un campionL contenente acido biliare con un reagente che comprende: (1) una deidrogenasi di steroide la quale catalizza la ossidazione reversibile di acidi biliari producendo acidi ossobiliari, nella quale reazione (i) uno dei composti scelti tra tionicotinammide .adenina dinucleotide fosfato oppure suoi analoghi (composti tio-NADP) e tionicotinammide adenina dinucleotide oppure suoi analoghi (composti tio-NAD) e (ii) uno dei composti scelti tra nicotinammide adenina dinucleotide fosfato oppure suoi analoghi (composti NADP ) e nicotinammide adenina dinuclieotide oppure suoi analoghi (composti NAD), vengono impiegati come coenzimi, (2) composto (definito in appresso), e (3) composto BJL (definito in appresso), per effettuare la seguente reazione di ciclizzazione, deidrogenasi di steroide Acido < -> Acido ossobiliare bil iare in cui A^ è un composto tio-NADP, un composto tio-NAD, un composto NADP oppure uh composto NAD, A2 è un prodotto ridotto di A^, B-L è un composto ridotto di NADP oppure un composto ridotto di NAD quando è un composto tio-NADP oppure |un composto tio-NAD, oppure un composto ridotto tio-NADP oppure un composto ridotto tio-NAD quando A^ è un composto NADP oppure un composto NAD, e B2 è un prodotto ossidato di B^, e misurare le variazioni della quantità di A2 oppure nella reazione di cui sopra.
  2. 2. Metodo di analisi altamente sensibile di acidi biliari che comprende le operazioni di: far reagire un campionje contenente acido biliare con un reagente che comprende: (1) una deidrogenasi dij steroide la quale catalizza la ossidazione reversibile di acidi biliari producendo acidi ossobiliari, nella quale reazione (i) uno dei composti·scelti fra composti tio-NADP e composti tio-NAD e (ii) uno dei composti scelti tra composti NADP e composti NAD, vengono impiegati come coenzimi, (2) composto.A^ (definitojin appresso), (3) composto B^ e, oppure B2 (definito in appresso) , e (4) una seconda deidrogenasi la quale non reagisce con acidi biliari ma jagisce in modo tale da far procedere la reazione jB2 - > Bj_, e il sostrato per la seconda ]deidrogenasi , per effettuare la seguente reazione di ciclizzazione, 1 deidrogenasi · \ di steroide Acido — > acodi ossobiliare bi l i are - seconda dei -drogenasi in cui A-^ è un composto tio-NAjDP, un composto tio-NAD, un composto NADP oppure un compósto NAD, A2 è un prodotto ridotto di A^, è un composto ridotto di NADP oppure un composto ridótto di NAD quando A-^ è un composto tio-NADP oppure un composto tio-NAD, oppure un composto ridotto tio-NADP oppure un composto ridotto tio-NAD quando A·^ è un composto NADP oppure un composto NAD, e B2 è un prodotto ossidato di B^, e B2 - :>Β·^ è una reazione enzimatica che produce B-^ impiegando B2 come coenzima, e misurare la quantità di<1 >À2 prodotta nella reazione di cui sopra.
  3. 3. Metodo di analisi altamente sensibile di acidi biliari che comprende le operazioni di: far reagire un campione contenente acido biliare con un reagente che comprende: (1) una deidrogenasi di steroide la quale catalizza la ossidazione reversibile di acidi biliari producendo acido ossobiliari, nella quale reazione (i) uno dei composti scelti tra composti tio-NADP e composti tio-NAD e (ii) uno dei composti scelti tra i composti NADP . e i composti NAD, vengono impiegati come coenzimi, (2) composto A-^ e, oppure A2 (definiti in appresso), (3) composto (definito in appresso), e (5) una terza deidrogénasi la quale non reagisce con acidi biliari maiagisce in modo tale da far procedere la reazione A2 ->A^ e il sostrato della seconda deidrogenasi, per effettuare la reazione di ciclizzazione che segue, Terza deidrogenasi deidrogeriasi v di steroide acido bil iare .> Acido ossobil iare in cui A^ è un composto tio-NADP, un composto tio-NAD, un composto NADP oppure un composto NAD, A2 è un prodotto ridotto di A-^, è un composto ridotto di NADP oppure un composto ridotto di NAD quando Ai 1 è un composto tio-NADP oppure un composto tio-NAD, oppure un composto ridotto di tio-NADP oppure un composto ridotto di tio-NAD quando A^ è un composto NADT oppure un composto NAD, e B2 è . un prodotto ossidato di B^ , e A2 - >A^ è una reazione enzimatica che produce A·^ impiegando A2 come coenzima, e j . misurare la quantità di J B^ consumata nella reazione di cui sopra .
  4. 4. Metodo secondò le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cui la deidrogenasi di steroide è deidrogenasi di 3a-idrossisteróide.
  5. 5. Metodo secondo le rivendicazioi 1, 2 oppure 3, in cui la deidrogenasi di steroide è deidrogenasi di 7a-idrossisteroide.
  6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3, in cui la deidrogenasi di steroide è deidrogenasi di 12a-idrossisteroide.
  7. 7. Metodo secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3, in cui il composto NADP è un composto scelto dal gruppo costituito da nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADP), acetilpiridina adenina dinucleotide fosfato (acetil-NADP) e nicotinammide ipoxantina dinucleotide fosfat† (deammino NADP).
  8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3, in cui il composto NAD è un{composto scelto tra il gruppo costituito tra nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), acetilpiridina adenina dinucleotide (acetil-NAD), e nicotinammide ipoxantina dinucleotide (deammino NAD).
  9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3 , in cui il composto di tip-NAD è un composto scelto tra il gruppo costituito da tionicotinammide adenina dinucleotide (tio-NAD)| e tionicotinammide ipoxantina dinucleotide.
  10. 10. Metodo secondo la rivendicazione 1, 2 oppure 3, in cui il composto tio-NADP\è un composto scelto tra il gruppo costituito da tionicotinammide adenina dinucleotide fosfato (tio-NADP) e tionicotinammide ipoxantina dinucleotide fosfato.
  11. 11. Composizione di reagente per la analisi di acidi biliari che comprende: (1) una deidrogenasi di steroide la quale catalizza la ossidazione reversibile di acidi biliari producendo acidi ossibiliari/ nella quale reazione (i) uno dei compostiiscelti tra composti tio-NADP oppure composti tio-!NAD e (ii) uno dei composti scelti tra composti NADP e composti NAD, vengono impiegati come coenzimi, (2) composto il quale è scelto tra il gruppo costituito da composti tio-NADP, composti tio-NAD, composti NADP, e composti NAD, e (3) composto B-j^ il quale è un composto ridotto di NADP oppure un composto ridótto di NAD quando A^ è un composto tio-NADP oppure un composto tio-NAD, oppure un composto ridotto di tio-NADP oppure un composto ridotto di tio-NAD quando A^ è un composto NADP oppure un composto NAD. i
  12. 12. Composizione di reagente per la analisi di acidi biliari che comprende: (1) una deidrogenasi di steroide la quale catalizza la ossidazione reversibile di acidi biliari producendo acidi ossobiliari, nella quale reazione (i) uno dei compostijscelti tra composti tio-NADP e composti tio-NAD e (ii) uno dei composti scelti da composti NADP e composti NAD, vengono impiegati come coenzimi, (2) composto A^ il quale è scelto tra il gruppo costituito da composti* tio- NADP, composti tio-NAD, composti NADP, e composti NAD, (3) composto il quale è un composto ridotto di NADP oppure un composto ridotto di NAD quando A^ è un composto tio-NADP oppurejun composto tio-NAD oppure un composto ridotto di tio-NADP oppure un composto di tio-NAD quando A^ è un composto NADP oppure un composto NAD e, oppure un composto B2 che è un prodotto ossidato di B-t, e (4) una seconda deidrog|enasi la quale non reagisce con acidi biliari ma'agisce in modo tale da far procedere la reazione, B2 - >B^, e il sostrato per la seconda deidrogenasi.
  13. 13. Composizione di reagente per l'analisi di acidi biliari che comprende: (1) una deidrogenasi di! steroide la quale catalizza la ossidazione reversibile di acidi biliari producendo acidi ossobiliari, nella quale reazione (i) uno dei composti scelti tra composti di tio-NADP e composti di tiq-NAD è (ii) uno dei composti scelti tra composti NADP e composti NAD vengono impiegati come coenzimi, (2) composto A-^ il quale è scelto tra il gruppo costituito dra composti di tio-NADP, composti tio-NAD, .composti NADP e composti NAD, e, oppure composto A2 che è un|prodotto ridotto di Ai , (3) composto il quale è un composto ridotto di NADP oppure un composto ridotto di NAD quando A^ è un composto tio-NADP oppure Jun composto tio-NAD, oppure un composto ridotto tio-NADP oppure un composto ridotto tio-NAD quando ,Aj è un composto NADP oppure un composto NAD, e (5) una terza deidrogenasi la quale non reagisce con acidi biliari ma agisce,in modo tal da far procedere la reazione, A2- >A^_ e il sostrato per la seconda deidrogenasi. 1
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3034969B2 (ja) * 1991-03-01 2000-04-17 旭化成工業株式会社 アンモニア、α−アミノ酸類またはα−ケト酸の高感度定量法および高感度定量用組成物
US6380380B1 (en) * 1999-01-04 2002-04-30 Specialty Assays, Inc. Use of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and nicotinamide adenine dinucliotide phosphate (NADP) analogs to measure enzyme activities metabolites and substrates

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2156579A1 (de) * 1971-11-15 1973-05-24 Knut Dr Ing Kauder Flexible rohrleitung zum transport erwaermter oder gekuehlter fluide
EP0245528B1 (en) * 1985-03-28 1991-07-24 Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. Quantitative analysis of 3 alpha-hydroxysteroid and reagent useful therefor
JPS6336758A (ja) * 1986-07-30 1988-02-17 Yanagiya:Kk 中空練り製品の成形方法
US5037738A (en) * 1987-06-03 1991-08-06 Abbott Laboratories Simultaneous assay for glucose and urea
JP2811319B2 (ja) * 1989-04-18 1998-10-15 旭化成工業株式会社 胆汁酸の高感度測定法および測定用組成物
JPH0673478B2 (ja) * 1990-01-11 1994-09-21 旭化成工業株式会社 Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物
EP0682119B1 (en) * 1990-09-18 1999-03-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Myo-inositol dehydrogenase

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