JPS61260882A - 安定なβ−ガラクトシダ−ゼ水性組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）　　発明の目的 〈産業上の利用分野〉 本発明は安定なアスペルギルス・オリーゼ起源のβ−ガ
ラクトシダーゼ水性組成物に関するものである。

β−ガラクトシダーゼは乳糖を加水分解してグルコース
とガラクトースを生成する酵素であす、医薬品、あるい
は食品製造工業（二於ける乳糖分解酵素として利用され
ている。

医薬品としては、乳糖不耐症（乳糖分解酵素欠損症）の
治療や乳幼児の下痢症の治療に広く利用されている。

食品製造工業Ｃ：於いては、乳糖除去ミルクの製造やホ
エー（固形分６．３チ、乳糖４．５チ）及びホエー粉（
固形分９４．６％、乳糖７２．３％）その他乳糖を多量
含む廃棄物を加水分解して、グルコース及びガラクトー
スを製造するため（二利用されている。

なお、これらの産業分野で実際Ｃ二利用されているβ−
ガラクトシダーゼは、主として、アスペルギルス・オリ
ーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　、ク
ルイベＯ？イセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ
ｅｓ　１ａ−ｃｔｉｓ　）又はクルイベロマイセス・フ
ラギリス（Ｋ、　ｆｒａｇｉｌｉｓ　）　（二より産生
されている。

これらの酵素は、起源により理化学的性質がかなり相違
するため、それぞれの酵素が最大活性を発揮するような
使用場面を選んで利用されている。

例えば、医薬品（二ついては、経口投与の際。

酸性の胃液中で安定な活性を発揮する必要があるため、
至適−が酸性側にあり、且つ麹菌として古くからの使用
実績（二より安全性の点でも問題の無いアスペルギルス
・オリーゼ産生のβ〜ガラクトシダーゼが利用されてい
る。

〈従来の技術〉 β−ガラクトシダーゼは一般に酵素製剤としての安定性
が乏しく、特（：水溶液の場合は非常（二不安定である
。

例工ば、アスペルギルス・オリーゼ起源のβ−ガラクト
シダーゼを水溶液状態で保存した場合、最大活性は４℃
では数ケ月間維持出来るが。

３７℃では数日間しか維持出来ないことが知られている
。〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第８０巻
、　　　１１９５頁。

１９７６年、〕 そのため、医薬品としては、冷所（１５℃以下）保存を
必要とする固形製剤のみが市販されている。

使用場面の拡大あるいは使用上の簡便さのため液剤医薬
品の開発が要望六れているが、未だ。

市販されるに到っていない。

β−ガラクトシダーゼ水溶液の安定化方法としては、■
大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（＝ついて、水溶液
を凍結保存する際、その溶液Ｃ二糖類、ゼラチン又はグ
リセリンを約０，１〜５−程度添加することＣ二より、
凍結時の酵素の失活を防止する方法。（特開昭５８−８
１７８２号）。

■酵母（クルイペロマイセス・フラギリス）起源のβ−
ガラクトシダーゼ水溶液に１０〜８０チのソルビトール
を添加して、安定な水性組成物を得る方法。（ＵＳＰ　
４４６４４６９）■発酵液よりβ−ガラクトシダーゼを
分離精製する工程Ｃユ於いて、被処理液中（二安定剤と
してＣｏ−Ｍｎ−Ｍｇ”及び含硫アミノ酸の１種以上と
リン酸イオンとを共存させる方法。

（特公昭４９−２０５１５号） などが公知である。

β−ガラクトシダーゼは９個々の酵素を詳細Ｃ二比較す
れば、それらを産生ずる微生物の種類（起源）Ｃ二より
、酵素分子としての理化学的性質に著しい差異のあるこ
とも亦知られている。

第１表は、起源の異なる９種のβ−ガラクトシダーゼに
ついて諸性質の文献値を比較したものであり９分子量は
１０．５〜５４■、　至適聞は３．２〜８．３．至適温
度は４６〜８０　（”Ｃ）　、　Ｋｍ値は０．７２〜９
、８　（ｍＭｌｏＮＰＧ　）とそれぞればらつきの大き
い値を示している。

このように、β−ガラクトシダーゼは起源により性質に
著るしい差異があるため、実際の使用に当ってはその使
用目的に適した理化学的性質のものが選ばれ、その酵素
Ｃ二適した安定他方′　　　　　法が採用されているの
が現状である。

第　　　　１　　　　　表 （β−ガラクトシダーゼの理化学的性質）＊＊ 本生産菌 Ｈ，コ　　　リ　　　−　：　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ｉａ　　ｃｏｌｉ。

Ｋ、フラギリス：　Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒ
ａｇｉｌｉｓ。

Ｓ、プノモニア：　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｒ
＋ｅｕｍｏｎｉａｅ。

Ａ、オリーゼ：　ＡｓｐｅｒｇｉＪｌｕｓ　ｏｒｙｚａ
ｅ。

Ａ、＝　　　ガ　　−　：　　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
　　ｎｉｇｅｒ。

Ｐ、シトリナム：　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｉｔｒ
ｉｎｕｍ。

Ｐ、　マルｆカー１−　：　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ　ｍ
ｕｌｔｉｃｏｌｏｒ。

Ｔ、サーモフィルス　：　　Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｊＪｕｓ。

傘＊文　献 ■　メソッド費イン命エンテモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍ−ｏｌｏｇｙ　）第５巻、２１２
頁、　　１９６２年。

■　アグリカルデ瓢うル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミスト−（Ａｇｒｉｃｕｌ　ｔｕｒａＩ　ａｎｄ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）第３６巻。

５７０−５７７頁、　　１９７２年。

■　バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
）第３巻、１５３５ｊｉ１９６４年。

■　ジャーナル・オプ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉ−ｏｃｈｅｍ　ｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ　
）第７７巻、　　２４１−２４７頁、　１９７５年。

■　メソッド・イン・エンテモロジー第２８巻、　７２
８−７３４頁、　　１９７２年。

■　アグリカルｙ−ユラル・アンド・バイオロジカルケ
ミストリー第４３巻、　　９４３−９５０頁、　　１９
７９年。

■　同上　第４７巻、　　２５３３−２５４０頁、　１
９８３年。

■　特開昭５６−１５４９９１号。

■　カナディアン・ジャーナル・オプ・マイクロバイオ
ロジー（Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍ
ｉｃｒｏｉｏｌｏｇｙ　）第２２巻、　８１７−８２５
頁、　　１９７６年。

〈発明が解決しようとする問題点〉 本発明は安定なアスペルギルス・オリーゼ起源のβ−ガ
ラクトシダーゼ水性組成物を提供すｌ　　ることを目的
とするものである。

現在、医薬品として市販されているβ−ガラクトシダー
ゼは、アスペルギルス・オリーゼ起、　　源の固形製剤
のみである。

β−ガラクトシダーゼの固形製剤は前述のようＣ二冷所
保存が義務付けられており、そのため１：本酵素を生薬
とした医薬品の流通過程ならびに取扱い（＝大きな制約
をうけているのが現状である。

また固形製剤を例えば乳児や幼児（二与えるとき、その
ままでは飲みすらいため、一般（：水や牛乳など（＝溶
解させてから与える場合が多く煩わしいことが問題であ
る。

これらの点に鑑み１例えば室温から高温にかけて安定で
あり、微生物汚染の極めて少なく。

更に飲みやすい液剤の開発が望まれるところである。

本発明者等は上述の事情により２種々の安定剤の使用を
検討し、従来困難視されていた安定なアスペルギルス・
オリーゼ起源のβ−ガラクトシダーゼ水性組成物の創製
に成功し２本発明を完成した。

（２）発明の構成 本発明は［マルチトール、キンリトール及びソルビトー
ルから選ばれる糖アルコールの１種又は２種以上を５０
〜８０％（ＶｊＡＮ）濃度で含有することを特徴とする
安定なアスペルギルス・オリーゼ起源のβ−ガラクトシ
ダーゼ水性組成物」（＝関するものである。

本発明に使用する糖アルコールはいづれも粉体あるいは
水溶液として工業的安価に入手し得るものである。

本発明（：使用するアスペルギルス・オリーゼ起源のβ
−ガラクトシダーゼは、古くからの使用実績（二より、
安全性が確認され副作用等の懸念の全く無いものである
。

糖アルコールの使用濃度は５０〜８０％（へ）が好まし
い。

５０チ未満の場合は、安定効果が劣り、８０％を超える
と、安定性の面では大差無いが糖アルコール溶解度上限
を超えてしまい取扱いにくくなる。

以下実施例によって本発明を更に詳細１＝説明するが２
本発明はこれ（二よって限定されるものではない。

実施例 アスペルギルスβ−ｇａ１．（製造番号９１４１５３　
）６８５、０００　Ｕを１チソルビトール５００ｄで溶
解し。

この溶液をダイアフローホローファイバーシステム（米
国アミコン社製、ＤＣ２型使用、ホローファイバーカー
トリッジとしてＨＩＰ３０−２０タイプ使用）で濃縮と
透析（透析外液として蒸留水使用）を行い、更（二限外
濾過（米国アミコン社製Ｐ　Ｍ　３０　Ｆ’過膜使用）
して酵素液６８３１１７　（１０，０叩Ｕ〜、　９６．
５ｑ蛋白質／ｄ）を得た。ソルビトール３．４５．！ｉ
’、蒸留水０．５１Ｌｔにこの酵素液１．０１１１を加
え溶解して酵素濃度２０２００７Ｍ　、　　ソルビトー
ル濃度７０　％　（％）のβ−ガラクトシダーゼ水性組
成物を得た。

この水性組成物は、乳幼児に与える牛乳（二１回宛約１
ｄ程度添加すること（二より下痢症の治療及び予防効果
を奏するものである。

この場合、従来の固形剤（粉剤、顆粒剤等）に比較して
、牛乳への添加混合が容易であり。

５ｏ〜６０℃に加温した牛乳に添加した場合でも殆んど
失活しない優れた特性を示すものである。

また、この水性組成物は好浸透圧酵母のタルイペロマイ
セス・ルクシー（Ｋ、　ｒｏｕｘｉｉ　）などごく限ら
れた微生物を除き、カビ、細菌、＃母など殆んど総べて
の微生物が生育しないため、衛生面でも安全に使用出来
るものである。

また、所望（二より２食品添加物として許容される香料
１色素２等を適宜添加出来るのは勿論である。

（３）　　発明の効果 本発明により安定なアスペルギルス・オリーゼ起源のβ
−ガラクトシダーゼ水性組成物が提供される。

吹下９本発明の詳細な説明するため試験例を示す。

試験例１．（起源の異なる酵素の安定性比較試験）■　
試験方法 酵素起源（酵素産生微生物）の異なる市販のｌ−ガラク
トシダーゼを２０単位／ｄの濃度になるように５０％（
％）ソルビトール水溶液及び７０チ（％）ソルビトール
水溶液に溶解し、試験管Ｃ二５ｄ宛封入して７０℃の湯
浴中で保温し、２時間経過した時の酵素活性を測定し、
保温前の酵素活性と比較して各供試酵素の活性残存率を
算出した。

なお、酵素１単位（Ｕ）は１分間当り１μｍｏｌの０−
ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下０Ｎ
ＰＧという）を加水分解する酵素量とした。但し、起源
により酵素の理化学的性質が異なるため、酵素活性の測
定は後述するよう（二それぞれの酵素毎に、ｐＨ，温度
及び基質濃度が最適になるような条件で行った。

■　供試酵素 下記４種の起源の異なる市販のβ−ガラクトシダーゼを
供試酵素とした。

１）エセリシア・コリ産生のβ−ガラクトシダーゼ。

（米国シグマ会社製市販品、カタログ番号Ｔ　６００８
番グレード６、以下「大腸菌β−ｇａｌｌという）２）
タルイベロマイセス・ラクチス産生のβ−ガラクトシダ
ーゼ。

（合同酒精会社製市販品、ラクターゼＧＯＤＯ−ＹＮＬ
、以下［酵母β−ｇａ１．ＬＪという）３）クルイベロ
マイセス・フラギリス産生のβ−ガラクトシダーゼ。

（米国シグマ会社製市販品、カタログ番号Ｇ−７０１３
番グレード１２．以下「酵母β−ｇａ１．ＦＪという） ４）アスペルギルス・オリーゼ産生のβ−ガラクトシダ
ーゼ。

（新日本化学工業会社製市販品、スミラクトＬＪ２を下
ｒアスペルギルスβ−ｇａ１．Ｊといつ）■　試験結果 本試験の結果は第２表（二示す通りである。

即ち、ソルビトール５０％及び７０％の水溶液（−溶解
したアスペルギルスβ−ｇａｌは７０℃に２時間保温し
た場合殆んど失活しなかった。これ（二対し、大腸菌β
−ｇａｌ、酵母β−ｇａ１．Ｌ及びＦはいづれも不安定
であり、ソルビトール５０（♂蕉）溶液の場合は完全に
酵素活性が消滅し、　７０　％　（Ｗ／Ｗ溶液の場合で
も、活性残存率がそれぞれ２５．３％６６．１％及び３
．６チと非常（＝低い値を示した。

第２表 また、第２表の成績から明らかなよう（二、β−ガラク
トシダーゼが同−属（タルイベロマイセス）０属する微
生物起源のものであっても。

それらを産生じた微生物の種（ラクチス及びフラギリス
）が相違すれば、それぞれの酵素（酵母β−ｇａ１．Ｌ
及び酵母β−ｇａｌＦ）のソルビトール添加による安定
化効果（二大差を示した。

；　　　なお９本発明に於いて、各酵素の活性測定は、
　　それぞれの酵素毎に−、湿温度び基質濃度が最適（
二なるよう（〜２次の方法で行った。

■　大腸菌β−ｇａ１．の活性測定 常法により行った。即ち。

０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，３）　１．
２５縦。

３．３６Ｍ２−メルカプトエタノール５０　ｐＬ、　３
０ｍＭ塩化マグネシウム水溶液５０μを及び供試酵素液
５０μｔかうなる溶液を３７℃、３分間保温して酵素を
活性化した後、３４ｍＭの０ＮＰＧを含む０．１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，３）　１００μｔを加え
。

さら（−３７℃で１０分間保温した後１ｍＭのエチレン
ジアミンテトラアセチイト（以下ＥＤＴＡという）ジナ
トリウムを含む１Ｍ炭酸ナトリウム０，５４を加えて反
応を停止させ＋　　４２０ｎｍでの吸光度を測定し、こ
の溶液中Ｃ二生成したＯ−ニトロフェノールの量を求め
た。

■　酵母β−ｇａｌ、Ｌ及びＦの活性測定法クエンドル
フ（Ｗｅｎｄｏｒｆ　）等の方法〔ジャーナル・オプ・
ミルク・アンド・フッド・テクノロジ　試−（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｌｋ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　）　＄　３４巻。

４５１頁、　１９７１年〕を若干変更して行った。即ち
。

２７ｍＭの０ＮＰＧを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝
液（…７．０　）　３　ｍ、　５ｍＭ塩化マンガン水溶
液１ｄ及び供試酵素液ＩＲ１を混合し、３７℃、　１０
分間保温した後１ｍＭＥＤＴＡジナトリクムを含むＩＭ
炭酸ナトリクム溶液１ｍを加え＋　　３００Ｏｒｐｍ。

５分間遠心分離して上清を得、その４２０　ｒａｎでの
吸光度を測定した。

■　アスペルギルスβ−ｇａ１．の活性測定法ｐＨ４，
５に調整した５、７ｍＭ０　Ｎ　Ｐ　Ｇ溶液３．５ｍｌ
と供試酵素液Ｑ、５ｍの混合液を３０℃（＝１０分間保
った後１Ｍ炭酸ナトリウム溶液１ゴを加えて反応を停止
させ、この溶液の４２０ｎｍでの吸光度を測定し生成し
たＯ−ニトロフェノールの量を求めた。

上記１）〜３）の方法Ｃ二於いて、酵素１単位０け１分
間当り１１ＩＸｎＯＩの０ＮＰＧを加水分解するん素置
とした。

験例２．（糖アルコールの種類別安定性比較試験） アスペルギルスβ−ｇａ１．　　を蒸留水で充分（二透
析して脱塩後、濃度５０チ（％）の各種の塘アルコール
水溶液（＝濃度４３０Ｕ／、９Ｔ二なるように溶解し。

各溶液を５ｇ宛試験管に封入し、　７０℃湯浴中で３０
分間保温後の酵素活性を測定し、保温前の活性と比較し
て酵素活性残存率を算出した。

本試験の結果は第３表ｆ二示す通りである。

第　　３　　表 試験例３．（糖アルコールの濃度別安定性比較試験） アスペルギルスβ−ｇａ１．を充分Ｃ二透析して脱塩後
、濃度１０％（ヤ嘔）、３０チ（Ｗ／Ｗ）、５０チ（Ｖ
ｊ／Ｗ）、７０％（％）及び８０％（”／Ｗ）のソルビ
トール水溶液（＝濃度４３０　Ｕ／、９１＝なるように
溶解し、各溶液を５ｇ宛試験管Ｃ封入し、７０℃湯浴中
で３０分間保温後の酵素活性を測定し、保温前の活性と
比較して酵素活性残存率を算出した。

なお、比較のためソルビトール水溶液の代り（＝水を使
用して同様な試験を行った。

本試験の結果は、第４表に示す通りである。

第４表 試験例４．（耐熱性試験） アスペルギルス・オリーゼ種（二属するが菌株の相違す
る微生物によって産生された２種のβ−ガラクトンダー
ゼを、　７０％（％）濃度のソルビトール水溶液中にそ
れぞれ所定濃度（＝溶解し。

５ｄ宛試験管に封入後８０℃湯浴中で３０分、１時間及
び２時間保温した時の酵素活性を測定し。

保温前の活性と比較して酵素活性残存率を算出した。

なお、供試酵素及び酵素濃度は以下の通りであるＯ （イ）供試酵素 試料１：（アスペルギルスβ−ｇａ１．）試料２：（ア
スペルギルス・オリーゼＵ　−８（微工研菌寄第７３７
８号）が産 生したβ−ガラクトシダーゼ〕 ←）酵素濃度 試料１　：　７６６Ｕ／ｉｔｓ 試料２　：　２７２Ｕ／１１１１ 本試験の結果は第５表（二示す通りである。

第５表 第５表から明らかなように２本発明のβ−ガラクトシダ
ーゼ水性組成物は、比較的短時間であれば８０℃の高温
でも活性低下の少ない耐熱性を示した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. マルチトール、キシリトール及びソルビトールから選ば
   れる糖アルコールの１種又は２種以上を５０〜８０％（
   Ｗ／Ｗ）濃度で含有することを特徴とする安定なアスペ
   ルギルス・オリーゼ起源のβ−ガラクトシダーゼ水性組
   成物。