JP2007536914A - シトクロムcの定量検出手段 - Google Patents
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Abstract
本発明は、所与の生物学的サンプル中のシトクロムcを検出する方法であって、シトクロムcの繰り返しの酸化還元を可能にする有効量の2つのレッドクス対を該サンプルに加える工程であり、該対は、シトクロムcオキシダーゼ酵素からなる酸化剤とシトクロムcに特異的な還元剤とを還元された補助因子と共に含む工程と、補助因子に依存しかつ補助因子の酸化型の形態を還元型の形態から区別することを可能にする生物物理学的システムによって、前記の繰り返しの酸化還元反応の間に酸化される補助因子の酸化を測定する工程であり、補助因子の酸化型の形態の量は、サンプル中のシトクロムcの濃度と相関させられる工程とを包含する方法に関する。
Description
本発明は、試験されるべき生物学的サンプル中のミトコンドリアからのシトクロムcの放出を検出する手段に関する。
ミトコンドリアは、細胞のアポトーシスの調節において、タンパク質のサイトゾルへの放出を通して中心的な役割を果たす。
抗アポトーシスタンパク質Bcl−2がミトコンドリア内にあることが見出されて以来、科学者は、このオルガネラがアポトーシスにおいて重要な担い手であると考え始めた。2つの主たる所見が、Bcl−2、ミトコンドリアおよびアポトーシス間の結び付きを補強した:Bcl−2がTNF誘導型アポトーシスの間に観察されるミトコンドリア膜電位(ΔΨm)の降下を多くの細胞タイプにおいて防止することが分かった。一方、Newmeyerらは、ミトコンドリアの因子がカスパーゼの活性化のために必要とされることを発見した。アポトーシスの間にミトコンドリアから放出されるこの因子は、後に、シトクロムcであると確認された。
2つの主要なアポトーシスの経路は、過去数年間にわたって記載されてきた:デスレセプター経路およびミトコンドリア経路である。最初のものは、デスレセプターによって連動させられ、これは、それらの適切なリガンドに結合する際に、死を誘導するシグナリングコンプレックスを形成し、結果として、プロカスパーゼ8の活性化を生じさせる。タイプI細胞(Tリンパ球)において、カスパーゼ8は、細胞を仕上げる下流のカスパーゼを切断する。タイプII(肝細胞Hepatocyte)において、カスパーゼ8は、Bidを切断し、C末端のフラグメントがミトコンドリアに転位したBH3−onlyタンパク質がミトコンドリア経路に連動する。デスレセプターの活性化とは無関係に、ミトコンドリア経路はまた、DNA損傷、トポイソメラーゼ阻害または栄養因子枯渇を含む大多数の死の刺激に応答して活性化され得る。この過程は、膜間空間からサイトゾルへのミトコンドリアタンパク質の放出に終わる。
Wangのグループは、カスパーゼ活性の誘導がサイトゾル抽出物の調製の間に放出されるシトクロムcの存在に依存していることを示した。シトクロムcのバインディングの際、Apaf−1(apoptotic protease-activating factor 1)は、コンフォメーションの変化を経、プロカスパーゼ9を活性化し、細胞死に至る。
アポトーシスのメカニズムに興味を持つ世界中の多くの研究所は、生物学的調製物(ミトコンドリアの上清、サイトゾル抽出物等)中のシトクロムcの放出を研究しており、この放出は、アポトーシス実行の特質である。したがって、シトクロムcの検出は、アポトーシス促進薬または抗アポトーシス薬を発見するために大きな興味を有し、単独でまたは他の測定(ΔΨm、ミトコンドリア膨張等)と組み合わされて、スクリーニング戦略と一体化される。
このタイプの調査は、一般に、免疫検出(例えば、ウエスタン・ブロッティングまたはELISA)を検出法として用いて実行される。しかしながら、ウエスタン・ブロッティングは、時間を消費する手順であり(約2日)、半定量的方法は正確性に乏しい。結果として、この方法は、種々の条件下でのシトクロムc放出の量および速度論の詳細な分析に用いられ得ず、薬物のスクリーニングに用いられ得ない。他方、ELISA定量法は、プレートコーティング、予めセッティングされたフォーマットの使用を必要とし、複数回の洗浄段階のため真にユーザーフレンドリーというわけではない。
HPLCも、シトクロムcの定量のために用いられてきた。ウエスタン・ブロッティングと比較して、HPLC法は、定量データを提供することができる。しかしながら、サンプルは、順番に定量化されなければならず、各定量化には、少なくとも20分を必要とする。
本発明者らは、シトクロムcに特異的な薬剤を用いることによって、酵素法により種々の細胞下分画中のシトクロムcの濃度を測定することが可能であることを見出した。
本発明の目的は、第1に、生物学的サンプル中のシトクロムcの濃度を正確に定量化するためのツールを提供することである。本発明の別の目的は、所望のアッセイ法を行うための既製品のキットを提供することである。
本発明によると、本方法は、
− シトクロムcの繰り返し(cycling)の酸化還元のために、研究されるサンプルに有効量の2つのレドックス対を加える工程であり、該対は、酸化剤であるシトクロムcオキシダーゼ酵素(COX)およびシトクロムcに特異的な還元剤中を補助因子と共に含む工程と、
− 酸化還元の繰り返しの間に酸化される補助因子の酸化を測定する工程であり、その酸化型の形態の量が、サンプル中のシトクロムcの濃度に相関させられる工程と
を必要とする。
− シトクロムcの繰り返し(cycling)の酸化還元のために、研究されるサンプルに有効量の2つのレドックス対を加える工程であり、該対は、酸化剤であるシトクロムcオキシダーゼ酵素(COX)およびシトクロムcに特異的な還元剤中を補助因子と共に含む工程と、
− 酸化還元の繰り返しの間に酸化される補助因子の酸化を測定する工程であり、その酸化型の形態の量が、サンプル中のシトクロムcの濃度に相関させられる工程と
を必要とする。
発生させられる繰り返しの酸化還元システムは、シトクロムcの高特異的かつ高感度の検出を可能にする。還元剤は、シトクロムcを特異的に還元し、この還元は、前記の補助因子の附随する酸化をモニタリングすることによって検出される。補助因子の酸化に起因するシグナルを増幅させるために、酸化剤であるシトクロムcオキシダーゼが、シトクロムcを再酸化するように反応培地に加えられ、これにより、このシトクロムcが還元剤によって再度用いられることが可能となる。発生させられる繰り返しの酸化還元システムは、シトクロムcの存在に厳密に依存する。したがって、補助因子の酸化の増幅は、シトクロムcが試験されるサンプル中に存在することを示す。
補助因子の酸化は、補助因子に応じ、かつ酸化型の形態を還元型の形態から区別することが可能である生物物理学的なシステム(例えば、NADHまたはNADPH検出のための340nmでの分子吸光光度分析法による吸光度測定;ただしこれに限定されない)によって手際よく測定される。
本発明の好ましい実施形態では、還元剤は、NADH−シトクロムcレダクターゼまたはNADPH−シトクロムcレダクターゼであり、補助因子はNADHまたはNADPHである。
有利には、前記の測定は、標準のシトクロムcの既知濃度の測定と比較される。
前記の酸化および還元剤および補助因子は、例えば(ただし限定はされない)、液体下であるか、乾燥させられるか、または凍結乾燥させられた形態であり、組み換えまたは天然の化合物の精製または化学合成によって得られる。
検出は、シトクロムcを含むと思われるあらゆる生物学的サンプル、例えば、ストレス、特にアポトーシス誘導ストレスに付されても付されなくてもよい、一次細胞、細胞系、組織、血液、臓器または腫瘍から精製される細胞の抽出物またはオルガネラについて行われてよい。
検出は、有利には、種々の実験条件下にインキュベーションを行った後にミトコンドリアを沈降させる際に得られる上清において、または、種々の実験条件下での細胞のインキュベーションの後のサイトゾルの精製の際に得られる細胞の抽出物において行われる。
本発明はまた、試験されるべきサンプル中のシトクロムcを検出するためのキットに関する。このようなキットは、
− シトクロムcの繰り返しの酸化還元のための2つのレドックス対であって、該対は、酸化剤、すなわち、シトクロムcオキシダーゼ酵素およびシトクロムcに特異的な還元剤を含み、還元された補助因子を用いる、ものを含む。
− シトクロムcの繰り返しの酸化還元のための2つのレドックス対であって、該対は、酸化剤、すなわち、シトクロムcオキシダーゼ酵素およびシトクロムcに特異的な還元剤を含み、還元された補助因子を用いる、ものを含む。
還元剤は、有利には、NADH−シトクロムcレダクターゼまたはNADPH−シトクロムcレダクターゼであり、補助因子はNADHまたはNADPHである。
前記キットにおいて、前記の各剤は、例えば(ただし制限はされない)、液体下にあるか、乾燥させられているか、または、凍結乾燥させられた形態にあり、組み換えまたは天然の化合物の精製または化学合成によって得られる。
場合によっては、前記のキットは、緩衝剤をさらに含む。
前記のキットはまた、対照標準として標準のシトクロムcを含む。
前記手段は、生物学的サンプル中のシトクロムcを検出するための、イムノアッセイ、HPLC検出またはウェスタンブロッティングの有利な代替物である。
本発明は、下記の実施例および図面によってさらに例示される。
本発明の本実施形態では、測定は、220マイクロリットルの最終容積の透明な平底96ウェルマイクロプレートにおいて行われる。酵素である調製された酵素緩衝剤(10mMのTris−HCl,pH 7.0, 250mMのサッカロース)が、180マイクロリットルのアッセイ緩衝剤(10mMのTris−HCl,pH=7.0, 120mMのKCl、300μMのNADHまたはNADPH)に加えられた(ウェル当たり20マイクロリットル)。反応は、220マイクロリットルの最終容積を得るように、精製されたシトクロムcまたは所望のサンプルのいずれかを20マイクロリットル加えることによって開始される。
NADHおよびNADPHの両方が340nmの波長を吸収するがNAD+およびNADP+がそれを吸収しないので、NADHまたはNADPHの酸化は、340nmで分光分析法により測定される。補助因子の酸化の速度の測定のために、吸光度が、速度論のモードで、室温で30分にわたりモニタリングされる。
NADHの消費の速度(M/分)
=(DOt=180秒−DOt=1800秒)・60/(1800−180)・6230
シトクロムcおよびNADHまたはNADPHの原液は、蒸留水において調製される。
=(DOt=180秒−DOt=1800秒)・60/(1800−180)・6230
シトクロムcおよびNADHまたはNADPHの原液は、蒸留水において調製される。
・シトクロムcの検出のための繰り返しの酵素アッセイ(図1)。
酵素Aは、シトクロムcレダクターゼであり、シトクロムcの還元および附随する補助因子(NADHまたはNADPH)の酸化を触媒する。このため、酸化されたシトクロムcは、レダクターゼによって還元される。酵素Bは、シトクロムcオキシダーゼであり、それは、還元されたシトクロムcを酸化し、電子を分子状酸素に移す。両酵素の存在は、シトクロムcを用いた酸化還元の繰り返しを可能にする。繰り返しの速度は、過剰の両酵素の存在下にシトクロムcによって制限された。NAD(P)Hの酸化の速度は、利用可能なシトクロムcの量に直接的に比例する。シアン化物(KCN)は、シトクロムcオキシダーゼ阻害剤である。
・NAD(P)Hの酸化は、酵素サイクルの種々の成分の同時の存在に依存し、シトクロムcオキシダーゼ阻害に応じて完全に阻止される。測定は、340nmでの吸光光度分析によって行われる(図2)。
完全培地:300μMのNADH、300μUのNADH−シトクロムcレダクターゼ、300μUのシトクロムcオキシダーゼ、2μMのシトクロムc;1.NADHのみ;2.シトクロムcオキシダーゼなしの完全培地;3.シトクロムcなしの完全培地;4.NADH−シトクロムcレダクターゼなしの完全培地;5.シトクロムcオキシダーゼの阻害に関して500μMのKCNが加えられた完全培地;6.完全培地;特に、成分のいずれかの欠如は繰り返し操作を妨げるが、シトクロムcオキシダーゼ調製のNADH−シトクロムcレダクターゼによる汚染に起因して、加えられたNADH−シトクロムcレダクターゼの欠如は別である。
・一定のシトクロムc濃度で、繰り返しの反応の速度は、加えられた酵素の量に依存する。測定は、340nmでの吸光光度分析によって行われる(図3)。
酵素濃度の低い範囲では、NADH(300μM)の酸化は、酵素濃度と相関する。選択された例では、NADH−シトクロムcレダクターゼは、シトクロムcオキシダーゼと比較して過剰に存在し、反応の速度は、この後者の酵素に依存する。したがって、大過剰の両酵素が、研究されるサンプルとともに潜在的に加えられる酵素から生じるかもしれないあらゆる干渉を避けるために必要とされる。
・飽和酵素濃度で、繰り返しのアッセイの速度は、シトクロムc濃度に依存するだけである。測定は、340nmでの吸光光度分析によって行われる(図4)。
高い酵素濃度(ウェル当たり、240μUのNADH−シトクロムcレダクターゼ、240μUのシトクロムcオキシダーゼ)で、NADH(300μM)がシトクロムc濃度に比例して酸化された。低いシトクロムc濃度について、NADHの消費の速度とシトクロムc濃度との間に線形相関がある。それによって、この反応は、シトクロムcを定量化するための簡単かつ便利な方法となる。
・飽和酵素濃度は、ミトコンドリア上清中の低濃度のシトクロムcを検出することを可能にする。測定は、340nmでの吸光光度分析によって行われる(図5)。
ミトコンドリアの調製およびインキュベーション:マウス肝臓のミトコンドリアが、標準的ではあるがわずかな改変を伴う手順によって調製された。簡単には、細かく切り刻まれた肝臓が、培地A(0.3Mのサッカロース、0.2mMのEGTAおよび5mMのTES,pH 7.2)中でホモジナイズされた。ホモジネートは、低速で遠心分離され(760g,4℃で10分)、上清が集められて培地Aに希釈され、さらに遠心分離された(8740g,4℃で10分)。洗浄されたミトコンドリアは、2つの連続するパーコール勾配(Percoll gradient)の超部上に層状に重ねられた。パーコール勾配は、培地B(0.3Mのサッカロース、0.2mMのEGTA、10mMのTE;pH 6.9)中の18%、30%および60%(w/v)のパーコールの3層からなっている。遠心分離(8740g,10分)の後、損なわれていないミトコンドリアを含む画分は、30%/60%の界面から集められ、培地Aにより洗浄され(8740g,10分)、ペレット状物が、500μLの培地A中に再懸濁させられた。タンパク質濃度は、BCAアッセイによって測定された。
精製されたミトコンドリア(4mgタンパク質/mL)は、次いで、培地C(0.2Mのサッカロース、5mMのコハク酸塩、10μMのEGTA、1mMのH3PO4、2μMのロテノンおよび10mMのTris−MOPS;pH 7.4)中で室温下に30分にわたり、シトクロムc放出の誘導剤としての500μMの塩化カルシウムまたは5μg/mLのアラメチシンとともにインキュベートされた。
サンプルの調製:処理されたミトコンドリアは、遠心分離され(6800g,4℃で10分)、上清は、10,000Daの濃縮器マイクロチューブ(concentrator microtube)上で、12,000gで室温下15分にわたり約20倍に濃縮された。各サンプル(20マイクロリットル)が200マイクロリットルの反応溶液(180μLのアッセイ緩衝液中の300μMのNADH、10μLの酵素緩衝液中の1mUのNADH−シトクロムcレダクターゼ、10μLの酵素緩衝液中の1mUのシトクロムcオキシダーゼ)に加えられた:1.蒸留水;2.精製されたシトクロムc 100nM;3.損なわれていない精製ミトコンドリアの上清;4.カルシウム処理されたミトコンドリアからの上清;5.アラメチシン処理されたミトコンドリアからの上清。この実験のセットは、提案された繰り返しの酵素アッセイがミトコンドリア調製物から放出されたシトクロムcを定量化するのに十分に高感度であることを確立する。
Claims (20)
- 所与の生物学的サンプル中のシトクロムcを検出する方法であって、
− シトクロムcの繰り返しの酸化還元を可能にする有効量の2つのレドックス対を該サンプルに加える工程であり、該対は、シトクロムcオキシダーゼ酵素からなる酸化剤と、シトクロムcに特異的な還元剤とを還元型の補助因子とともに含む、工程と、
− 補助因子に依存しかつ補助因子の酸化型の形態を還元型の形態から区別することを可能にする生物物理学的なシステムによって、前記の繰り返しの酸化還元反応の間に酸化される補助因子の酸化を測定する工程であり、補助因子の酸化型の形態の量は、サンプル中のシトクロムcの濃度に相関させられる、工程と
を包含する方法。 - 前記測定は、標準のシトクロムcにより行われた測定と比較される、請求項1に記載の方法。
- 還元剤はNADH−シトクロムcレダクターゼまたはNADPH−シトクロムcレダクターゼであり、還元型の補助因子はNADHまたはNADPHである、請求項1または2に記載の方法。
- 補助因子は、340nmでの吸光光度分析によって検出される、請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 前記の各剤は、限定されるわけではないが例えば、液体下にあるか、乾燥させられるかまたは凍結乾燥させられた形態であり、組み換えまたは天然の化合物の精製または化学合成によって得られる、請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
- あらゆる新しいスクリーニングプロトコールのために最適化されるか、または、あらゆる既存のスクリーニング手順に適応させられる、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
- 試験されるべきサンプル中のシトクロムcを検出するためのキットであって、
− シトクロムcの繰り返しの酸化還元のための2つのレドックス対であって、シトクロムcオキシダーゼ酵素からなる酸化剤と、シトクロムcに特異的な還元剤とを還元型の補助因子と共に含む対を含むキット。 - 還元剤はNADH−シトクロムcレダクターゼであり、補助因子はNADHである、請求項7に記載のキット。
- 還元剤はNADPH−シトクロムcレダクターゼであり、補助因子はNADPHである、請求項7に記載のキット。
- 参照基準としてシトクロムcをさらに含む、請求項7〜9のいずれか1つに記載のキット。
- 緩衝剤をさらに含む、請求項7〜10のいずれか1つに記載のキット。
- 前記の各剤は、限定されるわけではないが例えば、液体下にあるか、乾燥させられるか、または凍結乾燥させられた形態であり、組み換えまたは天然の化合物の精製または化学合成によって得られる、請求項7〜11のいずれか1つに記載のキット。
- 研究所での研究のみのために規定される、請求項7〜12のいずれか1つに記載のキット。
- 診断用途のために規定される、請求項7〜12のいずれか1つに記載のキット。
- 容器のあらゆるフォーマット、限定されるわけではないが例えば、96ウェルのマイクロプレート、384ウェルのマイクロプレート、1mLのキュベットに最適化される、請求項7〜14のいずれか1つに記載のキット。
- ミトコンドリア上清中のシトクロムcを検出するために最適化される、請求項7〜15のいずれか1つに記載のキット。
- サイトゾル抽出物中のシトクロムcを検出するために最適化される、請求項7〜15のいずれか1つに記載のキット。
- シトクロムcを含むことが予想される任意の他の生物学的サンプル中のシトクロムcを検出するために最適化される、請求項7〜15のいずれか1つに記載のキット。
- ミトコンドリアのおよび/またはサイトゾルの画分の調製のために供給される試薬を有する、請求項18に記載のキット。
- ミトコンドリアのおよび/またはサイトゾルの画分の調製のための方法論を有する、請求項19に記載のキット。
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