CZ277729B6 - Method of creatinine determination - Google Patents

Method of creatinine determination Download PDF

Info

Publication number
CZ277729B6
CZ277729B6 CS851216A CS121685A CZ277729B6 CZ 277729 B6 CZ277729 B6 CZ 277729B6 CS 851216 A CS851216 A CS 851216A CS 121685 A CS121685 A CS 121685A CZ 277729 B6 CZ277729 B6 CZ 277729B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
liter
mmol
sarcosine
methylhydantoin
units
Prior art date
Application number
CS851216A
Other languages
English (en)
Inventor
Joachim Rndr Siedel
Rolf Rndr Deeg
Albert Rndr Roder
Joachim Rndr Ziegenhorn
Hans Mollering
Helmgard Gauhl
Original Assignee
Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Mannheim Gmbh filed Critical Boehringer Mannheim Gmbh
Publication of CS121685A3 publication Critical patent/CS121685A3/cs
Publication of CZ277729B6 publication Critical patent/CZ277729B6/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/78Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914Hydrolases (3)
    • G01N2333/978Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/986Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81Packaged device or kit

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Oblast vynálezu
Vynález se týká způsobu stanovení kreatininu převedením na 1-methylhydantoin s následnou hydrolýzou, načež se stanoví vzniklé produkty.
Dosavadní stav techniky
V analytické chemii, zejména v klinicko-chemické diagnostice, je stále větší potřeba diagnostických postupů pro stanovení produktů biologické výměny látek a dalších odvozených sloučenin. Příčinou je výjimečně vysoká specifičnost reakcí, které jsou katalyzovány enzymatickými látkami a jejich rychlý, přesně definovaný a bezztrátový průběh za mírných reakčních podmínek, obvykle při teplotě 15 až 40 °C ve vodném prostředí při neutrálním pH a také možnost stanovit tyto látky jednoduchým a citlivým způsobem, zejména pomocí fotometrických měřicích metod buď přímo, nebo pomocí dalších indikátorů, a to vždy kvantitativně.
V případě enzymatického stanovení kreatininu v séru nebo v moči je známo několik postupů, které byly popsány například v publikacích: Wahlefeld A. W., G. Bolz a H. U. Bergmayer, v H. U. Bergmeyer: Methoden der enzymatischen Analyse, 3. vydání, sv. II, Verlag Chemie, Weinheim 1974, str. 1834 - 1838; Fossati P., L. Prencipe a G. Berti, Clinical Chemistry (1983), 29, 1494 - 1496; Tangenelli, E. L. Prenzipe, D. Bassi, S. Cambiaghi a F. Muxador, Clinical Chemistry (1983), 28, 1461 - 1464, tyto postupy však mají tu společnou nevýhodu, že reakce probíhá buď přes kreatin (Wahlefeld a další, Fossati a další), nebo přes amoniak (Tangenelli a další), jako meziprodukty. Jde o látky, které jsou v určitých koncentracích přítomny v téměř každém analyzovaném séru nebo ve vzorku moči. K měření množství kreatinu je tedy nutno užít dvou odlišných nebo za sebou prováděných reakčních směsí, v nichž se nejprve stanoví volný kreatin nebo amoniak a ve druhém stupni po přidání kreatininamidohydrolázy (E.C. 3.5.2.10) nebo kreatininiminohydrolázy (= kreatinindeiminázy) se pak zjišťuje další kreatin, který vzniká z kreatininu nebo další amoniak (postup zkouška/slepá zkouška nebo E-j_/E2). Takové postupy jsou velice náročné časově vzhledem k ručnímu provedení a při jejich provádění je možno užít automatizované analytické systémy jen omezeně, zejména v případě, že k úplnému průběhu reakce je zapotřebí delší inkubační doba. V zásadě je při vhodné volbě reakčních podmínek možno provést stanovení kreatininu známými enzymatickými metodami způsobem v tzv. fixovaném čase. Vyžaduje to však velmi přesné dodržování času, v němž se měření provádí za definovaných teplotních podmínek, což je zatím možno provést pouze v analytických automatech a vylučuje to ruční provádění měření.
Na rozdíl od kreatinu nebo amoniaku není 1-methylhydantoin (N-methylhydantoin, NMR) přírodní složkou séra nebo moči. Stanovení kreatininu přes 1-methylhydantoin jako meziprodukt by tedy mělo tu podstatnou výhodu, že nebude zapotřebí provádět slepou zkoušku a mimoto může být enzymatická reakce prováděna sama jako indikátorová reakce, nebo je možno za tuto reakci zařadit indikátorovou reakci, protože běží o látku, která se ani v séru ani v moči nenachází za běžných podmínek v signifikantních koncentracích.
V literatuře již byly popsány různé způsoby pro enzymatickou hydrolýzu hydantoinů působením Hydantoináz (hydropyrimidin-hydroláza, E. C. 3.5.2.2) z‘různých zdrojů, avšak účinek, tohoto enzymu bylo možno prokázat jen v případě nesubstituovaného hydantoinů, například podle publikace Wallach D. ,P. a S. Grisolia, J. Biol. Chem. (1957), 226, 277 - 288), popřípadě v případě hydantoinů, substituovaných v poloze 5 (DAS 26 31 048, DAS 28 11 303), Olivieri R. , E. Fascetti, L. Angelini a L. Degen, Biotechnology and Bioengineering (1981), 23, 2173 - 2183). Mimoto není pro žádný z uvedených enzymů možno prokázat závislost na kofaktoru. Enzym, popsaný v publikaci Wallacha a dalších, nepotřebuje pro hydrolýzu hydantoinů také žádnou přísadu vícevazných kovových iontů, v práci Olivieriho a dalších se dokonce popisuje inhibice hydantoin-hydrolýzy za přítomnosti chloridu amonného v koncentraci 0,1 mol/litr, kdežto účinnost enzymu, užívaného k provádění způsobu podle vynálezu, je možno přidáním amonných solí dokonce podstatně zvýšit.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je způsob stanovení kreatininu, tím, že se kreatinin převede působením kreatinindeiminázy E.C. 3.5.4.21 na 1-methylhydantoin s následnou hydrolýzou této látky působením 1-methylhydantoinázy za přítomnosti adenosintrifosfátu nebo guanosintrifosfátu a iontů hořčíku nebo manganu, načež se stanoví
a) produkt hydrolýzy 1-methylhydantoinu působením N-karbamoylsarkosinamindohydrolázy za vzniku sarkosinu a stanovením sarkosinu pomocí sarkosinoxydázy nebo sarkos indehydrogená zy, nebo
b) současně vznikající nukleosiddifosfát adenosintrifosfátu nebo guanosintrifosfátu, přičemž se stanovení provádí ve vodném roztoku s obsahem pufru při hodnotě pH v rozmezí 7,0 až 9,0 při koncentraci pufru v rozmezí 10 až 500 mmol/litr, za přítomnosti 0,1 až 100 mmol/litr amonné soli.
S výhodou se hořečnaté ionty užijí ve formě chloridu hořečnatého, síranu hořečnatého nebo asparganu hořečnatého.
S výhodou se přidá 0,1 až 50 mmol/litr dvojsytného kovového iontu, a 0,01 až 10 jednotek/ml 1-methylhydantoinázy a užije se 0,1 až 20 jednotek/ml N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy a 1 až 20 jednotek/ml sarkosinoxidázy nebo sarkosindehydrogenázy.
Nový enzym 1-methylhydantoináza se nachází v některých mikroorganismech. Jde zejména o mikroorganismy čeledi Brevibacterium, Moraxella, Micrococcus a Arthrobacter. Příklady některých kmenů těchto čeledí, v nichž je možno prokázat množství enzymů, které stojí za zpracování, jsou například Arthrobacter spec. DSM 2563, DSM 2564, Moraxella spec. DSM 2562, Micrococcus spec. DSM 2565 nebo Brevibacterium spec. DSM 2843.
Enzym, který se používá při provádění způsobu podle vynálezu, se získá s výhodou tak, že se pěstuje některý ze svrchu uvedených mikroorganismů a enzym se izoluje z biomasy a/nebo živného prostředí.
Byly stanoveny následující vlastnosti nového enzymu:
1. Molekulová hmotnost
a) 125 000 při zjištění elektroforézou na SDS-gelovém gradientu
2. Optimální pH je 7,8
Účinnost v % při 25 *C:
pH: 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
TES-pufr 5 76 100 100 95 69
150-mmol/1
TRIS-pufr 1 26 60 52 38 19
150 mmol/1
3. Specifičnost:
relativní účinnost v % (ve srovnání s ADP/pyruvátkináza/laktát-dehydrogenáza)
Substrát (vždy 0,1 mmol/litr konečné koncentrace v reakční směsi)
Při stanovení specifičnosti substrátu se užijí následující činidla:
1. Základní reakční činidlo:
složka koncentrace
fosforečnan draselný (pH 8,0) 75 mmol/litr
NADH 0,25 mmol/litr
ATP 1,30 mmol/litr
fosfoenolpyrohroznan 0,42 mmol/litr
chlorid hořečnatý 2,00 mmol/litr
pyrohroznan-kináza 4 j/ml
laktát-dehydrogenáza 10 j/ml
2. 1-methylhydantoináza (15 jednotek/ml v 50% glycerolu, 20 mmol/litr tris . HCl-pufru o pH 8,0
3. Roztoky hydantoinu
Koncentrace hydantoinů (1-methylhydantoinů, hydantoinu, 5-methylhydantoinu nebo 5,5-dimethylhydantoinu) byla vždy 0,6 mmol/litr vody
4. Provedení pokusu
Vlnová délka 365 nm, teplota 25 °C, objem zkoumaného roztoku 1,21 ml, d = 1 cm.
Do kyvety se napipetuje:
vzorek slepá zkouška
základní reakční
činidlo (1) 1,00 ml 1,00 ml
vzorek (3) 0,20 ml -
voda 0 0,20 ml
směs se promísí a pak se přidá:
1-methylhydantoináza ( 2) 0,01 ml 0,01 ml
Stanoví se Δε vzorku ( Δ Ep) a tatáž hodnota pro reakční směs ( Δ E^) · která je slepou zkouškou. Měření se provádí 2 minuty po přidání 1-methylhydantoinázy, výsledek se vypočítá z rovnice
Δ E = Δ Ep - Δ erl
5. Vypočítání relativní reakční rychlosti z hodnot E/min pro různé hydantoiny. ve srovnání s toutéž hodnotou pro 1-methylhydantoin, jehož hodnota se považuje za 100 %. Byly získány následující výsledky:
1-methylhydantoin
100 % %
5-methylhydantoin hydantoin
HN ch2
5,5-dimethylhydantoin
O
CH3 ch3
Nukleotidy
Relativní účinnost v % (ATP = 100) při stanovení přes karbamoylsarkosinamidohydrolázu + sarkosinoxydázu:
nukleotid (4 mmol/litr) %
ATP 100
ADP 1
AMP 0
GTP 7
CTP 1,5
TTP 0
UTP 0
ppi 0
Carb-fosfát 0
Na-tripolyfosfát 0
Na-hexametafosfát 0
4. Závislost na kovových iontech
Relativní účinnost v % mmol/litr (5 mmol/litr chloridu hořečnatého = 100)
sloučenina %
0 MgCl2 17
-1 MgCl2 83
5 MgCl2 100
10 MgCl2 98
5 MnCl2 60
5 ZnCl2 24
5. Aktivátory
Vyjádřeným aktivátorem je skupina NH4 +. Relativní účinnost v %
(30 mmol/litr AS = 100)
aktivační sloučenina mmol/litr ' %
žádná 0 44
(nh4)2so4 30 100
(nh4)2so4 10 95
nh4ci 30 91
NH4-acetát 30 98
Li2 SO 4 30 40
Nh 2 SO 30 39
K24 30 59
NaCl 30 41
NaHC03 30 40
6. Inhibitory
Vyjádřeným inhibitorem je EDTA a NaF
NAF: 1 x 10-2 mol/litr způsobí 100% inhibici
EDTA-inhibice: * mmol/1 relativní aktivita v %
0 100
5 100
10 42
50 2
* v přítomnosti 7,5 mM iontů Mg++ v reakční směsi
7. Michaelisova konstanta
Ι^ΑΤΡ (TES 0,15 mol/litr při pH 7,8 přes Sarcosin):
0,8 mmol/litr Km 1-methylhydantoin (0,15 mol/litr TES při pH 7,8 přes ADP): 0,02 mmol/litr
8. Stabilita:
a) Stabilita při různé teplotě v 50% glycerolu:
mmol/litr tris-pufru o pH 8,0 (2 jednotky/ml):
30 min zbytková účinnost v
25 °C 100
50 °C 94
60 °C 70
70 °C 0
b) Stálost.při různém pH % glycerolu, 10 mmol/litr tris-pufru, 0,2 jednotky/ml, +4 C, 3 dny potmě (výchozí hodnota je 100 %) pH zbytková účinnost v %
6,3 8
6,5 20
7,0 61
8,0 72
9,0 86
Enzym, který se užívá k provádění způsobu podle vynálezu, je možno získat z mikroorganismů, které obsahují dostatečné množství 1-methylhydantoinázy, a to způsobem, známým pro čištění enzymů. Účelně se postupuje tak, že se buňky mikroorganismu rozruší a enzym se vysráží přidáním polyethyleniminu. Tímto způsobem se získá enzymatický přípravek, který je možno přímo použít k analytickým účelům. V případě, že je zapotřebí dalšího čištění, provádí se s výhodou frakcionace síranem amonným, zahřátím nebo chromatografií.
Rozrušení mikroorganismů je možno provést známým chemickým nebo fyzikálním způsobem, například chemicky působením lysozymu nebo fyzikálně působením ultrazvuku, vysokým tlakem apod. Způsob není rozhodující. Výhodné jsou však ty způsoby, které rozrušují buněčnou membránu.
Pak se směs zahřívá s výhodou na 50 °C při pH, v němž má enzym dostatečnou stálost.
V případě chromatografického čistění je vhodné užít zejména fenylseparózu a aniontoměniče, které obsahují skupiny DEAE a jsou slabě alkalické. Při výhodném provádění tohoto čisticího prostředku se působí lysozymem ve 25% glycerolu, srážení se provádí polyethyleniminem, získá se sraženina, která se podrobí frakcionaci síranem amonným, načež se směs zahřívá na 50 °C při pH 8, pak se provádí chromatografie na fenylseparóze a pak na •p prostředku DEAE-Sephacel , nacez se užije frakcionace molekulárním sítem, s výhodou se užije SephacrylR S 20Ó. Tímto způsobem je možno získat čistý enzymatický přípravek se specifickou účinností 2,1 jednotky/mg bílkoviny, tento přípravek je možno užít ke stanovení vlastností enzymu.
Mikroorganismy, užité pro získání enzymu, se pěstují s výhodou na živném prostředí, které obsahuje jako zdroj uhlíku a dusíku kromě vitaminů a stopových prvků ještě 1-methylhydantoin.
Předmětem vynálezu je také použití 1-methylhydantoinázy ke stanovení methylhydantoinu ve vodném roztoku s obsahem pufru tak, že se kreatin převede kreatinindeiminázou E.C. 3.5.4.21 na 1-methylhydantoin, který se pak podrobí hydrolýze působením 1-methylhydantoinázy, s výhodou za přítomnosti nukleosid-trifosfátu a vícesytného kovového iontu, načež se stanoví
a) produkt hydrolýzy 1-methylhydantoinu působením N-karbamoylsarkoxinamidohydrolázy za vzniku sarkosinu s následným stanovením sarkosinu se sarkosinoxidázou nebo sarkosindehydrolázou, nebo
b) současně se tvořící nukleosiddifosfát.’
Vznikající produkt hydrolýzy se chová vzhledem k rychlosti reakce a výšce měřicího signálu při následné indikátorové reakci s N-karbamoylsarkosinamidohydrolázou v podstatě stejně, jako při reakci s 1-methylhydantoinem a N-karbamoylsarkosinem v ekvimolárním množství, jak je zřejmé z obr. 2 a 3.
Vodný roztok s obsahem pufru má pH s výhodou v rozmezí 7,0 až 9,0, zvláště v rozmezí 7,3 až 8,5 a zejména v rozmezí 7,5 a 8,2. K úpravě pH je možno užít látky, které mají dostatečnou kapacitu pufru v uvedeném rozmezí, jako jsou například fosfáty, tris-pufr, triethanolamin nebo TES. Nejvýhodnější je zejména TES-pufr. Koncentrace tohoto pufru se obvykle pohybuje v rozmezí 10 až 500 mmol/litr, s výhodou 50 až 200 ml/litr, zvláště v rozmezí 75 až 125 mmol/litr.
Z nukleosidtrifosfátů padá v úvahu zejména ATP nebo GTP, zvláště ATP. Koncentrační rozmezí se pohybuje obvykle mezi 0,05 až 50 mmol/litr, s výhodou 0,5 až 20 mmol/litr, zvláště v rozmezí 1 až 10 mmol/litr.
Z vícesytných kovových iontů se s výhodou užívají dvojsytné kovové ionty, zejména ionty hořečnaté a manganaté, zvláště ionty hořečnaté ve formě svých ve vodě rozpustných solí, například chloridu hořečnatého nebo síranu hořečnatého, nebo také asparaganu horečnatého. Koncentrace kovových iontů se pohybuje obvykle v rozmezí 0,1 až 50 mmol/litr, s výhodou v rozmezí 0,5 až 20 mmol/litr, a zvláště v rozmezí 1 až 10 mmol/litr.
Na. 1 ml reakční směsi se obvykle užije 0,01 až 10 jednotek 1-methylhydantoinázy, zejména 0,05 až 2, zvláště 0,1 až 1 j ednotka.
Aby bylo možno zvýšit účinnost 1-methylhydantoinázy, přidávají se ještě amonné soli. Koncentrace těchto solí se obvykle pohybuje v rozmezí 0,1 až 100 mmol/litr, s výhodou 1 až 30 mmol/litr, zvláště 5 až 10 mmol/litr.
Kreatininiminohydroláza se s výhodou použije v rozmezí 0,1 až 20 jednotek/ml, zvláště 0,05, až 15 jednotek/ml, zejména 1 až 10 jednotek/ml, zejména 1 až 10 jednotek/ml.
V případě N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy je možno použít běžně 0,1 až 20 jednotek/ml, s výhodou 0,5 až 10 jednotek/ml, zvláště 1 až 5 jednotek/ml. Jinak jsou údaje obdobné jako v DE-A-3248145.
V případě sarkosinoxydázy se obvykle užívá přibližně 1 až 2 jednotek/ml, s výhodou 2 až 10 jednotek/ml, zvláště 4 až 8 jednotek/ml. Totéž platí pro sarkosindehydrogenázu, kterou je k uvedenému účelu rovněž možno použít.
Stanovení sarkosinu sarkosin-oxidázou nebo sarkosindehydrogenázou je známé a může je provést každý odborník. Totéž platí pro stanovení vzniklého nukleosiddifosfátu, tj. ADP nebo GDP. Také v tomto případě se užívá známých postupů a také známých reakčních činidel.
Ke stanovení vzniklého sarkosinu je nejvýhodnější známá reakce se sarkosinoxidázou. Průběh oxidace sarkosinem je možno sledovat bud elektrofonicky spotřebou molekulárního kyslíku nebo tvorbou peroxidu vodíku v reakčním prostředí, nebo s výhodou enzymaticky na základě tvorby peroxidu vodíku a formaldehydu. Zvláště výhodné je stanovení peroxidu vodíku fotometricky, zvláště ve formě barevné reakce, katalyzované peroxidázou oxidativní vazbou kyseliny 2,4,6-tribrom-3-hydroxybenzoové na 4-aminoantipyrin. Účinnost peroxidázy má být 0,05 až 20 jednotek/ml, s výhodou 0,2 až 10 jednotek/ml, zejména 0,5 až 5 jednotek/ml. Kyselina tribromhydroxybenzoová se užije v koncentraci 1 až 25 mmol/litr, s výhodou 2 až 20 mmol/litr, zvláště 5 až 10 mmol/litr. Pro. 4-aminoantipyrin se užijí koncentrace 0,1 až 2 mmol/litr, s výhodou 0,2 až 1,5 mmol/litr, zvláště 0,5 až 1 mmol/litr. Je však také možno užít ostatní známé systémy pro stanovení peroxidu vodíku nebo pro stanovení formaldehydu.
Protože 1-methylhydantoináza převádí nukleosidtrifosfát stechiometricky na nukleosiddifosfát, je možno provádět stanovení kreatininu místo stanovení reakčního produktu po působení 1-methylhydantoinu také stanovením současně vznikajícího nukleosiddifosfátu, zejména ADP. Vhodná stanovení ADP jsou známá a popsaná například v publikaci H. U. Bergmeyer Methoden der enzymatischen Analyse, 3. vydání, 1974, str. 2128 ff a 2178 ff. Podobný popis proto nebude v průběhu přihlášky uváděn.
Reakční činidlo ke stanovení kreatininu s výhodou obsahuje kreatlnindeiminázu, 1-methylhydantoinázu, dále ATP nebo GTP, dvojsytný kovový ion, N-karbamoylsarkosinamidohydrolázu, sarkosinoxidázu nebo sarkosindehydrogenázu a pufr pro rozmezí 7,0 až 9,0.
Reakční činidlo s výhodou obsahuje ještě systém pro stanovení peroxidu vodíku nebo formaldehydu nebo systém příjemce elektronů, který může poskytovat zabarvení, například tetrazoliniovou sůl, aby bylo možno přímo pozorovat reakci se sarkosindehydrogenázou. Tyto systémy jsou známé, například z publikace H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim.
Kromě svrchu uvedených složek může reakční směs obsahovat ještě pomocné látky, například konzervační prostředky, jako azid sodíku, smáčedla a lipázy k vyčeření vzorků, zakalených přítomností triglyceridů, nebo také ferrokyanid draselný a askorbát-oxidázu k odstranění narušeného stanovení peroxidu vodíku působením bilirubinu nebo kyseliny askorbové. Při použití této reakční směsi ke stanovení 1-methylhydantoinu samotného je možno vynechat kreatininiminohydrolázu.
Reakční činidlo obsahuje jako dvojsytné kovové ionty s výhodou ionty hořečnaté nebo manganaté, jak již bylo uvedeno.
Svrchu uvedené reakční složky je možno užít také k impregnaci porézních nosných materiálů a pak provádět kvantitativní nebo kvalitativní stanovení kreatininu nebo 1-methylhydantoinu použitím těchto materiálů, například zkušebních proužků.
V dalším výhodném provedení může reakční činidlo obsahovat kreatinindeiminázu, 1-methylhydantoinázu, ATP nebo GTP, dvojsytné kovové ionty, zejména ionty hořečnaté nebo manganaté, systém pro stanovení ADP nebo GDP a pufr pro rozmezí pH 7,0 až 9,0.
Jako pufr se v tomto případě s výhodou užije fosforečnan draselný. Pro koncentraci pufru, kreatinindeiminázy, 1-methylhydantoinázy, ATP, hořečnatých nebo manganatých iontů a popřípadě amonných solí platí totéž, co bylo uvedeno shora.
Stanovení ADP se s výhodou provádí pomocí reakce mezi kinázou pyrohroznanu a laktát-dehydrogenázou za přítomnosti fosfoenolpyrohroznanu a NADH, přičemž vznikající množství ADP se stanoví fotometric’ y spotřebou NADH reakcí s laktát-dehydrogenázou. Tato stanovení jsou známa a může je provést každý odborník, není proto zapotřebí tyto postupy podrobněji uvádět.
V případě použití reakční směsi pro stanovení 1-methylhydantoinu sámotného je možno vynechat kreatininiminohydrolázu.
Vynález bude popsán následujícími příklady v souvislosti s přiloženými vyobrazeními.
Na obr. 1 je graficky znázorněna závislost extinkce, získané podle příkladu 5, na množství použitého 1-methylhydantoinu, na obr. 2 je znázorněno provedení z obr. 1 při použití N-karbamoylsarkosinu místo 1-methylhydantoinu v příkladu 6, na obr. 3 jsou graficky znázorněny výsledky z příkladu 5 a 6, na obr. 4 je 'znázorněno provedení z obr. 1 pro příklad 7, na obr. 5 je graficky znázorněna stechiometrická tvorba ADP, na obr. 6 je znázorněno provedení z obr. 1 pro příklad 8.
Byly užity následující zkratky a následující synonyma:
AS: síran amonný
Carb-fosfát: karbamyl-fosfát
CSHáza: N-karbamoylsarkosin-amidohydroláza
kreatinindeimináza: kreatinin-iminohydroláza
1-methylhydantoináza, NMHáza: 1-methylhydantoinhydroláza
N-methylhydantoin, NMH: 1-methylhydantoin
OD: optická hustota
PABS: kyselina p-aminobenzoová
ΡΡ±: TES: pyrofosfát kyselina 2-{[tris-(hydřoxymethyl)- -methyl]}aminoethansulfonová
TRIS: tris(hydroxymethyl)aminomethan.
Příklad 1
A) Pěstování výchozího kmene
K pěstování se užije Arthrobacter species DSM 2563 (izolovaný z orné půdy), který se přeočkovává 3 týdny na šikmý agar, který má na 1 litr následující složení:
g hydrofosforečnanu sodného Na2HPO4 . 2H2O g dihydrofosforečnanu draselného KH2PO4
0,5 g chloridu sodného
0,5 g síranu hořečnatého MgSO4 . 7H2O g N-methylhydantoinu (NMH) ml roztoku stopových prvků 1*
0,1 ml roztoku stopových prvků 2** ml vitaminového roztoku *** g agaru, pH 7,5 * Roztok stopových prvků 1
Ve 100 ml destilované vody se rozpustí 100 mg chloridu manganatého MnCl2 . 4H2O, 100 mg chloridu železitého
FeCl3 . 6H2O, 100 mg chloridu vápenatého CaCl2 . 2H2O a výsledný roztok se sterilizuje. Přidává se 1 ml tohoto roztoku na 1 litr živného prostředí.
«J· tfe1'' > o
Roztok stopových prvku 2
V 1000 ml destilované vody se rozpustí 1 mg chloridu mědnatého CuCl2 . 2H2O, 1 mg chloridu zinečnatého ZnCl2, 1 mg molybdenanu amonného (NH4)2Mo04, 1 mg chloridu kobaltnatého CoCl2 . 6H2O a výsledný roztok se sterilizuje. Přidává se 0,1 ml tohoto roztoku na 1 litr živného prostředí.
Vitaminový roztok
Ve 100 ml destilované vody se rozpustí 0,1 mg biotinu, 0,1 mg pyridoxolu, 0,1 mg pyridoxaminhydrochloridu, 0,1 mg PABS, 1,0 mg riboflavinu, 1,0 mg nikotinamidu, 1,0 mg kyseliny listové a 10,0 mg thiaminhydrochloridu a výsledný roztok se sterilizuje filtrací. Přidává se 1 ml tohoto roztoku na 1 litr živného prostředí.
ml kapalného, svrchu uvedeného prostředí se naočkuje plnou kličkou materiálu z šikmého agaru a kultura se protřepává 20 až 24 hodin při teplotě 28 °C v Erlenmeyerové baňce o objemu 100 ml. Pak se 10 ml této předběžné kultury přenese do 1000 ml stejného prostředí a dále se pěstuje 24 hódin při teplotě 28 °C až do přírůstku 200 ml/litr živného prostředí v Erlenmeyerové baňce (OD 1:20 = 0,425). Tato druhá předběžná kultura se přidává v množství 1 % do fermentoru s obsahem téhož prostředí o objemu 100 litrů a mikroorganismus se pěstuje 18 hodin při teplotě 28 °C.
Maximální tvorba enzymu se obvykle projevuje na konci růstu, tj. v pozdní log.-fázi. Ze shora uvedeného množství se získá 1180 g vlhké hmoty s obsahem 100 jednotek/litr NMHázy (1-methylhydantoinázy) a 160 jednotek/litr CSHázy (N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy).
B) Izolace a čištění enzymu
Z 280 g vlhké hmoty, tj. 20 litrů kultury Arthrobacter se izoluje 500 jednotek NMHázy způsobem, uvedeným v následujícím schématu:
Postup objem (ml) j ednotky j ednotky/mg bílkoviny výtěžek %
působení lysozymu ve 20% glycerolu 1400 1600 0,06 100
srážení polyethyleniminem. 430 1586 - 99-
frakcionace síranem amonným 120 1181 0,40 73
zahřívání na 50 °C při pH 8 90 934 0,67 58
chromatografie na fenylsepharose, eluát po odpaření 60 830 1,20 52
chromatografie na DEAEsephacelu 8 553 1,40 35
frakcionace molekulárním sítem Sephacryl S200 10 492 2,20 30,7
Údaje pro výsledný přípravek:
22,3 jednotky ml
10,5 mg/ml
2,1 jednotky/mg bílkoviny % glycerolu mmol/litr tris-pufru, pH = 8,3.
Stanovení účinnosti bylo prováděno následujícím způsobem:
1. Barevné reakční činidlo **
Složka
TES.KOH-pufr (pH 7,8)
4-aminoantipyrin
2,4,6-tribrom-3-hydroxybenzoová kyselina chlorid hořečnatý MgCl2
ATP síran amonný (NH4)~SO4
CSHáza sarkosin-oxidáza peroxidáza
2. Roztok 1-methylhydantoinu
3. Vlastní stanovení
Koncentrace
162 mmol/litr
0,81 mmol/litr
8,1 mmol/litr
8.1 mmol/litr
4,3 mmol/litr mmol/litr
1.1 jednotka/ml
6,5 jednotka/ml
2,7 jednotka/ml mmol/1
Užije se vlnové délky 546 nm, teplota 25 ’C, tloušťka vrstvy 1 cm, objem vzorku 2,03 ml, extinkční koeficient vzniklého barviva je 13 οιη2/μιηο1.
Do kyvety se napipetuje:
barevného reakčniho činidla (1) 1,88 ml vzorku 0,05 ml vzorek se promisí, chvíli se čeká tak, aby proběhla reakce mezi sarkosinem, obsaženým ve vzorku, a N-karbamoylsarkosinu, načež se přidá
1-methylhydantoin (2) 0,10 ml směs se promíchá a sleduje se vzestup exstinkce jako Δ E/min lineárním způsobem.
Vzorek: pro stanoveni se užije superatant surového extraktu po rozrušení mikroorganismu ultrazvukem ve 20% glycerolu s obsahem tris . HC1 o pH 8,0 o koncentraci 20 mmol/litr s 0,1 % prostředku triton X-100 po odstředění na ultraodstředivce.
** Pro sledování podle bodu 2 na str. 10, podle odst. 3b na str. 12 a 4,5 a 6 na str. 13 se odpovídajícím způsobem mění koncentrace látky nebo přidávané složky.
4. Výpočet
Λ E/min x 2,03 jednotky/ml vzorku = -------------- (popřípadě po x oi zředění vzorku)
Poznámka: Δ. E/min nemá být nikdy vyšší než 0,06, jinak je jinak je zapotřebí zředit vzorek. Fáze Lag trvá -přibližně 5 minut.
Příklad 2
Moraxella spec. DSM 2562, izolovaná ze vzorku podestýlky ve stáji skotu, se udržuje na šikmém agaru způsobem podle příkladu 1 a pak se pěstuje ve stejném prostředí jako species Arthrobacter.
Předběžná kultura ml prostředí NMH se uloží do 100 ml Erlenmeyerovy baňky, obsah baňky se naočkuje ze šikmého agaru a protřepává se 21 hodin při 28 ’C (OD 1:20 = 0,430).
Produkční kultura ml předběžné kultury se přenese do 400 ml prostředí NMH v Erlenmeyerově baňce o obsahu 2 litry a mikroorganismus se pěstuje 43 hodin při teplotě 28 °C za protřepávání. Pak se biologická hmota rozruší ultrazvukem a naměří se následující účinnost enzymu:
Hodiny kultivace OD 1:20 NMHáza jednotky/litr
24 0,415 41
28 0,495 72
39 0,730 57
Příklad 3
Brevibacterium species, DSM 2843, vzorek izolovaný ze stáje, odlišné od příkladu 2, se kultivuje stejným způsobem jako Moraxella v příkladu 2.
Předběžná kultura
Kultura se pěstuje 21 hodin při teplotě 28 ’C, OD 1:20 = 0,690.
Produkční kultura
Hodiny kultivace OD 1:20 NMHáza j ednotky/litr
15 0,440 26
24 0,550 80
39 0,670 59
43 0,750 46
Příklad 4
Mikrococcus spec. DSM 2565, izolovaný ze vzorku půdy, se pěstuje stejným způsobem jako Moraxella v příkladu 2.
Předběžná kultura: Kultura se pěstuje 21 hodin při teplotě 28 °C, OD 1:20 = 0,620.
Produkční kultura Hodiny kultivace OD 1:20 NMHáza jednotky/litr
24 0,690 53
27,5 0,800 83
Příklad 5
1. Enzymatický test s použitím barviva pro stanovení 1-methylhydantoinu (systém obsahuje 1-methylhydantoinázu/N-karbamoylsarkocinamidohydrolázu/sarkosinoxidázu, reakce se provádí se směsí peroxidázy, 4-aminoantipyrinu, kyseliny 2,4,6-tribrom-5-hydroxybenzoové a barevného indikátoru).
1.1 Reakční činidlo:
Složení reakčního činidla je uvedeno v následující tabulce:
Složka
Koncentrace
TES.KOH (pH 7,8)
MgCl2
ATP
NH4C1
4-aminoantipyrin kyselina 2,4,6-tribrom-3-hydroxybenzoová 1-methylhydantoináza N-karbamoylsarkosin-amidohydroláza sarkosin-oxidáza peroxidáza
100 mmol/litr mmol/litr mmol/litr mmol/litr
0,5 mmol/litr mmol/litr
0,15 jednotka/ml j ednotky/ml jednotek/ml jednotky/ml
1.2 Vlastni stanovení
Vlnová délka: 546 nm
Tloušťka vrstvy: 10 mm
Teplota: 25 °C
Měření se vždy provádí proti slepé zkoušce, která obsahuje pouze reakční činidlo.
Postup při měření je uveden v následujícím schématu:
Do kyvety se napipetuje:
hodnota pro hodnota pro slepou vzorek (P) zkoušku (RL) - , reakční činidlo podle odst. 1.1 2,00 ml 2,00 ml vzorek 0,10 ml voda - 0,10 ml
Složky se promísí, inkubují se 10 minut a pak se měří extinkce P proti RL, čímž se získá Δε.
vodné roztoky 1-methylhydantoinu o koncentraci 87,7 až 1754 pmol/litr.
Závislost Δε na okamžité koncentraci 1-methylhydantoinu ve vzorku je graficky znázorněna na obr. 1.
Příklad 6.
Stanovení N-karbamoylsarkosinu pomocí reakčního činidla 1.1 z příkladu 5.
Stanovení se provádí podle odstavce 1.2 z příkladu 5 pouze s tím rozdílem, že se místo vodných roztoků 1-methylhydantoinu užijí odpovídající vzorky s ekvimolární koncentrací (87,7 až 1754 ^mol/litr) N-karbamoylsarkosinu.
Závislost naměřené extinkční hodnoty má koncentraci N-karbamoylsarkosinu je graficky znázorněna na obr. 2.
Při srovnání hodnot, získaných pro extinkci v příkladu 5 a v příkladu 6 je možno pozorovat, že při použití vzorků s obsahem 1-methylhydantoinu a N-karbamoylsarkosinu v ekvimolární koncentraci se naměří totožné hodnoty barevného signálu, jak je zřejmé z obr. 3.
Příklad 7
Enzymatická zkouška v ultrafialovém světle pro stanovení 1-methylhydantoinu (směs obsahuje 1-methylhydahtoinázy, pyruvát-kinázu, laktát-dehydrogenázu).
7.1 Reakční činidlo
7.1.1 Reakční činidlo I:
Složka
Koncentrace
fosforečnan draselný (pH 8,0) 75 mmol/litr
NADH 0,25 mmol/litr
ATP 1,30 mmol/litr
fosfoenolpyrohroznan 0,42 mmol/litr
MgCl2 2,00 mmol/litr
pyruvát-kináza 4 j ednotky/ml
laktátdehydrogenáza jednotek/ml
7.1.2 1-Methylhydantoináza (15 jednotek/ml v 50% glycerolu o pH 8,0)
v.
7.2. Vlastní provedení
Vlnová délka: 365 nm
Tloušťka vrstvy: 10 mm
Teplota: 25 °C
Měření proti slepé zkoušce, která obsahuje pouze reakční činidlo
Do kyvety se napipetuje:
vzorek (P) slepá zkouška (RL) reakční činidlo I 1,00 ml vzorek 0,20 ml voda
1,00 ml
0,20 ml minuty se směs inkubuje, načež se měří výchozí extinkce vzorků (Ej ) a slepé zkoušky RL (E1 RL).
Pak se přidá:
NMHáza
0,01 ml
0,01 ml
Po dalších 5 až 10 minutách se měří extinkce P (e2,Rl)·
E - (Ep - Ερ) “ (e1,RL “ R2,RL^ ‘ vodné roztoky 1-methylhydantomu o koncentraci 87,7 az 877 μπιοΐ/litr k-k-k ) _ . .
> Poznámka:
V případě, že vzorek s obsahem 1-methylhydantoinázy obsahuje ještě určité množství ATPázy nebo NADH-oxidázy, což se ukáže při slepé zkoušce, a po přidání roztoku 1-methylhydantoinázy, je zapotřebí odečítat hodnoty E2 p a E? RL vždy ve stejných časových odstupech po přidáni' NMHaáy, například vždy po 6 minutách.
Závislost mezi naměřeným rozdílem v extinkci ( Δε) a okamžitou koncentrací 1-methylhydantoinu ve vzorku je znázorněna na obr. 4. Z výpočtu množství ADP, vznikajícího při hydrolýze 1-methylhydantoinu přes molární extinkční koeficient NADH při 365 nm je zřejmá stechiometrie celé reakce, spočívající ve spotřebě ATP za současného vzniku ADP a při současné hydrolýze 1-methylhydantoinu v poměru 1 : 1, jak je zřejmé z obr. 5.
Příklad 8
Enzymatická barevná zkouška ke stanovení kreatininu
8.1 Reakční činidlo:
Užije se reakční činidlo z odstavce 1.1 z příkladu 5 s přísadou kreatinin-iminohydrolázy v konečné koncentraci 2 j ednotky/ml.
8.2 Vlastní stanovení:
Stanovení se provádí podle odstavce 1.2 z příkladu 5, avšak jako vzorky se užijí vodné roztoky kreatininu o koncentraci, 87,7 až 1754 μιηοΐ/litr a doba inkubace pro P i RL se prodlouží na 20 minut.
Závislost Δ E na koncentraci kreatininu ve vzorku je graficky znázorněna na obr. 6.
V případě, že se z reakčního činidla 8.1 vynechá kreatininhydroláza, nedojde k žádné barevné reakci, tentýž zjev je možno pozorovat v případě, že se ve vzorku při stanovení podle odst. 8.2 užije místo roztoku kreatininu roztoku kreatinu o koncentraci 884 μτηοΐ/ϋύτ.

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ N Á R OKY
    1. : Způsob stanovení kreatininu, vyznačující se tím, že se kreatinin převede působením kreatinindeiminázy E.C. 3.5.4.21 na 1-methylhydantoin s následnou hydrolýzou této látky působením 1-methylhydantoinázy za přítomnosti adenosintrifosfátu nebo guanosintrifosfátu a iontů hořčíku nebo manganu, načež se stanoví
    a) produkt hydrolýzy 1-methylhydantoinu působením N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy za vzniku sarkosinu a stanovením sarkosinu pomocí sarkosinoxydázy nebo sarkosindehydrogenázy nebo
    b) současně vznikající nukleosiddifosfát adenosintrifosfátu nebo guanosintrifosfátu, přičemž se stanovení provádí ve vhodném roztoku s obsahem pufru při hodnotě pH v rozmezí 7,0 až 9,0 při koncentraci pufru v rozmezí 10 až
    500 mmol/litr, za‘přítomnosti 0,1 až 100 mmol/litr amonné soli.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se reakce provádí při hodnotě pH v rozmezí 7,3 až 8,5.
  3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se užije koncentrace pufru v rozmezí 50 až 200 mmol/litr.
  4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije 0,05 až 50 mmol/litr adenosintrifosfátu.
  5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se hořečnaté ionty použijí ve formě chloridu hořečnatého, síranu hořečnatého nebo asparganu hořečnatého.
  6. 6. Způsob podle nároku 1 nebo 5, vyznačující se tím, že se přidá 0,1 až 50 mmol/litr dvojsytného kovového iontu.
  7. 7. Způsob podle nároku 1 až 6, vyznačující se tím, že se přidá 0,01 až 10 jednotek/ml 1-methylhydantoinázy.
  8. 8. Způsob podle nároku 1 až 7, vyznačující se tím, že se použije 0,1 až 20 jednotek/ml N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se použije 1 až 20 jednotek/ml sarkosinoxidázy nebo sarkosindehydrogenázy.
    6 výkresů
    100,00 125,00 150,00 175,00 200,00
    Obr. 1
    25,00 50,00 75,00 100,00 125,00 150,00 175,00 200,00
    50,00 75,00 100,00 125,00 150,00 175,00 200,00
    Obr. 5 gd es
    Obr. 6
    100,00 125,00 150,00 175,00 200,00
CS851216A 1984-02-24 1985-02-20 Method of creatinine determination CZ277729B6 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19843406770 DE3406770A1 (de) 1984-02-24 1984-02-24 Nucleosidtriphosphat-abhaengige 1-methylhydantoinase und ihre verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS121685A3 CS121685A3 (en) 1992-06-17
CZ277729B6 true CZ277729B6 (en) 1993-04-14

Family

ID=6228749

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS851216A CZ277729B6 (en) 1984-02-24 1985-02-20 Method of creatinine determination

Country Status (15)

Country Link
US (1) US4816393A (cs)
EP (1) EP0154269B1 (cs)
JP (1) JPS60203190A (cs)
AT (1) ATE50789T1 (cs)
AU (1) AU555270B2 (cs)
CA (1) CA1261288A (cs)
CZ (1) CZ277729B6 (cs)
DD (1) DD241919A5 (cs)
DE (2) DE3406770A1 (cs)
DK (1) DK77185A (cs)
ES (1) ES540654A0 (cs)
FI (1) FI82071C (cs)
HU (1) HU194303B (cs)
IE (1) IE58353B1 (cs)
ZA (1) ZA851352B (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4021571A1 (de) * 1990-07-06 1992-01-16 Boehringer Mannheim Gmbh N-methylhydantoinase, kloniert
DE4029844A1 (de) * 1990-09-20 1992-03-26 Boehringer Mannheim Gmbh Carbamoylsarcosinhydrolase, kloniert
DE4103220A1 (de) * 1991-02-02 1992-08-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur stabilisierung von 1-methylhydantoinase, verwendung einer stabilisierten 1-methylhydantoinase zur bestimmung eines analyten, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignete mittel
US6524837B1 (en) 1999-03-29 2003-02-25 California Institute Of Technology Hydantoinase variants with improved properties and their use for the production of amino acids
WO2003093788A2 (en) * 2002-05-01 2003-11-13 Polymer Technology Systems, Inc. Test strip and method for determining concentration of creatinine in a body fluid
US7002670B2 (en) * 2002-06-12 2006-02-21 Baxter International Inc. Optical sensor and method for measuring concentration of a chemical constituent using its intrinsic optical absorbance
US20090029401A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Richmond Chemical Corporation Method for detecting biofuel producing microbes
CN108882895A (zh) * 2016-03-31 2018-11-23 聚合物工艺系统有限公司 用于肌酸酐电化学测定的系统和方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2122294C3 (de) * 1971-05-05 1979-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase
US4087329A (en) * 1975-08-28 1978-05-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Creatinine desimidase and its method of production
US4134793A (en) * 1975-08-28 1979-01-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Creatinine desimidase in the quantitative determination of creatinine
US4215197A (en) * 1978-08-04 1980-07-29 Miles Laboratories, Inc. Test means and method for creatinine determination
IT1137075B (it) * 1981-05-28 1986-09-03 Chemical Lab S R L Procedimento per la determinazione della creattinina (creatininio) in liquidi biologici, e reattivo per la sua attuazione
DE3248145A1 (de) * 1982-12-27 1984-06-28 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und reagenz zur bestimmung von n-carbamoylsarcosin und hierfuer geeignetes neues enzym

Also Published As

Publication number Publication date
EP0154269A3 (en) 1987-04-22
DE3406770A1 (de) 1985-08-29
FI850732A0 (fi) 1985-02-22
EP0154269A2 (de) 1985-09-11
ES8602114A1 (es) 1985-12-01
CS121685A3 (en) 1992-06-17
US4816393A (en) 1989-03-28
DE3576358D1 (de) 1990-04-12
EP0154269B1 (de) 1990-03-07
IE58353B1 (en) 1993-09-08
HUT37456A (en) 1985-12-28
JPH0373276B2 (cs) 1991-11-21
HU194303B (en) 1988-01-28
AU555270B2 (en) 1986-09-18
DK77185D0 (da) 1985-02-20
CA1261288A (en) 1989-09-26
IE850331L (en) 1985-08-24
ES540654A0 (es) 1985-12-01
DD241919A5 (de) 1987-01-07
FI82071C (fi) 1991-01-10
FI82071B (fi) 1990-09-28
JPS60203190A (ja) 1985-10-14
ZA851352B (en) 1985-10-30
ATE50789T1 (de) 1990-03-15
AU3895485A (en) 1985-08-29
DK77185A (da) 1985-08-25
FI850732L (fi) 1985-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lamprecht et al. Creatine phosphate
US4806415A (en) Method and system for determining the presence of adenosine triphosphate or flavin mononucleotide
EP0116307A2 (en) Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase
EP0135092A2 (en) Method for determination of ammonia
CZ277729B6 (en) Method of creatinine determination
US5780256A (en) Method and composition for quantitative determination of ammonia, α-amino acid, or α-keto acid
EP0016845B1 (en) Method and test composition for the determination of a substrate for xanthine-oxidase, including a novel xanthine-oxidase and method for the preparation thereof
US5916761A (en) Method for assaying vital sample
JPH0234599B2 (cs)
EP0089210B1 (en) Reagent for assaying cholinsterase
KR880012754A (ko) 신규의 모노글리세라이드 리파제와 그 제조방법 및 이것을 이용한 분석방법
Grassl d-Alanine
US4956276A (en) Analytical method of determining a reduced co-enzyme
JPH09285297A (ja) 生体試料の測定法
Ghetta et al. Polynucleotide phosphorylase-based photometric assay for inorganic phosphate
JPS6236199A (ja) カルシウムイオンの定量法
JP2001252095A (ja) 微量成分の測定法及びそれに用いる組成物
US4349625A (en) Method for assaying fatty acids
JPH10225300A (ja) グルコースまたはadpの高感度測定法
JPH0422560B2 (cs)
JPH04252200A (ja) Nadhキナーゼを用いる高感度定量法
Haarasilta et al. Pyruvate holo-and apocarboxylase content of biotin-deficient baker's yeast and the characteristics of the holoenzyme formation in permeabilized cells
JP2678155B2 (ja) 新規なnad合成酵素を用いた測定法
JPH04126099A (ja) ミオイノシトールの高感度定量法および定量用組成物
Grassl et al. Nicotinamide Mononucleotide

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20020220