JP3040224B2 - 免疫学的凝集反応粒子の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的凝集反応粒子
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野においては、種々の疾患
を血清学的に診断することが近年重要視されている。こ
の診断における極めて重要な課題は、血清中の抗原又は
抗体の定量を正確且つ迅速に、できれば簡便に行うこと
である。この課題を解決する方法の１つとして、抗原又
は抗体が感作された担体を使用する方法が広く採用され
ている。この抗原又は抗体が感作された担体を使用する
場合、試料中に抗体又は抗原が存在すると、抗原と抗体
とが反応し複合体を生成し、その複合体は凝集する。こ
の抗原と抗体との反応は、免疫学的凝集反応と呼ばれ
る。前記の抗原又は抗体が感作された担体を使用する方
法の特長は、前記複合体の凝集を肉眼でも観察すること
ができる点、該方法において行われる操作が比較的簡単
である点にある。

【０００３】上記の抗原又は抗体が感作された担体を使
用する方法において、使用される担体は次の２種類であ
る。即ち、動物赤血球、細菌菌体等の生物学的担体と、
ラテックス、カオリン、炭末、シリカ、アルミナ、有機
無機複合粒子等の非生物学的担体である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の２種類の担体の
うち、生物学的担体を使用する場合、同種の生物から採
取される生物学的担体を使用しても、前記の凝集の状態
において固体間差がみられることが多い。例えば、動物
赤血球を使用した場合、該赤血球の表面に存在する特定
の抗原により、凝集が起こるべきときに凝集が起こらな
いこと、即ち凝集像の崩れの問題がある。

【０００５】一方、非生物学的担体を使用する場合に
は、血清中に抗体又は抗原が比較的多く含まれていなけ
れば凝集しない、即ち感度が悪いという問題がある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の問
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、抗原又は抗
体が感作された担体を多糖で処理することにより、感度
の低下及び凝集像の崩れを防止することができることを
見いだし、本発明を完成するに到った。

【０００７】 即ち、本発明は、担体に抗原または抗体
を感作した後、アニオン性多糖で処理し、次いで緩衝液
で洗浄することを特徴とする免疫学的凝集反応粒子の製
造方法である。

【０００８】本発明において用いられる担体は、特に限
定されず、例えば、ポリスチレン粒子、ポリアクリルア
ミド粒子等のラテックス粒子、カオリン、炭末、シリ
カ、アルミナ、チタニア、ジルコニア等の酸化物、前記
酸化物を２種以上含んでなる複合酸化物等の無機粒子、
前記シリカ等の無機粒子表面を有機化合物で処理して得
られる該有機化合物が粒子表面に化学的又は物理的に結
合した有機無機複合粒子、ゼラチン粒子などの非生物学
的粒子、細菌菌体、動物赤血球などの生物学的粒子が挙
げられる。このうち、有機無機複合粒子は人工担体であ
るため、その表面を目的に応じて化学的処理をすること
ができ、また、前記した凝集像の崩れが発生しにくいの
で好適に用いられる。

【０００９】前記の担体に感作する物質としては免疫学
的凝集反応を起こすものであればよく、該物質として抗
原及び抗体が挙げられる。

【００１０】抗原は、抗体を産生させて、体液性免疫や
細胞性免疫を誘発する物質であれば特に限定されず、例
えば蛋白、糖蛋白、脂質蛋白、脂質、核酸等が挙げられ
る。抗体は、抗原と特異的に結合する活性を持つもので
あれば特に限定されず、例えばＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｉｇ
Ａ，ＩｇＤ，ＩｇＥ等が挙げられる。

【００１１】担体に抗原又は抗体を感作する方法は、公
知の方法を限定なく採用することができる。例えば、リ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液等の緩衝液
中において、担体と、該担体１ｇあたり０．０１〜５０
ｍｇの抗原又は抗体を混合し、次いで該混合物を放置す
る方法等が挙げられる。前記混合物を放置する時間は、
通常１時間以上である。感作温度は特に限定されない
が、通常４〜５６℃であり、好ましくは室温程度であ
る。

【００１２】本発明においては、担体に抗原又は抗体を
感作する前に、予め該担体をホルムアルデヒド、グルタ
ルアルデヒド、タンニン酸等の架橋剤で処理してもよ
い。

【００１３】本発明の特徴は、前述した操作により得ら
れる抗原又は抗体が感作された担体を多糖で処理点にあ
る。

【００１４】本発明において用いられる多糖は、公知の
多糖を限定なく使用することができる。この多糖を例示
すると、セルロース、アガロース、イヌリン等の単純多
糖、グルコマンナン、ガラクトグルコマンノグリカン、
アラビノガラクトグリカン等の複合多糖、アラビアゴ
ム、アルギン酸、トラガント酸等の酸性多糖、セルロー
ス、アミロース、ラミナラン等の中性多糖、カルボキシ
メチルセルロース、カルボキシセルロース、フタル酸酢
酸セルロース等のアニオン性多糖、ここに例示した多糖
の混合物が挙げられる。

【００１５】前記の多糖におけるカルボキシル基の水素
原子の一部又は全部は、ナトリウム原子、カルシウム原
子等の原子に置き換わり、前記の多糖が、ナトリウム
塩、カルシウム塩等の塩の形をとっていてもよい。

【００１６】以上に例示した多糖のうち、好ましく使用
されるのは、前記のアニオン性多糖である。

【００１７】本発明において、担体を多糖で処理する方
法は特に限定されない。この多糖で処理する方法を例示
すると、（Ａ）抗原又は抗体を感作した担体が含まれた
緩衝液と多糖又はその溶液とを接触させる方法、（Ｂ）
緩衝液から抗原又は抗体が感作された担体を単離し、そ
の単離された担体と、多糖の溶液とを接触させる方法等
が挙げられる。

【００１８】前記した多糖の溶液を調製するに際して使
用される溶媒は、公知の溶媒を限定せずに使用すること
ができる。この溶媒を例示すると、蒸留水、イオン交換
水等の水、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液
等の緩衝液等が挙げられる。前記の多糖で処理する方法
（Ｂ）において、抗原又は抗体が感作された担体を単離
する方法は、公知の単離方法を限定なく採用することが
できる。例えば、遠心分離による方法等が挙げられる。
そして、担体を単離する前には、予め抗原又は抗体が感
作された担体をリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸
緩衝液、フタル酸緩衝液等の緩衝液で洗浄することが、
多糖による処理の効果をより高めるために好ましい。

【００１９】本発明における多糖の使用量は特に限定さ
れないが、感作に用いる抗原又は抗体１ｍｇあたり１〜
１０００ｍｇとすることが好ましい。多糖の使用量を前
記範囲内とすると、感度を高め、凝集像の崩れをより確
実に防止することができる。本発明において、抗原又は
抗体が感作された担体を多糖で処理する際の温度は特に
限定されないが、通常４〜５６℃、好ましくは４〜１０
℃である。

【００２０】本発明において、担体を多糖で処理する時
間は、特に限定されないが、好ましくは２〜２４時間で
ある。多糖で処理する時間を前記範囲内とすると、感度
を高め、凝集像の崩れをより確実に防止することができ
る。

【００２１】本発明においては、抗原又は抗体が感作さ
れた担体を多糖で処理する前に、予め蛋白、例えば牛血
清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等で該担体をブロッ
キングすると、感度が向上し、且つ凝集像の崩れがより
起こりにくくなるので好ましい。前記の蛋白によるブロ
ッキングの方法は、公知の蛋白によるブロッキングの方
法を限定せずに採用することができる。

【００２２】以上に説明した本発明の製造方法により免
疫学的凝集反応粒子が得られる。そして、この免疫学的
凝集反応粒子は、通常水性媒体に分散され免疫学的凝集
反応試薬（以下単に「凝集反応試薬」ともいう。）とし
て使用される。

【００２３】本発明の免疫学的凝集反応粒子を凝集反応
試薬の有効成分として使用する場合、通常予め該免疫学
的凝集反応粒子をリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸
緩衝液等の緩衝液等で少なくとも１回洗浄し、次いで遠
心分離により該免疫学的凝集反応粒子を単離する。

【００２４】前記したように、本発明の製造方法によっ
て得られる免疫学的凝集反応粒子を水性媒体に分散させ
て凝集反応試薬とする場合、該免疫学的凝集反応粒子の
濃度は、特に限定されないが、免疫学的凝集反応粒子と
水性媒体との合計量を基準とすると、０．３〜１重量％
であることが、凝集像が鮮明となり、且つ感度が良好で
あるために好ましい。

【００２５】前記の凝集反応試薬には、蛋白、無機塩、
アミノ酸塩等を添加しても良い。前記の蛋白は、免疫学
的凝集反応粒子における抗原抗体反応を阻害しないもの
であれば特に限定されない。該蛋白を例示すると、牛血
清アルブミン、ヤギ血清、ウサギ血清ゼラチン、スキム
ミルク等が挙げられる。また、前記無機塩を例示する
と、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリウム
等が挙げられる。さらに、前記アミノ酸塩を例示する
と、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウ
ム等が挙げられる。

【００２６】前記の凝集反応試薬を得るに際して通常使
用される水性媒体として好ましいものを例示すると、超
純水、蒸留水等の水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グ
リシン緩衝液等の緩衝液、生理食塩水等のｐＨ４〜９の
水性媒体が挙げられる。これらのうち、リン酸緩衝液、
トリス緩衝液、グリシン緩衝液、生理食塩水が、免疫学
的凝集反応粒子における免疫学的凝集反応が速やかに進
行するために好ましい。

【００２７】本発明の製造方法により得られる免疫学的
凝集反応粒子を長期にわたって保存する場合、通常該免
疫学的凝集反応粒子を乾燥して保存することが好まし
い。免疫学的凝集反応粒子を乾燥する方法は特に限定さ
れないが、凍結乾燥による方法が好ましい。

【００２８】上記の乾燥した免疫学的凝集反応粒子は、
凝集反応試薬の１成分を使用するに際して、前記の水性
媒体に分散される。

【００２９】

【発明の効果】本発明の製造方法により得られる免疫学
的凝集反応粒子を含んでなる凝集反応試薬は、凝集像の
崩れが発生せず、且つ感度が良好である。この理由は明
らかではないが、多糖自身が有する粘度及び安定性に起
因して、好適な免疫学的凝集反応粒子、ひいては高品質
の凝集反応試薬が得られるものと考えられる。

【００３０】

【実施例】本発明を以下に示す実施例により具体的に説
明するが、本発明は、その実施例により何ら限定される
ものではない。

【００３１】実施例１ 凝集反応試薬として、免疫学的梅毒診断薬を作成する為
に、まず梅毒の病原菌であるトレポネーマ・パリダム１
×１０⁹ 個を１ｍｌの０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に
分散させた。次いで、このトレポネーマ・パリダムが分
散した塩化ナトリウム水溶液に更に４９ｍｌの０．１Ｍ
塩化ナトリウム水溶液を加え、超音波破砕器により２０
０Ｗで３０分間破砕した。次いで、有機無機複合粒子
（徳山曹達株式会社製商品名：イムノティクルスＨＤ
Ｐ）を０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄した後、該緩衝液
１ｍｌにて２．５重量％になるように上記粒子を分散さ
せた。上記破砕されたトレポネーマ・パリダムを含んだ
塩化ナトリウム水溶液１ｍｌに、上記有機無機複合粒子
を含んだ緩衝液を加えて１時間室温にて放置し、３００
０ｒｐｍで３分間遠心し、トレポネーマ・パリダム由来
の抗原が感作された有機無機複合粒子を単離した後、該
感作した有機無機複合粒子を、蒸留水に溶解した１重量
％カルボキシメチルセルロース溶液１ｍｌに４℃で４時
間放置し、免疫学的凝集反応粒子が含まれてなる液を得
た。尚、抗原１ｍｇあたりの多糖であるカルボキシメチ
ルセルロースの使用量は２０ｍｇであった。その後、該
免疫学的凝集反応粒子を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）１ｍｌを使用する洗浄を２回行い、凍結乾燥し
た。２か月間４℃で放置した後、５重量％の牛血清アル
ブミンを含んでなる０．０２Ｍリン酸緩衝液５ｍｌに、
前記の凍結乾燥した免疫学的凝集反応粒子を凝集反応試
薬基準で０．５重量％濃度となるように添加し、凝集反
応試薬を調合した。

【００３２】次に、この凝集反応試薬の免疫学的梅毒診
断薬としての性能を以下に示すように測定した。

【００３３】被検液として梅毒患者血清を予め０．０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）により１０倍に希釈した
ものを原液として、倍数希釈法に従って該リン酸緩衝液
を用いて希釈を行い、１０倍、２０倍、４０倍、８０
倍、１６０倍、３２０倍、６４０倍、１２８０倍の各希
釈液を調製した。次いで、前記の希釈液からそれぞれ２
５μｌずつマイクロタイタープレートのウェル中に分取
し、更に該ウェルにそれぞれ前記凝集反応試薬を２５μ
ｌずつ加えた後（前記の希釈倍率はそれぞれ２倍とな
る）、１分間撹拌し放置した。３０分後、粒子の凝集状
態を観察し、粒子リングが明らかに大きく、且つリング
内で粒子が一様に広がっていることが認められるウェル
における希釈液の最高希釈倍数を感度（抗体価）として
評価した。また、前記の観察において、粒子リンクが小
さいか、又はリング内で粒子が一様に広がっていないか
した場合に、凝集像の崩れが発生したものとして、その
個数を数えた。尚、凝集像の崩れは希釈倍率の低い方か
ら起こる。他方、上記の方法に従って、被検液として健
常者血清を希釈したものを用い、抗体価と凝集像の崩れ
の個数を測定した。表１に結果を示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】比較例１ 実施例１において、カルボキシメチルセルロース溶液で
処理しなかったこと以外はすべて実施例１と同様に行っ
た。表１に結果を示す。

【００３６】比較例２ 実施例１において、カルボキシメチルセルロース溶液に
代えて１重量％牛血清アルブミン水溶液１ｍｌで処理し
たこと以外はすべて実施例１と同様に行った。表１に結
果を示す。

【００３７】実施例２ 凝集反応試薬として、免疫学的大腸癌診断薬を作成する
為に、ウサギ由来の抗ヒトヘモグロビン抗体（カッペル
社製）を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．０５
Ｍ塩化ナトリウム水溶液１ｍｌに溶解させた。次いで、
このヒトヘモグロビン抗体を含んだ塩化ナトリウム水溶
液１ｍｌに、０．０５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０
２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に、ホルマリンで固定
化した０．５重量％の羊赤血球１ｍｌを分散させた液を
加えて室温で１時間放置し、感作した。次いで、３００
０ｒｐｍで３分間遠心して上記感作された該羊赤血球を
単離した後、０．０５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌで１回遠心洗浄し
た後、蒸留水に溶解した２重量％フタル酸酢酸セルロー
ス溶液１ｍｌに４℃で１晩放置し、免疫学的凝集反応粒
子が含まれてなる液を得た。尚、抗体１ｍｇあたりの多
糖であるフタル酸酢酸セルロースの使用量は２００ｍｇ
であった。その後、該免疫学的凝集反応粒子を０．０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌを使用する洗浄を
２回行い、凍結乾燥した。３か月間４℃で放置した後、
蒸留水に、前記の凍結乾燥した免疫学的凝集反応粒子を
凝集反応試薬基準で０．５重量％濃度となるように添加
し、凝集反応試薬を調合した。次に、この凝集反応試薬
の免疫学的大腸癌診断薬としての性能を以下に示すよう
に測定した。即ち、実施例１において、原液として大腸
癌患者便３ｍｇを、０．０１重量％のデオキシコール酸
ナトリウムを含んでなる０．０１Ｍグリシン緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に溶解させたものを用い、倍数希釈法による
希釈を前記グリシン緩衝液を用いて行い、他方の被検液
の原液として健常者便を希釈したものを使用した以外
は、実施例１と同様に測定した。尚、このとき測定した
感度は抗原力価とも呼ばれる。表１に結果を示す。

【００３８】比較例３ 実施例２において、フタル酸酢酸セルロース溶液で処理
しなかったこと以外はすべて実施例２と同様に行った。
表１に結果を示す。

【００３９】比較例４ 実施例２において、フタル酸酢酸セルロース溶液に代え
て２重量％乳製カゼイン（和光純薬工業社製）水溶液１
ｍｌで処理したこと以外はすべて実施例２と同様に行っ
た。表１に結果を示す。

【００４０】実施例３ 凝集反応試薬として、免疫学的成人Ｔ細胞白血病診断薬
を作成する為に、成人Ｔ細胞白血病ウイルス由来の抗原
を０．０７５Ｍの塩化ナトリウム水溶液１ｍｌ当り１０
０μｇ溶解した。次いで、水酸化ナトリウム存在下でオ
キシ塩化ジルコニウムより通常のゾルゲル法にて作成し
たジルコニア粒子を０．０７５Ｍの塩化ナトリウムを含
む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で２回洗浄し
た後、２．５重量％になるように上記緩衝液に分散させ
た。上記抗原溶液１ｍｌに上記無機粒子１ｍｌを分散さ
せた液を加えて１時間室温にて放置し、次いで０．０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌで２回洗浄して成
人Ｔ細胞白血病ウイルス由来の抗原が感作された凝集反
応粒子を調製した。次いで、上記凝集反応粒子が分散し
ているリン酸緩衝液に、１重量％になるように０．０２
ｇのアルギン酸ナトリウムを添加し、４℃で１晩処理
し、免疫学的凝集反応粒子が含まれてなる液を得た。
尚、抗原１ｍｇあたりの多糖であるアルギン酸ナトリウ
ムの使用量は２００ｍｇであった。その後、１重量％の
牛血清アルブミンを含んでなる０．０２Ｍリン酸緩衝液
５ｍｌに、前記免疫学的凝集反応粒子を凝集反応試薬基
準で０．５重量％濃度となるように添加し、凝集反応試
薬を調合した。

【００４１】次に、この凝集反応試薬の免疫学的成人Ｔ
細胞白血病診断薬としての性能を以下に示すように測定
した。即ち、実施例１において、原液として成人Ｔ細胞
白血病患者血清を用い、他方の被検液の原液として、健
常者血清を使用した以外は、実施例１と同様に測定し
た。表１に結果を示す。

【００４２】比較例５ 実施例３において、アルギン酸ナトリウムを添加しなか
ったこと以外はすべて実施例３と同様に行った。表１に
結果を示す。

【００４３】比較例６ 実施例３において、アルギン酸ナトリウム溶液に代えて
２重量％水溶性ゼラチン（新田ゼラチン社製）水溶液１
ｍｌで処理したこと以外はすべて実施例３と同様に行っ
た。表１に結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−84461（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−197867（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−241665（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−173567（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−238360（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/531

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 担体に抗原または抗体を感作した後、ア
   ニオン性多糖で処理し、次いで緩衝液で洗浄することを
   特徴とする免疫学的凝集反応粒子の製造方法。