JP3487651B2 - 免疫診断試薬の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、簡便で高感度な抗りん
脂質抗体測定用免疫診断試薬の製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】病気の診断等のために、血清、血しょ
う、脳脊髄液等を検体として、この検体中に含まれてい
るカルジオライピン、フォスファチジルコリン、コレス
テロール等のりん脂質に対応する抗りん脂質抗体を測定
する方法が知られている。 【０００３】このような抗りん脂質抗体を測定する方法
としては、例えば、炭素粒子りん脂質抗原懸濁液を使用
したＲＰＲ（Ｒａｐｉｄ Ｐｌａｓｍａ Ｒｅａｇｉ
ｎ）カード試験法（以下「ＲＰＲ法」という）、ＶＤＲ
Ｌ（Ｖｅｎｅｒｅａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂ）法、ＲＳＴ（Ｒｅａｇｉｎ Ｓｃｒｅｅ
ｎｉｎｇ Ｔｅｓｔ）法等の迅速性、操作性に優れたも
のが知られていた。しかし、これらの方法は、目視判定
法であるので、実施者、測定日等により結果が異なる等
の精度上の問題を有するものであった。 【０００４】近年、りん脂質をラテックス粒子等の不溶
性担体に固定化し、このものを緩衝液等に懸濁分散させ
て試薬とする方法が提案されている。このような試薬に
おいて、りん脂質のラテックス粒子等の不溶性担体への
固定化方法としては、従来、例えば、クリニカル・アン
ド・エクスペリメンタル・イミュノロジー（Ｃｌｉｎ．
Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、６８巻、２１５〜２２２
頁、（１９８７年）及び特表平４−５０３８６５号公報
には、マイクロタイタープレートのウェル又は磁性体粒
子にりん脂質の有機溶媒溶液を加え、溶媒を蒸発させて
プラスチックプレートの表面又は磁性体粒子表面に物理
吸着させる方法が開示されている。 【０００５】しかし、この方法を用いた場合、洗浄時に
プレート壁や磁性体粒子に吸着したりん脂質が剥がれ落
ちやすいので、得られた試薬は測定値がばらつき検出感
度が低くなる問題があり、また、りん脂質の種類により
分子の大きさや極性が異なるので、複数のりん脂質を抗
原として使用した場合、温度やｐＨ等の微細な条件の変
動でラテックス等の表面への吸着状況が変化し、安定し
た試薬の製造が困難であった。更に、この方法において
は、ラテックス粒子等の水性溶媒に懸濁されている不溶
性担体を使用した場合、物理吸着後に有機溶媒を蒸発さ
せると、粒子自体が変性して自己凝集を引き起こすの
で、得られたラテックス粒子等は診断用試薬として不適
当なものであった。 【０００６】特表昭６３−５０１９２８号公報及び特表
平４−５０３８６５号公報には、スペーサーを介した化
学結合方法が開示されており、特開昭５８−６１４６６
号公報にはメチル化タンパクを介した化学結合方法が開
示されている。しかし、これらの方法は、ラテックス粒
子を変性させることなくりん脂質を固定化することがで
きるが、化学修飾されたりん脂質を使用するので、りん
脂質の抗原としての反応性が低下する欠点を有してお
り、また、化学結合の反応条件の設定が複雑である等の
製造上の困難性が存在するものであった。 【０００７】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、抗原としての反応性の低下や抗原の遊離等に起因す
る感度の低下がなく、簡易かつ安定的に実施が可能な抗
りん脂質抗体測定用免疫診断試薬の製造方法を提供する
ことを目的とする。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明の要旨は、不溶性
担体を脂溶性染料の濃度が０．００１〜０．１％である
溶液中で処理し、その後前記不溶性担体に脂質抗原を固
定化することにより抗りん脂質抗体測定用免疫診断試薬
を得るところに存する。 【０００９】上記不溶性担体としては特に限定されず、
例えば、ポリスチレンラテックス粒子、ポリエチレンラ
テックス粒子等の各種の合成樹脂ラテックス粒子；ゼラ
チン粒子；ウシ、ヒツジ等の動物の赤血球；カオリン；
炭素末等の粒子状のもの等を挙げることができ、更に、
プラスチック製のマイクロタイタープレート、試験管等
を使用することもできる。なかでも、ポリスチレンラテ
ックス粒子が好ましい。上記不溶性担体の粒径は、好ま
しくは０．０５〜１０μｍであり、より好ましくは０．
１〜１μｍである。 【００１０】上記脂溶性染料としは、不溶性担体表面上
のマイナス電荷を相殺しうるものであれば特に限定され
ず、例えば、スダンブラックＢ、スダンＩＩＩ等を好適
に用いることができる。 【００１１】本発明においては、上記不溶性担体を上記
脂溶性染料で処理する。上記処理は、上記不溶性担体を
水又は有機溶媒等に懸濁したものに脂溶性染料を添加す
ることにより行うことができる。上記有機溶媒として
は、不溶性担体を溶解、変性させず、かつ、りん脂質を
可溶化することができるものであれば特に限定されず、
例えば、メタノール、エタノール、エーテル等を好適に
使用することができる。上記処理において、上記脂溶性
染料の溶解濃度は、最終濃度０．００１〜０．１％に限
定される。 【００１２】本発明においては、上記処理の後、不溶性
担体に脂質抗原を固定化することにより抗りん脂質抗体
測定用免疫診断試薬を得る。上記固定化は、上記処理を
施した不溶性担体を水又はメタノール等の有機溶媒等に
懸濁したものに、脂質抗原としてりん脂質を添加し、室
温〜１００℃で適当な時間吸着させることにより行うこ
とができる。上記りん脂質としては特に限定されず、例
えば、カルジオライピン、ホスファチジルコリン、コレ
ステロール等を挙げることができる。これらは２種以上
を併用してもよい。 【００１３】本発明によって製造した抗りん脂質抗体測
定用免疫診断試薬は、通常の緩衝液中に保存することが
できる。上記緩衝液としては特に限定されず、例えば、
りん酸緩衝液等の既知のもの等を挙げることができる。
また、そのｐＨ及びイオン強度は、通常の生理学的な条
件とすることができる。上記緩衝液には、所望により自
己凝集反応を抑制する物質、抗原抗体反応を促進する物
質等を添加併用することができる。 【００１４】本発明によって製造した抗りん脂質抗体測
定用免疫診断試薬は、緩衝液に懸濁した状態で長期間安
定に保存することができるが、凍結乾燥状態で保存する
こともできる。その際、凍結乾燥時の安定剤として一般
に使用されている薬剤を添加して使用することもでき
る。 【００１５】本発明によって製造した抗りん脂質抗体測
定用免疫診断試薬は、疾病の診断及び治療のための臨床
検査等の分野に広く使用することができる。 【００１６】 【作用】りん脂質は、一分子中に親水性基と疎水性基と
を有する両親媒性分子である。その平均分子量は８００
前後と小さいので、通常、スペーサー等を介して固定し
なければ抗原としての反応性が得られない。本発明にお
いては、ラテックス粒子等の不溶性担体の表面を脂溶性
染料の濃度が０．００１〜０．１％である溶液中で処理
することにより、担体表面に残留しているマイナス電荷
を相殺し、かつ担体表面の疎水性を高めて、抗原成分で
あるりん脂質と不溶性担体との電気的反発を軽減させ、
脂質抗原を不溶性担体に抗原性を保ったまま大量かつ容
易に物理吸着させることを可能としている。 【００１７】 【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。 【００１８】実施例１ ラテックス懸濁液として、平均粒径０．１９１μｍ、固
形分１０％（Ｗ／Ｖ）のポリスチレンラテックス（積水
化学工業社製）の水懸濁液０．１ｍｌを室温下に７００
ｒｐｍで回転振とうしつつ、脂溶性染料として、スダン
ブラックＢ（Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋ Ｂ、分子量４５
６．５、ロット番号２６１５０、クロマ−ゲゼルシャフ
ト社製）の水溶液０．４ｍｌを添加して最終濃度０．１
％として、更に室温下に１時間回転振とうした後、１８
０００ｒｐｍ×３０分間遠心してペレットを得た。これ
に脱イオン水２．０ｍｌを加えて１８０００ｒｐｍ×３
０分間遠心してペレットを得る洗浄操作を３回繰り返し
た後、洗浄後のペレットに脱イオン水０．１ｍｌを加え
て氷冷下に超音波処理（ダイアル２×ｄｕｔｙ５０％×
３０秒）して前処理済ラテックス懸濁液を得た。別に脂
質抗原液として、カルジオライピン（ジホスファチジル
グリセロールナトリウム塩、ウシ心臓由来、ロット番号
１１２Ｈ８３５０、シグマ社製）５ｍｇ／ｍｌエタノー
ル溶液、ホスファチジルコリン（ニワトリ卵黄由来、試
薬特級９５％、ロット番号ＶＯＦ９１４１、ナカライテ
スク社製）１０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液、コレステロ
ール（試薬特級、ロット番号Ｍ２Ｇ０７０１、ナカライ
テスク社製）１０ｍｇ／ｍｌエタノール溶液を、それぞ
れ２ｍｌ、１０ｍｌ、３ｍｌ（重量比１：１０：３）ず
つ混合したものを調製した。 【００１９】得られた前処理済ラテックス懸濁液（固形
分１０％（Ｗ／Ｖ））０．１ｍｌに、調製した脂質抗原
液１．０ｍｌを加え、室温下に７００ｒｐｍ×１時間回
転振とうした後、０．１Ｍほう化りんナトリウム（Ｎａ
ＰＢ）に牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ
Ａｌｂｕｍｉｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、Ｒｅａｇｅ
ｎｔ Ｇｒａｄｅ、ロット番号８１−０６６−２、マイ
ルス社製、以下「ＢＳＡ」という）を１％（Ｗ／Ｖ）の
濃度になるように溶解したブロッキング溶液を加え、更
に室温下に７００ｒｐｍ×１．５時間回転振とうした
後、１８０００ｒｐｍ×３０分間遠心してペレットを得
た。これに５．０ｍｌのラテックス懸濁液を加えて１８
０００ｒｐｍ×３０分間遠心してペレットを得る洗浄操
作を３回繰り返した後、洗浄後のペレットに２．０ｍｌ
のラテックス懸濁液を加えて氷冷下に超音波処理（ダイ
アル２×ｄｕｔｙ５０％×６０秒）して抗りん脂質抗体
測定用免疫診断試薬を得た。得られた抗りん脂質抗体測
定用免疫診断試薬は４℃にて保存した。 【００２０】評価方法抗りん脂質抗体の測定 得られた抗りん脂質抗体測定用免疫診断試薬５０μｌ、
０．１Ｍほう化りんナトリウム（ＮａＰＢ）にＢＳＡを
０．２５％（Ｗ／Ｖ）及びグリコシルエチルメタクリレ
ートのホモポリマー（平均分子量３０万、日本精化社
製）を１．０％（Ｗ／Ｖ）にそれぞれなるように溶解し
た検体希釈用緩衝液３５０μｌ、並びに、検体２０μｌ
を用いて、ヒト血清中の抗りん脂質抗体の測定を行い、
評価した。検体として用いた標準血清は、陽性検体とし
ては、ＲＰＲ法で１６倍である梅毒陽性ヒトプール血清
（ロット番号００１−０４９３５０９、ＴＳＩ Ｃｅｎ
ｔｅｒ Ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．社製）を−２０℃で凍結保存したも
のを溶解し、必要に応じて生理的食塩水で希釈し、抗り
ん脂質抗体価１６倍血清（原液）、抗りん脂質抗体価８
倍血清、抗りん脂質抗体価４倍血清、抗りん脂質抗体価
２倍血清としたものであり、陰性コントロールとして
は、ＲＰＲ法及びＴＰＨＡ法のいずれでも陰性である梅
毒陰性ヒトプール血清（ロットｄ、ロットｅ、セラコン
社製）を−２０℃で凍結保存したものを溶解した原液で
あった。更に陰性検体としては、生理的食塩水も用い
た。測定は、日立自動分析装置７１５０型（日立製作所
社製）を用い、３７℃で測定波長５７０ｎｍにて行い、
測定開始後８０秒後と３２０秒後（２４ポイントと５０
ポイント）における吸光度変化量（ΔＯ．Ｄ．５７０）
を測定し、反応量とした。測定はｎ＝２で行い、平均値
を求めた。結果を表２に示した。 【００２１】実施例２〜６及び比較例１、２、４、５ 脂溶性染料として表１に示した種類及び最終濃度のもの
を使用したこと以外は、実施例１と同様にして抗りん脂
質抗体測定用免疫診断試薬を得、測定し、評価した。結
果を表２及び表３に示した。なお、実施例４〜６及び比
較例４、５においては、脂溶性染料としてスダンＩＩＩ
（ＳｕｄａｎＩＩＩ、分子量３５２．４、特級試薬、ロ
ット番号１２０４−４−１６６−２、大和化工社製）を
使用した。 【００２２】比較例３及び比較例６ 脂溶性染料の代わりに超純水を使用したこと以外は、実
施例１と同様にして抗りん脂質抗体測定用免疫診断試薬
を得、測定し、評価した。結果を表２及び表３に示し
た。 【００２３】 【表１】【００２４】 【表２】 【００２５】 【表３】 【００２６】 【発明の効果】本発明の抗りん脂質抗体測定用免疫診断
試薬の製造方法は、上述の構成よりなるので、抗原成分
を簡易かつ安定的にラテックス粒子等に固定化すること
ができ、抗原としての反応性の低下や抗原の遊離に起因
する感度の低下がなく、高感度で自己凝集の少ない抗り
ん脂質抗体測定用免疫診断試薬を提供することができ
る。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−48659（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−231265（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−148（ＪＰ，Ａ) 特公 昭53−15132（ＪＰ，Ｂ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 不溶性担体を脂溶性染料の濃度が０．０
   ０１〜０．１％である溶液中で処理し、その後前記不溶
   性担体に脂質抗原を固定化することを特徴とする抗りん
   脂質抗体測定用免疫診断試薬の製造方法。