CZ277729B6

CZ277729B6 - Method of creatinine determination

Info

Publication number: CZ277729B6
Application number: CS851216A
Authority: CZ
Inventors: Joachim Rndr Siedel; Rolf Rndr Deeg; Albert Rndr Roder; Joachim Rndr Ziegenhorn; Hans Mollering; Helmgard Gauhl
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1984-02-24
Filing date: 1985-02-20
Publication date: 1993-04-14
Also published as: FI850732A0; HUT37456A; FI82071C; FI850732L; AU3895485A; DE3406770A1; US4816393A; CS121685A3; ZA851352B; HU194303B; JPS60203190A; ES540654A0; JPH0373276B2; DD241919A5; ES8602114A1; AU555270B2; DK77185D0; ATE50789T1; IE850331L; DK77185A

Description

Oblast vynálezu

Vynález se týká způsobu stanovení kreatininu převedením na 1-methylhydantoin s následnou hydrolýzou, načež se stanoví vzniklé produkty.

Dosavadní stav techniky

V analytické chemii, zejména v klinicko-chemické diagnostice, je stále větší potřeba diagnostických postupů pro stanovení produktů biologické výměny látek a dalších odvozených sloučenin. Příčinou je výjimečně vysoká specifičnost reakcí, které jsou katalyzovány enzymatickými látkami a jejich rychlý, přesně definovaný a bezztrátový průběh za mírných reakčních podmínek, obvykle při teplotě 15 až 40 °C ve vodném prostředí při neutrálním pH a také možnost stanovit tyto látky jednoduchým a citlivým způsobem, zejména pomocí fotometrických měřicích metod buď přímo, nebo pomocí dalších indikátorů, a to vždy kvantitativně.

V případě enzymatického stanovení kreatininu v séru nebo v moči je známo několik postupů, které byly popsány například v publikacích: Wahlefeld A. W., G. Bolz a H. U. Bergmayer, v H. U. Bergmeyer: Methoden der enzymatischen Analyse, 3. vydání, sv. II, Verlag Chemie, Weinheim 1974, str. 1834 - 1838; Fossati P., L. Prencipe a G. Berti, Clinical Chemistry (1983), 29, 1494 - 1496; Tangenelli, E. L. Prenzipe, D. Bassi, S. Cambiaghi a F. Muxador, Clinical Chemistry (1983), 28, 1461 - 1464, tyto postupy však mají tu společnou nevýhodu, že reakce probíhá buď přes kreatin (Wahlefeld a další, Fossati a další), nebo přes amoniak (Tangenelli a další), jako meziprodukty. Jde o látky, které jsou v určitých koncentracích přítomny v téměř každém analyzovaném séru nebo ve vzorku moči. K měření množství kreatinu je tedy nutno užít dvou odlišných nebo za sebou prováděných reakčních směsí, v nichž se nejprve stanoví volný kreatin nebo amoniak a ve druhém stupni po přidání kreatininamidohydrolázy (E.C. 3.5.2.10) nebo kreatininiminohydrolázy (= kreatinindeiminázy) se pak zjišťuje další kreatin, který vzniká z kreatininu nebo další amoniak (postup zkouška/slepá zkouška nebo E-j_/E₂). Takové postupy jsou velice náročné časově vzhledem k ručnímu provedení a při jejich provádění je možno užít automatizované analytické systémy jen omezeně, zejména v případě, že k úplnému průběhu reakce je zapotřebí delší inkubační doba. V zásadě je při vhodné volbě reakčních podmínek možno provést stanovení kreatininu známými enzymatickými metodami způsobem v tzv. fixovaném čase. Vyžaduje to však velmi přesné dodržování času, v němž se měření provádí za definovaných teplotních podmínek, což je zatím možno provést pouze v analytických automatech a vylučuje to ruční provádění měření.

Na rozdíl od kreatinu nebo amoniaku není 1-methylhydantoin (N-methylhydantoin, NMR) přírodní složkou séra nebo moči. Stanovení kreatininu přes 1-methylhydantoin jako meziprodukt by tedy mělo tu podstatnou výhodu, že nebude zapotřebí provádět slepou zkoušku a mimoto může být enzymatická reakce prováděna sama jako indikátorová reakce, nebo je možno za tuto reakci zařadit indikátorovou reakci, protože běží o látku, která se ani v séru ani v moči nenachází za běžných podmínek v signifikantních koncentracích.

V literatuře již byly popsány různé způsoby pro enzymatickou hydrolýzu hydantoinů působením Hydantoináz (hydropyrimidin-hydroláza, E. C. 3.5.2.2) z‘různých zdrojů, avšak účinek, tohoto enzymu bylo možno prokázat jen v případě nesubstituovaného hydantoinů, například podle publikace Wallach D. ,P. a S. Grisolia, J. Biol. Chem. (1957), 226, 277 - 288), popřípadě v případě hydantoinů, substituovaných v poloze 5 (DAS 26 31 048, DAS 28 11 303), Olivieri R. , E. Fascetti, L. Angelini a L. Degen, Biotechnology and Bioengineering (1981), 23, 2173 - 2183). Mimoto není pro žádný z uvedených enzymů možno prokázat závislost na kofaktoru. Enzym, popsaný v publikaci Wallacha a dalších, nepotřebuje pro hydrolýzu hydantoinů také žádnou přísadu vícevazných kovových iontů, v práci Olivieriho a dalších se dokonce popisuje inhibice hydantoin-hydrolýzy za přítomnosti chloridu amonného v koncentraci 0,1 mol/litr, kdežto účinnost enzymu, užívaného k provádění způsobu podle vynálezu, je možno přidáním amonných solí dokonce podstatně zvýšit.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je způsob stanovení kreatininu, tím, že se kreatinin převede působením kreatinindeiminázy E.C. 3.5.4.21 na 1-methylhydantoin s následnou hydrolýzou této látky působením 1-methylhydantoinázy za přítomnosti adenosintrifosfátu nebo guanosintrifosfátu a iontů hořčíku nebo manganu, načež se stanoví

a) produkt hydrolýzy 1-methylhydantoinu působením N-karbamoylsarkosinamindohydrolázy za vzniku sarkosinu a stanovením sarkosinu pomocí sarkosinoxydázy nebo sarkos indehydrogená zy, nebo

b) současně vznikající nukleosiddifosfát adenosintrifosfátu nebo guanosintrifosfátu, přičemž se stanovení provádí ve vodném roztoku s obsahem pufru při hodnotě pH v rozmezí 7,0 až 9,0 při koncentraci pufru v rozmezí 10 až 500 mmol/litr, za přítomnosti 0,1 až 100 mmol/litr amonné soli.

S výhodou se hořečnaté ionty užijí ve formě chloridu hořečnatého, síranu hořečnatého nebo asparganu hořečnatého.

S výhodou se přidá 0,1 až 50 mmol/litr dvojsytného kovového iontu, a 0,01 až 10 jednotek/ml 1-methylhydantoinázy a užije se 0,1 až 20 jednotek/ml N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy a 1 až 20 jednotek/ml sarkosinoxidázy nebo sarkosindehydrogenázy.

Nový enzym 1-methylhydantoináza se nachází v některých mikroorganismech. Jde zejména o mikroorganismy čeledi Brevibacterium, Moraxella, Micrococcus a Arthrobacter. Příklady některých kmenů těchto čeledí, v nichž je možno prokázat množství enzymů, které stojí za zpracování, jsou například Arthrobacter spec. DSM 2563, DSM 2564, Moraxella spec. DSM 2562, Micrococcus spec. DSM 2565 nebo Brevibacterium spec. DSM 2843.

Enzym, který se používá při provádění způsobu podle vynálezu, se získá s výhodou tak, že se pěstuje některý ze svrchu uvedených mikroorganismů a enzym se izoluje z biomasy a/nebo živného prostředí.

Byly stanoveny následující vlastnosti nového enzymu:

1. Molekulová hmotnost

a) 125 000 při zjištění elektroforézou na SDS-gelovém gradientu

2. Optimální pH je 7,8

Účinnost v % při 25 *C:

pH:	6,5	7,0	7,5	8,0	8,5	9,0
TES-pufr	5	76	100	100	95	69
150-mmol/1
TRIS-pufr	1	26	60	52	38	19

150 mmol/1

3. Specifičnost:

relativní účinnost v % (ve srovnání s ADP/pyruvátkináza/laktát-dehydrogenáza)

Substrát (vždy 0,1 mmol/litr konečné koncentrace v reakční směsi)

Při stanovení specifičnosti substrátu se užijí následující činidla:

1. Základní reakční činidlo:

složka koncentrace

fosforečnan draselný (pH 8,0)	75 mmol/litr
NADH	0,25 mmol/litr
ATP	1,30 mmol/litr
fosfoenolpyrohroznan	0,42 mmol/litr
chlorid hořečnatý	2,00 mmol/litr
pyrohroznan-kináza	4 j/ml
laktát-dehydrogenáza	10 j/ml

2. 1-methylhydantoináza (15 jednotek/ml v 50% glycerolu, 20 mmol/litr tris . HCl-pufru o pH 8,0

3. Roztoky hydantoinu

Koncentrace hydantoinů (1-methylhydantoinů, hydantoinu, 5-methylhydantoinu nebo 5,5-dimethylhydantoinu) byla vždy 0,6 mmol/litr vody

4. Provedení pokusu

Vlnová délka 365 nm, teplota 25 °C, objem zkoumaného roztoku 1,21 ml, d = 1 cm.

Do kyvety se napipetuje:

vzorek slepá zkouška

základní reakční
činidlo (1)	1,00	ml	1,00	ml
vzorek (3)	0,20	ml	-
voda	0		0,20	ml
směs se promísí a pak se	přidá:
1-methylhydantoináza ( 2)	0,01	ml	0,01	ml

Stanoví se Δε vzorku ( Δ Ep) a tatáž hodnota pro reakční směs ( Δ E^) · která je slepou zkouškou. Měření se provádí 2 minuty po přidání 1-methylhydantoinázy, výsledek se vypočítá z rovnice

Δ E = Δ Ep - Δ e_rl

5. Vypočítání relativní reakční rychlosti z hodnot E/min pro různé hydantoiny. ve srovnání s toutéž hodnotou pro 1-methylhydantoin, jehož hodnota se považuje za 100 %. Byly získány následující výsledky:

1-methylhydantoin

100 % %

5-methylhydantoin hydantoin

HN ch₂

5,5-dimethylhydantoin

O

^CH3 ch₃

Nukleotidy

Relativní účinnost v % (ATP = 100) při stanovení přes karbamoylsarkosinamidohydrolázu + sarkosinoxydázu:

nukleotid (4 mmol/litr) %

ATP	100
ADP	1
AMP	0
GTP	7
CTP	1,5
TTP	0
UTP	0
ppi	0
Carb-fosfát	0
Na-tripolyfosfát	0
Na-hexametafosfát	0

4. Závislost na kovových iontech

Relativní účinnost v % mmol/litr	(5 mmol/litr chloridu hořečnatého = 100)
sloučenina	%
0	MgCl₂	17
-1	MgCl₂	83
5	MgCl₂	100
10	MgCl₂	98
5	MnCl₂	60
5	ZnCl₂	24
5. Aktivátory
Vyjádřeným aktivátorem	je skupina NH₄ ⁺. Relativní	účinnost v %
(30 mmol/litr AS = 100)
aktivační sloučenina	mmol/litr '	%
žádná	0	44
(nh₄)₂so₄	30	100
(nh₄)₂so₄	10	95
nh₄ci	30	91
NH₄-acetát	30	98
Li2 SO 4	30	40
Nh 2 SO	30	³⁹
K₂s°₄	30	59
NaCl	³⁰	41
NaHC0₃	30	40
6. Inhibitory
Vyjádřeným inhibitorem	je EDTA a NaF
NAF: 1 x 10^-2 mol/litr	způsobí 100% inhibici
EDTA-inhibice: *	mmol/1 relativní	aktivita v %
	0 100
	5 100
	10 42
	50 2
* v přítomnosti 7,5 mM	iontů Mg⁺⁺ v reakční směsi

7. Michaelisova konstanta

Ι^ΑΤΡ (TES 0,15 mol/litr při pH 7,8 přes Sarcosin):

0,8 mmol/litr K_m 1-methylhydantoin (0,15 mol/litr TES při pH 7,8 přes ADP): 0,02 mmol/litr

8. Stabilita:

a) Stabilita při různé teplotě v 50% glycerolu:

mmol/litr tris-pufru o pH 8,0 (2 jednotky/ml):

30 min	zbytková účinnost v
25 °C	100
50 °C	94
60 °C	70
70 °C	0

b) Stálost.při různém pH % glycerolu, 10 mmol/litr tris-pufru, 0,2 jednotky/ml, +4 C, 3 dny potmě (výchozí hodnota je 100 %) pH zbytková účinnost v %

6,3	8
6,5	²⁰
7,0	61
8,0	72
9,0	86

Enzym, který se užívá k provádění způsobu podle vynálezu, je možno získat z mikroorganismů, které obsahují dostatečné množství 1-methylhydantoinázy, a to způsobem, známým pro čištění enzymů. Účelně se postupuje tak, že se buňky mikroorganismu rozruší a enzym se vysráží přidáním polyethyleniminu. Tímto způsobem se získá enzymatický přípravek, který je možno přímo použít k analytickým účelům. V případě, že je zapotřebí dalšího čištění, provádí se s výhodou frakcionace síranem amonným, zahřátím nebo chromatografií.

Rozrušení mikroorganismů je možno provést známým chemickým nebo fyzikálním způsobem, například chemicky působením lysozymu nebo fyzikálně působením ultrazvuku, vysokým tlakem apod. Způsob není rozhodující. Výhodné jsou však ty způsoby, které rozrušují buněčnou membránu.

Pak se směs zahřívá s výhodou na 50 °C při pH, v němž má enzym dostatečnou stálost.

V případě chromatografického čistění je vhodné užít zejména fenylseparózu a aniontoměniče, které obsahují skupiny DEAE a jsou slabě alkalické. Při výhodném provádění tohoto čisticího prostředku se působí lysozymem ve 25% glycerolu, srážení se provádí polyethyleniminem, získá se sraženina, která se podrobí frakcionaci síranem amonným, načež se směs zahřívá na 50 °C při pH 8, pak se provádí chromatografie na fenylseparóze a pak na •p prostředku DEAE-Sephacel , nacez se užije frakcionace molekulárním sítem, s výhodou se užije Sephacryl^R S 20Ó. Tímto způsobem je možno získat čistý enzymatický přípravek se specifickou účinností 2,1 jednotky/mg bílkoviny, tento přípravek je možno užít ke stanovení vlastností enzymu.

Mikroorganismy, užité pro získání enzymu, se pěstují s výhodou na živném prostředí, které obsahuje jako zdroj uhlíku a dusíku kromě vitaminů a stopových prvků ještě 1-methylhydantoin.

Předmětem vynálezu je také použití 1-methylhydantoinázy ke stanovení methylhydantoinu ve vodném roztoku s obsahem pufru tak, že se kreatin převede kreatinindeiminázou E.C. 3.5.4.21 na 1-methylhydantoin, který se pak podrobí hydrolýze působením 1-methylhydantoinázy, s výhodou za přítomnosti nukleosid-trifosfátu a vícesytného kovového iontu, načež se stanoví

a) produkt hydrolýzy 1-methylhydantoinu působením N-karbamoylsarkoxinamidohydrolázy za vzniku sarkosinu s následným stanovením sarkosinu se sarkosinoxidázou nebo sarkosindehydrolázou, nebo

b) současně se tvořící nukleosiddifosfát.’

Vznikající produkt hydrolýzy se chová vzhledem k rychlosti reakce a výšce měřicího signálu při následné indikátorové reakci s N-karbamoylsarkosinamidohydrolázou v podstatě stejně, jako při reakci s 1-methylhydantoinem a N-karbamoylsarkosinem v ekvimolárním množství, jak je zřejmé z obr. 2 a 3.

Vodný roztok s obsahem pufru má pH s výhodou v rozmezí 7,0 až 9,0, zvláště v rozmezí 7,3 až 8,5 a zejména v rozmezí 7,5 a 8,2. K úpravě pH je možno užít látky, které mají dostatečnou kapacitu pufru v uvedeném rozmezí, jako jsou například fosfáty, tris-pufr, triethanolamin nebo TES. Nejvýhodnější je zejména TES-pufr. Koncentrace tohoto pufru se obvykle pohybuje v rozmezí 10 až 500 mmol/litr, s výhodou 50 až 200 ml/litr, zvláště v rozmezí 75 až 125 mmol/litr.

Z nukleosidtrifosfátů padá v úvahu zejména ATP nebo GTP, zvláště ATP. Koncentrační rozmezí se pohybuje obvykle mezi 0,05 až 50 mmol/litr, s výhodou 0,5 až 20 mmol/litr, zvláště v rozmezí 1 až 10 mmol/litr.

Z vícesytných kovových iontů se s výhodou užívají dvojsytné kovové ionty, zejména ionty hořečnaté a manganaté, zvláště ionty hořečnaté ve formě svých ve vodě rozpustných solí, například chloridu hořečnatého nebo síranu hořečnatého, nebo také asparaganu horečnatého. Koncentrace kovových iontů se pohybuje obvykle v rozmezí 0,1 až 50 mmol/litr, s výhodou v rozmezí 0,5 až 20 mmol/litr, a zvláště v rozmezí 1 až 10 mmol/litr.

Na. 1 ml reakční směsi se obvykle užije 0,01 až 10 jednotek 1-methylhydantoinázy, zejména 0,05 až 2, zvláště 0,1 až 1 j ednotka.

Aby bylo možno zvýšit účinnost 1-methylhydantoinázy, přidávají se ještě amonné soli. Koncentrace těchto solí se obvykle pohybuje v rozmezí 0,1 až 100 mmol/litr, s výhodou 1 až 30 mmol/litr, zvláště 5 až 10 mmol/litr.

Kreatininiminohydroláza se s výhodou použije v rozmezí 0,1 až 20 jednotek/ml, zvláště 0,05, až 15 jednotek/ml, zejména 1 až 10 jednotek/ml, zejména 1 až 10 jednotek/ml.

V případě N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy je možno použít běžně 0,1 až 20 jednotek/ml, s výhodou 0,5 až 10 jednotek/ml, zvláště 1 až 5 jednotek/ml. Jinak jsou údaje obdobné jako v DE-A-3248145.

V případě sarkosinoxydázy se obvykle užívá přibližně 1 až 2 jednotek/ml, s výhodou 2 až 10 jednotek/ml, zvláště 4 až 8 jednotek/ml. Totéž platí pro sarkosindehydrogenázu, kterou je k uvedenému účelu rovněž možno použít.

Stanovení sarkosinu sarkosin-oxidázou nebo sarkosindehydrogenázou je známé a může je provést každý odborník. Totéž platí pro stanovení vzniklého nukleosiddifosfátu, tj. ADP nebo GDP. Také v tomto případě se užívá známých postupů a také známých reakčních činidel.

Ke stanovení vzniklého sarkosinu je nejvýhodnější známá reakce se sarkosinoxidázou. Průběh oxidace sarkosinem je možno sledovat bud elektrofonicky spotřebou molekulárního kyslíku nebo tvorbou peroxidu vodíku v reakčním prostředí, nebo s výhodou enzymaticky na základě tvorby peroxidu vodíku a formaldehydu. Zvláště výhodné je stanovení peroxidu vodíku fotometricky, zvláště ve formě barevné reakce, katalyzované peroxidázou oxidativní vazbou kyseliny 2,4,6-tribrom-3-hydroxybenzoové na 4-aminoantipyrin. Účinnost peroxidázy má být 0,05 až 20 jednotek/ml, s výhodou 0,2 až 10 jednotek/ml, zejména 0,5 až 5 jednotek/ml. Kyselina tribromhydroxybenzoová se užije v koncentraci 1 až 25 mmol/litr, s výhodou 2 až 20 mmol/litr, zvláště 5 až 10 mmol/litr. Pro. 4-aminoantipyrin se užijí koncentrace 0,1 až 2 mmol/litr, s výhodou 0,2 až 1,5 mmol/litr, zvláště 0,5 až 1 mmol/litr. Je však také možno užít ostatní známé systémy pro stanovení peroxidu vodíku nebo pro stanovení formaldehydu.

Protože 1-methylhydantoináza převádí nukleosidtrifosfát stechiometricky na nukleosiddifosfát, je možno provádět stanovení kreatininu místo stanovení reakčního produktu po působení 1-methylhydantoinu také stanovením současně vznikajícího nukleosiddifosfátu, zejména ADP. Vhodná stanovení ADP jsou známá a popsaná například v publikaci H. U. Bergmeyer Methoden der enzymatischen Analyse, 3. vydání, 1974, str. 2128 ff a 2178 ff. Podobný popis proto nebude v průběhu přihlášky uváděn.

Reakční činidlo ke stanovení kreatininu s výhodou obsahuje kreatlnindeiminázu, 1-methylhydantoinázu, dále ATP nebo GTP, dvojsytný kovový ion, N-karbamoylsarkosinamidohydrolázu, sarkosinoxidázu nebo sarkosindehydrogenázu a pufr pro rozmezí 7,0 až 9,0.

Reakční činidlo s výhodou obsahuje ještě systém pro stanovení peroxidu vodíku nebo formaldehydu nebo systém příjemce elektronů, který může poskytovat zabarvení, například tetrazoliniovou sůl, aby bylo možno přímo pozorovat reakci se sarkosindehydrogenázou. Tyto systémy jsou známé, například z publikace H. U. Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie, Weinheim.

Kromě svrchu uvedených složek může reakční směs obsahovat ještě pomocné látky, například konzervační prostředky, jako azid sodíku, smáčedla a lipázy k vyčeření vzorků, zakalených přítomností triglyceridů, nebo také ferrokyanid draselný a askorbát-oxidázu k odstranění narušeného stanovení peroxidu vodíku působením bilirubinu nebo kyseliny askorbové. Při použití této reakční směsi ke stanovení 1-methylhydantoinu samotného je možno vynechat kreatininiminohydrolázu.

Reakční činidlo obsahuje jako dvojsytné kovové ionty s výhodou ionty hořečnaté nebo manganaté, jak již bylo uvedeno.

Svrchu uvedené reakční složky je možno užít také k impregnaci porézních nosných materiálů a pak provádět kvantitativní nebo kvalitativní stanovení kreatininu nebo 1-methylhydantoinu použitím těchto materiálů, například zkušebních proužků.

V dalším výhodném provedení může reakční činidlo obsahovat kreatinindeiminázu, 1-methylhydantoinázu, ATP nebo GTP, dvojsytné kovové ionty, zejména ionty hořečnaté nebo manganaté, systém pro stanovení ADP nebo GDP a pufr pro rozmezí pH 7,0 až 9,0.

Jako pufr se v tomto případě s výhodou užije fosforečnan draselný. Pro koncentraci pufru, kreatinindeiminázy, 1-methylhydantoinázy, ATP, hořečnatých nebo manganatých iontů a popřípadě amonných solí platí totéž, co bylo uvedeno shora.

Stanovení ADP se s výhodou provádí pomocí reakce mezi kinázou pyrohroznanu a laktát-dehydrogenázou za přítomnosti fosfoenolpyrohroznanu a NADH, přičemž vznikající množství ADP se stanoví fotometric’ y spotřebou NADH reakcí s laktát-dehydrogenázou. Tato stanovení jsou známa a může je provést každý odborník, není proto zapotřebí tyto postupy podrobněji uvádět.

V případě použití reakční směsi pro stanovení 1-methylhydantoinu sámotného je možno vynechat kreatininiminohydrolázu.

Vynález bude popsán následujícími příklady v souvislosti s přiloženými vyobrazeními.

Na obr. 1 je graficky znázorněna závislost extinkce, získané podle příkladu 5, na množství použitého 1-methylhydantoinu, na obr. 2 je znázorněno provedení z obr. 1 při použití N-karbamoylsarkosinu místo 1-methylhydantoinu v příkladu 6, na obr. 3 jsou graficky znázorněny výsledky z příkladu 5 a 6, na obr. 4 je 'znázorněno provedení z obr. 1 pro příklad 7, na obr. 5 je graficky znázorněna stechiometrická tvorba ADP, na obr. 6 je znázorněno provedení z obr. 1 pro příklad 8.

Byly užity následující zkratky a následující synonyma:

AS:	síran amonný
Carb-fosfát:	karbamyl-fosfát
CSHáza:	N-karbamoylsarkosin-amidohydroláza
kreatinindeimináza:	kreatinin-iminohydroláza

1-methylhydantoináza, NMHáza: 1-methylhydantoinhydroláza

N-methylhydantoin, NMH: 1-methylhydantoin

OD:	optická hustota
PABS:	kyselina p-aminobenzoová
ΡΡ_±: TES:	pyrofosfát kyselina 2-{[tris-(hydřoxymethyl)- -methyl]}aminoethansulfonová
TRIS:	tris(hydroxymethyl)aminomethan.

Příklad 1

A) Pěstování výchozího kmene

K pěstování se užije Arthrobacter species DSM 2563 (izolovaný z orné půdy), který se přeočkovává 3 týdny na šikmý agar, který má na 1 litr následující složení:

g hydrofosforečnanu sodného Na₂HPO₄ . 2H₂O g dihydrofosforečnanu draselného KH₂PO₄

0,5 g chloridu sodného

0,5 g síranu hořečnatého MgSO₄ . 7H₂O g N-methylhydantoinu (NMH) ml roztoku stopových prvků 1*

0,1 ml roztoku stopových prvků 2** ml vitaminového roztoku *** g agaru, pH 7,5 * Roztok stopových prvků 1

Ve 100 ml destilované vody se rozpustí 100 mg chloridu manganatého MnCl₂ . 4H₂O, 100 mg chloridu železitého

FeCl₃ . 6H₂O, 100 mg chloridu vápenatého CaCl₂ . 2H₂O a výsledný roztok se sterilizuje. Přidává se 1 ml tohoto roztoku na 1 litr živného prostředí.

«J· tfe¹'' > o

Roztok stopových prvku 2

V 1000 ml destilované vody se rozpustí 1 mg chloridu mědnatého CuCl₂ . 2H₂O, 1 mg chloridu zinečnatého ZnCl₂, 1 mg molybdenanu amonného (NH₄)₂Mo0₄, 1 mg chloridu kobaltnatého CoCl₂ . 6H₂O a výsledný roztok se sterilizuje. Přidává se 0,1 ml tohoto roztoku na 1 litr živného prostředí.

Vitaminový roztok

Ve 100 ml destilované vody se rozpustí 0,1 mg biotinu, 0,1 mg pyridoxolu, 0,1 mg pyridoxaminhydrochloridu, 0,1 mg PABS, 1,0 mg riboflavinu, 1,0 mg nikotinamidu, 1,0 mg kyseliny listové a 10,0 mg thiaminhydrochloridu a výsledný roztok se sterilizuje filtrací. Přidává se 1 ml tohoto roztoku na 1 litr živného prostředí.

ml kapalného, svrchu uvedeného prostředí se naočkuje plnou kličkou materiálu z šikmého agaru a kultura se protřepává 20 až 24 hodin při teplotě 28 °C v Erlenmeyerové baňce o objemu 100 ml. Pak se 10 ml této předběžné kultury přenese do 1000 ml stejného prostředí a dále se pěstuje 24 hódin při teplotě 28 °C až do přírůstku 200 ml/litr živného prostředí v Erlenmeyerové baňce (OD 1:20 = 0,425). Tato druhá předběžná kultura se přidává v množství 1 % do fermentoru s obsahem téhož prostředí o objemu 100 litrů a mikroorganismus se pěstuje 18 hodin při teplotě 28 °C.

Maximální tvorba enzymu se obvykle projevuje na konci růstu, tj. v pozdní log.-fázi. Ze shora uvedeného množství se získá 1180 g vlhké hmoty s obsahem 100 jednotek/litr NMHázy (1-methylhydantoinázy) a 160 jednotek/litr CSHázy (N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy).

B) Izolace a čištění enzymu

Z 280 g vlhké hmoty, tj. 20 litrů kultury Arthrobacter se izoluje 500 jednotek NMHázy způsobem, uvedeným v následujícím schématu:

Postup	objem (ml)	j ednotky	j ednotky/mg bílkoviny	výtěžek %
působení lysozymu ve 20% glycerolu	1400	1600	0,06	100
srážení polyethyleniminem.	430	1586	-	99-
frakcionace síranem amonným	120	1181	0,40	73
zahřívání na 50 °C při pH 8	90	934	0,67	58
chromatografie na fenylsepharose, eluát po odpaření	60	830	1,20	52
chromatografie na DEAEsephacelu	8	553	1,40	35
frakcionace molekulárním sítem Sephacryl S200	10	492	2,20	30,7

Údaje pro výsledný přípravek:

22,3 jednotky ml

10,5 mg/ml

2,1 jednotky/mg bílkoviny % glycerolu mmol/litr tris-pufru, pH = 8,3.

Stanovení účinnosti bylo prováděno následujícím způsobem:

1. Barevné reakční činidlo **

Složka

TES.KOH-pufr (pH 7,8)

4-aminoantipyrin

2,4,6-tribrom-3-hydroxybenzoová kyselina chlorid hořečnatý MgCl₂

ATP síran amonný (NH₄)~SO₄

CSHáza sarkosin-oxidáza peroxidáza

2. Roztok 1-methylhydantoinu

3. Vlastní stanovení

Koncentrace

162 mmol/litr

0,81 mmol/litr

8,1 mmol/litr

8.1 mmol/litr

4,3 mmol/litr mmol/litr

1.1 jednotka/ml

6,5 jednotka/ml

2,7 jednotka/ml mmol/1

Užije se vlnové délky 546 nm, teplota 25 ’C, tloušťka vrstvy 1 cm, objem vzorku 2,03 ml, extinkční koeficient vzniklého barviva je 13 οιη²/μιηο1.

Do kyvety se napipetuje:

barevného reakčniho činidla (1) 1,88 ml vzorku 0,05 ml vzorek se promisí, chvíli se čeká tak, aby proběhla reakce mezi sarkosinem, obsaženým ve vzorku, a N-karbamoylsarkosinu, načež se přidá

1-methylhydantoin (2) 0,10 ml směs se promíchá a sleduje se vzestup exstinkce jako Δ E/min lineárním způsobem.

Vzorek: pro stanoveni se užije superatant surového extraktu po rozrušení mikroorganismu ultrazvukem ve 20% glycerolu s obsahem tris . HC1 o pH 8,0 o koncentraci 20 mmol/litr s 0,1 % prostředku triton X-100 po odstředění na ultraodstředivce.

** Pro sledování podle bodu 2 na str. 10, podle odst. 3b na str. 12 a 4,5 a 6 na str. 13 se odpovídajícím způsobem mění koncentrace látky nebo přidávané složky.

4. Výpočet

Λ E/min x 2,03 jednotky/ml vzorku = -------------- (popřípadě po _x oi zředění vzorku)

Poznámka: Δ. E/min nemá být nikdy vyšší než 0,06, jinak je jinak je zapotřebí zředit vzorek. Fáze Lag trvá -přibližně 5 minut.

Příklad 2

Moraxella spec. DSM 2562, izolovaná ze vzorku podestýlky ve stáji skotu, se udržuje na šikmém agaru způsobem podle příkladu 1 a pak se pěstuje ve stejném prostředí jako species Arthrobacter.

Předběžná kultura ml prostředí NMH se uloží do 100 ml Erlenmeyerovy baňky, obsah baňky se naočkuje ze šikmého agaru a protřepává se 21 hodin při 28 ’C (OD 1:20 = 0,430).

Produkční kultura ml předběžné kultury se přenese do 400 ml prostředí NMH v Erlenmeyerově baňce o obsahu 2 litry a mikroorganismus se pěstuje 43 hodin při teplotě 28 °C za protřepávání. Pak se biologická hmota rozruší ultrazvukem a naměří se následující účinnost enzymu:

Hodiny kultivace	OD 1:20	NMHáza jednotky/litr
24	0,415	41
28	0,495	72
39	0,730	57

Příklad 3

Brevibacterium species, DSM 2843, vzorek izolovaný ze stáje, odlišné od příkladu 2, se kultivuje stejným způsobem jako Moraxella v příkladu 2.

Předběžná kultura

Kultura se pěstuje 21 hodin při teplotě 28 ’C, OD 1:20 = 0,690.

Produkční kultura

Hodiny kultivace	OD 1:20	NMHáza j ednotky/litr
15	0,440	26
24	0,550	80
39	0,670	59
43	0,750	46

Příklad 4

Mikrococcus spec. DSM 2565, izolovaný ze vzorku půdy, se pěstuje stejným způsobem jako Moraxella v příkladu 2.

Předběžná kultura: Kultura se pěstuje 21 hodin při teplotě 28 °C, OD 1:20 = 0,620.
Produkční kultura Hodiny kultivace	OD 1:20	NMHáza jednotky/litr
24	0,690	53
27,5	0,800	83

Příklad 5

1. Enzymatický test s použitím barviva pro stanovení 1-methylhydantoinu (systém obsahuje 1-methylhydantoinázu/N-karbamoylsarkocinamidohydrolázu/sarkosinoxidázu, reakce se provádí se směsí peroxidázy, 4-aminoantipyrinu, kyseliny 2,4,6-tribrom-5-hydroxybenzoové a barevného indikátoru).

1.1 Reakční činidlo:

Složení reakčního činidla je uvedeno v následující tabulce:

Složka

Koncentrace

TES.KOH (pH 7,8)

MgCl₂

ATP

NH₄C1

4-aminoantipyrin kyselina 2,4,6-tribrom-3-hydroxybenzoová 1-methylhydantoináza N-karbamoylsarkosin-amidohydroláza sarkosin-oxidáza peroxidáza

100 mmol/litr mmol/litr mmol/litr mmol/litr

0,5 mmol/litr mmol/litr

0,15 jednotka/ml j ednotky/ml jednotek/ml jednotky/ml

1.2 Vlastni stanovení

Vlnová délka: 546 nm

Tloušťka vrstvy: 10 mm

Teplota: 25 °C

Měření se vždy provádí proti slepé zkoušce, která obsahuje pouze reakční činidlo.

Postup při měření je uveden v následujícím schématu:

Do kyvety se napipetuje:

hodnota pro hodnota pro slepou vzorek (P) zkoušku (RL) - , reakční činidlo podle odst. 1.1 2,00 ml 2,00 ml vzorek 0,10 ml voda - 0,10 ml

Složky se promísí, inkubují se 10 minut a pak se měří extinkce P proti RL, čímž se získá Δε.

vodné roztoky 1-methylhydantoinu o koncentraci 87,7 až 1754 pmol/litr.

Závislost Δε na okamžité koncentraci 1-methylhydantoinu ve vzorku je graficky znázorněna na obr. 1.

Příklad 6.

Stanovení N-karbamoylsarkosinu pomocí reakčního činidla 1.1 z příkladu 5.

Stanovení se provádí podle odstavce 1.2 z příkladu 5 pouze s tím rozdílem, že se místo vodných roztoků 1-methylhydantoinu užijí odpovídající vzorky s ekvimolární koncentrací (87,7 až 1754 ^mol/litr) N-karbamoylsarkosinu.

Závislost naměřené extinkční hodnoty má koncentraci N-karbamoylsarkosinu je graficky znázorněna na obr. 2.

Při srovnání hodnot, získaných pro extinkci v příkladu 5 a v příkladu 6 je možno pozorovat, že při použití vzorků s obsahem 1-methylhydantoinu a N-karbamoylsarkosinu v ekvimolární koncentraci se naměří totožné hodnoty barevného signálu, jak je zřejmé z obr. 3.

Příklad 7

Enzymatická zkouška v ultrafialovém světle pro stanovení 1-methylhydantoinu (směs obsahuje 1-methylhydahtoinázy, pyruvát-kinázu, laktát-dehydrogenázu).

7.1 Reakční činidlo

7.1.1 Reakční činidlo I:

Složka

Koncentrace

fosforečnan draselný (pH 8,0)	75	mmol/litr
NADH	0,25	mmol/litr
ATP	1,30	mmol/litr
fosfoenolpyrohroznan	0,42	mmol/litr
MgCl₂	2,00	mmol/litr
pyruvát-kináza	4 j ednotky/ml

laktátdehydrogenáza jednotek/ml

7.1.2 1-Methylhydantoináza (15 jednotek/ml v 50% glycerolu o pH 8,0)

v.

7.2. Vlastní provedení

Vlnová délka: 365 nm

Tloušťka vrstvy: 10 mm

Teplota: 25 °C

Měření proti slepé zkoušce, která obsahuje pouze reakční činidlo

Do kyvety se napipetuje:

vzorek (P) slepá zkouška (RL) reakční činidlo I 1,00 ml vzorek 0,20 ml voda

1,00 ml

0,20 ml minuty se směs inkubuje, načež se měří výchozí extinkce vzorků (Ej ) a slepé zkoušky RL (E_{1 RL}).

Pak se přidá:

NMHáza

0,01 ml

Po dalších 5 až 10 minutách se měří extinkce P (^e2,Rl)·

E - (E_lřp - Ε_2χρ) “ (^e1,RL “ ^R2,RL^ ‘ vodné roztoky 1-methylhydantomu o koncentraci 87,7 az 877 μπιοΐ/litr k-k-k ) _ . .

> Poznámka:

V případě, že vzorek s obsahem 1-methylhydantoinázy obsahuje ještě určité množství ATPázy nebo NADH-oxidázy, což se ukáže při slepé zkoušce, a po přidání roztoku 1-methylhydantoinázy, je zapotřebí odečítat hodnoty E_{2 p}a E? _RL vždy ve stejných časových odstupech po přidáni' NMHaáy, například vždy po 6 minutách.

Závislost mezi naměřeným rozdílem v extinkci ( Δε) a okamžitou koncentrací 1-methylhydantoinu ve vzorku je znázorněna na obr. 4. Z výpočtu množství ADP, vznikajícího při hydrolýze 1-methylhydantoinu přes molární extinkční koeficient NADH při 365 nm je zřejmá stechiometrie celé reakce, spočívající ve spotřebě ATP za současného vzniku ADP a při současné hydrolýze 1-methylhydantoinu v poměru 1 : 1, jak je zřejmé z obr. 5.

Příklad 8

Enzymatická barevná zkouška ke stanovení kreatininu

8.1 Reakční činidlo:

Užije se reakční činidlo z odstavce 1.1 z příkladu 5 s přísadou kreatinin-iminohydrolázy v konečné koncentraci 2 j ednotky/ml.

8.2 Vlastní stanovení:

Stanovení se provádí podle odstavce 1.2 z příkladu 5, avšak jako vzorky se užijí vodné roztoky kreatininu o koncentraci, 87,7 až 1754 μιηοΐ/litr a doba inkubace pro P i RL se prodlouží na 20 minut.

Závislost Δ E na koncentraci kreatininu ve vzorku je graficky znázorněna na obr. 6.

V případě, že se z reakčního činidla 8.1 vynechá kreatininhydroláza, nedojde k žádné barevné reakci, tentýž zjev je možno pozorovat v případě, že se ve vzorku při stanovení podle odst. 8.2 užije místo roztoku kreatininu roztoku kreatinu o koncentraci 884 μτηοΐ/ϋύτ.

Claims

PATENTOVÉ N Á R OKY

1. : Způsob stanovení kreatininu, vyznačující se tím, že se kreatinin převede působením kreatinindeiminázy E.C. 3.5.4.21 na 1-methylhydantoin s následnou hydrolýzou této látky působením 1-methylhydantoinázy za přítomnosti adenosintrifosfátu nebo guanosintrifosfátu a iontů hořčíku nebo manganu, načež se stanoví

a) produkt hydrolýzy 1-methylhydantoinu působením N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy za vzniku sarkosinu a stanovením sarkosinu pomocí sarkosinoxydázy nebo sarkosindehydrogenázy nebo

b) současně vznikající nukleosiddifosfát adenosintrifosfátu nebo guanosintrifosfátu, přičemž se stanovení provádí ve vhodném roztoku s obsahem pufru při hodnotě pH v rozmezí 7,0 až 9,0 při koncentraci pufru v rozmezí 10 až

500 mmol/litr, za‘přítomnosti 0,1 až 100 mmol/litr amonné soli.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se reakce provádí při hodnotě pH v rozmezí 7,3 až 8,5.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se užije koncentrace pufru v rozmezí 50 až 200 mmol/litr.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije 0,05 až 50 mmol/litr adenosintrifosfátu.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se hořečnaté ionty použijí ve formě chloridu hořečnatého, síranu hořečnatého nebo asparganu hořečnatého.
6. Způsob podle nároku 1 nebo 5, vyznačující se tím, že se přidá 0,1 až 50 mmol/litr dvojsytného kovového iontu.
7. Způsob podle nároku 1 až 6, vyznačující se tím, že se přidá 0,01 až 10 jednotek/ml 1-methylhydantoinázy.
8. Způsob podle nároku 1 až 7, vyznačující se tím, že se použije 0,1 až 20 jednotek/ml N-karbamoylsarkosinamidohydrolázy.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že se použije 1 až 20 jednotek/ml sarkosinoxidázy nebo sarkosindehydrogenázy.

6 výkresů

100,00 125,00 150,00 175,00 200,00

Obr. 1

25,00 50,00 75,00 100,00 125,00 150,00 175,00 200,00

50,00 75,00 100,00 125,00 150,00 175,00 200,00

Obr. 5 gd es

Obr. 6

100,00 125,00 150,00 175,00 200,00